Учет электростатических взаимодействий при прогнозировании стабильности белковых комплексов: теория и расчет для глобулярных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Кошлан Татьяна Викторовна

• Кошлан Татьяна Викторовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Кошлан Татьяна Викторовна

1.1 Методы электрофореза

1.2 Хроматографические методы

1.3 Масс-спектрометрия

1.3.1 Электронный удар

1.4 Рентгеноструктурный анализ кристаллов белков

1.5 Методы спектрального анализа

1.5.1 Спектроскопия в ультрафиолетовом и видимом диапазоне

1.5.2 Спектрофлуориметрия

1.6 Круговой дихроизм

1.7 Заключение

2 Постановка и описание физической модели взаимодействия белковых молекул

2.1 Описание физическс>й мсдели

2.1.1 Задача электростатического взаимодействия двух проводящих сфер

2.1.2 Физическая интерпретация числа обусловленности

2.2 Заключение

3 Математическое моделирование влияния фосфорилирования на характер образования биологических комплексов р53-Мёш2 и р53-р300

3.1 Структура и функции белка р53

3.2 Структура и функции белка М^ш2

3.3 Структура и функции белка р300

3.4 Структура образования биологических комплексов р53-М^ш2 и р53-р300

3.4.1 Структура образования комплекса р53-М^ш2

3.4.2 Структура комплекса р53-р300

3.4.3 Математическая модель фосфорилирования аминокислотных остат-

ков белка р53 и анализ реакционной активности образования

биологических комплексов с белками р300 и М^ш2

3.5 Численный расчет образования биологических комплексов различными участками белков р53 и р300

3.6 Заключение

4 Математическое моделирование выявление активных участков взаимодействия белковых молекул (Модель линейного докинга)

4.1 Описание алгоритмов

4.1.1 Алгоритм №1

4.1.2 Алгоритм №2

4.2 Численное моделирование образования гетеродимеров и гомодимеров согласно алгоритму

4.2.1 Численные расчеты взаимодействия Кар1(81-140)-Мар1

4.2.2 Численный расчет взаимодействия М^т2(436_482) с М^т2

4.3 Численное моделирование образования гомодимеров согласно алгоритму

4.3.1 Численный расчет взаимодействия полипептидных последовательностей белка Мар1

4.4 Заключение

5 Определение влияния точечных замен на сродство между белковыми молекулами

5.1 Структура и функции белков семейства Вс1-2

5.2 Описание алгоритма

5.3 Результаты численных расчетов Вс1-2-ВН3-Вах

5.4 Поведение гидрофобных молекул в водном окружении

5.5 Анализ взаимодействия двух белков на примере образования гомоди-мера Мар1-Мар1

5.6 Образование гидрофобного кластера за счет нескольких замен а.а. в белках: Е110Ш,К11Ш,Е112Ш, Е116Ш одного белка Мар1 и Е12Ш, Ш22Ш, д126Ш другого белка Мар1

5.7 Замена гидрофильного аминокислотного остатка Т101А на гидрофобный аминокислотный остаток

5.8 Заключение

6 Заключение 90 ЛИТЕРАТУРА

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Учет электростатических взаимодействий при прогнозировании стабильности белковых комплексов: теория и расчет для глобулярных белков»

Актуальность задачи.

Белковые молекулы - один из важнейших видов макромолекул живой природы. Они выполняют множество функций: ферментативную (каталитическую), структурную, сократительную и др.

Каждая белковая молекула характеризуется своей нативной конформацией, которая определяется аминокислотной последовательностью, и пребывание в которой позволяет ей выполнять свои биологические функции.

Взаимодействие между такими белковыми молекулами осуществляется в определенных участках, строение которых определяется их конформацией. Определение таких активных участков, ответственных за связывание белковых комплексов на данный момент является сложной задачей, поскольку далеко не всегда известна даже точная конформация белков. По этой причине определить афинность и сродство различных участков белков, их реакционную способность и устойчивость образованного биологического комплекса, а также вероятность участия различных доменов в образовании биологического комплекса, является весьма сложной задачей для экспериментатора.

Для исследования и определения структуры белка и уточнении его свойств используется метод молекулярной динамики, который изначально был разработан в теоретической физике, получил большое распространение в химии и, начиная с 1970-х годов, в биохимии и биофизике. Одной из важных задач в протеомике является исследование белковых взаимодействий, поскольку участие белков в различных химических процессах и в передаче сигнала определяют функционирование клетки и всего организма в целом. Также практически невозможно учесть подвижность аминокислотных остатков и полипептидных цепей белка-мишени при взаимодействии с низкомолекулярным лигандом, поскольку это приводит к так называемому ^комбинаторному взрыву^, что в свою очередь не позволяет говорить о единственности найденного варианта взаимодействия белка-мишени с лигандом. Так в работе [1] в ходе выполненного моделирования методами молекулярной динамики, были найдены от 200 до 10 000 возможных комбинаций образования комплекса белка с лигандом. Такое огромное количество модификаций наряду с отсутствием критерия

отбора наиболее вероятных вариантов связанных структур биологических комплексов (который бы позволял радикально сократить их количество), делает весьма затруднительным интерпретацию полученных теоретических результатов для практического применения, а именно: нахождение каталитических центров и качественная оценка константы диссоциации взаимодействующих веществ.

