Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Кустанова, Гульсара Амангалиевна

• Кустанова, Гульсара Амангалиевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кустанова, Гульсара Амангалиевна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Сепсис - общемедицинская проблема.

1.2. Современное состояние проблемы в области изучения эндотоксинового шока.

1.2.1. Структура бактериальных ЛПС.

1.2.2. Этиология эндотоксинового шока.

1.2.3. Рецепторы ЛПС.

1.2.4. Медиаторы эндотоксинового шока.

1.2.5. Влияние ЛПС на сердечно-сосудистую систему.

1.2.6. Влияние ЛПС на систему гемостаза.

1.2.7. Влияние ЛПС на биохимические параметры крови.

1.3. Белки теплового шока.

1.3.1 Структура, функции, протективная роль.

1.3.2. Современное состояние проблемы изучения протективной функции белков теплового шока.

1.3.3. БТШ и сердечно-сосудистая система.

1.3.4. БТШ и апоптоз.

1.3.5. Перспективы использования системы БТШ в медицине.

1.4. Антагонисты бактериальных эндотоксинов и их роль в защите от сепсиса.

Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. 1. Объект исследования.

II.2. Методы исследования.

П.2.1.Катетерная технология регистрации артериального давления и внутривенной инъекции препаратов.

11.2.2.Хирургические процедуры: имплантация артериальных и венозных катетеров.

11.2.3.Исследование параметров гемостаза.

II.2.4. Биохимические исследования.

11.3. Протоколы исследований.

11.4. Статистическая обработка результатов.

Глава III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Esherichia coli.

III. 1.1. Влияние на выживаемость животных.

III. 1.2. Влияние на параметры гемостаза.

III. 1.3. Влияние на параметры гемодинамики.

III. 1.4. Влияние на биохимические параметры.

111.2. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium.

111.2.1. Влияние на выживаемость животных.

111.2.2. Влияние на параметры гемостаза.

111.2.3. Влияние на параметры гемодинамики.

111.2.4. Влияние на биохимические параметры.

111.3. Превентивные эффекты ЛПС из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium.

111.3.1. Влияние на выживаемость животных.

111.3.2. Влияние на параметры гемостаза.

111.3.3. Влияние на параметры гемодинамики.

111.3.4. Влияние на биохимические параметры.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов»

Актуальность проблемы

В течение длительного времени сепсис остается проблемой медицинского, демографического и экономического значения, поскольку летальность по данным разных авторов может варьировать от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 80% (Martin et al., 2003; Белобородое, 1997). Согласно недавним литературным данным, в США и в странах Европы сепсис ежегодно развивается у 700000 пациентов, причем количество подтвержденных случаев увеличивается на 1,5 % в год (Angus, Wax, 2001; Riedermann et al., 2003).

Среди причин смертности населения США септицемия, осложненная эндотоксиновым шоком, стоит на 13-ом месте. Особо важное значение приобретают грамотрицательные инфекции в структуре внутрибольничных инфекций у детей и лиц пожилого возраста, а также у пациентов с соматическими заболеваниями. Экстремальные ситуации, стресс, физическое перенапряжение приводят к срыву адаптационных возможностей организма. Эти и другие причины в ослабленном организме приводят к генерализации процесса, крайним проявлением которого является эндотоксиновый шок. Установлено, что у 50% пациентов с сепсисом развивается септический шок, и половина из них погибает, несмотря на адекватное лечение антибиотиками и неотложную терапию (Dal Nogare, 1991).

Эндотоксин грамотрицательных бактерий способен убить человека и животных при очень низкой концентрации в крови - 1 нг/мл (Mayeux, 1997), действуя на разные клетки организма как непосредственно, так и опосредованно, через индукцию синтеза в клетках-мишенях биологически активных веществ. Специфические антитела к эндотоксину применяли в лечении септического шока в двойном слепом исследовании при внутримышечном введении антител новорожденным. Разницы между контрольной и группой новорожденных, получавших антитела, выявлено не было (Румянцев и др., 1988). В связи с изложенным, поиск средств и методов защиты от эндотоксинового шока остается чрезвычайно актуальным.

Исследования действий эндотоксинов нашли отражение в эволюции патогенетической терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов, связывающих эндотоксины, антител к эндотоксинам, ингибиторов синтеза простагландинов и других производных арахидоновой кислоты, блокирования медиаторов воспаления до вмешательства в механизмы нарушения гемостаза (Пак и др., 2003). Однако недавние клинические исследования, направленные на анализ снижения смертности пациентов от сепсиса в зависимости от применяемой терапии, показали практически отсутствие прогресса в лечении этого заболевания (Riedermann et al., 2003).

В последние годы после получения препаратов экзогенного белка теплового шока 70 кДа (БТШ70) - природного и рекомбинантного - возрос интерес к разработке новых лекарственных средств на основе БТШ70 для лечения различных заболеваний. Экспрессия белков теплового шока или стресс-белков является одним из ответов организма на воспаление (Маргулис, Гужова, 2000). В литературе имеются указания на то, что уровни экспрессии БТШ хорошо коррелируют с выживаемостью грызунов в модели эндотоксинового шока (Hotchkiss et al., 1993; Lappas et al., 1994). Эти наблюдения очень важны в клиническом отношении, поскольку могут быть использованы для создания препаратов предотвращающих развитие септического шока при грам-отрицательном сепсисе. В последнее десятилетие большое значение отводится изучению защитных свойств БТШ70. Однако эти исследования проведены в основном на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova et al., 2001). На сегодняшний день не вызывает сомнений тот факт, что исследование защитных свойств экзогенного БТШ70 против эндотоксинового шока in vivo представляют собой важный инструмент в оценке ответа целого организма на септическое воздействие и способствует развитию новых подходов к терапии сепсиса.

Еще одним из перспективных направлений в защите от грамотрицательной инфекции становятся природные антагонисты эндотоксинов или аналогичные им вещества, синтезированные химическим путем. В этой связи поиск исходно низкотоксичных липополисахаридов (ЛПС), обладающих свойствами антагонистов эндотоксинов имеет первостепенную значимость (Gangloff et al., 1999). Работы в этом направлении начались в 80-е годы, когда были выделены из фотосинтезирующих бактерий низкотоксичные липополисахариды (Qureshi et al., 1988, Krauss et al., 1989) и в экспериментах in vitro показана их способность конкурировать с эндотоксинами за рецепторы клеток-мишеней (Rietschel et al., 1994). К числу таких низкотоксичных липополисахаридов относится ЛПС из фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus). Проведенные ранее исследования на клеточных культурах показали способность защитного действия ЛПС из Rb. capsulatus от некоторых эффектов эндотоксинов (Грачев и др., 1998; Винокуров и др., 2003). Однако, исследования этого препарата in vivo на выявление его защитных свойств, ранее не проводились.

Цель работы

Целью данной работы являлось изучение влияния БТШ70 и ЛПС из Rb. capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов из Esherichia coli (Е. coli) и Salmonella typhimurium (S. typhimurium).

Задачи исследования

1. Исследовать влияние экзогенного БТШ70, в зависимости от способа его применения, на гибель животных, вызванную эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium.

2. Изучить действие экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения параметров гемостаза.

3. Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения биохимических параметров крови.

4. Изучить влияние ЛПС из Rb. capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из S. typhimurium.

Научная новизна работы

Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено исследование эффектов БТШ70 на животных in vivo. Показано, что БТШ70 при предварительном введении снижает смертность животных от шока, индуцированного разными эндотоксинами, отменяет эндотоксин-индуцибельное увеличение параметров гемостаза. В экспериментах in vivo на крысах впервые проведено исследование защитного действия антагониста эндотоксина низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus. Показано, что предварительное введение низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus снижает смертность животных от эндотоксинового шока, снижая его эффекты на организм.

