Влияние фито - зооэкстрактов на вирусрепродуцирующие свойства культивируемых клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Хазиев, Ленар Ринатович

• Хазиев, Ленар Ринатович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Хазиев, Ленар Ринатович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ........................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................8

1.1 Классификация культивируемых клеток животных и человека..................8

1.1.2 Методы выращивания культур клеток животных....................................................14

1.1.3 Виды контаминации клеточных культур.........................................................19

1.2 Сыворотка крови - важнейший компонент питательных сред для роста и пролиферации большинства культур клеток..........................................23

1.2.1 Биохимический состав сыворотки крови животных............................................26

1.2.2 Сыворотка крови животных и культивирование клеток....................................28

1.2.3 Влияние объективных и субъективных факторов на качество сыворотки крови для выращивания клеток..................................................................31

1.2.4 Роль сыворотки в адгезии и распластывании клеток на субстратах... 40

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................44

2.1 Материалы и методы исследований ...................................................................................44

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................57

3.1 Технологические схемы получения сывороток крови и экстрактов... 57

3.2 Физико - химический и биохимический состав сывороток крови взрослого крупного рогатого скота и их плодов, экстрактов из

мышц, остаточных сгустков крови плодов коров и комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки............... 58

3.3 Кариологический анализ перевиваемых линий клеток................................................................................ 65

3.4 Влияние экстрактов на пролиферативную активность клеток................................................................................... 73

3.5 Влияние экстрактов в составе питательных сред на репродукцию вирусов.............................................................................. 75

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.................... 86

5 ВЫВОДЫ........................................................................... 98

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................100

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................................................102

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................103

9 ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................................119

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние фито - зооэкстрактов на вирусрепродуцирующие свойства культивируемых клеток»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Новейшая биотехнология (биоинженерия) - это наука о генно - инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.

Разработка методов культивирования клеток in vitro, освоение этих методов специалистами биофабрик позволила решить многие вопросы реального производства вирусвакцин и диагностикумов. Однако, необходимо дальнейшее совершенствование методов культивирования, получение новых культур клеток, обладающих высокой чувствительностью к вирусам, создание новых клеточных систем на основе гибридизации и генетической трансформации клеток.

Проблема поиска различных биологически активных компонентов ростовой среды для наиболее эффективного культивирования клеток в вирусологии и биотехнологии актуальна. На сегодня важнейшей составной частью питательных сред, содержащей факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Она остается незаменимым компонентом ростовой среды для большинства клеточных культур (Нариманов А.А., 1991; Хижняк JI.H., Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков В.И., 2000; Рянский А.Л., 2001; Еремец В.И., 2011; Tayler W., 1974 и др.; Reuveny S. et al., 1986; Velez D. et al., 2006). При культивировании клеток чаще используется сыворотка крови крупного рогатого скота, но ее широкое использование ограничивается дефицитом и высокой стоимостью (Манцыгин Ю.А. и др., 1983; Хаертынов С.Х., 1982; Evege Е. et al. 1985; Jayme D. et al. 1988 и др.). Для стимуляции роста клеток применяются гомо -и гетеровидовые варианты сывороток крови, обычно крупного рогатого скота, лошадей и свиней. Оптимальная концентрация сывороточного компонента в среде при этом составляет 10% (Ганиев И.М., 2007; Гурьянов Н.И., 2008).

Поиск замены ее более дешевыми биологически активными веществами является перспективным (Иванов A.B. и др., 2010; Плотникова Э.М., 2012).

На ранних этапах становления культур клеток широко применялись мышечные экстракты плодов коров, но в последние десятилетия они не используются. Ранее была предпринята попытка оценки биологических свойств и биохимического состава экстрактов из мышц, печени, почек плодов коров (Гильмутдинов Р.Я., 2008; Закиров P.P., 2009; Самуйленко А.Я., 2011). Результаты исследований показали, что экстракт из мышц плодов коров является прекрасной биодобавкой в питательные среды при выращивании клеток для репродукции на них вирусов, с целью получения вакцинных и диагностических препаратов против возбудителей заболеваний сельскохозяйственных животных (Гаффаров Х.З., Гумеров В.Г., 2010; Панин А.Н., Малик Н.И.и др., 2012). Данная проблема решена не полностью, не только с технологической точки зрения, но и в связи с резким уменьшением количества плодов коров на мясокомбинатах.

1.2 Цели и задачи исследований. Цель работы состояла в оптимизации биодобавки в питательные среды при выращивании культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

© получить экстракт из кабачков и мышц щуки;

® исследовать биохимические показатели сывороток крови коров, бычков, плодов коров, экстрактов из остаточных сгустков крови, мышц плодов коров и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки;

© изучить ростстимулирующий эффект сывороток крови коров (СКК), бычков (СКБ), плодов коров (СКПК), экстрактов из остаточных сгустков крови (ЭОСКПК) и мышц плодов коров (ЭМПК), и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки (ЭК+ЭМЩ) в 10% концентрации в питательной среде на перевиваемых культурах клеток LEK, MDBK, Vero, РК-15;

« оценить репродукцию вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) на культуре клеток MDBK, парагриппа~3 (ПГ-3) на культуре клеток LEK; реовируса

на культуре Vero, выращенных на питательной среде с вышеперечисленными био добавками.

1.3 Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующего фактора в питательные среды биодобавки, состоящей из экстрактов кабачков и мышц щуки. Установлено, что комбинированный экстракт в 10% концентрации в питательной среде хорошо стимулирует рост клеток при сравнительно низкой плотности их посева - 40 тыс. кл/см2, LE К - 5.65-ЮД2, MDBK- 5,74±0,13, РК-15 -5,74±0,16, Vero - 6,85±0,11, что практически лишь незначительно уступает контролю. Дается характеристика комбинированного экстракта по основным биохимическим показателям, которые сравнительно ниже, чем у сывороток крови крупного рогатого скота и их экстрактов, но несмотря на это данная биодобавка хорошо стимулирует рост клеток Впервые проведена оценка репродукции вирусов ИРТ, ПГ-3 крупного рогатого скота на перевиваемых культурах клеток MDB К и LEK, а также реовируса тип I штамма «Lang», на клетках Vero с добавлением в их ростовую среду комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки.

Подана заявка на предполагаемое изобретение РФ «Разработка метода получения клеток почек от новорожденных крольчат». Плотникова Э.М., Глаголева И.С., Хазиев JI.P. и др.- приоритетная справка ФИПС №2013107101/ 20 (0110574) 18.02.13 г.

1.4 Практическая значимость работы. Разработана технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки; показана возможность его применения в средах для культивирования перевиваемых линий клеток с целью репродукции на них вирусов. Результаты выполненных исследований используются в производственном процессе в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань.

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях: «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); Международная

научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013 г.).

1.6 Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки на основе раствора Хэнкса в качестве биодобавки в питательные среды при выращивании перевиваемых культур клеток и репродукции на них вирусов;

2. Ростовые свойства экстракта, состоящего из биологически активных веществ растительного и животного происхождения относительно перевиваемых линий клеток LEK, MDBK, Vero, РК-15 при добавлении его в культуральную среду в концентрации 10%;

3. Репродукция вирусов на перевиваемых культурах клеток, выращенных на среде с использованием сочетанного экстракта.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 1 страницах компьютерного текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка литературы и приложений. Работа содержит 11 таблиц, проиллюстрирована 21 рисунком. Список использованной литературы включает 163 библиографических источников, в том числе 47 на иностранном языке и 4 ссылки на интернет - сайт.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Классификация культивируемых клеток животных и человека

Культивируемые клетки следует, прежде всего, подразделять по видовой принадлежности животных, от которых они получены. К настоящему времени, в лабораториях развитых стран выращиваются клетки от многих видов животных, например, от собак, китайского хомячка, крыс, мышей и т.д., но, прежде всего, интересует культивирование клеток сельскохозяйственных животных, в частности: крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец. Кроме того, следует учитывать и подразделять культивируемые клетки в зависимости от органа или ткани из которых они получены.

Список типов клеток, которые в настоящее время можно культивировать, достаточно велик. Это клетки соединительной ткани (фибробласты), скелетных тканей (кости и хрящи), гладких мышц сердца, эпителиальных тканей (печень, легкие), молочной железы, кожи, мочевого пузыря, почек, нервной системы (глиальные клетки и нейроны), хотя последние лишены способности к пролиферации, эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и много различных типов опухолевых клеток (Harris С.С., Trump B.F., Stoner G.D., 1980).

Культуры клеток получают из тканей эмбрионов или взрослых животных. В особую группу следует отнести культуры клеток, полученные из опухолей животных и человека.

