Исследование стабильности и скоростей формирования различных состояний мутантных форм апомиоглобина с заменами аминокислотных остатков на поверхности белка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Мажорина Мария Анатольевна

• Мажорина Мария Анатольевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Мажорина Мария Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие принципы самоорганизации белковых молекул

1.2 Пути самоорганизации (одностадийное и многостадийное сворачивание)

1.3 Современные направления в исследовании самоорганизации белков

1.4. Кинетические методы исследования самоорганизации белков

1.5. Характеристика объекта исследования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Методы генной инженерии

2.1.1. Полимеразная цепная реакция

2.1.2. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции

2.1.3. Выделение и очистка фрагментов ДНК

2.1.4. Лигирование фрагментов ДНК

2.1.5. Трансформация клеток E. coli

2.1.6. Анализ клонов методом ПЦР

2.1.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.1.8. Проведение реакции секвенирования

2.1.9. Список использованных в работе праймеров

2.2. Экспрессия генов выделение и очистка апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм

2.3. Физико-химические методы исследования

2.3.1. Круговой дихроизм

2.3.2. Флуоресцентная спектроскопия

2.3.3. Динамическое светорассеяние

2.3.4. Абсорбционная спектроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. ЗАМЕНЫ ГИДРОФОБНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ НА ПОВЕРХНОСТИ СПИРАЛЕЙ АПОМИОГЛОБИНА

3.1. Выбор аминокислотных остатков для замен

3.2 Исследование равновесного разворачивания мутантных форм апомиоглобина

З.З.Кинетические исследования сворачивания/разворачивания мутантных форм апомиоглобина

ГЛАВА 4. ЗАМЕНЫ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ПЕТЛЯХ, СОЕДИНЯЮЩИХ ЭЛЕМЕНТЫ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ АПОМИОГЛОБИНА

4.1. Выбор аминокислотных остатков для замен

4.2. Исследование равновесного разворачивания мутантных форм апомиоглобина

4.3. Исследование мутантных форм апомиоглобина методом динамического рассеяния света

4.4. Кинетические исследования сворачивания/разворачивания мутантных форм апомиоглобина

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

PDB (Protein Data Bank) - банк данных пространственных структур белков а.о. - аминокислотный остаток Да - дальтон

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия

ДТТ (DTT) - дитиотреитол, ^^)-1,4бис(сульфинил)бутан-2,3-диол

ИПТГ (IPTG) - изопропил-1-тио-Р-0-галактопиранозид

ПААГ (PAAG) - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

HPLC (high performance liquid chromatography) - высокоэффективная жидкостная хроматография

Ia - йодацетамид

ТФА (TFA) - трифторуксусная кислота OD600 - оптическая плотность на 600 нм КД - круговой дихроизм

DLS (dynamic light scattering ) - динамическое рассеяние света

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование стабильности и скоростей формирования различных состояний мутантных форм апомиоглобина с заменами аминокислотных остатков на поверхности белка»

Актуальность темы исследования

Одной из фундаментальных задач молекулярной биологии является изучение процесса спонтанного сворачивания белка в свое уникальное нативное состояние, в частности, определение взаимосвязи между аминокислотной последовательностью белка и особенностями его свободно-энергетического профиля, отражающего взаимное расположение уровней свободной энергии всех его состояний. Решение данной задачи позволит направленно изменять стабильности белков и получать белковые структуры с заданными свойствами.

Степень разработанности

В настоящее время ученые достигли значительных успехов в этом направлении исследований. Например, показано, что не все остатки, входящие в последовательность белка, являются важными для его правильного сворачивания. Поэтому белки с низкой гомологией последовательности могут иметь сходную пространственную структуру (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002; Plotkin S.S., Onuchic J.N., 2002). Наряду с этим, важно отметить, что замена лишь одного аминокислотного остатка может существенно повлиять на весь процесс самоорганизации белка (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002; Guzman-Luna V. et al., 2017; Frare E. et al., 2005).

Несмотря на огромное количество опубликованных на сегодняшний день экспериментальных и теоретических работ в области исследования самоорганизации белковых структур, достаточно много вопросов, связанных с деталями этого сложного процесса, до сих пор ожидают своего решения. Самым сложным является получение знаний о сворачивании белков в живой клетке, поскольку в этом случае оно происходит в многокомпонентном макромолекулярном окружении. Этим обусловлен большой интерес ученых к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов (Ryabova N.A. et al., 2013; Marchenko N.Yu. et al., 2009; Marchenkov V.V., Semisotnov G.V., 2009), а также котрансляционного сворачивания (Кузнецова И.М. и др., 2005; Fink A.I.,

1999), которые способствуют правильной самоорганизации белка в этих условиях. Экспериментальные работы, посвященные самоорганизации белков, ведутся в основном in vitro. Используют для этого зрелые очищенные белки.

Белки, сворачивание которых проходит в одну стадию, достаточно хорошо изучены методом Ф-анализа, который впервые был предложен Ферштом (Matouschek A. et al., 1989, 1990; Fersht A.R. et al., 1992). Это метод, который по результатам кинетических исследований мутантных форм белков позволяет определить вовлеченность аминокислотных остатков в ядро сворачивания. Гораздо менее изучено многостадийное сворачивание белков. В частности, плохо изучены свойства белка при переходе из одного промежуточного состояния в другое. Нет полного понимания того, какие взаимодействия определяют стабильность и высоту энергетического барьера, разделяющего развернутое состояние белка и состояние расплавленной глобулы (промежуточное состояние).

Научная новизна

Наибольшее количество экспериментальных работ посвящено изучению взаимодействий в гидрофобном ядре белка, поскольку широко распространено мнение об их первостепенной роли в определении стабильности структуры белков (например, Baryshnikova E.N. et. al., 2005). Намного меньше исследованы взаимодействия аминокислотных остатков на поверхности белковых молекул, в том числе их участие в определении стабильности нативной структуры, а также скоростей денатурации и ренатурации многостадийно сворачивающихся белков. И совсем мало работ, посвященных систематическому исследованию петель, соединяющих элементы вторичной структуры белка, поскольку считается, что это «не существенные» участки для нативной структуры.

Данная диссертационная работа посвящена исследованию апомиоглобина. Апомиоглобин - это хороший модельный объект для исследования глобулярных белков, самоорганизация которых проходит через образование промежуточного состояния типа расплавленной глобулы. Получены новые экспериментальные данные о равновесных и кинетических свойствах мутантных форм белка с

заменами и вставками поверхностных аминокислотных остатков, принадлежащих спиралям апомиоглобина (Мажорина М.А., Мельник Б.С., 2018), а также располагающихся в четырех его петлях (Majorina M.A. et al., 2020). Результаты экспериментов позволили сделать выводы о влиянии таких замен на свободно-энергетический профиль белка. Например, нами впервые показано следующее. Хотя с помощью выбранных в данной работе точечных замен гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности апомиоглобина (L9E, A15S, A19S, A53S, A57S, A125S, A144S, L149E), максимально доступных для растворителя, нельзя существенно повлиять на стабильность его промежуточного состояния относительно развернутого, однако на стабильность промежуточного состояния апомиоглобина влияет введение остатков глицина в петли, соединяющие элементы его вторичной структуры (Мажорина М.А., Мельник Б.С., 2018; Majorina M.A. et al., 2020). Определены аминокислотные остатки, замены которых оказывают избирательное влияние на стабильность или только нативного, или только переходного состояния белка относительно развернутого состояния (Мажорина М.А., Мельник Б.С., 2018), а также случаи неаддитивного влияния двух одновременных замен аминокислотных остатков на свободно-энергетический профиль апомиоглобина. Кроме того, показано, что направленно изменить скорость формирования нативного состояния апомиоглобина, не повлияв существенно на скорость его разворачивания, можно заменами аминокислотных остатков в районе петель белка.

Цели и задачи

Цель представленной диссертационной работы - исследовать влияние замен аминокислотных остатков на поверхности апомиоглобина на свободную энергию различных состояний белка. В частности, исследовать:

1. Одиночные замены гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности спиралей апомиоглобина.