Научно-практическое значение

Полученные результаты показывают, что БТШ70 и ЛПС из Rb. capsulatus могут быть рекомендованы для создания новых фармакологических препаратов для профилактики от эндотоксинов. Создание таких препаратов имеет важное социально-экономическое значение, поскольку они могут быть использованы не только как лечебное средство при эндотоксемии, но и в профилактических целях для предупреждения возникновения подобных осложнений.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Кустанова, Гульсара Амангалиевна

выводы

1. Показано, что экзогенный БТШ70 снижает физиологические эффекты эндотоксинов. Эффективность БТШ70 зависит как от способа его применения, так и от структуры эндотоксинов. Предварительное введение БТШ70 за 10 минут до эндотоксинов как из Е. coli, так и из S. typhimurium уменьшает гибель животных. При введении БТШ70 после эндотоксинов его защитные свойства проявляются только в случае применения эндотоксина из S. typhimurium.

2. Предварительное введение БТШ70 полностью предотвращает вызванное эндотоксинами из Е. coli или S. typhimurium увеличение следующих параметров гемостаза: тромбопластинового времени свертывания крови, протромбинового времени свертывания крови, концентрации фибриногена, времени фибринолиза. При введении БТШ70 после эндотоксинов также наблюдается нормализация изучаемых параметров гемостаза за исключением тромбопластинового времени свертывания крови.

3. Обнаружено, что только при предварительном применении БТШ70 наблюдается его влияние на гемодинамические эффекты эндотоксинов. Введение БТШ70 после эндотоксинов не влияет на изменения гемодинамических параметров, вызванные эндотоксинами.

4. Предварительное введение БТШ70 полностью предотвращает эндотоксин-индуцированные изменения содержания в крови глюкозы, белков, креатинина, триглицеридов, билирубина, тогда как введение БТШ70 после эндотоксинов вызывает нормализацию только глюкозы и белка, вызванную эндотоксином из Е. coli.

5. ЛПС из Rhodobacter capsulatus проявляет защитные эффекты от эндотоксинов сходные с БТШ70, которые выражаются в уменьшении гибели животных, а также в нормализации биохимических параметров крови, гемостаза и гемодинамики.

6. БТШ70 и ЛПС из Rhodobacter capsulatus могут быть рекомендованы для создания новых фармакологических препаратов для защиты от эндотоксинов.

Заключение

1. Влияние БТШ70 на физиологические эффекты эндотоксинов из Esherichia coli и Salmonella typhimurium

Эндотоксиновый шок остается одной из главных проблем, связанных с лечением инфекционных заболеваний (Martin et al., 2003). В настоящее время разрабатывается огромное количество фармакологических препаратов -потенциальных лекарств для лечения эндотоксинового шока, некоторые из которых уже есть на рынке. Действие многих из препаратов было направлено на специфические провоспалительные медиаторы и поэтому в целом оказалось неэффективным, так как процесс развития эндотоксинового шока включает широкое разнообразие медиаторов. Более успешная стратегия лечения направлена на конечную стадию сепсиса, а именно на изменённую коагуляцию. Однако клинические испытания подобных препаратов (Xigris) показали, что препарат не может применяться в клинике.

Весьма перспективной представляется альтернативная терапия, которая направлена на предотвращение связывания ЛПС с рецепторами клеток хозяина. Такая терапия может включать вещества, нейтрализующие ЛПС или антагонисты к рецепторам эндотоксинов.

Одним из этапов нашей работы было изучить протективные эффекты экзогенного белка теплового шока БТШ70, выделенного из мышцы быка, на эффекты эндотоксина на модели крыс.

Проведенные ранее исследования показали, что БТШ70 способен проявлять защитные свойства от эндотоксинов (Koh et al 1999; Meldrum et al.,1999; Ding et al 2001). Эффекты экзогенного БТШ70 на введение эндотоксина изучались в основном либо индукцией БТШ70 путем предварительной тепловой обработкой, либо другими стимулами или использованием ингибиторов и индукторов определенных БТШ (Ding et al., 2001; Paidas et al., 2002; Vega and De Maio 2003; Nakada et al., 2005). Кроме того, основные исследования в этом направлении проведены в основном на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova et al., 2001).

Наши исследования, проведенные на бодрствующих животных, показали, что предварительное введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, за 10 минут до эндотоксинов из Е. coli и S. typhimurium может снижать их физиологические эффекты.

Так, в наших экспериментах предварительное введение БТШ70 снижало смертность животных от эндотоксинов. Характерно, что последующее введение БТШ70 после эндотоксинов было эффективным в снижении смертности только в случае применения эндотоксина из S. typhimurium, тогда как применение БТШ70 после ЛПС Е. coli даже немного увеличивало этот параметр. Подобные эффекты можно объяснить тем, что БТШ70 вероятно блокирует механизмы, которые впоследствии приводят к развитию воспалительного сигнала, на ранних этапах. Из литературных данных известно, что БТШ70 способен подавлять развитие воспаления путем блокирования передачи сигнала от ЛПС в ядро (Shi et al., 2006). БТШ70, введенный экзогенно, способен препятствовать реакции фосфорилирования фактора NFkB, что в итоге приводит к торможению передачи сигнала. В результате не начинает нарабатываться основной цитокин ФНО-а, и в итоге воспалительный процесс не развивается в полном объеме. Кроме того, в литературе имеются доказательства того, что БТШ70 имеет ингибиторный эффект на высвобождение цитокинов (Ding et al., 2001; Suganuma et al., 2002; Nakada et al., 2005).

Известно, что введение эндотоксина животным вызывает каскад событий, инициированных секрецией известных цитокинов, которые изменяют экспрессию генов и индуцируют лихорадку, вызывает увеличение сердечного выброса, изменения в работе сердечно-сосудистой системы, нарушения в работе печени и почек (Pajkrt et al 1997; Karima et al., 1999). Согласно литературным данным, БТШ70 модулирует фибринолитическую и свёртывающую системы во время эндотоксемии (Ding et al., 2001; Suganuma et al., 2002; Nakada et al., 2005). В некотором отношении наши данные подтвердили это предположение, поскольку предварительное введение БТШ70 значимо изменяло наблюдаемое увеличение всех параметров гемостаза (Рис III. 1.2.1.).

При эндотоксиновом шоке происходят нарушения в работе свертывающей, фибринолитической и противосвертывающей систем. В результате чего развивается синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) - дисбаланс в работе этих трех систем. В наших экспериментах при введении эндотоксина Е. coli наблюдалось увеличение изучаемых параметров гемостаза. Увеличение времени свертывания как тромбопластинового, так и протромбинового свидетельствует о наступлении эндотоксин-индуцибельной фазы гипокоагуляции (или переходной) стадии ДВС-синдрома, когда на фоне гиперколичеств циркулирующего в крови тромбопластина активируется и противосвертывающая система - активность факторов как внешнего, так и внутреннего пути свертывания крови замедляется, время свертывания удлиняется. Вследствие гипокоагуляции фибриноген не трансформируется в фибрин, концентрация его в крови увеличивается, кроме того, фибриноген как белок острой фазы начинает активно синтезироваться в печени (Сидоркина и др., 2003). При эндотоксиновом шоке в патогенезе тяжелых нарушений коагуляции играет роль ещё один механизм - увеличение ингибитора активации фибринолитической системы (в частности, ингибитора активации плазминогена), что способствует неадекватному удалению сгустков фибрина из сосудистого русла (Грачев и др., 2003). В результате время лизиса сгустка (время фибринолиза) удлиняется. Известно, что ключевым активатором нарушений при ДВС-синдроме является IL-6, а TNF-a опосредованно влияет на этот процесс за счет воздействия на IL-6 (Esmon, 2001).