Разработанный и физически обоснованный в диссертации математический подход в дополнение к работам по молекулярной динамике, позволит изучать поведения ди-меров in vitro, изучать влияние фосфорилирования аминокислотных остатков полипептидной цепи на образование биологических комплексов, определять нахождение активных участков белков и выявлять стабильность различных участков белковых комплексов путем анализа матрицы потенциальной энергии электростатического взаимодействия между различными участками полипептидных цепей участвующих белков, а также исследовать влияние точечных замен в ВНЗ-пептидах на стабильность образованного ими биологического комплекса с проапоптическими белками семейства Bcl-2 и качественно определять K при связывании различных ВНЗ-пептидов с белками семейства Bcl-2.

В перспективе это позволит решать фундаментальные и прикладные проблемы медицины, например, разрабатывать новые лекарственные средства, изучать процессы происходящие при развитии болезней, что являются актуальной задачей.

Цель диссертационной работы. Целью диссертационной работы является разработка биофизических подходов для исследования стабильности белковых комплексов с использованием методов вычислительной линейной алгебры, электростатики и компьютерного моделирования.

Научная новизна работы.

1. Построена математическая модель взаимодействия белковых молекул, на примере белков гистонового шаперона Napl. Разработанная модель позволяет сделать вывод о взаимодействии между различными аминокислотными последовательностями на основании предложенного и физически обоснованного в диссертации критерия (числа обусловленности матрицы, элементами которой являются потенциальные энергии электростатического взаимодействия между попарно взятыми аминокислотными остатками белков) и определять какие из приведенных биологических объектов образуют более устойчивые соединения. Разработанный подход позволит определить наиболее устойчивые сайты взаимодейтсвия между белками, если есть предварительные данные о трехмерной структуре белков. Предложенные методы помогут внести ясность и однозначность в результаты полученных экспериментальных работ, поскольку будут выявлены наиболее устйочивые области взаимодействия.

2. Введенный критерий (число обусловленности матрицы, элементами которой являются потенциальные энергии электростатического взаимодействия между попарно

взятыми аминокислотными остатками белков) позволит прогнозировать уменьшение и увеличение силы связывания белков при образовании димерных комплексов.

3. Разработана математическая модель фосфорилирования аминокислотных остатков полипептидной цепи белка р53, проведен численный расчет матриц потенциальной энергии электростатического взаимодействия различных аминокислотных последовательностей с учетом фосфорилирования двух аминокислотных остатков белка р53 и выполнен анализ влияния фосфорилирования полипептидных последовательностей данного белка на его реакционную способность образовывать биологические комплексы с различными участками белков р300 и Mdm2. В ходе выполненного анализа было выявлено, что фосфорилирование двух аминокислотных остатков Thr 18 и Ser 20 N—конца белка р53 приводит к изменению стабильности биологических комплексов, образованных различными доменами белков р53,р300 и Mdm2.

Полученные результаты выявили влияния процессов фосфорилирования N—конца белка р53 на устойчивость биологических комплексов, образованных участками белков р53-р300 и р53-Mdm2.

Таким образом, возможно определить механизм переключения биологической активности такого важного белка, как р53, который является супрессором опухолей и играет важную роль во многих клеточных процессах.

4. Разработаны математические алгоритмы, которые позволяют определять нахождение активных участков белков, которые представлены подряд расположенными аминокислотными остатками в полипептидной цепи белка и определять их стабильность, таких как гомодимер гистонового шаперона Napl- Napl и гомодиме-ра Mdm2-Mdm2. Таким образом, разработанная математическая модель позволит проводить анализ различных биологических комплексов, что поможет определить в будущем направление каскадных биохимических реакций.

В перспективе это позволит определять активные участки связывания полипептидных цепей различных белков, а также подобрать и синтезировать высокоселективные полипептидные последовательности, которые будут связываться в заданном исследвоателем активном центре белка, что будет приводить к его активированию или ингибированию и блокировке дальнейшей передачи сигнала в живую клетку.

5. Разработан математический алгоритм для определения влияния точечных замен аминокислотных остатков на сродство между белковыми молекулами, активный центр которых ^рассеян^ по полипептидной цепи белка.

В ходе выполненного численного моделирования получается набор решений контроль однозначности которого осуществляется путем качественного сопоставления полученных численных значений логарифма числа обусловленности матрицы, элементами которой являются потенциальные энергии электростатического взаимодействия между попарно взятыми аминокислотными остатками белков и изменение эн-

тропии, с константой диссоциации (К^).

Предложенный подход даст возможным находить оптимальные пептиды с учетом сродства к их белкам-мишеням и разрабатывать в будущем ингибиторы или активаторы белков.

Практическая ценность результатов работы.

1. Разработанные в диссертации математические модели позволят:

- синтезировать аминокислотные последовательности с определенными физическими характеристиками,

- ускорить и повысить эффективность проводимых экспериментов, а так же снизить их стоимость за счет уменьшения количества проводимых опытов,

- создавать модели пептидов с заданными реакционными свойствами.

