Молекулярные механизмы конформационной стабильности белков при высоких температурах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор физико-математических наук Петухов, Михаил Геннадьевич

• Петухов, Михаил Геннадьевич
• доктор физико-математических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор физико-математических наук Петухов, Михаил Геннадьевич

Введение

Актуальность исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Апробация работы

Основные положения, выносимые на защиту

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Методы моделирования гидратации белков

1.1.1 Модели, использующие полноатомное представление молекул

1.1.2 Модели гидратации на основе электростатических эффектов

1.1.3 Модели, основанные на расчете площади поверхности белка, доступной растворителю (ПДР)

1.1.4 Гидрофобные взаимодействия

1.1.5 Сравнительный анализ моделей гидратации

1.1.6 Методы расчета ПДР

1.2 Использование термостабильных ферментов в биотехнологии

1.3 Молекулярные механизмы термостабильности белков

1.3.1 Изменения в аминокислотном составе термофильных белков

1.3.2 Ионные пары

1.3.3 Водородные связи

1.3.4 Внутренняя стабильность альфа-спиралей

1.3.5 Образование дисульфидных мостиков

1.3.6 Гидрофобные взаимодействия

1.3.7 Влияние кинетики сворачиванаия и разворачивания

1.3.8 Замены на остатки Pro в петлях термофильных белков

1.3.9 Связывание с ионами металлов

1.3.10 Увеличение количества третичных взаимодействий

1.3.11 Посттрансляционные модификации

1.3.12 Активность термостабильных белков

1.3.13 Направленная эволюция

1.3.14 Вычислительные методы для рационального конструирования термостабильных белков

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Синтез пептидов

2.2 КД спектроскопия

2.3 Статистический анализ белкового банка данных PDB

2.4 Вычисления, основанные на статистической физике

2.5 Молекулярное моделирование

Глава 3. Молекулярные механизмы гидратации белков

3.1 JNA - новый метод расчета доступной растворителю поверхности макромолекул

3.1.1 Алгоритм JNА

3.1.2 Аналитические выражения для расчёта производных площади ПДР по координатам атомов

3.1.3 Оценка точности расчета ПДР молекулярных объектов различной химической структуры с помощью алгоритма JNA

3.1.4 Оценка вычислительная эффективности метода JNA

3.2 Зависимость свободной энергии водородных связей между белком и молекулами воды от ПДР полярных и заряженных групп белка

3.2.1 Случаи, где атомы белка выступают в роли акцептора водородной связи

3.2.2 Случаи, где атомы белка выступают в роли донора водородной связи

3.2.3 Образование водородных связей SH и S-CH3 группами белка

3.2.4 Вклад водородных связей в энергию гидратации

3.3 Влияние водных мостиков на конформационную стабильность белка

3.3.1 Расчет положения всех возможных водных мостиков в пептидах и глобулярных белках

3.3.2 Свободная энергия образования водных мостиков в белках

3.3.3 Исследование стабильности водных мостиков в белках с помощью МД

3.3.4 Водные мостики в глобулярных белках

3.4 Приближенный метод расчета энергии электростатической поляризации растворителя

3.5 Энергетические составляющие, пропорциональные ПДР

3.6 Влияние гидратации на свободную энергию сворачивания глобулярных белков

Глава 4. Факторы, влияющие на конформационную стабильность альфа-спиралей белков

4.1 Позиционная зависимость СТ аминокислот в альфа-спиралях

4.1.1 Конструирование пептидов на основе поли-Ala

4.1.2 Анализ спектров КД а-спиральных пептидов

4.1.3 Определение СТ аминокислот с помощью модели AGADIR

4.1.4 Энергетические вклады в СТ аминокислот

4.1.5 Позиционная зависимость СТ и данные белковой базы данных

4.1.6 Значение позиционной зависимости СТ для стабильности альфа-спиральных конформаций в белках

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы конформационной стабильности белков при высоких температурах»

Актуальность исследования

Конструирование промышленно важных ферментов, имеющих высокую активность и термостабильность при заданных условиях среды (температура, рН, давление, ионная сила и т.д.), имеет большое практическое значение и способно прояснить многие вопросы, связанные с механизмами сворачивания белков в уникальную биологически активную конформацию. В представленной работе были исследованы молекулярные механизмы гидратации и конформационной стабильности белков и на этой основе разработаны новые теоретические подходы к рациональному конструированию промышленно важных ферментов. Их эффективность была проверена на примере одного из самых широко используемых в биотехнологической промышленности ферментов - глюкоамилазы из гриба Aspergillus awamori.

Гидратация белков, а также другие физические взаимодействия, стабилизирующие их структуру, являются одними из наиболее активно исследуемых факторов, влияющими на сворачивание глобулярных белков в воде. К сожалению, имеющиеся в настоящее время методы моделирования гидратации белков не позволяют одновременно учитывать все основные физические взаимодействия белка с водой (водородные связи, электростатическая поляризация, ван-дер-ваальсовые и гидрофобные взаимодействия) в одной вычислительно эффективной модели. Кроме того, значительный вклад в конформационную стабильность белка вносят такие структуры, как водные мостики на поверхности белка. Полноатомные модели гидратации,,хотя и учитывают все эти факторы, перегружены несущественными деталями, а также требуют использования долгих времён релаксации и термодинамического уравновешивания самих водных боксов при любых значительных изменениях конформации белка. Все это делает такие модели практически неприменимыми, если необходимо исследовать значительную часть конформационного пространства белка. Относительно простые и вычислительно эффективные модели гидратации белков на основе расчета их поверхности, доступной растворителю (ПДР), наоборот, слишком схематичны и не способны учесть существенные детали основных физических взаимодействий и присутствие стабильных структур воды на поверхности белка, что снижает их точность и предсказательную силу при моделировании процессов динамики и сворачивания белка в нативную конформацию. В представленной работе мы разработали новую модель гидратации белков на основе расчета ПДР, учитывающую водородные связи белка с водой, влияние всех возможных водных мостиков, электростатическую поляризацию воды, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и потери энтропии молекул воды на поверхности белка.

Одной из актуальных проблем биофизики является конструирование коротких пептидов и белков, имеющих достаточную конформационную стабильность при заданных условиях окружающей среды. В работе исследованы причины высокой термостабильности семейства белков RecA из термофильных бактерий и показано, что повышенная стабильность элементов их вторичной структуры является необходимым условием высокой конформационной стабильности белков при высоких температурах. Теоретически и экспериментально исследованы основные факторы, влияющие на стабильность этих элементов вторичной структуры в пептидах и глобулярных белках. На этой основе впервые разработан метод глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей, входящих в а-спиральные конформации, позволяющий находить уникальные последовательности, имеющие максимально возможное количество взаимодействий, стабилизирующих а-спираль. Эффективность метода была проверена как на примере коротких пептидов, так и на глюкоамилазе из гриба Asp. awamori.

Актуальность выбора именно этого фермента в качестве объекта исследования, определяется тем, что он является центральным элементом широкомасштабного промышленного процесса производства биоэтанола и глюкозо-фруктозных сиропов из различного растительного сырья и отходов сельскохозяйственного производства [1].

Цели и задачи исследования

Целью представленной работы были исследование причин термостабильности глобулярных белков и разработка на этой основе вычислительно эффективных методов для молекулярного моделирования и рационального конструирования термостабильных ферментов, способных работать с повышенной активностью в жестких условиях современных промышленных реакторов, а также проверка эффективности работы этих методов на примере коротких пептидов и глобулярных белков.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) Исследование молекулярных механизмов гидратации пептидов и белков и создание новой вычислительно эффективной модели гидратации, включающей в себя все основные физические факторы, играющие значительную роль в этом процессе.

2) Исследование причин термостабильности белков из термофильных бактерий с помощью методов молекулярного моделирования, молекулярной динамики и сравнительного анализа термофильных и мезофильных белков из нескольких различных суперсемейств белков.

3) Создание статистико-мехнической модели, описывающей термодинамику сворачивания белковых а-спиралей при различных условиях окружающей среды (температура, рН и ионная сила раствора и т.д.) и позволяющей с большой точностью предсказывать конформационную стабильность а-спиралей в мономерных пептидах.

4) Создание на основе этой теоретической модели нового практически важного метода конструирования белков и соответствующих компьютерных программ для глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей а-спиралей белков, позволяющих стабилизировать их структуру при высоких температурах.

5) Конструирование с помощью этого метода термостабильных мутантов глюкоамилазы из гриба Asp. awamori, а также исследование их активности при высоких температурах.

Научная новизна

1) Предложен новый вычислительно эффективный способ расчета свободной энергии образования водородных связей белка с окружающим его растворителем (водой), включая и расчет всех возможных водных мостиков в данной конформации белка.

2) Показано, что часто используемое предположение о постоянстве атомарных параметров гидратации (АПГ) полярных и заряженных групп не применимо для расчета гидратации глобулярных белков. Получены аналитические выражения для зависимостей АПГ полярных и заряженных групп белков от их ПДР.

3) Предложена новая модель гидратации белков, включающая водородные связи между белком и водой, электростатическую поляризацию воды, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и энтропийные потери. Расчеты гидратации белков в свернутой и развернутой конформации показали, что гидратация в значительной мере компенсирует внутрибелковые взаимодействия при сворачивании глобулярных белков в нативную конформацию.

4) Предложен новый вычислительно эффективный непараметрический метод приблизительного расчета ПДР биомакромолекул. В отличие от других параметрических методов приближенного расчета ПДР, предложенный нами метод не имеет эмпирических параметров и работает с примерно одинаковой точностью на любых молекулах, независимо от их химической природы или конформационного состояния.

5) Сравнительный анализ термофильных белков из нескольких независимых суперсемейств и их мезофильных аналогов показал, что повышенная стабильность их аспиралей является необходимым, но недостаточным фактором общей термостабильности этих белков.

6) Впервые было показано, что основными физическими факторами, определяющими стабильность а-спиралей этих термостабильных белков, являются так называемые структурные тенденции (СТ) аминокислот к образованию а-спиральной конформации и взаимодействия боковых групп аминокислот.

7) Впервые показано, что белки суперсемейства RecA имеют примерно одинаковую стабильность при нормальных температурах обитания их организмов-хозяев.

8) На основе модифицированной модели AGADIR впервые создан метод глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей белковых а-спиралей. Создана оригинальная компьютерная программа для глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей а-спиралей коротких пептидов и белков. Программа способна искать уникальные аминокислотные последовательности, имеющие максимально возможное количество стабилизирующих взаимодействий в а-спиральных конформациях. При этом предусмотрена возможность произвольно фиксировать любые фрагменты первичной структуры (например, аминокислоты, участвующие во взаимодействиях, стабилизирующих третичную структуру белка) в их нативных последовательностях. В отличие от имеющихся в настоящее время способов частичной термостабилизации белков с помощью точечных аминокислотных замен, разработанный метод основан на осуществлении множественных аминокислотных замен, позволяющих оптимизировать те физические взаимодействия в а-спиралях белков, которые не влияют на активность, но увеличивают стабильность белков в экстремальных температурных условиях.

9) Определены аминокислотные последовательности с близким к максимальному количеством внутриспиральных стабилизирующих взаимодействий для пептидов длиной 13, 14, 15 и 16 остатков. По данным КД спектроскопии, содержание а-спиральной конформации в нескольких коротких синтетических пептидах с оптимизированными последовательностями оказалось в хорошем согласии с теоретическими предсказаниями модели.