В наших экспериментах было отмечено, что эндотоксин вызывает нарушения в работе системы гемостаза, а именно - увеличивает протромбиновое и тромбопластиновое время свертывания крови, концентрацию фибриногена и время фибринолиза. Предварительное введение БТШ70 полностью блокировало эндотоксин-индуцированное (как эндотоксином из Е. coli, так и из S. typhimurium) увеличение всех этих параметров гемостаза. Эффекты эндотоксинов из Е. coli и S. typhimurium, направленные на повышение параметров гемостаза, полностью предотвращались с помощью предварительного введения БТШ70. Можно полагать, что предварительное введение БТШ70 снижало или предотвращало эндотоксин-индуцированную выработку цитокина, обусловливающего эти изменения.

При введении БТШ70 после эндотоксинов также наблюдалась нормализация изучаемых параметров гемостаза за исключением тромбопластинового времени свертывания крови. Увеличение только тромбопластинового времени говорит о нарушениях в работе именно внутреннего пути свертывания крови - пути контактной активации, когда механизм запускается вследствие контакта фактора XII с поврежденной эндотелиальной поверхностью, с измененными клеточными мембранами (Сидоркина и др., 2003). Вероятно, именно этот механизм не предотвращается при последующем введении БТШ70 после эндотоксинов.

Ранее было показано, что ЛПС-индуцибельное увеличение продукции ФНО-а, IL-1(3, IL-10 и IL12b клетках значительно ингибировалось экспрессией БТШ70 (Ding et al., 2001). Более того, было продемонстрировано, что врожденный иммунитет использует по крайней мере три клеточных рецептора, CD 14, TLR4, MD-2 во время распознавания ЛПС на клеточном уровне. БТШ могут взаимодействовать с формальными рецепторами ЛПС, таким как CD 14, изменяя при этом ответ на ЛПС на всех клеточных уровнях (Triantafilou and Triantafilou. 2004).

Необходимо подчеркнуть, что имеется масса доказательств, предполагающих, что при различных условиях БТШ высвобождаются из периферических моноцитов крови, несмотря на отсутствие пептидных последовательностей - мишеней секреции белка (Guzhova et al., 2001; Walsh et al., 2001; Hunter-Lavin et al., 2004; Johnson and Fleshner 2006). Поэтому, БТШ являются важными в иммунном ответе, и клетки могут абсорбировать и утилизировать БТШ из клеточных культур (Guzhova et al., 2001; Wallin et al., 2002; Johnson and Fleshner 2006, Campisi et al., 2003).

Хорошо известно, что эндотоксин может индуцировать гипотензию и тахикардию (Lin et al., 1999; Van Amersfoort et al., 2003). В наших экспериментах гемодинамическая реакция крыс на ЛПС разных бактерий не была идентичной. Так, инъекция ЛПС из Е. coli приводила к гипотензии и тахикардии, тогда как введение ЛПС из S. typhimurium приводило к развитию гипертензии с последующей гипотензией и тахикардии. Известно, что эффекты эндотоксинов различны и это различие может быть обусловлено дозой, схемой введения или структурой липида А. Так, мы видим, что эффект эндотоксина из S. typhimurium отличен от эффектов эндотоксина из Е. coli. Вероятной причиной этого может быть и различие в структуре липида А этих эндотоксинов - так, было показано, что самый сильный и токсичный липид А обусловлен наличием в его структуре шести жирнокислотных остатков -именно такое строение имеет липид А эндотоксина из Е. coli. Если же в структуре липида А меньше или больше чем 6 жирнокислотных остатков -это свидетельствует о менее токсичных свойствах эндотоксина (Rietschel et al., 1994).

Известно, что в ответ на введение эндотоксина повышается активность симпатических нервов и зон центрального сердечно-сосудистого контроля. Гипертензивная фаза при введении S. typhimurium обусловлена стимуляцией адренорецепторов, поскольку блокада адренорецепторов подавляет гипертензивную фазу, обусловленную эндотоксином S. typhimurium в такой же дозе (Гражданкин и др., 2003).

В отношении ЧСС, превентивное введение препарата БТШ70 имело некоторые эффекты относительно частичной нормализации этих параметров, в частности, снижало уровень тахикардии, обусловленной эндотоксином из S. typhimurium. С другой стороны, последующее за эндотоксином применение БТШ70 в случае эндотоксина из Е. coli приводило даже к значимому увеличению уровня тахикардии (Рис III. 1.3.2., В).

Основными показателями, характеризующими работу печени и почек при стрессовых и патологических состояниях, являются такие биохимические показатели как глюкоза, белки, триглицериды, билирубин, креатинин. Введение эндотоксинов вызывало первоначальную гипергликемию (через 20 минут) с выраженной гипогликемией к 5-му часу от начала введения эндотоксинов. Снижение уровня глюкозы в крови по крайней мере частично связано с подавлением эндотоксинами экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕРСК) (Granner et al., 1990). Введение БТШ70 до эндотоксина в наших экспериментах восстанавливало исходный уровень глюкозы, что указывает на восстановление глюконеогенеза. Наблюдаемые нами эффекты экзогенного БТШ70 аналогичны защитным эффектам, вызываемых тепловым шоком в работе Paidas с соавторами, которые показали, что уровни РЕРСК mRNA снижались у мышей после введения ЛПС, тогда как у мышей, предварительно подвергнутых тепловому шоку, экспрессия РЕРСК mRNA не менялась (Paidas et al., 2002).

Известно, что при эндотоксиновом шоке происходит снижение экстракции аминокислот и снижается синтез белков (Karima et al., 1999). Кроме того, при эндотоксиновом шоке увеличивается в плазме уровень азота мочевины и, как следствие, наблюдается увеличение концентрации креатинина в крови, из-за увеличения в печени липопротеинов очень низкой плотности снижается также уровень периферических триглицеридов в крови; кроме того, в печени прогрессирует увеличение уровня билирубина (Karima et al., 1999). Данные наших исследований подтвердили эти литературные данные относительно изменений этих биохимических параметров. В литературе описанные эффекты эндотоксина связывают с влиянием на печень и почки основного паракринного и аутокринного цитокина при эндотоксиновом шоке - TNF-a. Тот факт, что лишь предварительное введение БТШ70 до эндотоксина на пятом часе достоверно подавляло эти изменения параметров говорит о том, что БТШ70 вероятно блокирует механизмы, которые впоследствии приводят к развитию воспалительного сигнала, на ранних этапах. Из литературных данных известно, что БТШ70 способен подавлять развитие воспаления путем блокирования передачи сигнала от ЛПС в ядро (Shi et al., 2006).

2. Влияние липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium

Одним из направлений предотвращения токсичности эндотоксинов является исследование возможности создания антагонистов к рецепторам, способным блокировать активацию клеток, индуцированную эндотоксинами. Липид А является уникальной частью всех ЛПС большинства патогенных бактерий, их главным «токсикофором» (Galanos et al., 1985; Takada and Kotani, 1989). Создание антагонистов, препятствующих взаимодействию липида А с клетками-мишенями является заманчивой перспективой для лечения сепсиса, бактериемии, септического шока и других индикаций. В настоящее время создана серия синтетических аналогов липида А. Среди них Е5531 (Crist et al., 1999), исследования которого показали некоторое снижение его антагонистической активности при введении в кровь (Wasan et al., 1999). Синтетический липополисахарид второго поколения Е5564, также антагониста эндотоксина, имеет преимущество перед Е5531, выражающееся в более длительной циркуляции в крови (Rossignol et al., 2004).

Очевидно, антагонисты ЛПС блокируют эффекты эндотоксинов в модели клинического сепсиса и потенциально могут использоваться в лечении или предотвращении сепсиса.

Из Rhodobacter capsulatus был получен низкотоксичный липополисахарид, для которого была показана способность защитного действия от ряда эффектов эндотоксинов. Так, проведенные ранее исследования показали, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus на нейтрофилах подавляет кальциевый ответ клеток, вызываемых разными эндотоксинами, подавляет экспрессию Р-интегринов и снижает адгезивную активность клеток, индуцированную эндотоксинами (Асташкин и др., 1999; Винокуров и др., 2003), на нейтрофилах и моноцитах человека подавляет эндотоксин-индуцибельный дыхательный взрыв, ингибирует замедление апоптоза индуцированное эндотоксином (Винокуров и др., 2000; Винокуров и др., 2003), ЛПС Rhodobacter capsulatus сохраняет активность нейтрофилов к фагоцитозу, не активируя дыхательный взрыв (Винокуров и др., 2003).

