Исследование стабильности и скоростей формирования различных состояний мутантных форм апомиоглобина с заменами аминокислотных остатков на поверхности белка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Мажорина Мария Анатольевна

• Мажорина Мария Анатольевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Мажорина Мария Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие принципы самоорганизации белковых молекул

1.2 Пути самоорганизации (одностадийное и многостадийное сворачивание)

1.3 Современные направления в исследовании самоорганизации белков

1.4. Кинетические методы исследования самоорганизации белков

1.5. Характеристика объекта исследования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Экспрессия генов и выделение апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм

2.2. Формирование дисульфидной связи в апомиоглобине

2.3. Физико-химические методы исследования

2.3.1. Круговой дихроизм

2.3.2. Флуоресцентная спектроскопия

2.3.3. Динамическое светорассеяние

2.3.4. Абсорбционная спектроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВ.. 63 ГЛАВА 4. ВВЕДЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНОЙ СВЯЗИ

4.1. Выбор аминокислотных остатков для замены на цистеин

4.2. Формирование дисульфидной связи в мутантной форме апомиоглобина с заменами Н36С и Б106С

4.3. Исследование равновесного разворачивания мутантной формы апомиоглобина с окисленной и восстановленной дисульфидной связью

4.4. Кинетические исследования сворачивания/разворачивания мутантных форм апомиоглобина с окисленной и восстановленной дисульфидной связью

ГЛАВА 5. ЗАМЕНЫ ГИДРОФОБНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ НА ПОВЕРХНОСТИ АПОМИОГЛОБИНА

5.1. Выбор аминокислотных остатков для замен

5.2 Исследование равновесного разворачивания мутантных форм апомиоглобина

5.3.Кинетические исследования сворачивания/разворачивания мутантных форм апомиоглобина

ГЛАВА 6. ЗАМЕНЫ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ПЕТЛЯХ, СОЕДИНЯЮЩИХ ЭЛЕМЕНТЫ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ АПОМИОГЛОБИНА

6.1. Выбор аминокислотных остатков для замен

6.2. Исследование равновесного разворачивания мутантных форм апомиоглобина

6.3. Исследование мутантных форм апомиоглобина методом динамического рассеяния света

6.4. Кинетические исследования сворачивания/разворачивания мутантных форм апомиоглобина

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

PDB (Protein Data Bank) - банк данных пространственных структур белков а.о. - аминокислотный остаток Да - дальтон

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ (DTT) - дитиотреитол, ^^)-1,4бис(сульфинил)бутан-2,3-диол

ИПТГ (IPTG) - изопропил-1-тио-Р-0-галактопиранозид

ПААГ - (PAAG) полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

HPLC (high performance liquid chromatography) - высокоэффективная жидкостная хроматография

Ia - йодацетамид

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование стабильности и скоростей формирования различных состояний мутантных форм апомиоглобина с заменами аминокислотных остатков на поверхности белка»

Актуальность темы исследования

Одной из фундаментальных задач молекулярной биологии является изучение процесса спонтанного сворачивания белка в свое уникальное нативное состояние, в частности, определение взаимосвязи между аминокислотной последовательностью белка и особенностями его свободно-энергетического профиля, отражающего взаимное расположение уровней свободной энергии всех его состояний. Решение данной задачи позволит направленно изменять стабильности белков и получать белковые структуры с заданными свойствами.

Степень разработанности

В настоящее время ученые достигли значительных успехов в этом направлении исследований. Например, показано, что не все остатки, входящие в последовательность белка, являются важными для его правильного сворачивания. Поэтому белки с низкой гомологией последовательности могут иметь сходную пространственную структуру (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002; Plotkin S.S., Onuchic J.N., 2002). Наряду с этим, важно отметить, что замена лишь одного аминокислотного остатка может существенно повлиять на весь процесс самоорганизации белка (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002; Guzman-Luna V. et al., 2017; Frare E. et al., 2005).

Несмотря на огромное количество опубликованных на сегодняшний день экспериментальных и теоретических работ в области исследования самоорганизации белковых структур, достаточно много вопросов, связанных с деталями этого сложного процесса, до сих пор ожидают своего решения. Самым сложным является получение знаний о сворачивании белков в живой клетке, поскольку в этом случае оно происходит в многокомпонентном макромолекулярном окружении. Этим обусловлен большой интерес ученых к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов (Ryabova N.A. et al., 2013; Marchenko N.Yu. et al., 2009; Marchenkov V.V., Semisotnov G.V., 2009), а

также котрансляционного сворачивания (Кузнецова И.М. и др., 2005; Fink A.I.,

5

1999), которые способствуют правильной самоорганизации белка в этих условиях. Экспериментальные работы, посвященные самоорганизации белков, ведутся в основном in vitro. Используют для этого зрелые очищенные белки.

Белки, сворачивание которых проходит в одну стадию, достаточно хорошо изучены методом Ф-анализа, который впервые был предложен Ферштом (Matouschek A. et al., 1989; Matouschek A. et al., 1990; Fersht A.R. et al., 1992; Fersht A.R., Sato S., 2004). Это метод, который по результатам кинетических исследований мутантных форм белков позволяет определить вовлеченность аминокислотных остатков в ядро сворачивания. Гораздо менее изучено многостадийное сворачивание белков. В частности, плохо изучены свойства белка при переходе из одного промежуточного состояния в другое. Нет полного понимания того, какие взаимодействия определяют стабильность и высоту энергетического барьера, разделяющего развернутое состояние и промежуточное состояние типа расплавленной глобулы.

Научная новизна

Наибольшее количество экспериментальных работ посвящено изучению взаимодействий в гидрофобном ядре белка, поскольку широко распространено мнение об их первостепенной роли в стабильности белковой структуры (например, Baryshnikova E.N. et. al., 2005). Гораздо менее исследовано влияние аминокислотных замен на поверхности белковых молекул на стабильность и скорости сворачивания/разворачивания многостадийно сворачивающихся белков. И совсем мало работ, посвященных систематическому исследованию петель, соединяющих элементы вторичной структуры белка, поскольку считается, что это «не существенные» участки для нативной структуры.

Данная диссертационная работа посвящена исследованию апомиоглобина. Апомиоглобин является хорошим модельным объектом для исследования глобулярных белков, самоорганизация которых проходит через образование промежуточного состояния типа расплавленной глобулы. Получены новые экспериментальные данные о равновесных и кинетических свойствах мутантных

форм белка с заменами и вставками аминокислотных остатков, расположенных на поверхности спиралей апомиоглобина и в двух его петлях. Результаты экспериментов позволили сделать выводы о влиянии таких замен на свободно-энергетический профиль белка. Например, впервые показано, что заменами аминокислотных остатков не только в гидрофобном ядре (Baryshnikova E.N., 2005), но и на поверхности апомиоглобина (Melnik T.N. et al., 2014; Мажорина М.А. и др., 2018) нельзя существенно повлиять на стабильность его промежуточного состояния относительно развернутого. Изменить стабильность промежуточного состояния возможно лишь введением дисульфидного мостика на поверхности белка (Melnik T.N. et al., 2014), а также введением мутаций в петли, соединяющие элементы его вторичной структуры (Majorina M.A et al., 2020). Найдены случаи не аддитивного влияния двух одновременных замен аминокислотных остатков.

Цели и задачи

Цель представленной диссертационной работы - исследовать влияние замен аминокислотных остатков на поверхности апомиоглобина на свободно-энергетический профиль белка. В частности, исследовать:

1. Введение дисульфидной связи.