10) На основе известной пространственной структуры глюкоамилазы из мицелиального гриба Asp. cmamori, фермента, используемого при производстве биоэтанола, с помощью разработанных нами методов сконструировано и биохимически исследовано несколько аминокислотных замен (G127A, Р128А, I136L, G137A и G139A), оптимизирующих внутренние взаимодействия в а-спирали "D" этого фермента. Полученные экспериментальные данные показали, что один из созданных нами мутантов глюкоамилазы показал рекордную, на сегодняшний день, термостабильность.

Теоретическая и практическая значимость

В настоящее время моделирование взаимодействий белков и других биомакромолекул с окружающим растворителем является основным источником ошибок в расчетах свободной энергии при молекулярном моделировании и молекулярной динамики этих молекул. Полученные в работе аналитические выражения для зависимостей свободной энергии образования водородных связей полярных и заряженных групп белка с молекулами воды от площади их ПДР могут быть использованы для уточнения непрерывных моделей гидратации белков, основанных на вычислении площади ПДР. Кроме того, разработанный нами новый метод приближённого вычисления площади ПДР биомакромолекул может значительно повысить вычислительную эффективность этих методов при расчетах энергии гидратации белков в произвольной конформации.

Кристаллические структуры многих известных белков имеют большое количество а-спиралей, образующих каркас их пространственной структуры. В предлагаемой работе было впервые показано, что стабильность а-спиралей во многом определяет и общую термостабильность белков. Это обстоятельство может быть использовано для конструирования термостабильных белков, работающих в жестких условиях современных промышленных реакторов. Это имело бы огромное практическое значение для биотехнологической промышленности. В предлагаемой работе впервые был разработан и испытан новый метод создания термостабильных ферментов, который основан на глобальной оптимизации их аминокислотных последовательностей, позволяющей стабилизировать структуру ферментов при высоких температурах. Метод использует модифицированную теоретическую модель AGADIR, описывающую термодинамику сворачивания а-спиралей при различных условиях окружающей среды (температура, рН и ионная сила раствора). Модификации модели были разработаны в нашей совместной работе с европейскими (лаб. проф. Serrano, EMBL, Германия) и японскими (лаб. проф. Yumoto, ONRI, Осака) коллегами. Было показано, что эта модель хорошо воспроизводит экспериментальные данные по термостабильности как мономерных а-спиральных пептидов, так и глобулярных белков.

Одним из наиболее широко используемых ферментов при производстве биоэтанола является нетермостабильная глюкоамилаза, выделяемая из мицелиального гриба Asp. awamori. Были определены несколько вариантов аминокислотных замен, необходимых для увеличения термостабильности глюкоамилазы из гриба Asp. awamori. Соответствующие мутантные гены были сконструированы генно-инженерными методами и клонированы в Saccharomyces cerevisiae. Соответствующие мутантные белки были экспрессированы, выделены и очищены. Была исследована их активность при различных температурах. Один из полученных термостабильных мутантов показал рекордную термостабильность и оказался способным работать вплоть до температуры 80°С.

В отличие от а-амилаз, глюкоамилазы очень редко встречаются в гипертермофильных бактериях и архебактериях. Несмотря на их высокую термостабильность, в промышленном производстве они не применяются из-за сравнительно низкой активности. Вместо этого, используется глюкоамилаза из Asp. awamori, имеющая высокую активность при умеренных температурах и нейтральных значениях рН, что вынуждает производителей этанола вводить специальную стадию в технологическом процессе, терять энергию, время и эффективность производства этанола на охлаждение промежуточного ожиженного продукта до требуемых более низких температур. Получение термостабильного мутанта глюкоамилазы с повышенной активностью, способного стабильно работать при 95°С и выше, позволило бы сократить целую стадию в этом биотехнологическом процессе и, таким образом, оптимизировать затраты и эффективность этого широкомасштабного производства. Использование биоэтанола в качестве топлива в виде 10-20% добавок в бензин получило широкое распространение во многих развитых странах.

Апробация работы

Материалы дисертации были представлены на многих международных и отечественных конференциях, включая: Peptide chemistry-94, Kyoto, Japan, 1994; Peptide chemistry-95, Fukuoka, Japan, 1995; 3rd Albany conference on computational biology "Phylogenetic and structural relationships among proteins", Rensselaerville, USA, 1995; 1st Peptide Engineering Meeting, Osaka, Japan, 1997, Sequnece Analysis Modeling and Simulations, EMBO workshop, Heidelberg,Germany, 1998; 13-th European Students' Conference 2002 Berlin, Germany 2002; Бреслеровские чтения (2002): Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня, Санкт-Петербург, 2002; 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. 2004, Пущино, 2004; 9-я Международная Пущинская школа-конференция "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), XIII International Conference on Small-angle Scattering, Kyoto, Japan, 2006; ИНТЕРВАЛ-06 Всероссийская (с международным участием) конференция по интервальному анализу и его приложениям, Петергоф, 2006, Научная конференция "Молекулярная генетика, биофизика и медицина"(Бреслеровские чтения-Н), Санкт-Петербург, 2006; International conference "Molecular basis of homologous recombination in pro- and eukaryotes", Humboldt University, Berlin, Germany, 2006; IV Moscow International

Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development", Moscow, 2007; XIV Международная конференция "Ломоносов-2007", Москва, 2007; XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008»; Москва, 2008; ISACC-2008 International Symposium "Atomic Cluster Collisions : Structure and Dynamics from the nuclear to the MesoBioNano scale"; St. Petersburg, 2008; The Second Saint-Petersburg International Conference onNanoBio Technologies; St.-Petersburg„ 2008;

Основные положения, выносимые на защиту

1. Новый непараметрический метод приближённого расчёта площади ПДР и аналитические выражения для расчета её первых производных по координатам атомов молекулы.

2. Аналитические выражения, позволяющие на основе площади ПДР полярных и заряженных атомов белка эффективно вычислять свободные энергии образования ими водородных связей (включая водные мостики) с окружающим белок растворителем.

3. Некорректность широко используемых предположений о постоянстве атомарных параметров гидратации для описания взаимодействий полярных и заряженных атомов глобулярных белков с водой. Аналитические выражения для расчета зависимости атомарных параметров гидратации (АПГ) от площади поверхности, доступной растворителю (ПДР).

4. Зависимость альфа-спиральных структурных тенденций аминокислот (СТ) от их положения в альфа-спиралях.

5. Повышенная стабильность а-спиралей является необходимым, но недостаточным условием термостабильности суперсемейства белков RecA. Кроме того, проведенный анализ показал, что исследованные белки при нормальных условиях функционирования их организмов-хозяев имеют примерно одинаковый уровень конформационной стабильности их а -спиралей.

6. Новый практически важный метод глобальной оптимизации первичной структуры а-спиралей белков, имеющих максимально высокую конформационную стабильность.

7. Аминокислотные последовательности длиной 10, 11, 12, 13 аминокислотных остатков, имеющие близкую к максимально возможной конформационную стабильность в а-спиральной конформации.

8. Новые аминокислотные замены в а-спирали D глюкоамилазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori (ГА), повышающие ее конформационную стабильность при высоких температурах. Было показано, что в отличие от аминокислотной замены Р128А, замены G137A, I136LhG139A имеют сильный термостабилизирующий эффект.

Список сокращений

АК - аминокислота

АПГ — атомарный параметр гидратации

ВДВП - ван-дер-ваальсова поверхность

ВМ - водный мостик

ГА - глюкоамилаза

КД - круговой дихроизм

МД - молекулярная динамика

МП — молекулярная поверхность

ПДР — поверхность, доступная растворителю

САК - содержание а-спиральной конформации

СТ - структурная тенденция аминокислот принимать альфа-спиральную конформацию является составляющей общего изменения свободной энергии аминокислот при образовании альфа-спиралей, связанной с уникальной ковалентной структурой каждой природной аминокислоты. Например - изменение набора разрешенных конформационных состояний боковой цепи аминокислоты.

СЭГ — свободная энергия гидратации

ЯМР — ядерный магнитный резонанс

CHARMM, AMBER, ЕСЕРР - энергетические потенциалы

МК - Монте-Карло

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота ПЦР — Полимеразная цепная реакция КА - Конформационный анализ УФ - Ультрафиолет

HPLC — High performance liquide chromatography

JNA - Joint Neighbors Approximation

PDB - Protein Data Bank (белковая база данных)

SOD - супероксид-дисмутазы

TIP3P - молекулярная модель воды

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Петухов, Михаил Геннадьевич

Общие выводы

1. Разработан новый подход молекулярного моделирования гидратации белков, позволяющий эффективно вычислять основные составляющие свободной энергии гидратации для белков в произвольной конформации. Показано, что атомарные параметры гидратации полярных и заряженных атомов зависят от их поверхности, доступной растворителю. Получены аналитические выражения для этих зависимостей.

2. Экспериментально показано, что структурные тенденции аминокислот, влияющие на стабильность а-спиралей зависят от их типа и позиции в а-спиралях. Величина эффекта в некоторых случаях молсет составлять до 1.1 ккал/моль. Показано, что позиционный эффект определяется комбинацией трех физических факторов: конфигурационной энтропией, гидратацией и количеством ван-дер-ваальсовых контактов боковых цепей аминокислот.

3. Разработан новый метод глобальной оптимизации для конструирования аминокислотных последовательностей а-спиралей, имеющих близкую к максимально возможной конформационную стабильность. Данные КД-спектроскопии показали, что содержание а-спиральной конформации в пептидах длиной 10-13 остатков может достигать 70-75%.

4. Показано, что термостабильность белков RecA из термофильных бактерий связана с конформационной стабильностью их а-спиралей. Проведенный анализ показал, что а-спирали белков RecA из термофильных, мезофильных и психрофильных бактерий, при нормальных температурах функционирования их организмов-хозяев, имеют примерно одинаковый уровень конформационной стабильности.

5. Экспериментально показано, что константа термоинактивации двойного мутанта глюкоамилазы из Asp. awamori (G137A и А246С) примерно в 2 раза ниже, чем у белка дикого типа. Кроме того, двойная мутация I136L и G139A в термочувствительной а-спирали D этого фермента имеет значительный термостабилизирующий эффект. к

Благодарности.

Автор признателен проф. (В.А. Ланцову( и проф. L. Serrano за поддержку и полезные предложения, сотрудникам ОМРБ ПИЯФ, принимавшим непосредственное участие в работе: [П.М. Фирсову|, В.В. Исаеву-Иванову, Г.Н. Рычкову. М.А. Суржик, Т.Н. Кузнецовой, Е. Глазунову, Д. Карелову, Д. Лебедеву, студентам СПбГПУ: С.Чуркиной., А. Шмидту и А. Швецову а также зарубежным коллегам Dr. N. Yumoto и Dr. D. Cregut, принимавшим активное участие в экспериментальной работе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Автором опубликованы 29 статей, из них 17 в международных , 12 в российских журналах и сборниках и 18 тезисов на всероссийских и международных конференциях:

1. Мазур А.К., Петухов М.Г., Елякова JI.A. Модель пространственного случайного блуждания деполимеразы при взаимодействии с субстратом // Биофизика, — 1988. — Том 33.-С. 417-421.