Клетки, полученные из опухолей, довольно легко переходят в перевиваемые линии. Из первичных культур клеток от эмбрионов животных довольно часто получают перевиваемые культуры, чего нельзя сказать о клетках из тканей взрослых животных. Существенный вклад по получению перевиваемых линий

клеток внесли как отечественные, так и зарубежные ученые (Хаертынов С.Х., 1982; Дьяконов Л.П., 2011; Puck Т.Т. et al., 1958; Moorhead P.S., 1961; Hayflick L., 1965 и многие др.), сведения о которых отражены в каталоге клеточных культур позвоночных и беспозвоночных животных.

В 1966 г. предложена унифицированная терминология для тканевых культур животных. Основные положения ее приводятся ниже (Самуйленко А.Я., 2011).

Культура тканей (tissue culture) - сборное понятие, обозначающее систему, в которой клетки, ткани или органы сохраняют жизнеспособность или способность размножаться in vitro более 24 ч.

В зависимости от вида биологического объекта различают: культуру клеток (cell culture) - термин, который обозначает рост клеток in vitro и включает в себя также рост единичных клеток (клетки в культуре не образуют ткань); культуру тканей или органов (tissue or organ culture) - термин, который обозначает поддержание роста тканей, зачатков органов или их частей in vitro при сохранении их дифференцировки, структуры и (или) функции.

Эксплантат (explantat) - вырезанный кусок ткани или органа, используемый для культуры in vitro.

Однослойная культура клеток, монослой (monolayer) - клетки, растущие в один слой на определенной поверхности.

Суспензионная культура (suspension culture) - тип культуры, при котором клетки размножаются во взвешенном состоянии в питательной среде.

Первичная культура (primary culture) - культура, для получения которой используют клетки, ткани или органы, взятые непосредственно из организма. К этому понятию не относятся эксплантаты новообразований, возникшие вследствие введения культур клеток экспериментальному животному (Плотникова Э.М., 2010).

Клеточная линия (cell line) получается из первичной культуры после первого пассажа и складывается из большого количества клеточных линий, представленных в первичной культуре.

Стабильная (перевиваемая) клеточная линия (established cell line) -клеточная линия, обладающая способностью к неограниченному количеству пассажей. Стабильной клеточной линией считается такая, которая пассировалась не менее 70 раз с 3-дневными промежутками.

Клеточный штамм (cell strain) выводится из первичной культуры или из клеточной линии путем селекции или клонирования клеток со специфическими свойствами (маркерами). Эти маркеры должны сохраняться во время дальнейшего культивирования. При описании штамма необходимо характеризовать его свойства, например, наличие определенного хромосомного набора, специфических антигенов, устойчивости к определенному вирусу.

Подштамм (substrain) можно получить из штамма путем изоляции единичной клетки или группы клеток, обладающих свойствами, которыми не обладают остальные клетки штамма.

Клон (clone) - популяция клеток, полученная путем деления (митоза) одной клетки. Клон не всегда однороден и не должен быть таким, поэтому нельзя использовать термины «клон» или «клонированный» для обозначения однородной популяции клеток.

Клонированный штамм или линия (clones train or line) - штамм или линия, выведенные из одного клона.

Диплоидная клеточная линия (diploid cell line) -линия клеток, 75% которой имеют такой же кариотип, как и нормальные клетки того вида, из которого они выведены. Диплоидное число хромосом необязательно равнозначно диплоидному кариотипу, поскольку возможны случаи, когда клетка может терять один хромосомальный тин и приобретать дру гой. В этом случае изменяется кариотип клетки, но диплоидное число хромосом сохраняется. Такие клетки следовало бы называть «псевдодиплоидными». Описание диплоидной клеточной линии должно включать фактическое число обследованных клеток, процент диплоидных клеток и кариотип.

Гетероплоидная клеточная линия (heteroploid cell line) - линия клеток, которая содержит менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом. Это не

означает, что клетки имеют характер новообразования или обладают способностью к неограниченному росту in vitro. При описании гетероплоидной клеточной линии следует указать наряду с кариотипом процент клеток исходной линии (stemline).

Субкультура (subculture) - перенос клеток из одной системы в другую, пассаж. Пассаж (passage) - синоним субкультуры, т.е. перенос клеток из одной системы в другую. При употреблении этого термина необходимо отметить, что именно пассируется, так как вирусологи используют его для обозначения переноса выращиваемой жидкости, а не клеток. Число пассажей (subculture number) - число переносов выращиваемых клеток из одной системы в другую. Интервал субкультивирования (subculture intervall) - интервал между последующими пассажами. Этот термин не имеет ничего общего с определением «время генерации клеток».

В процессе совместного культивирования клеток разного происхождения было обнаружено, что в некоторых случаях они могут сливаться, образуя гибридные клетки. Это вызвало большой интерес и стимулировало поиски способа направленного получения гетерокарионов в больших количествах. Вначале, для этой цели был использован вирус Сендай, который вызывал слияние мембран контактирующих клеток. В процессе дальнейших исследований было установлено, что подобным действием обладает полимер полиэтиленгликоль. Развитие этих работ, в конце концов, привело к созданию гибридом — гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, получившие широкое применение в разнообразных фундаментальных и прикладных исследованиях (Эфрусси Б., 1976; Рингертц Н., Севидж Р., 1979; Иванов A.B., 2012).

Развитие исследований в выше перечисленных направлениях, а также во многих других здесь неупомянутых, постепенно привело исследователей к осознанию того факта, что выделенные из тканей и переведенные в культуру клетки уже не те, какими они были i a vivo. В культуре они выходят из-под влияния привычного микроокружения и контроля со стороны организма, и при сохранении ряда основных свойств, приобретают новые, позволяющие клеточной

популяции выживать в искусственных условиях. Так сформировалась новая область клеточной биологии под названием — биология клетки в культуре.

К особой группе культивируемых клеток относятся эмбриональные стволовые клетки.

Впервые в 1998 году в двух лабораториях Соединенных Штатов Америки были достигнуты первые успехи по длительному культивированию эмбриональных стволовых клеток человека, которые вызвали огромный научный и общественный резонанс (Thomson J. A.., Ichkovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Walnitz M.A., Swergiel J.J., Marshall V.S., 1998; Shamblott M. J., Axelman J., Wang S., Bugg E.M., Littlefield J.W, Donovan P.J, 1998).

Огромный интерес исследователей именно к этим клеткам объясняется следующими причинами. Во-первых, это пока единственный тип стволовых клеток, который удается длительное время поддерживать в культуре в недифференцированном состоянии и, следовательно, эти клетки могут быть постоянным и стандартным источником клеточного материала для клинического использования. Во-вторых, они плюрипотентны, т. е. из них можно получить путем направленной дифференцировки практически любые специализированные клетки человеческого организма.

Стволовая клетка - это незрелая клетка, способная к самообновлению и развитию в специализированные клетки организма. По своей сути стволовые клетки - это своеобразная «ремонтная бригада» организма, которая устремляется в проблемную зону и заменяет собой больные, поврежденные клетки того или иного органа. Благодаря своей способности превратиться в любую ткань, стволовые клетки могут применяться для лечения огромного количества заболеваний. Повреждения органов скелета, построенных из костной и хрящевой ткани у животных, а также проблема их реабилитации после таких травм в ветеринарной практике достаточно актуальна (www.mosbiotechworld.ru.).

Следует отметить, что при разработке методов заместительной клеточной терапии с помощью стволовых клеток взрослого организма возникает ряд серьезных проблем, которые на сегодняшний день еще не имеют решения. Во-

первых, при наследственных заболеваниях собственные клетки пациента не могут быть использованы для лечения. Во-вторых, при серьезных нарушениях обмена, сопровождающих многие хронические заболевания, или при обширных травмах собственные клетки пациента также малопригодны для имплантаций. В этих случаях единственным и доступным решением является применение аллогенных стволовых клеток, полученных от доноров. При этом помимо проблем возможной гистонесовместимости имплантируемых клеток, возникает более простая, но не менее серьезная практическая проблема — недостаток донорского материала. Поэтому с отсутствием постоянных линий стволовых клеток взрослого человека, идея использования в лечебной практике эмбриональных стволовых клеток на сегодняшний день представляется весьма привлекательной.

1.1.2 Методы выращивания культур клеток животных

Клетки большинства культур животных, включая первичные, размножаются в форме монослоя, прикрепляются к пластиковому, или к стеклянному субстрату.