На основании этих данных, демонстрирующих защитные эффекты ЛПС из Rhodobacter capsulatus в экспериментах in vitro, нами было сделано предположение о том, что ЛПС Rhodobacter capsulatus способен проявлять защитные эффекты при эндотоксиновом шоке in vivo.

Наши исследования, проведенные на бодрствующих животных, показали, что при предварительном введении низкотоксичного липополисахирида до эндотоксина снижается смертность животных и составляет 46 % в отличие от 80 % в группе животных, которым вводили эндотоксин из Salmonella typhimurium. Следует отметить, что такой результат показывает более высокий потенциал изучаемого препарата как снижающего эффекты эндотоксина, чем показанный для Е5531 (Kawata et al., 1999).

Как известно, ответ организма на грамотрицательные бактерии запускается по крайней мере, частично распознаванием и ответом клеток-хозяина на эндотоксин, который является главной составляющей внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Ulmer, 2002). ЛПС распознаётся разными путями - в одном пути (гуморальном) участвуют собственные антитела и липопротеины, чтобы нейтрализовать и очистить кровь от ЛПС; второй путь запускает мощный комплексный воспалительный ответ, включающий активацию клеток с участием LBP-белка, CD-14 рецептора и толл-подобиых рецепторов, в частности TLR4 (Diks et al., 2001). В ответе на инфекцию липополисахариды в крови детектируются такими клетками, как моноциты, макрофаги, Купферовы клетки печени, запуская их к продукции большого разнообразия цитокинов и других клеточных медиаторов (Burrel, 1994, Fiuza and Suffredini, 2001), которые могут защищать хозяина. Однако во время или после киллинга бактерий свободные ЛПС могут индуцировать недопустимо высокие уровни клеточных медиаторов, которые запускают различные патофизиологические процессы (Bone, 1991; Norimatsu and Morrison, 1998; Suffredini and O'Grady, 1999), приводящие к мультиорганному воспалению и смерти (Brandtzaeg et al., 2001).

Прежде всего, в наших экспериментах было отмечено снижение смертности при предварительном введении ЛПС Rhodobacter capsulatus. Вероятно, этот защитный эффект ЛПС Rhodobacter capsulatus обусловлен его способностью прочно связываться с рецепторами к эндотоксинам, блокируя тем самым активацию клеток к синтезу провоспалительных цитокинов.

Известно, что при сепсисе происходят нарушения в системе работы крови. Так, эндотоксины стимулируют макрофаги, моноциты, эндотелиальные клетки, что приводит к секреции растворимых медиаторов (ФНО-б, ИЛ-1, ИЛ-6, оксида азота, метаболитов арахидоновой кислоты, интерферона-у и других). Свободные цитокины активизируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме (Rigato et al., 2001; Грачёв и др., 2003). Установлена зависимость между уровнями цитокинов и выраженностью катаболизма, расстройствами кислородного транспорта, функциональными нарушениями в жизненно важных органах, в частности, в печени, почках (Karima et al., 1999).

В наших экспериментах липополисахарид из Rhodobacter capsulatus отменял нарушения в работе системы коагуляции - отменял увеличение параметров гемостаза, вызванное эндотоксином из Salmonella typhimurium.

Известно, что эффекты эндотоксина, оказываемые на систему гемостаза, вторичны и опосредованы высокими концентрациями в крови провоспалительного медиатора - IL-6 (Karima et al., 1999). Вероятно, липополисахарид из Rhodobacter capsulatus подавляет продукцию IL-6, в результате в системе не развивается воспаление и связанные с этим нарушения в крови.

При предварительном введении липополисахарид из Rhodobacter capsulatus до эндотоксина в наших экспериментах не развивалась гипертензивная фаза и гипотензия полностью подавлялась.

Ранее в острых опытах на мышах линии С57В1/6 было установлено, что внутрибрюшинное введение ЛПС Rhodobacter capsulatus за 10-15 минут до эндотоксина Salmonella typhimurium подавляло его летальное действие. Предварительное введение ЛПС Rhodobacter capsulatus снижало летальность на 56 % (Асташкин, 1998).

В литературе имеются предположения, что эндотоксины и индуцируемые ими цитокины влияют на основную систему детоксикации ксенобиотиков в печени - цитохром Р-450. Оказалось, что и эндотоксин, и цитокины способны резко снижать ферментативную активность различных изоформ цитохрома Р-450 (Nadin et al., 1995). В тесте гексеналового сна было установлено, что введение ЛПС Rhodobacter capsulatus укорачивало продолжительность гексеналового сна, индуцированного эндотоксином, т.е. при введении ЛПС Rhodobacter capsulatus показатели продолжительности гексеналового сна приближались к контрольным цифрам. Эти данные подтверждают сделанное ранее предположение об антагонистическом действии ЛПС Rhodobacter capsulatus в отношении эндотоксина с клетками-мишенями. В то же время ЛПС Rhodobacter capsulatus не предупреждает влияние оксида азота, освободившегося из препарата донора N0, в качестве которого использовали нитропруссид натрия. В тесте гексеналового сна было выявлено, что ЛПС Rhodobacter capsulatus эффективно подавляет действие эндотоксина на систему цитохрома Р-450. Если мышам одновременно с эндотоксином вводили нитропруссид, гексеналовый сон становился короче. Это позволяет предположить, что ингибиторное действие эндотоксина на систему цитохрома Р-450 опосредуется оксидом азота. Таким образом, гемодинамические эффекты липополисахарида из Rhodobacter capsulatus опосредуются влиянием его на работу фермента NO-синтазы. Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus блокирует действие эндотоксина на систему цитохрома Р-450 в результате подавления его связывания с клетками-мишенями на уровне взаимодействия со специфическими рецепторами.

Введение как БТШ70, так и ЛПС Rb. capsulatus наблюдали сходные эффекты в подавлении физиологических эффектов эндотоксинов. Этот факт дает основание предположить, что два этих препарата в итоге приводят к одинаковому результату, но опираясь на литературные данные, можно сделать предположение о разных механизмах действия БТШ70 и ЛПС Rb. capsulatus. Два этих агента действуют на разных этапах (разных участках) развития эндотоксинового шока.

БТШ70 работает на уровне передачи сигнала в ядро клетки. Механизм действия БТШ70 связан с активацией NFkB фактора. При развитии сепсиса для встраивания в ядро и соответственно для запуска реакции выработки цитокинов необходимо, чтобы произошла реакция фосфорилирования NFkB. В отсутствии БТШ70 это происходит. БТШ70 же, введенный экзогенно, препятствует реакции фосфорилирования NFkB и не происходит встраивания его в ядро. В результате не начинает нарабатываться ФНО-а - основной аутокринный и паракринный цитокин - и в итоге воспалительный процесс не развивается в полном объеме.

ЛПС Rb. capsulatus действует на более позднем участке - на стадии передачи сигнала в цитоплазму. ЛПС Rb. capsulatus прерывает передачу сигнала на стадии рецептор/лиганд. ЛПС Rb.capsulatus связывается с рецептором эндотоксинов, что препятствует связыванию последних и передачи сигнала в цитоплазму. Однако, через некоторое время может произойти интернализация, сигнал будет передаваться в ядро, что может быть связано с тем, что появляются новые рецепторы, которые могут взаимодействовать с циркулирующими эндотоксинами, если их большой избыток и в результате вызывать эффекты.