2. Реализованные математические модели, выполненные диссертантом, реализованы в виде оригинального программного комплекса и были апробированы в численных экспериментах. Это позволило в автоматическом режиме варьировать состав биологических субстанций, их физические и геометрические параметры с целью регистрации зависимостей между ними,, что даст в будущем использовать разработанный программный комплекс в качестве инструмента исследования в области молекулярной биофизики.

Таким образом, мы можем прогнозировать устойчивость белковых комплексов, качественно определять константу диссоциации, синтезировать пептиды с заданной константой диссоциации к различным белкам, при этом позволяя увеличивать избирательность пептидов, увеличивая сродство к одним белкам и уменьшая к другим, что является важным условием усовершенствования пептидной терапии.

Достоверность результатов основывается:

1. на надежности и теоретической разработанности математических методов, корректностью используемых приближений, воспроизводимостью расчетных данных;

2. на сравнении теоретических результатов построенных моделей с данными, полученными экспериментальным путем другими авторами.

Характер результатов. Совокупность полученных в диссертации результатов позволяет считать, что в ней представлено решение научной задачи, имеющей важное значение для развития молекулярной биофизики, в том числе биофизики белковых комплексов. На основе результатов теоретического исследования, проведенного в диссертационной работе, основанного на анализе электростатического взаимодействия между белковыми молекулами, предложен новый способ, позволяющий исследовать физические свойства биологических структур и использовать полученные результаты биофизических исследованиях и в биомедицинских исследованиях.

Положения, выносимые на защиту.

1. Число обусловленности матрицы, элементами которой являются потенциаль-

ные энергии электростатического взаимодействия между попарно взятыми аминокислотными остатками биологических комплексов для различных доменов белков, служит критерием стабильности, образовавшегося биологического комплекса, а также позволяет исследовать процессы фосфорилирования на примере димеров типа р53-Ыаш2 и р53-р300.

2. Разработанные в диссертации алгоритмы позволяют определять нахождение каталитически активных участков белковых молекул при взаимодействии без учета трехмерной структуры при условии что активный участок взаимодействия состоит из подряд расположенных аминокислотных остатков полипептидной цепи: белок-белок, пептид-белок, пептид-пептид, домен-домен, а также выявлять стабильность различных участков белковых комплексов (линейный докинг) путем анализа матрицы потенциальной энергии попарного электростатического взаимодействия между различными сайтами биологического комплекса, таких как гомодимер гистонового шаперона Nap1- Napl и гомодимер Mdm2- Mdm2, которые отвечают за вступление целой белковой молекулы в биохимические реакции.

3. Математический метод, основанный на анализе матрицы, элементами которой являются потенциальные энергии электростатического взаимодействия между попарно взятыми аминокислотными остатками исследуемых биологических комплексов, позволяет с учетом трехмерной структуры:

- учитывать влияние точечных замен аминокислотных остатков в пептидах при связывании с целыми белками,

- качественно определять диапозон изменения аффинности при связывании целого белка с различными пептидами.

Личный вклад автора. Все результаты работы получены автором лично или при его определяющем участии.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинаре кафедры физической электроники и кафедры медицинской физики Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого, в лаборатории регуляции экспрессии генов ФГБУН Института цитологии РАН, на международных конференций EMBO Conference: Molecular Machines: Integrative Structural and Molecular Biology, 2016, 20-23 November, Heidelberg, Germany и Proteomic Forum,2017, 2-5 April, Potsdam, Germany, 10th International Congress on Structural Biology, October 18-19, 2018 Helsinki, Finland, Proteomic Forum,2019,24-28 March, Potsdam, Germany.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в числе которых 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК и индексируемых в БД Scopus и Web of Science и одна монография, изданная издательством Springer-Nature.

Структура и обьем диссертации.

Диссертация состоит из 5 глав, введения, заключения. Содержит 101 страницу

машинописного текста, включая 52 рисунка, 7 таблиц и список используемых источников, насчитывающий 85 наименований.

Во введении сформулированы актуальность темы, обоснование выбора объекта исследования, цели, основные результаты, научная новизна, практическая ценность, положения выносимые на защиту и структура диссертации.

Аннотация диссертационной работы по главам.

Каждая из глав содержит краткое введение в частную задачу данной главы с заключением. Остановимся на кратком содержании каждой главы. Диссертация состоит из девяти глав, введения и заключения.

Во введении сформулированы актуальность темы, обоснование выбора объекта исследования, цели, научная новизна, практическая ценность, характер результатов, положения выносимые на защиту, структура и обьем диссертации.

Первая глава. Первая глава посвящена обзору и критическому анализу различных экспериментальных подходов, связанных с исследованием структуры молекул, взаимного расположения доменов в пространстве, выявления активных центров белков.

Вторая глава. В данной главе диссертантом рассмотрена задача моделирования процессов электростатического взаимодействия образования белковых комплексов с использованием классической электростатической теории, а также введен и обоснован критерий - число обусловленности матрицы стационарных потенциальных энергий связи между фрагментами биокомплекса, который характеризует степень устойчивости конфигурации биологического комплекса.

Третья глава. В данной главе разработана физическая модель влияния фосфо-рилирования аминокислотных остатков полипептидной цепи на образование биологических комплексов на примере фосфорилирования гибкого Оконца белка р53 по двум аминокислотным остаткам и анализ стабильности образованных им биологических комплексов р53-М^т2 и р53-р300 до и после фосфорилирования.

