Анализ модулирующего действия ΔΨ на работу некоторых систем активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Орлова, Ольга Валентиновна

• Орлова, Ольга Валентиновна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Орлова, Ольга Валентиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. Потенциал покоя клеток высших растений и его

функциональное значение

1.1. Природа потенциала покоя клеток высших растений II

1.1.1. Особенности потенциала покоя плазмалеммы

1.1.2. Природа пассивной компоненты потенциала покоя

1.1.3. Природа активной компоненты потенциала покоя

1.2. Роль потенциала покоя в функциональной активности плазмалеммы

1.2.1. Потенциал покоя и физико-химическое состояние плазмалеммы

1.2.2. Потенциал покоя как регулятор пассивной проницаемости плазмалеммы

1.2.3. Потенциал покоя и работа первичных активных транспортных систем

1.2.4. Потенциал покоя и вторичный активный транспорт

1.2.5. Роль потенциала покоя в работе мембраносвязанных ферментов

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Выделение фракции, обогащенной плазматическими мембранами, методом дифференциального

ультрацентрифугирования

2.2. Формирование искусственного Д\|/ на мембранах с

помощью К*-диффузионного потенциала

2.3. Определение Д\|/ и ДрН во фракции изолированных плазматических мембран методом флуоресцентных зондов

2.3.1. Измерение Д\|/ с помощью флуоресцентных зондов

АНС", ДСМ и сНз-Сз-(5)

2.3.2. Измерение ДрН с помощью флуоресцентного

зонда 9-аминоакридина

2.3.3. Определение ЭН-групп с помощью зонда

флуоресцеинмеркутиацетата

2.4. Определение АТФазной активности во фракции изолированных плазматических мембран

2.4.1. Спектрофотометрический метод определения АТФазной активности с помощью

малахитового зеленого

2.4.2. Определение АТФазной активности методом

Лоури-Лопец

2.4.3. Люциферин-люциферазный метод определения

АТФазной активности

2.5. Изучение вторичного активного транспорта сахарозы

2.5.1. Метод турбидиметрии

2.5.2. Метод миллипоровой фильтрации

2.5.3. Изучение транспорта Сахаров в частично изолированных проводящих тканях растений по характеру биоэлектрических реакций

2.6. Определение белка во фракции изолированных плазматических мембран методом Лоури

2.7. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Стабилизирующая роль АТФ-зависимого Н+-насоса в электрогенезе

плазматических мембран клеток высшего растения

3.1. Способность везикул генерировать пассивную компоненту потенциала покоя (Дц/о), представленную К*-

диффузионным потенциалом

3.2. Способность везикул генерировать активную (АТФ-зависимую) компоненту потенциала покоя

3.3. Стабилизирующая роль активной компоненты потенциала покоя

в электрогенезе везикул плазматических мембран

Глава 4. Модулирующее влияние ^-диффузионного потенциала на

гидролитическую активность Н+-АТФазы плазматических мембран

высшего растения в различных условиях

4.1. Влияние мембранного потенциала на гидролитическую

4.2. Влияние мембранного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы при пониженной температуре (6°С)

4.3. Усиление влияния мембранного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы у растений, подвергнутых холодовому

закаливанию

Глава 5. Исследование роли мембранного потенциала во вторичном активном транспорте сахарозы в плазматических мембранах клеток высших

растений

5.1. Исследование биоэлектрических реакций клеток проводящих тканей высшего растения при

транспорте сахарозы

5.2. Изучение потенциал-зависимости транспорта сахарозы на везикулах плазматических мембран

5.3. Анализ изменений мембранного потенциала, индуцированных транспортом сахарозы в везикулах плазмалеммы

5.4. Влияние ^-диффузионного потенциала на конформационное состояние переносчика сахарозы везикул плазматических мембран (по анализу содержания свободных SH-групп)

Заключение

Выводы

Литература

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

9-АА - 9-аминоакридин

АНС" -анилинонафталин-8-сульфонат

ДСМ - п-толуолсульфонат-4(п-диметиламиностирол)

ДЦКД - N, -дициклогексилкарбодиимид

КЦХФГ - карбонилцианид-(т)-хлорфенилгидразон

ПМ- плазматические мембраны

ФМА - флуоресцеинмеркуриацетат

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

сй8-Сз-(5) - 3,3-ди-пропил-2,2-тиодикарбоцианин

Е0 - диффузионная компонента потенциала покоя клетки

Етг - потенциал покоя клетки

Ер - электрогенная (активная) компонента потенциала покоя клетки

1фл - интенсивность флуоресценции

ДрН - разность концентраций ионов водорода

Ац> - мембранный потенциал (разность потенциалов) в везикулах ПМ Ду|/о - К^-диффузионный потенциал Дур - АТФ-зависимый потенциал

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ модулирующего действия ΔΨ на работу некоторых систем активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что биоэлектрические потенциалы растений изучаются на протяжении весьма длительного времени и в этой области накоплен значительный экспериментальный материал, их функциональная роль остается очень слабо раскрытой. Имеются лишь отдельные исследования, в которых делаются попытки выяснить возможность участия биоэлектрических потенциалов в физиолого-биохимических и биофизических процессах у растений (Опритов и др., 1991; Gradmann et al., 1993; Медведев, 1996). Вместе с тем, становится все более очевидным, что разности биоэлектрических потенциалов на мембранах растительных клеток не могут быть безразличны для ряда процессов. К их числу следует отнести и процессы мембранного транспорта.

В последнее время появился ряд исследований, посвященных выяснению роли мембранного потенциала (Ау) в регуляции работы мембраносвязанных ферментных систем, в частности, Н+ -АТФазы плазматических мембран, которая способна выполнять функцию электрогенного Н+-насоса (Остроумов, Воробьев, 1976; Тимашев, 1981; Конев, 1987; Slayman, 1987; De Weer et al., 1988; Tsong et al., 1989; Треушников и др., 1994; Briskin et al., 1995). С помощью анализа вольт-амперных кривых активного транспорта Н+ было показано, что работа Н+-АТФазы как Н+-насоса является потенциал-зависимой (Slayman, 1987; Blatt, 1987; Briskin et al., 1995). В то же время остается неясным влияние А у на протекание реакции гидролиза АТФ, катализируемого Н+-АТФазой ПМ, в ходе которой освобождается энергия, используемая для активного транспорта Н+ через мембрану, хотя выяснение данного вопроса является не менее важным, чем доказательство потенциал-зависимости самого транспорта Н+.

Становится все более очевидным, что Лч|/ как универсальная конвертируемая форма энергии в клетке может принимать участие и в процессах вторичного активного транспорта (Опритов и др., 1991), в частности, вторичного активного транспорта сахарозы (Getz et al., 1987; Калинин, Опритов, 1989; Опритов и

др., 1991; Bush, 1993; Shakya, Sturm, 1998). Вместе с тем, данный вопрос исследован пока недостаточно. Так, до сих пор не ясно, какой этап переноса является потенциал-зависимым, как изменяется потенциал-зависимость транспорта сахарозы с изменением величины и знака Ау и т.д.

Для успешного выполнения вышеназванных функций мембранный потенциал должен поддерживаться на относительно высоком стационарном уровне. В клетках большое стабилизационное значение имеет связь электрогенеза ПМ с внутриклеточными системами метаболизма и регуляции (Reid et al., 1985; Hansen et al., 1987; Michelet, Boutry, 1995). Менее известно о значении собственно электрогенных систем, в частности, Н+-насоса (Н+-АТФазы) в стабилизации мембранного потенциала, хотя это представляется важным, поскольку возникающая при работе Н+ -насоса протондвижущая сила имеет значение для транспорта целого ряда потенциалопределяющих ионов (Максимов, 1989; Опритов и др., 1991; Michelet, Boutry, 1995).

Все вышеизложенное обусловило цель и задачи представленной работы.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы было выяснение роли Ац/ в функционировании систем первичного и вторичного активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1- оценка стабилизирующей роли АТФ-зависимого Н+-насоса (Н+-АТФазы) в электрогенезе плазмалеммы растительных клеток;

2- анализ модулирующего влияния Ду различной величины и знака на гидролитическую активность Н+-АТФазы и изменения потенциал-зависимости данной ферментной системы при холодовом закаливании растений;

3- установление роли Av|> разного знака и величины во вторичном активном транспорте сахарозы.

Большая часть исследований была выполнена на изолированной фракции везикул плазматических мембран (ПМ), что позволило наблюдать процессы пер-

вичного и вторичного активного транспорта без вмешательства внутриклеточного содержимого.

Основные элементы научной новизны. В результате проведенных исследований на фракции изолированных везикул ПМ установлено, что мембранный потенциал, возникающий как ^-диффузионный (А\[/0), не проявлял способности к сохранению постоянства своей исходной величины. Появление в составе мембранного потенциала АТФ-зависимой компоненты (А\[/р) приводило к стабилизации электрогенеза ПМ на некотором стационарном уровне.

Впервые показано стимулирующее влияние индуцированного валиноми-цином ^-диффузионного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы. Ограничение конформационной подвижности фермента при 6°С сопровождалось усилением потенциал-зависимости. Такой же эффект наблюдался и при холодовом закаливании растений озимой пшеницы.

На инвертированных везикулах ПМ установлена зависимость вторичного активного транспорта сахарозы от величины и знака К*-диффузионного мембранного потенциала. Основную роль в транспорте сахарозы играет А у со знаком «+» внутри везикул ПМ. При генерации на везикулах А\|/ отрицательного знака выход сахарозы реализуется через АрН. Существует быстрая (начальная) и релаксирующая фазы выхода сахарозы из везикул. Потенциал-зависимой является только начальная фаза. Релаксирующая фаза зависит от концентрации сахарозы во внешней среде. Кажущаяся константа транспорта (-Кт) сахарозы оказывается близкой к 5 мМ. Обе фазы ингибируются флоридзином.

Анализ содержания свободных БН-групп в везикулах ПМ с использованием блокатора транспорта сахарозы флоридзина свидетельствует об участии Ау в структурных перестройках, происходящих при транслокации мембраносвязан-ных переносчиков сахарозы.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты имеют значение для решения вопроса о функциональной роли мембранного потенциала в клетках высших растений. Обнаруженное усиление потенциал-зависимости работы Н+-АТФазы при холодовом закаливании растений вносит определенный вклад в

изучение механизмов регуляции работы данной ферментной системы при нахождении растений в режиме адаптации.

Положения, выносимые на защиту. Работа Н+-насоса (Н+-АТФазы) ПМ является одним из важных факторов стабилизации (автостабилизации) электроге-неза плазмалеммы растительных клеток, обеспечивающих надежность этого процесса в условиях физиологической нормы и при определенном отклонении от нее. Мембранный потенциал может выступать в качестве фактора, модулирующего гидролитическую активность Н+-АТФазы. Его влияние на работу фермента носит, по-видимому, организующий характер и тесно связано с конформацион-ной подвижностью фермента. Процедура холодового закаливания высших растений (на примере проростков озимой пшеницы) усиливает потенциал-зависимость гидролитической активности Н+-АТФазы. Вторичный активный транспорт сахарозы является электрогенным. Выход сахарозы из везикул происходит как при положительном («+» внутри инвертированных везикул), так и отрицательном значении А\|/ (в последнем случае реализация электрического градиента происходит через конверсию в АрН). Существует быстрая (начальная) и ре-лаксирующая фазы выхода из везикул сахарозы, причем потенциал-зависимой является только первая. Использование энергии Д\|/ в качестве движущей силы переноса сахарозы может реализовываться через конформационные изменения мембранных переносчиков.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 3 Всесоюзной конференции «Транспорт ассимилятов в растениях и проблема сахаронакопления» (Фрунзе, 1983), Международной конференции «Мембранный транспорт в растениях» (Прага, 1984), на 3 съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993), 3 ежегодном симпозиуме Российского общества физиологов растений «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), 2 Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1998), а также на региональных конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания объектов и методов исследования (2 глава), изложения полученных результатов и их обсуждения(3-5 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 7 таблиц, список литературы включает 230 названий, из которых 139 иностранных.

Глава 1. ПОТЕНЦИАЛ ПОКОЯ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ЕГО

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ

1.1. Природа потенциала покоя клеток высших растений

К настоящему времени потенциал покоя исследован в наибольшей степени на животных клетках. Известно, что Emr животных клеток составляет до 100 мВ и может рассматриваться как алгебраическая сумма пассивной и активной составляющих . Пассивная компонента (Е0) формируется за счет диффузии ионов (в основном К1") и составляет более 50% от общей величины Emr. Активная (метаболическая) компонента (ЕР) возникает в основном за счет разделения зарядов при работе Ма+,К*-АТФазы. (Ohki, 1985).

Потенциал покоя клеток высших растений также имеет комплексную природу, связанную как с наличием двух составляющих Emr (ED и ЕР), так и со строением растительной клетки, различные мембранные структуры которой характеризуются собственными электрическими свойствами. К основным по-тенциалобразующим элементам растительной клетки можно отнести клеточную стенку, плазмалемму и тонопласт. Оценка электрических свойств митохондрий и хпоропластов представляет значительные методические трудности. Мало известно об электрических свойствах ядра и ряда других клеточных структур (Опритов и др., 1991).

Потенциал покоя клеточной стенки, измеренный с помощью микроэлектродов, составляет для высших растений величину порядка -20 -г -30 мВ (Chedhomme, Roña, 1988), причем известно, что вклад данного потенциала в общий измеряемый Emr клетки тем больше, чем плотнее контакт клеточной стенки и плазмалеммы (Юрин и др., 1977). Считают, что основной вклад в измеряемый Emr клетки вносит потенциал плазмалеммы. Величина его у высших растений нередко составляет около -130 4- -150 мВ (Etherton, Higinbotham, 1960; Вахмистров и др., 1974; Кларксон, 1978; Chedhomme, Roña, 1988; Опритов и

др., 1S91). Потенциал плазмалеммы, так же, как и клеточной стенки, имеет знак «-» относительно внешней среды. Результаты измерений потенциала то-нопласта показывают, что он имеет знак «+» по отношению к цитоплазме и составляет по данным микроэлектродных измерений 5 -н 20 мВ для изолированных вакуолей или 30 4- 40 мВ для интактных клеток (Bates et al., 1982; Ched-homme, Rona, 1988).

Уравнение для измерения Emr имеет вид :

Emr = Et rs /( rs+ Rt) + Epm ars /( ors + Rpm),

где Et и Epm - потенциалы покоя тонопласта и плазмалеммы соответственно, Rt - сопротивление тонопласта, Rpm - сопротивление плазмалеммы, rs - сопротивление шунта утечки, введенного электродом через мембрану, а - коэффициент, отличающий сопротивление шунта через плазмалемму от сопротивления шунта через тонопласт (Bates et al., 1982). Таким образом, Emr представляет из себя алгебраическую сумму потенциалов плазмалеммы и тонопласта и всегда отрицателен по знаку вследствие меньших величин потенциала тонопласта.