2. Точечные замены гидрофобных аминокислотных остатков.

3. Замены аминокислотных остатков в петлях, соединяющих элементы вторичной структуры белка:

3.1. Изменение «гибкости» петли при замене остатков пролина (Pro) на глицин (Gly).

3.2. Удлинение петли за счет введения нескольких остатков глицина (Gly).

Для достижения целей были поставлены следующие задачи.

1. Спроектировать на поверхности апомиоглобина: 1.1. Введение дисульфидной связи,

1.2. Замены гидрофобных аминокислотных остатков,

1.3. Замены аминокислотных остатков пролина (Pro) в петлях на один или несколько остатков глицина (Gly).

2. Получить генетические конструкции, выделить и очистить мутантные формы белка с выбранными заменами.

3. Провести равновесные и кинетические исследования денатурации и ренатурации белков.

4. Провести сравнительную оценку влияния разных типов мутаций на свободно-энергетический профиль апомиоглобина.

Методология и методы исследования

В рамках данной диссертационной работы были получены генетические конструкции мутантных форм апомиоглобина с заменами и вставками аминокислотных остатков на поверхности спиралей и в петлях белка. Получение генетических конструкций мутантных форм белка проводилось совместно с сотрудниками Группы генной инженерии Института белка РАН (Гуховым А.С.) и Группы спектроскопии белка Института белка РАН (Глуховой К.А.), что отражено в публикациях.

Проведены работы по выделению белков и их очистке методом хроматографии. Чистоту белковых препаратов контролировали с помощью SDS электрофореза. Полученные мутантные формы апомиоглобина исследовали с помощью современных физико-химических методов, включающих абсорбционную и флуоресцентную спектроскопию, круговой дихроизм в ближней и дальней УФ области, динамическое рассеяние света. В частности, с помощью метода кругового дихроизма (КД) в ближней и дальней ультрафиолетовой области, а также флуоресценции триптофановых остатков исследовали белки в нативных условиях, а также их разворачивание разными концентрациями денатуранта (мочевины). Методом динамического рассеяния света оценивалась склонность белков к агрегации.

Методом триптофановой флуоресценции с использованием приставки остановленного потока для быстрого смешивания растворов проведены кинетические исследования денатурации и ренатурации белков: измерены кинетические кривые денатурации и ренатурации, рассчитаны константы скоростей сворачивания/разворачивания, построены их зависимости от концентрации денатуранта (шевронные графики), рассчитаны свободные энергии всех состояний апомиоглобина. Данный экспериментальный подход к анализу кинетических свойств многостадийно сворачивающихся белков на примере апомиоглобина был разработан и успешно применяется в Лаборатории физики белка ИБ РАН (ВагувЪшкоуа Б.М е! а1., 2005).

Теоретическая и практическая значимость

По результатам исследований апомиоглобина, проведенных в рамках данной диссертационной работы, удалось сделать важные выводы, которые применимы для проектирования мутаций в любом глобулярном белке. Полученные знания могут быть использованы в белковой инженерии и биотехнологии, например, для решения проблем, связанных с агрегацией белков и амилоидообразованием. В литературе эти процессы связывают со стабильностью, скоростью образования и концентрацией промежуточного состояния (например, К^та К., 1992; Кайпа N.8. е! а1., 2017).

Результаты проделанной работы помогают раскрыть взаимосвязь между аминокислотной последовательностью белка и его пространственной структурой, что способствует разработке методик направленного изменения стабильности белков и получению белковых структур с заданными свойствами.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 119 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 141 источник. Работу иллюстрируют 32 рисунка и 1 таблица.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Ежегодная институтская конференция ИБ РАН (Россия, Пущино, 2010), 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -Наука XXI века» (Россия, Пущино, 2011), European Biophysics Congress (Germany, Dresden, 2015), XXVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2015), XXVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2016), 20-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Россия, Пущино, 2016), 22-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2018), XIV Международная научная конференция Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2019 (Россия, Москва-Севастополь, 2019), 73-я всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биосистемы:организация, поведение, управление» (Россия, Нижний Новгород, 2020).

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи в журналах из перечня ВАК («Молекулярная биология», «PLOS One», «FEBS Letters») и 9 тезисов конференций.

Положения, выносимые на защиту

1. Ни одиночные, ни множественные замены гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности апомиоглобина существенно не влияют на стабильность промежуточного состояния белка относительно развернутого состояния.

2. Введение дисульфидной связи на поверхности апомиоглобина, а также замены аминокислотных остатков пролина в петлях на один или несколько остатков глицина изменяют стабильность промежуточного состояния белка.

3. На поверхности апомиоглобина найдены гидрофобные аминокислотные

остатки, замены которых избирательно влияют на стабильность только нативного

10

или только переходного состояния белка относительно развернутого состояния. Обнаружены случаи не аддитивного влияния двух одновременных замен аминокислотных остатков.

4. Изменение «гибкости» петли при введении замены P120G в мутантную форму апомиоглобина с заменой S117G избирательно влияет на стабильность только переходного состояния исходной мутантной формы.

Личный вклад автора

Автор участвовал в постановке целей и задач исследования. Все работы по выделению и очистке апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм, а также их физико-химические исследования и обработка полученных данных выполнены лично автором. Получение генетических конструкций мутантных форм белка проводилось совместно с сотрудниками группы генной инженерии Института белка РАН (Гуховым А.С.) и группы спектроскопии белка Института белка РАН (Глуховой К.А.), что отражено в публикациях.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общие принципы самоорганизации белковых молекул.

Одним из самых важных компонентов всех живых организмов являются белки. Их активное изучение позволило раскрыть все многообразие и значимость выполняемых ими функций. Они участвуют в транспорте молекул, являются катализаторами и регуляторами важнейших клеточных процессов, обеспечивают движение, восприятие и передачу межклеточных сигналов, защиту от чужеродных молекул и многое другое.

Белок является гетерополимером. В основе любого белка лежит полипептидная цепь, состоящая из аминокислотных остатков и представляющая собой первый уровень структурной организации (первичную структуру) белка. Этот факт был установлен Э. Фишером еще в начале 20 века. Существуют 20 основных аминокислотных остатков, из которых образуется множество белков. Их положение в белковой цепи определяется генами. Кроме того, многие белки могут содержать в себе дополнительные молекулы или ионы, необходимые для

правильного выполнения белком своей функции. Их называют кофакторами или лигандами. Исследования природных лигандов и их влияния на структуру и стабильность белков представляют собой отдельную область научных интересов (Уверский В.Н., Нарижнева Н.В., 1998; Stepanenko O.V. et al., 2012).

В 1961 году Анфинсен сделал замечательное открытие, за которое был удостоен Нобелевской премии. Он показал на примере рибонуклеазы, что глобулярный белок способен к спонтанной самоорганизации in vitro (ренатурации), если после биосинтеза он не подвергся сильной химической модификации. Иными словами, если воздействие аномальных температур или состава растворителя не привело к разрыву основной цепи белка, его архитектура спонтанно восстанавливается при «нормализации» среды (Anfinsen C.B. et al., 1961). Фактически это означает, что сама последовательность аминокислотных остатков в цепи белка определяет способ построения его трехмерной структуры. Впоследствии этот вывод получил подтверждение в экспериментах на многих других белках. Открытие явления самоорганизации и расшифровка первых трехмерных структур стали отправной точкой для активного обсуждения и исследования процесса сворачивания белков (Финкельштейн А.В., 2018).