Четвертая глава. В данной главе диссертантом были разработаны математические алгоритмы, применение которых позволяет определять активные участки белков, а так же выявлять стабильность различных участков полипептидных цепей белковых комплексов путем анализа матрицы потенциальной энергии электростатического взаимодействия между различными участками белковых димеров, таких как гомодимер гистонового шаперона Мар1- Мар1 и гомодимера М^т2—М^т2, которые отвечают за вступление целой белковой молекулы в биохимические реакции.

Пятая глава. В данной главе изучено влияние точечных замен в в проапопти-ческих белках семейства Вс1-2 на стабильность образованного ими биологического комплекса с антиапоптическими белками семейства Вс1-2, а также описана методика качественного определения константы диссоциации пептидов к полноразмерным

белкам путем сопоставления с численными значениями логарифма числа обусловленности матрицы, элементами которой являются потенциальные энергии электростатического взаимодействия между попарно взятыми аминокислотными остатками белков.

В заключении сформулированы основные выводы и результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы.

Публикации

1. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Mathematical Modeling of Protein Complexes. Springer-Nature,2018,Pp.367.

2. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Mathematical modeling of the formation of biological complexes based on site-directed mutagenesis// EMBO Conference: Molecular Machines: Integrative Structural and Molecular Biology. 2016, 20-23 November, Heidelberg , Germany.

3. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Mathematical modeling studies of the stability complex biological systems in the case of the interaction of histone proteins H2A, H2B, H3 and H4 in vitro//EMBO Conference: Molecular Machines: Integrative Structural and Molecular Biology. 2016, 20-23 November, Heidelberg, Germany.

4. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Mathematical modeling to predict the reactivity of Nap1 with histone proteins based on their domain structure// EMBO Conference: Molecular Machines: Integrative Structural and Molecular Biology.2016,20-23 November,Heidelberg, Germany.

5. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Physical modeling of structure formation of the histone dimers H2A, H2B, H3 and H4 // Proteomic Forum 2017, 2-5 April. Potsdam, Germany.

6. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Physical modeling of the influence of phosphorylation and dephosphorylation processes the p53 protein on its binding with proteins Mdm2 and p300 // Proteomic Forum 2017, 2-5 April. Potsdam, Germany.

7. Koshlan T.V., Kulikov K.G. A mathematical model of temperature aggregation of protein structures in aqueous solutions// Proteomic Forum 2017, 2-5 April. Potsdam, Germany.

8. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Maps interaction protein complexes// Proteomic Forum 2019, 24-28 March. Potsdam, Germany.

9. Koshlan T.V., Kulikov K.G. The role of electrostatic interaction in the formation of protein complexes, for example proteins p53, p63 and p73// Proteomic Forum 2019, 24-28 March. Potsdam, Germany.

10. Koshlan T.V., Kulikov K.G. Qualitative analysis of the dissociation constant (Kd) in the interaction of peptides with full-length proteins// Proteomic Forum 2019, 24-28 March. Potsdam, Germany.

11. Кошлан Т.В., Куликов К.Г. Математическое моделирование взаимодействия белковых молекул и прогнозирование их реакционной способности. Журнал техни-

ческой физики. 2016. Т. 86. № 10. С. 131-138.

12. Кошлан Т.В., Куликов К.Г. Математическое моделирование образования ги-стонового октамера. Журнал технической физики. 2017. Т. 87. № 5. С. 665-671.

13. Кошлан Т.В., Куликов К.Г. Математическое моделирование образования комплекса белковых молекул с учетом их доменной структуры. Журнал технической физики. 2017. Т. 87. № 4. С. 489-497.

14. Кошлан Т.В., Куликов К.Г. Математическое моделирование влияния температуры на характер связывания мономерных белков в водных растворах. Журнал технической физики. 2017. Т. 87. № 11. С. 1734-1741.

15. Кошлан Т.В., Куликов К.Г. Математическое моделирование линейного докин-га. Ч.1 Определение участков связывания между белковыми молекулами. Журнал технической физики. 2018. Т. 88. № 8. С. 1137-1149.

16. Кошлан Т.В., Куликов К.Г. Математическое моделирование линейного до-кинга. Ч.2 Определение влияния точечных мутаций на сродство между белковыми молекулами. Журнал технической физики. 2018. Т.88. № 8. С. 1150-1159.

Глава 1

Физические методы исследования белков

В этой главе рассмотрены различные экспериментальные подходы для определения структуры молекул, взаимного расположения доменов в пространстве, выявления активных центров белков и отмечены их достоинства и ограничения в области исследования различных физических свойств биологических комплексов.

1.1 Методы электрофореза

Основой метода электрофореза является движение заряженных частиц под действием электрического поля [2]-[8]. Большое количество таких важных биологических молекул, как белки, аминокислоты, нуклеиновые и рибонуклеиновые кислоты обладают различными ионизируемыми группами и поэтому в растворе существуют различные электрические заряженные частицы: либо виде анионов, либо в виде катионов. Эти частицы мигрируют либо к аноду, либо к катоду под действием приложенного электрического поля. Отметим, что многие сложные биологические молекулы могут иметь несколько различных заряженных групп и будут двигаться в среде с приложенным электрическим полем в зависимости от результирующего заряда.