Природа субстрата определяется главным образом типом используемых клеток и характером проводимых исследований. Для увеличения смачиваемости стеклянной посуды ее обрабатывают полистиролом. В особых случаях (культуры нейронов, мышечных клеток и некоторые культуры эпителиальных клеток), пластиковая поверхность покрывается желатином или коллагеном для придания ей положительного заряда. Сосуды для культивирования клеток варьируют по размеру. Определяющими факторами при выборе посуды является требуемое количество клеток (максимальная плотность большинства трансформированных культур 5*104-10:' клеток/см2). Однослойные стационарные культуры применяются в вирусологии довольно продолжительное время и этот метод выращивания клеток является незаменимым. При использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов.

С этой точки зрения, более выгодны роллерные культуры, которые экономичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.

Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой.

Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для культивирования используют 0,5-3,0- х литровые бутыли. В производственных

условиях объем их может достигать до 20 литров и более. Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их несложно. Важное значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения емкостей варьировали от 8-12 об/час, до 1 об/мин, Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость зращения флаконов в пределах 0,5-1 об/мин. Рекомендуется, в течение первых 30 мин после посева клеток, обеспечить высокую скорость вращения емкостей (0,5-1 об/мин) для равномерного распределения клеток, затем перевести их на низкую скорость вращения (20 - 30 об/час).

Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необходима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преимуществом роллерного культивирования по сравнению с традиционными стационарными культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред и высокий выход вирусного антигена (на \-2ig). (Бенюмович М.С., 1990).

Следующим методом более эффективного накопления больших количеств клеток является суспензионное культивирование клеток, которое было предложено Оуенсом с сотрудниками в 1953 году. Впервые показана способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспензионном состоянии.

Многие зарубежные биотехнологические компании в настоящее время производят специализированные безсывороточные среды для суспензионного культивирования тех или иных клеточных линий, количество которых исчисляется многими десятками. Однако, в отечественных источниках подобные работы практически не встречаются, возможно ввиду того, что описываемые технологии культивирования клеток в России пока являются уделом немногочисленных биофармацевтических компаний. Количество клеточных

культур, чувствительных к широкому спектру вирусов разных таксономических групп и способных к активной пролиферации при безопорном (суспензионном) способе культивирования, крайне ограничено. Чаще всего данным способом культивируется линия клеток СНО (Жданова H.A., Юрков С.Г, Бурдинская О.Н, 2008; Лобанова Н.В, Трусова И.Н. и др., 2011; Петров A.B., Пигарева Н.В. и др, 2012; Лобанова Н.В, Нурбаков A.A. и др, 2013).

Клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных типов клеточных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, находятся в суспензионном состоянии, благодаря постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «урожай», чем в стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.

Концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до 10*105 в 1.

5 3

Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии бывает 2-5*10 в 1 см . Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными магнитными мешалками, а также круговыми качалками, что позволяет уменьшить риск их повреждения. В настоящее время широко применяют вращение флаконов и бутылей вокруг продольной оси (15 - 40 об/мин). На магнитных мешалках скорость вращения составляет 100-200 об/мин. Скорость перемешивания зависит от объема культуры; малые объемы культуры требуют невысокой скорости, тогда как ее необходимо увеличить при больших объемах. Для предотвращения оседания клеток на внутренней поверхности сосуда производят силиконизирование. Силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда.

Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при pH 7,0-7,2. Питательные среды, применяемые для выращивания клеток в суспензии, не отличаются от сред, используемых для выращивания клеточных линий в

однослойной культуре. Чаще всего при культивировании клеток в суспензиях берут среду Игла с двукратной концентрацией аминокислот и витаминов. Суспензионные культуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем монослойные.

Различные аминокислоты используются из питательной среды растущими клетками с неодинаковой скоростью.

Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является парциальное давление кислорода в жадкой среде. Концентрация кислорода в газовой фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже атмосферной. Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы, клетки теряют правильную округлую форму. При небольшом избытке кислорода клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода. Оптимальная концентрация кислорода для различных клеточных культур находится в пределах от 9 до 17% или 293 мм рт. столба.

Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концентрации клеток в исходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питательной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.

Суспензионные культуры широко используются в вирусологических исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов (Тутов И.К., Ситьков В.И., 1997; Гумеров В. Г., 1999).

Наиболее эффективным из всех методов выращивания клеток в настоящее зремя является метод культивирована клеток на «микроносителях», который предложен Van Werel в 1967 году, и сочетает элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток (Дьяконов Л.П., 2009).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Хазиев, Ленар Ринатович, 2013 год

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авторское свидетельство (A.C.) № 1813783, «Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей»; Гурьянов Н.И., Юсупов Р.Х., Коксин В.П., Гурьянова В.А., Ильясова В.А. и Ильясова Г.Х., 26.04.1990, зарегистрирован 11.10.1992

2. Авторское свидетельство (A.C.) № 1151577 «Питательная основа для культивирования патогенных микроорганизмов»; Ганиткевич М.И., Черняк Б.И./ СССР// Открытия. - № 15. - 1985.

3. Авторское свидетельство (A.C.) № 1025722, Панкова Г.Е., Сергеев В.А., Дьяконов Л.П. и др./ СССР// - 1981.

4. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков/ Р. Адаме// - М., 1983. - 264 с.

5. Акиншина, Г.Т. Методические положения по культивированию и длительному хранению в культурах клеток возбудителя токсоплазмоза (Toxoplasma gondii, Sporozoa) в научных и производственных паразитологических лабораториях/ Г.Т. Акиншина, М.И. Гулюкин, Т.В. Гальнбек, А.Г. Алимов// М.: - 2012. - С. 11.

6. Андреева, М.А. Изучение возможности использования сывороток, обработанных полиэтиленгликолем, в производстве вирусных препаратов/ М.А. Андреева, Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, С.Б. Шмелева// Цитология. - Т.38. - № 2. - 1996. - С. 175176.

7. Бенюмович, М.С. Суспензии клеток человека и животных/ Бенюмович М.С. // ч. 1 Итоги науки и техники ВИНИТИ, серия «Цитология», М.. - Т.6. - 1990. - 300 с.

8. Борхсениус, С.Н. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, взаимодействие с иммунной системой млекопитающих, патогенность, диагностика/ С.Н. Борхсениус, O.A. Чернова, М.С. Вонский// - СПб.: Наука. -2002.-319 с.

9. Бутко, М.П. Чувствительность перевиваемой культуры клеток СПЭВ, выращенных на среде гемогидролизат к корона - и энтеровирусам свиней/М.П.

Бутко, А.Г. Батиашвили, В.Ф. Нестеренко// Вопросы зоогигиены, дератизации и санитарной микробиологии в промышленном животноводстве. - М., 1983. - С. 102-104.

10. Вангели, C.B. и др. Характеристика перевиваемых культур клеток, хронически инфицированных ВЛКРС/С.В. Вангели, М.И. Гулюкин Г.А. Надточей, JI.A. Иванова, О.Н. Рудакова// Ветеринария. - № 10. - 2007. - С. 50 - 52.

11. Велеева, Е. Новые питательные среды для выращивания культур клеток/ Е. Велеева, П. Текерлеков// Ветер. Сб. - Т. 82. - №3. - 1984. - С. 13 - 15.

12. Велямов, М.Т. Чувствительность культур клеток, выращенных в питательных средах из гидролизатов белков гороха и сои, к вирусам парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота/ М.Т. Велямов// Автореф. дис. ... канд. вет. наук. -М., 1986. - 19 с.

13. Витакер, А. Новые методы культуры животных тканей/ А. Витакер, Дж. Мульвани, М. Розенбаум и др.// Пер. -с англ.- М.: Мир, 1976.- С. 255. •

14. Воронин, Е.С. Биотехнология. С.-Петербург ГИОРД. - 2008. - С. 60. <

15. Волкова, О.Н. Сыворотка тюленя — компонент ростовой среды для клеточных культур млекопитающих. Исследование цитотоксичности и ростстимулирующий активности сыворотки/ О.Н. Волкова, С.И. Поликарпова, А.М. Седов, О.Г. Саканделидзе/'/ Биотехнология. - №2. - ] 991. - С. 38-40.

16. Гаврилов, С.Н., Опарин В.Н., Курносое А.Н./ С.Н. Гаврилов, В.Н. Опарин, А.Н. Курносов/ Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии, эпизоотологии// -Покров, - 1981.-С. 36-38.

17. Гаенко, Т.П. Бессывороточное культивирование генно - инженерных клеток-продуцентов ГМ - КСФ. Условия культивирования и синтез ГМ- КСФ/ Т.П. Гаенко, P.A. Алибаева// Биотехнология. - №11-12. - 1993. - С. 39-41.

18.Ганиев, И.М. Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов: Автореф. дис. ... канд.вет.наук. - К., 2007 - 19 с.