Растительные клетки отличаются высокими значениями потенциала покоя (средние величины порядка -150 мВ, а у зеленых клеток водных растений до -250 мВ и выше ( Новак, Иванкина, 1977)). Столь высокие величины потенциала покоя растительных клеток создаются благодаря значительному вкладу его метаболической компоненты ЕР (Опритов и др., 1991). Эти особенности величин Ер и Emr в целом у растений связаны, видимо, с тем, что функционирование растительных клеток в большей степени подвержено влиянию условий внешней среды. И именно такие высокие величины Emr (обусловленные в большей мере активной компонентой) необходимы растению для регуляции и поддержания напряженного режима работы клеток (см. Раздел 1.2).

1.1.1. Особенности потенциала покоя плазмалеммы

Наибольший интерес при исследовании Emr клетки вызывает потенциал плазмалеммы. И не только потому, что по величине он часто близок к клеточному. Этому потенциалу должна принадлежать особая роль. По сути дела ПМ -

это основной барьер, отделяющий клетку от внешней среды. Плазмалемма осуществляет функции обмена веществ, здесь происходят многочисленные транспортные процессы, работает большое количество мембраносвязанных ферментов и т.д.

В наибольшей мере исследован мембранный потенциал плазмалеммы животных клеток (Ohki, 1985). Потенциал покоя крупных клеток харовых водорослей, измеренный как скачок потенциала на границе клеточной стенки и цитоплазмы, при введении микроэлектрода составил примерно -80 -100 мВ (Воробьев и др., 1967; Воробьёв, 1970). В клетках высших растений методически трудно осуществить точную оценку Ерт ввиду малого размера клеток, а также очень тонкого слоя цитоплазмы между плазмалеммой и тонопластом. Поэтому для оценки потенциала плазмалеммы приходилось применять специальные приемы исследования. Среди первых работ по измерению потенциала плазмалеммы были исследования, выполненные Этертоном и Хигинботамом на невакуолизированных клетках молодых корневых волосков Avena (Etherton, Higinbotham, 1960). Полученные ими данные показали, что мембранный потенциал клетки определяется главным образом потенциалом плазмалеммы. Для более точного определения потенциала плазмалеммы применяли также прием центрифугирования, в результате чего цитоплазма скапливалась в одной из частей клетки, где и можно было применить введение микроэлектродов (Goldsmith, Cleland, 1978) и др. Исследования, выполненные на колеоптилях овса, показывают, что величина Ерт зависит от характера «прокола» клетки микроэлектродом. Emr имеет значительную величину, когда «прокол» не затрагивает тонопласт и снижается в обратном случае ( Bates et al., 1982 ).

Исследования потенциала плазмалеммы проводятся также и с помощью флуоресцентных зондов как на целых клетках, так и на изолированных везикулах ПМ (данная модель особенно удобна, т.к. не осложнена другими структурами клетки и позволяет проводить оценку А\|/ только на ПМ). Определяя изменение интенсивности флуоресценции (1фл) зондов при изменении потенциала, переводят относительные единицы 1фл в мВ. Однако, не всегда однозначно можно интерпретировать результаты таких измерений. Некоторые зонды обна-

руживают чувствительность к поверхностному потенциалу, при использовании на целых клетках ряд зондов может вызвать деполяризацию ПМ, отмечается токсическое действие некоторых зондов (особенно катионов) на клетку (Добрецов, 1989). Тем не менее часто данный метод является единственно возможным для оценки потенциала плазмалеммы и достаточно успешно применяется при тщательном подходе к выбору зонда.

1.1.2. Природа пассивной компоненты потенциала покоя

Пассивная (диффузионная) компонента потенциала покоя Е0 определяется концентрационными градиентами переносимых через мембрану ионов и соответствующими коэффициентами их проницаемости. Е0 клеток высших растений связан в основном с потоками ионов К\ Na+ и СГ через плазматическую мембрану.

Существуют различные механизмы пассивного переноса ионов через мембрану. Ионы могут диффундировать через гидрофильные поры в ПМ (Кагава, 1985), при участии переносчиков, а также по каналам. Известны процессы К7Н+, Na+/H+, Са++/Н+ - антипорта, Н+/СГ -симпорта на различных растительных мембранах (Hager, Hermsdorf, 1981; Bennet, Spanswick, 1983; Sze, 1985; Андреев и др., 1989). Наиболее совершенной структурой, осуществляющей пассивный перенос ионов, считаются каналы (Terlau, Stuhmer, 1998). Они отличаются большой селективностью и скоростью переноса, причем каналы, специфичные к одному и тому же иону могут различаться между собой по структурным и функциональным характеристикам (Соколик, Юрин, 1981; Hedrich, Neher, 1987; Lew, 1991). На различных мембранах растительных клеток показано наличие калиевых, (Соколик, Юрин, 1981; Азимов и др., 1987; li-jima, Hagiwara, 1987; Schauf, Wilson, 1987; Moran et al., 1988; Hedrich, Schroder, 1989; Blatt, 1990; Vogelzang, Prins, 1994; Hedrich et at., 1995), кальциевых (Lunevsky et al., 1983; Берестовский и др., 1987; Allen, Sanders, 1994; Pineros, Tester, 1995; Ward et al., 1995) и анионных ( Lunevsky et al., 1983; Kataev et al., 1984; Берестовский и др., 1987; Schauf, Wilson, 1987; Катаев и др., 1988; Hedrich, Schroeder, 1989; Kelleretal., 1989; Schmidt, Schroeder, 1994) каналов.

Расчет Ed для клеток растений проводят по уравнению Гольдмана-Ходжкина-Хаксли:

RT РкКГ + PNa[Na+]0Ut + Pci[Crf ED= — In--

F Рк[КТ + PNa[Na+]'n + Pc,[СГ]'

«lOUt

где PK, PNa и PCi - коэффициенты проницаемости для К1", Na+ и Cl соответственно, [\С]Ш, [Na]out и [CI]0Ut - концентрации этих ионов снаружи, [\Cf, [Na+f и [СГ]'П - концентрации внутри клетки. Из данного уравнения понятно, что Е0 определяется распределением ионов К1", Na+ и СГ внутри клетки и во внешней среде и зависит от их коэффициента проницаемости ( при необходимости в уравнение Гольдмана вводятся дополнительные члены, когда в среде в большом количестве присутствуют другие ионы). Рассчитанный по уравнению Гольдмана коэффициент проницаемости К" для мембран растений составляет 10'8 + 10"6 см с1 (Sze, Hodges, 1976; Рубин, 1987 ). Внутриклеточная концентрация К* у высших растений составляет порядка 100 мМ и является весьма лабильной в зависимости от функционального состояния, возраста клеток и т.д. (Higinbotham et al., 1967; Katou, Okamoto, 1970; Вахмистров и др., 1974; Оп-ритов и др., 1991 ). Величина Рк является наибольшей в сравнении с другими ионами, что позволяет считать \С основным потенциалобразующим ионом. \С-проницаемость ПМ зависит от ряда факторов. Так, на Рк, а следовательно и на Ed значительное влияние оказывают ионы Са++. Известно, что Са++ воздействует на структурно-функциональное состояние плазматических мембран - в присутствии Са++ меняется величина заряда мембранной поверхности, текучесть липидного матрикса (Quinn, 1981 ) и т.д. Было показано, что в присутствии ионов Са++ Рк снижается ( Ока et al., 1987). Кроме ионов Са++ на РК может также оказывать влияние температура (Александров, 1985; Пятыгин, Опритов, 1987 ) и другие факторы, влияющие на изменение пассивной проницаемости мембраны.

Относительная проницаемость Риа/Рк У рэстении по данным различных исследователей варьирует от 0,68 (Higinbotham et al., 1970) до 0,06 (Blatt, 1987). Несмотря на наличие данных, показывающих иногда существенные величины PNa, реальный вклад Na+ в Е0 не должен быть значителен, поскольку в клетках растений отсутствует K+/Na+ - асимметрия, свойственная животным клеткам.

Более заметную роль в составе пассивной компоненты потенциала покоя должен играть ион СГ. Концентрация его в растительных клетках может достигать значительных величин - до 100 мМ (Marschrier, 1986). Хотя РС| меньше Рк, все же по данным ряда исследователей он составляет весьма значимую величину (Higinbotham et al., 1970; Sze, Hodges, 1976; Корзун, Саляев, 1984; Ретивин, Опритов, 1986). Видимо, ионам СГ в растительных клетках принадлежит роль основного противоиона К\ из чего следует важность оценки потоков СГ для характеристики ED (Clarkson, Hanson, 1980; Новак, Якимов, 1987, Воробьев, 1988).

1.1.3. Природа активной компоненты потенциала покоя

Как было отмечено выше, растениям присущи не только более высокие значения потенциала покоя (в отличие от животных), но и значительно больший вклад активной (метаболической) компоненты в общую величину Emr. Высокие значения Ер и Emr связаны со спецификой работы электрогенных транспортных систем у растительных клеток. Источником энергии для работы таких систем могут быть не только митохондриальное дыхание, но и фотосинтез. У клеток нефотосинтезирующих тканей практически весь Ер связан с митохонд-риальным дыханием (темновая метаболическая компонента). Об этом свидетельствуют, например, данные по влиянию цианида на Етг и активность дыхания (Higinbotham et al., 1970), а также корреляция темнового Ер с внутриклеточным содержанием АТФ (Lew, Spanswick, 1984; Reid et al, 1985). Ряд исследований указывает на связь темнового Ер с функционированием на плазма-лемме электронтранспортной цепи (ЭТЦ) ( Ivankina, Novak, 1988). Следует отметить, что на поддержание достаточно высоких значений Ер в растительных

клетках расходуется сравнительно небольшой процент энергии метаболизма. Так, для эпидермальных клеток корня кукурузы эта цифра составляет порядка 3,5 % . В клетках фотосинтезирующих тканей на свету основной вклад в Ер вносит фотоиндуцированная метаболическая компонента. Об этом свидетельствуют, например, данные, полученные с помощью ингибиторного анализа (Новак, Иванкина, 1977; Dahse et al., 1987; Опритов и др., 1991).

Высокие значения величины Ер в клетках растений связано не только с более сложными по происхождению источниками энергии для работы электрогенных насосов, но и с мощностью самих насосов, а также с природой ионов, которые принимают участие в формировании метаболической компоненты потенциала покоя. Так, Ер растительных клеток связывают преимущественно с транспортом ионов Н+ через ПМ, проницаемость мембран для которых низка, что обусловливает меньшую величину возможной диссипации Ер по сравнению с животными клетками (Опритов и др., 1991).

Основной и наиболее мощной системой, участвующей в формировании Ер считают электрогенную Н+-АТФазу ПМ. К настоящему времени достаточно хорошо изучены ее свойства, ведутся исследования молекулярного строения (Палладина, 1983; Sze, 1985; Воробьев, 1988; Serrano, 1989; Palmgren, 1994; Frias et al., 1996 ). Исследования АТФ-зависимой генерации электрического потенциала проводились как на везикулах ПМ (Калинин и др., 1979; Sze, Churchill, 1981; Калинин и др., 1982; Педченко, Палладина, 1986; Гайворонская и др., 1987б"), так и на протеолипосомах с встроенной в них АТФазой (O'Neill, Spanswick, 1984). Доказательства того, что именно электрогенный транспорт Н+, осуществляемый Н+-насосом, формирует в основном Ер, получены в экспериментах по сравнению действия на мембранный потенциал клеток in vivo КЦХФГ и азида натрия (Felle, 1981; Lew, Spanswick, 1984 ). Об этом свидетельствуют также данные ингибиторного анализа, позволяющие заключить, что Н+-АТФаза ПМ играет определяющую роль в формировании Ер.( Опритов и др., 1991).

Помимо Н+-насоса, представленного Н+-АТФазой, определенный вклад в Ер может вносить ЭТЦ, также осуществляющая электрогенный перенос Н+ через ПМ. Об этом свидетельствует ряд проведенных исследований (Новак, Иванкина, 1977, . , Ivankina, Novak, 1988 ). Однако, существуют крайние точки зрения на эту проблему. Ряд исследователей указывает на то, что вклад ЭТЦ в Emr практически полностью соответствует Ер (Новак, Иванкина, 1978, Ivankina, Novak, 1988). Другая точка зрения состоит в том, что ЭТЦ совсем не участвует в электрогенном транспорте Н+ через ПМ, формирующем Ер ( Marre et al., 1988 ). Поэтому решение данного вопроса связано с дальнейшими исследованиями ЭТЦ ПМ.

Наряду с Н+-АТФазой и ЭТЦ ПМ в формировании Ер может, вероятно, участвовать и Са++-АТФаза (Тихая и др., 1985; Zocchi, Hanson, 1983; Evans et al., 1994 ). Однако, влияние Са++, видимо, в большей степени связано с его способностью к регуляции активности Н+-насоса . Поэтому достаточно трудно оценить вклад Са++-АТФазы в Ер. Неясным остается вопрос и об участии в формировании Ер СГнасоса, представленного по некоторым данным соответствующей АТФазой (Goldfarb et al., 1984 ).

Как уже отмечалось выше, в генерацию потенциала покоя кроме плаз-малеммы определенный вклад вносит и тонопласт. На тонопласте выявлены две основные электрогенные системы - Н+-пирофосфатаза и Н+-АТФаза, причем Н+-АТФаза отличается по ряду свойств от соответствующего фермента ПМ ( Williams et al., 1990 ). Транспортируя ионы Н+ в вакуоль, данные ферментные системы формируют потенциал тонопласта (со знаком «+» внутри). Несмотря на незначительную величину потенциала тонопласта, вклад его Emr как правило учитывается.

Метаболическую компоненту Етг отличает высокая лабильность, т.е. способность реагировать на изменение ряда физических и химических факторов. Это в первую очередь действие температуры, светового фактора, фитогормо-нов и др. Такая высокая лабильность метаболической компоненты потенциала покоя, видимо, играет роль в регуляторных, приспособительных механизмах

клетки, позволяя адекватно реагировать на изменения условий окружающей среды (Опритов и др., 1991).

1.2. Роль потенциала покоя в функциональной активности плазмалеммы

Несмотря на возросшее число исследований, посвященных выяснению роли потенциала покоя в функционировании плазмалеммы клеток высших растений, этот вопрос пока еще остается мало изученным. Электрогенез высших растений, и в частности потенциал покоя, связан с более мощными (по сравнению с животными клетками) ионными процессами, в основном метаболическими по своей природе. Известно, что метаболические процессы отличаются своей лабильностью и способностью к саморегуляции. Видимо, большие величины потенциала покоя и его высокий уровень связи с метаболическими процессами вызваны той особой ролью, которую играет электрогенез в жизнедеятельности растений.

Известно, что растительные клетки более подвержены влиянию условий внешней среды по сравнению с животными клетками. О важности в этих условиях процессов электрогенеза свидетельствуют большие величины напряженности электрического поля на ПМ (средние значения напряженности оцениваются в пределах ~ 105 В/см ) (Конев, Калер, 1988; Чизмаджев, Пастушенко, 1989).