Рассмотри более детально, как разделяются заряженные биологические частицы в процессе электрофореза.

Для разделения выбранных биологических объектов в среде, к электродам следует приложить разность потенциалов (напряжение), которое создает электрическое поле , которое соответствует отношению приложенного напряжения V и расстояния й между электродами. Таким образом, когда на молекулу, которая обладает зарядом д (Кл), действует электрическое поле , возникает сила Ед (Н). Данная сила приводит к движению заряженной молекулы к электроду. Во время движения возникает сила трения, которая задерживает движение молекулы. Сила трения зависит от фор-

мы и размера молекулы и от размера пор среды, в которой проводят электрофорез, вязкости буфера и имеет гидродинамическую природу. На практике чаще используют понятие электрофоретической подвижности иона , которая является отношением скорости движения иона к напряженности поля. Молекулы будут разделяться в зависимости от их размера, даже если они обладают одинаковым суммарным зарядом, поскольку на них воздействует различная сила трения. Таким образом, молекулы начинают двигаться в буфере с различной скоростью и разделяться в зависимости от их электрофоретической подвижностью при подаче разности потенциалов на электроды.

При отключении электрического поля до того, как все молекулы достигнут электродов, компоненты биологической смеси образца будут разделены в зависимости от их электрофоретической подвижности. Определение и локализацию разделенных компонентов биологической смеси определяют с помощью авторадиографии или путем окрашивания в подходящем красителе. Электрофореграммы белков-ферментов позволяют изучать изменения активности и изоферментного спектра белков под действием внешних и внутренних факторов как у человека, так и у других организмов.

Электрофорез является удобным методом, который позволяет разделять смесь белков после проведенных перед этим различных экспериментов и делать выводы об устойчивости биологических комплексов: гомодимеров, гетеродимеров, тетрамеров, олигополимеров и т.п. Во время проведения электрофореза основная часть генерируемой мощности рассеивается в виде тепла. Нагревание среды, в которой проводят электрофорез, имеет негативные последствия, а именно: - уменьшение вязкости буфера со снижением сопротивления среды, - образование конвекционных токов, приводящих к перемешиванию разделенных образцов, - повышение скорости диффузии ионов образца и буфера, приводящее к уширению зон разделяемых образцов, - термическое разрушение образцов, которые довольно часто чувствительны к нагреванию. Это может вызвать денатурацию белков

Метод электрофореза может только подтвердить или не подтвердить образования молекулярного комплекса или его диссоциацию, но ничего не говорит нам о природе взаимодействия или причинах диссоциации, как и о структуре образовавшегося комплекса [8]. Не позволяет выявить строение каталитических активных центров молекулы. Не дает возможности рассчитать термодинамические константы вступающих во взаимодействия молекул или делать какие либо выводы об устойчивости биологических комплексов.

1.2 Хроматографические методы.

Хроматографический метод это метод разделения веществ [9]-[18]. Он был разработан русским ботаником Михаилом Цветом.

В основе метода хроматографии лежит распределение анализируемых веществ между двумя несмешивающимися фазами, которое описывается коэффициентом распределения КДвум различным фазам А и В отвечает коэффициент распределения при заданной температуре и он является величиной постоянной [19]

К N

где Аа—концентрация в фазе А, Ад—концентрация в фазе В.

В любой хроматографической системе есть неподвижная (стационарная) фаза и подвижная фаза. Неподвижной фазой может выступать твердый носитель, гель, жидкость или смесь твердого вещества и жидкости. Подвижная фаза может быть жидкой, газообразной и проникает сквозь неподвижную фазу после нанесения на нее разделяемой смеси. В процессе хроматографии, вещества контактируют с двумя фазами и различия в коэффициентах распределения веществ приводят к разделению исследуемой смеси.

На данный момент существует два основных варианта проведения хроматогра-фического разделения: тонкослойная и колоночная.

Рассмотрим более подробно колоночную хроматографию. В данном методе стационарная фаза находится в металлической или в стеклянной колонке. Смесь веществ, подлежащих анализу веществ, наносят на колонку, а затем начинают пропускать через неё подвижную фазу, которую называют элюентом.

Данный метод колоночной хроматографии наиболее часто используется для аналитических целей в биохимии. В процессе прохождения элюента через колонку анализируемые вещества разделяются в зависимости от их коэффициентов распределения и выходят из колонки как раствор элюата.

В тонкослойной хроматографии стационарная фаза на подходящей матрице покрывают тонким слоем пластинку из стекла, металлической фольги или пластика. Смесь, подлежащую разделению наносят на край пластинки в виде пятна или полосы. Далее в пластинке, находящейся в горизонтальной или вертикальном положении, начинает поступать подвижная фаза под действием капиллярных сил, заставляя анализируемые вещества мигрировать к противоположному краю пластинки с определенной для каждого вещества скоростью.