19. Галахарь, H.JI. Культивирование гибридом в среде, содержащий сыворотку эмбрионов овец/ Н.Л. Галахарь, С.Н. Дьяченко// Цитология. - Т. 29. - № 9. - 1987. -С. 1078.

20.Гаспарян, Г.Г. Межклеточные контакты ускоряют рост клеточных колоний в культуре клеток куриного эмбриона/ Г.Г. Гаспарян, A.B. Саркисян, P.M. Саядян и др.// Цитология. - Т. 39. - № 7. - 1997. - С. 566 - 570

21.Гаффаров Х.З. Моно -и смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят/Х.З. Гаффаров, А.В.Иванов, Непоклонов Е.А.и др. -Казань -Из-во, «Фэн»-2002.- С351-362.

22.Голубев, Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии/ Д.Б. Голубев, A.A. Соминина, М.Н. Медведева - Л.: Медицина, 1976.- С. 222.

23.Гильмутдинов, Р.Я. Сравнительное изучение сывороток крови разных видов животных и тканевых экстрактов плодов коров при культивировании клеток/ Р.Я. Гильмутдинов, Н.И. Гурьянов, P.P. Закиров, Н.В. Бадрутдинов// Актуальные вопросы аграрной науки и образования. Матер. Междунар. науч. - практ. конф., посвященной 65- летию Ульяновской ГСХА. - Т. 4. - 2008. - С. 31- 35.

24. Гизитдинов, H.H. Разработка паточного способа изготовления сухих белковых гидролизатов гороха и сои/ H.H. Гизитдинов. Ю.Х. Бахтахунов, М.Т. Велямов// Вестник с.-х. науки Казахстана. - №1. - 1984. - С. 62 - 64.

25. Гудкова, Д.А. Зависимость пролиферации клеток линии ЗТ 6 в полностью бессывороточной среде от эпидермального фактора роста/ Д.А. Гудкова, А.Б. Сорокин// Цитология. - Т. 29 - № 2. - 1987. - С. 1309 - 1313.

26.Гурбанов, С.М. Культивирование линий лимфобластоидных и миеломных клеток в среде на основе ферментативного гидролизата мышечных белков/ С.М. Гурбанов, В.А. Сергеев, В.К. Сологуб, В.И. Кис// С. - х. биол. - №2. - 1987. - С. 112-116.

27. Гурьянов, Н.И. Качество сыворотки крови коров и бычков/ Н.И. Гурьянов// Ветеринария. - № 4. - 2000. - С. 24-25.

28. Гурьянов, Н.И. Преимущество использования сыворотки крови из сердца бычков для культивирования клеток/ Н.И. Гурьянов и др.// Ветеринария. - №7. - 2008. -С.

29. Гумеров, В.Г. Сравнительное изучение эффективности ассоциированной вакцины против ПГ - 3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота/ В.Г. Гумеров// Матер. Междунар. науч. - практ. конф., посвященной 125- летию КГАВМ - Ч. 4. - 1998. -С. 34.

30. Гумеров, В.Г. Оптимизация условий роплерного культивирования вирусов ПГ - 3 и ИРТ на перевиваемых линиях культур клеток/ В.Г. Гумеров, И.Г. Каримуллина, Л.И. Матвеева// Матер, конф. «Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии». - Казань, 1999. - С. - 25.

31. Гумеров, В.Г. Разработка диагностических тест - систем при ИРТ крупного рогатого скота. Научные основы обеспечения защиты животных от экзотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных 1> заболеваний/ В.Г. Гумеров, А.К. Галиуллин, Р.Г. Ахметсафин, P.P. Шарафиева и др.// Матер. Междунар. симпозиума 28 - 30 ноября 2005 г. - Ч. - 2. - Казань, 2005. -С, - 113- 117.

32. Гуненков, В.В. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии/ В.В. Гуненков, О.И. Сухарев, В.Ф. Сирота// Вопр. вирусол. - № 6. - 2003. - С. 38 - 39

33.Дебабов, Д.В. Устойчивость к антибиотикам: происхождение, механизмы, подходы к преодолению/ Д.В. Дебабов// Биотехнология. - №4. - 2012. - С. 7 - 17.

34. Дмитриева, Э.А. Изучение динамики распределения сульфгидрильных соединений в культурах клеток, тканях и органах животных при репродукции вируса ящура и вируса осповакцины/ Э.А. Дмитриева// Автореф. дис... канд. биол. наук. - К., 1968. - 20 с.

35. Дзагуров, С.Г. Проблема безопасности профилактических препаратов/ С.Г. Дзагуров// Международный симпозиум по стандартизации медицинских биологических препаратов,- М., 1976.- С. 1- 4.

36. Дьяконов, JI.П. Проблемы культивирования клеток животных и некоторые вопросы цитопатологии/ Л.П. Дьяконов//' Бол. ВИЭВ. - Вып. 19. - 1983. - С. 3-8.

37. Дьяконов, Л.П. Методические рекомендации по культивированию первичных культур и субкультур из ткани легкого плодов крупного рогатого скота/ Л.П. Дьяконов, Д.В. Лобунцова, Б.П. Аспинадзе// - М., 1985.- С. 8.

38. Дьяконов, Л.П. Получение гибридных клеток сельскохозяйственных животных и их использование для вирусологических исследований/ Л.П. Дьяконов, A.A. Кущ, Ш.М. Тугизов, Е.В. Майджи// Цитология. - № 9. - 1987. - С. 1082.

39. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии)/ Под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова// - М.: Компания Спутник+, 2000. - С. 400.

40. Дьяконов, Л.П.- «Животная клетка в культуре» (Методы и применение в биотехнологии), Изд-во «Спутник +», М., 2009. - 656 с.

41.Дьяконов, Л.П. - «Каталог клеточных культур позвоночных и беспозвоночных животных», М,, 2011. - 155 с.

42. Егоров, Е.Е. Усиление контроля пролиферации в теломеризированных клетках/ Е.Е. Егоров, М.В. Молдавер, Х.С. Вишнякова и др.// Сб. Конфер. «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» - М. - 2005. - С. 30-31

43. Еремец, В.И. Совершенствование и стандартизация технологических процессов, методов контроля и управления качеством противовирусных вакцин/ В.И. Еремец, А.Я. Самуйленко, Н.К. Еремец и др.//' Ветеринарный врач. - №3. — 2011.— С. 4-7.

44.Елисеев, Т.А. Питательная среда для суспензионного культивирования клеток ВНК - 21/ Т.А. Елисеев, К.Г. Шмаленко// Ветеринарная биотехнология. Матер. Междунар. науч. - практ. конф., посвящ. 80 - летию ФГУП. - Щелково, 2004. - С. 136- 138.

45. Жданова, H.A. / H.A. Жданова, С.Г. Юрков, О.Н. Бурдинская// ВНИИВВиМ, Ветеринария. - №7. - 2008. - С.57 - 58

46. Жестерев, В.И./ В.И. Жестерев, Сергеев В.А., Хижинская В.П. и др.// Цитология. - №4. - 1986. - С. 465 - 469.

47. Закиров, P.P. Применение тканевых экстрактов плодов коров при репродукции вирусов на перевиваемых линиях клеток/ P.P. Закиров// Автореф. дис. ... канд.вет.наук. - К., 2009 - 24 с.

48. Иванов, A.B. Использование экстрактов из тканей органов плодов коров при культивировании перевиваемых клеток/ A.B. Иванов, Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, И.М. Ганиев, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова// Ветеринарный врач - № 2.-2010.-С. 23-27.

49.Иванов, A.B. и др. Биологическая безопасность: молекулярно-клеточные аспекты диагностики зооантропонозов.//А.В.Иванов, Э.М.Плотникова, Р.Н.Низамов и др.-М.: Планида, 2012.-С.590-594.

50.Иванов, И.В. Сравнительная активность вируса ПГ-3, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13 и MDBK суспензионным и псевдосуспензионным способом/ И.В. Иванов// Тез.докл. Всерос.научно- практ.конф., посвящ. 30- летию института 8-9 июня 2000 г.- Щелково, 2000.- С. 40.

51 .Иванюшенкова, И.В. Культивирование вакцинных штаммов вируса африканской чумы лошадей в суспензии клеток с использованием гидролизата белков крови/ И.В. Иванюшенкова, Г.Н. Дороненкова, В.Г. Костюченко и др.// Вирусные и микробные болезни животных. Сб. науч. тр. -Владимир, 1995. -С. 179 - 181.

52.Иржанов, С.Д. Органные культуры в вирусологических исследованиях/ С.Д. Иржанов, Я.Е. Хесин// - М.: Медицина, 1977. - 159 с.