При рассмотрении роли Етг в функциональной активности плазмалеммы важно учитывать следующие его особенности: 1) непосредственную связь с мембранными структурами, в том числе с плазмалеммой; 2) векторный характер потенциала покоя; 3) его делокализованность по мембране; 4) сложность механизмов генерации; 5) чувствительность к влиянию внешних и внутренних факторов (Опритов и др., 1991). Таким образом, потенциал покоя должен определять условия протекания мембраноэависимых процессов, иными словами, основной его функцией считается управляющая. Можно выделить несколько направлений осуществления данной функции. 1). Роль потенциала покоя как

энергетического фактора, когда электрическая форма энергии может расходоваться на протекание каких-либо процессов: при пассивном транспорте ионов Emr может замедлять или ускорять движение через каналы (Uribe, Lüttge, 1984; Опритов и др., 1991), отмечается роль мембранного потенциала как кинетического фактора, контролирующего транспорт N03" через мембрану (Menarg, Blatt, 1995), при вторичном активном транспорте по градиенту Етг осуществляется движение заряженного комплекса протонированного переносчика с веществом (Калинин, Опритов, 1989; Bush, 1990; Опритов и др., 1991; Buckhout, 1994), и др. 2). Регуляторная роль потенциала покоя, связанная с его влиянием на структурные особенности мембраны (Конев, 1987; Конев, Калер, 1988; Terlau, Stuhmer, 1998). 3). Участие Emr в процессах морфогенеза, связанное с поляризацией клеток и тканей и возникновением электрических полей, которые в значительной степени определяют процессы роста и развития (Bentrup, 1985; Goldsworthy, 1986; Медведев, 1996). 4). Защитная роль потенциала покоя, когда изменение Emr рассматривается как наиболее раннее звено в развитии синдрома адаптации у высших растений (Пятыгин, Опритов, 1992; Опритов и др., 1993; Ретивин и др., 1997).

1.2.1. Потенциал покоя и физико-химическое состояние плазмалеммы

Для установления влияния потенциала покоя на физико-химическое состояние ПМ проводятся эксперименты как на растениях in vivo, так и на модельных мембранных структурах, на которые накладывают искусственно созданную разность потенциалов с помощью источника напряжения или путем формирования ^-диффузионного потенциала (О"Shea et al., 1984а).

Влияние потенциала покоя на физико-химическое состояние плазма-леммы связано прежде всего с высокими значениями напряженности электрического поля на ПМ (McCaid, Zhao, 1997). Электрическое поле может непосредственно влиять на молекулы белков и липидов, входящих в состав мембраны, поскольку данные молекулы или отдельные их участки могут обладать диполь-ным моментом. Считается, что существует два основных способа влияния потенциала покоя на структуру биомембран (Конев, 1987; Конев, Калер, 1988).

Это прямое влияние на мембранные белки и липидный бислой и опосредованное - на белки и белок-белковые взаимодействия через модификацию липид-ного бислоя. Прямое влияние на белки и их комплексы может проявляться через изменение их ориентации, в также путем сдвигов в конфигурации функционально-значимых центров (Конев, Калер, 1988; Гладышева и др., 1989; Tsong et al., 1989). Влияние потенциала покоя на липидный бислой плазматических мембран может осуществляться путем изменения микровязкости липидов, а также через явление электрострикции. При увеличении Emr микровязкость липидов возрастает, причем этот процесс идет нелинейно. С увеличением величины Emr (особенно при значениях больше 120 мВ) усиливается крутизна этой зависимости (О'Shea et al., 1984а,б). Следует отметить, что влияние потенциала покоя на микровязкость липидов является неспецифичным, также неспецифичной является и электрострикция (электромеханическое сжатие мембраны, связанное с высокими напряженностями электрического поля (Beilby, Coster, 1980; Ивков, Берестовский, 1981; Пасечник, 1982; Конев, 1987)). Более специфичным является действие Етг на конформацию белковых молекул и их ориентацию в мембране (Конев, 1987). Опосредованное влияние потенциала покоя может проявляться, например, через регуляцию упорядоченности липидно-го бислоя, что повышает эффективность белок-белковых взаимодействий (Конев, Калер, 1988). Однако, в большинстве случаев бывает трудно отличить непосредственное влияние потенциала покоя на белковые системы от его влияния на эти системы опосредованно через изменение липидного матрикса.

Потенциал покоя, будучи связанным по своей природе с мембраной, может не только оказывать непосредственное влияние на ее физико-химическое состояние, но и, в свою очередь, сам зависит от свойств и состояния мембран. Клеточные мембраны отличаются высокой лабильностью своей структуры, т.е. способностью претерпевать различные структурные перестройки при действии внешних и внутренних факторов (Конев, Волотовский, 1977; Конев, 1987). Эти перестройки естественно касаются и систем пассивного и активного транспорта ионов, что, в свою очередь, непосредственно отражается на электрической активности клеток (Антонов, 1982; Болдырев, 1985). Так, в нашей лаборатории исследована роль структурных перестроек в ПМ в регуляции потенциала покоя

при действии температурного фактора (Опритов и др, 1984а; Пятыгин, Опри-тов, 1987; Пятыгин и др., 1989; Опритов и др., 1991). В результате было показано, что структурные изменения в мембранных липидах могут через активность Н+-АТФазы влиять на мембранный потенциал. Изменение потенциала покоя клеток может быть также связано со структурными перестройками в белковых молекулах ПМ (Александров, 1985; Пятыгин, Опритов, 1987), с изменением рН среды, действием фитогормонов и др. (Конев, Волотовский, 1977; Конев, 1987; Singh, Amin, 1991).

Следует отметить, что влияние потенциала покоя на физико-химическое состояние мембран является одним из наиболее важных путей, посредством которых Етг может регулировать протекание многочисленных мембраносвязан-ных процессов.

1.2.2. Потенциал покоя как регулятор пассивной проницаемости плазма-леммы

Изменение физико-химического состояния плазматических мембран (в результате изменения микровязкости липидов, состояния белков и т.д.) отражается на функционировании систем пассивного и активного транспорта. Этот эффет можно назвать структурно-организующим. Пассивный транспорт может осуществляться различными способами. Наиболее известными в отношении потенциал-зависимости являются ионные каналы. Канальный транспорт зависит от энергетического профиля канала, определяемого его структурой. Под влиянием Emr происходит изменение структурного состояния канала. Изменяется его энергетический профиль и, следовательно, интенсивность транспорта. Потенциал-зависимость присуща различным ионным каналам. Наиболее хорошо изучены калиевые каналы (Соколик, Юрин, 1981; Moran et al. 1988; Грабов, 1991; Vogelzang, Prins, 1994; Hedrich et al., 1996; MacRobbie, 1998). Так, на плазмалемме клеток нителлы обнаружено два типа калиевых каналов: активируемых деполяризацией (Д-каналы) или гиперполяризацией (Г-каналы) (Соколик, Юрин, 1981). Сходный характер потенциал-зависимости обнаружен на моторных клетках самана (Moran et al., 1988). Вероятность перехода Г-

каналов в открытое состояние увеличивается у них с изменением потенциала с -70 до -180 мВ. Д-каналы открываются с большей вероятностью при потенциалах более положительных, чем -50 мВ. Потенциалзависимая активация Са++-каналов контролируется внутриклеточной концентрацией ц-АМФ (Берестовский и др., 1987; Жерелова, Грищенко, 1988). В клетках высших растений обнаружены и потенциалзависимые СГканалы (Schónkneht et al., 1988; Грабов, 1990; Lew, 1991)/ В опытах Берестовского показа-

на потенциалзависимость СГ -каналов, активируемых в ответ на деполяризацию (Берестовский и др., 1987). Изменение потенциала покоя непосредственно влияет на конформационное состояние белкового компонента мембраны, наиболее чувствительного к действию электрического поля (сенсора). Сенсор связан с частью канала, называемую воротами. Влияя на конформацию ворот, сенсор вызывает открывание или закрывание канала (Гелетюк, Казаченко,

1990). Изменение структурного состояния плазматических мембран под влиянием Emr сказывается также и на других механизмах пассивной проницаемости (кинковая проводимость, транспорт с участием переносчиков и др.). Однако экспериментальные данные здесь практически отсутствуют (Опритов и др.,

1991).

1.2.3. Потенциал покоя и работа первичных активных транспортных систем

Основной электрогенной первичной транспортной системой плазматических мембран клеток высших растений считают Н+-АТФазу. Изучению структурных особенностей, функциональной активности и регуляции данной системы посвящено в последние годы большое количество работ (Калинин и др., 1979; Sze, 1985; Slayman, 1987; Serrano, 1989; Briskin, 1990; Опритов и др., 1991; Опритов и др., 1994; Briskin et al., 1995; Michelet, Bonthry, 1995; Frias et al., 1996; Marra et al., 1996; Roberts, Beauge, 1997). Транспортные АТФазы, являясь электрогенными мембранными системами, участвуют в создании на плазматических мембранах градиента электрического потенциала. Высказываются предположения, что по принципу обратной связи мембранный потенциал может оказывать регулирующее влияние на работу АТФаз (Опритов и др., 1991).

Такие исследования уже проводились для Na+, К*"-АТФазы животных (De Weer et al., 1988). Было показано, что №+'К*-АТФаза под влиянием электрического поля может изменять конформацию из «калиевой» формы в «натриевую», использовать энергию поля для транспорта ионов без участия АТФ. Зависимость активности Ма+,К+-АТФазы от мембранного потенциала носит линейный характер, что свидетельствует о наличии в реакционном центре одной потенциал-зависимой стадии реакции (это конформационный переход между EiP (3Na+) и Е2Р (3 Na+), связанный с переносом трех ионов натрия через мембрану ) (De Weer et al., 1988). Предположения о возможности регуляции Н+ -АТФазы ПМ клеток высших растений с помощью потенциала покоя также имеются в литературе (Marre et al., 1988; Опритов и др., 1991; Briskin et al., 1995). Влияние мембранного потенциала на Н+-АТФазу, также как и на системы пассивного транспорта, может осуществляться двумя способами: 1) через изменение состояния липидов ПМ, которые играют важную роль в функционировании Н+-АТФазы (Дергунов и др., 1984; Kasamo, Yamanishi, 1991); 2) путем воздействия мембранного потенциала на конформационную подвижность Н+-АТФазы(Остроумов, Воробьев, 1976; Конев, Калер, 1988). При этом Д\|/ может менять ориентацию фермента, деформировать белковые молекулы, сдвигать равновесие между конформационными состояниями. Возможно также влияние на скорость самой ферментативной реакции.

Следует, однако, отметить, что пока только предположительно можно говорить об участии потенциала во всех формах активности Н+-АТФазы ПМ клеток высших растений.

1.2.4. Потенциал покоя и вторичный активный транспорт

Участие потенциала покоя в процессах вторичного активного транспорта веществ показано в большом количестве исследований (Kinraide, Etherton, 1980; Lichtner et al., 1981; Felle, 1983; De Bock, 1985; Калинин, Опритов, 1989; Bush, 1990; Delrotetal., 1990; Опритов и др., 1991; Buckhout, 1994). Считается, что потенциал покоя в данном случае может использоваться для движения че-

рез мембрану заряженного комплекса или, влияя на конформационное состояние переносчика, изменять его сродство к переносимому веществу и тем самым менять скорость транспорта. Участие Лу во вторичном активном транспорте может выражаться в диссипации электрического потенциала, которая регистрируется как деполяризация мембраны (Wright, Fisher, 1980; Lichtner, Spanswick, 1981; Kinraide et al., 1984; Reinhold, Kaplan, 1984; Lin, 1985; De Bock, 1985). Деполяризация не длится долго и сменяется реполяризацией, которая происходит, видимо, как за счет активации работы электрогенных транспортных систем, в первую очередь Н+-АТФазы, так и за счет некоторого компенсационного выхода IС из клеток. Несмотря на наличие ряда работ, посвященных роли К* в процессах первичного и вторичного активного транспорта (Delrot, 1981; Reinhold, Kaplan, 1984; Опритов и др., 1991; Пятыгин и др., 1994), характер взаимосвязи потоков этого иона с работой Н+-помпы и вторичными активными транспортными системами нельзя считать до конца раскрытым.

Для многих веществ, переносимых через плазмалемму с помощью систем вторичного активного транспорта, показано наличие переносчика (Ripp et al., 1988; Lemoine, Delrot, 1989; Калинин и др., 1991; Krämer, 1994). При этом транспортируемый комплекс вещество-переносчик имеет, как правило, положительный заряд благодаря протонированию. Протонирование, помимо смены заряда переносчика, по-видимому, является фактором, регулирующем также конформационное состояние переносчика, изменение его сродства к переносимому веществу (Delrot, 1981; Опритов и др., 1991). Так, удалось выделить из плазматических мембран полипептиды, являющиеся переносчиками (или компонентами переносчиков) сахарозы (Lemoine, Delrot, 1989; Калинин и др., 1991). Для переносчиков характерен высокий уровень специфичности (Felle, 1981). В осуществлении связи переносчика с веществом большое значение имеют, по-видимому, SH-группы ( Delrot, 1981; Lichtner et al., 1981; Lichtner, Spanswick, 1981).

Действие Emr на вторичный активный транспорт обусловлено, видимо, прежде всего его влиянием на конформационное состояние переносчика (Wright et al., 1986). Предварительные данные, полученные в нашей лабора-

тории, позволяют предполагать, что в составе переносчика в участке его связывания с переносимым веществом, имеются SH-группы, а сам процесс переноса связан с изменением конформационного состояния транспортера (Опритов и др., 1991).

В последние годы, наряду с моделью транспорта веществ с помощью движущихся в мембране переносчиков, получили также распространение представления о несколько ином способе вторичного активного тарснпорта, согласно которым переносчик - это интегральный белок, полипептидная цепь которого несколько раз перешнуровывает мембрану (Опритов и др., 1991; Kramer, 1994). Часть полипептидной цепи при этом образует гидрофильный канал, а ряд сегментов выступает над мембраной как с внутренней, так и с наружной стороны. Меняя свое конформационное состояние, такой переносчик может транспортировать вещество с одной стороны мембраны на другую. Такой принцип работы описан, например, для переносчика глюкозы в эритроцитах человека (Walmsley, 1988).

Помимо прямого участия потенциала покоя как энергетического фактора в процессе вторичного активного транспорта веществ и непосредственного действия на белковый переносчик, не следует также исключать также влияния Етг через изменения в состоянии липидного окружения транспортера. Такие предположения высказываются рядом исследователей (Остроумов, Воробьев, 1976; Конев, Калер, 1988; Опритов и др., 1991).

Как показали эксперименты на изолированных везикулах ПМ, в процессах вторичного активного транспорта через плазмалемму могут принимать участие как пассивная, так и активная составляющие мембранного потенциала (Калинин, Опритов, 1989; Опритов и др., 1991). Во фракции изолированных везикул плазмалеммы клеток флоэмы борщевика транспорт сахарозы поддерживался и в отсутствии АТФ (в качестве движущей силы выступал \С-диффузионный потенциал, создаваемый на мембране с помощью \С и валино-мицина) (Калинин, Опритов, 1989).

In vivo несомненно основной вклад во вторичный активный транспорт должна вносить метаболическая компонента мембранного потенциала (формируемая в основном за счет работы Н+-АТФазы), которая является его наиболее лабильной частью, реагирующей на изменение внешних условий среды (Reinhold, Kaplan, 1984).