Преимуществом такого метода перед колоночной хроматографией является возможность анализировать сразу несколько образцов. Для улучшения разделения анализируемых веществ, состав подвижной фазы можно изменять, например, меняя

концентрацию соли, значения рН, или полярность. Успешным проведением прояви-тельной хроматографии является выход в чистом виде всех компонентов смеси.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кошлан Татьяна Викторовна, 2019 год

Литература

[1] Демчук О.Н., Карпов П.А., Блюм Я.Б. Докинг низкомолекулярных лигандов на молекуле растительного FtsZ-белка: применение технологии CUDA для ускорении расчетов. // Цитология и генетика. 2012. N.3. С.55-64.

[2] Гааль Э., Медбеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. 448 с.

[3] Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л. М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высшая школа, 1975. 327 с.

[4] Голицын В.М. Неденатурирующий электрофорез. Фракционирование фотосинтетических пигмент-белковых комплексов и белков плазмы крови // Биохимия. 1999. Т.64. С. 64-70.

[5] Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. 463 с.

[6] Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.

[7] Сафонов В.И., Сафонова М.П. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в полиакриламидном геле // Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука, 1971. С. 113-137.

[8] Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови. М.: Оп-тиум Пресс, 1994. 62 с.

[9] Хефтман Э., Кастер Т., Нидервизер А., Кацимпулас Н., Куксис А., Кротью Р., Рональд Р. Хроматография. Практическое приложение метода. В 2-х ч. Ч. 1. / Под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986. 336 с.

[10] Schlüter H. Reversed-Phase Chromatography //J. Chromat. Libr. 2000. V. 61. Pp. 147-234.

[11] Jungbauer A., Machold C. Chromatography of proteins //J. Chromat. Libr. 2004. V. 69. Part B. Pp. 669-737.

[12] Caude M., Jardy A. Normal-phase liquid chromatography // Chrom. Sci. Ser. l998. V. 78. Pp. 325-363.

[13] Rogner M. Size Exclusion Chromatography //J. Chromat. Libr. 2000. V. 6l. Pp. 89-l45.

[14] Anspach F. Affinity chromatography //J. Chromat. Libr. 2004. V. 69. Part А. Pp. l39-l69.

[15] Cuatrecasas P., Wilchek M. Affinity chromatography // Encyclopedia of Biological Chemistry. 2004. V. l. Pp. 5l-56.

[16] Hage D., Nelson M. Chromatographic immunoassays // Anal. Chem. 200l. V. 73. Pp. l98A-205A.

[17] Хеншен A., Xy^ К., Лотшпайх Ф., Вальтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Москва. Мир. l988. 688 с.

[18] Остерман Л. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. l985. 536 с.

[19] Уилсон К., Уолкер Дж. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. М.: Бином, 20l3.

[20] Клюев Н.А., Бродский Е.С. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений//Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2002, т. XLVI, № 4

[21] А.Т. Лебедев А.Т., Артеменко К.А., Самгина Т.Ю. Основы масс-спектрометрии белков и пептидов М.: Техносфера ВМСО, 20l2.

[22] Бландел Т., Джонсон Л. Кристаллография белка. —М.:Мир, l979.

[23] D'Arcy S., Martin K.W., Panchenko T., Chen X., Bergeron S., Stargell L.A., Black B.E., Luger K. Chaperone Napl shields histone surfaces used in a nucleosome and can put H2A-H2B in an unconventional tetrameric form.//Mol. Cell. 20l3. V.5l. N.5. Pp.662-677.

[24] Andrews A.J., Downing G., Brown K., Park Y.J., Luger K. A thermodynamic model for Napl-histone interactions.// J. Biol. Chem. 2008. V.283. N.47. Pp.324l2-324l8.

[25] Aguilar-Gurrieri.C.Structural evidence for Napl-dependent H2A-H2B deposition and nucleosome assembly.//EMBO J. 2016. V.35. N.13.Pp.1465-1482.

[26] Уильяме Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978.

[27] Практикум по биохимии. Под редакцией С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. М.:МГУ, 1989.

[28] Gerald D. Fasman. Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules. — Springer, 1996.

обращения 25.02.2018).

[29] Fenley A.T., Adams D.A., Onufriev A.V. Charge state of the globular histone core controls stability of the nucleosome.//Biophys. J. 2010. Vol.99. Pp. 1577-1585.

[30] Семчиков Ю.Д. Высокомолекулярные соединения. М.: Академия, 2010.

[31] Gerstein M. & Richards F.M. Protein Geometry: Volumes, Areas, and Distances. Yale University, 1977

[32] Biro J.C. Indications that "codon boundaries"are physico-chemically defined and that protein-folding information is contained in the redundant exon bases.//Theoterical biology and medical modelling, 2006 V. 3. N.15, Pp.1-12.

[33] Almazov A.B. Probabilistic methods in the theory of polymers M.:Science,1971.

[34] Ryskin Ya.I. Hydrogen bond and structure of hydrosilicates L.:Science,1972

[35] Саранин В. А. О взаимодействии двух электрически заряженных проводящих шаров.// УФН. 1999. Т.169. С. 453-458.

[36] Саранин В.А. Напряженность электрического поля заряженных проводящих шаров и пробой воздушного промежутка между ними.// УФН. 2002. Т.172. С.1449-1454.

[37] Саранин В.А. Теоретические и экспериментальные исследования взаимодействия двух проводящих заряженных шаров.// УФН.2010. Т.180. С. 1109-1117.