На сегодняшний день установлено, что белковые цепи сворачиваются строго определенным образом с образованием уникальных, активно функционирующих нативных структур. Все уровни организации нативной структуры формируются и поддерживаются с помощью нескольких основных типов взаимодействий: водородных связей, гидрофобных, ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий. Среди них гидрофобным взаимодействиям отводится главная роль в обеспечении компактности белковой молекулы, водородные связи поддерживают вторичную структуру, а ван-дер-ваальсовы силы и электростатические взаимодействия — третичную структуру белка (Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002). Все указанные типы взаимодействий можно объединить под названием "конформационные силы", отметив при этом, что все они имеют различную физическую природу, а, следовательно, по-разному

зависят от условий среды, в которую помещают молекулу белка. Это дает возможность экспериментаторам, подбирая необходимые условия, добиваться полного или частичного разворачивания (денатурации) белка. Подобные опыты открывают перспективы для изучения указанных выше конформационных сил, в частности, их перераспределения с изменением условий растворения. В свою очередь, это позволяет изучать свойства различных состояний белковых молекул. Например, исследование состояний, являющихся по своим свойствам промежуточными между нативным и полностью развернутым состоянием, а также переходных состояний, определяющих высоту энергетического барьера между разными состояниями белка. Необходимо подчеркнуть, что для нормального функционирования белковой молекулы важно, чтобы уникальная пространственная структура белка была стабилизирована всем комплексом «конформационных сил». Даже частичное «выключение» одной из них неизбежно приведет к потере биологической активности (Uversky V.N., Ptitsyn O.B., 1996).

Для оценки стабильности структуры белка принято пользоваться значением свободной энергии. Ее величина определяется энтальпией Н, характеризующей энергию взаимодействия его атомов, и энтропией S, связанной с числом возможных конформаций N, которое соответствует данному состоянию белковой молекулы (S = RT ln (N), где R — молярная газовая постоянная, T- абсолютная температура). Уравнение для расчета свободной энергии выглядит следующим образом: AG = AH -TAS.

Переход белковой молекулы из развернутого состояния (U), представленного огромным числом конформаций, в нативное состояние (N), имеющее, напротив, строго определенную конформацию основной цепи, связан с преодолением свободно-энергетического барьера. Этот барьер создан значительным увеличением свободной энергии белка на фоне уменьшения конформационной подвижности его основной цепи. С одной стороны, само существование энергетического барьера между нативным и полностью развернутым (или промежуточным) состоянием обеспечивает идентичность всех

молекул белка в его нативном состоянии. Благодаря этому белки — природные гетерополимеры — способны образовывать кристаллы, чем отличаются от синтетических гетерополимеров. Также экспериментально показано, что ничем не осложненный процесс сворачивания (а именно когда нет изомеризации пролинов или реорганизации S-S мостиков и т.д.) происходит очень быстро при физиологических условиях, а, следовательно, барьер свободной энергии не очень высокий (Кузнецова И.М. и др., 2005).

Огромное разнообразие конформаций, которые может принимать

полипептидная цепь, возникает благодаря практически неограниченному

вращению вокруг связей N - Ca (угол ф) и Ca - C (угол у). Как же тогда белок

успевает перебрать все возможные конформации и свернуться в свою нативную

структуру за секунды? При этом нативная пространственная структура ведет себя

как самая стабильная из всех структур цепи, так как белковая цепь попадает в нее

при разных кинетических процессах (сворачивание на рибосоме, ренатурация in

vitro или транслокация через мембрану). Поиском ответа на этот вопрос в свое

время заинтересовался Левинталь (Levinthal C., 1968). По его представлениям, для

перебора всех возможных конформаций и выбора своей нативной структуры

белку из 100 аминокислотных остатков потребовалось бы 10100 лет. Этот факт в

литературе известен как "парадокс Левинталя". Пытаясь найти решение,

Левинталь предположил, что нативная структура белка определяется не

термодинамикой, не стабильностью, а кинетикой, т.е. она соответствует не

глобальному, а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи

(Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., 2002). В 1997 году удалось доказать, что к

любой стабильной структуре белка всегда ведет достаточно быстрый путь

сворачивания. Расчеты показали, что и энергетическая, и энтропийная

составляющие свободной энергии переходного состояния пропорциональны не

числу звеньев цепи N (как предполагал Левинталь), а N2/3 (Finkelstein A.V.,

Badretdinov A.Ya., 1997). Следовательно, время достижения стабильной

структуры белковой цепи из 100-150 аминокислотных остатков порядка

нескольких секунд или минут. По той же причине большие белки состоят из

14

отдельно сворачивающихся стабильных доменов, иначе их сворачивание было бы слишком медленным (Финкельштейн А.В., Гарбузинский С.А., 2016).

Таким образом, и теория, и эксперимент подтверждают, что нативной структуре белка отвечает минимум его свободной энергии, а точнее, минимум свободной энергии системы белок-растворитель, который достигается в результате образования неполярными группами белка гидрофобного ядра и освобождения молекул воды. При этом значительно увеличивается энтропия растворителя (Кузнецова И.М. и др., 2005). Поиск такой уникальной нативной структуры среди бесчисленного множества возможных структур является основной целью сворачивания (самоорганизации) белка.

1.2 Пути самоорганизации (одностадийное и многостадийное сворачивание).

Активное изучение самоорганизации глобулярных белков породило спор среди ученых, касающийся основных стадий этого процесса. Было предложено несколько теорий сворачивания белка. Например, Филлипс предположил, что на N-конце растущей цепи (с которого начинается биосинтез белка) возникает зародыш структуры, и остальная цепь наматывается на него (Phillips C.M. et al., 1995). Однако, эта теория не нашла подтверждения в эксперименте. Опыт показал, что замкнутая в кольцо цепь небольшого белка ингибитора трипсина, сохраняет способность к самоорганизации. Даже если при разрезании этого кольца новым N-концом окажется бывшая середина цепи, самоорганизация ведет к прежней пространственной структуре (Goldenberg, D.P., Creighton, T.E., 1983).

Альтернативной точки зрения придерживался Болдвин. В 1972 году он выдвинул гипотезу, в которой постулировал существование механизма нуклеации и роста («nucleation-growth model») в процессе самоорганизации структуры белка (Tsong T.Y. et al., 1972). Лимитирующим шагом при этом он назвал формирование ядра сворачивания, которое быстро растет, охватывая всю молекулу. Такое гидрофобное ядро образуется в результате завязывания нативных контактов между неполярными остатками боковых цепей, или в его роли может выступать, например, участок а-спирали, образовавшийся на ранних этапах процесса. Эта

гипотеза подразумевала, что кинетика сворачивания белка протекает по принципу «все или ничего»: каждая молекула белка скачком переходит из развернутого состояния в свернутое состояние, минуя какие-либо интермедиаты. В подтверждение этой гипотезы для ряда небольших глобулярных белков было установлено, что процесс их равновесного разворачивания сильными денатурантами, такими как гуанидингидрохлорид и мочевина, можно описать моделью двух состояний — нативного и полностью развернутого (Jackson S.E., and Fersht A.R., 1991; Fersht A.R., 1997). Активным сторонником этой теории был П.Л. Привалов. Он экспериментально показал, что денатурация белка происходит как переход типа «все или ничего» и, следовательно, является внутримолекулярным аналогом фазового перехода первого рода (Privalov P.L., 1979; Privalov P.L., 1982). Компьютерные эксперименты, проведенные Е.И. Шахновичем и А.М. Гутиным, также указывали на сходство кинетических аспектов самоорганизации белковых структур и фазовых переходов первого рода (Gutin A.M. et al., 1996).