2. Замены аминокислотных остатков в петлях, соединяющих элементы вторичной структуры белка:

1) Одиночные замены аминокислотных остатков.

2) Изменение «гибкости» петель при замене остатков пролина (Pro) на глицин (Gly).

3) Удлинение петли за счет введения нескольких остатков глицина (Gly). Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Спроектировать на поверхности апомиоглобина:

1) Одиночные замены гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности спиралей.

2) Одиночные замены аминокислотных остатков в петлях.

3) Замены аминокислотных остатков пролина (Pro) в петлях на один или несколько остатков глицина (Gly).

2. Получить генетические конструкции, выделить и очистить мутантные формы белка с выбранными заменами.

3. Провести равновесные и кинетические исследования денатурации и ренатурации белков.

4. Провести сравнительную оценку влияния разных типов мутаций на свободно-энергетический профиль апомиоглобина.

Методология и методы исследования

В рамках данной диссертационной работы были получены генетические конструкции с заменами и вставками аминокислотных остатков на поверхности спиралей и в петлях белка. Создание генетических конструкций мутантных форм белка проводилось автором при содействии сотрудников группы генной инженерии Института белка РАН и группы спектроскопии белка Института белка РАН (Гуховым А.С. и Глуховой К.А.). Степень участия автора в генно-инженерных экспериментах не менее 80%.

Проведены работы по выделению белков и их хроматографической очистке. Чистота белков контролировалась с помощью SDS электрофореза. Полученные мутантные формы апомиоглобина исследовали с помощью современных физико-

химических методов, включающих абсорбционную и флуоресцентную спектроскопию, спектроскопию кругового дихроизма в ближней и дальней УФ области, динамическое светорассеяние. В частности, с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД) в ближней и дальней ультрафиолетовой области, а также флуоресценции триптофановых остатков исследовали белки в нативных условиях, а также их разворачивание разными концентрациями денатуранта (мочевины). Методом динамического рассеяния света оценивалась склонность белков к агрегации.

Методом триптофановой флуоресценции с использованием приставки остановленного потока для быстрого смешивания растворов проведены исследования кинетики процессов сворачивания и разворачивания белков: измерение кинетических кривых сворачивания и разворачивания, расчет видимых констант скоростей этих процессов, построение их зависимости от концентрации денатуранта (шевронные графики), расчет свободной энергии всех состояний апомиоглобина. Данный экспериментальный подход к анализу кинетических свойств многостадийно сворачивающихся белков на примере апомиоглобина был разработан и успешно применяется в Лаборатории физики белка ИБ РАН (Baryshnikova E.N. et. al., 2005).

Теоретическая и практическая значимость

По результатам исследований апомиоглобина, проведенных в рамках данной диссертационной работы, удалось сделать важные выводы, которые применимы для проектирования мутаций в любом глобулярном белке. Полученные знания могут быть использованы в белковой инженерии и биотехнологии, например, для решения проблем, связанных с агрегацией белков и амилоидообразованием. В литературе эти процессы связывают со стабильностью, скоростью образования и концентрацией промежуточного состояния (например, Kuwajima K., 1992; Katina N.S. et. al., 2017).

Результаты проделанной работы помогают раскрыть взаимосвязь между последовательностью аминокислотных остатков белка и его пространственной

структурой, что способствует разработке методик направленного изменения стабильности белков и получению белковых структур с заданными свойствами.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 122 страницах и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 147 источников. Работу иллюстрируют 37 рисунков.

Апробация работы и публикации

Результаты работы прошли апробацию на следующих конференциях: Ежегодная институтская конференция ИБ РАН (Россия, Пущино, 2010), 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -Наука XXI века» (Россия, Пущино, 2011), European Biophysics Congress (Germany, Dresden, 2015), XXVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2015), XXVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2016), 20-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Россия, Пущино, 2016), 22-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2018), XIV Международная научная конференция Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2019 (Россия, Москва-Севастополь, 2019), 73-я всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биосистемы:организация, поведение, управление» (Россия, Нижний Новгород, 2020).

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи в журналах из перечня ВАК («Молекулярная биология», «PLOS One», «FEBS Letters») и 9 тезисов конференций.

Положения, выносимые на защиту

1. Хотя одиночные замены гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности апомиоглобина, максимально экспонированных на растворитель (Ь9Б, Л15Б, Л19Б, Л53Б, Л57Б, Л125Б, Л144Б, Ь149Б), существенно не влияют на стабильность промежуточного состояния белка относительно развернутого, введение остатков глицина в петли апомиоглобина (Р370, Р1200, Р120(30), Р120(60)) позволяет дестабилизировать его промежуточное состояние относительно развернутого состояния.

2. На поверхности апомиоглобина найдены гидрофобные аминокислотные остатки, замены которых избирательно влияют на стабильность или только нативного, или только переходного состояния белка относительно развернутого состояния. Обнаружены случаи неаддитивного влияния двух одновременных замен аминокислотных остатков на стабильность различных состояний белка.

3. Направленно изменить скорость формирования нативного состояния апомиоглобина, не повлияв существенно на скорость его разворачивания, можно заменами аминокислотных остатков в районе петель белка.

Личный вклад автора

Автор участвовал в постановке целей и задач исследования. Все работы по выделению и очистке апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм, а также их физико-химические исследования и обработка полученных данных выполнены лично автором. Создание генетических конструкций мутантных форм белка проводилось автором совместно с сотрудниками группы генной инженерии Института белка РАН и группы спектроскопии белка Института белка РАН (Гуховым А.С. и Глуховой К.А.). Степень участия автора в генно-инженерных экспериментах не менее 80%.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общие принципы самоорганизации белковых молекул.

Одним из самых важных компонентов всех живых организмов являются белки. Их активное изучение позволило раскрыть все многообразие и значимость выполняемых ими функций. Они участвуют в транспорте молекул, являются катализаторами и регуляторами важнейших клеточных процессов, обеспечивают движение, восприятие и передачу межклеточных сигналов, защиту от чужеродных молекул и многое другое.

Белок является гетерополимером. В основе любого белка лежит полипептидная цепь, состоящая из аминокислотных остатков и представляющая собой первый уровень структурной организации (первичную структуру) белка. Этот факт был установлен Э. Фишером еще в начале 20 века. Существуют 20 основных аминокислотных остатков, из которых образуется множество белков. Их положение в белковой цепи определяется генами. Кроме того, многие белки могут содержать в себе дополнительные молекулы или ионы, необходимые для правильного выполнения белком своей функции. Их называют кофакторами или лигандами. Исследования природных лигандов и их влияния на структуру и стабильность белков представляют собой отдельную область научных интересов (Уверский В.Н., Нарижнева Н.В., 1998; Stepanenko O.V. et al., 2012).

В 1961 году Анфинсен сделал замечательное открытие, за которое был

удостоен Нобелевской премии (Anfinsen C.B. et al., 1961). Он показал на примере

рибонуклеазы, что глобулярный белок способен спонтанно сворачиваться in vitro

(ренатурировать), если после биосинтеза не было серьезной химической

модификации белка (иными словами, если воздействие аномальных температур

или состава растворителя не привело к разрыву основной цепи белка) (Anfinsen

C.B. et al., 1961; Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002). Фактически это

означает, что сама последовательность аминокислотных остатков в цепи белка

определяет способ построения его трехмерной структуры. Впоследствии этот

вывод получил подтверждение в экспериментах на многих других белках.

Открытие явления самоорганизации и расшифровка первых трехмерных структур

12

стали отправной точкой для активного обсуждения и исследования процесса сворачивания белков (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002).

