Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна

• Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Строение и рост фолликулов.

2.2. Дцерно-цитоплазматическое созревание ооцитов.

2.3. Способность к созреванию и оплодотворению вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

2.4. Методы извлечения ооцитов из яичников и отбор ооцитов для культивирования и оплодотворения in vitro.

2.5. Среды и сыворотки, используемые для созревания ооцитов коров.

2.6. Подготовка ооцитов для оплодотворения in vitro.

2.7. Культуры клеток, используемые для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота.

2.8. Культивирование и сокультивирование оплодотворенных ооцитов in vitro на монослоях различных соматических клеток.

3. Собственные исследования.

3.1. Материал и методика исследований.

3.2. Влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота при культивировании вне организма.

3.3. Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сыворотки и гонадотропных гормонов.

3.4. Культивирование ооцитов в различных культуральных средах.

3.5. Влияние дозы гепарина и времени капацитации спермиев на их оплодотворяющую способность.

3 .6. Культивирование и сокультивирование предымплантационных эмбрионов на монослоях соматических клеток.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота»

Актуальность темы. Трансплантация эмбрионов является эффективным биотехнологическим методом воспроизводства животных, который используется в настоящее время для ускорения генетического прогресса в молочном скотоводстве. Низкий коэффициент размножения крупного рогатого скота и продолжительный интервал поколений существенно ограничивают возможности селекции молочного стада.

Современные экономические условия диктуют неотложную необходимость повышения интенсивности селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных качеств животных, создания современных высокопродуктивных пород, линий и гибридов скота, отвечающих требованиям постоянно меняющейся конъюнктуры рынка /50/.

В настоящее время в племенных хозяйствах генетический прогресс породы снижается из-за преждевременной выбраковки высокопродуктивных животных-вирусоносителей. Для предотвращения исчезновения наиболее ценных животных можно использовать программу эмбриопересадок. Получение эмбрионов от животных - вирусоносителей, их отмывание и обработка в растворе трипсина позволяют полностью удалить вирусы лейкоза, ринотрахеита и др., располагающиеся на оболочках клеток. Использование в качестве реципиентов здоровых животных гарантирует оздоровление стада без понижения генетического потенциала /38/.

Развитие биотехнологических методов позволяет на современном этапе эффективнее использовать репродуктивный потенциал высокопродуктивных животных. Однако использование новых биотехнологических методов, а также проведение исследований в области биологии эмбрионального развития сдерживаются высокими материальными затратами на получение эмбрионов на ранних стадия развития.

Большое значение в решении данной проблемы отводится специализации по созреванию и оплодотворению ооцитов вне организма, с целью удовлетворения потребности науки и практики в ранних эмбрионах.

Одним из путей снижения стоимости эмбрионов является получение яйцеклеток при убое высокоценных коров после выбраковки на мясо и оплодотворение яйцеклеток in vitro.

Максимальное использование генетического фонда яйцеклеток возможно лишь в условиях созревания и оплодотворения in vitro.

Эффективность получения эмбрионов вне организма в настоящее время составляет лишь 10% живого потомства. Низкий процент обусловлен, прежде всего, неполноценным созреванием ооцитов in vitro. Для обеспечения полноценного созревания ооцитов необходимо смоделировать условия in vitro близкие к естественным. Успех культивирования ооцитов вне организма зависит от многих факторов -качества культуральных сред, сочетания в культуральной среде биологически активных веществ, соблюдения температурного и газового режимов, возраста, времени года и генотипа животного. Усовершенствовать существующие методы регуляции созревания ооцитов возможно путем включения клеточных элементов интактных фолликулов и кондиционных сред, а также путем воздействия гормонов на пострецепторные внутриклеточные посредники.

Применение метода трансплантации эмбрионов по системе МОЕТ (множественная овуляция и эмбриотрансплантация) ускоряет генетический прогресс в 10 раз по сравнению с методом искусственного осеменения /39/.

Английские ученые проводили опыты по производству эмбрионов коров in vitro в большом количестве, и пришли к выводу, что применение этой технологии возможно в производстве, и в ближайшем будущем будет иметь огромное значение в развитии скотоводства /96/.

Цель и задачи исследований.