53.Конки, Д. Культуры животных клеток. Методы/ Д. Конки, Э. Эрба, Р. Фрелини и др.// Пер. с англ.- М.: Мир, 1989.- С. 333.

54. Коренева, А.И. Разработка питательных сред для культур клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина/ А.И. Коренева// Автореф. дис... канд. техн. наук. - М., 1995. - 28 с.

55. Корнилаева, Г.В. Культивирование Т - лимфобластоидных клеточных линий в средах, содержащих ростовые протеиньс/ Г.В. Корнилаева, Р.Я. Подчерняева, Е.И. Мельниченко и др.// Вопр. вирусол. - Т. 42. - № 3. - 1997. - С. 133 - 134.

56. Кравченко, А.Т. Проблема контаминации живых вакцин/ А.Т. Кравченко// Журн. микробиологии - №5. - 1971. - С. 66-71.

57. Круман, И.И. Исследование возрастного изменения ростстимулирующего влияния сыворотки на клетки ВНК-21/ И.И. Круман, С.Н. Мякишева, Б.К. Гаврилюк// Цитология. - Т. 26. - № 9 . - 1984. - С. 1043-1047.

58. Круман, И.И. Остановка роста клеток ВНК-21 и их стабилизация в состоянии покоя под действием сывороточных фракций/ И.И. Круман, Н.Ф. Остапенко, Б.К. Гаврилюк и др.// Цитология. Т. 23. - № 8. - 1981. - С. 934-943.

59.Культуры животных клеток 121 Электронный ресурс^: Основы биотехнологии. -Режим доступа: http://www.biotechnolog.ru

60. Лобанова, Н.В. Оптимизация процесса культивирования клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный интерферон - бета/ Н.В. Лобанова, И.Н. Трусова, ЕГ. Благодатских, И.О. Копылова, Л.В. Ермолина, E.H. Сауткина, P.A. Хамитов, Ю.А. Серегин// Биотехнология. - №6. - 2011. - С. 55 - 62.

61. Лобанова, Н.В. Оптимизация процессов культивирования эукариотичееких клеток - продуцентов на основе линии СНО при производстве биофармацевтических препаратов/ Н.В. Лобанова, A.A. Нурбаков, E.H. Сауткина, P.A. Хамитов, Ю.А. Серегин// Биотехнология. - №1. - 2013. - С. 8 - 25.

62. Манцыгин, Ю.А. О преимуществах использования свиной сыворотки при культивировании некоторых линий клеток животных и человека/ Ю.А. Манцыгин, Н.В. Святухина, С.А. Павулсоне// Цитология. - Т. 25. - № 10. - 1983. -С. 1197- 1201.

63 .Нариманов, A.A. Сравнительное исследование действия экстаркта плацентарной ткани и фибронектина на клетки млекопитающих invitro/ A.A. Нариманов, Б.К. Гаврилюк// Биотехнология. - № 5. - 1990. - С. 38 - 40.

64. Новиков, Д.К. Клиническая иммунопатология. Руководство/ Д.К.Новиков, П.Д.Новиков// - М.; Мед.лит. - 2009. - С. 346

65. Новохатский, A.C.. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии/ A.C. Новохатский// Итоги науки и техники. Сер. Вирусология ВИНИТИ- Т. 8. - 1979. - С. 156.

66. Онищенко, Г.Г. Оптимизация технологии производства живой культуральной противогриппозной вакцины с использованием питательной среды на основе

гидролизатов белков растительного происхождения/ Г.Г. Онищенко, H.A. Мазуркова, Г.П. Трошкова и др.// Биотехнология. - № 3. - 2007. - С. 31 - 37.

67. Панкова, Г.Е. Гидролизаты мышечных белков при культивировании тканей животных invitro/ Г.Е. Панкова, Д.А. Цуверкалов// Ветеринария. - № 5. - 1963. -С. 62-63.

68. Пат. 2455015. Способ получения сыворотки крови плодов коров для культивирования клеток животных и человека / Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, A.B. Иванов - опуб. 10.07.2012.

69. Пат. 2460786. Способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота для культивирования клеток животных и человека / A.B. Иванов, Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, A.A. Иванов, Н.В. Бадрутдинов, Р.Х. Хусаенов -опуб. 10.09.2012.

70.Петров, A.B. Адаптация клеток линии СНО - К 1 к суспензионному культивированию в коммерческих бессывороточных средах/ A.B. Петров,,Н.В. Пигарева, Б.В. Мурашев, М.М. Карасев. A.C. Симбирцев// Биотехнология. - №2. -2012.-С. 50-58.

71. Плотникова, Э.М. Культуры клеток тканей из паренхиматозных органов плода коровы. /Э.М. Плотникова, В.Г. Гумеров, И.М.Ганиев, В.Г. Цыганова, Р. Р. Шарафиева Международная научно - практ. конф. посвящ. 50 -летию ФГУ «ФЦТРБ ВНИВИ» и биологич. безопасность/Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность- Казань.-2010. - С. 447- 450.

72. Плотникова, Э.М. Применение цитогенетическихи молекулярно-генетических методов для видовой идентификации перевиваемых линий клеток животных/ Э.М. Плотникова, Е.Ю. Закирова, А.В.Иванов, Т.Х. Фаизов. //Ветеринарная медицина М1жвидомчий тематичний науковий сборник 97.-Харков.- 2013.-С.535-536.

73.Плотникова, Э.М. Изучение свойств перевиваемых линий клеток после реконсервации /Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, Е.Ю. Хамзина и др. //Ветеринария,- М.- 12.2012.-С. 54-56.

74. Плотникова, Э.М. Способ оптимизации состава и свойств культуральной среды для репродукции вирусов /Э.М.Плотникова, Н.И.Гурьянов, Л.Р.Хазиев и др.// Ученые записки КГАВМ.-Казань.-Т.211.-2012.-С.183-187.

75. Пилле, Э.Р. Современное состояние проблемы контроля биологических препаратов на отсутствие вирусов - контаминантов/ Э.Р. Пилле, С.Г. Дзагуров// Материалы научной конференции Гос. Контрольного ин-та им. Л.А.Тарасевича-М.: 1970.-С. 129-141.

76. Пилле, Э.Р. Обезьяны как источник вирусных заболеваний человека/ Э.Р. Пилле// Вопр. вирусологии - Т. 30. - 1985. - С. 129 - 141.

77. Пинаев, Г.П. Методы культивирования клеток/ Г.П. Пинаев, М.С. Богданова// Изд-во Политехи. Ун-та. - 2008. - С. 228-230

78. Пиотрович, В.А. Разработка питательных сред для культивирования культур клеток/ В.А. Пиотрович/У Автореф. дис... канд. вет. наук. - Киев, 2002,- 18 с.

79. Плохинский, H.A. Математические методы в биологии/ H.A. Плохинский// - М.: МГУ, 1978.-226 с.

80. Подчерняева, Р.Я. Применение кондиционированных питательных сред для культивирования клеток и их изучение/ Р.Я. Подчерняева, Г.А. Данлыбаева, М.В. Мезенцева, Г.Р. Михайлова, Е.И. Исаева, А.М. Рябоконь// Гос. Универ. им. Ломоносова, Москва

81. Подчерняева, Р.Я. Методические рекомендации по контролю качества жидкой сыворотки крови крупного рогатого скота, применяемой в медицинских и биологических целях/ Р.Я. Подчерняева, Г.Р. Михайлова, Е.И. Исаева и др.// Журн. Миллиметровые волны в биологии и медицине - № 1 (33). - 2004. - С. 12 -17.

82. Пол, Дж. Культура клеток и тканей/ Дж. Пол// Пер. с англ.- М.: Медицина, 1963.347 с.

83. Поликарпова, С.И. Рост клеток в культуре в средах, содержащих сыворотки отечественного производства/ С.И. Поликарпова и др.// Цитология. - Т. 29. - № 9. -С. 1099- 1100.

\

84. Простяков, А.П. Гидролизат белков сыворотки молока для питательных сред клеточных культур/ А.П. Простяков, С.П. Сергеева, Л.П. Дьяконов, Г.М. Строкина// Ветеринария. - № 7. - 1990. - С. 67 - 69.

85. Радаева, И.Ф. Получение и применение сывороток оленей и овец для культивирования клеточных линий/ И.Ф. Радаева, Г.А. Костина, О.П. Аверихин, В.В. Шапров// Биотехнология. - № 4. - 1990. - С. 36 - 38.

86. Радаева, И.Ф. Исследование свойств сывороток крови различных видов животных/ И.Ф. Радаева, Г.А. Костина, С.Б. Шмелева, М.А. Андреева// Цитология. Т. 38. - № 2. - 1996. - С. 244.