Таким образом, защитное действие экзогенного БТШ70 и ЛПС Rb. capsulatus могут реализовываться разными путями, но в результате приводить к сходным эффектам.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кустанова, Гульсара Амангалиевна, 2007 год

1. Асташкин Е.И., Прохоренко И.Р., Егорова Н.Д. Липополисахарид из фотосинтезирующих бактерий подавляет ингибиторное действие эндотоксинов на систему цитохрома Р450 мышей С57В1/6 in vivo. Доклады Академии Наук. 1998; 362: 277-280.

2. Асташкин Е.И., Прохоренко И.Р., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В. Подавление Са ответа нейтрофилов человека, вызываемого эндотоксинами, с помощью липополисахарида фотосинтезирующих бактерий. Доклады Академии Наук. 1999; 364(5): 700-2.

3. Белобородое В.Б. Сепсис современная проблема клинической медицины. Российский Медицинский Журнал. 1997; Т.5; № 24; 326338.

4. Варбанец Л.Д. Эндотоксины грамотрицательных бактерий: структура и биологическая роль. Микробиол. журн. 1994; 56(3): 7697.

5. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Липополисахарид Rhodobacter caplulatus нейтрализует эндотоксин-индуцированные ответы нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека. Доклады Академии Наук. 2006; 406: 19-22.

6. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Эффект липополисахаридов разной структуры на адгезию и генерацию активных форм кислорода человеческими нейтрофилами. Доклады Академии Наук. 2003; 393: 485-7.

7. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р., Юринская М.М., Грачев С.В. Действие липополисахаридов и ультрафиолета С на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека. Иммунология. 2000; 6: 23-27.

8. Грачёв С.В., Пак С.Г., Малов В.А., Городнова Е.А. Текущие аспекты патогенеза сепсиса. Терапевтический архив. 2003; 11: 84-89.

9. Ю.Гужова И.В., Маргулис М.А. Индукция и аккумуляция HSP70 приводит к формированию комплекса с другими клеточными белками. Цитология. 2001; 42(7): 647-52.

10. П.Лейдерман И.Н. Синдром полиорганной недостаточности (ПОН). Метаболические основы. Вестник интенсивной терапии. 1999; 2: 813; 3: 13-17.

11. Ломакина Е.Д., Свечкарев В.Г. Результаты исследования образа жизни студентов начальных курсов некоторых вузов. Физическое воспитание студентов творческих специальностей. ХГАДИ. Харьков. 2002; 8: 86-91.

12. Маргулис М.А., Гужова И.В. Стресс-белки в эукариотических клетках. Цитология. 2000; 42(4): 323-42.

13. М.Мокрушин А.А., Плеханов А. Иммунологическая идентификация эндогенных пептидов на срезах обонятельной коры. Доклады Академии Наук. 2001; 378: 227-9.

14. Мурашев А.Н., Медведев О.С., Давыдова С.А. Руководство по экспериментальной физиологии кровообращения. Саратов: Изд-во Саратов, ун та, 1992. С. 42.1 б.Мюлленайзен Б. Синдром стресса. Изд-во Казанского университета, 1993. 135 с.

15. Николаев А. Ю., Милованов Ю. С. Лечение почечной недостаточности М: ООО "Медицинское информационное агентство". 1999; ISBN 5-89481-023-Х.

16. Пак С.В., Малов М.Ф., Горобченко А.Н. Инфекционные заболевания: расширение традиционных точек зрения. Терапевтическмй Архив. 2003; 75(11): 5-10.

17. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Гужова И.В. Свободный от липополисахарида белок теплового шока БТШ70 имеет гипотермный и сомногенный эффекты. Доклады Академии Наук. 2005; 402: 167-170.

18. Ломакина Т.Л. Программированная гибель клеток. С.-Пб. 1996. 286 с.

19. Румянцев Д.О., Кабанова И.Н., Петровский В.К., Метелица В.И., Кокурина Е.В. Воспалительная активность и снижение в плазме белков при неспецифических воспалительных заболеваниях. Фармацевтическая. Токсикология. 1988; (4): 15-7.

20. Сидоркина А.Н, Сидоркин В.Г., Преснякова М.В. Биохимические основы системы гемостаза и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. Н.Новгород: ННИИТО. 2003. 100 с.

21. Antal-Szalmas Р, Poppelier MJ, Broekhuizen R, Verhoef J, van Strijp JA, van Kessel KP. Diverging pathways for lipopolysaccharide and CD 14 in human monocytes. Cytometry. 2000; 41(4): 279-88.

22. Angus D.C., Wax R.C. Epidemiology of sepsis: an update. Crit. Care. Med. 2001; 29: 109-116.

23. Bachetti T, Pasini E, Suzuki H, Ferrari RSpccies-specific modulation of the nitric oxide pathway after acute experimentally induced endotoxemia. Crit Care Med. 2003 May; 31(5): 1509-14.

24. Badr K.F., Murray J.J., Breyer M.D. et al. Mesangial cell, glomerular and renal vascular responses to endothelin in the rat kidney. J. Clin. Invest. 1989; 83: 336-342.

25. Beno W.A. and Kimura R.H. Nonstressed rat model of acute endotoxemia. Am. Physiol. J. 19r 9; 276 (45): 671-678.

26. Bernard Catherine; Regine Merval; Bruno Esposito; Alain Tedgui. Resistance to Endotoxin Shock in Spontaneously Hypertensive Rats. Hypertension. 1998; 31: 1350-13.^6.

27. Bhagat K., Collier J. et al. Lo.ul Venous Responses to Endotoxin in Humans. Circulation. 1996; 94: 490-497.

28. Bone R.C. The pathogenesis of sepsis. Ann. Intern. Med. 1991; 115: 457469.

29. Brand K., Fowler B.J., Edgingion T.S. et al. Tissue factor mRNA in THP-1 monocytic cells is regulated at both transcriptional and posttranscriptional levels in response to LPS. Mol. Cell Biol. 1991; 11: 4732-4738.

30. Brandtzaeg P, Bjerre A, Ovste^o R, Brusletto B, Joo GB, luerulf P. Neisseria meningitidis lipopolysaccharides in human pathology. J Endotoxin Res. 2001; 7(6): 401-2n.

31. Brown AR, Fishman M. Tumor necrosis factor-alpha analyzed within individual macrophages by ombined immunocytochemlslry and computer-aided image analysis. Cell Immunol. 1990 Oct 15; 1Л 0(2): 35263.

32. Bruneteau M, Minka S. Lipopoly iccharides of bacterial path о n ens from the genus Yersinia: a mini-revie . Biochemist. 2003 Jan; 85 (1-2): 14552.

33. Burrell R. Human responses to i acterial endotoxin. Circ Shock. 1994; 43(3): 137-53.

34. Campbell M-A. and Sefton B.l\f. Protein tyrosine phosphorylation is indused in murine В lymphocytes in response to stimulation with antiimmunoglobulin. EMBO J. 1990; 9: 2125-2131.

35. Campisi J., Leem Т.Е., Fleshner M. Stress-induced extracellular Hsp72 is a functionally significant danger: Ignal to the immune system. Cell Stress & Chaperones. 2003; 8: 272-286.

36. Chaby R., Strategies for the control of LPS-mediated pathophysiological disorders. Drug Discov Today. 1 °09; 4(5): 209-221.

37. Chan EL, Murphy JT. React!' oxygen species mediate rudotoxin-induced human dermal endothelial NF-kappaB activation. J Surg Res. 2003 May 1; 111(1): 120-6.

38. Chen D., Pan J., Du В., Sun D. I .duction of the heat shock i ponse in vivo inhibits NF-kappaB acti iy and protects murine H/er from endotoxemia-induced injury. J С in Immunol. 2005; 25(5): 452 61.

39. Chen T-Y, Bright S.W., Pace et al., Induction of macrophage -mediated tumor cytotoxicity by :; hamster monoclonal anti >dy with specifity for LPS-receptor. J. Im: mol. 1990; 113: 8-12.

40. Cristian L, Lear JD, DeGrado \ Determination of membn.ne protein stability via thermodynamic с ipling of folding to thirl-disulfide interchange. Protein Sci. 2002; 1 ,•;): 1732-40.