В 1973 году О.Б. Птицын предложил концепцию стадийного сворачивания белка («каркасная модель» - «framework model»). Согласно этой модели, различные типы взаимодействий последовательно вовлекаются в процесс формирования структуры белка. При этом зародышевые а-спирали и Р-шпильки, образующиеся на ранних этапах сворачивания, слипаются вместе с образованием глобулы, которая на этом этапе лишь отдаленно напоминает нативную. На последних этапах происходит окончательная достройка нативной структуры белка. Другими словами, процесс самоорганизации белковой молекулы сопровождается формированием ряда промежуточных состояний с последовательным возрастанием степени упорядоченности (Птицын О.Б., 1973).

В основе гипотезы О.Б. Птицына была «нативоподобная» глобула, позже получившая название «расплавленная глобула» («molten globule»). Эксперименты, проводимые в его лаборатории, показали наличие у значительного числа малых глобулярных белков третьего термодинамического состояния молекулы (помимо

нативного и полностью развернутого). Оно было отделено от нативного и развернутого состояний переходами типа "все-или-ничего", и его можно было наблюдать в процессе равновесного разворачивания белков сильными денатурантами (Ptitsyn O.B., 1995). Впоследствии состояние расплавленной глобулы было признано учеными универсальным равновесным, а также кинетическим интермедиатом всех белковых молекул (Uversky V.N., Ptitsyn O.B., 1996).

В целом «расплавленная глобула» имеет ряд характерных признаков: она компактна, содержит достаточно много вторичной структуры, но ее боковые группы не упорядочены (Dolgikh et al., 1981; Ptitsyn, 1995; Уверский В.Н. и др., 1993). Также она характеризуется отсутствием кооперативного температурного плавления и быстрыми внутримолекулярными движениями (Финкельштейн А.В. и др., 2005).

С одной стороны, существование кинетического интермедиата означает, что сворачивание не является процессом типа «все или ничего». С другой стороны, рассуждая над проблемой сосуществования этих двух гипотез, О.Б. Птицын показал, что обе они верны для некоторых классов белков (Ptitsyn O.B., 1998). Он выделял два типа барьеров на пути сворачивания белков: «барьеры сворачивания» между развернутым и промежуточным состояниями и «барьеры улучшения» между промежуточным и нативным состояниями. При этом он подчеркнул, что обязательные шаги на пути сворачивания белка (формирование вторичной структуры, схлопывание в глобулярную структуру, упаковка боковых групп и т.д.) являются очень быстрыми, поэтому не могут быть причиной высоких барьеров, замедляющих сворачивание. Это и позволило ему предположить, что механизм нуклеации и роста может быть применим также и к случаю, когда сворачивание идет через образование промежуточного состояния, где он может относиться к переходу из развернутого состояния в промежуточное состояние типа расплавленной глобулы. Второй же барьер («барьер улучшения»), даже если он высокий, является необязательным и может быть удален посредством

небольших изменений аминокислотной последовательности белка или условий эксперимента. Кроме того, образованию промежуточного состояния типа расплавленной глобулы обычно предшествует формирование еще одного промежуточного состояния (быстрее миллисекунд), характеризующегося наличием элементов вторичной структуры, но отсутствием гидрофобного ядра («предшественник» расплавленной глобулы). Данное состояние он представлял себе как форму, в которой развернутая цепь накапливается перед прыжком через «барьер сворачивания», а саму стадию его образования - как безбарьерный процесс диффузной природы. Это промежуточное состояние было также обнаружено в равновесных экспериментах (Ptitsyn O.B., 1998).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мажорина Мария Анатольевна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Барышникова, Е.Н. Изучение кинетики сворачивания/разворачивания апомиоглобина / Е.Н. Барышникова, Б.С. Мельник, Г.В. Семисотнов, В.Е. Бычкова // Молекулярная биология. - 2005. - Т. 39(6). - С. 1008-1016.

2. Барышникова, Е.Н. Равновесное разворачивание мутантных форм апомиоглобина с заменами консервативных нефункциональных остатков на аланин / Е.Н. Барышникова, В.А. Балобанов, Н.С. Катина, Б.С. Мельник, Д.А. Долгих, Г.В. Семисотнов, В.Е. Бычкова // Молекулярная биология. - 2007. - Т. 41(4). - С. 674-678.

3. Барышникова, Е.Н. О роли некоторых консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков в переходном состоянии и в интермедиате сворачивания апомиоглобина / Е.Н. Барышникова, Б.С. Мельник, В.А. Балобанов, Н.С. Катина, А.В. Финкельштейн, Г.В. Семисотнов, В.Е Бычкова // Молекулярная биология. - 2009. - Т.43(1). - С. 136-147.

4. Векшин, Н.Л. Фотоника биологических структур / Н.Л. Векшин. - Пущино: НЦБИ, 1988. - 163 с.

5. Волькенштейн, М.В. Биофизика: учебное руководство / М.В. Волькенштейн. - 2-е изд., - М.: Наука, 1988. - 592 с.

6. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. - М.: «Мир», 1988. - 538 с.

7. Кантор, Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, П. Шиммел. - М.: Мир, 1984. - 2 т.

8. Котова, Н.В. Сворачивание глобулярных белков in vivo / Н.В. Котова, Г.В. Семисотнов // Успехи биологической химии. - 1998. - Т. 38. - С. 199-223;

9. Кузнецова, И.М. Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков / И.М. Кузнецова, В. Форже, К.К. Туроверов // Цитология. - 2005. - № 11. - С. 943-952;

10. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович. - М.: Мир, 1986. - 496 с.

11. Мажорина, М.А. Влияние аминокислотных замен на поверхности апомиоглобина на энергетический профиль белка / М.А. Мажорина, К.А. Глухова, В.В. Марченков, Б.С. Мельник // Молекулярная биология. - 2018. - Т.52(1).

- С. 62-72.

12. Мажорина, М.А. Исследование влияния гибкости основной цепи белка на энергетический профиль апомиоглобина / М.А. Мажорина, Б.С. Мельник // Актуальные вопросы биологической физики и химии. - 2018. - Т.3(1). - С. 34-38.

13. Пермяков, Е.А. Метод собственной люминисценции белка / Е.А. Пермяков.

- М.: Наука, 2003. - 188 с.

14. Птицын, О.Б. Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул / О.Б. Птицын // Докл. Акад. Наук СССР. - 1973. - Т. 210. - С. 1213-1215.

15. Пфайл, В. Стабильность и кооперативные свойства частично свернутых белков / В. Пфайл // Биохимия. - 1998. - Т. 63(3). - С. 349-359;

16. Рубин, А.Б. Биофизика / А.Б. Рубин. - М.: Книжный дом «Университет», 1999. - 1т.

17. Сурин, А.К. Мономерная форма молекулярного шапе-рона 0гоЕЬ: структура, стабильность и олигомеризация / А.К. Сурин, Н.В. Котова, С.Ю. Марченкова, В.В. Марченков, Г.В. Семисотнов // Биоорган. Химия. - 1999. - Т. 25. - №5. - С. 358-364.

18. Уилсон, К. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии / ред. К.Уилсон, Дж. Уолкер. - 2-е изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. - 848 с.

19. Уверский, В.Н. Влияние природных лигандов на структурные свойства и конформационную стабильность белков (Обзор) / В.Н. Уверский, Н.В. Нарижнева // Биохимия. - 1998. - Т. 63(4). - С. 500-515.