На сегодняшний день установлено, что белковые цепи сворачиваются строго определенным образом с образованием уникальных, активно функционирующих нативных структур. Все уровни организации нативной структуры формируются и поддерживаются с помощью нескольких основных типов взаимодействий: водородных связей, гидрофобных, ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий. Среди них гидрофобным взаимодействиям отводится главная роль в обеспечении компактности белковой молекулы, водородные связи поддерживают вторичную структуру, а ван-дер-ваальсовы силы и электростатические взаимодействия — третичную структуру белка. Все указанные типы взаимодействий можно объединить под названием «конформационные силы», отметив при этом, что различная физическая природа этих сил является причиной их разной зависимости от условий среды, в которые помещают молекулу белка (Уверский В.Н., Птицын О.Б., 1996; Уверский В.Н., 1998). Это дает возможность экспериментаторам, подбирая необходимые условия, добиваться полного или частичного разворачивания (денатурации) белка и изучать указанные выше конформационные силы, в частности, их перераспределение с изменением условий растворения (Уверский В.Н., Птицын О.Б., 1996). Благодаря этому исследователи могут изучать свойства всех состояний белковых молекул, в том числе интермедиатов сворачивания, а также переходных состояний, определяющих высоту энергетического барьера между разными состояниями белка. Необходимо подчеркнуть, что для нормального функционирования белковой молекулы важно, чтобы уникальная пространственная структура белка была стабилизирована всем комплексом «конформационных сил». Даже частичное «выключение» одной из них неизбежно приведет к потере биологической активности (Уверский В.Н., Птицын О.Б., 1996).

Для оценки стабильности структуры белка принято пользоваться значением свободной энергии. Ее величина определяется энтальпией Н, характеризующей

энергию взаимодействия его атомов, и энтропией S, связанной с числом возможных конформаций главной цепи (S = RT ln (n), где R — молярная газовая постоянная, T- абсолютная температура, n - число возможных конформаций). Уравнение для расчета свободной энергии выглядит следующим образом: AG = AH -TAS (Кузнецова И.М. и др., 2005). молекулы белка

Для того чтобы осуществить переход из развернутого состояния с огромным числом возможных конформаций полипептидной цепи в нативное состояние со строго определенной конформацией, белку необходимо преодолеть так называемый свободно-энергетический барьер (Кузнецова И.М. и др., 2005). Этот барьер создан значительным увеличением свободной энергии белка на фоне уменьшения конформационной подвижности его основной цепи. Экспериментально показано, что ничем не осложненный процесс сворачивания (а именно когда нет изомеризации пролинов или реорганизации S-S мостиков и т.д.) происходит очень быстро при физиологических условиях, а, следовательно, барьер свободной энергии не очень высокий (Кузнецова И.М. и др., 2005).

Огромное разнообразие конформаций, которые может принимать полипептидная цепь, возникает благодаря практически неограниченному вращению вокруг связей N - Ca (угол ф) и Ca - C (угол у). Как же тогда белок успевает перебрать все возможные конформации и свернуться в свою нативную структуру за секунды? При этом нативная структура является самой стабильной из всех структур цепи, и белковая цепь сворачивается в нее в ходе разных процессов (сворачивание на рибосоме, ренатурация in vitro или транслокация через мембрану) (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002). Поиском ответа на этот вопрос в свое время заинтересовался Левинталь (Levinthal C., 1968). По его представлениям, для перебора всех возможных конформаций и выбора своей нативной структуры белку, содержащему 100 звеньев полипептидной цепи, потребовалось бы 10100 лет. Этот факт в литературе известен как «парадокс Левинталя». Левинталь предположил, что выбор нативной структуры белка определяет не термодинамика (т.е. не стабильность), а кинетика. Согласно его

предположению, нативная структура соответствует не глобальному минимуму свободной энергии цепи, а просто быстро достижимому (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002). В 1997 году удалось доказать, что к любой стабильной структуре белка всегда ведет достаточно быстрый путь сворачивания. Расчеты показали, что и энергетическая, и энтропийная составляющие свободной энергии переходного состояния пропорциональны не числу звеньев цепи N (как предполагал Левинталь), а N2/3 (Finkelstein A.V., Badretdinov A.Ya., 1997). Следовательно, время достижения стабильной структуры белковой цепи из 100150 аминокислотных остатков порядка нескольких секунд или минут (Finkelstein A.V., Badretdinov A.Ya., 1997; Финкельштейн А.В., Гарбузинский С.А., 2016). Для того чтобы ускорить процесс самоорганизации крупных белков, отдельные домены, из которых они состоят, способны самостоятельно сворачиваться. Это значит, что «единицей самоорганизации» является не целый белок, а его отдельный домен (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002).

Таким образом, и теория, и эксперимент подтверждают, что нативная структура белка характеризуется минимальным значением ее свободной энергии, а, точнее, минимальным значением свободной энергии системы белок-растворитель, которое достигается в результате образования гидрофобного ядра неполярными группами белка и освобождения молекул воды (Кузнецова И.М. и др., 2005). При этом значительно увеличивается энтропия растворителя (Кузнецова И.М. и др., 2005). Поиск такой уникальной нативной структуры среди всех возможных структур является основной целью сворачивания (самоорганизации) белка.

1.2 Пути самоорганизации (одностадийное и многостадийное сворачивание).

Активное изучение самоорганизации глобулярных белков породило спор среди ученых, касающийся основных стадий этого процесса. Было предложено несколько теорий сворачивания белка. Например, Филлипс (Phillips D.C., 1966) предположил, что сворачивание начинается с образования зародыша структуры на N-конце полипептидной цепи, а затем остальная цепь организуется вокруг него

(Phillips D.C., 1966; Барышникова Е.Н., 2005; Финкельштейн А.В., 2014). Однако, эта теория не нашла подтверждения в экспериментах, проведенных на небольшом белке, ингибиторе трипсина. Даже при замыкании в кольцо его последовательности или образовании нового N-конца в бывшей середине цепи исследуемый белок сохранял способность к самоорганизации (Goldenberg, D.P., Creighton, T.E., 1983; Барышникова Е.Н., 2005; Финкельштейн А.В., 2014).

Альтернативной точки зрения придерживался Болдуин. В 1972 году он выдвинул гипотезу (Tsong T.Y. et al., 1972), в которой постулировал существование механизма нуклеации и роста («nucleation-growth model») в процессе самоорганизации структуры белка. По его мнению, сначала происходит формирование ядра сворачивания (лимитирующий шаг), которое должно затем быстро расти, охватывая всю молекулу (Ptitsyn O.B., 1998). Ядро сворачивания формируется за счет образования нативных контактов между неполярными остатками боковых цепей, в его роли может быть участок а-спирали, образовавшийся на ранних стадиях процесса (Кузнецова И.М. и др., 2005). Согласно гипотезе Болдуина, белок сворачивается по принципу «все или ничего». Следовательно, каждая молекула белка должна переходить из развернутого в нативное состояние без образования каких-либо интермедиатов (промежуточных состояний) (Ptitsyn O.B., 1998; Балобанов В.А., 2010). В подтверждение этой гипотезы для ряда небольших глобулярных белков было установлено, что процесс их равновесного разворачивания сильными денатурантами, такими как гуанидингидрохлорид и мочевина, можно описать моделью двух состояний — нативного и полностью развернутого (Jackson S.E., and Fersht A.R., 1991; Fersht A.R., 1997). Активным сторонником этой теории был П.Л. Привалов. Он экспериментально показал, что денатурация белка является переходом типа «все или ничего». Следовательно, это внутримолекулярный аналог фазового перехода первого рода (Privalov P.L., 1979; Privalov P.L., 1982). Компьютерные эксперименты, проведенные Е.И. Шахновичем и А.М. Гутиным, также указывали на сходство кинетики самоорганизации белковых структур и фазовых переходов

первого рода (Gutin A.M. et al., 1996; Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002).

16

В 1973 году О.Б. Птицын (Птицын О.Б., 1973) предложил идею стадийного сворачивания белка («каркасная модель» - «framework model»). Согласно этой модели, различные типы взаимодействий последовательно вовлекаются в процесс формирования структуры белка. При этом зародышевые а-спирали и Р-шпильки, образующиеся на ранних этапах сворачивания, слипаются вместе с образованием глобулы, которая на этом этапе лишь отдаленно напоминает нативную. На последних этапах происходит окончательная достройка нативной структуры белка - самый медленный шаг самоорганизации (Финкельштейн А.В., 2014). Другими словами, в процессе самоорганизации молекулы белка происходит последовательное образование ряда промежуточных состояний, степень упорядоченности которых постепенно возрастает (Ptitsyn O.B., 1998).