2. Петухов М.Г., Першин B.JL АВ INITIO-исследование электронного строения молекулы альфа-Д-глюкозы // Журнал структурной химии, - 1988. - Том 29. - С. 167-168.

3. Петухов М.Г., Дорофеев В.Э., Абагян Р.А., Мазур А.К. Глобальная оптимизация конформационной энергии олигопептидов с помощью туннельного алгоритма // Биофизика, - 1992. - Том 37. - С. 226-230.

4. Петухов М.Г., Мазур А.К. Моделирование возможных способов связывания субстрата в активном центре альфа-Амилазы А из Aspergillus oryzae II Мол. Биол., - 1992. - Том 26. -С. 292-299.

5. Petukhov M.G., Yumoto N., Murase S., Yamamoto H., Tatsu Y., Yoshikawa S. Computer molecular modeling investigation of the conformational properties of the helical part of Neuropeptide Y (NPY) substituted at N-terminus // Peptide Chemistry, - ed. Ohno M., Protein Research Foundation - 1994. - P. 401-404.

6. Yumoto N., Murase S., Petukhov M.G., Yamamoto H., Tatsu Y., Taguchi Т., Yoshikawa S. Stabilization of alpha-helix in Neuropeptide- Y by end capping and helix dipole/charge interaction // Peptide Chemistry, - ed. Ohno M., Protein Research Foundation, - 1994. - P. 429432.

7. Petukhov M.G., Mazur A.K., Elyakova L.A. Investigation of the conformational properties of a beta-(l~>3) branched beta-(l—>6) heptasaccharide elicitor and its analogues by internal coordinate stochastic dynamics // Carbohydr. Res. - 1995. - Vol. 279. - P. 41-57.

8. Murase S., Yumoto N., Petukhov M.G., Yoshikawa S. Acylation of the alpha-amino group in neuropeptide Y(12-36) increases binding affinity for the Y2 receptor // J. Biochem. (Tokyo), -1996.,-Vol. 119.-P. 37-41.

9. Petukhov M., Yumoto N., Murase S., Onmura R., Yoshikawa S. Factors that affect the stabilization of alpha-helices in short peptides by a capping box. // Biochemistry - 1996. - Vol. 35.-P. 387-397.

10. Petukhov M., Kil Y., Kuramitsu S., Lanzov V. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their alpha-helices // Proteins - 1997. - Vol. 29. - P. 309-320.

11. Петухов М.Г., Киль Ю.В., Ланцов В.А. О природе терморезистентности белков: стабильность альфа-спиралей белков RecA термофильных бактерий // Докл. Акад. Наук — 1997. - Том 356. - С. 268-271.

12. Petukhov М., Munoz V., Yumoto N., Yoshikawa S., Serrano L. Position dependence of non-polar amino acid intrinsic helical propensities // J. Mol. Biol. - 1998. - Vol. 278. - P. 279-289.

13. Rizvi T.Z., Petukhov M., Tatsu Y., Yumoto N., Yoshikawa S. Stabilization of helix-turn-helix motif in short peptides // J. Chem. Soc. Pakistan - 1998. - Vol. 20. - P. 137-140.

14. Петухов М.Г., Байтин Д.М., Киль Ю.В., Ланцов В.А. Оптимальная жесткость белковой структуры: три класса жесткости у семейства белков RecA эубактерий // Докл. Акад. Наук. - 1998.-Том 362.-С. 118-121.

15. Petukhov М., Cregut D., Soares С.М., Serrano L. Local water bridges and protein conformational stability // Protein Sci. - 1999. - Vol. 8. - P. 1982-1989.

16. Petukhov M., Uegaki K., Yumoto N., Yoshikawa S., Serrano L. Position dependence of amino acid intrinsic helical propensities II: non-charged polar residues: Ser, Thr, Asn, and Gin. // Protein Sci. - 1999. - Vol. 8. - P. 2144-2150.

17. Chervyakova D., Kagansky A., Petukliov M., Lanzov V. [L29M] substitution in the interface of subunit-subunit interactions enhances Escherichia coli RecA protein properties important for its recombinogenic activity // J. Mol. Biol. - 2001 - Vol. 314. - P. 923-935.

18. Petukhov M., Uegaki K., Yumoto N., Serrano L. Amino acid intrinsic alpha-helical propensities III: positional dependence at several positions of С terminus // Protein Sci. - 2002. -Vol. 11.-766-777.

19. Петухов M., Рынков Г., Серрано JI. Теоретическое моделирование гидратации белков. // Бреслеровские чтения (2002): Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. -ред. Ланцов В. - Издательство ПИЯФ РАН. - 2002. Том 1. - С. 148-168.

20. Bayramov F.B., Toporov V.V., Petukhov M.G., Glazunov E.A., Bairamov B.H. Structural properties and dynamics of low-energy collective excitations of water and lisozyme // Phys. Stat. Sol. (C). - 2004.-Vol. 1.-P. 3134-3137.

21. Petukhov M., Rychkov G., Firsov L., Serrano L. H-bonding in protein hydration revisited // Protein Sci. - 2004. - Vol. 13. - P. 2120-2129.

22. Petukhov M., Lebedev D., Shalguev V., Islamov A., Kuklin A., Lanzov V., Isaev-Ivanov V. Conformational flexibility of RecA protein filament: Transitions between compressed and stretched states // Proteins - 2006. - Vol. 65. - P. 296-304.

23. Якимов А., Петухов M. Молекулярное моделирование пространственной структуры биомакромолекул с помощью методов интервального анализа и глобальной оптимизации в обобщенных координата // ИНТЕРВАЛ-06 Всероссийская (с международным участием) конференция по интервальному анализу и его приложениям — издательство Санкт-Петербургского Государственного университета — 2006. — С. 154-157.

24. Rychkov G., Petukhov М. Joint neighbors approximation of macromolecular solvent accessible surface area // J. Comput. Chem. - 2007. - Vol. 28. - P. 1974-1989.

25. Петухов М.Г., Лебедев Д.В., Карелов Д.В., Исаев-Иванов В.В. Крупномасштабная конформационная подвижность филамента белка RecA. // Бреслеровские чтения 2 (2006):

Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. - ред. Ланцов В. - Издательство ПИЯФ РАН - 2007. - Том 1. - С. 99-109.

26. Рынков Г.Н., Петухов М.Г. Теоретическое моделирование гидратации белков, с помощью расчёта площади поверхности доступной растворителю. // Бреслеровские чтения 2 (2006): Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. — ред. Ланцов В - Издательство ПИЯФ РАН. - 2007. - Том 1. - 299-313.

27. Рычков Г.Н., Петухов М.Г. Расчёт площади поверхности биополимеров, доступной растворителю, с помощью объединения пар атомов. // Вестник молодых ученых МГУ "Ломоносов". - Мысль. - 2007. - Том 4. - С. 11-19.

28. Petukhov М., Tatsu Y., Tamaki К., Murase S., Uekawa H., Yoshikawa S., Serrano L., Yumoto N. Design of stable alpha-helices using global sequence optimization // J. Pept. Sci. -2009.-Vol. 15.-P. 359-365.

29. Суржик M.A., Чуркина C.B., Шмидт A.E., Швецов А.В., Кожина Т.Н., Фирсов Д.Л., Фирсов Л.М., Петухов М.Г. Влияние точечных аминокислотных замен во внутренней альфа-спирали на термостабильность глюкоамилазы из Aspergillus awamori xlOO // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - принята для публикации.

Тезисы докладов на научных конференциях

1. Petukhov М, Lebedev D, Karelov D, Glazunov E, Kuklin A, Lanzov V, Isaev-Ivanov V.

Molecular Mechanisms of a Large Scale Conformational Flexibility and Thermostability in the RecA Protein. In: Solov'yov A, editor. Europhysics conference abstracts; St. Petersburg (Russia) June 3-7,2008. European Physical Society, p 97.

2. Rytchkov GN, Bobrov KS, Borisova AS, Shabalin KA, Petukhov MG, Kulminskaya AA. Modification of regiospecificity of the alpha-galactosidase from Thermotoga maritima towards pharmaceutical^ important globotriose. 2008; St.-Petersburg, Russia June 16-18, 2008. Publishing House of St.-Petersburg State Polytechnical University, p 173-174.

3. Шмидт AE, Чуркина CB, Суржик MA, Кожина TH, Петухов МГ, Фирсов JIM. Новый способ конструирования термостабильной глюкоамилазы. 9 декабря 2008 г.; Санкт-Петербург. Издательство Санкт-Петербургского Политехнического университета, р 133-134.

4. Илатовский А.В., Петухов М.Г. Расчет спектров МРН для супернуклеосомной структуры хроматина. 9 декабря 2008 г.; Санкт-Петербург. Издательство Санкт-Петербургского Политехнического университета, р 115-116.

5. Якимов, А.П., Петухов, М.Г. ."Метод поиска низкоэнергетических конформаций биомолекул с гарантированной сходимостью"., Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", (ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев), Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ, Москва, 2008г., стр. 21-22.

6. Швецов, А.В., Петухов, М.Г., "Моделирование конформационной подвижности филамента белка RecA"., Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", (ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев), Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ, Москва, 2008г., стр. 19-20.

7. Ilatovskiy A., Petukhov М., "Statistical analysis of GC-content in promoter areas of complete bacterial genome", IV Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development", Moscow,, March, 2007, P. 397.

8. Рычков Г.Н., Петухов М.Г., Расчёт площади поверхности биополимеров, доступной растворителю, с помощью объединения пар атомов. XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", Москва, апрель, 2007г., том 1, стр. 51

9. Рынков Г.Н., Петухов М.Г., "Новый непараметрический метод приблизительного вычисления площади поверхности биополимеров, доступной растворителю (ПДР)", научная конференция "Современные проблемы науки о полимерах", Сборник тезисов, Санкт-Петербург, 2007г., стр. 84

10. Платовский А.В., Петухов М.Г., "Моделирование супернуклеосомной структуры хроматина", материалы политехнического симпозиума "Молодые ученые -промышленности северо-западного региона", Санкт-Петербург, 2007г. стр. 119.

11. Швецов А.В., Петухов М.Г., "Моделирование конформационной подвижности белка RecA", материалы политехнического симпозиума "Молодые ученые -промышленности северо-западного региона", Санкт-Петербург, 2007г., стр. 128.

12. Якимов А.П., Петухов М.Г., "Моделирование пространственных структур биомакромолекул методами математики надежных вычислений", материалы политехнического симпозиума "Молодые ученые — промышленности северо-западного региона", Санкт-Петербург, 2007г., стр. 132.

13. Petukhov М., Lebedev D., Shalguev V., Islamov A., Kuklin A., Lanzov V., Isaev-Ivanov V. M., "Conformational flexibility of RecA protein filament: transitions between compressed and stretched states", XIII Interactional Conference on Small-angle Scattering, Kyoto, Japan, July, 2006, P. 31.

14. Petukhov M., Lebedev D., Shalguev V., Islamov A., Kuklin A., Lanzov V., Isaev-Ivanov V. "Investigations of the large scale flexibility in RecA protein filament by small angle neutron scattering (SANS)", 5-th Workshop on Investigations at the IBR-2 Pulsed Reactor, Dubna, Russia, July, 2006, P. 60.

15. Рычков Г.Н., Петухов М.Г.,"Расчёт вероятностей образования водородных связей при гидратации белка на основе поверхности, доступной растворителю", "Биология — наука XXI века": 9-ая международная Пущинская школа-конференция молодых учёных, сборник тезисов, Пущино, апрель, 2005г., стр. 330.