20. Уверский, В.Н. Разворачивание расплавленной глобулы сильными денатуран-тами протекает по принципу "все-или-ничего" / В.Н. Уверский, Г.В. Семисотнов, О.Б. Птицын // Биофизика. - 1993. - Т. 38. - С. 37-46.

21. Финкельштейн, А.В. Физика белка / А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын. - М.: Книжный дом «Университет», 2002. - 376 с.

22. Финкельштейн, А.В. Предсказание скоростей и ядер сворачивания глобулярных белков на основе теории их самоорганизации / А.В. Финкельштейн, Д.Н. Иванков, О.В. Галзитская // Успехи биологической химии. - 2005. - Т. 45. - С. 3-36.

23. Финкельштейн, А.В. Физика белковых молекул / А.В. Финкельштейн. -Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2014. - 424 с.

24. Финкельштейн, А.В. Решение парадокса Левинталя возможно на уровне формирования и упаковки вторичных структур белков / А.В. Финкельштейн, С.А. Гарбузинский // Биофизика. - 2016. - Т. 61(1). - С. 5-10.

25. Финкельштейн, А.В. 50+ лет самоорганизации белков / А.В. Финкельштейн // Успехи биологической химии. - 2018. - Т. 58. - С. 7-40.

26. Anfinsen, C.B. The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain / C.B. Anfinsen, E. Haber, M. Sela, F.H., Jr. White // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1961. - V. 47(9). - Р. 1309-1314.

27. Aoto, P.C. Probing the non-native H helix translocation in apomyoglobin folding intermediates / P.C. Aoto, C. Nishimura, H.J. Dyson, P.E. Wright // Biochemistry. -2014. - V.53(23). - P. 767-780.

28. Badieyan S, Bevan DR, Zhang C. Study and design of stability in GH5 cellulases. Biotechnol Bioeng. 2012 Jan;109(1):31-44.

29. Balasco, N. Role of loops connecting secondary structure elements in the stabilization of proteins isolated from thermophilic organisms / N. Balasco, L. Esposito, A. De Simone, L. Vitagliano // Protein Sci. - 2013. - V. 22(7). - P. 1016-1023.

30. Baldwin RL. On-pathway versus off-pathway folding intermediates. Fold Des. 1996;1(1):R1-8.

31. Baryshnikova, E.N. Three-state protein folding: Experimental determination of free-energy profile / E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov, V.E. Bychkova //Protein Sci.. - 2005. - V. 14. - Р. 2658-2667.

32. Bogatyreva, N.S. Cunning simplicity of protein folding landscapes / N.S. Bogatyreva, A.V. Finkelstein // Protein Eng. - 2001. - V. 14(8). - P. 521-523.

33. Chen, Y.H. Determination of the Helix and Beta Form of Proteins in Aqueous Solution by Circular Dichroism / Y. H. Chen, J.T. Yang, K.H. Chau // Biochemistry. -1974. - V. 13(16). - P. 3350-3359.

34. Chow, C. Structural characterization of apomyoglobin self-associated species in aqueous buffer and urea solution / C. Chow, N. Kurt, R.M. Murphy, S. Cavagnero // Biophys J. - 2006. - V.90(1). - P. 298-309.

35. Clarke, J. Engineered disulfide bonds as probes of the folding pathway of barnase: increasing the stability of proteins against the rate of denaturation / J. Clarke, A.R. Fersht // Biochemistry. - 1993. V.32(16). - P. 4322-4329.

36. Dani VS, Ramakrishnan C, Varadarajan R. MODIP revisited: re-evaluation and refinement of an automated procedure for modeling of disulfide bonds in proteins. Protein Eng. 2003 Mar;16(3):187-93.

37. De Young, L.R. Aggregation and denaturation of apomyoglobin in aqueous urea solutions / L.R. De Young, K.A. Dill, A.L. Fink // Biochemistry. - 1993. - V. 32(15). -P. 3877-3886.

38. Dill, K.A. From Levinthal to pathways to funnels / K.A. Dill, H.S. Chan // Nature Struct. Biol. - 1997. - V. 4(1). - P.10-19.

39. Dinner, A.R. Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment / A.R. Dinner, A. Sali, L.J. Smith, C.M. Dobson, M. Karplus // Trends Biochem. Sci. - 2000. - V. 25(7). - P. 331-339.

40. Dolgikh, D.A. Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? / D.A. Dolgikh, R.I. Gilmanshin, E.V. Brazhnikov, V.E. Bychkova, G.V. Semisotnov, S.Yu. Venyaminov, O.B. Ptitsyn // FEBS Lett. - 1981. - V. 136(2). - P. 311-315.

41. Dombkowski, A.A. Protein disulfide engineering / A.A. Dombkowski, K.Z. Sultana, D.B. Craig // FEBS Lett. - 2014. - V. 588(2). - P. 206-212.

42. Dosztanyi, Z. The Pairwise Energy Content Estimated from Amino Acid Composition Discriminates between Folded and Intrinsically Unstructured Proteins / Z.

109

Dosztanyi, V. Csizmok, P. Tompa, I. Simon // J. Mol. Biol. - 2005. - V. 347(4). - P. 827-839.

43. Eliezer, D. Is apomyoglobin a molten globule? Structural characterization by NMR / D. Eliezer, P.E. Wright // J. Mol. Biol. - 1996. - V. 263(4). - P. 531-538.

44. Ermolenko, D.N. Noncharged amino acid residues at the solvent exposed positions in the middle and at the C terminus of the a-helix have the same helical propensity / D.N. Ermolenko, J.M. Richardson, G.I. Makhatadze // Protein Science. -2003. - V. 12(6). - P. 1169-1176.

45. Fass D. Disulfide bonding in protein biophysics / D. Fass Annu // Rev. Biophys. -2012. - V.41. - P.63-79.

46. Fass, D. Enzymology of Disulfide Cross-Linking in Proteins / D. Fass, C. Thorpe // Chemistry. Chem Rev. - 2018. - V. 118(3). - P. 1169-1198.

47. Fersht, A.R. The folding of an enzyme. 1. Theory of protein engineering analysis and pathway of protein folding / A.R. Fersht, A. Matouschek, L. Serrano // J. Mol. Biol.

- 1992. - V. 224(3). P. 771-782.

48. Fersht, A.R. Nucleation mechanisms in protein folding / A.R. Fersht // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997. - V. 7(1). - P. 3-9.

49. Fersht, A.R. Structure and mechanism in protein science: A guide to enzyme catalysis and protein folding. Ch. 15, 18, 19 / A.R. Fersht. - N.Y.: W.H. Freeman & Co, 1999.

50. Fersht, A.R. Protein folding and unfolding at atomic resolution / A.R. Fersht, V. Dagget // Cell. - 2002. - V. 108(4). - P. 1-20.

51. Fersht, A.R. O-Value analysis and the nature of protein-folding transition states / A.R. Fersht, S. Sato // Proc. Natl. Acad. - 2004. - V. 101(21). - P. 7976-7981.

52. Fink, A.I. Chaperone-Mediated Protein Folding / A.I. Fink // Physiol.Rev. - 1999.

- V. 79(2). - P. 425-449.

53. Finkelstein, A.V. Rate of protein folding near the point of thermodynamic equilibrium between the coil and the most stable chain fold / A.V. Finkelstein, A. Ya. Badretdinov // Fold. Design. - 1997. - V. 2(2). - P. 115-121.