В основе гипотезы О.Б. Птицына была «нативоподобная» глобула, позже получившая название «расплавленная глобула» («molten globule»). Эксперименты, проводимые в его лаборатории, показали наличие у значительного числа малых глобулярных белков третьего термодинамического состояния молекулы (помимо нативного и полностью развернутого). Оно было отделено от нативного и развернутого состояний переходами типа «все-или-ничего», и его можно было наблюдать в процессе равновесного разворачивания белков сильными денатурантами (Ptitsyn O.B., 1995). Впоследствии состояние расплавленной глобулы было признано учеными универсальным равновесным, а также кинетическим интермедиатом всех белковых молекул (Финкельштейн А.В., 2014).

В целом «расплавленная глобула» имеет ряд характерных признаков: она компактна, содержит достаточно много вторичной структуры, но ее боковые группы не упорядочены (А.В. Финкельштейн и др., 2005; Dolgikh et al., 1981; Ptitsyn, 1995; Уверский В.Н. и др., 1993). Также она характеризуется отсутствием кооперативного температурного плавления и быстрыми внутримолекулярными движениями (Финкельштейн А.В. и др., 2005). Для образования «расплавленной глобулы» достаточно миллисекунд (например, Samatova et al., 2010).

С одной стороны, существование кинетического интермедиата означает, что сворачивание не является процессом типа «все или ничего». С другой стороны, рассуждая над проблемой сосуществования этих двух гипотез, О.Б. Птицын показал, что обе они верны для некоторых классов белков (РЙБуп О.В., 1998). Он выделял два типа барьеров на пути сворачивания белков: «барьеры сворачивания» между развернутым и промежуточным состояниями и «барьеры улучшения» между промежуточным и нативным состояниями. При этом он подчеркнул, что образование элементов вторичной структуры, формирование глобулы, укладка боковых групп и т.д. происходят очень быстро и не могут быть причиной высоких свободно-энергетических барьеров. Это и позволило ему предположить, что механизм нуклеации и роста может быть применим также и к случаю, когда сворачивание идет через образование промежуточного состояния, где он может относиться к переходу между развернутым и промежуточным состояниями. Второй же барьер («барьер улучшения»), даже если он высокий, является необязательным и может быть удален посредством небольших изменений аминокислотной последовательности белка или условий эксперимента. Кроме того, образованию промежуточного состояния типа расплавленной глобулы обычно предшествует формирование еще одного промежуточного состояния (быстрее миллисекунд), характеризующегося наличием элементов вторичной структуры, но отсутствием гидрофобного ядра («предшественник» расплавленной глобулы). Данное состояние он представлял себе как форму, в которой развернутая цепь накапливается перед прыжком через «барьер сворачивания», а саму стадию его образования - как безбарьерный процесс диффузной природы. Это промежуточное состояние было также обнаружено в равновесных экспериментах (РЙБуп О.В., 1998).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мажорина Мария Анатольевна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балобанов, В.А. Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм: диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук: 03.01.02 / Балобанов Виталий Александрович. -Пущино - Москва, 2010.- 96 с.

2. Барышникова, Е.Н. Изучение кинетики сворачивания/разворачивания апомиоглобина / Е.Н. Барышникова, Б.С. Мельник, Г.В. Семисотнов, В.Е. Бычкова // Молекулярная биология. - 2005. - Т. 39. - №6. - С. 1008-1016.

3. Барышникова, Е.Н. Исследование ядра сворачивания апомиоглобина: диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук: 03.00.02 / Барышникова Екатерина Николаевна.- Пущино, 2005. - 112 с.

4. Барышникова, Е.Н. Равновесное разворачивание мутантных форм апомиоглобина с заменами консервативных нефункциональных остатков на аланин / Е.Н. Барышникова, В.А. Балобанов, Н.С. Катина, Б.С. Мельник, Д.А. Долгих, Г.В. Семисотнов, В.Е. Бычкова // Молекулярная биология. - 2007. - Т. 41. - № 4. - С. 674-678.

5. Барышникова (Саматова), Е.Н. О роли некоторых консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков в переходном состоянии и в интермедиате сворачивания апомиоглобина / Е.Н. Барышникова (Саматова), Б.С. Мельник, В.А. Балобанов, Н.С. Катина, А.В. Финкельштейн, Г.В. Семисотнов, В.Е Бычкова // Молекулярная биология. - 2009. - Т.43. - № 1. - С. 136-147.

6. Векшин, Н.Л. Фотоника биологических структур / Н.Л. Векшин. - Пущино: НЦБИ, 1988. - 163 с.

7. Волькенштейн, М.В. Биофизика: учебное руководство / М.В. Волькенштейн. - 2-е изд., - М.: Наука, 1988. - 592 с.

8. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. - М.: «Мир», 1988. - 538 с.

9. Кантор, Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, П. Шиммел. - М.: Мир, 1984. - 2 т.

10. Катина, Н.С. Амилоидная агрегация апомиоглобина и его мутантных форм: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.01.03 / Катина Наталья Сергеевна. - Пущино, 2016. - 134 с.

11. Катина, Н.С. Структурные особенности и стабильность промежуточных состояний карбоксиангидразы / Н.С.Катина, В.А. Балобанов, Н.Б. Ильина, Н.Ю. Маркелова, И.А. Кашпаров, В.В. Марченков // Актуальные вопросы биологической физики и химии. - 2018. - Т.3. - № 3. - С. 642-650.

12. Котова, Н.В. Сворачивание глобулярных белков in vivo / Н.В. Котова, Г.В. Семисотнов // Успехи биологической химии. - 1998. - Т. 38. - С. 199-223.

13. Кузнецова, И.М. Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков / И.М. Кузнецова, В. Форже, К.К. Туроверов // Цитология. - 2005. - № 11. - С. 943-952.

14. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович. - М.: Мир, 1986. - 496 с.

15. Мажорина, М.А. Влияние аминокислотных замен на поверхности апомиоглобина на энергетический профиль белка / М.А. Мажорина, К.А. Глухова, В.В. Марченков, Б.С. Мельник // Молекулярная биология. - 2018. - Т.52. - № 1. -C. 62-72.

16. Мажорина, М.А. Исследование влияния гибкости основной цепи белка на энергетический профиль апомиоглобина / М.А. Мажорина, Б.С. Мельник // Актуальные вопросы биологической физики и химии. - 2018. - Т.3. - № 1. - C. 3438.

17. Мельник, Б.С. Исследование многостадийно сворачивающихся глобулярных белков: диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук: 03.01.02 / Мельник Богдан Степанович. - Пущино, 2015. -217 с.

18. Мельникова, Д.Л. Трансляционная подвижность и особенности надмолекулярной организации белков с внутренней неупорядоченной структурой на примере а- и к- казеинов: диссертация на соискание ученой степени кандидата

физико-математических наук: 01.04.07 / Мельникова Дарья Леонидовна. - Казань, 2019. - 167 с.

19. Михайлина, А.О. Регуляторные свойства бактериальных и архейных рибосомных белков L1 и L4: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.01.03 / Михайлина Алиса Олеговна. - Пущино, 2020. - 149 с.

20. Нагибина, Г.С. Метод стабилизации структуры белков, основанный на определении и закреплении их «ослабленных» участков: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.01.02 / Нагибина Галина Сергеевна. - Пущино, 2020. - 118 с.

21. Нагибина, Г.С. Проверка подхода к созданию стабильных форм белков, основанного на предсказании нативно-развернутых участков, на примере рибосомных белков Ь1 / Г.С. Нагибина, В.В. Марченков, К.А. Глухова, Т.Н. Мельник, Б.С. Мельник // Биохимия. - 2020. -Т.85. - №1. - С. 104-115.

22. Пермяков, Е.А. Метод собственной люминисценции белка / Е.А. Пермяков. - М.: Наука, 2003. - 188 с.