16. Рынков Г.Н., Петухов М.Г., "Новый метод расчёта невалентных взаимодействий растворителя с внутренними атомами глобулярных белков", "Молодые учёные промышленности Северо-западного региона": политехнический симпозиум, сборник тезисов, Санкт-Петербург, ноябрь, 2004г., стр. 72.

17. Рычков Г.Н. и Петухов М.Г. "Новый метод приблизительного расчёта площади поверхности белка, доступной растворителю". "Биология - наука XXI века": 8-ая международная Пущинская школа-конференция молодых учёных (Пущино). Сборник тезисов, 2004г., стр. 242.

18. Rychkov G. and Petukhov М. Based on approximate accessible surface model of protein hydration // 13-th European Students' Conference 2002, Humbolt University of Berlin, 2002, P. 21.

6.4 Заключение

В этой работе мы разработали новый практически важный метод для рационального конструирования белковых а-спиралей, имеющих высокую конформационную стабильность с помощью глобальной оптимизации первичной структуры белка. Одна из важных особенностей метода - возможность произвольной фиксации любых функционально значимых фрагментов первичной структуры и оптимизации только тех элементов структуры, которые не содержат важные функциональные группы белка. Было показано, что предложенный метод является эффективным инструментом для белковой инженерии. В отличие от других методов глобальной энергетической оптимизации (молекулярная динамика, Монте-Карло, отжиг и т.д.), которые часто используются, чтобы изменить в структуре белка одну-две аминокислоты и, таким образом, увеличить стабильность исследуемого бежа, прибавляя несколько стабилизирующих взаимодействий, разработанный нами метод, имеет дело со всеми возможными последовательностями белковых а-спиралей и выбирает лучший из их числа. Насколько нам известно, это первая работа в новой и многообещающей области глобальной оптимизации аминокислотных последовательностей белков.

Хотя, гарантированная сходимость к глобальному минимуму не может быть в настоящее время получена ни для каких интересных многомерных задач, было показано, что разработанный нами метод имеет высокую эффективность в оптимизации аминокислотных последовательностей а-спиральпых пептидов. Измерения КД нескольких синтетических пептидов с оптимизированными последовательностями оказались в хорошем согласии с теоретическими расчетами, как в терминах абсолютных, так и относительных величин а-спирального содержания. Оптимизированные последовательности показали ожидаемую зависимость их а-спирального содержания от длины пептида. Мотивы аминокислотных последовательностей, найденные при оптимизации, соответствуют основным факторам белковой стабилизации, которые публиковались в литературе. Кроме того, было показано, что потенциал 20 природных аминокислот вполне достаточен для формирования стабильных а-спиралей в мономерных пептидах длиной всего лишь 10-12 остатков при нормальных физиологических условиях. Метод, фактически, не зависит от используемой здесь теоретической модели AGADIR. Можно ожидать, что в будущем и другие теоретические подходы докажут свою успешность не только в предсказаниях а-спиралей, но также и для других элементов вторичной структуры в белках ф-структуры, повороты, и т.д.). В этом случае метод, представленный в этой работе, может быть легко адаптирован для новых теоретических подходов.

Глава 7. Рациональное конструирование термостабильных мутантов глюкоамилазы из гриба Asp. awamori

Г люкоамилаза (КФ 3.2.1.3, 1,4-а-1>глюкан-глюкогидролаза) из мицслиального гриба Asp. awamori XI00 последовательно отщепляет в процессе реакции гидролиза глюкозные остатки с ^восстанавливающих концов крахмала, гликогена, мальтоолигосахаридов. Фермент широко распространен в природе, как у прокариот, так и у эукариот. У млекопитающих глюкоамилаза найдена в виде комплекса с мальтазой в щеточных каемках мембран кишечника и почек. У бактерий фермент встречается нечасто, но широко распространен у дрожжей и у других микроскопических грибов (Aspergillus, Mucor, Neurospora Rhizopus, Trichoderma и др.).

Г ® г © 1

Молотое зерно

Же ли ров анный продукт а-Лмнлща Охлаждение

Ожиженнын продукт

Глюкоамилаза

Глюко-ммомераза

Осахаренным продукт

Дроясжн а

Я Фруктоза

Ферментация I

Этанол

Рисунок 7.1 Стандартный технологический процесс производства биоэтанола и глюкозосодержащих сиропов из крахмала

В 1973 г. корпорация Clinton Corn (США) внедрила технологию получения фруктозы и этанола из кукурузного крахмала - наиболее крупномасштабный биотехнологический процесс, существующий в мире в настоящее время. Этот технологический процесс (см. Рисунок 7.1) включает несколько стадий ферментативного гидролиза крахмала [1]. На первой стадии этого технологического процесса крахмал гидролизуется термостабильной альфа-амилазой при температуре 95-105°С в течение 1 часа с образованием мальтоолигосахаридов различной длины, которые затем превращаются в глюкозу в процессе их гидролиза с невосстанавливающих концов ферментом глюкоамилазой (1,4-альфа- глюкан-глюкогидролазой). Одна из нерешенных проблем заключается в том, что глюкоамилаза недостаточно термостабильна, и поэтому вторая стадия (гидролиз мальтоолигосахаридов глюкоамилазой) идет при температуре 55 — 60°С несколько суток. Энергия, затрачиваемая на охлаждение сиропа после первой стадии до 60°С, а также необходимость занятия производственных мощностей в течение длительного времени практически удваивают себестоимость продукта.

Промышленная значимость глюкоамилазы несомненно стимулировала изучение как физико-химических свойств самого фермента, так и генно-инженерных аспектов его потенциальных производителей, в особенности мицелиальных грибов и дрожжей. В 6070-ые годы были определены основные молекулярные характеристики глюкоамилаз из разных источников - валовый аминокислотный и карбогидратный составы, молекулярные веса для разных форм, поведение в электрофоретических экспериментах, спектральные характеристики, особенности взаимодействия с субстратами разного размера и химического состава. Проведено количественное кинетическое описание работы фермента и на этой основе предложено описание субсайтной структуры активного центра [44,232-236].

Рис. 7.2 Пространственная структура молекулы глюк о амилазы из Aspergillus awamori XI00

В начале 90-х годов в серии работ нашей лаборатории была впервые определена с высоким разрешением пространственная структура глюкоамилазы из гриба Asp. awamori XI00 и ряда её комплексов с лигандами [43, 237] (см. Рисунок 7.2) и на этой основе начата обширная работа по сайт-специфическому мутагенезу для улучшения технологических характеристик глюкоамилазы [40, 235]. Однако из-за недостаточной эффективности методов конструирования белков, основанных на некоординированных точечных заменах аминокислот, удалось повысить термостабильность глюкоамилазы дикого типа примерно до 70°С [238].

Получение термостабильной мутантной глюкоамилазы из гриба Asp. awamori XI00, способного работать при 95°С и выше, позволило бы сократить целую стадию в самом широкомасштабном промышленном биотехнологическом процессе в мире и, таким образом, значительно снизить себестоимость конечного продукта. Кроме того, одностадийный комбинированный гидролиз крахмала с помощью термостабильных альфа- и глюкоамилаз при максимально высоких температурах позволил бы значительно увеличить скорость реакции и уменьшить требуемое время и потребляемые ресурсы.

Повышенная стабильность а-спиралей неоднократно указывалась в качестве одной из главных причин термостабильности белков из термофильных организмов [79, 82, 140]. Кроме того, делались неоднократные попытки получить термостабильную глюкоамилазу с помощью точечных аминокислотных замен, стабилизирующих структуру а-спиралей [40, 239, 240]. Поэтому, в этой работе мы попытались создать более термостабильные формы этого фермента с помощью аминокислотных замен, стабилизирующих одну из а-спиралей этого белка.

7.1 Конструирование термостабильных форм глюкоамилазы и МД

Многими исследователями неоднократно предпринимались попытки термостабилизации глюкоамилазы из Asp. awamori с помощью аминокислотных замен в различных элементах ее структуры, включая и аминокислотные замены, стабилизирующие конформационную подвижность различных а-спиралей белка. [41, 86, 235, 239, 241-243]. В этих работах было показано, что различные элементы вторичной структуры вносят неодинаковый вклад в общую термостабильность белка. В частности, оказалось, что точечная замена А246С увеличивает термостабильность белка на 4°С и является одной из наиболее термостабилизирующих точечных замен в этом белке, найденных до сих пор. Этот эффект, вероятно, связан с созданием искусственного дисульфидного моста (С246-С320) с единственным свободным остатком С320 в этом белке [85]. Было показано, что а-спираль "D" является одним из наиболее термочувствительных элементов вторичной структуры глюкоамилазы [239]. В частности, замена G137A, стабилизирующая эту а-спираль, повышает термостабильность фермента примерно на 1°С [40]. Поэтому дальнейшие термостабилизирующие модификации глюкоамилазы проводили в а-спирали "D" этого фермента.

В кристаллической структуре глюкоамилазы а-спираль "D" имеет длину 20 аминокислотных остатков (номера аминокислотных остатков белка от 125 до 145) в последовательности RDGPALRATAMIGFGQWLLDN, включая два концевых остатка в положениях N-cap и С-сар. Здесь и далее используется стандартная номенклатура положений аминокислот в а-спиралях белков [147]. Ряд остатков в этой последовательности редко встречаются в белковых а-спиралях в связи с тем, что они либо имеют высокие потери энтропии при встраивании в а-спирали (G127,1136, G137hG139), либо стерически препятствуют соседним остаткам находиться в а-спирали (Р128) [126]. Поэтому замена этих остатков на более склонные к образованию а-спиралей (например Ala и Leu) может значительно усилить конформационную стабильность этой а-спирали и, соответственно, термостабильность всего белка. Последнее обстоятельство подтверждается как наблюдениями, что повышенная стабильность а-спиралей является одним из основных факторов термостабильности нескольких независимых семейств белков [79-82], так и успешными экспериментами по повышению термостабильности различных белков с помощью аминокислотных замен, стабилизирующих их а-спирали [140, 244, 245].

Однако известно, что, в отличие от глобулярных белков в кристаллических условиях, в водном окружении при повышенных температурах один или два остатка на концах их а-спиралей часто не имеют стабильной конформации (так называемый "terminal fraying") [246, 247]. В этом случае G127 и Р128 могут оказаться в позициях а-спирали N-cap и N1 соответственно, где эти аминокислотные остатки обладают сильным стабилизирующим а-спирали эффектом [126].