41. Crist P. Career transition from cl ,eian to academician: respon Abilities and reflections Am J Occup The, 1999; 53(1): 14-9.

42. Dal Nogare. Septic shock. Am J ' Vd Sci. 1991; 302(1): 50-6:', lleview.

43. Diks SH, van Deventer SJ, V ppelenbosch MP. Lipopol v.saccharide recognition, internalisation, si ailing and other cellular effects. J Endotoxin Res. 2001; 7(5): 335-'' .

44. Diks SH, van Deventer SJ, Г ppelenbosch MP. Lipopol у saccharide recognition, internalisation, si' 11 ling and other cellular cffects. J Endotoxin Res. 2001; 7(5): 335- :.

45. Dillmann WH, Mestril R. Heat ock proteins in myocardial stress. J. Cardiol. 1995; 84(4): 87-90.

46. Ding XZ, Fernandez-Prada С ! , Bhattacharjee A.K, 1! over D.L. Over-expression of hsp-70 ihibits bacterial lipopol; accharide production of cytokines in h ,an monocyte-derived m:: rophages. Cytokine. 2001; 16(6): 210-219.

47. Esmon CT. Role of coagulali inhibitors in inflammati i. Thromb Haemost. 2001; 86(1): 51-6. Re\' \v.

48. Feinstein D.L, Reis D.J, Regun: , an. Ingibition of astroglial , лпс oxide synthase type 2 expression by i uzoxan. J. Molecular. Pharmacology, 2001;55:304-308.

49. Feinstein DL, Galea E, Aquino XA. Heat shock protein 70 uppresses astroglial-inducible nitric oxide . thase expression by decrc !ng NFJB activation. J Biol Chem. 1996; 27 : 17724 -17732.

50. Fenton MJ, Golenbock DT. ! S-binding proteins and r ceptors. J Leukoc Biol. 1998; 64(1): 25-32.

51. Fiuza C, Suffredini AF. Human ,iodels of innate immunit; : local and systemic Fleming I, Grey G.A , Schott C. el al. Inducible but not constitutive production of nitric xidc by vascular smooth m scle cells. Eur. J. Pharmacol. 2001; 20: 37>3''6.

52. Galanos С, Luderitz 0, Rietsclicl ET, Westphal 0, Brade II, Brade L, Freudenberg M, Schade U, Imc i M, Yoshimura H, et al. Synthetic and natural Escherichia coli free lipid Л express identical endotoxic activities Eur J Biochem. 1985; 148(1): 1-5.

53. Gangloff SC, Hijiya N, Hazoi Л, Goyert SM. Lipopol у saccharide structure influences the macrop! <ic response via CD14-independent and CD 14-dependent pathways. Clin InfcctDis. 1999; 28(3): 491-6.

54. Gerard C. Complement C5a in the Sepsis Syndrome — Too Much of a Good Thing? Clinical implica1! ns of basic research N. Engl J Med. 2003; 348: 2.

55. Grinnel BW, Joyce D. Recoaibi.iant human activated protein С: A system modulator function for treatment of severe sepsis. Grit. Care. Med. 2001; 29 (7): 53-61.

56. Guidon PT Jr, Hightower LE. The 73 kilodalton heat shock cognate protein purified from rat brain coniiins nonesteriiied palmitic and stearic acids. J Cell Physiol. 1986; 12,S'2 : 239-45.

57. Guzhova IV, Kislyakova KA, Г ,'^skalinova (X. l iidlanskaya II, Tytell M, Cheetham M, Margulis BA. vitro studies .,how that Hsp70 can be released by glia and that exoy :s Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res. 2001; 914: o6-73.

58. Haas I.G., Meo T. cDNA clone1" of the imnvn м-lobulin heavy chain binding protein. Proc. Natl. Ac." ci. USA. 19o. ; 85: 2250.

59. Hauser GJ, Dayao EK, Wasse:! ,, i\, et al. HS'} 'ncluction inl.ibits iNOS mRNA expression and attenn;. . i hypotension in endotoxin-challenged rats. Am J Physiol. 1996; 271:: -2535.

60. Held HD, Uhlig S. Median! of endoto pulmonary vascular hyperreactу in mice. Ani 2000 Oct; 162(4 Pt 1): 1547-52

61. Henderson В., Poole S., Wilso: \!. Bacterial m virulence factors which causc !. tissue patho! synthesis. Microbiol. Rev. 19^6; J: 316-341.

62. Hinshaw, L.B. Pathophysiology of endotoxin ac Nowotny, J. J. Spitzer, and E. .' ' jgler (ed.), ! Cellular and molecular aspect, endotoxin i\ 1990; 1:419-426.

63. Hitchcock P.J., Leive L., M. •': H. et al. I.: present and future. J. Bacterid. 6; 166: 699

64. Hoffmann H., Siebeck M., lag! M. et ; hirudin, a specific inhibitor )f thrombin, intravascular coagulation and :.'•" lung injury ' Dis. 1990; 142: 782-788.

65. Hotchkiss R, Nunnally I, Li: ot S, Taulic Hyperthermia protects mice a;\ii i the lethal c! Physiol. 1993; 265(6 Pt 2): M .

66. Perdrizct G, Karl I. ts of endotoxin. Am Jill MJ, Andrew SM, >d mononuclear cells.of a selective PAF linated i intravascular

67. Biphasic changes in idotoxen^a. Am. J.

68. Icnk JG Bilo, Felix a!., Glucose-insulinpotassium infusion in sepsis and septic shock: no hard evidence yet. Crit Care. 2003; 7(1): 13-15.

69. Jakobovits A, Sharon N, Zan-Bar I. Acquisition of mitogenic responsiveness by nonresponding lymphocytes upon insertion of appropriate membrane components J Exp Med. 1982 Oct 1;156(4):1274-9.

70. Jesmok G, Lindsey C, Duerr M, Fournel M, Emerson T Jr. Efficacy of monoclonal antibody against human recombinant tumor necrosis factor in E. coli-challenged swine. Am J Pathol. 1992 Nov; 141(5): 1197-207.

71. Johnson JD, Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J Leukoc Biol. 2006; 79(3): 425-34.

72. Julou-Schaeffer G., Gray G.A., Fleming I. et al. Loss of vascular responsiveness indused by endotoxin involves L-arginine pathway. Am. J.Physiol. 1990; 259: 1038-1043.

73. Karima R, Matsumoto S, Higashi H, Matsushima K. The molecularpathogenesis of endogenous shock and organ failure. Mol Med Today. 1999; 5(3): 123-32.

74. Kaufmann S.H., Vath U., Thole J.E. et al. Enumeration of T cells reactive with Mycobacterium tuberculosis organisms and specific for the recombinant mycobacterial 65-kDa protein. Eur. J. Immunol. 1987; 17: 351.

75. Kaufmann S.H.E. Heat shock proteins and the immune response. Immunol. Today. 1990; 11: 129.

76. Kennedy MN, Mullen GED, Leifer CA, Lee CW, Mazzoni A, Dileepan KN, and Segal DM. A Complex of Soluble MD-2 and1.popolysaccharide Serves as an Activating Ligand for Toll-like Receptor 4. JBC Papers in Press. 2004; 10: 1074.

77. Kimoto M, Nagasawa K, Miyake K. Role of TLR4/MD-2 and RP105/MD-1 in innate recognition of lipopolysaccharide. Scand J Infect Dis. 2003; 35(9): 568-72.

78. Kitchens RL, Thompson PA. Modulatory effects of sCD14 and LBP on LPS-host cell interactions. J Endotoxin Res. 2005; 11(4): 225-9.

79. Klabunde Richard E. Species in Septic Shock. Associate Professor of Physiology OUTCOM. 2002; 179(6): 1419-27.

80. Klosterhalfen B, Horstmann-Jugemann K., Vogel P. et al. Time course of inflammatory mediators during recurrent endotoxemia. Biochem. Pharmacol., 1992; 43(10): 2103-9.