Метаболическая составляющая мембранного потенциала, формирующаяся в основном за счет работы Н+-АТФазы, является частью электрохимического градиента протона, который, наряду с электрической (А\|/), имеет и химическую (АрН) компоненту. Поэтому одним из важных вопросов является выяснение соотношения данных компонент во вторичном активном транспорте. Согласно концепции Митчела, в энергетическом плане обе компоненты должны быть равноценны во вторичном активном транспорте. Данное положение подтверждается экспериментально в опытах по искусственному созданию на везикулах Avj/ и АрН (Калинин, Опритов, 1989). Однако, в разных условиях влияние этих составляющих может проявляться по разному. Например, важна не только величина АрН, но и абсолютные значения pH внутри и снаружи везикул. При этом может превалировать либо А у, либо АрН (Калинин, Опритов, 1989). Для А\|/ можно также предположить существование неких пороговых значений, определяющих влияние мембранного потенциала на вторичный активный транспорт. Об этом свидетельствуют данные по влиянию Emr на конформационное состояние переносчика, где потенциал может выполнять структурно-организующую функцию ( Опритов и др., 1991).

В литературе обсуждается также вопрос об участии А у в процессах передвижения веществ на далекие расстояния, в частности, в передвижении ас-симилятов по флоэме (Опритов и др., 1991). Об этом свидетельствуют опыты с применением слабых электрических токов, а также приема шунтирования. Для объяснения механизмов участия мембранного потенциала в процессах дальнего транспорта веществ рядом исследователей была привлечена электроосмотическая концепция, которая, однако, в дальнейшем, не получила подтверждения (MacRobbie, 1977).

Несмотря на значительное количество публикаций, посвященных изучению процессов вторичного активного транспорта, для окончательного решения вопроса об основных принципах работы данных систем и, в частности, влияния на них мембранного потенциала, необходимо дальнейшее проведение исследований.

1.2.5. Роль потенциала покоя в работе мембраносвязанных ферментов

Потенциал покоя, являясь неотъемлемой частью нормального состояния плазматических мембран, должен оказывать влияние не только на работу систем первичного и вторичного активного транспорта, но и на функционирование мембраносвязанных ферментов. Действительно, существуют данные, свидетельствующие о таком влиянии. Опытами, проведенными на метаболизирую-щих клетках ацетобакгерий, было доказано, что интенсивность синтеза целлюлозы зависит от величины мембранного потенциала, полностью затормаживаясь при его исчезновении (Ре1тег а1., 1982). На везикулах, выделенных из волокон семян хлопчатника, показано, что создание на мембране \С-диффузионного потенциала с полярностью, соответствующей нативной, вызывает 4-12-кратное увеличение активности (3-глюкансинтазы с возрастанием величины Етг (Васю, Ое1тег, 1981). Известно, что активность данного фермента достаточно сильно регулируется состоянием липидного окружения, а зависимость микровязкости липидов от мембранного потенциала уже (как было отмечено выше) показана для плазматических мембран (Опритов и др., 1991). В ряде исследований отмечается зависимость между уровнем мембранного потенциала и синтезом полисахаридов в растительных клетках (Великанов и др., 1997; Великанов и др., 1998).

Можно также предполагать аналогическое действие мембранного потенциала и на другие ферментные системы плазмалеммы, но экспериментальные данные по этому вопросу практически отсутствуют.

Кроме отмеченного выше влияния мембранного потенциала на различные аспекты функциональной активности плазмалеммы, можно привести еще

ряд примеров, подтверждающих значительную роль Emr (A\j/) в данной активности.

В первую очередь, это касается действия фитогормонов. Известно, что фитогормоны оказывают влияние на электрическую полярность плазмалеммы через действие на системы первичного активного транспорта (в основном через Н+-АТФазу). Действие это в качестве важного этапа предполагает изменение электрохимического градиента протона, причем именно электрической его части придается особое значение. Поэтому было высказано предположение, что и величина электрической полярности в свою очередь может влиять на характер действия фитогормонов (Максимов, 1989 ), что может быть связано с разным исходным состоянием электрогенных транспортных систем.

В заключение необходимо отметить особую значимость мембранного потенциала в процессах морфогенеза, а также широко обсуждаемую в последнее время защитную роль Emr.

Мембранный потенциал, поляризуя клетки и ткани, приводит к образованию на них электрических полей. Эти поля рассматриваются рядом исследователей как некая матрица, которая определяет весь ход морфогенеза клеток и тканей (Bentrup, 1985; Медведев, 1996).

Что касается защитной роли мембранного потенциала, в последнее время успешно разрабатывается концепция, согласно которой изменения мембранного потенциала составляют одно из наиболее ранних звеньев в развитии синдрома адаптации (Пятыгин, Опритов, 1992; Опритов и др., 1993; Опритов и др., 1994; Пятыгин и др., 1996). Поскольку под контролем мембранного потенциала находится работа значительного числа мембраносвязанных систем, возрастание его величины на фазе адаптивной реполяризации при действии неблагоприятных факторов должно способствовать восстановлению различных мембранных функций.

Все вышесказанное позволяет сделать заключение о том, что мембранный потенциал, определяя во многом физико-химическое состояние плазма-

леммы, играет роль управляющего фактора в работе многих мембраносвязанных систем (каналы, рецепторы, системы первичного и вторичного активного транспорта и др.). Однако, многие механизмы участия мембранного потенциала в функциональной активности плазмалеммы остаются до сих пор не ясными и требуют дальнейших экспериментальных исследований.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Орлова, Ольга Валентиновна

выводы

1.Установлено, что одним из ведущих и, по-видимому, наиболее оперативных факторов стабилизации электрогенеза на ПМ растений, является работа АТФ-зависимого Н+-насоса (представленного Н+-АТФазой). Непосредственное участие Н+-насоса в осуществлении электрогенеза в качестве одного из его механизмов позволяет рассматривать обнаруженный феномен стабилизации как автостабилизацию.

2. Впервые экспериментально показано, что Д\|/ может выступать в качестве фактора, модулирующего гидролитическую активность Н+ -АТФазы в плазматических мембранах растений. Модулирующее влияние Ду проявлялось преимущественно на начальных этапах реакции и обнаруживало тесную связь с конформационнной подвижностью Н+-АТФазы, которую изменяли путем понижения температуры. Сформулированы представления об организующем характере влияния мембранного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы.

3. Обнаружено, что процедура холодового закаливания растений на примере озимой пшеницы усиливает зависимость гидролитической активности Н+ -АТФазы от Предположено, что усиление потенциал-зависимости работы данного фермента является одной из приспособительных мер защиты от угнетающего влияния холодового фактора.

4. При исследовании биоэлектрических реакций частично изолированных проводящих тканей зарегистрирован эффект деполяризации при введении в среду сахарозы, что свидетельствует об ее потенциал-зависимом транспорте. На использование энергии электрического градиента в транспорте сахарозы непосредственно указывает факт диссипации обеих форм Ду («""-диффузионной и АТФ-зависимой) при наличии в везикулах сахарозы по сравнению с везикулами, загруженными маннитом.

5. С использованием метода ультрафильтрации в сочетании с радиометрическим методом установлено усиление выхода 14С- сахарозы из везикул под влиянием мембранного потенциала разного знака. Отрицательный потенциал («-» внутри инвертированных везикул) оказывал значительно меньшее влияние и проявлял его через конверсию в АрН.

6. Исследование кинетики индуцированного Ду экспорта сахарозы из везикул методом турбидиметрии позволило выявить 2 фазы: быструю - потенциал-зависимую и последующую, более медленную - релаксирующую, которая такой зависимости не проявляла. Установлено, что изменение содержания сахарозы во внешней среде оказывало влияние только на релаксирующую фазу. Определена кажущаяся константа (-Кт) транспорта сахарозы в везикулах (~5 мМ).

7. Анализ содержания свободных ЭН-групп в везикулах ПМ с использованием блокатора транспорта сахарозы флоридзина свидетельствует об участии мембранного потенциала в структурных перестройках, происходящих при транслокации мембраносвязанных переносчиков сахарозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в работе получены данные, указывающие на возможность прямого участия Д\|/ в функционировании первичных и вторичных систем активного транспорта в плазматических мембранах клеток высших растений. В то же время, результаты проведенных исследований свидетельствуют и об участии основной первичной транспортной системы ПМ - Н+-АТФазы в стабилизации электрогенеза растительных клеток.

Анализируя стабилизирующее влияние Н+-насоса, представленного Н+-АТФазой, на Дц/ клеток растений, следует учитывать, прежде всего, представления об эквивалентной электрической цепи ПМ, в которой элементы, соответствующие системам пассивного и активного транспорта ионов, соединены не последовательно, а параллельно (Опритов и др., 1991). В этом случае возникающий Д\|/ не сводится к простой сумме ЭДС насоса и ЭДС систем пассивного транспорта ионов.

Для понимания стабилизирующей роли Н+-насоса в электрогенезе существенными являются также сведения о том, что его работа, приводя к генерации ДуР, оказывает определенное влияние и на трансмембранное распределение ионов (прежде всего, К*), участвующих в возникновении пассивной компоненты мембранного потенциала {С|Ьга1 е! а1., 1990; Опритов и др, 1991; М1сИе1е1, Во1Лгу, 1995). Это влияние (при участии Д\|/Р) на пассивный транспорт ионов может осуществляться как непосредственно (Опритов и др., 1991), так и, вероятно, через усиление стрикционного эффекта на липидный матрикс ПМ, вследствие чего происходит снижение ионной проницаемости мембраны (Конев, 1987; Опритов и др., 1991).

Стабилизирующая роль АТФ-зависимого Н+-насоса в электрогенезе во многом обусловлена тем, что работа этого насоса позволяет компенсировать влияние на Ду фактора утечки ионов через ПМ по электрохимическому градиенту. Это дает основания полагать, что Н+-насос ПМ работает, вероятно, в режиме некоторой функциональной избыточности, которая и является необходимым условием поддержания постоянства величины не только A\j/P, но и интегрального А\у. В то же время, не вызывает сомнений, что такая функциональная избыточность не бесконтрольна, и, в частности, может по принципу обратной связи быть детерминирована величиной возникающего потенциала (Slayman, 1987; Опритов и др. , 1991).

Полученные результаты по исследованию стабилизирующего влияния Н+-АТФазы на мембранный потенциал расширяют известные представления о возможных аспектах участия АТФ-зависимого Н+-насоса в электрогенезе ПМ клеток высших растений. До сих пор это участие связывали, главным образом, с возникновением значительной метаболической компоненты А\\i, чувствительной к различного рода модулирующим воздействиям, а также, по некоторым последним данным (Опритов и др., 1991; Fromm, Spanswick, 1993; Trebacz et al., 1994), с механизмом генерации распространяющихся потенциалов действия. Роль насоса в стабилизации величины Д\[/ на ПМ клеток, показанная в наших экспериментах, особенно важна в условиях, когда пассивный транспорт ионов к возникновению стабильного во времени А у не приводит. При этом следует отметить то обстоятельство, что стабилизирующую роль играет система, непосредственно участвующая в самом процессе электрогенеза ПМ. Тем самым, можно говорить о существовании вполне определенного механизма автостабилизации этого процесса, а также рассматривать ее в качестве первичной меры предотвращения нежелательных изменений величины А\|/. С выдвинутыми нами положениями согласуются данные ряда авторов о том, что уменьшение доли пассивной компоненты в составе Ау клеток высших растений, вызванное влиянием некоторых условий (увеличением внеклеточной концентрации К\ инфицированием патогенными микробами Phytophtora), может сопровождаться возрастанием доли А\|/Р, приводящим к сохранению относительного постоянства величины А\|/ (Tomiyama et al., 1983; Kojima et al., 1985).

Рассматривая стабилизацию электрогенеза Н+-АТФазой как автостабилизацию, можно полагать, что и сам A\j/ по принципу обратной связи должен оказывать влияние на функционирование Н+-АТФазы.

Исследование влияния индуцированного валиномицином \С-диффузионного потенциала на гидролитическую активность Н+-АТФазы показало наличие эффекта потенциал-зависимости, проявляющегося в стимуляции реакции гидролиза АТФ в ряду значений потенциала, равных 0, 41 и 87 мВ. При этом следует отметить, что данные эти были получены не косвенно, а на модельной системе выделенных везикул ПМ, что позволило осуществить непосредственную оценку изменений скорости реакции при создании на ПМ К+-диффузионного потенциала различной величины.

Наиболее существенной среди установленных особенностей потенциал-зависимости реакции гидролиза АТФ является организующий характер влияния А\[/0 на данную реакцию. На это указывает связь потенциал-зависимости с кон-формационной подвижностью фермента, заключающаяся в возрастании стимулирующего влияния Д\|/о в условиях ограничения конформационной подвижности фермента при пониженной температуре, а также в присутствии ДЦКД. Объяснение данного явления возможно на основании модели континуальной диффузии, которая используется рядом авторов для анализа принципов регуляции скорости ферментативных реакций, протекающих в биомембранах и других вязких гетерогенных средах (Треушников и др., 1994). В рамках такого подхода показано, что вероятность выхода продукта реакции помимо фактора времени детерминирована еще двумя параметрами, один из которых зависит от подвижности и реакционной способности реагентов, а другой учитывает действие внешних сил (в частности, Ду). Использование модели континуальной диффузии показывает реальную возможность обнаруженной в опытах связи между эффектом модулирующего влияния мембранного потенциала на скорость реакции гидролиза АТФ и молекулярной подвижностью реагентов, включая возникновение феномена компенсации. Существенно, что феномен компенсации неспецифичен, т.к. проявляется при различных воздействиях, ограничивающих конформационную подвижность фермента (понижение температуры, действие ДЦКД).

Вероятной причиной ограничения конформационной подвижности Н+-АТФазы при низкой температуре и вызванного этим быстрого затухания реакции гидролиза АТФ может быть, видимо, неодинаковая холодовая чувствительность фермента на разных стадиях ферментативного цикла. Согласно известной схеме (Briskin, 1990), полный цикл изменений в рамках одного элементарного акта ферментативного катализа включает прямой и обратный переходы между конформациями (Ei и Е2), различающимися по каталитическим и транспортным свойствам: присоединение АТФ, транспортируемого Н+ и образование фосфорилируемого интермедиата происходит в состоянии E1t а освобождение Н+ и дефосфорилирование фермента - в конформации Е2. Исходя из данной схемы и неодинаковом влиянии низкой температуры на начальный этап гидролиза АТФ и сопряженный с ним транспорт Н+ можно полагать, что более высокую чувствительность к низкой температуре имеет, видимо, конформация Е2. Т.е., обратный переход Н+-АТФазы в исходную конформацию Ei при низкой температуре затруднен, в результате время жизни фермента в конформации Е2 стремится к бесконечности, а вероятность возврата в Ei - к нулю. Этот процесс обусловливает достаточно быстрое угнетение реакции гидролиза АТФ при 6°С. При этом парадоксально высокая стартовая скорость реакции при низкой температуре может быть объяснена, видимо, тем, что вследствие понижения температуры уменьшается разнообразие связанных с кТ конфигураций, в которых исходно находится макромолекула фермента и увеличивается вероятность образования фермент-субстратного комплекса (при условии, что молекулы субстрата в избыточной концентрации находятся в непосредственной близости от активного центра фермента) (Иосг, 1975).