[38] Смайт В. Электростатика и Электродинамика. Перевод со второго американского издания А.В. Гапонова и М.А. Миллера. Изд. ИЛ, М. 1954.

[39] Paige C.C. and Van Dooren P. On the Quadratic Convergence of Kogbetliantz's Algorithm for Computing the Singular Value Decomposition. Linear Algebra and Its Applications. 1985. V.77. Pp.301-313.

[40] Matej H. and Tomaz U.Strength of hydrogen bonds of water depends on local environment. //The Journal of chimical physics, 20l2. V. l36. N. Pp. l44305-l-l44305-7. В. Вересов. Структурная биология апоптоза.Минск : Белорус. наука, 2008. — 398 с.

[41] Wade M., Wang Y.V., Wahl G.M. The p53 orchestra: Mdm2 and Mdmx set the tone.//Trends Cell Biol. 20l0. V.20. N.5.Pp.299-309.

[42] Lane D.P., Crawford L.V.T. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells.// Nature l979. V.278. Pp.26l-263.

[43] Elena S., Yentram H., Emily A., Thanos D. H. The p53 Tumor Suppressor Pathway and Cancer Springer, 2005.

[44] Nag S., Qin J., Srivenugopal K.S., Wang M., Zhang R. The MDM2-p53 pathway revisited.//J. Biomed. Res. 20l3. V.27. N.4. Pp.254-27l.

[45] Ayeda Ayed, Theodore Hupp. Molecular Biology Intelligence Unit. V.l, p53. Springer Science & Business Media,20l0

[46] Кишкун А.А. Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции. Руководство для врачей. ЭОТАР-Медиа, 2008. 976 c.

[47] Fflaum J., Schlosser S., Muller M. p53 Family and Cellular Stress Responses in Cancer. //Front Oncol. 20l4. V.4. N.285.

[48] Miriam S., Lopez-Pajares V. and Zhi-Min Yuan. MDM2 and MDMX: Alone and together in regulation of p53. //Transl. Cancer Res. 20l2. V.l. N.2. Pp.88-89.

[49] Wade M., Wang Y.V., Wahl G.M.The p53 orchestra: Mdm2 and Mdmx set the tone.//Trends Cell Biol. 20l0. V.20. N.5. Pp. 299-309

[50] Yingjuan Q., Xinbin C., Qian Y. et al. Senescence regulation by the p53 protein family.// Methods Mol. Biol. 20l3. V.965. Pp.37-6l.

[51] Daniel P. T., Stefan M. F., Bycroft M., and Fersht A.R. Four domains of p300 each bind tightly to a sequence spanning both transactivation subdomains of p53. //Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 2007. V.l04. N.l7. Pp.7009-70l4.

[52] Moll U.M., Petrenko O.The MDM2-p53 interaction.//Mol. Cancer. Res. 2003. V.l. N.l4.Pp.l00l-l008.

[53] Terzianl T. and Lozano G. Building p53.//Genes. Dev. 20l0. V.24. N.20. Pp.22292232.

[54] Mendoza M., Mandani G., and Momand J. The MDM2 gene family. //Biomol. Concepts. 2014. V.5. N.1. Pp.9-19.

[55] Manfredi J.J.The Mdm2-p53 relationship evolves: Mdm2 swings both ways as an oncogene and a tumor suppressor.//Genes. Dev. 2010. V.24. N.15. Pp.1580-1589.

[56] Mary E. Gerritsen, Amy J. Williams, Andrew S. Neish,Sarah Moore, Yang Shi, and Tucker Collins. CREB-binding protein/p300 are transcriptional coactivators of p65.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V.94. N.7. Pp.2927-2932.

[57] Yang, Lin-Jing Li, Ling-Zhi Xu, Jiang-Qi Liu, Huan-Ping Zhang, Xiao-Rui Geng, Zhi-Gang Liu & Ping-Chang Yang. Histone acetyltransferease p300 modulates TIM4 expression in dendritic cells.//Scientific Reports 6, Article number: 21336. 2016.

[58] Piergiorgio Percipalle and Neus Visa. Molecular functions of nuclear actin in transcription.//J. Cell. Biol. 2006. V.172. N.7. Pp.967-971.

[59] Delvecchio M., Gaucher J., Aguilar-Gurrieri C., Ortega E., Panne D. Structure of the p300 catalytic core and implications for chromatin targeting and HAT regulation. //Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. V.20. N.9. Pp.1040-1046

[60] Shangary S., Wang S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. //Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2009. V.49. Pp.223-241.

[61] Feng H, Jenkins L.M., Durell S.R., Hayashi R., Mazur S.J., Cherry S., Tropea J.E., Miller M., Wlodawer A., Appella E., Bai Y. Structural basis for p300 Taz2-p53 TAD1 binding and modulation by phosphorylation. //Structure. 2009. V.17. N.2. Pp.202-210.

[62] The Universal Protein Resource//http://www.uniprot.org/(дата обращения 05.09.2019).

[63] Системная компьютерная биология / Коллектив авторов .— Монография .— Новосибирск : Издательство СО РАН, 2008 .— 769 с.

[64] Betts M.J., Sternberg M.J. An analysis of conformational changes on protein-protein association: implications for predictive docking.// Protein Eng. 1999. V. 12. Pp. 271-283.