54. Foit, L. Chaperone activation by unfolding / L. Foit, J.S. George, B.W. Zhang, C.L. Brooks, and J.C.A. Bardwell // PNAS. - 2013. - V. 110(14). - P. 1254-1262.

55. Frare, E. Chemical synthesis of the RGD-protein decorsin: Pro-Ala replacement reduces protein thermostability / E. Frare, P. Polverino de Laureto, E. Scaramella, F. Tonello, O. Marin, R. Deana and A. Fontana // Protein Engineering, Design and Selection. - 2005. - V. 18(10). - P. 487-495.

56. Fukamizo, T. A flexible loop controlling the enzymatic activity and specificity in a glycosyl hydrolase family 19 endochitinase from barley seeds (Hordeum vulgare L.) / T. Fukamizo, R. Miyake, A. Tamura, T. Ohnuma, K. Skriver, N.V. Pursiainen, A.H. Juffer // Biochim Biophys Acta. - 2009. - V. 1794(8). - P. 1159-1167.

57. Garcia, C. Changes in the apomyoglobin pathway caused by mutation in the distal histidine residue / C. Garcia, Ch. Nishimura, S. Cavagnero, H.J. Dyson, P.E. Wright // Biochemistry. - 2000. - V. 39(37), - P. 11227-11237.

58. Gast, K. Compactness of protein molten globules: temperature-induced structural changes of the apomyoglobin folding intermediate / K. Gast, H. Damaschun, R. Misselwitz, M. Muller-Frohne, D. Zirwer, G. Damaschun // Eur. Biophys. J. - 1994. - V. 23(4). - P. 297-305.

59. Gavrilov, Y. Shortening a loop can increase protein native state entropy / Y. Gavrilov, S. Dagan, Y. Levy // Proteins. - 2015. - V. 83(12). - P. 2137-2146.

60. Gidalevitz, T. Orchestration of secretory protein folding by ER chaperones / T. Gidalevitz, F. Stevens, Y. Argon // Biochim Biophys Acta - 2013. - V. 1833(11). - P. 2410-24.

61. Gilbert, H.F. Protein chaperones and protein folding / H.F. Gilbert // Curr. Opin. Biotechnol. - 1994. - V. 5(5). - P. 534-539.

62. Goldenberg, D.P. Circular and circularly permuted forms of bovine pancreatic trypsin inhibitor / D.P. Goldenberg, T.E. Creighton // J. Mol. Biol. - 1983. - V. 165(2). -P. 407-413.

63. Grantcharova, V.P. Long-range order in the src SH3 folding transition state / V.P. Grantcharova, D.S. Riddle, D. Baker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - V. 97(13). - P. 7084-7089.

64. Griko, Y.V. Thermodynamic study of the apomyoglobin structure / Y.V. Griko, P.L. Privalov, S.Y. Venyaminov, V.P. Kutyshenko // J. Mol. Biol. - 1988. - V. 202(1). -P. 127-138.

65. Gutin, A.M. Chain Length Scaling of Protein Folding Time / A.M. Gutin, V.I. Abkevich, and E.I. Shakhnovich // Phys. Rev. Lett. - 1996. - V. 77(27). - P. 5433-5436.

66. Guzman-Luna, V. The effect of specific proline residues on the kinetic stability of the triosephosphate isomerases of two trypanosomes. Proteins / V. Guzman-Luna, A.G. Quezada, A.J. Diaz-Salazar // Proteins. - 2017. - V. 85. - P. 571-579.

67. Hargrove, M.S. Stability of myoglobin: a model for the folding of heme proteins / M.S. Hargrove, S. Krzywda, A.J. Wilkinson, Y. Dou, M. Ikeda-Saito, J.S. Olson // Biochemistry. - 1994. - V. 33(39). - P. 11767-11775.

68. Hartl, F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding / F.U. Hartl, J. Martin // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1995. - V.5(1). - P. 92-102.

69. Jackson, S.E. Folding of chymotrypsin inhibitor 2. Evidence for a two-state transition / S.E. Jackson, Fersht A.R. // Biochemistry. - 1991. - V. 30(43). - P. 1042810435.

70. Jackson, S.E. How do small single-domain proteins fold? / S.E. Jackson // Fold Des. - 1998. - V. 3(4). - P. 81-91.

71. Jennings, P.A. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin / P.A. Jennings, P.E. Wright // Science. - 1993. - V. 262(5135). - P. 892-896.

72. Jennings, P.A. Overexpression of myoglobin and assignment of its amide, C alpha and C beta resonances / P.A. Jennings, M.J. Stone, P.E. Wright // J Biomol NMR. - 1995. - V. 6(3). - P. 271-276.

73. Katina, N.S. sw ApoMb Amyloid Aggregation under Nondenaturing Conditions: The Role of Native Structure Stability / N.S. Katina, V.A. Balobanov, N.B. Ilyina, V.D. Vasiliev, V.V. Marchenkov, A.S. Glukhov, A.D. Nikulin, V.E. Bychkova // Biophys J. -2017. - V. 113(5). - P. 991-1000.

74. Kay, M.S. Packing interactions in apomyoglobin folding intermediate / M.S. Kay, R.L. Baldwin // Nature Struct. Biol. - 1996. -V. 3. - P. 439-445.

75. Kelly, S.M. How to study proteins by circular dichroism / S.M Kelly, T.J. Jess, N.C. Price // Biochim Biophys Acta. - 2005. - V. 1751(2). - P. 119-139.

76. Kiefhaber, T. Kinetic traps in lysozyme folding / T. Kiefhaber // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - V. 92(20). - P. 9029-9033.

77. Kragelund, B.B. Folding of a four-helix bundle: studies of acyl-coenzyme A binding protein / B.B. Kragelund, C.V. Robinson, J. Knudsen, C.M. Dobson, F.M. Poulsen // Biochemistry. - 1995. - V. 34(21). - P. 7217-7224.

78. Kuwajima, K. Protein folding in vitro / K. Kuwajima // Curr. Opin. Biotechnol. - 1992. - V.3(5). - P. 462-467.

79. Ladurner, A.G. Glutamine, Alanine or Glycine Repeats Inserted into the Loop of a Protein Have Minimal Effects on Stability and Folding Rates / A.G. Ladurner, A.R. Fersht // J. Mol. Biol. - 1997. - V. 273(1). - P. 330-337.

80. Levinthal, C. Are there pathways for protein folding? / C. Levinthal // J. Chem. Phys. - 1968. - V. 65(1). - P. 44-45.

81. Lobanov, M.Y. The Ising Model for Prediction of Disordered Residues from Protein Sequence Alone / M.Y. Lobanov, O.V Galzitskaya // Phys. boil. - 2011. - V. 8(3). - P. 1 - 10.

82. Majorina, M.A. Loops linking secondary structure elements affect the stability of the molten globule intermediate state of apomyoglobin / M.A. Majorina, V.A. Balobanov, V.N. Uversky, B.S. Melnik // FEBS Lett. - 2020. - V.594(20). - P.3293-3304.

83. Marchenko, N.Yu. Molecular chaperones under normal and pathological conditions / N.Yu. Marchenko, S.O. Garbuzynskiy, G.V. Semisotnov // In: Molecular Pathology of Proteins (ed. D.I. Zolobotny). - Nova Science Publishers: N.Y. - 2009. -P. 57-89.