87. Раковская, И.В. Биологическая характеристика микоплазм-контаминантов тканевых культур/ И.В.Раковская// Автореф. дис... канд. биол. наук. - М., 1966. -23 с.

88. Раскин, Б.М. Всесоюзный съезд микробиологов и эпидемиологов, 16-й/ Б.М. Раскин// Тезисы докладов. - Ч. 1. - М., 1977. - С. 310 - 311.

89. Рингертц, Н. Гибридные клетки/ Ред. А.В. Зеленин// «Мир», Москва. - 1979.

90. Рянский, А.Л. Изучение ростовых свойств питательных сред фирмы HIMEDIA/ А.Л. Рянский, Н.С. Шевырев, О.В. Щербакова// Тезисы докл. Всерос. науч.- практ. конф., посвященной 30- летию института 8-9 июня 2000 г. - Шелково, 2000.- С. 112.

91. Самуйленко, А.Я. Использование культуры клеток в диагностике вирусных болезней/ А.Я. Самуйленко// Инфекционная патология животных, диагностика вирусных инфекций. - Т. 7. - 2011. - С. 17-119

92. Самуйленко, А.Я. Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК/ А.Я. Самуйленко, В.М. Попова, И.Н. Матвеева, Л.А. Скороходова// Материалы международной научно - практической конференции. «Современные методы фильтрации в биотехнологии». - 5 - 7 декабря 2012 г. е - mail: [e-mail]

93. Сергеев, В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани/ В.А. Сергеев -М.: Колос, 1966.-С. 311.

94. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных/ В.А. Сергеев - М.: Колос, 1976,- С. 302.

95. Сергеев, В.А. Суспензионное культивирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ В.А. Сергеев, С.М. Гурбанов, Е.А. Непоклонов, А.Н. Курносов// Вопр. вирусол. - № 1. - 1989. - С. 103 - 106.

96. Сергеев, В.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии/ В.А. Сергеев, Ю.А. Собко//- К.: Урожай, 1990. - 152 с.

97. Сипер, P.E. Биотехнология клеток животных/ P.E. Сипер, Дж.Б. Гриффите// Агропромиздат, М. - 1989.

98. Сюрин, В.Н. Парагриппозная инфекция крупного рогатого скота/ В.Н. Сюрин, В.В. Гуненков// Ветеринария. - № 6. - 1968. - С. 109-112.

99.Тартаковский, А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих/ А.Д. Тартаковский// Методы культивирования клеток. -Сб.науч.трудов - Л.: Наука. - 1995. - С.44 - 63.

100. Телишевская, Л.Я. Разработка методов изготовления гидролизатов для питательных сред/ Л.Я. Телишевская, С.П. Сергеева// Аграр. наука. - № 10. -2000.-С. 22-23.

101. Трошкова, Г.П. Совершенствование технологии приготовления питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки/ Г.П. Трошкова, Л.Д. Мартынец, Е.В. Кирова и др.// Биотехнология. - № 4. -2006.-С. 74-78.

102. Турчанинова, O.E. Латентные вирусы обезьян, выделенные от африканских зеленых мартышек. Стандарты, эталоны и методы контроля бактериальных и вирусных препаратов/ O.E. Турчанинова, H.H. Додонова// Труды Гос. контрольного ин-та им. Л.А. Тарасевича - Т. 1. - 1971. - С. 96 - 97.

103. Тутов, И.К. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов/ И.К. Тутов, В.И. Ситьков// Ставрополь. - 1997.

104. Федотова, A.B. Выращивание клеток щитовидной железы при пониженных концентрациях сыворотки крови/ A.B. Федотова A.B., A.B. Федотов, А.Г. Снежко, Н.С. Белавкина// Цитология. - Т. 36. - № 6. - 1994. - С. 538 - 539.

105. Хаертынов, С.Х. Взятие крови с целью получения сыворотки для культивирования клеток/ С.Х. Хаертынов, Н.К. Мамлеева// Цитология. - № 11. -1982.-С. 66-67.

106. Хамзина, Е.Ю. Применение цитогенетических и молекулярно -генетических методов для видовой идентификации перевиваемых линий клеток Vero/ Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, Э.М. Плотникова, Т.Х. Фаизов// Ученые записки Казанского университета - Т. 154. — К. 1. - 2012. - С. 126 - 132.

107. Хазиев, Л.Р. Количественный разброс хромосом культур клеток РК - 15 при культивировании в среде с добавлением сыворотки крови разных видов животных/ Л.Р. Хазиев// Матер. Междунар. науч. - практ. конф. молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов». — 2013. — С. 149-150.

108. Хазипов, Н.З. Избранные труды/ Н.З. Хазипов// - Казань: Центр информационных технологий КГАВМ. - 2007. - 338 с.

109. Шелудъко, Н.С. Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков/ Н.С. Шелудъко// - Л.: Наука, 1978. - 262 с.

110. Шептун, Н.Г. Биохимическое обоснование к получению и использованию гидролизатов фибрина и отходов производства препаратов иммуноглобулинов/ Н.Г. Шептун// Автореф. дис... канд. биол. наук. - Воронеж, 1989. - 22 с.

111. Шичкина, В.П. Инфицированность крупного рогатого скота аденовирусами/ В.П. Шичкина// Ветеринария. - № 11.- 1971. - С. 39 -40.

112. Эфрусси, Б. Гибридизация соматических клеток/ Ред. А.В. Зеленин// «Мир», Москва. - 1976.

113. Ballard, F. Effects of Growth factors on protein turnover in cultured cells/ F. Ballard// Hoppe - Beyler s Z. Physiol Chern. - 1982. - V. 363. - № 9. - P. 977.

114. Barile, M. Isolation of Mycoplasma arginine from commercial bovine sera its implication in contaminated cultures / M. Barile, J. Kern // Proc. Soc. Exp. Biol. And Med. - 1971,-V. 138. -№2.-P. 432 -437.

115. Barile, M. F. Mycoplasma infection of cell cultures // Isr. J. Med. Sci. - 1981. - V. 17. -P. 555 - 562.

116. Bergman, H. Isolirung and Charakterisierung bovine Parainfluenza - 3 - Viren in der DDR/ H. Bergman, H. Lieberman// Arch.exp. Veterinarmed- 1967. - Bd. 21. - H. 6. - P. 1485 - 1497.

117. Berman, L. Eight culture strains (Detroit) of human epithelial - like cells/ L. Berman, C. Stulberg// Proc. Soc. exp. Biol. - 1956. - V. 92. - № 4. - P. 730 - 735.

118. Bertolero, F. Effects of serum and serum-derived factors on gowth and differentiation of mouse keratinocytes/ F. Bertolero, R. Kaighn, R. Camalier, U. Saffoiotti// In Vitro. -1986.-V. 22.-P. 423-428.

119. Burke, J. Growth in retinal glial cells in vitro is affected differentially by two types of contact - mediated interactions/ J. Burke// Exp. Cell Res. - 1989. - V. 180. - P. 13 -19.

120. Chang, R. Macromolecular growth requirements of human cells in continuous culture/R. Chang, R. Pennell, W. Keller, I,. Wheaton // Proc. Soc. exp. Biol. - 1959. -V. 102. -№ 1.-P. 213-217.

121. Dunham, W. Propagation of polivirus in chick embryo cell cultures. I. Cultivation of 3 virus types/ W. Dunham, F. Ening// Proc. Soc. exp. Biol. - 1957. - V. 95. - № 4. - P. 637-639.

122. Eagle, H. Aminoacid merabolism in mammalian cell cultures/ H. Eagle// Proc. Nat. Sci. US.- 1959.-V. 130. -№3373. - p. 432-437.

123. Esber, H.G. Variability of hormone concentration and ration in commercial sera used for tissue culture/ H.G. Esber, I.J. Payne, A.E. Bogden// J.Nat.Cancer Inst. - 1973. - V. 50.-№ 2.-P. 559-562.

124. Ferguson, J. Isolation and long-term culture of diploid mammalian cell lines / J. Ferguson, A. Wansbrough // Cancer Res. - 1962. - V. 22. - № 5.- Part 1. - P. 556 -562.

125. Fogh, J. A review of cell culture contaminations/ J. Fogh, N. Holmgren, P. Ludovici// In Vitro. - 1971.-V. 7.-№ l.-P. 26.

126. Foley, G. Isolation and serial propagation of malignant and normal cells in semi-defined media. Origins of CCRF cell lines / G. Foley, B. Drolet, R. McCarthy // Cancer Res. - 1960. - V. 20. - № 6. - P. 930 - 938.