23. Поварницына, Т.В. Определение последовательности разрушения элементов структуры зеленого флуоресцентного белка при его тепловой денатурации: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.01.03 / Поварницына Татьяна Владимировна.- Пущино, 2013.- 110 с.

24. Птицын, О.Б. Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул / О.Б. Птицын // Докл. Акад. Наук СССР. - 1973. - Т. 210. - С. 1213-1215.

25. Пфайл, В. Стабильность и кооперативные свойства частично свернутых белков / В. Пфайл // Биохимия. - 1998. - Т. 63. - № 3. - С. 349-359;

26. Рубин, А.Б. БИОФИЗИКА: В 2т. Т.1: Теоретическая биофизика: учебник.-3-е изд. / А.Б. Рубин. - М.: Изд-во МГУ; изд-во «Наука», 2004. - 448 с.

27. Сарских, А.В. Структура полноразмерного Ы-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 ^егтш ШегторЫ!ш с РНК на его РНК-связывающие свойства: диссертация на

соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.01.03 / Сарских Алена Витальевна.- Пущино, 2014. - 117 с.

28. Сурин, А.К. Мономерная форма молекулярного шапе-рона ОгоБЬ: структура, стабильность и олигомеризация / А.К. Сурин, Н.В. Котова, С.Ю. Марченкова, В.В. Марченков, Г.В. Семисотнов // Биоорган. Химия. - 1999. - Т. 25. - №5. - С. 358-364.

29. Уилсон, К. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии / ред. К.Уилсон, Дж. Уолкер. - пер. с англ. - 2-е изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. - 848 с.

30. Уилсон, К., Уолкер Дж. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии / ред. К.Уилсон, Дж. Уолкер. - пер. с англ. - 3-е изд. - М.: Лаборатория знаний, 2020. - 855 с.

31. Уверский, В.Н. Разворачивание расплавленной глобулы сильными денатурантами протекает по принципу "все-или-ничего" / В.Н. Уверский, Г.В. Семисотнов, О.Б. Птицын // Биофизика. - 1993. - Т. 38. - С. 37-46.

32. Уверский, В.Н. Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков сильными денатурантами: I. Карбоангидраза В / В.Н. Уверский, О.Б. Птицын // Молекулярная биология. - 1996. - Т.30. - № 5. - С. 11241134.

33. Уверский, В.Н. Влияние природных лигандов на структурные свойства и конформационную стабильность белков (Обзор) / В.Н. Уверский, Н.В. Нарижнева // Биохимия. - 1998. - Т. 63. - № 4. - С. 500-515.

34. Уверский, В.Н. Разнообразие компактных форм денатурированных белков: диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук: 03.00.02 / Уверский Владимир Николаевич.- Пущино, 1998.- 410 с.

35. Финкельштейн, А.В. Физика белка / А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын. - М.: Книжный дом «Университет», 2002. - 376 с.

36. Финкельштейн, А.В. Предсказание скоростей и ядер сворачивания глобулярных белков на основе теории их самоорганизации / А.В. Финкельштейн,

Д.Н. Иванков, О.В. Галзитская // Успехи биологической химии. - 2005. - Т. 45. - С. 3-36.

37. Финкельштейн, А.В. Физика белка / А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын. -КДУ, 2012. - 524 с.

38. Финкельштейн, А.В. Физика белковых молекул / А.В. Финкельштейн. -Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2014. - 424 с.

39. Финкельштейн, А.В. Решение парадокса Левинталя возможно на уровне формирования и упаковки вторичных структур белков / А.В. Финкельштейн, С.А. Гарбузинский // Биофизика. - 2016. - Т. 61. - № 1. - С. 5-10.

40. Финкельштейн, А.В. 50+ лет самоорганизации белков / А.В. Финкельштейн // Успехи биологической химии. - 2018. - Т. 58. - С. 7-40.

41. Эйткен Э. и др. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии / ред. К. Уилсон, Дж. Уокер. - пер. с англ. Т. П. Мосоловой и Е. Ю. Бозелек-Решетняк.; под ред. А. В. Левашова, В. И. Тишкова. - 2-е изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. - 848 с.

42. Anfinsen, C.B. The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain / C.B. Anfinsen, E. Haber, M. Sela, F.H., Jr. White // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1961. - V. 47. - № 9. - Р. 1309-1314.

43. Aoto, P.C. Probing the non-native H helix translocation in apomyoglobin folding intermediates / P.C. Aoto, C. Nishimura, H.J. Dyson, P.E. Wright // Biochemistry. -2014. - V.53. - № 23. - P. 767-780.

44. Balasco, N. Role of loops connecting secondary structure elements in the stabilization of proteins isolated from thermophilic organisms / N. Balasco, L. Esposito, A. De Simone, L. Vitagliano // Protein Sci. - 2013. - V. 22. - № 7. - P. 1016-1023.

45. Baldwin, R.L. On-pathway versus off-pathway folding intermediates / R.L. Baldwin // Fold Des. - 1996. - V.1. - № 1. - P. 1-8.

46. Baryshnikova, E.N. Three-state protein folding: Experimental determination of free-energy profile / E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov, V.E. Bychkova //Protein Sci.. - 2005. - V. 14. - Р. 2658-2667.

47. Bogatyreva, N.S. Cunning simplicity of protein folding landscapes / N.S. Bogatyreva, A.V. Finkelstein // Protein Eng. - 2001. - V. 14. - № 8. - P. 521-523.

48. Chen, Y.H. Determination of the Helix and Beta Form of Proteins in Aqueous Solution by Circular Dichroism / Y. H. Chen, J.T. Yang, K.H. Chau // Biochemistry. -1974. - V. 13. - № 16. - P. 3350-3359.

49. Chow, C. Structural characterization of apomyoglobin self-associated species in aqueous buffer and urea solution / C. Chow, N. Kurt, R.M. Murphy, S. Cavagnero // Biophys J. - 2006. - V.90. - № 1. - P. 298-309.

50. Clarke, J. Engineered disulfide bonds as probes of the folding pathway of barnase: increasing the stability of proteins against the rate of denaturation / J. Clarke, A.R. Fersht // Biochemistry. - 1993. V.32. - № 16. - P. 4322-4329.

51. De Young, L.R. Aggregation and denaturation of apomyoglobin in aqueous urea solutions / L.R. De Young, K.A. Dill, A.L. Fink // Biochemistry. - 1993. - V. 32. - № 15. - P. 3877-3886.

52. Dill, K.A. From Levinthal to pathways to funnels / K.A. Dill, H.S. Chan // Nature Struct. Biol. - 1997. - V. 4. - № 1. - P.10-19.

53. Dinner, A.R. Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment / A.R. Dinner, A. Sali, L.J. Smith, C.M. Dobson, M. Karplus // Trends Biochem. Sci. - 2000. - V. 25. - № 7. - P. 331-339.

54. Dolgikh, D.A. Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? / D.A. Dolgikh, R.I. Gilmanshin, E.V. Brazhnikov, V.E. Bychkova, G.V. Semisotnov, S.Yu. Venyaminov, O.B. Ptitsyn // FEBS Lett. - 1981. - V. 136. - № 2. -P. 311-315.

55. Dombkowski, A.A. Protein disulfide engineering / A.A. Dombkowski, K.Z. Sultana, D.B. Craig // FEBS Lett. - 2014. - V. 588. - № 2. - P. 206-212.

56. Dosztanyi, Z. The Pairwise Energy Content Estimated from Amino Acid Composition Discriminates between Folded and Intrinsically Unstructured Proteins / Z. Dosztanyi, V. Csizmok, P. Tompa, I. Simon // J. Mol. Biol. - 2005. - V. 347. - № 4. -P. 827-839.

57. Eliezer, D. Is apomyoglobin a molten globule? Structural characterization by NMR / D. Eliezer, P.E. Wright // J. Mol. Biol. - 1996. - V. 263. - № 4. - P. 531-538.

58. Ermolenko, D.N. Noncharged amino acid residues at the solvent exposed positions in the middle and at the C terminus of the a-helix have the same helical propensity / D.N. Ermolenko, J.M. Richardson, G.I. Makhatadze // Protein Science. -2003. - V. 12. - № 6. - P. 1169-1176.