Более высокая холодовая чувствительность скорее конформации Е2 в рамках полного ферментативного цикла и данные об усилении потенциал-зависимости работы фермента при низкой температуре позволяют допустить, что модулирующее влияние мембранного потенциала охватывает, возможно, не весь ферментативный цикл, а лишь отдельные его стадии, связанные с существованием фермента в конформации Е2. Согласно данным анализа вольт-амперных характеристик АТФ-зависимого Н+-насоса ПМ (Slayman, 1987; Blatt, 1987), в ферментативном цикле Н+-АТФазы следует предполагать наличие одной или даже двух потенциал-чувствительных стадий. Возможно, потенциалза-висимым является (как и в случае Ыа'^-АТФазы ПМ животных (De Weer et al.,

1988)), переход между высокоэнергизованным фосфорилированным интерме-диатом (Ei~P) и низкоэнергизованным фосфорилированным интермедиатом (Е2-Р) ( Slayman, 1987 ).

Возможное наличие потенциал-чувствительных стадий в рамках ферментативного цикла означает, что каждый такой цикл в ходе реакции гидролиза АТФ должен испытывать модулирующее влияние мембранного потенциала. Однако это не согласуется с нашими данными о том, что при 24°С влияние А\\/0 проявлялось только на начальном этапе реакции. Рациональное объяснение такого явления может состоять в том, что в результате работы Н+-АТФазы на везикулах ПМ возникает градиент рН, направленный из инвертированных везикул в среду, который по принципу обратной связи способен оказать некоторое модулирующее влияние на активность данной ферментной системы (Michelet, Bouthry, 1995; Marre, Ballarin-Denti, 1985) ослабляя стимулирующий эффект Д\|/0 и взяв на себя в данном случае роль регулятора реакции гидролиза АТФ . Возможно также, что в опытах in vitro момент запуска реакции гидролиза, связанный с переходом фермента из нерабочего состояния в рабочее, в большей степени зависит от организующего эффекта мембранного потенциала, чем последующие этапы реакции, когда фермент находится как бы в «потоке» (Николаев, 1976), т.е. в ходе реакции. Возможно, обе указанные причины способствовали проявлению свойства потенциал-зависимости преимущественно в начале реакции гидролиза АТФ при 24°С.

Исследование гидролитической активности Н+- АТФазы при холодовом закаливании проростков пшеницы показало наличие двух эффектов в данном процессе: 1) возрастание базовой активности и 2) усиление потенциал-зависимости реакции гидролиза АТФ у озимой пшеницы. Если возрастание базовой АТФазной активности при закаливании - достаточно известное явление (Красавцев, 1988; Алешина и др., 1988), в основе которого, видимо, лежит приспособительная лабилизация мембранной структуры, приводящая к увеличению скорости протекающих в мембране ферментативных процессов (Хочачка, Сомеро 1988), то установленное нами усиление потенциал-зависимости работы фермента является принципиально новым феноменом, который, возможно, имеет важное значение для функционирования растений в неблагоприятных (в частности, температурных) условиях.

Можно полагать, что явление повышения потенциал-чувствительности при закаливании наряду с повышением базового уровня можно рассматривать в качестве реального приспособительного изменения, направленного на усиление устойчивости АТФазных систем ПМ к неблагоприятному действию холода. То, что данный феномен выражен сильнее у озимой пшеницы, отражает преимущественное значение такого фактора для тех растений, которые в ходе онтогенеза в норме испытывают сильное холодовое воздействие.

Феномен усиления потенциал-чувствительности гидролитической активности Н+-АТфазы при холодовом закаливании имеет смысл лишь при сохранении при низких температурах самого Ду. Это удовлетворяет данным о том, что одно из наиболее ранних и важных звеньев низкотемпературной адаптации растений связано с восстановлением клеточного электрогенеза (Пятыгин и др., 1996). Явление усиления потенциал-чувствительности гидролитической активности Н+-АТФазы при закаливании озимой пшеницы согласуется с современными представлениями об устойчивости растений к низким температурам. Так, известно, что ПМ клеток растений обладают наименьшими жидкостными свойствами в сравнении с другими клеточными мембранами и наиболее чувствительны к действию холода (Красавцев, 1988; Климов, 1997). При этом в качестве первичной мишени холодового повреждения выступает Н+-АТФаза. В то же время необходимым условием репарации холодового повреждения клеток является сохранение активного транспорта Н+ через ПМ (Красавцев, 1988). Обеспечение надежной работы Н+-АТФазы в условиях холодового воздействия является для растений весьма актуальным. Отчасти эта проблема, видимо, решается путем обнаруженного феномена адаптивного увеличения степени управляемости АТФазной активности электрическим потенциалом ПМ.

Известно, что функционирование первичных и вторичных систем активного транспорта в ПМ тесно взаимосвязано между собой. В настоящее время считается доказанным участие в процессах вторичного активного транспорта электрохимического градиента протона (Reinhold, Kaplan, 1984), но до сих пор нет определенных данных об участии в данном процессе Avj/ (Bush, 1989; Buckhout, 1994).

Проведенные нами исследования биоэлектрических реакций при транспорте сахарозы в клетках проводящих тканей, дают возможность предполагать участие биоэлектрического потенциала в процессах вторичного активного транспорта, а также сделать некоторые выводы относительно его механизмов. Как уже было отмечено (см. главу 5), наибольшая скорость деполяризации электрического потенциала наблюдается при малых концентрациях сахарозы во внешней среде (до 10 мМ), снижаясь в интервале 10-50 мМ и практически не изменяясь при больших концентрациях сахарозы. Эти данные согласуются с предположениями о существовании различных механизмов переноса сахарозы в растениях: 1) энергетически зависимого, особо чувствительного к ПХМБ, действующего до концентрации сахарозы 10 мМ; 2) осуществляемого с помощью переносчиков, но энергетически не зависимого и чувствительного только к высоким концентрациям ПХМБ, который действует до 50 мМ сахарозы; 3) механизма простой диффузии, действующего при больших концентрациях сахарозы (Schmitt et al., 1984).

Однако, возможность непосредственного исследования механизмов потенциал-зависимого транспорта сахарозы в ПМ появилась только при проведении экспериментов на везикулах ПМ.

Результаты, полученные при изучении потенциал-зависимого транспорта сахарозы в везикулах ПМ клеток высших растений, указывают на непосредственное использование энергии электрического градиента в этом процессе. Возможность участия мембранного потенциала различной полярности в электрогенном транспорте служит доказательством унверсальности использования энергии электрического поля на транспорт, хотя в случае отрицательного Avj/d на везикулах это происходит путем конверсии Ау в АрН. Подтверждением электрогенности транспорта является усиление выхода сахарозы из везикул, происходящее с ростом величины мембранного потенциала. Наибольший интерес представляет установленный нами факт наличия двух фаз выхода сахарозы: начальной, которая является потенциал-зависимой, и последующей, более медленной релаксирующей, для которой такая зависимость отсутствует. Несколько неожиданным, даже парадоксальным, является отсутствие влияния мембранного потенциала на изменение светопропускания (т.е. на выход сахарозы) медленной фазы, хотя, как было отмечено выше, амплитуды изменения обеих фаз оказываются достаточно близкими по величине, что указывает на сопоставимость количеств транспортируемой сахарозы. В связи с этим необходимо отметить, что в литературе имеются данные о существовании энергозависимой и не требующей энергии стадий переноса сахарозы (Schmitt et al., 1984 ).В то же время, как показали данные исследования, релаксирующая стадия является чувствительной к содержанию сахарозы во внешней среде. Анализ кинетических параметров позволил определить кажущуюся Кт транспорта (5 мМ) и Vmax. Эти величины оказываются сравнимыми с установленными ранее для сахарозы (Schmitt et al., 1984). Близкие значения-Km (полученные нами и известные из литературы) можно трактовать как показатель сходной природы переносчиков, участвующих в транспорте сахарозы. Потенциал-зависимость начальной стадии переноса может указывать на то, что потребление энергии электрического градиента в наибольшей степени происходит на начальных этапах процесса.

Исходя из факта существования двух фаз изменения светопропускания при выходе са харозы из везикул, можно предположить существование различных механизмов переноса сахарозы. Возможность существования таких механизмов неоднократно обсуждалась в литературе (Schmitt et al., 1984). Например, в работе (Schmitt et al., 1984 ) предположено, что до 10 мМ сахарозы в среде действует энергозависимый механизм (к такому механизму, возможно, имеет отношение установленная нами начальная стадия изменения светопропускания), после 50 мМ - работа переносчиков, которая не является энергозависимой. Поскольку в наших экспериментах используемая концентрация сахарозы составляла от 25 до 100 мМ, это позволило предположить, что релаксирующая фаза изменения светопропускания соответствует механизму облегченной диффузии, которая не подвержена влиянию Д\|/0. Наряду с этим можно высказать предположение, что обнаруженная нами различная энергетическая и концентрационная зависимость выхода сахарозы на начальной и релаксирующей фазе свидетельствует о двух типах переносчиков, функционирующих на ПМ, Имеющиеся в литературе данные по клонированию переносчиков (Schakya, Sturm, 1996) также указывают на существование двух различных транспортеров, функционирующих на ПМ.

Нельзя исключить также, что наличие двух стадий в изменении свето-пропускания обусловлено особенностями функционирования переносчиков в модельной системе везикул ПМ.

Можно также полагать, что реализация начальной стадии переноса под влиянием Ац10 отражает однонаправленный процесс, связанный с перемещением через мембрану загруженных переносчиков и еще не зависящий от их возврата в незагруженном состоянии. При этом скорость транслокации положительно заряженных переносчиков, а возможно и их количество, вовлеченное в транспорт, зависят от величины мембранного потенциала. Можно предположить, что меньшая скорость релаксирующей фазы изменения светопропуска-ния, по-видимому, определяется тем, что она включает в себя стадию возврата свободных переносчиков, которая происходит медленнее, чем движение загруженных транспортеров. Такие данные также имеются в литературе (Никольский, Трошин, 1973 ). Возможно, меньшая скорость транслокации свободных переносчиков связана со стадией освобождения переносчика от субстрата. Косвенным указанием на это может служить замедление скорости выхода сахарозы в релаксирующую фазу с увеличением ее концентрации в среде.

Независимость изменения светопропускания релаксирующей фазы от мембранного потенциала служит также указанием на то, что свободная форма переносчика является незаряженной и его возврат осуществляется по концентрационному градиенту или, возможно, реализуется через механизм изменения конформации. Существование незаряженной формы переносчика наряду с заряженной также обсуждается в литературе ( Humphreys, 1978 ).

Для понимания механизмов функционирвания системы транспорта сахарозы в ПМ представляют интерес данные по влиянию конкурентного ингибитора транспорта сахарозы - флоридзина . Они показывают, что флоридзин уменьшает амплитуду изменения светопропускания, что свидетельствует о снижении выхода сахарозы из везикул. Исходя из конкурентного характера механизма действия флоридзина снижение амплитуды светопропускания можно трактовать как уменьшение мест связывания сахарозы на внешней стороне мембраны (в случае везикул - внутренней), что блокирует ее перемещение. При этом комплекс флоридзин-переносчик сам не транспортируется.

Важной особенностью выхода сахарозы из везикул является диссипация мембранного потенциала, генерируемого на везикулах. Как показали проведенные нами эксперименты, Ду может выступать в качестве универсального источника энергии для транспорта сахарозы, поскольку его использование может происходить как в области положительных, так и отрицательных значений, хотя в последнем случае и проявляется через конверсию Ду в ДрН при К+/Н+-антипорте (Калинин, Опритов, 1985).

Механизм функционирования мембранного переноса сахарозы, использующего энергию электрического поля, до настоящего времени не представляется достаточно ясным. По-видимому, одним из наиболее вероятных путей участия мембранного потенциала в процессе транспорта заряженных переносчиков связан с изменением их конформации. Это находит свое подтверждение как в установленных ранее фактах изменения в количестве ЭН-групп выделенного переносчика сахарозы с молекулярной массой 42 кД, где влияние сахарозы и флоридзина можно было связать с посадкой субстрата (Калинин и др., 1991), так и в полученных нами данных по изменению количества свободных БН-групп при наложении электрического поля на мембрану везикул ПМ, когда происходит увеличение количества свободных БН-групп в везикулах с сахарозой без изменения их количества в везикулах, содержащих маннит или сахарозу в сочетании с флоридзином. Отсутствие влияния мембранного потенциала в двух последних случаях позволяет сделать вывод, что молекулы переносчиков находятся в непротонированной (незаряженной) форме. По-видимому, одним из условий протонизации переносчиков являются структурные изменения в их молекулах, которые должны инициироваться процессом связывания сахарозы.

При этом на поверхность переносчиков экспонируются 1МН2 -группы , которые приобретают положительный заряд путем акцептирования протонов. Видимо, неспособность к связыванию с маннитом и блокирование данного процесса флоридзином затрудняет структурный переход и протонирование переносчика. Противоположный характер влияния субстрата и мембранного потенциала на уровень свободных ЗН-групп указывает на различное структурное состояние переносчиков на стадии акцептирования и транслокации сахарозы. При этом основным фактором структурных перестроек в ходе транслокации, видимо, является мембранный потенциал. Доказательством этому служит более высокое содержание свободных БН-групп при увеличении А\\10. По-видимому, с ростом потенциала в молекуле переносчика происходят более глубокие конформаци-онные сдвиги и масштаб этих перестроек определяет эффективность функционирования электрогенных переносчиков, т.к. существует прямая корреляция между количеством транспортируемой сахарозы и величиной Ац/ на мембране (Калинин, Опритов, 1989).

Таким образом, представленный в работе материал свидетельствует о возможности прямого участия мембранного потенциала в функционировании первичных и вторичных систем активного транспорта в везикулах ПМ, доказывая универсальную роль Ацг в клетках высшего растения. Влияние мембранного потенциала на исследуемые нами системы первичного и вторичного активного транспорта может осуществляться по принципу обратной связи, реализация которого происходит в их постоянном балансе, выраженном как через изменение мембранного потенциала (через его потребление), так и в его стабилизации (через изменение активности Н+-АТФазы).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Орлова, Ольга Валентиновна, 1999 год

Литература

1. Азимов P.P., Гелетюк В.И., Берестовский Г.Н. Одиночный потенциал-зависимый lT-канал клеток водоросли Nitellopsis obtusa // Биофизика. -1987,-Т.32, №1.-0.79-84.

2. Александров В.Я.. Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 1985. - 318 с.

3. Алешина Н.В., Боруах К.К., Астахова Н.В., Трунова Т.И. Получение и свойства плазматических мембран этиолированных проростков озимой пшеницы // Физиология растений. -1988. - Т.35, № 6. - С. 1050-1057.

4. Андреев И.М., Коренькова В.Д., Молотковский Ю.Г. Барьерные свойства тонопласта выделенных вакуолей из корнеплода кормовой свеклы. Искусственная генерация трансмембранных ионных градиентов // Биологические мембраны. -1985. - Т.2, № 10. - С. 996-1002.

5. Андреев И.М., Коренькова В.Д., Молотковский Ю.Г. Са2+ / пН+ - антипорт в везикулах тонопласта из листьев гороха // Биологические мембраны. -1989. -Т.6, №2. - С. 159-166.

6. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: Наука, 1982151 с.

7. Берестовский Г.Н., Жерелова О.М., Катаев A.A. Ионные каналы клеток ха-ровых водорослей И Биофизика. -1987. - Т.32, № 6. - С. 1011-1027.

8. Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики. М.: Наука, 1977 - 366 с.