[65] Park Y.J., Luger K. The structure of nucleosome assembly protein 1.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103. N.5. Pp.1248-1253.

[66] Leslie P.L., Ke H., Zhang Y.The MDM2 RING domain and central acidic domain play distinct roles in MDM2 protein homodimerization and MDM2-MDMX protein heterodimerization//J. Biol. Chem. 2015. V.290. N.20. Pp.12941-12950.

[67] Poyurovsky M.V., Priest C., Kentsis A., Borden K.L., Pan Z.Q., Pavletich N., Prives C. The Mdm2 RING domain C-terminus is required for supramolecular assembly and ubiquitin ligase activity //EMBO J. 2007. V.26. N.1. Pp.90-101.

[68] Haiming D., Meng X.W., Scott H Kaufmann S.H. BCL2 Family, Mitochondrial Apoptosis, and Beyond.// Cancer. Transl. Med. 2016 V.2. N.1. Pp.7-20.

[69] Ding J., Zhang Z., Roberts G.J., Falcone M., Miao Y., Shao Y., Zhang X.C., Andrews D.W., Lin J. J.Bcl-2 and Bax interact via the BH1-3 groove-BH3 motif interface and a novel interface involving the BH4 motif. // Biol. Chem. 2010. V.285. N.37. Pp.28749-28763.

[70] Bhat V., Olenick M.B., Schuchardt B.J., Mikles D.C., McDonald C.B., Farooq A. Molecular determinants of the binding specificity of BH3 ligands to BclXL apoptotic repressor. //Biopolymers. 2014. V.101. N.6. Pp.573—582.

[71] Ku B., Liang C., Jung J.U., Oh B.H., Bonsu Ku., Chengyu L., Jae U. J., Byung-Ha O. Evidence that inhibition of BAX activation by BCL-2 involves its tight and preferential interaction with the BH3 domain of BAX.//Cell Research. 2011. V.21. Pp.627—641.

[72] Dewson G. Interplay of Bcl-2 Proteins Decides the Life or Death Fate.//The Open Cell Signaling Journal. 2011. V.3. Pp.3—8.

[73] Yoshihiro Yoshitake, Daiki Fukuma, Akira Yuno, Masatoshi Hirayama, Hideki Nakayama, Takuya Tanaka, Masashi Nagata, Yasuo Takamune, Kenta Kawahara, Yoshihiro Nakagawa, Ryoji Yoshida, Akiyuki Hirosue, Hidenao Ogi, Akimitsu Hiraki, Hirofumi Jono, Akinobu Hamada, Koji Yoshida, Yasuharu Nishimura, Yusuke Nakamura and Masanori Shinohara. Phase II Clinical Trial of Multiple Peptide Vaccination for Advanced Head and Neck Cancer Patients Revealed Induction of Immune Responses and Improved OS //Clin. Cancer Res. 2015 V. 21. N.2. Pp.312—321.

[74] Haiming D., Meng X.W., Scott H Kaufmann S.H. Bcl2 Family, Mitochondrial Apoptosis, and Beyond// Cancer. Transl. Med. 2016 V.2. N.1. Pp.7—20.

[75] Dewson G. Interplay of Bcl-2 Proteins Decides the Life or Death Fate//The Open Cell Signaling Journal. 2011. V.3. Pp.3—8.

Bhat V., Olenick M.B., Schuchardt B.J., Mikles D.C., McDonald C.B., Farooq A. Molecular Determinants of the Binding Specificity of BH3 Ligands to Bcl-xl Apoptotic Repressor //Biopolymers. 2014. V.101. N.6. Pp.573—582.

[77] Zlatanova J., Seebart C., Tomschik M. Napl: taking a closer look at a juggler protein of extraordinary skills//FASEB J. 2007. V.21. N.7. Pp.1294-1310.

[78] Protein data bank. https://www.rcsb.org/

[79] Dijk E., Hoogeveen A., Abeln S.The Hydrophobic Temperature Dependence of Amino Acids Directly Calculated from Protein Structures.// PLOS Comput. Biol. Pp. 1-17.

[80] Ku B., Liang C., Jung J.U., Oh B.H., Bonsu Ku., Chengyu L., Jae U.J., Byung-Ha O. Evidence that inhibition of BAX activation by BCL-2 involves its tight and preferential interaction with the BH3 domain of BAX. // Cell Research. 2011. Vol. 21. Pp. 627-641

[81] Тырсин А.Н., Калев О.Ф., Яшин Д.А., Лебедева О.В. Оценка состояния здоровья популяции на основе энтропийного моделирования// Математическая биология и биоинформатика 2015. Т. 10. № 1. С. 206-219

[82] Лебедева О.В. Энтропийное моделирование динамики многомерных стохастических систем. // Дисс. на соис. уч. степени кандидата физико-математических наук, Челябинск, 2015.

[83] Cover T.M., Thomas J.A. Elements of Information Theory. N.Y.: Wiley, 1991, 563 p.

[84] Wypych G. Handbook of solvents. ChemTec Publishing, 2001, p.1680.

[85] Рубин А.Б. Биофизика. Том 1. Теоретическая биофизика. М.: МГУ, 1999, 448с.