81. Koh Y., Lim C., kim M., Shim Т., Lee S., Kim W., Kim D., Kim W.D. Heat shock response decreased endotoxin-induced acute lung injury in rats. Respirology. 1999; 4(4): 325-330.

82. Kondakova AN, Fudala R, Senchenkova SN, Shashkov AS, Knirel YA, Kaca W. Structural and serological studies of the O-antigen of Proteus mirabilis 0-9. Carbohydr Res. 2003 May 23; 338(11): 1191-6.

83. Kono Hiroshi, Hideki Fujii, Masami Asakawa, Masayuki Yamamoto, Masanori Matsuda, Akira Maki, and Yoshiro Matsumoto. Protective Effects of Medium-Chain Triglycerides on the Liver and Gut in Rats Administered Endotoxin Ann Surg. 2003; 237(2): 246-255.

84. Kotanidou A., Choi A.M., Winchurch RA, Otterbein L, Fessler HE. Urethan anesthesia protects rats against lethal endotoxemia and reduces TNF-alpha release. J Appl Physiol. 1996 Nov; 81(5): 2305-11.

85. Krauss H. Clinical aspects and prevention of Q fever in animals. Eur J Epidemiol. 1989; 5(4): 454-5.

86. Kuhn H.-M., Meier-Dieter U., Meier H. ECA, the enterobacterial common antigen. FEMS Microbiol. Rev. 1988; 3: 195-222.

87. Kumor LW, Olkowski AA, Gomis SM, Allan В J. Cellulitis in broiler chickens: epidemiological trends, meat hygiene, and possible human health implications. Avian Dis. 1998 Apr-Jun; 42(2): 285-91.

88. Lane T.A., Lamkin G.E., Wancewicz E.V. Protein kinase С ingibitors block the enhanced expression of intercellular adhesion molecule-1 on endothelial cells activated by interleukin-1, LPS and TNF-a. Biochem.Biophys. Res. Common. 1990; 172: 1273-1281.

89. Lappas GD, Karl IE, Hotchkiss RS. Effect of ethanol and sodium arsenite on HSP-72 formation and on survival in a murine endotoxin model. Shock. 1994; 2(1): 34-9.

90. Lau SS, Griffin TM, Mestril R. Protection against endotoxemia by HSP70 in rodent cardiomyocytes. Am J Physiol. 2000; 278: 1439-1445.

91. Laubach V.E., Foley P.L., Shockey K.S. et al Protective roles of nitric oxide and testosterone in endotoxemia: evidence from NOS-2-deficient mice. Am. J. Physiol. 1998; 275(44): 2211-2218.

92. Lei MG, Morrison DC. Differential expression of caveolin-1 in lipopolysaccharide-activated murine macrophages. Infect Immun. 2000 Sep; 68(9): 5084-9.

93. Li G.C. Heat shock proteins: role in thermotolerance, drug resistance, and relationship to DNA topoisomerases. Nat. Cancer Inst. Monogr. 1987;4:99-103.

94. Lin HC, Wan FJ, Kang BH, Wu CC, Tseng С J Systemic administration of lipopolysaccharide induces release of nitric oxide and glutamate and c-fos expression in the nucleus tractus solitarii of rats. Hypertension. 1999; 33(5): 1218-24.

95. Lindquist S. The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 1986; 55:

96. Lush C.W, Cepinskas G, Kvietys P.R. LPS tolerance in human endothelial cells: reduced PMN adhesion, E-selectin expression, and NF-kB mobilization. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000; 287: 853861.

97. Macarthur H, Westfall T.C. Riley D.P. et al. Inactivation of catecholamines by superoxide gives new insights on the pathogenesis of septic shock. PNAS. 2000; 97(17): 9753-9758.

98. Marshall J.C. Inflammation, coagulopathy, and the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome. Crit. Care Med. 2001; 29 (7): 99106.

99. Martin G.S, Mannino D.M, Eaton S, and Moss M. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1546-1554.

100. Mastronardi C.A, Yu W.H., Srivastava V.K. et al. LPS-indused leptin release is neurally controlled. PNAS. 2001; 98(5): 14720-14725.

101. Mayeux PR. Pathobiology of lipopolysaccharide. J Toxicol Environ Health. 1997; 51(5): 415-35.

102. McKenna T.M. Prolonged exposure of rat aorta to low levels of endotoxin in vitro results in impaired contractility. Association with vascular cytokine release. J. Clin. Invest. 1990; 86: 160-168.

103. McMillan J. Competence to Consent, by Becky Cox White. Theor MedBioeth. 1998; 19(2): 161-6.

104. Meldrum DR, Meng X, Shames BD, Pomerantz B, Donnahoo KK, Banerjee A, Harken AN. Liposomal delivery of heat-shock protein 72into the heart prevents endotoxin-induced myocardial contractile dysfunction. Surgery. 1999; 126: 135-141.

105. Miyake K. Endotoxin recognition molecules MD-2 and toll-like receptor 4 as potential targets for therapeutic intervention of endotoxin shock. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2004; 3(3): 291-7.

106. Mohri M., Spriggs .R., Kufe D. Effects of LPS on phospholipase a2 activity and TNF-a expression in HL-60 cells. J. Immunol. 1990; 144: 2678-2682.

107. Mokrushin AA, Tokarev AV. Endogenous regulators of long-term potentiation and depression in rat olfactory cortex slices. Neurosci Behav Physiol. 1997 May-Jun; 27(3): 229-33.

108. Morimoto Y, Hayashi E, Ohno T, Kawata A, Horikoshi Y, Kanzaki H. Quality control of human IVF/ICSI program using endotoxin measurement and sperm survival test. Hum Cell. 1997; 10(4): 271-6.

109. Mullarkey M, Rose JR, Bristol J, Kawata T, Kimura A, Kobayashi S. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 304(3): 1093-102.

110. Mulleneisen NK Management of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 1993 Apr 8; 328(14): 1017-22.

111. Murray DR, Freeman GL. Tumor necrosis factor-alpha induces a biphasic effect on myocardial contractility in conscious dogs. Circ Res 1996 Jan; 78(1): 154-60.

112. Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 1986; 74(5): 1124-36.

113. Nadin L, Butler AM, Farrell GC, Murray M. Pretranslational down-regulation of cytochromes P450 2C11 and 3A2 in male rat liver by tumor necrosis factor alpha. Gastroenterology. 1995; 109(1): 198-205.

114. Nasraway SA. The problems and challenges of immunotherapy in sepsis. Chest. 2003 May; 123(5 Suppl): 451-9. Review.

115. Negulyaev YA, Vedernikova EA, Kinev AV, Voronin AP. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells. Biochim Biophys Acta. 1996; 1282(1): 156-62.

116. Norimatsu M. and Morrison DC. Correlation of antibiotic-induced endotoxin release and cytokine production in Escherichia coli-inoculated mouse whole blood ex vivo. J Infect Dis. 1998; 177(5): 1302-7.

117. Nowak TS, JrOsborne, OCSuga S. Stress protein and proto-oncogene expression as indicators of neuronal pathophysiology after ischemia. Prog Brain Res. 1993; 96: 195-208.

118. O'Leary, Koll MFerguson, CNCoakley, JHHinds, CJPreedy, VRGarlick PJ. Liver albumin synthesis in sepsis in the rat: influence of parenteral nutrition, glutamine and growth hormone. Clin Sci. 2003; 105(6): 691-8.

119. Olson N.C., Joyce P.B., Fleisher I.N. Role of platelet-activating factor and eicosanoids during endotoxin-induced lung injuri in pigs. Am. J. Physiol. 1990; 258: 1674-1686.

120. Paidas CN, Mooney ML, Nicholas GT, De Maio A. Accelerated recovery after endotoxic challenge in heat shock-pretreated mice. Am J Physiol. 2002; 282: 1374-1381.