84. Marchenkov, V.V. GroEL-assisted protein folding: Does it occur within the chaperonin inner cavity? / V.V. Marchenkov, G.V. Semisotnov // Int. J. Mol. Sci. -2009. - V.10. - P. 2066-2083.

85. Mason JM, Gibbs N, Sessions RB, Clarke AR. The influence of intramolecular bridges on the dynamics of a protein folding reaction. Biochemistry. 2002 Oct 8;41(40):12093-9.

86. Matouschek, A. Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering / A. Matouschek, , J.T. Kellis Jr., L. Serrano and A.R. Fersht // Nature. - 1989. - V. 340. - P. 122-126.

87. Matouschek, A. Transient folding intermediates characterized by protein engineering / A. Matouschek, , J.T. Kellis Jr., L. Serrano and A.R. Fersht // Nature. -1990. - V. 346(6283). - P. 440-445.

88. Matsumura, M. Stabilization of phage T4 lysozyme by engineered disulfide bonds / M. Matsumura, W.J. Becktel, M. Levitt, B.W. Matthews // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1989. - V. 86(17). - P. 6562-6566.

89. Melnik, T.N. Independent of Their Localization in Protein the Hydrophobic Amino Acid Residues Have No Effect on the Molten Globule State of Apomyoglobin and the Disulfide Bond on the Surface of Apomyoglobin Stabilizes This Intermediate State / T.N. Melnik, M.A. Majorina, D.S. Larina, I.A. Kashparov, E.N. Samatova, A.S. Glukhov, B.S. Melnik // Plos.one. - 2014. - V. 9(6). - P. 1-11.

90. Nagi, A.D. An inverse correlation between loop length and stability in a four-helix-bundle protein / A.D. Nagi, L. Regan // Folding & Design. - 1997. - V. 2(1). - P. 67-75.

91. Nakamura, H. A Novel Engineered Interchain Disulfide Bond in the Constant Region Enhances the Thermostability of Adalimumab Fab / H. Nakamura, N. Oda-Ueda, T. Ueda, T. Ohkuri // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2018. - V. 495(1). -P. 7 - 11.

92. Nazari, M. Step-Wise Addition of Disulfide Bridge in Firefly Luciferase Controls Color Shift through a Flexible Loop: A Thermodynamic Perspective / M. Nazari, S. Hosseinkhani, L. Hassani // Photochem Photobiol Sci. - 2013. - V. 12(2). - P. 298 -308.

93. Nazari, M. Design of Disulfide Bridge as an Alternative Mechanism for Color Shift in Firefly Luciferase and Development of Secreted Luciferase / M. Nazari, S. Hosseinkhani // Photochem Photobiol Sci. - 2011. - V. 10(7). - P. 1203 - 1215.

94. Nikitina, J. Importance of a single disulfide bond for the PsbO protein of photosystem II: protein structure stability and soluble overexpression in Escherichia coli / J. Nikitina, T. Shutova, B. Melnik, S. Chernyshov, V. Marchenkov, G. Semisotnov, V. Klimov, G. Samuelsson // Photosynth Res. - 2008. - V. 98(1-3). - P. 391-403.

95. Nishimura, C. Identification of native and non-native structure in kinetic folding intermediates of apomyoglobin / C. Nishimura, H.J. Dyson, P.E. Wright // J. Mol. Biol. - 2006. - V. 355(1). - P. 139-156.

96. Oda, M. Increased thermodynamic stability by hydrophilic amino acid substitutions on the surface of Streptomyces subtilisin inhibitor / M. Oda, K. Kanaori, K. Akasaka // J. Biol. Macromol. - 2007(1). - V. 7. - P. 3-8.

97. Otzen, D.E. Structural changes in the transition state of protein folding: alternative interpretations of curved chevron plots / D.E. Otzen, O. Kristensen, M. Proctor, M. Oliveberg // Biochemistry. - 1999. - V. 38(20). - P. 6499-6511.

98. Pace, C.N. Conformational stability and activity of ribonuclease T1 with zero, one, and two intact disulfide bonds / C.N. Pace, G.R. Grimsley, J.A. Thomson, B.J. Barnett // J Biol Chem. - 1988. - V. 263(24). - P. 11820-11825.

99. Pakula, A.A. Reverse hydrophobic effects relieved by amino-acid substitutions at a protein surface / A.A. Pakula, R.T. Sauer // Nature. - 1990. - V. 344(6264). - P. 363364.

100. Pande, V.S. Pathways for protein folding. / V.S. Pande, A.Yu. Grosberg, T. Tanaka, D.S. Rokhasar // Cur. Opin. Struc. Biol. - 1998. - V .8(1). - P. 68-79.

101. Permyakov, S.E. How to improve nature: study of the electrostatic properties of the surface of a-lactalbumin / S.E. Permyakov, G.I. Makhatadze, R. Owenius, V.N. Uversky, C.L. Brooks, E.A. Permyakov, L.J. Berliner // Protein Engineering, Design and Selection. - 2005. - V. 18(9). - P. 425-433.

102. Perry, L.J. Disulfide bond engineered into T4 lysozyme: stabilization of the protein toward thermal inactivation / L.J. Perry, R. Wetzel // Science. - 1984. - V. 226(4674). - P. 555-557.

103. Petersen, M.T. Amino acid neighbours and detailed conformational analysis of cysteines in proteins / M.T. Petersen, P.H. Jonson, S.B. Petersen // Protein Eng. - 1999.

- V. 12(7). - P. 535-548.

104. Phillips, C.M. Ultrafast thermally induced unfolding of Rnase A / C.M. Phillips, Y. Mizutani, R.M. Hochstrasser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - V. 92(16). - P. 7292-7296.

105. Plotkin, S.S. Understanding protein folding with energy landscape theory. I. Basic concepts / S.S. Plotkin, J.N. Onuchic // Quart. Rev. Biophys. - 2002. - V. 35(2). -P. 111-167.

106. Privalov, P.L. Stability of proteins. Small globular proteins / P.L. Privalov // Adv. Prot. Chem. - 1979. - V. 33. - P. 167-241.

107. Privalov, P.L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system (Review) / P.L. Privalov // Adv. Prot. Chem. - 1982. - V. 35. - P. 1104.

108. Ptitsyn, O.B. Molten globule and protein folding / O.B. Ptitsyn // Adv. Protein Chem. - 1995. - V .47. - P. 83-229.

109. Ptitsyn, O.B. Protein folding: nucleation and compact intermediates / O.B. Ptitsyn // Biochemistry (Mosc). - 1998. - V. 63(4). - P. 367-73.

110. Ramakrishnan, V. Geofold: Topology-Based Ptotein Unfolding Pathways Capture The Effects of Engineered Disulfides on Kinetic Stability / V. Ramakrishnan, S.P. Srinivasan, S.M. Salem, S.J. Matthews, W. Colon, M. Zaki, C. Bystroff // Proteins.

- 2013. - V. 80(3). - P. 920-934.

111. Rollins, G.C. General mechanism of two-state protein folding kinetics / G.C. Rollins, K.A. Dill // J Am Chem Soc. - 2014. - V. 136(32). - P. 11420-11427.

112. Ryabova, N.A. Molecular chaperone GroEL/ES: unfolding and refolding processes / N.A. Ryabova, V.V. Marchenkov, S.Y. Marchenkova, N.V. Kotova, G.V.

Semisotnov // Biochemistry (Mosc). - 2013. V. 78(13). - P. 1405-1414.