Целью нашей работы явилось совершенствование метода культивирования и оплодотворения вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

Исследования влияния эффекта биологически активного вещества на созревание и оплодотворение ооцитов in vitro подразумевает следующие этапы: 1) выявление оптимальной концентрации, в которой биологически активное вещество оказывает какой-либо эффект на мейоз ооцитов коров; 2) определение характера влияния биологически активных веществ на оплодотворение, дробление и выход качественных эмбрионов на пролонгированных стадиях развития (морула, бластоциста).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Определить влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооциов крупного рогатого скота при культивировании вне организма.

2. Определить влияние астральной сыворотки и гонадотропных гормонов на созревание и оплодотворение ооцитов in vitro. А также выявить минимальную концентрацию эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, влияющих положительно на созревание ооцитов.

3. Выяснить роль гепарина и различных сред для капацитации и времени их соинкубирования с ооцитами на оплодотворяющую способность спермиев и их выживаемость в культуральных средах.

4. Изучить влияние фолликулов и их стенок, соматических клеток на развитие зародышей после экстракорпорального оплодотворения ооцитов in vitro.

Научная новизна.

Научная новизна исследований состоит в эффективности использования биологически активных веществ для созревания и оплодотворения ооцитов in vitro. Продемонстрирована возможность преодоления блока клеточного деления на стадии 8-16 бластомеров путем использования монослоя гранулезных клеток. Впервые была установлена оптимальная доза 50мкг/мл гепарина для капацитации спермы быков, при котором процент дробления составил 42,5%.

Практическая значимость работы.

На основании результатов проведенных исследований разработаны оптимальные культуральные среды, с добавлением эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, при котором созрело ооцитов 56%, а оплодотворилось 50%. Предложено, минимизировать концентрацию эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ, что позволит получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных ооцитов in vitro. Показана одинаковая эффективность созревания, оплодотворения и развития ооцитов крупного рогатого скота в культуральных средах ТСМ-199, МРМ, МММ. Предложено сокультивирование на монослое гранулезных клеток для успешного преодоления 8-16 клеточного эмбрионального блока.

Схема основных процессов, протекающих при созревании и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота.

Спермии Капацитация

Ооциты

Созревание ооцитов в средах

Акросомная реакция гиперактивация

Первое кополярное тельце метафазы 2

Пенетрация зоны пеллюцида

Слияние мембраны гамет

Деконденсация головки спермия

Завершение мейоза

Образование пронуклеуса

Образование пронуклеуса

Сингамия, деление

Культивирование эмбрионов в средах

Культивирование эмбрионов на монослоях различных соматических клеток

Трансплантация

Заключение диссертации по теме «Физиология», Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна

5. ВЫВОДЫ.

1. При культивировании ооцитов in vitro необходимо учитывать сезон года, так как он оказывает существенное влияние на выход созревших ооцитов.

2. Созревание и оплодотворение в присутствии эстральной сыворотки, полученной от коров в раннем эструсе эффективнее, чем применение фетальной сыворотки.

3. При снижении концентрации эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ можно получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных ооцитов in vitro.

4. Среду ТСМ-199 и МММ более универсальны, и их можно использовать при капацитации спермиев.

5. При капацитации спермиев с гепарином достигается высокая степень оплодотворяемости, оптимальная доза гепарина составляет от 10 до 50мг/мл, а время капацитации от 10 до 25 минут.

6. Однослойные клеточные культуры клеток репродуктивного тракта позволяют преодолеть эмбриональный "блок" предымплантационных эмбрионов на стадии 8-16 клеток.

89

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для созревания и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота, предлагается использовать минимальную концентрацию астральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ, что позволит получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворивших ооцитов.

2. Для капацитации спермы быков, предлагается оптимальная доза 50мкг/мл гепарина, при котором процент дробления составляет 42,5%.

3. Для успешного преодоления 8-16 клеточного эмбрионального блока предложено сокультивирование на монослое гранулезных клеток, при котором стадии метафазы 2 достигло 80% ооцитов, а оплодотворилось до 20,8%.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна, 2000 год

1. Альм X, Х.Торнер / Факторы, влияющие на созревание ооцитов крупного рогатого скота при дозревании in vitro. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. -Боровск. -1990. часть 2.-е 139-140.