59. Fass D. Disulfide bonding in protein biophysics / D. Fass Annu // Rev. Biophys. -2012. - V.41. - P. 63-79.

60. Fass, D. Enzymology of Disulfide Cross-Linking in Proteins / D. Fass, C. Thorpe // Chemistry. Chem Rev. - 2018. - V. 118. - № 3. - P. 1169-1198.

61. Fersht, A.R. The folding of an enzyme. 1. Theory of protein engineering analysis and pathway of protein folding / A.R. Fersht, A. Matouschek, L. Serrano // J. Mol. Biol.

- 1992. - V. 224. - № 3. P. 771-782.

62. Fersht, A.R. Nucleation mechanisms in protein folding / A.R. Fersht // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997. - V. 7. - № 1. - P. 3-9.

63. Fersht, A.R. Structure and mechanism in protein science: A guide to enzyme catalysis and protein folding. Ch. 15, 18, 19 / A.R. Fersht. - N.Y.: W.H. Freeman & Co, 1999.

64. Fersht, A.R. Protein folding and unfolding at atomic resolution / A.R. Fersht, V. Dagget // Cell. - 2002. - V. 108. - № 4. - P. 1-20.

65. Fersht, A.R. O-Value analysis and the nature of protein-folding transition states / A.R. Fersht, S. Sato // Proc. Natl. Acad. - 2004. - V. 101. - № 21. - P. 7976-7981.

66. Fink, A.I. Chaperone-Mediated Protein Folding / A.I. Fink // Physiol.Rev. - 1999.

- V. 79. - № 2. - P. 425-449.

67. Finkelstein, A.V. Rate of protein folding near the point of thermodynamic equilibrium between the coil and the most stable chain fold / A.V. Finkelstein, A. Ya. Badretdinov // Fold. Design. - 1997. - V. 2. - № 2. - P. 115-121.

68. Foit, L. Chaperone activation by unfolding / L. Foit, J.S. George, B.W. Zhang, C.L. Brooks, and J.C.A. Bardwell // PNAS. - 2013. - V. 110. - № 14. - P. 1254-1262.

69. Frare, E. Chemical synthesis of the RGD-protein decorsin: Pro-Ala replacement reduces protein thermostability / E. Frare, P. Polverino de Laureto, E. Scaramella, F. Tonello, O. Marin, R. Deana and A. Fontana // Protein Engineering, Design and Selection. - 2005. - V. 18. - № 10. - P. 487-495.

70. Fukamizo, T. A flexible loop controlling the enzymatic activity and specificity in a glycosyl hydrolase family 19 endochitinase from barley seeds (Hordeum vulgare L.) / T. Fukamizo, R. Miyake, A. Tamura, T. Ohnuma, K. Skriver, N.V. Pursiainen, A.H. Juffer // Biochim Biophys Acta. - 2009. - V. 1794. - № 8. - P. 1159-1167.

71. Garcia, C. Changes in the apomyoglobin pathway caused by mutation in the distal histidine residue / C. Garcia, Ch. Nishimura, S. Cavagnero, H.J. Dyson, P.E. Wright // Biochemistry. - 2000. - V. 39. - № 37. - P. 11227-11237.

72. Gast, K. Compactness of protein molten globules: temperature-induced structural changes of the apomyoglobin folding intermediate / K. Gast, H. Damaschun, R. Misselwitz, M. Muller-Frohne, D. Zirwer, G. Damaschun // Eur. Biophys. J. - 1994. - V. 23. - № 4. - P. 297-305.

73. Gavrilov, Y. Shortening a loop can increase protein native state entropy / Y. Gavrilov, S. Dagan, Y. Levy // Proteins. - 2015. - V. 83. - № 12. - P. 2137-2146.

74. Gidalevitz, T. Orchestration of secretory protein folding by ER chaperones / T. Gidalevitz, F. Stevens, Y. Argon // Biochim Biophys Acta - 2013. - V. 1833. - № 11. -P. 2410-24.

75. Gilbert, H.F. Protein chaperones and protein folding / H.F. Gilbert // Curr. Opin. Biotechnol. - 1994. - V. 5. - № 5. - P. 534-539.

76. Goldenberg, D.P. Circular and circularly permuted forms of bovine pancreatic trypsin inhibitor / D.P. Goldenberg, T.E. Creighton // J. Mol. Biol. - 1983. - V. 165. - № 2. - P. 407-413.

77. Griko, Y.V. Thermodynamic study of the apomyoglobin structure / Y.V. Griko, P.L. Privalov, S.Y. Venyaminov, V.P. Kutyshenko // J. Mol. Biol. - 1988. - V. 202. - № 1. - P. 127-138.

78. Gutin, A.M. Chain Length Scaling of Protein Folding Time / A.M. Gutin, V.I. Abkevich, and E.I. Shakhnovich // Phys. Rev. Lett. - 1996. - V. 77. - № 27. - P. 54335436.

79. Guzman-Luna, V. The effect of specific proline residues on the kinetic stability of the triosephosphate isomerases of two trypanosomes. Proteins / V. Guzman-Luna, A.G. Quezada, A.J. Diaz-Salazar // Proteins. - 2017. - V. 85. - P. 571-579.

80. Hargrove, M.S. Stability of myoglobin: a model for the folding of heme proteins / M.S. Hargrove, S. Krzywda, A.J. Wilkinson, Y. Dou, M. Ikeda-Saito, J.S. Olson // Biochemistry. - 1994. - V. 33. - № 39. - P. 11767-11775.

81. Hartl, F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding / F.U. Hartl, J. Martin // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1995. - V.5. - № 1. - P. 92-102.

82. Jackson, S.E. Folding of chymotrypsin inhibitor 2. Evidence for a two-state transition / S.E. Jackson, Fersht A.R. // Biochemistry. - 1991. - V. 30. - № 43. - P. 10428-10435.

83. Jackson, S.E. How do small single-domain proteins fold? / S.E. Jackson // Fold Des. - 1998. - V. 3. - № 4. - P. 81-91.

84. Jennings, P.A. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin / P.A. Jennings, P.E. Wright // Science. - 1993. - V. 262. - № 5135. - P. 892-896.

85. Jennings, P.A. Overexpression of myoglobin and assignment of its amide, C alpha and C beta resonances / P.A. Jennings, M.J. Stone, P.E. Wright // J Biomol NMR. - 1995. - V. 6. - № 3. - P. 271-276.

86. Katina, N.S. sw ApoMb Amyloid Aggregation under Nondenaturing Conditions: The Role of Native Structure Stability / N.S. Katina, V.A. Balobanov, N.B. Ilyina, V.D. Vasiliev, V.V. Marchenkov, A.S. Glukhov, A.D. Nikulin, V.E. Bychkova // Biophys J. -2017. - V. 113. - № 5. - P. 991-1000.

87. Kelly, S.M. How to study proteins by circular dichroism / S.M Kelly, T.J. Jess, N.C. Price // Biochim Biophys Acta. - 2005. - V. 1751. - № 2. - P. 119-139.

88. Kragelund, B.B. Folding of a four-helix bundle: studies of acyl-coenzyme A binding protein / B.B. Kragelund, C.V. Robinson, J. Knudsen, C.M. Dobson, F.M. Poulsen // Biochemistry. - 1995. - V. 34. - № 21. - P. 7217-7224.

89. Kuwajima, K. Protein folding in vitro / K. Kuwajima // Curr. Opin. Biotechnol.

- 1992. - V.3. - № 5. - P. 462-467.

90. Ladurner, A.G. Glutamine, Alanine or Glycine Repeats Inserted into the Loop of a Protein Have Minimal Effects on Stability and Folding Rates / A.G. Ladurner, A.R. Fersht // J. Mol. Biol. - 1997. - V. 273. - № 1. - P. 330-337.

91. Levinthal, C. Are there pathways for protein folding? / C. Levinthal // J. Chem. Phys. - 1968. - V. 65. - № 1. - P. 44-45.