116

113. Saha, R. A functional loop spanning distant domains of glutaminyl-tRNA synthetase also stabilizes a molten globule state // R. Saha, S. Dasgupta, R. Banerjee, A. Mitra-Bhattacharyya, D. Söll, G. Basu, S. Roy // Biochemistry. - 2012. - V. 51(22). - p. 4429-4437.

114. Samatova, E.N. Finkelstein A.V. How strong are side chain interactions in the folding intermediate? / E.N. Samatova, N.S. Katina, V.A. Balobanov, B.S. Melnik, D.A. Dolgikh, V.E. Bychkova // Protein Sci. - 2009. - V. 18(10). - P. 2152-2159.

115. Samatova, E.N. Folding intermediate and folding nucleus for I-->N and U-->I-->N transitions in apomyoglobin: contributions by conserved and nonconserved residues / E.N. Samatova, B.S. Melnik, V.A. Balobanov, N.S. Katina, D.A. Dolgikh, G.V. Semisotnov, A.V. Finkelstein, V.E. Bychkova // Biophys J. - 2010. - V. 98(8). - P. 1694-1702.

116. Sanchez-Romero, I. Mechanism of protein kinetic stabilization by engineered disulfide crosslinks / I. Sanchez-Romero, A. Ariza, K.S. Wilson, M. Skj0t, J. Vind, L. De Maria, L.K. Skov, J.M. Sanchez-Ruiz // PLoS One. - 2013. - V. 8(7). - e70013.

117. Sandberg, A. Stabilization of Neurotoxic Alzheimer Amyloid - Oligomers by Protein Engineering / A. Sandberg, L.M. Lucheshi, S. Sollvander, T. Hard et al. // PNAS. - 2010. - V. 107(35). - P. 1-10.

118. Schweiker, K.L. Computational design of the Fyn SH3 domain with increased stability through optimization of surface charge-charge interaction / K.L. Schweiker, A. Zarrine-Afsar, A.R. Davidson, G.I. Makhatadze // Protein Science. - 2007. - V. 16(12). -P. 2694-2702.

119. Schweiker, K.L. A computational Approach for the Rational Design of Stable Proteins and Enzymes: Optimization of Surface Charge-Charge Interactions / K.L. Schweiker, G.I. Makhatadze // Methods in Enzymology. - 2009. - V. 454. - P. 175-211.

120. Shen, Y. Structures of Human Insulin-Degrading Enzyme Reveal a New Substrate Recognition Mechanism / Y. Shen, A. Joachimiak, M.R. Rosner, W. Tang // Nature. -2006. - V. 443(7113). - P. 870-874.

121. Siadat, O.R. The effect of engineered disulfide bonds on the stability of Drosophila melanogaster acetylcholinesterase / O.R. Siadat, A. Lougarre, L. Lamouroux, C. Ladurantie, D. Fournier // BMC Biochem. - 2006. - V. 7(12). - P.1-7.

122. Spagnolo, L. Folding specificity induced by loop stiffness / L. Spagnolo, S. Ventura, L. Serrano // Protein Sci. - 2003. - V. 12(7). - P. 1473-1482.

123. Stepanenko, O.V. Ligand-binding proteins: structure, stability and practical application / O.V. Stepanenko, A.V. Fonin, I.M. Kuznetsova, K.K. Turoverov // Protein structure. - 2012. - V. 12. - P. 265-290.

124. Strub, C. Mutation of exposed hydrophobic amino acids to arginine to increase protein stability / C. Strub, C. Alies, A. Lougarre, C. Ladurantie, J. Czaplicki, D. Fournier // Biochemistry. - 2004. - V.5(9). - P. 1471-2091.

125. Tanford, C. Protein denaturation / C. Tanford // Adv. Protein Chem. - 1968. - V. 23. - P. 121-282.

126. Tisi, L.C. Concerved structural features on protein surfaces: small exterior hydrophobic clusters / L.C. Tisi, P.A. Evans // J.Mol.Biol. - 1995. - V. 249(2). - P. 251258.

127. Thornton, J.M. Disulphide bridges in globular proteins / J.M. Thornton // J Mol Biol. - 1981. - V. 151(2). - P. 261-287.

128. Tsong, T.Y. A sequential model of nucleation-dependent protein folding kinetic studies of ribonuclease A. / T.Y. Tsong, R.L. Baldwin, P.A. McPhie // J. Mol. Biol. -1972. - V. 63(3). - P. 453-469.

129. Uversky, V.N. All-or-none solvent-induced transitions between native, molten globule and unfolded states in globular proteins / V.N. Uversky, O.B. Ptitsyn // Folding & Design. - 1996. - V. 1(2). - P. 117-122.

130. Viguera, A.R. Bergerac-SH3: "frustation" induced by stabilizing the folding nucleus / A.R. Viguera, L. Serrano // J Mol Biol. - 2001. - V. 311(2). - P. 357-371.

131. Viguera, A.R. Unspecific hydrophobic stabilization of folding transition states / A.R. Viguera, C. Vega, L. Serrano // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - V. 99(8). -P. 5349-5354.

132. Vogl, T. Mechanism of protein stabilization by disulfide bridges: calorimetric unfolding studies on disulfide-deficient mutants of the alpha-amylase inhibitor tendamistat / T. Vogl, R. Brengelmann, H.J. Hinz, M. Scharf, M. Lötzbeyer, J.W. Engels // J Mol Biol. - 1995. - V. 254(3). - P. 481-96.

133. Wetzel, R. Disulfide Bonds and Thermal Stability in T4 Lysozyme / R. Wetzel, L.J. Perry, W. Baase, W.J. Becktel // PNAS. - 1988. - V. 85(2). - P. 401-405.

134. Weathers, E.A. Reduced amino acid alphabet is sufficient to accurately recognize intrinsically disordered protein / E.A. Weathers, M.E. Paulaitis, T.B. Woolf, J.H. Hoh // FEBS Lett. - 2004. - V. 576(3). - P. 348-352.

135. Went, H.M. Ubiquitin folds through a highly polarized transition state / H.M. Went, S.E. Jackson // Protein Eng. Des. Sel. - 2005. V. 18(5). - P. 229-237.

136. Wright, C.F. The importance of loop length in the folding of an immunoglobulin domain / C.F. Wright, J. Christodoulou, C.M. Dobson, J. Clarke // Protein Engineering, Design & Selection. - 2004. - V. 17(5). - P. 443-453.

137. Wright, P.E. Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-functional paradigm / P.E. Wright, H.J. Dyson // J Mol Biol. - 1999. - V. 293(2). - P. 321-331.

138. Wu, S.C. Engineering monomeric streptavidin and its ligands with infinite affinity in binding but reversibility in interaction / S.C. Wu, K.K. Ng, S.L. Wong // Proteins. - 2009. - 77(2). - P. 404-412.

139. Yang, Z. R. RONN: The Bio-Basis Function Neural Network Technique Applied to the Detection of Natively Disordered Regions in Proteins / Z.R. Yang, R. Thomson, P. McNeil, R.M. Esnouf // Bioinformatics. - 2005. - V. 21(16). - P. 3369-3376.

140. Zapun, A. Folding in vitro of bovine pancreatic trypsin inhibitor in the presence of proteins of the endoplasmic reticulum / T.E. Creighton, P.J. Rowling, R.B. Freedman Proteins. - 1992. -V.14(1). - P. 10-15.

141. Zhang, T. Entropic effects of disulphide bonds on protein stability / T. Zhang, E. Bertelsen, T. Alber // Nat Struct Biol. - 1994. - V. 1(7). - P. 434-438.