2. Байбеков Ф. Р., Мальцева И. В. / Результаты культивирования ооцитов коров на монослое клеток яйцевода. // Опыт подготовки кадров для сельского хозяйства зарубежных стран. М. -1992. -с. 95-97.

3. Байбеков Ф.Р. / Усовершенствование метода культивирования и оплодотворения ооцитов коров in vitro в различных культуральных системах. // Автореферат. -Дубровицы. -1992г. -с.21-24.

4. Байтлесов Е.У., Бозымов К.К. / Влияние качества и стадии развития эмбрионов мясных коров на их жизнеспособность после оттаивания. // Вопросы интенсификации животноводства. Дубровицы. -1994. -с.50-59.

5. Бугров А.Д., Ткачев И.В. / Выход ооцитов крупного рогатого скота в зависимости от размеров яичников. // Научно-технический бюллетень. -Харьков. -1996. -с.22-26.

6. Бугров А.Д., Ткачев И.В. / Зависимость выхода и качества ооцитов от типоразмеров яичников коров. // Зоотехния. №6. -1999. -с.30-31.

7. Букаров Н., Еремина М. / Молочная корова начала третьего тысячелетия. // Молочное и мясное скотоводство. -1994. -№4. -с. 24-25.

8. Бурляева Б.В., Енина Л.В., Середин В.А. / Влияние фолликулярной жидкости на созревание ооцитов in vitro. // Морфо-функциональные показатели продуктивных животных. Сборник научных трудов. -Ставрополь. 1992. - с.73-77.

9. Гавриков А.М, Кинзеев В.Н. / Влияние сезона года на результаты трансплантации эмбриона. // Молочное и мясное скотоводство. -1993. №5. -с. 19-21.

10. Голубев А.К, Макарова З.Н, Завертяев Б.П. / Получение эмбрионов коров вне организма. // ЛенЦНТИ. -1987. -с.30-39.

11. Голубев А.К, Сироткин А.В, Кузьмина Т.И и др. / Регуляция созревания яйцеклетки у сельскохозяйственных животных. // Итоги науки и техники. Серия животноводство и ветеринария. -М. -1987. -Т. 19.-с 40-45.

12. Грин Н, Стаут У, Тейлор Д. / Оплодотворение. // Биология. / Изд. Мир. -1993. с.146-147.

13. Забелина Н.В. / Добавление ооцитов коров вне организма в гомологичной фолликулярной жидкости. // Автореферат. С.Петербург-Пушкино. -1995. -с.23-29.

14. Завертяев Б.П. / Состояние и перспективы исследований по получению эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. -Алма-Ата. Талым". -1991. --с.67-76.

15. Качура В.С, Дзицюк В.В. / Капацитация спермотозоидов быка при оплодотворении вне организма и методы ее оценки. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. -Боровск. -1990. -с.120-121.

16. Кесян А.З. / Разработка условий для обеспечения развития и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота, полученных инвитро. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологичских наук. М. - 1993. --с. 13-15

17. Костина Г.А, Радаева И.Ф. / Влияние ростовых протеинов на пролиферативную активность культивируемых клеток. // Цитология. -1999. -т.41. 3/4. с.282.

18. Кочанов Н. Е и др. / Рост и атрезия фолликулов на яичниках циклирующей коровы. // Эстральный цикл коровы. Российская Академия наук. Уральское отделение. Коми научный центр. - Сыктывкар. - 1994. -с. 30-37.

19. Кузьмина Т.И и др. / Модернизация систем дозревания ооцитов коров для получения эмбрионов. // Международный симпозиум "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке изменений генома сельскохозяйственных животных. Материалы собр. -1994. -стр.29.

20. Кузьмина Т.И., Кирюкова Ю.С., Гойло Т.А. / Влияние катионных белков фолликулярной жидкости на экстракорпоральное созревание ооцитов крупного рогатого скота. // Теория и практика использования БАВ в животноводстве. Киров. -1998. -с. 47-48.

21. Лебедева И.Ю., Гойло Т.А., Кузьмина Т.И. / Влияние бычьего пролактина на синтез ДНК в культуре клеток гранулезы коров. // Бюллетень ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных. С.Петербург. -1994. -с. 10-13.

22. Мадич А. / Стимуляция раннего эмбрионального развития. // Молочное и мясное скотоводство-1998. №2-с.21-23.