121. Palsson-McDermott EM, O'Neill LA. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology. 2004; 113(2): 153-62.

122. Polla B.S. A role for heat shock proteins in inflammation? Immunol. Today. 1988; 9: 134.

123. Polla BS, Cossarizza A. Stress proteins in inflammation EXS. 1996; 77: 375-91.

124. Qureshi N, Honovich JP, Нага H, Cotter RJ, Takayama K. Location of fatty acids in lipid A obtained from lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023. J Biol Chem. 1988; 263(12): 5502-4.

125. Ramadori G, Meyer zum Buschenfelde KH, Tobias PS, Mathison JC, Ulevitch RJ. Biosynthesis of lipopolysaccharide-binding protein in rabbit hepatocytes. Pathobiology. 1990; 58 (2): 89-94.

126. Rees D.D., Cellex S., Palmer R.M. et al. Dexamethasone prevents the induction by endotoxin of a nitric oxide synthase and the associated effects on vascular tone: an insight into endotoxin shock. Biochem. Byophys. Res. Commun. 1990; 173: 541-547.

127. Riedemann N.C., Guo R.F., Ward P.A. The enigma of sepsis. J. Clin. Invest. 2003; 112(4): 460-467.

128. Rietschel ET, Kirikae T, Schade FU, Mamat U, Schmidt G, Loppnow H, Ulmer AJ, Zahringer U, Seydel U, Di Padova F, et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J. 1994; 8(2): 217-25.

129. Rigato 0, Silva E, Kallas EG, Brunialti MK, Martins PS, Salomao R. Pathogenetic aspects of sepsis and possible targets for adjunctive therapy Curr. Drug. Targets. Immune Endocr Metabol Disord. 2001; 1(1): 13-30.

130. Rooney J.V., Emery D.W., Sibley C.H. Slow response variant of the В lymphoma 707/3 defective in in LPS activation of NF-kB. Immunogenetics. 1990; 31: 65-78.

131. Sandset PM, Warn-Cramer В J, Maki SL, Rapaport SI. Immunodepletion of extrinsic pathway inhibitor sensitizes rabbits to endotoxin-induced intravascular coagulation and the generalized Shwartzman reaction. Blood. 1991; 78(6): 1496-502.

132. Schmidt J.A., Abdulla E. Down regulation of IL-1 beta biosynthesis by inducers of the heat-shock response. J. Immunol. 1988; 141: 2027.

133. Shankavaram UT, DeWitt DL, Wahl LM. Lipopolysaccharide induction of monocyte matrix metalloproteinases is regulated by the tyrosine phosphorylation of cytosolic phospholipase A2. J Leukoc Biol. 1998; 64(2): 221-7.

134. Shi Y, Tu Z, Tang D, Zhang H, Liu M, Wang K, Calderwood SK, Xiao X. The inhibition of LPS-induced production of inflammatorycytokines by HSP70 involves inactivation of the NF-kappaB pathway but not the МАРК pathways. Shock. 2006; 26(3): 277-284.

135. Silva MF, Silva CL. The role of somatic structure of the fungus Paracoccidioides brasiliensis upon В cell activation in experimental paracoccidioidomycosis. Clin Exp Immunol. 1995; 101(2): 321-7.

136. Suffredini AF, Fantuzzi G, Badolato R, Oppenheim JJ, O'Grady NP. New insights into the biology of the acute phase response. J Clin Immunol. 1999; 19(4): 203-14.

137. Suganuma T, Irie K, Fujii E, Yoshioka T, Muraki T. Effect of heat stress on lipopolysaccharide-induced vascular permeability change in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002; 303(2): 656-63.

138. Sun D, Chen D, Du B, Pan J. Heat shock response inhibits NF-kappaB activation and cytokine production in murine Kupffer cells. J Surg. Res. 2005; 129(1): 114-21.

139. Szabo C. Alterations in nitric oxide production in various forms of circulatory shock. New horiz. 1995; 3(1): 2-32.

140. Takada H, Kotani S. Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit Rev Microbiol. 1989; 16(6): 477-523.

141. Takeuchi O, Hoshino K, Kawai T, Sanjo H, Takada H, Ogawa T, Takeda K, Akira S. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity. 1999; 11(4): 443-51.

142. Triantafilou M, Triantafilou K. Sepsis: molecular mechanisms underlying lipopolysaccharide recognition. Molecular Medicine. 2004; 6: 1-18.

143. Tsan MF, Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. Am. J Physiol Cell Physiol. 2004; 286(4): 739-44.

144. Ulevitch RJ, Tobias PS Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Curr Opin Immunol. 1999; 11(1): 19-22.

145. Ulmer A.J., Rietschel E.Th., Zahringer U., Heine H. Lipopolysaccharide: Structure, Bioactivity, Receptors, and Signal Transduction. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2002; V.14; № 76: 53-68

146. Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J.C., and Kuiper J. Receptors, Mediators, and Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock. Clin Micr Rewviews. 2003; 3: 379-414.

147. Van der Horst 1С, Ligtenberg JJ, Bilo HJ, Zijlstra F, Gans RO. Glucose-insulin-potassium infusion in sepsis and septic shock: no hard evidence yet. Crit Care. 2003; 7(1): 13-5.

148. Van der Poll, Susette M. Coyle, Karen Barbosa, Carla C. Braxton and Stephen F. Lowry. Epinephrine inhibits Tumor Necrosis Factor-a and Potentiates Interleukin 10 production during human endotoxemia. J.Clin Invest. 1999; 97(3): 713-719.

149. Van Eden W. and Young, D. Heat shock protein 60 and the regulation of autoimmunity. Stress Proteins in Medicine 1996; 14: 93-102.

150. Vandbuskirk A., Crump B.L., Margolash E., Pierce S.K A peptide binding protein having a role in antigen presentation is a member of the HSP70 heat shock family. J. Exp. Med. 1989; 170: 1799.

151. Vega VL, De Maio A. Geldanamycin treatment ameliorates the response to LPS in murine macrophages by decreasing CD 14 surface expression. Mol Biol Cell. 2003; 14: 764-773.

152. Visintin A, Iliev DB, Monks BG, Halmen KA, Golenbock DT. MD-2. Immunobiology. 2006; 211(6-8): 437-47.

153. Vissers YL, von Meyenfeldt MF, Braulio VB, Luiking YC, Deutz NE. Measuring whole-body actin/myosin protein breakdown in mice using a primed constant stable isotope-infusion protocol. Clin Sci. 2003; 104(6): 585-90.

154. Wallin R.P., Lundqvist A., More S.H., Von Bonin A., Kiessling R., Ljunggren H.G. Heat-shock proteins as activators of the immune system. Trends Immunol. 2002; 23(3): 130-135.

155. Walsh RC, Koukoulas I, Garnham A, Moseley PL, Hargreaves M, Febbraio MA. Exercise increases serum Hsp72 in humans. Cell Stress Chaperones. 2001; 6: 386-393.

156. Weinstein S.L., Gold M.R., De Franko A.L. Bacterial LPS stimulated protein tyrosine phosphorylation in macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990; 88:4148-4152.

157. Welch W.J., Mizzen L.A., Arrigo A.P. Stress-induced proteins. USLA Symposia Mol. Cell. Biol. 1989; 96: 187.

158. Winfield J., Jarjour W. Do stress proteins play a role in arthritis and autoimmunity? Immunological reviews. 1991; 121: 193-220.

159. Wong HR, Ryan M, Wispe JR. The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking Ik-Bdegradation and NF-kB nuclear translocation. Biochem Biophys Res Commun. 1997; 231:257-263.

160. Wy CA, Goto M, Young RI, Myers TF, Muraskas J. Prophylactic treatment of endotoxic shock with monophosphoryl lipid A in newborn rats. Biol Neonate. 2000 Mar; 77(3): 191-5.

161. Xigris // Data on www.lilly.com. 2002

162. Young R.A. Stress proteins and immunology. Ann. Rev. Immunol. 1990; 8: 401.