Для того чтобы проверить эту гипотезу, мы провели моделирование молекулярной динамики (МД) молекулы глюкоамилазы в периодическом водном боксе при постоянной температуре 70°С с помощью GROMACS, широко используемого пакета программ для моделирования молекулярной динамики белков. о г -1 6 н ю

Времн МД, не

Рисунок 7.3. Конформационная подвижность а-спиралей (покачаны черным цветом) в пространственной структуре глюкоамилазы из Aspergillus awamori Х100 при 70°С во время 10нс молекулярной динамики этого фермента в периодическом водном боксе

Из данных, представленных на рисунке 7.3, видно, что, в отличие от некоторых других а-спиралей глюкоамилазы, N-концевые остатки а-спирали "D" при температуре 70°С имеют достаточно стабильную а-спиральную конформацию. При этом аминокислотные остатки G127 и Р128 стабильно занимают а-спиральные позиции N2 и N3 соответственно, и поэтому их замена на другие аминокислоты могла бы обеспечить значительное повышение термостабильности этого фермента (см. обсуждение ниже). В то же время, полученные с помощью МД результаты показывают, что эффект расплавленных концов для С-концевых остатков этой а-спирали, так же как для N- и С-копцевых остатков а-спирали "С" (остатки 75-90), а-спирали "F" (остатки 211-224) и а-спирали "К" (остатки 348-354), весьма значителен и действительно может изменять длину и положение концов многих а-с пират ей этого белка по сравнению с тем, что наблюдается в статических кристаллических структурах. Таким образом, полученные нами результаты показывают. что при конструировании мутантных белков с целенаправленным изменением их биохимических свойств, белки необходимо рассматривать как динамические системы.

Проведенные нами расчеты с помощью теоретической модели AGADIR показали, что замена G137A в а-спирали '"D'" глюкоамилазы понижает свободную энергию свернутой конформации белка примерно на 2 ккал/моль. Для других возможных аминокислотных замен в этой а-спирали расчеты также показали значительные изменения свободной энергии белка, стабилизирующие его активную конформацию, а именно: ~ -4.2 ккал/моль для двойного мутанта G127A и Р128А (М7), ~ -6.1 для тройного мутанта G127A, Р128А и G139A (М8), - -6.6 ккал/моль для мутанта, имеющего 4 аминокислотных замены G127A, Р128А, G139A и I136L (М9), что может значительно повысить термостабильность этого фермента.

7.2 Исследование активности мутантных форм глюкоамилазы при повышенной температуре

В работе мы конструировали и биохимически исследовали двойной мутант МЗ, несущий аминокислотные замены G137A и А246С, и три мутантные формы глюкоамилазы (М7, М8 и М9), полученные с помощью серии последовательных аминокислотных замен в а-спирали "D" глюкоамилазы дикого типа. Все выбранные нами аминокислотные замены предназначались для стабилизации этой а-спирали за счет усиления так называемых внутренних а-спиральных СТ ее аминокислот, а также устранения возможных стерических затруднений, связанных с присутствием аминокислотных остатков пролина в положении N2.

На рисунке 7.4 показаны зависимости констант термоинактивации двойного мутанта МЗ и глюкоамилазы дикого типа (WT) от температуры. Как видно из представленных данных, в диапазоне температур 65-75°С константа температурной инактивации двойного мутанта примерно в 2-3 раза ниже, чем у белка дикого типа.

0.030 0.025 0.020 i И

L> о 0.015 Й га

0.010 0.005 0.000

60 65 70 75 80 85

Температура, °С

Рисунок 7.4 Сравнение термостабильности глюкоамилазы из Aspergillus awamori XI00 дикого типа (WT) и двойного мутанта МЗ (G137A & А246С) при различных температурах

Температура полной инактивации двойного мутанта несколько выше 80С°, что примерно на 5-6°С выше, чем у коммерчески используемого белка дикого типа из мицелиальных грибов. При этом при примерно одинаковой активности этот мутант глюкоамилазы при температуре 75°С сохраняет свою работоспособность в 2 раза дольше, чем широко используемый сейчас в промышленном производстве белок дикого типа, что позволяет достигать большей глубины гидролиза. Важно также то, что термостабилизирующий эффект этих двух мутаций носит аддитивный характер.

Константы инактивации для фермента дикого типа и других исследованных нами мутантных форм глюкоамилазы приведены в таблице 7.1. Наиболее термостабильным является двойной мутант МЗ. Этот фермент единственный сохраняет остаточную активность при 80°С. Мутант М7, имеющий две замены в а-спирали "D" G127A и Р128А, не дал ожидаемого увеличения термостабильности глюкоамилазы. Хотя эта форма глюкоамилазы и сохраняет остаточную активность при 70°С, его константы инактивации в 3-5 раз выше, чем у белка дикого типа в области температур от 65°С до 70°С.

Список литературы диссертационного исследования доктор физико-математических наук Петухов, Михаил Геннадьевич, 2009 год

1. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехноголия. Принципы и применение -Москва: Мир, 2002.

2. Финкелынтейн А.В., Птицин О.Б. Физика белка Москва: Книжный дом "Университет", 2002.

3. Privalov P.L., Gill S.J. Stability of protein structure and hydrophobic interaction // Adv. Protein Chem. 1988. - Vol. 39. - P. 191-234.

4. Honig В., Yang A.S. Free energy balance in protein folding // Adv. Protein Chem. 1995. -Vol. 46. - P. 27-58.

5. Papazyan A., Warshel A. Continuum and dipole-lattice models of solvation // J. Phys. Chem. 1997.-Vol. 101.-P. 11254-11264.

6. Sharp K.A., Honig B. Electrostatic interactions in macromolecules: theory and applications // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1990. - Vol. 19. - P. 301-332.

7. Chothia C. Hydrophobic bonding and accessible surface area in proteins // Nature. 1974. -Vol. 248.-P. 338-339.

8. Eisenberg D., McLachlan A.D. Solvation energy in protein folding and binding // Nature. -1986.-Vol. 319.-P. 199-203.

9. Wesson L. Eisenberg D. Atomic solvation parameters applied to molecular dynamics of proteins in solution // Protein Sci. 1992. - Vol. 1. - P. 227-235.

10. Koehl P. Electrostatics calculations: latest methodological advances // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. - Vol. 16. - P. 142-151.

11. Warshel A., Russell S.T. Calculations of electrostatic interactions in biological systems and in solutions // Q. Rev. Biophys. 1984. - Vol. 17. - P. 283-422.

12. Honig В., Nicholls A. Classical electrostatics in biology and chemistry // Science. 1995. -Vol. 268.-P. 1144-1149.

13. Abagyan R., Totrov M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 235. - P. 9831002.

14. Hermann R.B. Theory of hydrophobic bonding. II. The correlation of hydrocarbon solubility in water with solvent cavity surface area // J. Phys. Chem. 1972. - Vol. 76. - P. 2754-2759.

15. Lee В., Richards F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility //J. Mol. Biol. -1971. Vol. 55. - P. 379-400.

16. Wolfenden R. Interaction of the peptide bond with solvent water: a vapor phase analysis // Biochemistry. 1978. - Vol. 17. - P. 201-204.

17. Wolfenden R., Andersson L., Cullis P.M., Southgate C.C. Affinities of amino acid side chains for solvent water// Biochemistry. 1981. - Vol. 20. - P. 849-855.

18. Wuthrich K., Otting G., Liepinsh E. Protein hydration in aqueous solution // Faraday Discuss. 1992. - Vol. 93. - P. 35-45.

19. Walrafen G.E. Raman and infrared spectral investigations of water structure. // Water, a comprehensive treatise / book auth. F. Franks. New York: Plenum Press, 1972: Vol. 1.

20. Matheson R.R., Scheraga H.A. A method for predicting nucleation sites for protein folding based on hydrophobic contacts // Macromolecules. 1978. - Vol. 11. - P. 819-829.

21. Morra G., Meli M., Colombo G. Molecular dynamics simulations of proteins and peptides: from folding to drug design // Curr. Protein Pept. Sci. 2008. - Vol. 9. - P. 181-196.

22. Juffer A.H., Eisenhaber F., Hubbard S.J., Walther D. Argos P. Comparison of atomic solvation parametric sets: applicability and limitations in protein folding and binding // Protein Sci. 1995. - Vol. 4. - P. 2499-2509.

23. Shrake A., Rupley J.A. Environment and exposure to solvent of protein atoms. Lysozyme and insulin // J. Mol. Biol. 1973. - Vol. 79. - P. 351-371.

24. Connolly M.L. Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids // Science. 1983. -Vol. 221.-P. 709-713.

25. Richmond T.J. Solvent accessible surface area and excluded volume in proteins. Analytical equations for overlapping spheres and implications for the hydrophobic effect // J. Mol. Biol. -1984.-Vol. 178.-P. 63-89.

26. Gibson K.D., Scheraga H. A. Surface-area of the intersection of 3 spheres with unequal radii -a simplified analytical formula// Mol. Phys. 1988. - Vol. 64. - P. 641-644.

27. Hayryan S., Ни C.K., Skrivanek J., Hayryane E., Рокоту I. A new analytical method for computing solvent-accessible surface area of macromolecules and its gradients // J. Comput. Chem. 2005. - Vol. 26. - P. 334-343.

28. Wodak S.J., Janin J. Analytical approximation to the accessible surface area of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980. Vol. 77. - P. 1736-1740.

29. Weiser J., Shenkin P.S., Still W.C. Approximate solvent-accessible surface areas from tetrahedrally directed neighbor densities // Biopolymers. 1999. - Vol. 50. - P. 373-380.

30. Weiser J., Shenkin P.S., Still W.C. Fast, Approximate Algorithm for Detection of Solvent-Inaccessible Atoms // J. Comput. Chem. 1999. - Vol. 20. - P. 586-596.

31. Weiser J., Shenkin P.S., Still W.C. Approximate atomic surfaces from linear combination of pairwise overlaps (LCPO) // J. Сотр. Chem. 1999. - Vol. 20. - P. 217-230.

32. Weiser J., Shenkin P.S., Still W.C. Optimization of gaussian surface calculations and extension to solvent-accessible areas // J. Сотр. Chem. 1999. - Vol. 20. - P. 688-703.

33. Vasilyev V., Purisima E.O. A fast pairwise evaluation of molecular surface area // J. Comput. Chem. 2002. - Vol. 23. - P. 737-745.

34. Rychkov G., Petukhov M. Joint neighbors approximation of macromolecular solvent accessible surface area// J. Comput. Chem. 2007. - Vol. 28. - P. 1974-1989.

35. Bruins M.E., Janssen A.E., Boom R.M. Thermozymes and their applications: a review of recent literature and patents // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. - Vol. 90. - P. 155-186.

36. Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular biotechnology : principles and applications of recombinant DNA Washington, D.C.: ASM Press, 2003.

37. Ford C. Improving operating performance of glucoamylase by mutagenesis // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - Vol. 10. - P. 353-357.

38. Wang Y., Fuchs E., da Silva R., McDanield A., Seibel J., Ford C. Improvement of Aspergillus niger Glucoamylase Thermostability by Directed Evolution // Starch. 2006. - Vol. 58.-P. 501-508.

39. Aleshin A.E., Hoffman C., Firsov L.M., Honzatko R.B. Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100 // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 238. - P. 575591.

40. Aleshin A.E., Firsov L.M., Honzatko R.B. Refined structure for the complex of acarbose with glucoamylase from Aspergillus awamori var. XI00 to 2.4-A resolution // J. Biol. Chem. -1994. Vol. 269. - P. 15631-15639.

41. Neustroev K.N., Golubev A.M., Firsov L.M., Ibatullin F.M., Protasevich, II, Makarov A.A. Effect of modification of carbohydrate component on properties of glucoamylase // FEBS Lett. -1993.-Vol. 316.-P. 157-160.

42. Afonsoa V., Champya R., Mitrovica D., Collina P., Lomri A. Reactive oxygen species and superoxide dismutases: Role in joint diseases. // Joint Bone Spine -2007. Vol. 74. - P. 324-329.