23. Маленько Г.П. / Получение ранних зародышей крупного рогатого скота при дозревании и оплодотворении ооцитов вне организма. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственныхживотных. -Боровск. -1990. -часть 2. -с.127-128.

24. Малиновский А.М., Мороз Т.А., Малиновская В.А. / Применение биостимуляторов при трансплантации эмбрионов. // Теория и практика использования БАВ в животноводстве. -Киров. -1998. -с. 56-57.

25. Мальцева И, Байбеков Ф.Р. / Оплодотворение ооцитов коров in vitro в зависимости от индивидуальных особенностей семени быков. // Опыт подготовки кадров для сельского хозяйства зарубежных стран. —М. -1992. -С.99-101.

26. Мамлеев Р.С, Куанышбеков Б.М, Зубриянов A.B. / Влияние гормонов и ростовых факторов на созревание ооцитов коров вне организма. // Казахский НИТИ животноводства. -1992. -с.34-35.

27. Морено Мело Вильма. / Совершенствование метода культивирования оплодотворенных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота. // Автореферат. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. - 1992. -с.8-12.

28. Петручек А.Н., Коровко В.И. / Физиотерапевтические методы повышения оплодотворяемости коров. // Вопросы повышения продуктивности в животноводстве, звероводстве и оленеводстве Дальнего Востока. Уссурийск. -1997. -с.53-55.

29. Позднякова Т.Э, Кузьмина Т.И. / Влияние рекомбинантрого бычьего соматотропного гормона на созревание ооцитов коров. // Бюллетень ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных. -Выпуск. 410. С.Петербург. - 1994. -с.7-9.

30. Позднякова Т.Э. / Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы. // Автореферат. С-Петербург, -Пушкин-1994. -с. 20.

31. Решетникова Н.М. / Трансплантация эмбрионов как аналитический метод воспроизводства стада. // Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения. ВНИИ плем. Москва. -1992. -с 4-7.

32. Решетникова Н.М., Мороз Т.А., Малиновский А.М и соавторы. / Проблема интенсификации воспроизводства в племенном скотоводстве. // Современные аспекты селекции, биотехнологии, информации в племенном животноводстве. ВНИИплем. -Москва. -1997. -с.121-130.

33. Савченкова И.П. // Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. -Дубровицы. -1999.

34. Свиридов Б.Е. / Закономерности роста фолликулов и созревание ооцитов в яичниках коров и при культивировании in vitro. // Автореферат. — С.Петербург. 1991. -с.7-9.

35. Сергеев Н.И, Лебедев В.И, Самоделкин В.И, Тяпугин Е.Л. /

36. Эффективность применения трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве. // Сельскохозяйственная наука Севера-Востока Европейской части России. Статьи научных трудов. -Киров. -1995. -том. 3. -€.65-69.

37. Сергеев Н.И, Смыслова В.И. / Морфологическая оценка эмбрионов. // Журнал "Зоотехния", М. - 1993. - №8. - с.23-25.

38. Сироткин А.В, Мамлиеев P.C. / Влияние пептидных гормонов на созревание ооцитов коров in vitro. // Трансплантация и культивирование эмбрионов крупного рогатого скота, с.н.т. -Ленинград. -1989. С.75-78.

39. Смыслова Н.И, Сергеев Н.И, Тарадайник Т.Е, Сингина Г.Н. / Культивирование созревших и оплодотворенных in vitro ооцитов в средах с клетками воспроизводительного тракта. // Доклады РАСХН. -1999. -№2. -с.47-49.

40. Соколовская И. И. / Второй международный симпозиум по иммунологии воспроизводства. II Жив март. -1969. -#3. -с.85-86.

41. Удавленникова H.H. / Получение и развитие потомства из созревших и оплодотворенных вне организма яйцеклеток коров. // Автореферат. -М. -1992. -с.5-6.

42. Хилькевич Н.М., Тяпугин Е. / Экономические аспекты трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве. // Молочное и мясное скотоводство. -1992. 5-6. -с. 16-17.

43. Швидерски Г, Блотнер С. / Оплодотворение яйцеклеток in vitro минимальным количеством спермиев в перивителлиновое пространство. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных.-Боровск.-1990 частъ2. -с 141.