9. Болдырев A.A. Определение неорганического фосфата // Транспортные аденозинтрифосфатазы. Современные методы исследования / Под ред. A.A.Болдырева. М.: МГУ, 1977. - С. 179-181.

10. Болдырев A.A. Биологические мембраны и транспорт ионов. М.: МГУ, 1985.-208 с.

11. Булычев A.A., Андрианов В.К., Курелла Г.А., Литвин Ф.Ф. Трансмембранный потенциал клетки и хлоропласта высшего надземного растения // Физиология растений. -1971. - Т. 18, № 2. - С. 248-256

12. Буравцев В.Н., Гуревич A.B., Макарова Т.Н. Стабилизация проводящего канала в бислойных липидных мембранах электрическим полем // Биофизика. -1994. - Т.39, № 2. - С. 351-356.

13. Вахмистров Д.Б., Воробьев Л.Н., Мельников П.В. «""-термодинамический потенциал и дискретные уровни мембранных потенциалов корневых клеток Trianea bogotensis //Доклады АН СССР. -1974. - Т.215, № 6. - С. 1501-1504.

14. Великанов Г.А., Белова Л.П., Ценцевицкий А.Н. Электрическое напряжение на плазмалемме и интенсивность синтеза полисахаридов клеточной стенки растений // Успехи современной биологии. - 1997. - Т. 117, вып.1. - С. 95-106.

15. Великанов Г.А., Белова Л.П., Ценцевицкий А.Н., Ильина Т.Н., Лозовая В.В. Синтез полисахаридов клеточной стенки растений при различных уровнях мембранного потенциала на плазмалемме // Известия АН. Сер. Биол. - 1998. - № 1 -С. 30-36.

16. Воробьев Л.Н. особенности генерации биоэлектрических потенциалов в растительных клетках //Труды МОИП. - 1970. - Т.45. - С. 30-38.

17. Воробьев Л.Н. Регулирование ионного транспорта: теоретические и практические аспекты минерального питания растений // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. Т.: ВИНИТИ. - 1988.- 179 с.

18. Воробьев Л.Н., Раденович Ч.Н., Хитров Ю.А., Яглова Л.Н. Исследование скачков биопотенциалов при введении микроэлектрода в вакуоль клеток Nitella mucionata //Биофизика. -1967. - Т. 12, № 6. - С. 1016-1021.

19. Гайворонская Л.М., Тимонина В.П., Трофимова М.С., Дзюбенко B.C. Получение и характеристика везикул плазматической мембраны с низкой протонной проницаемостью из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы // Физиология растений. - 1987. - Т.34, № 1. - С. 13 - 28.

20. Гайворонская Л.М., Трофимова М.С., Молотковский Ю.Г. Протонный контроль электрогенной Н+-АТФазы в везикулах плазматических мембран из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы // Доклады АН СССР. - 1987. - Т.292, № 3. - С. 759-762.

21. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Кластерная организация ионных каналов. М.: Наука, 1990.-224 с.

22. Гладышева Т.Б., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Влияние мембранного потенциала на гидролиз АТФ в субмитохондриальных частицах // Биологические мембраны. -1989. - Т.6, № 2. - С. 159-166.

23. Грабов А.М. Потенциалзависимые калиевые каналы в плазмалемме корневого волоска // Физиология растений. -1991. - Т.37. - С. 324-327.

24. Дергунов А.Д., Капрельянц A.C., Островский Д.Н. Белок-липидные взаимодействия и функционирование мембраносвязанных ферментов // Успехи современной биологии. -1984. -Т.25. - С. 89-109.

25. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989. -274 с.

26. Жерелова О.М., Грищенко В.М. Регулирование потенциалзависимых кальциевых каналов плазмалеммы клеток харовых водорослей / Внутриклеточная сигнализация. М., 1988. - С. 71-76.

27. Ивков Г.В., Берестовсий Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. М.: Наука, 1981.-293 с.

28. Инге-Вечтомова Н.И., Батов А.Ю., Верзилин H.H., Саламатова Т.С., Чиркова Т.В., Бурсова М.П., Максимов Г.Б. Спектрофлуориметрические методы исследования биологических объектов // Методы изучения мембран растительных клеток. Л.ЛГУ, 1986. - С. 142-165.

29. Инге-Вечтомова Н.И., Максимов Г.Б., Батов А.Ю., Кренгауз Л.М., Шульц М.Э. Сравнительный анализ свойств плазмалеммы корней и колеоптилей кукурузы в модельной системе // Мембранный транспорт и биоэлектрогенез у растений / Межвузовский сборник. Горький: ГГУ, 1987. - С. 34-41.

30. Иост X. Физиология клетки М.: Мир, 1975. - 864 с.

31. Кагава Я.. Биомембраны. М: Высшая школа, 1985. - 303 с.

32. Калинин В.А., Опритов В.А. Протонно-калиевый обмен при генерации АТФ-зависимого градиента pH в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы растений // Биофизика. -1985. - Т.ЗО, № 1. - С. 76-80.

33. Калинин В.А., Опритов В.А. Роль Ау и АрН в протонзависимом транспорте сахарозы в везикулах плазматических мембран флоэмы растений // Физиология растений. -1989. - Т.36, № 5. - С. 901-909.

34. Калинин В.А., Опритов В.А., Швец И.М. //Активный электрогенный транспорт Н+ в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика // Биофизика. -1982. -Т.28, № 1. -С. 58-61.

35. Калинин В.А., Опритов В.А., Швец И.М., Ищенко Г.А. АТФ-зависимая генерация градиента электрохимического потенциала протонов в везикулх плазматических мембран клеток флоэмы борщевика Heracleum sosnovskyi // Доклады АН СССР. -1979. -Т.249,№ 4. - С. 1022-1024.

36. Калинин В.А., Опритов В.А., Швец И.М., Сидоркин В.Г.,Фирсова И.А. О типах АТФаз плазматических мембран клеток флоэмы борщевика Heracleum sosnovskyi //Доклады АН СССР. -1979. -Т.248, №6. - С. 1510-1513.

37. Калинин В.А., Швец И.М., Опритов В.А. Полипептид с молекулярной массой 42 кД - возможный компонент переносчика (или переносчик) сахарозы? //Физиология растений. -1991. - Т.38, № 6. - С. 1134-1140.

38. Катаев А.А., Жерелова О.М., Берестовский Г.Н. Влияние заряженных местных анестатинов на инактивацию Са2+-активируемых Cl-каналов харовой водоросли. // Биофизка. -1988. - Т.33, №6. - С. 1006-1012.

39. Кларксон Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки . М.: Мир, 1978.-368 с.

40. Климов C.B. Биоэнергетическая концепция устойчивости растений к низким температурам II Успехи современной биологии. -1997. - Т.217, №2. - С. 133-154.

41. Конев C.B. Структурная лабильность биологических мембран и регулятор-ные процессы. Минск: Наука и техника, 1987. - 240 с.

42. Конев C.B., Волотовский И.Д. Структурные перестройки биологических мембран / Биомембраны: структура, функции, методы исследования. Рига: Зинатне, 1977. - С. 42-76.

43. Конев C.B., Калер Г.В. Трансмембранный электрический потенциал как регулятор функциональной активности биомембран // Биофизика. - 1988. - Т. 33, №6-С. 1088-1092.

44. Корзун A.M., Саляев Р.К., Кузеванов В.В. Особенности электрофизиологических исследований вакуолярной мембраны клеток высших растений // Физиология растений. -1984. -Т.31, № 2. - С. 213-220.

45. Красавцев O.A. Свойства плазмалеммы морозостойких растительных клеток// Успехи современной биологии. -1988. - Т. 106, № 1. - С. 143-157.

46. Кулене В.В., Скулачев В.П., Ясайтис A.A. Обнаружение мембранного потенциала митохондрий по изменению флуоресценции анилинонафталин-сульфоната // Биохимия. -1971. - Т.36, № 3. - С. 649-652.

47. Курсанов АЛ. Транспорт ассимилятов в растениях . М.: Наука, 1976. - 646 с.

48. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973 - 343 с.

49. Максимов Г. Б. АТФ-зависимый мембранный транспорт катионов и роль ци-

токининов в его регуляции у растений : Дисс.....докт. биол. наук. М.: ИФР

АН СССР, 1989.-47 с.

50. Максимов Г.Б., Батов А.Ю. Изучение роли АТФаз в регуляции ионного транспорта // Мембранный транспорт и биоэлектрогенез у растений/ Межвузовский сборник. Горький: ГГУ, 1988. - С. 52-56.

51. Маркин B.C., Цонг Т.Я., Робертсон Б., Астумян Р.Д. Мембранные переносчики как преобразователи свободной энергии: оптимизация переноса энергии // Биологические мембраны. -1992. - Т.9, № 2. - С. 214-222.

52. Медведев С.С. Физиологические основы полярности растений. С.Петербург: Кольна, 1996 -160 с.

53. Миронов Г.П., Каминский Ю.Г., Кондрашова М.Н. Чувствительный флуори-метрический метод определения SH- и SS- групп при их совместном присутствии // Вопр. мед. химии. -1971. - Т. 17, № 1. - С. 83-88.

54. Николаев Л .А. Основы физической химии биологических процессов. М.: Высшая школа, 1976. - 262 с.

55. Никольский H.H., Трошин A.C. Транспорт Сахаров через клеточные мембраны. Л.: Наука, 1973. - 222 с.

56. Новак В.А., Иванкина Н.Г. Зависимость светоиндуцированного внутриклеточного электрического потенциала элодеи от процесса фотосинтеза // Цитология -1977. - Т. 19, № 5. - С. 508-513.

57. Новак В.А., Якимов Ю.Е. Транспорт и влияние хлорида на рост растений // Докл. АН СССР. - 1987. - Т.292, № 2. - С. 508-512.

58. Новицкая Г.В., Боруах К.К., Суворова Т.А. Липидный состав плазмалеммы проростков озимой пшеницы и его изменение при их низкотемпературном закаливании // Прикладная биохимия и микробиология. -1992. - Т. 28, № 1. -С. 134-139.

59. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб А.М. Мембраноактивные комплексо-ны. М.: Наука, 1974 - 463 с.

60. Опритов В.А., Калинин В.А., Ретивин В.Г. Теоретические основы и методы изучения биофизических процессов у растений. Горький: ГГУ ,1979. - 54 с.

61. Опритов В.А., Пятыгин С.С., Крауз В.О. Анализ роли электрической активности клеток высшего растения в развитии адаптационного синдрома при охлаждении // Физиология растений. -1993. - Т.40, № 4. - С. 619-626.

62. Опритов В.А., Пятыгин С.С., Крауз В.О., Худяков В.А., Абрамова H.H. Активация электрогенного Н+-насоса плазматических мембран при адаптации клеток высшего растения к низкой положительной температуре II Физиология растений. -1994. - Т.41, №4. - С. 488-494.

63. Опритов В.А., Пятыгин С.С., Ретивин В.Г. Биоэлектрогенез у высших растений. М.: Наука, 1991 - 216 с.

64. Опритов В.А., Пятыгин С.С., Худяков В.А. О роли структурных перестроек липидов возбудимых мембран в генерации потенциалов действия высших растений при умеренном охлаждении II Биофизика. -1984. - Т. 29, № 3. - С. 415-418.

65. Остроумов С.А., Воробьев Л.Н. Мембранный потенциал как возможный полифункциональный регулятор активности мембранных белков // Биологические науки. -1976. - № 7 (151). - С. 22-27.

66. Палладина Т.А. Транспортные Н+ - АТФазы несопрягяющихся мембран II Успехи совр. биологии. -1983. - Т.96, № 3(6). - С. 394-408.

67. Пасечник В.И. Поперечная деформация бислойных липидных мембран при электрострикции // Биофизика -1982 - Т.27, № 5. - С. 727 - 730. .

68. Педченко В.К., Палладина Т.А. Электрогенность Н+-АТФазы плазматической мембраны корней кукурузы //Докп. АН УССР. -1985. - № 4. - С. 73-76.

69. Петренко Ю.М., Путвинский A.B. Лабораторные работы по биофизике клетки, органов и тканей. М.: МГУ, 1981 -199 с.

70. Пятыгин С.С., Опритов В.А. Температурный фактор и биоэлектрическая активность клеток растений II Успехи совр. биологии, 1987. - Т. 104, № 3(6). -С. 426-442.

71. Пятыгин С.С., Опритов В.А. О роли изменений мембранного потенциала клеток высшего растения в формировании адаптационного синдрома при охлаждении // Докл. АН -1992 - Т. 326, № 1 - С. 202 -205.

72. Пятыгин С.С., Опритов В.А. О влиянии мембранного потенциала на фазовое состояние липидного матрикса плазматической мембраны интактной растительной клетки при физиологически умеренных положительных температурах II Биофизика. -1993. - Т.38, № 1 - С. 175 -180.

73. Пятыгин С.С., Опритов В.А., Крауз В.О., Половинкин А.В. Повышение холодоустойчивости электрогенеза как основа адаптивной реполяризации клеток высшего растения при охлаждении II Физиология растений. - 1996. -Т.43, №2.-0.256-261.

74. Пятыгин С.С., Опритов В.А. Худяков В.А., Гнездилов А.В. Природа температурной зависимости потенциала покоя холодочувствительного растения Cucurbita // Физиология растений. -1989. - Т. 36, № 1. - С. 118-125.

75. Ретивин В.Г., Опритов В.А. Анализ электрохимических градиентов потен-циалопределяющих ионов в клетках проводящих тканей тыквы в покое и при возбуждении II Физиология растений. -1986. - Т.ЗЗ, № 3. - С. 447-459.

76. Ретивин В.Г., Опритов В.А., Федулина С.Б. Предадаптация стебля Cucurbita pepo L. к повреждающему действию низких температур, индуцированн-ная потенциалом действия // Физиология растений. - 1997. - Т.44, № 4. -С.499-510.

77. Ретивин В.Г., Федосеев В.В. Влияние блокаторов ионной проницаемости на биоэлектрические реакции изолированных проводящих пучков стебля тыквы // Мембранный транспорт и биоэлектрогенез у растений / Межвуз. сборник. Горький : ГГУ, 1987. - С. 55-63.

78. Рубин А.Б. Биофизика. М.: Высшая школа, 1987 - 303 с.

79. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М.: Наука, 1972. -338 с.

80. Соколик А.И., Юрин В.М. Транспортные свойства калиевых каналов плаз-малеммы клеток Ше11а в состоянии покоя // Физиология растений. - 1981. -Т. 28, №2. - С. 294-301.

81.Танкелюн О.В., Чиркова Т.В., Тищенко Н.Н., Магомедов И.М. Биохимические методы исследования мембран. Ферменты // Методы изучения мембран растительных клеток / Учебное пособие. Ленинград: ЛГУ, 1986 - С.

82. Тимашев С.Ф. Влияние электрических полей на кинетику биологических процессов // Биофизика. -1981. - Т.24, № 4. - С. 642-648.

83. Тихая Н.И., Максимов Г.Б. Выделение плазмалеммы из растительных клеток И Методы изучения мембран растительных клеток / Учебное пособие. Ленинград: ЛГУ, 1986,- С. 20-29.

84. Тихая Н.И., Максимов Г.Б., Коренькова Н.В., Вахмистров Д.Б. Полная активность К,Мд-АТФазы и ориентация везикул мембранных препаратов растительных клеток // Физиология растений. -1984. - Т.31, № 3. - С. 882-888.