43. Greenberger J. Gene therapy approaches for stem cell protection. // Gene Therapy. 2008. -Vol. 15. - P. 100-108.

44. Dive D., Gratepanche S., Yera H., Becuwe P., Daher W., Delplace P., Odberg-Ferragut C., Capron M., Khalife J. Superoxide dismutase in Plasmodium: a current survey // Redox Rep. -2003.-Vol. 8.-P. 265-267.

45. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Mol Cell Biochem. 1997. - Vol. 174. - P. 305-319.

46. Skulachev V.P. Mitochondria, reactive oxygen species and longevity: some lessons from the Barja group // Aging Cell. 2004. - Vol. 3. - P. 17-19.

47. Razvi A., Scholtz J.M. Lessons in stability from thermophilic proteins // Protein Sci. 2006. -Vol. 15.-P. 1569-1578.

48. Trivedi S., Gehlot H.S., Rao S.R. Protein thermostability in Archaea and Eubacteria // Genet Mol. Res. 2006. - Vol. 5. - P. 816-827.

49. Mozo-Villiarias A., E. Q. Theoretical Analysis and Computational Predictions of Protein Thermostability // Current Bioinformatics. 2006. - Vol. 1. - P. 25-32.

50. Li W.F., Zhou X.X., Lu P. Structural features of thermozymes // Biotechnol. Adv. 2005. -Vol. 23.-P. 271-281.

51. Pace C.N. Contribution of the hydrophobic effect to globular protein stability // J. Mol. Biol.- 1992.-Vol. 226.-P. 29-35.

52. Dao-pin S., Anderson D.E., Baase W.A., Dahlquist F.W., Matthews B.W. Structural and thermodynamic consequences of burying a charged residue within the hydrophobic core of T4 lysozyme // Biochemistry. 1991. - Vol. 30. - P. 11521-11529.

53. Sun D.P. Sauer U., Nicholson H., Matthews B.W. Contributions of engineered surface salt bridges to the stability of T4 lysozyme determined by directed mutagenesis // Biochemistry. -1991. Vol. 30. - P. 7142-7153.

54. Wilkinson D.L., Harrison R.G. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli // Biotechnology (N Y). 1991. - Vol. 9. - P. 443-448.

55. Tan Y.H., Luo R. Protein Stability Prediction: A Poisson-Boltzmann Approach // J. Phys. Chem. B. 2008. - Vol. 112.-P. 1875-1883.

56. Schymkowitz J., Borg J., Stricher F., Nys R„ Rousseau F., Serrano L. The FoldX web server: an online force field // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33. - P. W382-388.

57. Ladenstein R., Antranikian G. Proteins from hyperthermophiles: stability and enzymatic catalysis close to the boiling point of water // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1998. - Vol. 61.- P. 37-85.

58. Vieille C., Zeikus G.J. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - Vol. 65. - P. 1-43.

59. Sterner R., Liebl W. Thermophilic adaptation of proteins // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. -2001.-Vol. 36.-P. 39-106.

60. Zhou X.X., Wang Y.B., Pan Y.J., Li W.F. Differences in amino acids composition and coupling patterns between mesophilic and thermophilic proteins // Amino Acids. 2008. - Vol. 34. - P. 25-33.

61. Berezovsky I.N., Shakhnovich E.I. Physics and evolution of thermophilic adaptation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. - Vol. 102. - P. 12742-12747.

62. Menendez-Arias L., Argos P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics point to residue substitutions in alpha-helices // J. Mol. Biol. 1989. - Vol. 206. - P. 397-406.

63. Wetmur J.G., Wong D.M., Ortiz В., Tong J., Reichert F., Gelfand D.H. Cloning, sequencing, and expression of RecA proteins from three distantly related thermophilic eubacteria // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 25928-25935.

64. Argos P., Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. Thermal stability and protein structure // Biochemistry. 1979. - Vol. 18. - P. 5698-5703.

65. Bohm G., Jaenicke R. Relevance of sequence statistics for the properties of extremophilic proteins // Int. J. Pept. Protein Res. 1994. - Vol. 43. - P. 97-106.

66. Matsui I., Harata K. Implication for buried polar contacts and ion pairs in hyperthermostable enzymes // FEBS J. 2007. - Vol. 274. - P. 4012-4022.

67. Teplyakov A.V., Kuranova I.P., Harutyunyan E.H., Vainshtein B.K., Frommel C., Hohne W.E., Wilson K.S. Crystal structure of thermitase at 1.4 A resolution // J. Mol. Biol. 1990. -Vol.214.-P. 261-279.

68. Shirley B.A., Stanssens P., Hahn U., Pace C.N. Contribution of hydrogen bonding to the conformational stability of ribonuclease T1 // Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 725-732.

69. Tanner J.J., Hecht R.M., Krause K.L. Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 25 Angstroms Resolution// Biochemistry. 1996. - Vol. 35. - P. 2597-2609.

70. Jaenicke R., Bohm G. The stability of proteins in extreme environments // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 738-748.

71. Nielsen M.S., Harris P., Ooi B.L., Christensen H.E. The 1.5 A resolution crystal structure of Fe3S4.-ferredoxin from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // Biochemistry. -2004. Vol. 43. - P. 5188-5194.

72. Petukhov M., Kil Y., Kuramitsu S., Lanzov V. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their alpha-helices // Proteins. 1997. - Vol. 29. - P. 309-320.

73. Петухов М.Г., Киль Ю.В., Ланцов B.A. О природе терморезистентности белков: стабильность альфа-спиралей белков RecA термофильных бактерий И Докл. Акад. Наук. -1997.-Vol. 356.-Р. 268-271.

74. Петухов М.Г., Байтин Д.М., Киль Ю.В., Ланцов В.А. Оптимальная жесткость белковой структуры: три класса жесткости у семейства белков RecA эубактерий // Докл. Акад. Наук. 1998.-Vol. 362. - Р. 118-121.

75. Facchiano A.M., Colonna G., Ragone R. Helix stabilizing factors and stabilization of thermophilic proteins: an X-ray based study // Protein Eng. 1998. - Vol. 11. - P. 753-760.

76. Matsumura M., Matthews B.W. Stabilization of functional proteins by introduction of multiple disulfide bonds // Methods Enzymol. -1991. Vol. 202. - P. 336-356.

77. Matsumura M., Signor G., Matthews B.W. Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds //Nature. 1989. - Vol. 342. - P. 291-293.

78. Li Y., Coutinho P.M., Ford C. Effect on thermostability and catalytic activity of introducing disulfide bonds into Aspergillus awamori glucoamylase // Protein Eng. 1998. - Vol. 11. - P. 661-667.

79. Dombkowski A.A. Disulfide by Design: a computational method for the rational design of disulfide bonds in proteins // Bioinformatics. 2003. - Vol. 19. - P. 1852-1853.

80. Ishikawa K., Nakamura H., Morikawa K., Kanaya S. Stabilization of Escherichia coli ribonuclease HI by cavity-filling mutations within a hydrophobic core // Biochemistry. 1993. -Vol. 32.-P. 6171-6178.

81. Burley S.K., Petsko G.A. Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization// Science. 1985. - Vol. 229. - P. 23-28.

82. Hollien J., Marqusee S. A thermodynamic comparison of mesophilic and thermophilic ribonucleases H // Biochemistry. 1999. - Vol. 38. - P. 3831-3836.

83. Serrano L., Bycroft M., Fersht A.R. Aromatic-aromatic interactions and protein stability. Investigation by double-mutant cycles // J. Mol. Biol. 1991. - Vol. 218. - P. 465-475.

84. Schuler В., Kremer W., Kalbitzer H.R., Jaenicke R. Role of entropy in protein thermostability: folding kinetics of a hyperthermophilic cold shock protein at high temperatures using 19F NMR // Biochemistry. 2002. - Vol. 41. - P. 11670-11680.

85. Matthews B.W., Nicholson H., Becktel W.J. Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. - Vol. 84. - P. 6663-6667.

86. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия Москва: Мир, 1984.

87. Hardy F., Vriend G., Veltman O.R., van der Vinne В., Venema G., Eijsink V.G. Stabilization of Bacillus stearothermophilus neutral protease by introduction of prolines // FEBS Lett. 1993. -Vol. 317.-P. 89-92.

88. Nakai Т., Okada K., Akutsu S., Miyahara I., Kawaguchi S., Kato R., Kuramitsu S., Hirotsu K. Structure of Thermus thermophilus HB8 aspartate aminotransferase and its complex with maleate // Biochemistry. 1999. - Vol. 38. - P. 2413-2424.

89. Li C., Heatwole J., Soelaiman S., Shoham M. Crystal structure of a thermophilic alcohol dehydrogenase substrate complex suggests determinants of substrate specificity and thermostability // Proteins. 1999. - Vol. 37. - P. 619-627.

90. Fujii Т., Hata Y., Oozeki M., Moriyama H., Wakagi Т., Tanaka N., Oshima T. The crystal structure of zinc-containing ferredoxin from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus sp. strain 7 // Biochemistry. 1997. - Vol. 36. - P. 1505-1513.

91. Eidsness M.K., Richie K.A., Burden A.E., Kurtz D.M., Jr., Scott R.A. Dissecting contributions to the thermostability of Pyrococcus furiosus rubredoxin: beta-sheet chimeras // Biochemistry. 1997. - Vol. 36. - P. 10406-10413.

92. Wang C., Eufemi M., Turano C., Giartosio A. Influence of the carbohydrate moiety on the stability of glycoproteins // Biochemistry. 1996. - Vol. 35. - P. 7299-7307.

93. Arnold U., Schierhorn A. Ulbrich-Hofmann R. Modification of the unfolding region in bovine pancreatic ribonuclease and its influence on the thermal stability and proteolytic fragmentation // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 259. - P. 470-475.

94. Olsen O., Borriss R., Simon O., Thomsen K.K. Hybrid Bacillus (l-3,l-4)-beta-glucanases: engineering thermostable enzymes by construction of hybrid genes // Mol. Gen. Genet. 1991. -Vol. 225.-P. 177-185.

95. McAfee J.G., Edmondson S.P., Datta P.K., Shriver J.W., Gupta R. Gene cloning, expression, and characterization of the Sac7 proteins from the hyperthermophile Sulfolobus acidocaldarius // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 10063-10077.

96. Van den Burg В., Vriend G., Veltman O.R., Venema G., Eijsink V.G. Engineering an enzyme to resist boiling // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95. - P. 2056-2060.

97. Jackel C., Kast P., Hilvert D. Protein design by directed evolution // Annu. Rev. Biophys. -2008. Vol. 37. - P. 153-173.

98. Stemmer W.P. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature. 1994. -Vol. 370.-P. 389-391.

99. Zhao H., Arnold F.H. Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase // Protein Eng. 1999. - Vol. 12. - P. 47-53.

100. Giver L., Gershenson A., Freskgard P.O., Arnold F.H. Directed evolution of a thermostable esterase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - Vol. 95. - P. 12809-12813.

101. Lippow S.M., Tidor B. Progress in computational protein design // Curr. Opin. Biotechnol. -2007.-Vol. 18.-P. 305-311.

102. Kang S.G., Saven J.G. Computational protein design: structure, function and combinatorial diversity // Curr. Opin. Chem. Biol. 2007. - Vol. 11. - P. 329-334.