127. Gaunt, S. Cell cycle variation associated with feeder effects in cultures of Chiness hamster fibroblasts/ S. Gaunt, S. Subak - Sharpe// Exp. Cell Res. - 1977. - V. 109. - P. 341 -348.

128. Girardi, A. Growth and CF antigenicity of measles virus in cells deriving from human heart/ A. Girardi, J. Warren, C. Goldman, B. Jeffries// Proc. Soc. exp. Biol. - 1958. - V. 98. -№ l.-P. 18-22.

129. Haff, R. Serial propagation of three strai of rabbit fibroblasts; their susceptibility to infection with vaccinia virus/ R. Haff, H. Swim// Proc. Soc. exp. Biol. - 1956. - V. 93. -№2.-P. 200-204.

130. Harris, C.C. Normal Human Tissue and Cell Culture, Methods in Cell Biology/ C.C. Harris, B.F. Trump, G.D. Stoner// Acad. Press, New York. - 1980. - V. 21 $

131. Hayflick, L. The limited in vitro life time of human diploid cell strains/ L. Hayflick// Exp. Cell Res. - 1965. - P. 614 - 636.

132. Hoch - Ligeti, C. Behavior of explants from human adult bronchial epithelium in vitro/ C. Hoch - Ligeti, J. Hobbs// Proc. Soc. exp. Biol. - 1958. - V. 97. - № 1. - P. 59 -62.

133. Holmes, R. Longterm cultivation on human cell (Chang) in chemically defined medium and effect on added peptone fraction/ R. Holmes// J. Biophys. and Biochem. Cytol. - 1959. - V. 6. - P. 535 - 536.

134. Jorden, W. Human nasal cells in continuous culture. J. Establishment of two lines of epithelial - like cells/ W. Jorden// Proc. Soc. exp. Biol. - 1956. - V. 92. - № 4. - P. 867 -871.

135. Keay, L. Production of sindbis, influenza, and wesicular stomatitis viruses in chicken embryo and rat embryo cell suspensions/ L. Keay, Schlesinger// Biotechnol Bioeng. -1974. - № 16(8). - P. 1025 - 1044.

136. Kniazeff, A.// J. Methods in Enzymology. - 1979. - V. 43. - P. 233 - 257.

137. Mc. Garritty, G.J. Procedures to reduce contamination of cell cultures/ G.J. Garritty Mc., L.L. Coriell// In vitro. - 1971. - V. 6. - P. 257 - 265.

138. Melnick, J. // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). - 1952. - V. 81. - P. 208 - 210.

139. , O. Separation on growth promoting activity from horse serum by dialysis/ O.Metzger, M. Moscowitz// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1960. - V. 104. - P. 363 -365.

140. Monlander C., Kniazeff A., Boone C. et al. // In Vitro. - 1972. - V. 7. - № 3. - P. 168

- 173.

141. Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains/ P.S. Moorhead// Exp. Cell Res. - 1961. - P. 585 - 621.

142. Nelson- Rees W.A., Flandermeyer R.R. (1977). Science (Wash.), 195, 1343.

143. Nelson- Rees W.A., Flandermeyer R.R. (1981). Science (Wash.), 212, 446.

144. Nelson- Rees W.A., Flandermeyer R.R., Hawthorne P.K. (1974). Science (Wash.), 184, 1093.

145. Perry, V. The long- term tissue culture of human skin/ V. Perry, V. Evans, W. Earle, G. Hyatt, W. Bedell// Am. J. Hyg. - 1956. - V. 63. - № 1. - P. 52 - 58.

146. Puck, T.T. Long- term cultivation of euploid cells from human and animal subjects/ T.T. Puck, S.J. Cieciura, A. Robinson// J. E*p. Med. - 1958. - P. 945 - 955.

147. Puck, T. Genetic of somatic mammalian cells. Long - term cultivation of enploid cells from human and animal subjects/ T. Puck, S. Ciecura, A. Robinson// J. Exp. Med. -1958. - V. 108. - № 6. - P. 945 - 955.

148. Pumper, R. Multiplication of vaccinia vims in serum-free and serum-containing cell cultures/ R. Pumper, L. Alfred, D. Sackett// Nature. - 1960. - V. 185. - № 4706. - P. 123- 124.

149. Reuveny, S. Evaluation of a cell culture fermenter/ S. Reuveny, Z.-B. Zheng, L. Eppstein// American Biotechnol. Lab. - 1986. - January /February. - P. 28 - 36.

150. Rightsel, W.A. Detection of latent viruses/ W.A. Rightsel// Nat. Cancer Inst. Monogr.

- 1968. - V. 29.-P. 359 - 363.

151. Shamblott, M.J. Derivationof pluripotent stem cells from biology to biological substitutes/ M.J. Shamblott, J. Axelman, S. Wang, E.M. Bugg, J.W. Littlefield, P.J. Donovan et al.// Tissue Eng. - 1995. - P. 3 - 13.

152. Smith, M. The Haemagglutinin of Echovirus SAI/ M. Smith// Arch. Ges. Virusforsch. - 1969.-Bd. 28.-P. 417-420.

153. Stocker, M. Dencity - dependent inhibition of cell growth in cultures/ M. Stocker, H. Rubin// Nature. - 1967. - V. 215. - P. 171 - 172.

154. Swim, H. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially/ H. Swim, R. Parker// Am. J. Hyg. - 1957. - V. 66. - № 2. - P. 235 - 243.

155. Thomson, J.A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts/ J.A. Thomson, J. Ichkovitz-Eldor, S.S. Shapiro, M.A. Walnitz, J.J. Swergiel, V.S. Marshall// Science. - 1998. - P. 1145 - 1147.

156. Tjio, J. Genetics of somatic mammalian cells. Chromosomal constitution of cells in tissue culture / J. Tjio, T. Puck // J. Exp. Med. - 1958. - V. 108. - № 2. - P. 259 - 268.

157. Traian, E. Patent 80263, MRI3 A61K 35/22. Proceden de preparare a serului stimulat de cal, pentru culture celulate / E. Train, M. Melania, M. Marin, N. Stefan (CPP), 1982.

158. Trowell, O. Coll. Intern/ O. Trowell// CNRS. - 1961. -V. 101. - P. 237.

159. Welke, G. Vervendung von Diploidzellinien als Vermehrungssubstrat fur die Virusimpfstoffproduction/ G. Welke// Zbl. gesamte Hyg .- 1980. - Bd. 26.- P. 365 - 372.

160. www.cbio.ru

161. www.golklom.ru

162. http://www.biotechnolog.ru

163. www.mosbiotechworld.ru

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамент научно-технологической политики и образования Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

УТВЕРЖДАЮ

' Директор ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ», профессор, д.в.н. X

А.В.Иванов « зО?» A^X^JhZ^L 2011 г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по применению перевиваемой линии клеток РК-15 для репродукции вирусов-peo- типа -1, корона-, диареи в вирусологических и диагностических

исследованиях

Казань-2011

ч1 1 нг , 0 / и

УТВЕРЖДАЮ: у /^Дир'ёктор"'ФГБУ1 «ФЦТРБ-ВНИВИ», /с ГЧл 1-кор^иРАСХН^фофессор, д.в.н.

А.В. Иванов

ч г .»^

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО УСКОРЕННОМУ ПОЛУЧЕНИЮ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК и ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕТОДОМ

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ

КАЗАНЬ-2012

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

Департамент научно-технологической политики и образования Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Проект

УТВЕРЖДАЮ:

Дирек;шр^«?У «ФЦТРБ-ВЦ^ВИ>>^;лр6.фессор, д.б.н.

дадА ^орр. 'РА^^СЦ

.А'^В.Иванов

2013 г.

""-»«С.-1Ш&:

Методические рекомендации

по использованию культуры клеток МВВК с различными сыворотками крови животных при репродукции вирусов ИРТ и ПГ-3

/

Казань -2013

УТВЕРЖДАЮ Директор ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» член-корр. РАСХН,

проф. Иванов А.В. .Г

« /<Р » ОКЯлЛ, Л

ОКЛМ

ИНСТРУКЦИЯ

по получению и контролю качества комбинированного экстракта

растительного и животного происхождения при культивировании клеток и

Комбинированный экстракт . растительного и животного происхождения представляет собой прозрачную слегка коллоидную светло-желтую жидкость, состоящую из одной части экстракта кабачков и одной части экстракта мышц щуки. Данные экстракты готовятся на растворе Хэнкса при смешивании их в соотношении 1:3, а готовые экстракты -1:1.

2. Необходимые производственные помещения для приготовления комбинированного экстракта животного и растительного происхождения

Все операции по производству данного экстракта проводятся в условиях лаборатории института.