92. Lobanov, M.Y. The Ising Model for Prediction of Disordered Residues from Protein Sequence Alone / M.Y. Lobanov, O.V Galzitskaya // Phys. boil. - 2011. - V. 8.

- № 3. - P. 1 - 10.

93. Majorina, M.A. Loops linking secondary structure elements affect the stability of the molten globule intermediate state of apomyoglobin / M.A. Majorina, V.A. Balobanov, V.N. Uversky, B.S. Melnik // FEBS Lett. - 2020. - V.594. - № 20. - P. 3293-3304.

94. Marchenko, N.Yu. Molecular chaperones under normal and pathological conditions / N.Yu. Marchenko, S.O. Garbuzynskiy, G.V. Semisotnov // In: Molecular Pathology of Proteins (ed. D.I. Zolobotny). - Nova Science Publishers: N.Y. - 2009. -P. 57-89.

95. Marchenkov, V.V. GroEL-assisted protein folding: Does it occur within the chaperonin inner cavity? / V.V. Marchenkov, G.V. Semisotnov // Int. J. Mol. Sci. -2009. - V.10. - P. 2066-2083.

96. Matouschek, A. Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering / A. Matouschek, , J.T. Kellis Jr., L. Serrano and A.R. Fersht // Nature. - 1989. - V. 340. - P. 122-126.

97. Matouschek, A. Transient folding intermediates characterized by protein engineering / A. Matouschek, , J.T. Kellis Jr., L. Serrano and A.R. Fersht // Nature. -1990. - V. 346. - № 6283. - P. 440-445.

98. Matsumura, M. Stabilization of phage T4 lysozyme by engineered disulfide bonds / M. Matsumura, W.J. Becktel, M. Levitt, B.W. Matthews // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1989. - V. 86. - № 17. - P. 6562-6566.

99. Melnik, T.N. Independent of Their Localization in Protein the Hydrophobic Amino Acid Residues Have No Effect on the Molten Globule State of Apomyoglobin and the Disulfide Bond on the Surface of Apomyoglobin Stabilizes This Intermediate State / T.N. Melnik, M.A. Majorina, D.S. Larina, I.A. Kashparov, E.N. Samatova, A.S. Glukhov, B.S. Melnik // Plos.one. - 2014. - V. 9. - № 6. - P. 1-11.

100. Nagi, A.D. An inverse correlation between loop length and stability in a four-helix-bundle protein / A.D. Nagi, L. Regan // Folding & Design. - 1997. - V. 2. - № 1. -P. 67-75.

101. Nakamura, H. A Novel Engineered Interchain Disulfide Bond in the Constant Region Enhances the Thermostability of Adalimumab Fab / H. Nakamura, N. Oda-Ueda, T. Ueda, T. Ohkuri // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2018. - V. 495. - № 1.

- P. 7 - 11.

102. Nazari, M. Step-Wise Addition of Disulfide Bridge in Firefly Luciferase Controls Color Shift through a Flexible Loop: A Thermodynamic Perspective / M. Nazari, S. Hosseinkhani, L. Hassani // Photochem Photobiol Sci. - 2013. - V. 12. - № 2. - P. 298

- 308.

103. Nazari, M. Design of Disulfide Bridge as an Alternative Mechanism for Color Shift in Firefly Luciferase and Development of Secreted Luciferase / M. Nazari, S. Hosseinkhani // Photochem Photobiol Sci. - 2011. - V. 10. - № 7. - P. 1203 - 1215.

104. Nikitina, J. Importance of a single disulfide bond for the PsbO protein of photosystem II: protein structure stability and soluble overexpression in Escherichia coli / J. Nikitina, T. Shutova, B. Melnik, S. Chernyshov, V. Marchenkov, G. Semisotnov, V. Klimov, G. Samuelsson // Photosynth Res. - 2008. - V. 98. - № 1-3. - P. 391-403.

105. Nishimura, C. Identification of native and non-native structure in kinetic folding intermediates of apomyoglobin / C. Nishimura, H.J. Dyson, P.E. Wright // J. Mol. Biol.

- 2006. - V. 355. - № 1. - P. 139-156.

106. Oda, M. Increased thermodynamic stability by hydrophilic amino acid substitutions on the surface of Streptomyces subtilisin inhibitor / M. Oda, K. Kanaori, K. Akasaka // J. Biol. Macromol. - 2007(1). - V. 7. - P. 3-8.

107. Otzen, D.E. Structural changes in the transition state of protein folding: alternative interpretations of curved chevron plots / D.E. Otzen, O. Kristensen, M. Proctor, M. Oliveberg // Biochemistry. - 1999. - V. 38. - № 20. - P. 6499-6511.

108. Pace, C.N. Conformational stability and activity of ribonuclease T1 with zero, one, and two intact disulfide bonds / C.N. Pace, G.R. Grimsley, J.A. Thomson, B.J. Barnett // J Biol Chem. - 1988. - V. 263. - № 24. - P. 11820-11825.

109. Pakula, A.A. Reverse hydrophobic effects relieved by amino-acid substitutions at a protein surface / A.A. Pakula, R.T. Sauer // Nature. - 1990. - V. 344. - № 6264. - P. 363-364.

110. Pande, V.S. Pathways for protein folding. / V.S. Pande, A.Yu. Grosberg, T. Tanaka, D.S. Rokhasar // Cur. Opin. Struc. Biol. - 1998. - V .8. - № 1. - P. 68-79.

111. Permyakov, S.E. How to improve nature: study of the electrostatic properties of the surface of a-lactalbumin / S.E. Permyakov, G.I. Makhatadze, R. Owenius, V.N. Uversky, C.L. Brooks, E.A. Permyakov, L.J. Berliner // Protein Engineering, Design and Selection. - 2005. - V. 18. - № 9. - P. 425-433.

112. Perry, L.J. Disulfide bond engineered into T4 lysozyme: stabilization of the protein toward thermal inactivation / L.J. Perry, R. Wetzel // Science. - 1984. - V. 226.

- № 4674. - P. 555-557.

113. Petersen, M.T. Amino acid neighbours and detailed conformational analysis of cysteines in proteins / M.T. Petersen, P.H. Jonson, S.B. Petersen // Protein Eng. - 1999.

- V. 12. - № 7. - P. 535-548.

114. Phillips, D.C. The three-dimensional structure of an enzyme molecule // Scientific American. - 1966. - V. 215. - P. 78-90.

115. Plotkin, S.S. Understanding protein folding with energy landscape theory. I. Basic concepts / S.S. Plotkin, J.N. Onuchic // Quart. Rev. Biophys. - 2002. - V. 35. - № 2. - P. 111-167.

116. Privalov, P.L. Stability of proteins. Small globular proteins / P.L. Privalov // Adv. Prot. Chem. - 1979. - V. 33. - P. 167-241.

117. Privalov, P.L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system (Review) / P.L. Privalov // Adv. Prot. Chem. - 1982. - V. 35. - P. 1104.

118. Ptitsyn, O.B. Molten globule and protein folding / O.B. Ptitsyn // Adv. Protein Chem. - 1995. - V .47. - P. 83-229.

119. Ptitsyn, O.B. Protein folding: nucleation and compact intermediates / O.B. Ptitsyn // Biochemistry (Mosc). - 1998. - V. 63. - № 4. - P. 367-73.

120. Ramakrishnan, V. Geofold: Topology-Based Ptotein Unfolding Pathways Capture The Effects of Engineered Disulfides on Kinetic Stability / V. Ramakrishnan, S.P. Srinivasan, S.M. Salem, S.J. Matthews, W. Colon, M. Zaki, C. Bystroff // Proteins. - 2013. - V. 80. - № 3. - P. 920-934.

121. Rollins, G.C. General mechanism of two-state protein folding kinetics / G.C. Rollins, K.A. Dill // J Am Chem Soc. - 2014. - V. 136. - № 32. - P. 11420-11427.

122. Ryabova, N.A. Molecular chaperone GroEL/ES: unfolding and refolding processes / N.A. Ryabova, V.V. Marchenkov, S.Y. Marchenkova, N.V. Kotova, G.V. Semisotnov // Biochemistry (Mosc). - 2013. V. 78. - № 13. - P. 1405-1414.