85. Тихая Н.И., Тазабаева К.А., Вахмистров Д.Б. Са-АТФаза плазмалеммы корневых клеток ячменя. Свойства и ориентация // Физиология растений. -1985. - Т.32, № 6. - С. 1079-1090.

86. Треушников В.М., Пятыгин С.С., Опритов В.А. Использование модели континуальной диффузии для анализа принципов регуляции скорости ферментативной реакции в условиях мембраны II Биологические мембраны. -1994. -Т. 11, № 3-С. 420-428.

87. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. - 568 с.

88. Чизмаджев Ю.А., Пастушенко В.Ф. Электрическая стабильность биологических и модельных мембран И Биологические мембраны. - 1989. - Т. 6, № 9.-С. 1013-1045.

89. Швец И.М. Применение метода дифференциального центрифугирования для изучения активного транспорта ионов в плазматических мембранах клеток высших растений II Молекулярная биология. -1981. - № 28. - С. 2630.

90. Шевченко Е.В., Смирнова Е.Ю., Антонов В.Ф. Бислойные липидные мембраны как сенсоры температуры двухвалентных ионов и электрического поля // Сенсорные системы. -1992. - Т.6, №4. - С. 103-106.

91. Юрин В.М., Гончарик М.Н., Галактионов С.Г. Перенос ионов через мембраны растительных клеток. Минск : Наука и техника, 1977. -166 с.

92. Allen J., Sanders D. Two voltage-gated, calcium release channels coreside in the vacuolar membrane of broad bean guard cells II Plant Cell. - 1994. - N 6. -P. 685-694.

93. Azzi A. The application fluorescent probes in membrane studies // Quart. Rev. Of Biophys. -1975. - V.8, N 2. - P. 237-317.

94. Bacic A., Delmer D.-P. Stimulation of membrane-associated polysaccharide synthetases by a membrane potential in developing cotton fibers // Planta. -1981.-V. 152.-P. 346-351.

95. Backer D.A. Proton co-transport of organic solutes by plant cells II New Phytol. -1978. -V.8, N3. - P. 485-492.

96. Bashford C., Alder A.M., Gray M.A., Micklem K.J., Taylor C.C., Turek P.J., Pasternak C.A. Oxanol dyes as monitor of membrane potential. The effect of viruses and toxines on the plasma membrane potential of animal cells in monolayer culture and in suspension // J. Cell Biol. - 1985. - V.123, N 3. - P. 326-336.

97. Bates G.V., Goldsmith M.H.M., Goldsmith T.M. Separation of tonoplast and plasma memdrane potential and resistance in cell of oat coleoptiles // J. Membr. Biol. -1982. - V.66, N 1. - P. 15-23.

98. Baydoun E.A.H., Northcote D.N. Isolation and characterization of membranes from the cell of maize root tips // J. Cell Biol. - 1980. - V.45, N 1. - P. 147-167.

99. Beilby M.J., Coster H.G.L. The double-fixed-charge membrane: electromechanical stress and the effects of temperature on punchthrough II Aust. J. Plant Physiol. -1980. - V.7. - P. 595-608.

100. Bennet A.B., O'Neill S.D., Spanswick R.M. H+-ATPase activity from storage tissue of Beta vulgaris. 1. Identification and characterization of an anion-sensitive H+-ATPase II Plant Physiol. -1984. - V.74, N 3. - P. 538-544.

101. Bennet A.B., Spanswick R.M. Optical measurements of ApH and А \\f on corn root membrane vesicles. Kinetic analysis of СГ -effect on a proton-translocating ATPase II J. Membr. Biol. -1983. - V.71, N 1-2. - P.

102. Bentrup F.-W. Botanische Electrophysiologie. Vom Phänomen zum molecularen Mechanismus // Naturwissensehaften. -1985. - Bd.72. - S. 169-179.

103. Blatt M.R. Electrical characteristics of stomatal guard cells: the contribution of ATP-dependent, «electrogenic» transport revealed by current-voltage and difference-current-voltage analysis // J. Membr. Biol. -1987. - V.98, N 3. - P. 257-274.

104. Blatt M.R. Electrical characteristics of stomatal guard cells: The ionic basis of the membrane potential and the consequence of potassium chloride leakage from microelectrodes // Planta. -1987. - V.170, N 2. - P. 274-287.

105. Blatt M. R. Potassium channel currents in intact stomatal guard cell: Rapid enchancement by abscisic acid // Planta. -1990. - V.180, N 3. - P. 445-455.

106. Bowman J.B. et al. Effects of inhibitors on the plasma membrane and mitochondrial adenosine triphosphatase of Neurospora crassa // Biochim. et Biophis. Acta. -1978. -V. 512, N 1. - P. 13-28.

107. Briskin D.R. The plasma membrane H+-ATPase of higher plant cells: Biochemistry and transport function // Biochem. Biophys. Acta. - 1990. - V. 1019, N 2. - P. 95-109.

108. Briskin D.R., Basu S., Assmann S.M. Characterization of the red beet plasma membrane H+-ATPase reconstituted in a planor bilaier system // Plant Physiol. -1995. -V. 108, N 1. - P. 393-398.

109. Briskin D.P., Gawienowski M.S. Role of the plasma membrane H+-ATPase in \C - transport // Plant Physiol. -1996. V. 111, N 4. - P. 1199-1207.

110. Buckhout T.J. Kinetik analysis of the plasma membrane sucrose-H+-symporter from sugar beet (Beta vulgaris) leaves // Plant physiol. - 1994. - V.106, N 3. - P. 991-1052.

111. Bush D.R. Proton-coupled sucrose transport in plasmalemme vesicles isolated from sugar beet leaves // Plant Physiol. -1989. - V.89, N 2. - P. 1318-1323.

112. Bush D.R. Electrogenicity, pH-dependence and stoichiometry of proton-sucrose symport // Plant Physiol. - 1990. - V.93, N 3. - P. 1590-1596.

113. Bush D.R. Proton coupled sugar and amino acid transporters in plants // Ann. Rev. Physiol. Plant. -1993. - V.44. - P. 513-542.

114. Chedhomme F., Rona J.P. Electrical properties of tonoplast from cells and vesicles of storage Riwi Fruits // J. Plant Physiol. -1988. - V. 133, N 1. - P. 89-95.

115. Clarcson D.T., Hanson J.B. The mineral nutrients of higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. -1980. - V.31, N 1. - P. 239-298.

116. Dahse I., Linsel G., Müller E., et al. The membrane potential as indicator for transport and energetic processes of leaf cells of the aquatic plant Eregia densa. I. Ion and light dependence of reactions on membrane inhibitors II Bio-chem. Physiol. Pflanzen. -1987. - Bd. 182. - S. 117-128.

117. De Bock F. Sucrose and glycine uptake in steam and roots of Cuscuta seedlings// J. Plant Physiol. -1985. - V.121, N 5. - P. 441-451.

118. Delmer D.P., Benziman M., Padan E. Requirement for a membrane potential for cellulose synthesis in intact cells of Acetobacter xilinum II Proc. Nat. Acad. Sei. USA. - 1982. - V. 79. - P 5282-5286.

119. Delrot S. Proton fluxes associated with sugar uptake in Vicia faba leaf tissues II Plant Physiol. -1981. - V.68, N 3. - P. 706-711.

120. Delrot S., Bonnemain J.L. Mechanism and control of phloem transport // Physiol. Veget. -1985. - V.23, N 2. - P 199-205.

121. Delrot S., Collet 0., Lemoine R. Characterization of sucrose carrier protein and of sucrose uptake in plasma membrane vesicles II Physiol. Plant. - 1990. -V.79, N 2. - Pt. 2-88.

122. Delrot S., Roques N., Descotes G., Mentech J. Recognition of some deoxy-derivatives of sucrose be the sucrose transporters of the plasma membrane // Plant Physiol. Biochem. -1991. - V.29. - P. 25-29.

123. Denson R.F., Kinraide T.B. Oxygen-induced membrane depolarization in legume root nodules. Possible Evidence for an osmoelectrical mechanism controlling nodule gas permeability // Plant Physiol. -1995. - V. 108, N 1. - P. 235-240.

124. De Weer P., Gadsby D.S., Racowski R. F. Voltage dependence of the Na,K-pump // Annu. Rev. Physiol. -1988. - V.50. - P. 225-241.

125. Etherton B., Higinbotham N. Transmembrane potential measurements of cells of higher plants as related to salt uptake II Science. - 1960. - V. 131. - P. 409410.

126. Evans D.E., Theodoulon F.L., Williamson I.M., Boyce J.M. The calcium pumps of plant cell membranes II Symp. Soc. Exp. Biol. -1994. -V. 48. - P. 43-59.

127. Felle H. Driving forces and current -voltage characteristics of amino acid transport in Ricia fluitans // Biocim. et Biophys. Acta. - 1983. - V.730, N 2. - P. 342-350.

128. Frias I., Caldeira M.T., Perez-Castineira J.R., et al. A major isoform of the maize plasma membrane H(+)-FNHase: characterization and induction by auxin in coleoptiles II Plant Cell. -1996. -V. 8(9). - P. 1533-1544.

129. Fromm J., Spanswick R. Characteristics of action potentials in willow (Salix viminalis L.) II J. Exp. Bot. -1993. - V.44, N 264. - P. 1119-1125.

130. Fuhrmann G.F., Boehm C., Treuvenef A.P.R. Sugar transport and potassium permeability in yeast plasma membrane vesicles // Biochim. et Biophys. Acta. -1976. - V.433, N 4. - P. 583-590.

131. Gerhardt B., Beevers H. Influence of sucrose on protein determination by the Lowry procedure // Anal. Biochem. -1969. - V. 23, N 1. - P. 193-195.

132. Gets H.P., Knauer D., Willenbrink J. Transport of sugars across the plasma membrane of beet root protoplasts II Planta. - 1987. -V. 171, N 2. P. 185-196.

133. Gibrat R., Grouzis J.-P., Rigaud J., Grignon C. Potassium stimulation of corn root plasmalemma ATPase. II. H+-pumping in native and reconstituted vesicles with purified ATPase II Plant Physiol. -1990. - V.93, N 3. - P. 1183-1189.

134. Goldfarb V., Sanders D., Gradmann D. Reversal of electrogenic CPpump in Acetabularia increases level and 32P-labelling of ATP // J. Exp. Bot. - 1984. - V. 35, N 154. - 645-658.

135. Goldsmith M.H.M., Cleland R.E. The contribution of tonoplast and plasma membrane to the Electrical properties of a higher- plant cell // Planta. - 1978. -V. 142, N3. - P. 261-265.

136. Goldsworthly A. The electric compass of plant II New Sci. -1986. - V. 109. - P. 22-23.

137. Gradmann D. Electrocoupling of ion transporters in plants II J. Membr. Biol. -1993. - V.136, N 3. - P. 327-332.

138. Grouzis J.-P., Gibrat R., Rigaud J., Ageorges A., Grignon C. Potassium stimulation of corn root plasmalemma ATPase. I. Hydrolytic activity of native vesicles and purified enzyme // Plant Physiol. - 1990. - V.93, N 3. - P. 11751182.

139. Hager A., Hermsdorf P. A H+/Ca2+ antiporter in membranes of microsomal vesicles from maize coleoptiles, a secondary energized Ca2+-pump // Z. Naturforsch. -1981. -V. 36. - P. 1009-1012.

140. Hansen U.-P., Kolbowski J., Dau H. Relationship between phonosynthesis and plasmalemma transport//J. Exp. Bot. -1987. -V.38, N 197. - P. 1965-1981.

141. Hedrich R., Moran O., Conti F., Busch H., Becker D., Gambale F., Dreyer I., Kuch A., Neuwinger K., Palme K. Inward rectifier potassium channels in plants differ from their animal counterparts in response to voltage and channel modulators // Em. Biophys. J. -1995. -V. 24, N 2. - P. 107-115.

142. Hedrich R., Neher E. Cytoplasmic regulates voltage-dependent ion channels in plant vacuoles II Nature. -1987. - V. 329. - P. 833-836.

143. Hedrich R., Schroeder J.I. The physiology of ion channels and electrogenic pumps in higher plants II Annu. Rev. Plant Physiol. -1989. - V.40. - P. 539-569.

144. Higinbotham N., Etherton B., Foster R.J. Mineral ion contents and cell transmembrane electropotentials of pea oat seedlings tissues II Ibid. - 1967. - V. 42, N 1. - P. 37-46.

145. Higinbotham N., Graves J.S., Devis R.F. Evidence for an electrogenic ion transport pump in cells of higher plants H J. Memb. Biol. - 1970. - V.3, N 3. - P. 210-222.

146. Hodges T.K. ATPases associated with membranes of plant cells // Encyclopedia of plant physiol. New Ser. -1976. - V.2, part A. - P. 260-283.

147. Hodges T.K. et al. Purification of an ion-stimulated adenosine triphosphatase from plant roots: Association with plasma membrane II Proc. Natl. Acad. Sci. US -1972. - V. 69, N 11. - P. 3307-3311.

148. Humphreys T. A model for sucrose transport in the maize scutellum // Phyto-chemistry. -1978. - V.17, N 4. - P. 679-684.

149. lijima T., Hagiwara S. Voltage-dependent K~"channels in protoplasts of trob-lobe ulls of Dionala muscipula II J. Memb. Biol. -1987. -V. 100, N 1. P. 73-81.

150. Ivankina N.G., Novak V.A. Transplasmalemma redox reactions and ion transport in photosynthetic and heterotrophic plant cells II Physiol. Plant. - 1988. -V.73, N 1. - P. 161-168.

151. Kasamo K., Yamanishi H. Functional reconstitution of plasma membrane H+-ATPase from mung bean (Vigna radiata L.) hypocotils in liposomes prepared with various molecular species of phospholipids // Plant and Cell Physiol. -1991. -V.32, N 87. - P. 1219-1225.

152. Kataev A.A., Zherelova O.M., Berestovsky G.N. Ca2+-induced activation and irreversible inactivation of chloride channels in the perfused plasmalemma of Nitellopsis obtusa // Gen. Physiol. Biophys. -1984. - V.3, N 2. - P. 447-452.

153. Katou K., Okamoto H. Distribution of electric potential and ion transport in the hypocotyl of Vigna sesquipedalis. I. Distribution of overall ion concentration and role of hydrogen ion in generation of potential difference // Plant and Cell Physiol. -1970. - V.11. - P. 385-402.

154. Keller B.U., Hedrich R., Raschke K. Voltage-dependent anion channels in the plasma membrane of guard cells // Nature. -1989. - V. 341. - P. 450-453.

155. Kinnaly K., Tedeschi H. Metabolic effects of same electrofluorimetrics dyes // Biochim. et Biophys. Acta. -1978. - V. 503, N 2. - P. 380-388.

156. Kinraide Th.B., Etherton B. Electrical evidance for different mechanisms of uptake for basic, neutral and acidic amino acids in Oat coleoptiles // Plant Physiol. -1980. - V.65, N 6. - P. 1085-1089.

157. Kinraide T.B., Newman I.A., Etherton B. A quantitative stimulation model for H+-amino-acid cotransport to interact the effects of Amino acids on membrane potential and extracellular pH II Plant Physiol. -1984. -V. 76, N 3. - P. 806-813.