103. Marti S., Andres J., Moliner V., Silla E., Tunon I., Bertran J. Computational design of biological catalysts // Chem. Soc. Rev. 2008. - Vol. 37. - P. 2634-2643.

104. Jacobs D.J., Rader A.J., Kuhn L.A., Thorpe M.F. Protein flexibility predictions using graph theory // Proteins. 2001. - Vol. 44. - P. 150-165.

105. Lazaridis Т., Karplus M. "New view" of protein folding reconciled with the old through multiple unfolding simulations // Science. 1997. - Vol. 278. - P. 1928-1931.

106. Lazaridis Т., Lee I., Karplus M. Dynamics and unfolding pathways of a hyperthermophilic and a mesophilic rubredoxin// Protein Sci. 1997. - Vol. 6. - P. 2589-2605.

107. Malakauskas S.M., Mayo S.L. Design, structure and stability of a hyperthermophilic protein variant //Nat. Struct. Biol. 1998. - Vol. 5. - P. 470-475.

108. Finkelstein A.V., Badretdinov A.Y., Ptitsyn O.B. Physical reasons for secondary structure stability: alpha-helices in short peptides // Proteins. 1991. - Vol. 10. - P. 287-299.

109. Doig A.J., Baldwin R.L. N- and C-capping preferences for all 20 amino acids in alpha-helical peptides // Protein Sci. 1995. - Vol. 4. - P. 1325-1336.

110. Stapley B.J., Rohl C.A., Doig A.J. Addition of side chain interactions to modified Lifson-Roig helix-coil theory: application to energetics of phenylalanine-methionine interactions // Protein Sci. 1995. - Vol. 4. - P. 2383-2391.

111. Munoz V., Serrano L. Elucidating the folding problem of helical peptides using empirical parameters //Nat. Struct. Biol. 1994. - Vol. 1. - P. 399-409.

112. Munoz V., Serrano L. Elucidating the folding problem of helical peptides using empirical parameters. II. Helix macrodipole effects and rational modification of the helical content of natural peptides // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 245. - P. 275-296.

113. Munoz V., Serrano L. Elucidating the folding problem of helical peptides using empirical parameters. III. Temperature and pH dependence // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 245. - P. 297-308.

114. Lacroix E., Viguera A.R., Serrano L. Elucidating the Folding Problem of alpha-Helices: Local Motifs, Long- range Electrostatics, Ionic-strength Dependence and Prediction of NMR Parameters // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 284. - P. 173-191.

115. Petukhov M., Munoz V., Yumoto N., Yoshikawa S., Serrano L. Position dependence of non-polar amino acid intrinsic helical propensities // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 278. - P. 279289.

116. Petukhov M., Uegaki K., Yumoto N., Yoshikawa S., Serrano L. Position dependence of amino acid intrinsic helical propensities II: non-charged polar residues: Ser, Thr, Asn, and Gin // Protein Sci. 1999. - Vol. 8. - P. 2144-2150.

117. Petukhov M., Uegaki K., Yumoto N., Serrano L. Amino acid intrinsic alpha-helical propensities III: positional dependence at several positions of С terminus // Protein Sci. 2002. -Vol. 11.-P. 766-777.

118. Huyghues-Despointes B.M., Scholtz J.M., Baldwin R.L. Helical peptides with three pairs of Asp-Arg and Glu-Arg residues in different orientations and spacings // Protein Sci. 1993. - Vol. 2. - P. 80-85.

119. Padmanabhan S., Baldwin R.L. Tests for helix-stabilizing interactions between various nonpolar side chains in alanine-based peptides // Protein Sci. 1994. - Vol. 3. - P. 1992-1997.

120. Armstrong K.M., Fairman R., Baldwin R.L. The (i, i + 4) Phe-His interaction studied in an alanine-based alpha- helix // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 230. - P. 284-291.

121. Huyghues-Despointes B.M., Scholtz J.M., Baldwin R.L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide // Protein Sci. 1993. -Vol. 2.-P. 1604-1611.

122. Lockhart D.J., Kim P.S. Internal stark effect measurement of the electric field at the amino terminus of an alpha helix // Science. 1992. - Vol. 257. - P. 947-951.

123. Lockhart D.J., Kim P.S. Electrostatic screening of charge and dipole interactions with the helix backbone // Science. 1993. - Vol. 260. - P. 198-202.

124. Harper E.T., Rose G.D. Helix stop signals in proteins and peptides: the capping box // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - P. 7605-7609.

125. Aurora R., Srinivasan R., Rose G.D. Rules for alpha-helix termination by glycine // Science. 1994. - Vol. 264. - P. 1126-1130.

126. Villegas V., Viguera A.R., Aviles F.X., Serrano L. Stabilization of proteins by rational design of alpha-helix stability using helix/coil transition theory // Fold. Des. 1996. - Vol. 1. - P. 29-34.

127. Gill S.C., von Hippel P.H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data// Anal. Biochem. 1989. - Vol. 182. - P. 319-326.

128. Chen Y.H., Yang J.T., Chau K.H. Determination of the helix and beta form of proteins in aqueous solution by circular dichroism // Biochemistry. 1974. - Vol. 13. - P. 3350-3359.

129. Vriend G. WHAT IF: a molecular modeling and drug design program // J. Mol. Graph. -1990.-Vol. 8.-P. 52-56.

130. Munoz V., Serrano L. Development of the multiple sequence approximation within the AGADIR model of alpha-helix formation: comparison with Zimm-Bragg and Lifson- Roig formalisms // Biopolymers. 1997. - Vol. 41. - P. 495-509.

131. Munoz V., Serrano L. Helix design, prediction and stability // Curr. Opin. Biotechnol. -1995.-Vol. 6.-P. 382-386.

132. Richardson J.S., Richardson D.C. Amino acid preferences for specific locations at the ends of alpha helices // Science. 1988. - Vol. 240. - P. 1648-1652.

133. Ooi Т., Oobatake M., Nemethy G., Scheraga H.A. Accessible surface areas as a measure of the thermodynamic parameters of hydration of peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. -Vol. 84. - P. 3086-3090.

134. Lee K.H., Xie D., Freire E., Amzel L.M. Estimation of changes in side chain configurational entropy in binding and folding: general methods and application to helix formation // Proteins. 1994. - Vol. 20. - P. 68-84.

135. Guvench O., Brooks C.L., 3rd Efficient approximate all-atom solvent accessible surface area method parameterized for folded and denatured protein conformations // J. Comput. Chem. -2004. Vol. 25. - P. 1005-1014.

136. Gibson K.D., Scheraga H.A. Volume of the Intersection of 3 Spheres of Unequal Size a Simplified Formula // J. Phys. Chem. - 1987. - Vol. 91. - P. 4121-4122.

137. Gibson K.D., Scheraga H.A. Exact calculation of the volume and surface-area of fused hard-sphere molecules with unequal atomic radii // Mol. Phys. 1987. - Vol. 62. - P. 1247-1265.

138. Petukhov M., Rychkov G., Firsov L., Serrano L. H-bonding in protein hydration revisited // Protein Sci. 2004. - Vol. 13. - P. 2120-2129.

139. Fraczkiewicz R., Braun W. Exact and Efficient Analytical Calculation of the Accessible Surface Areas and Their Gradients for Macromolecules // J. Comput. Chem. 1998. - Vol. 19. -P. 319-333.

140. Weiser J., Weiser A.A., Shenkin P.S., Still W.C. Neighbor-list reduction: Optimization for computation of molecular van der Waals and solvent-accessible surface areas // J. Сотр. Chem. 1998.-Vol. 19.-P. 797-808.

141. Lavor C. A deterministic approach for global minimization of molecular potential energy functions // International Journal of Quantum Chemistry. 2003. - Vol. 95. - P. 336-343.

142. Lin Y., Stadtherr M.A. Deterministic global optimization of molecular structures using interval analysis // Journal of Computational Chemistry. 2005. - Vol. 26. - P. 1413-1420.

143. Otting G., Liepinsh E., Wuthrich K. Protein hydration in aqueous solution // Science. -1991.-Vol. 254.-P. 974-980.

144. Cheng Y.K., Rossky P.J. Surface topography dependence of biomolecular hydrophobic hydration //Nature. 1998. - Vol. 392. - P. 696-699.

145. Petukhov M., Cregut D., Soares C.M., Serrano L. Local water bridges and protein conformational stability // Protein Sci. 1999. - Vol. 8. - P. 1982-1989.

146. Ippolito J.A., Alexander R.S., Christianson D.W. Hydrogen bond stereochemistry in protein structure and function// J. Mol. Biol. 1990. - Vol. 215. - P. 457-471.

147. Morris A.S., Thanki N., Goodfellow J.M. Hydration of amino acid side chains: dependence on secondary structure // Protein Eng. 1992. - Vol. 5. - P. 717-728.

148. Thanki N., Umrania Y., Thornton J.M., Goodfellow J.M. Analysis of protein main-chain solvation as a function of secondary structure // J. Mol. Biol. 1991. - Vol. 221. - P. 669-691.

149. Gregoret L.M., Rader S.D., Fletterick R.J., Cohen F.E. Hydrogen bonds involving sulfur atoms in proteins // Proteins. 1991. - Vol. 9. - P. 99-107.

150. Armstrong K.M., Baldwin R.L. Charged histidine affects alpha-helix stability at all positions in the helix by interacting with the backbone charges // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1993.-Vol. 90.-P. 11337-11340.

151. Thanki N., Thornton J.M., Goodfellow J.M. Influence of secondary structure on the hydration of serine, threonine and tyrosine residues in proteins // Protein Eng. 1990. - Vol. 3. -P. 495-508.

152. Pearlman D.A., Case D.A., Caldwell J.C., Ross W.S., Cheatham Т.Е., Fergusson D.M., Seibel G.L., Chandra Singh U., Weiner P., Kollman P.A. AMBER 4.1 San Francisco: University of California, 1995.

153. Pal S.K., Peon J., Zewail A.H. Biological water at the protein surface: dynamical solvation probed directly with femtosecond resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. - Vol. 99. -P. 1763-1768.

154. Jeffrey G.A., Saenger W. Hydrogen bonding in biological structures Berlin ; New York: Springer-Verlag, 1991.

155. Edsall J.T., Wyman J. Biophysical chemistry New York: Academic Press, 1958.

156. Tsai C.S. An introduction to computational biochemistry New York: J. Wiley, 2002.

157. Taylor R., Kennard O. Hydrogen-bond geometry in organic crystals // Acc. Chem. Res. -1984.-Vol. 17. P. 320-326.

158. Finney J.L. Towards a molecular picture of liquid water // Biophysics of Water / ed. F. Franks. New York: John Wiley & Sons Ltd., 1982.

159. Feyereisen M.W., Feller D., Dixon D.A. Hydrogen bond energy of the water dimer // J. Phys. Chem. 1996. - Vol. 100. - P. 2993-2997.

160. Franks F. Water a comprehensive treatise //. New York: Plenum press, 1982: Vol. 7.

161. Bundi A., Wuthrich K. 1H-NMR parameters of the common amino acid residues measured in aqueous solutions of the linear tetrapeptides H-Gly-Gly-X-L-Ala-OH // Biopolymers. 1979. -Vol. 18.-P. 285-297.

162. Fiebig K.M., Schwalbe H., Buck M., Smith L.J., Dobson C.M. Toward a description of the conformations of denaturated states of proteins. Comparison of a random coil model with NMR measurements // J. Phys. Chem. 1996. - Vol. 100. - P. 2661-2666.