44. Шегелъская Е.А., Щербак Е.В. / Динамика событий первого мейотического деления в ооцитах коров и свиней при культивировании вне организма. // Научно-технический бюллетень. Харьков. -1996.-с.26-30.

45. Шейкин В.Н. / Фолликулогенез в яичниках коров в различные фазы полового цикла. // Биотехнология размножения сельскохозяйственных животных. Научно-технический бюллетень (ВИЖ). Дубровицы.-1989г.-е. 18-21.

46. Эрнст Л.К, Голубев А.К, Макарова З.Н. / Культивирование эмбрионов из ооцитов коров. // Докл. ВАСХНИЛ. -1982. -№12. -с26-28.

47. Эрнст Л.К, Хачатуров Е.Н, Ярных Е.В. / Получение ранних эмбрионов крупного рогатого скота вне организма. // Сельскохозяйственная биология. -1987. -№12. -х.60-65.

48. Эрнст Л.К, Кузьмина Т.И, Джоббур З.И. / Комплексное тестирование качества ооцит-кумулюсных комплексов коров. // Серия биология животных. Издательство "Известие". Сельскохозяйственная биология, - 1994, -№2, -с43-48.

49. Эрнст Л.К., Макарова З.Н и др. / Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной яйцеклетки коровы. // Вестник с.-х науки. -1983. -№7. ^с.77-86.

50. Эрнст Л.К, Прокофьев М.И. / Биотехнология сельскохозяйственных животных. // Москва. Колос. -1995. -с. 192.

51. Эрнст Л.К, Сергеев Н.И. / Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М. Агропромиздат. -1989.

52. Эрнст Л.К. / Крупномасштабная селекция новый этап совершенствования крупного рогатого скота. // Новое в животноводстве. -1985. -с. 14-35.

53. Эрнст Л.К. / Мейоз в ооцитах коров при культивировании их вне организма. // Доклад Всесоюзной ордена Ленина и орден трудового Красного Знамени академии сельскохозяйственных наук им.

54. В.И.Ленина. -М. -ноябрь 1987. -с.24-27.

55. Юрина Н.А., Торбек В.Э., Румянцева Л.С. Основные этапы эмбриогенеза позвоночных животных и человека. - Изд-во РУДН. - М. -1992. -с.17.

56. Austin C.R. / Observations on the penetration of the sperm into the mammalian eqq. //I. Sci.Res. Austral.-195 l.-V 4. -p. 581-596

57. Barnes F.L. /Characterization of the onset of embryonic control and early development in the bovine embryo. //Ph. D. Thesis. University of Winconsin. -1988. -p. 74.

58. Berg U, Brem G. / Developmental rates of in vitro produced IVM-IVF bovine oocytes in different cell co-culture systems. // Theriogenology.-1990.-vol.33.-#l. -p.195.

59. Berg U, Brem G./ Созревание и оплодотворение in vitro ооцитов, полученных при убое телок и коров, и последующее культивирование до стадии бластоцисты (ФРГ). //Zuchthygiene.-1989.-vol.24J3. -р.134-139.

60. Biggers J.D.et.al. The pattern of energy metabolism in the mouse oocyte and zygote. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1967. -v.58. -p.560-567.

61. Camous S, Heyman Y. / Влияние трофобластических пузырьков на развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота в культуре и выживание их после пересадки реципиентам.(ФРГ) //1. Reprod. Fertil. -1984. -vol.72. #2. -р.479-485.

62. Chang М.С. / Fertilizing capacity of spermatozoa Deposited into the fallopian tubes. //Nature.-Lond. -1951. -vol.168, -p.697-698.

63. Cheng W.T,Moor R.M,Polge С./ In vitro fertilization of pig and sheep oocytes matured in vivo and in vitro. // Theriogenology.-1986.-25. -p.146.

64. Chen-lu H.B and Lu К H./ Effect of protein supplements on in vitro maturation, fertilization and culture to blastocyst and natching stage of bovine oocytes. // -Theriogenology. -January-1990. -vol. 33. -#1. -p. 205.

65. Critser E. et.al. / The effect of semen extension camp and caffeine on in vitro fertilization of bovine oocytes. // Theriogenology. -1984. -vol.21. -p.625-631.