158. Knaff D.B., Whetstone R., Carr J.W. The role of the membrane potential in active transport by the photosyntethic bacterium Chromatin vinossum // FEBS Lett. -1979. - V.99, N 2. - P. 283-286.

159. Kojima H., Katou K., Okamoto H. Homeostatic regulation of membrane potential by an electrogenic ion pump against change in the K* concentration of the extra- and intra-organ perfusion solution II Plant Cell Physiol. -1985. - V.26, N 2. -P. 351-359.

160. Krämer R. Functional principles of solute transport systems: concepts and perspectives // Biochem. et Biophys. Acta. -1994. - V.1185. - P . 1-34.

161. Lakos Z., Somogyi B., Balazs M., Matko T., Damjanovich S. The effect of transmembrane potential on the dynamic behavior of cell membranes // Biochim. et Biophys. Acta. -1990. - V. 1023, N 1. - P. 41-46.

162. Lemoine R., Delrot S. Proton-motive-force-driven uptake in sugar beet plasma membrane vesicles II FEBS Lett. -1989 -V. 249, N 1. - P. 129-133.

163. Leonard R.T., Hodges T.K. Characterization of plasma membrane, associated adenosine triphosphatase activity of oat roots // Plant Physiol. - 1973. - V. 52, N 1.-P. 6-12.

164. Lew R.R. Substrate regulation of single potassium and chloride ion channels in Arabidopsis plasma membrane // Plant Physiol. -1991. - V. 95, N 3. - P. 642647.

165. Lew R.R., Spanswick R.M. Characterization of the electrogenicity of soybean (Glycine max L.) roots. ATP dependence and effect of ATPase inhibitors // Plant Physiol. -1984. - V. 75, N 1. - P. 1-6.

166. Li Z.S., Gallet O., Lemoine R., Delrot S. The sucrose carrier of the plant plasmalemma. III. Partial purification and reconstitution of active sucrose transport in liposomes // Biochim. et Biophys. Acta. -1992. - V. 1103, N 2. - P. 259-267.

167. Lichtner F.T., Lucas W,J., Spanswick R.M. Effect of sulfhydryl reagents on the biophysical properties of the plasmalemma of Chara corallina // Plant Physiol. -1981. -V. 68, N4. P. 899-905.

168. Lichtner F.T., Spanswick R.M. Sucrose/proton cotransport in developing soybean cotyledons // «Plant membrane transport: Curr. Concept. Issues. Proc. Int. Work-shop», Toronto, 1979, Amsterdam e.a. 1980. - P. 545-546.

169. Lichtner F.T., Spanswick R.M. Sucrose uptake by developing soybean cotyledons II Plant Physiol. -1981. - V. 68, N 3. - P. 693-698.

170. Lin W. Energetics of sucrose transport into protoplasts from developing soybean cotyledons// Plant Physiol. -1985. - V.78, N 1. - P. 41-45.

171. Lomax T.L., Mehlhorn R.J. Determination of osmotic volums and pH gradients of plant membrane and lipid vesicles using ESP spectroscopy II Biochim. et Biophys. Acta. - 1985. -V. 821, N 1. -106-114.

172. Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. - V. 193, N 2. - P. 265-275.

173. Lunevsky V.L., Zherelova O.M., Vostrikov J.V., Berestovsky G.N. Excitation of Characeae cell membranes as a result of activation of calcium and chloride channels // J. Membr. Biol. -1983. - V. 72, N 1. - P. 43-58.

174. MacRobbie E.A. Signal-transduction and ion channels in guard cells // Philos. Trans R. Soc. Lond. B. Biol Sci. -1998,- 353(1374). - P. 1475-1488.

175. Marra M., Fogliano V., Zambardi A., Fullone M.R., Nasta D., Aducci P. The H+-ATPase purified from maize root plasma membranes retains fusicoccin in vivo activation // FEBS Lett. -1996. - V. 382, N 3. - P. 293-296.

176. Marre E., Ballarin-Denti A. The proton pumps of the plasmalemma and the tonoplast of higher plants // J. Bioenerg. Biomembr. - 1985. - V. 17, N 1. - P.1-21.

177. Marre M.T., Moroni A., Albertgoni F.G., Marre E. Activation of the H+-pump by ferricyanide-induced potential depolarization and cytoplasm acidification // Plant Physiol. -1988. -V. 87, N 1. - P. 25-29.

178. Marschner H. Mineral nutrition of higher plants. L.etc.: Acad. Press, 1986. -674 p.

179. Marshall J., Corzo A., Leigh R.A., Sanders P. Membrane potential dependent calcium transport in right-side-out plasma membrane vesicles from Zea mays L. Roots II Plant J. -1994. - V. 5. - P. 683-694.

180. Maszbek L., Szabo Т., Fesus L. A highly sensitive method for the measurement of ATPase activity II Anal. Biochem. -1977. -V. 77, N 1. - P. 286-288.

181. McCaig C.D. Physiological electrical fields modify cell behavior // Bioessays. -1997.-V. 19, N9.-P. 819-826.

182. McMurchie E.J., Pomeroy M.K. Isolation and properties of ion-stimulated ATPase activity associated with Cauliflower plasma membranes // Plant Physiol. -1981. - V.68, N 3. - P. 626-630.

183. Meharg A.A., Blatt M.R. N03-transport across the plasma membrane of Arabi-dopsis thaliana root hairs: kinetic control by pH and membrane voltage // J. Membr. Biol. -1995. -V. 145, N 1. - P. 49-66.

184. Melamed-Harel H., Reinhold L. Hysteresis in the responses of membrane potential, membrane resistance and growth rate to cyclic temperature change // Plant Physiol. -1979. - V. 63, N 6. - P. 1089-1094.

185. Michelet B., Boutry M. The plasma membrane H+-ATPase. A highly regulated enzyme with multiple physiologicfl function // Plant Physiol. -1995. - V.108, N 1. -P. 1-6.

186. Moran N., Ehrenstein G., Iwasa K., Mischke C., Bare C., Satter R.L. Potassium channels in motor cells of Samanea saman: A patch clamp study // Plant Physiol. -1988. - V. 88, N 3. - P. 643-648.

187. Morre D.J., Peter A.D., Morre D.M., Van Astine J.M. Effect of centrifugation on separation be aqucons two-phase partition of an early and late endosome model using inside-out plasma membrane vesicles from plants II J. Chromatogr. -1998. -V.711 (1-2). - P. 195-201.

188. Ohki S. The origin of electrical potential in biological systems II Comprehensive Treatise Electrochem. -1985. -V. 10. - P. 1-130.

189. Oka K., Naiton S., Yoshida M., Ishikava H., Ohta E., Sakata M. Membrane potential measurement of protoplast isolated from Vigna mungo hypocotyl using a fluorescent probe dis-C3-(5) II Plant Cell Physiol. -1987. -V. 28, N 5. - P. 843850.

190. O'Neill S.D., Spanswick R.M. Solubilization and reconstitution of vanadate-sensitive H+-ATPase from the plasma membrane of Beta vulgaris // J. Membr. Biol. - 1984. -V. 79, N 3. - P. 231-243.

191.0'Shea P.S., Feuerstein-Thellen S., Azzi A. Membrane-potential-dependent changes of lipid microviscosity of mitochondria and phospholipid vesicles // Bio-chem. J. - 1984a. - V.220.- P. 795-801.

192. O'Shea P.S., Thelen S., Petrone G., Azzi A. Proton mobility in biological membranes: the relationship between membrane lipid state and proton conductivity // FEBS Lett. - 1984b. - V. 172. - P. 103-108.

193. Palmgren M.G. Why isoform of the plant plasma membrane H+-ATPase ? II Symp. Soc. Exp. Biol. -1994. -V. 48. - P. 23-31.

194. Perlin D.S., Spanswick R.M. Characterization of ATPase activity associated with corn leaf plasma membranes II Plant Physiol. -1981. - V. 68, N 3. - P. 521527.

195. Pierce W.S., Hendrix D.L. Utilization of enzyme markers to determine the location of plasma membrane from Pisum epicotyls on sucrose gradients // Planta. -1979. - V.146, N 2. - P. 161-169.

196. Pineros M., Tester M. Characterization of a voltage-dependent Ca2+ selective channel from wheat roots // Planta. -1995. - V. 195, N 2. - P. 478-488.

197. Poole R.G., Briskin D.P., Kratky Z., Johnstone R.M. Density gradient localization of plasma membrane and tonoplast from storage tissue of growing and dormant red beet. Characterization of proton-transport and ATPase in tonoplast vesicles // Plant Physiol. -1984. - V. 74, N 3. - P. 549-556.

198. Quinn P.T. The fluidity of cell membranes and its regulation // Progr. Biophys. And Mol. Biol. -1981. -V. 38, N 1, - P. 1-20.

199. Reid R.J., Dejaegere R., Pitman M.G. Regulation of electrogenic pumping in barley by pH and ATP // J. Exp. Bot. -1985. - V. 36, N 165. - P. 535-549.

200. Reinhold L., Kaplan A. Membrane transport of sugars and amino acids // Ann. Rev. Plant Physiol. -1984. -V. 35< N 1. - P. 45-60.

201. Ripp K.G., Viitanen P.V., Hitz W.D., Francesahi V.R. Identification of a membrane protein associated with sucrose transport into cells of developing soybean cotyledons II Plant Physiol. -1988. - V.88, N 4. - P. 1435-1445.

202. Roberts G., Beauge L. Complex ATP-activation kinetics of plant H+-translocating ATPase . May or not two substrate sites // Eur. J. Biochem -1997. -V. 246(1), N 1.-P. 228-232.

203. Schauf C.L., Wilson K.J. Properties of single \C and CPchannels in Aselepias tuberosa // Plant Physiol. -1987. - V. 85, N 2. - P. 413-418.

204. Schmitt M.R., Hitz W.D., Lin W., Guaquinta R.T. Sugar transportinto proto-plastsisolated fromdeveloping soybean cotyledons. II Sucrose transport kinetics, selectivity and modelling studies // Plant Physiol. - 1984. - V. 75, N 4. - P. 941946.

205. Schmidt C., Schroeder Anion selectivity of slow anion channels in Vicia faba guard cells: large nitrate permeability // Plant Physiol. - 1994. - V.106, N 2. - P. 383-391.

206. Schonkneht G., Hedrich R., Junge W., Raschke K. A voltage-dependent chloride channel in the photosynthetic membrane of a higher plant // Nature. -1988. -V. 336, N 3. - P. 589-592.

207. Schuldiner S., Rottenderg H., Avron M. Determination of ApH in chloroplasts. 2. Fluorescent amines as a prode for the determination of the ApH in chloroplasts // Eur. J. Biochem. - 1972. - V.25, N 1. - P. 64-70.

208. Serrano R. Structure and function of plasma membrane ATPase II Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. -1989. -V. 40. - P. 61-94.

209. Shakya R., Sturm A. Characterization of source- and sink-specific sucrose/H+ symporters from carrot II Plant Physiol. -1998. - V. 118, N 4. - P. 1473-1480.

210. Singh A.K., Amin M Effect of extracellular pH on a membrane potential and cetoplasmic steaming in Nitella and Chara cells II Indian J. Exp. Biol. -1991. - V. 29, N 3. - P. 201-204.

211. Slayman S.L. The plasma membrane ATPase of Neurospora: a proton pumping electroenzyme // J. Bioenerg. Biomembr. -1987. -V. 19, N 1. - P 1-20.

212. Strehler B.L. Adenosine-S"-triphosphate and creatin phosphat. Determination with luciferase // Method of enzymatic analysis. New-York: Academic Press, 1965. - P. 559-572.

213. Sze H. H+-translocating ATPases: Advances using membrane vesicles II Annu. Rev. Plant Physiol. -1985. - V. 36, N 1. - P. 175-202.

214. Sze H., Churchill K.A. Mg2+/KCI-ATPase of plant plasma membranes is an electrogenic pump II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci. -1981. - V. 78, N 9. -P. 5578-5582.

215. Sze H., Hodges Т.К. Characterization of passive ion transport in plasma membrane vesicles of oat roots // Plant Physiol. -1976. - V. 58, N 3. - P. 304-308.

216. Terlau H., Stuhmer W. Structure and function of voltage-gated ion channels II Naturwisseuschaften. -1998. - Bd. 85, H.9. - S. 437-444.

217. Tomiyama K., Okamoto H., Katou K. Effects of infections on the passive and electrogenic component of the membrane potential of potato tuber cells // Physiol. Plant Pathol. -1983. - V. 22, N 1. - P. 233-243.

218. Trebacz K., Simonis W., Sohonkneht G. Cytoplasmic Ca2+, K\ CI" and N03~ activities in the liverwort Conocephalum conicum L. at rest and during action potentials // Plant Physiol. - 1994. - V. 106, N 3. - P. 1073-1084.

219. Tsong T.Y., Lin D.-S., Chauvin F., Gaigalas A., Astumian R.D. Electroconfor-mational coupling (ECC): an electric field induced enzyme oscillation for cellular energy and signal transduction // Bioelectrochem. Bioenerg. - 1989. - V. 21, N 3. -P. 319-331.

220. Tu S.-l., Loper M.T., Brauer D., Hsu A.-F. The nature of proton-translocating ATPases in Maize roots // J. Plant Nutr. -1992. - V. 15, N 6-7. - P. 929-944.

221. Tu S.-l., Sliwinski B.J. Mechanistic investigation on the temperature dependence and inhibition of corn root plasma membrane ATPase // Arch. Biochem. Biophys. -1985. -V. 241, N 2. - P. 348-355.

222. Uribe E.G., Luttge U., Solute transport and life functions of plants // Amer. Sci. -1984.-V. 72. - P. 567-573.

223. Vogelzang S.A., Prince H.B. Patch clamp analysis of the dominant plasma membrane iC-channel in root cell protoplasts of Plantago media L. Its significance for the P and K state // J. Memb. Biol. - 1994. - V. 141(2), N 1. - P. 113122.

224. Ward J.M., Pei Z.-M., Schroeder J.I. Roles of ion channel in itritiation of signal transduction in higher plants // Plant Cell. -1995. - V. 7. - P. 833-844.

225. Walmsley A.R. The dynamics of the glucose transporter // Trands. Biochem. Sci. -1988. - V. 13, N 6. - P. 226-231.

226. Widell S., Lundborg T., Larsson C. Plasma membranes from oats prepared by pertition as aqueaus polymer two-phase system II Plant Physiol. -1982. - V. 70, N5. - P. 1429-1435.

227. Williams L., Thorn M., Maretzki A. Characterization of a proton translocating ATPase and sucrose uptake in a tonoplast-enriched vesicle fraction from sugarcane // Physiol. Plant -1990. - V.80, N 2. - P. 169-176.

228. Wright J.P., Fisher D.B. Measurement of sieve tube membrane potential // Plant Physiol. -1980. - V. 65, N 6. - P 58-61.

229. Wright J.P., Seckler R., Overath P. Molecular aspects of sugar: ion cotrans-port //Annu. Rev. Biochem. - 1986. - V. 55. - P. 225-248.

230. Zocchi G., Hanson J.B. Calcium transport and ATPase activity in a microsomal vesicle fraction from corn roots // Plant, Cell and Environ. -1983. - V.6, N 3 -P.203-209.