163. Osapay K., Case D.A. A new analysis of proton chemical shifts in protein // J. Am. Chem. Soc. 1991.-Vol. 113.-P. 9436-9444.

164. Serrano L. Comparison between the phi distribution of the amino acids in the protein database and NMR data indicates that amino acids have various phi propensities in the random coil conformation // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 254. - P. 322-333.

165. Vuister G.W., Bax A.J. Quantitative J correlation. A new approach for measuring homonuclear three-bond J(HNHa) coupling constants in 15N enriched proteins // J. Am. Chem. Soc. 1993. - Vol. 115. - P. 7772-7777.

166. Imoto T. Electrostatic free energy of lysozyme // Biophys J. 1983. - Vol. 44. - P. 293-298.

167. Dunfield L.G., Burgess A.W., Scheraga H.A. Energy parameters in polypeptides. 8. Empirical potential energy algorithm for the conformational analysis of large molecules // J. Phys. Chem. 1978. - Vol. 82. - P. 2609-2616.

168. Ashbaugh H.S., Paulaitis M.E. Entropy of hydrophobic hydration: extension to hydrophobic chains // J. Phys. Chem. 1996. - Vol. 100. - P. 1900-1912.

169. Sitkoff D., Sharp K.A., Honig B. Accurate Calculation of Hydration Free Energies Using Macroscopic Solvent Models // J. Phys. Chem. 1994. - Vol. 98. - P. 1978-1988.

170. Shoemaker K.R., Kim P.S., Brems D.N., Marqusee S., York E.J., Chaiken I.M., Stewart J.M., Baldwin R.L. Nature of the charged-group effect on the stability of the C-peptide helix // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985. - Vol. 82. - P. 2349-2353.

171. Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B. A theory of protein molecule self-organization. IV. Helical and irregular local structures of unfolded protein chains // J. Mol. Biol. 1976. - Vol. 103. - P. 15-24.

172. Finkelstein A.V. Theory of protein molecule self-organization. III. A calculating method for the probabilities of the secondary structure formation in an unfolded polypeptide chain // Biopolymers. 1977. - Vol. 16. - P. 525-529.

173. Finkelstein A.V. Electrostatic interactions of charged groups in water environment and their influence on the polypeptide chain secondary structure formation // Molek. Biol. (USSR). 1977. -Vol. 10. - P. 811-819.

174. Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B. Theory of protein molecule self-organization. I. Thermodynamic parameters of local secondary structures in the unfolded protein chain // Biopolymers. 1977. - Vol. 16. - P. 469-495.

175. Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B., Kozitsyn S.A. Theory of protein molecule self-organization. II. A comparison of calculated thermodynamic parameters of local secondary structures with experiments // Biopolymers. 1977. - Vol. 16. - P. 497-524.

176. Bierzynski A. Kim P.S., Baldwin R.L. A salt bridge stabilizes the helix formed by isolated C-peptide of RNase A // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982. - Vol. 79. - P. 2470-2474.

177. Kim P.S., Baldwin R.L. A helix stop signal in the isolated S-peptide of ribonuclease A // Nature. 1984. - Vol. 307. - P. 329-334.

178. Scholtz J.M., Baldwin R.L. The mechanism of alpha-helix formation by peptides // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1992. - Vol. 21. - P. 95-118.

179. Doig A.J. Recent advances in helix-coil theory // Biophys. Chem. 2002. - Vol. 101-102. -P. 281-293.

180. Creamer T.P., Rose G.D. Alpha-helix-forming propensities in peptides and proteins // Proteins. 1994. - Vol. 19. - P. 85-97.

181. Seale J.W. Srinivasan R., Rose G.D. Sequence determinants of the capping box, a stabilizing motif at the N- termini of alpha-helices//Protein Sci. 1994. - Vol. 3. - P. 1741-1745.

182. Munoz V., Blanco F.J., Serrano L. The hydrophobic-staple motif and a role for loop-residues in alpha- helix stability and protein folding // Nat. Struct. Biol. 1995. - Vol. 2. - P. 380385.

183. Prieto J., Serrano L. C-capping and helix stability: the Pro C-capping motif // J. Mol. Biol. -1997. Vol. 274. - P. 276-288.

184. Viguera A.R., Serrano L. Stable proline box motif at the N-terminal end of alpha-helices // Protein Sci. 1999. - Vol. 8. - P. 1733-1742.

185. Penel S., Morrison R.G., Mortishire-Smitli R.J., Doig A.J. Periodicity in alpha-Helix Lengths and C-Capping Preferences // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 293. - P. 1211-1219.

186. McGregor M.J., Islam S.A., Sternberg M.J. Analysis of the relationship between side-chain conformation and secondary structure in globular proteins // J. Mol. Biol. 1987. - Vol. 198. - P.295.310.

187. Chakrabartty A., Kortemme Т., Padmanabhan S., Baldwin R.L. Aromatic side-chain contribution to far-ultraviolet circular dichroism of helical peptides and its effect on measurement of helix propensities // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - P. 5560-5565.

188. Serrano L., Fersht A.R. Capping and alpha-helix stability // Nature. 1989. - Vol. 342. - P.296.299.

189. Munoz V., Serrano L. Intrinsic secondary structure propensities of the amino acids, using statistical phi-psi matrices: comparison with experimental scales // Proteins. 1994. - Vol. 20. -P. 301-311.

190. Swindells M.B., MacArthur M.W., Thornton J.M. Intrinsic phi, psi propensities of amino acids, derived from the coil regions of known structures //Nat. Struct. Biol. 1995. - Vol. 2. - P. 596-603.

191. Aurora R., Rose G.D. Helix capping // Protein Sci. 1998. - Vol. 7. - P. 21-38.

192. Kumar S., Bansal M. Dissecting alpha-helices: position-specific analysis of alpha-helices in globular proteins // Proteins. 1998. - Vol. 31. - P. 460-476.

193. Chakrabartty A., Schellman J.A., Baldwin R.L. Large differences in the helix propensities of alanine and glycine // Nature. 1991. - Vol. 351. - P. 586-588.

194. Viguera A.R., Serrano L. Experimental analysis of the Schellman motif // J. Mol. Biol. -1995.-Vol. 251. P. 150-160.

195. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features // Biopolymers. 1983. - Vol. 22. - P. 2577-2637.

196. Adams M.W. Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100 degrees С // Annu Rev Microbiol. 1993. - Vol. 47. - P. 627-658.

197. Chan M.K., Mukund S., Kletzin A., Adams M.W., Rees D.C. Structure of a hyperthermophilic tungstopterin enzyme, aldehyde ferredoxin oxidoreductase // Science. 1995. -Vol. 267.-P. 1463-1469.

198. Story R.M., Steitz T.A. Structure of the recA protem-ADP complex 11 Nature. 1992. - Vol. 355. - P. 374-376.

199. Karlin S., Weinstock G.M., Brendel V. Bacterial classifications derived from recA protein sequence comparisons // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 6881-6893.

200. Petukhov M., Yumoto N., Murase S., Onmura R., Yoshikawa S. Factors that affect the stabilization of alpha-helices in short peptides by a capping box // Biochemistry. 1996. - Vol. 35.-P. 387-397.

201. Roca A.I., Cox M.M. RecA protein: structure, function, and role in recombinational DNA repair // Prog. Nucleic Acid. Res. Mol. Biol. 1997. - Vol. 56. - P. 129-223.

202. Minton K.W. DNA repair in the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 13. - P. 9-15.

203. Baitin D.M., Zaitsev E.N., Lanzov V.A. Hyper-recombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa with enhanced activity of its primary DNA binding site // J. Mol Biol. -2003.-Vol. 328.-P. 1-7.

204. Zavodszky P., Kardos J., Svingor, Petsko G.A. Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - Vol. 95. -P. 7406-7411.

205. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура Ленинград: Наука, 1975.

206. Levy A.V., Montalvo A. The tunneling algorithm for the global minimization of functions // SIAM J. Sci. Stat. Comput. 1985. - Vol. 6. - P. 15-29.

207. Himmelblau D.M. Applied nonlinear programming New York,: McGraw-Hill, 1972.

208. Miele A., Huang H.Y., Heideman J.C. Sequential gradient-restoration algorithm for the minimization of constrained functions—Ordinary and conjugate gradient versions // Journal of Optimization Theory and Applications. 1969. - Vol. 4. - P. 213-243.

209. Petukhov M., Tatsu Y., Tamaki K., Murase S., Uekawa H., Yoshikawa S., Serrano L., Yumoto N. Design of stable alpha-helices using global sequence optimization // J Pept Sci. -2009. Vol. 15. - P. 359-365.

210. Hyun H.H., Zeikus J.G. General Biochemical Characterization of Thermostable Pullulanase and Glucoamylase from Clostridium thermohydrosulfuricum // Appl. Environ. Microbiol. -1985.-Vol. 49.-P. 1168-1173.

211. Natarajan S., Sierks M.R. Functional and structural roles of the highly conserved Trpl20 loop region of glucoamylase from Aspergillus awamori // Biochemistry. 1996. - Vol. 35. - P. 3050-3058.

212. Sauer J., Sigurskjold B.W., Christensen U., Frandsen T.P., Mirgorodskaya E., Harrison M., Roepstorff P., Svensson B. Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1543. - P. 275-293.

213. Bertoldo C., Antranikian G. Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - Vol. 6. - P. 151-160.

214. Aleshin A., Golubev A., Firsov L.M., Honzatko R.B. Crystal structure of glucoamylase from Aspergillus awamori var. XI00 to 2.2-A resolution // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 19291-19298.

215. Norouzian D., Akbarzadeh A., Scharer J.M. Moo Young M. Fungal glucoamylases // Biotechnol. Adv. 2006. - Vol. 24. - P. 80-85.

216. Liu H.L., Wang W.C. Predicted unfolding order of the 13 alpha-helices in the catalytic domain of glucoamylase from Aspergillus awamori var. XI00 by molecular dynamics simulations // Biotechnol. Prog. 2003. - Vol. 19. - P. 1583-1590.

217. Reilly P.J., Chen H.M., Bakir U., Ford C. Increased thermostability of Asnl82 --> Ala mutant Aspergillus awamori glucoamylase // Biotechnol. Bioeng. 1994. - Vol. 43. - P. 101-105.

218. Li Y., Reilly P.J., Ford C. Effect of introducing proline residues on the stability of Aspergillus awamori // Protein Eng. 1997. - Vol. 10. - P. 1199-1204.

219. Liu H.L., Wang W.C. Protein engineering to improve the thermostability of glucoamylase from Aspergillus awamori based on molecular dynamics simulations // Protein Eng. 2003. -Vol. 16. - P. 19-25.

220. Serrano L., Neira J.L., Sancho J., Fersht A.R. Effect of alanine versus glycine in alpha-helices on protein stability //Nature. 1992. - Vol. 356. - P. 453-455.

221. Kiefhaber Т., Baldwin R.L. Intrinsic stability of individual alpha helices modulates structure and stability of the apomyoglobin molten globule form // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 252.-P. 122-132.

222. Stelea S.D., Pancoska P., Benight A.S., Keiderling T.A. Thermal unfolding of ribonuclease A in phosphate at neutral pH: deviations from the two-state model // Protein Sci. 2001. - Vol. 10. - P. 970-978.