123. Saha, R. A functional loop spanning distant domains of glutaminyl-tRNA synthetase also stabilizes a molten globule state // R. Saha, S. Dasgupta, R. Banerjee, A. Mitra-Bhattacharyya, D. Söll, G. Basu, S. Roy // Biochemistry. - 2012. - V. 51. - № 22. - P. 4429-4437.

124. Samatova, E.N. Finkelstein A.V. How strong are side chain interactions in the folding intermediate? / E.N. Samatova, N.S. Katina, V.A. Balobanov, B.S. Melnik, D.A. Dolgikh, V.E. Bychkova // Protein Sci. - 2009. - V. 18. - № 10. - P. 2152-2159.

125. Samatova, E.N. Folding intermediate and folding nucleus for I-->N and U-->I-->N transitions in apomyoglobin: contributions by conserved and nonconserved residues / E.N. Samatova, B.S. Melnik, V.A. Balobanov, N.S. Katina, D.A. Dolgikh, G.V. Semisotnov, A.V. Finkelstein, V.E. Bychkova // Biophys J. - 2010. - V. 98. - № 8. - P. 1694-1702.

126. Sandberg, A. Stabilization of Neurotoxic Alzheimer Amyloid - Oligomers by Protein Engineering / A. Sandberg, L.M. Lucheshi, S. Sollvander, T. Hard et al. // PNAS. - 2010. - V. 107. - № 35. - P. 1-10.

127. Schweiker, K.L. Computational design of the Fyn SH3 domain with increased stability through optimization of surface charge-charge interaction / K.L. Schweiker, A. Zarrine-Afsar, A.R. Davidson, G.I. Makhatadze // Protein Science. - 2007. - V. 16. - № 12. - P. 2694-2702.

128. Schweiker, K.L. A computational Approach for the Rational Design of Stable Proteins and Enzymes: Optimization of Surface Charge-Charge Interactions / K.L. Schweiker, G.I. Makhatadze // Methods in Enzymology. - 2009. - V. 454. - P. 175-211.

129. Shen, Y. Structures of Human Insulin-Degrading Enzyme Reveal a New Substrate Recognition Mechanism / Y. Shen, A. Joachimiak, M.R. Rosner, W. Tang // Nature. -2006. - V. 443. - № 7113. - P. 870-874.

130. Siadat, O.R. The effect of engineered disulfide bonds on the stability of Drosophila melanogaster acetylcholinesterase / O.R. Siadat, A. Lougarre, L. Lamouroux, C. Ladurantie, D. Fournier // BMC Biochem. - 2006. - V. 7. - № 12. - P. 1-7.

131. Spagnolo, L. Folding specificity induced by loop stiffness / L. Spagnolo, S. Ventura, L. Serrano // Protein Sci. - 2003. - V. 12. - № 7. - P. 1473-1482.

132. Stepanenko, O.V. Ligand-binding proteins: structure, stability and practical application / O.V. Stepanenko, A.V. Fonin, I.M. Kuznetsova, K.K. Turoverov // Protein structure. - 2012. - V. 12. - P. 265-290.

133. Strub, C. Mutation of exposed hydrophobic amino acids to arginine to increase protein stability / C. Strub, C. Alies, A. Lougarre, C. Ladurantie, J. Czaplicki, D. Fournier // Biochemistry. - 2004. - V.5. - № 9. - P. 1471-2091.

134. Tanford, C. Protein denaturation / C. Tanford // Adv. Protein Chem. - 1968. - V. 23. - P. 121-282.

135. Tisi, L.C. Concerved structural features on protein surfaces: small exterior hydrophobic clusters / L.C. Tisi, P.A. Evans // J.Mol.Biol. - 1995. - V. 249. - № 2. - P. 251-258.

136. Thornton, J.M. Disulphide bridges in globular proteins / J.M. Thornton // J Mol Biol. - 1981. - V. 151. - № 2. - P. 261-287.

137. Tsong, T.Y. A sequential model of nucleation-dependent protein folding kinetic studies of ribonuclease A. / T.Y. Tsong, R.L. Baldwin, P.A. McPhie // J. Mol. Biol. -1972. - V. 63. - № 3. - P. 453-469.

138. Uversky, V.N. All-or-none solvent-induced transitions between native, molten globule and unfolded states in globular proteins / V.N. Uversky, O.B. Ptitsyn // Folding & Design. - 1996. - V. 1. - № 2. - P. 117-122.

139. Vogl, T. Mechanism of protein stabilization by disulfide bridges: calorimetric unfolding studies on disulfide-deficient mutants of the alpha-amylase inhibitor tendamistat / T. Vogl, R. Brengelmann, H.J. Hinz, M. Scharf, M. Lotzbeyer, J.W. Engels // J Mol Biol. - 1995. - V. 254. - № 3. - P. 481-96.

140. Wetzel, R. Disulfide Bonds and Thermal Stability in T4 Lysozyme / R. Wetzel, L.J. Perry, W. Baase, W.J. Becktel // PNAS. - 1988. - V. 85. - № 2. - P. 401-405.

141. Weathers, E.A. Reduced amino acid alphabet is sufficient to accurately recognize intrinsically disordered protein / E.A. Weathers, M.E. Paulaitis, T.B. Woolf, J.H. Hoh // FEBS Lett. - 2004. - V. 576. - № 3. - P. 348-352.

142. Wright, C.F. The importance of loop length in the folding of an immunoglobulin domain / C.F. Wright, J. Christodoulou, C.M. Dobson, J. Clarke // Protein Engineering, Design & Selection. - 2004. - V. 17. - № 5. - P. 443-453.

143. Wright, P.E. Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-functional paradigm / P.E. Wright, H.J. Dyson // J Mol Biol. - 1999. - V. 293. - № 2. -P. 321-331.

144. Wu, S.C. Engineering monomeric streptavidin and its ligands with infinite affinity in binding but reversibility in interaction / S.C. Wu, K.K. Ng, S.L. Wong // Proteins. - 2009. - V. 77. - № 2. - P. 404-412.

145. Yang, Z. R. RONN: The Bio-Basis Function Neural Network Technique Applied to the Detection of Natively Disordered Regions in Proteins / Z.R. Yang, R. Thomson, P. McNeil, R.M. Esnouf // Bioinformatics. - 2005. - V. 21. - № 16. - P. 3369-3376.

146. Zapun, A. Folding in vitro of bovine pancreatic trypsin inhibitor in the presence of proteins of the endoplasmic reticulum / T.E. Creighton, P.J. Rowling, R.B. Freedman Proteins. - 1992. -V.14. - № 1. - P. 10-15.

147. Zhang, T. Entropic effects of disulphide bonds on protein stability / T. Zhang, E. Bertelsen, T. Alber // Nat Struct Biol. - 1994. - V. 1. - № 7. - P. 434-438.

Благодарности

Хочу выразить огромную благодарность и признательность моему научному руководителю Богдану Степановичу Мельнику за чуткое руководство, обсуждение работы, помощь в планировании экспериментов и переданные знания.

Большое спасибо Татьяне Николаевне Мельник за помощь и поддержку при оформлении данной работы, а также ценные замечания.

Благодарю Глухову Ксению Алексеевну, а также Глухова Анатолия Сергеевича за помощь в создании генетических конструкций мутантных форм апомиоглобина.

Хочу сказать спасибо Наталье Сергеевне Катиной и Нелли Борисовне Ильиной за помощь в освоении методики экспрессии и выделения апомиоглобина, Виктору Викторовичу Марченкову и Ивану Андреевичу Кашпарову за помощь в освоении методики хроматографической очистки белков, Виталию Александровичу Балобанову за помощь в проведении экспериментов методом динамического рассеяния света (ЭЬБ).

Огромное спасибо также всему коллективу отдела теоретических и экспериментальных исследований самоорганизации белков за неоценимую поддержку, многочисленные обсуждения полученных результатов, переданные знания и опыт, дружескую обстановку, доброжелательность и терпение.