66. Critser E. S, Leibfried-Rutledge M.L. et.al. / Acquisition of development al competence during maturation in vitro. // Theriogenology. -1986. -vol.25. -#1. -p. 150-155.

67. Crosby J.M, Osbom J.C. et.al. / Follicle cell regulation of protein Synthesis and developmental competence in sheep oocytes. J. Reprod. Fert. -1981. -62. -p.575-582.

68. Crozet N. Ultrastructural aspects of in vivo fertilization in the cow. // Gamete. Res. -1984. -#10. -p.241-251.

69. Eppig., Downs S.M. / The effect of hypoxanthine on mouse oocyte growth and development in vitro; maintenance of meiotic arrest and gonadotropin -induced oocyte maturation. //Dev. Biol. -1987. -v. 119. -p.313-321.

70. Eyestone W.H, Ax R.L. / A review of ovarian follicular cysts in the cow with comparisons to the condition in women rats and rabbits. // Theriogenology. -1984. -vol. 22. -p. 109.

71. Eyestone W.H, N.L. First. / Характеристика остановки в развитии ранних эмбрионов коров, культивируемых in vitro. // Theriogenology. March. -1991. -vol. 35. #3. -p. 613-624.

72. Eyestone W.H. et.al. / Метод культивирования в яйцеводах овцы оплодотворенных яйцеклеток и двух клеточных эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты (США) // Theriogenology. -1987. -vol. 28. #1. -p. 1-7.

73. Eyestone W.H. et.al. Co-culture of early bovine embryos with oviductalepithelium. // Theriogenology. -1987. -v.27. #1. -p.228-233.

74. First N.Z, Barnes F.L. / Development of preimplantation mammalian embryos. Development of preimplantation embryos and their environment. // Alan R.Liss, Inc.-1989,-p. 151-170.

75. First NZ.Parrish J.J. / Capacitation of bovine sperm by heparin. //Biol.Reprod. -1988.-V.38.-p.l 171-1180.

76. First N.Z.Parrish J.J. / In vitro fertilization of ruminants. //J.Reprod.Fert.Suppl. -1987.-34.-p. 151-165.

77. Fukui Y, and Ono H. /In vitro development to blastocyst of in vitro matured and fertilized bovine oocytes. //Vet.Rec. -1988. -vl22. -p.282-283.

78. Fukui Y, Fukushima M.et.al./ Effect of gonadotropins, steroids and culture media on bovine oocyte maturation in vitro.// Theriogenology. -1982. -vol.18.-p.161-175.

79. Goto K, Kajihara Y. / Pregnancies after coculture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes. It I.Reprod. Fertil.-l988.-83.-p.753-758.

80. Handrow R.R, Lenz R.W, Ax R.Z./ Structural comparisons between glycosaminoglycans to promote an acrosome reaction in bovine spermatozoa.//Biochem. Biophys.Res.Commun.-1982.-107 -p.1326-1332.

81. King W.A. / The pronucles of bovine ova fertilized in vitro. // Hereditas. -1985. -vol.102, -p.293-296.

82. Langlais J,K.D.Roberts. / A molecular model of sperm capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa. //Gamete Res.-1985. -12. -p. 183-224.

83. Lee C.N et.al. / Glycosaminoglycans in ewe reproductive tracts and their influence on acrosome reactions in bovine spermatozoa in vitro. // J.Anim. Sci. -1986. -63. -p.861-867.

84. Lee C.N, Ax R.L. / Concentrations and composition of glycosaminoglycans in the female bovine reproductive tract. // J.Dairy. Sci. -1984. -67. -p.2006-2009.

85. Lee Myeng-Sik, Boh-Suk Yang et. al. / Transferable bovine embryo production by in vitro fertilization. // RDA The Reaserch Reports of the Rural Development Administration, Suwon, -Korea, -1993, -Vol.35,#2, december, -p.513-516.

86. Leibfried-Rutldge M.L. et.al. / Effect of fetal calf serum and bovine serum albumin on in vitro maturation and fertilization of bovine and hamster cumulus oocyte complexes. Biol. Reprod. -1986 -#35. -p. 850-857.

87. Lenz R.W, Ax R.L. / Proteoglicans from bovine follicular fluid enhances an acrosome reaction in bovine spermatozoa. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1982. -Vol.106, -p. 1092.