3. Необходимые оборудование, материалы, реактивы

Для производства комбинированного экстракта требуется следующее оборудование, материалы и реактивы:

- автоклавы ГК-100-3, АВ-75 (ГОСТ 19569-74);

- сосуды высокого давления (бачки из нержавеющей стали емкостью 10-20 дм3) ГОСТ 11874-66;

-микроскоп «Биолам» ГОСТ 8284-78;

- камера Горяева;

- шкаф сушильный, стерилизационный ГОСТ 2106-68;

- холодильник ГОСТ 16-317-76; •

репродукции вирусов на них 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

УТВЕРЖДАЮ Зам. директора ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по НИР, _ профессор '^^¿L^^'-Иапуниди К.Х.

« 40 » П1сгл1]ъл 2013 г

АКТ

L Li\_ А

Комиссионной проверки по получению и контролю качества комбинированного экстракта растительного и животного происхождения для культивирования клеток и репродукции на них вирусов

г.Казань ' ' 14.11.2013г.

Комиссия в составе: зав. лаб. вирусологии, д.в.н.. профессора Гаффарова Х.З. (председатель), зав. лаб. культур клеток и гибридомной технологии, д.в.н. Плотниковой Э.М., с.н.с., к.б.н. Гурьянова Н.И., вед. науч. сотрудника Гумерова В.Г., с.н.с., к.в.н. Ефимовой М.А., с.н.с., к.в.н. Каримуллиной И.Г., м.н.с. Хазиева Л.Р.. м.н.с. Глаголевой И.С в период с 10 октября по 14 ноября 2013 года провели проверку по получению и контролю качества комбинированного экстракта растительного и животьки^ происхождения для культивирования клеток и репродукции на чих вирусов на предмет соответствия требований, предъявляемых к нему.

Комбинированный экстракт растительного и животного происхождения представляет собой прозрачную слегка коллоидную светло-желтую жидкость, состоящую из одной части экстракта кабачка и одной части экстракта мышцы щуки. Данные экстракты готовятся при смешивании их составных частей с раствором Хэнкса в соотношении 1:3.

Схема технологического процесса получения комбинированного экстракта из кабачка и мышцы щуки:

1 стадия - измельчение гомогенизатором кабачков и мышц щуки,

2 стадия - залив измельченных продуктов раствором Хэнкса и их

экстракция в холодильнике, при температуре +2 0 С 24 ч,

3 стадия - сбор экстрактов, их смешивание в соотношении 1.1,

4 стадия - замораживание комбинированного экстракта,

5 стадия - размораживание и стерилизация экстракта,

6 стадия - расфасовка и маркировка экстракта,

7 стадия - упаковка, хранение и транспортировка экстракта.

Культуру клеток LEK, MDB К, Vero выращивали монослойно в

стеклянных флаконах на среде Игла MEM с 10 % -й концентрацией комбинированного экстракта из кабачка и мышцы щуки (ЭК+ЭМИ0 пои кратности пересева 1:4 - 1:5, а для расчета индекса пролиферации посевная концентрация клеток составляла 60000 клеток/мл при плотности посева

40000 клеток/см2 . Клетки выращивали в термостате при 37°С. Для установления ИП клетки подсчитывали в камере Горяева после 72-х часового культивирования.

Репродукцию вирусов ИРТ и ПГ-3 крупного рогатого скота определяли путем титрования их на культуре клеток MDBK и LEK, выращенных на среде Игла MEM с добавлением сыворотки крови плодов коров (СКПК), экстрактов из остаточных сгустков крови плодов коров (ЭОСКПК), из мышечной ткани плодов коров (ЭМТПК) и экстракта из кабачка и мышцы щуки (ЭК+ЭМЩ), а в качестве контроля использовали среду с добавлением сыворотки крови бычков.

При изучении репродукции вирусов ИРТ и 1ТГ-3 на данных культурах клеток (5 раз) установлено: что титр вируса ИРТ составлял 6,6+0,2, а вируса ПГ-3 - 6,4+0,3 Ig ТЦД50/мл.

При изучении роста и общей морфологии культуры клеток LEK, MDBK и Vero пересевали 12 раз. Установлено, что монослой образуется через 48-72 часа после пересева клеток. Монослой плотный, однородный; тяжи и «окна» отсутствуют. Клетки в монослое имеют эпителиоподобную форму, четкие границы, в цитоплазме отсутствуют посторонние включения и вакуоли. Индекс пролиферации после 5-ти опытов у этой линии клеток варьировал от 5,31 до 5,69.

Для оценки на соответствие по кариотипу этой культуры клеток проведен подсчет числа хромосом в 100 метафазных пластинках. Кариологический анализ является наиболее объективным тестом на возможную перекрестную контаминацию клеточных культур. Результаты исследований показали, что пределы изменчивости хромосомных пластинок по числу хромосом 35-80, модальный класс их 41-45 хромосом.

Контроль на стерильность культуры клеток MDBK в отношении вульгарной микрофлоры и микоплазм проведен на питательных средах МПБ. МПА_, ТПС, Кита-Тароцци, Чапека и Сабуро. Установлено, что перевиваемые линии клеток MDBK, LEK и Vero не контаминированы микоплазмами, бактериальной и грибковой микрофлорой.

Вирус репродуцирующая активность клеток на основе экстрактов кабачков и мышц щуки представлена в таблице 1

Таблица 1 - Репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на перевиваемых линиях

клеток MDBK и LEK

Вид сыворотки крови и экстрактов Культура клеток

MDBK LEK

Титры вирусов lg ТЦД50/МП

ИРТ ПГ-3

СКБ, контроль 6,6^0,2 6,5+0,1

СКПК 7,1 ±0.2** 6,8+0,3**

ЭОСКПК 6,7+0,1* 6,6+0,2*

ЭМТПК 6,5+0,3* 6,4+0,1*

ЭК+ЭМЩ 6,6+0,2* 6,4+0,3*

ТЦДЗО/.мл - тканевая цитопатическая доза вируса;

*, ** - уровни достоверности различия с контролем (р), соответственно

<0,05; <0,01.

Из данных таблицы видно, что наибольшее количество вирусной массы ИРТ и ПГ-3 было получено при использовании в качестве ростстимулирующей добавки в ростовую среду СКПК и СКБ. Из исследованных биодобавок наилучшим оказался экстракт из остаточных сгустков крови плодов коров. При этом репродукция вируса ИРТ была выше, чем вируса ПГ-3 и его титр незначительно ниже контроля.

Данные о репродукции реовируса на культуре клеток Vero, выращенной с применением сыворотки крови и экстрактов в культуральной среде отражены в таблице 2

Таблица 2 - Репродукция реовируса тип 1, штамм «Lang», на _перевиваемой культуре клеток Vero_

Вид сыворотки крови и экстрактов Титр вируса в РГА, ]/п

СКБ, контроль 32

СКПК 64

ЭОСКПК 32

ЭМТПК 64

ЭК+ЭМЩ 64

Как видно из таблицы, репродукция реовируса на культуре клеток Vero, с добавлением в культуральную среду экстракта мышц плодов коров была выше, чем в контроле с сывороткой крови взрослого крупного рогатого скота и не уступала таковой на клетках, выращенных на средах с сывороткой крови плодов коров, хотя следует отметить несколько заниженное размножение данного вируса, выращиваемого на среде с остаточными сгустками крови плодов коров и комбинированным экстрактом из кабачков и мышц щуки. Это можно объяснить тем, что питательные вещества экстрагировались амниотической жидкостью стельных коров.

Испытав ростстимулирующую активность комбинированного экстракта растительного и животного происхождения при культивировании клеток и репродукцию вирусов на перевиваемых культурах клеток, выявлена хорошая биологическая активность. При этом индекс пролиферации культивируемых клеток колебался в диапазоне 6,0 - 8,0, в зависимости от вида клеток, а репродукция вирусов была на уровне, когда в культуральную среду добавляли сыворотку крови крупного рогатого скота.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований, комиссия пришла к заключению, что разработанный экстракт растительного и животного происхождения на основе раствора Хэнкса обладает ростстимулирующей активностью для перевиваемых культур клеток и репродукции на них вирусов.

Подписи:

Председатель комиссии зав. лаб. ^^

вирусологии, д.в.н., профессор г^^уаЖ'^^^^ Гаффаров Х.З.

Члены комиссии: /У ^

вед. науч. сотрудник, к.в.н.

с.н.с.к.в.н.,

с.н.с., к.б.н.

зав. лаб. культуры клеток и гибридомной

технологии, д.в.н.

с.н.с., к.б.н.

м.н.с.

м.н.с.