88. Lenz R.W. et.al. / In vitro Maturation and fertilization of bovine oocytes are temperature-dependent processes. //Biol. Reprod.-1983.-29. -p.173-179.

89. Lonergan, P.,C.Carolan,P.Mermillod. / Development of bovine embryos in vitro following oocyte maduration under defined conditions Reproduction. // Nutrition Development, Elsevier/INRA, -Paris, -1994, -vol. 34, #4, -p 329-339.

90. Lopata M.L. et.al. / A metod for collecting motell spermatozoa from human semen. //Fertil.Steril.-l976.-27 -p.677-684.

91. Moor.R.M,A.O.Trounson. I Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes and their subsequent development capacity. // J.Reprod.Fert. -1977.-vol.49. -p.101-109.

92. Moor.R.M. / Measurement of intercellular coupling between oocytes and cumulus cells using intracellular markers.// Exp. Cell.Res. -1980. -vol.126, -p. 15-26.

93. Parrish J.J,Susko-Parrish J.L et.al. / Bovine in vitro fertilization. // Prol. 11 Feet. Conf.A.1 and Reproduction. -1986.-pl20.

94. Parrish J.J,Susko-Parrish J.L et.al. / Role of heparin in bovine sperm capacitation. //Biol.Reprod.-1985.-32.(suppl I), -p 211.

95. Piedrahita LA. et.al. / Influence of feeder layer type on the efficiency of isolation of porcine embryo derived cell lines. // Theriogenology.-1990.-vol.34.-p.865-877.

96. Pincus Y, Enzmann E. / The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro. // Exp, Med. -1935. -vol.62, -p.665-675.

97. Roberts R.M. / Minireview: Concepts Interferons and Maternal Recognition of Pregnancy. //Biol. Reprod.-1989.-vol.40.-p449-452.

98. Rodriguez H.F, Wiemer R.S. / A bilayered fetal-cell co-culture system for culturing bovine embryos. // Theriogenol ogy. -1990. vol. 3 3. -# 1. -p.309.

99. Rosenkranz C.F.Jr.,Neal L First. / Effect of free aminoacids and vitaminson cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro. // Journal of animal science. -1994, -vol. 72, #2, p. 434-437.

100. Rutledge et.al. / Изучение возможности ооцитов крупного рогатого скота к дальнейшему развитию in vitro при созревании in vitro или in vivo (США). // Biol. Reprod. -1987. -v.36. #2. -p376-383.

101. Sanbuissho A, Coskun S. et.al. / Stimulatory action of epidermal Growth factor (EGF) on bovine oocyte maturation in serum free defined medium. // Theriogenology.-1990.-vol.33.-#l -p.318.

102. Sato E. et.al. / Prevention of spontaneous degeneration of mouse oocytes in culture by ovarian glicosaminoglicans. // Biol. Reprod. -1987. -vol.37, -p. 120.

103. Scodras J.M., Pollard J.W., Betteridge К,J. / Влияние типа соматических клеток на эмбриональное развитие коров в условиях сокультивирования. // Ontario, Canada. -Theriogenology. -January -1991. -vol. 35. -#1. -p. 269.

104. Suss U,et.al./ Cumulus expansion, in vitro fertilization and embryonic development after in vitro maturation of bovine oocytes in the presence of follicle stimulating of liteinizing hormone. // Reprod.Dom.Anim.-1990.-25. -p.3-13.

105. Voelkel S.A,et.al. / Use of a uterine-cell monolayer culture system for micromanipulated bovine embryos. // Theriogenology.-1985.-24.(3). -p.271-281.

106. Walker S.K.et.al. / In vitro culture of sheep embryos without co-culture: successes and perspectives. // Theriogenology.-1992.-vol.37. -p.111-126.

107. Wang Z.M, Macdonald. / Germination of red maple seed. Seed Science and Technology.// Theriogenology. -1993. -v 6. -p.785-790.

108. Yonis A.J, Backett T. / In vitro development of bovine oocytes into morulas and blastocysts. // Theriogenology.-1990.-vol.33.-#l.-p.362.

109. Zhou Song Chen. / Effect of supplement bovine follicular floid to the maturation medium on in vitro developmental ability of bovine follicular oocytes. // Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences. -Pekin. -1993. -Vol. 24. -No 6. -p.110-120.