Трансмембранные градиенты одновалентных катионов и регуляция экспрессии генов миокинов при электростимуляции миотубул в культуре тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат наук Милованова Ксения Геннадьевна

• Милованова Ксения Геннадьевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Милованова Ксения Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физическая нагрузка как фактор изменения ионных градиентов

1.2 Изменение внутриклеточной концентрации натрия и калия как фактор регуляции транскрипции и трансляции

1.3 Мышечное сокращение - главный регулятор продукции миокинов

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследования

2.2 Дизайн исследования

2.3 Методы исследования

2.3.1 Оценка жизнеспособности клеток

2.3.2 Измерение содержания белка

2.3.3 Электростимуляция клеточной культуры

2.3.4 Измерение внутриклеточного №+ и К+

2.3.5 [Са2+] визуализация

2.3.6 Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг

2.3.7 Выделение РНК и анализ на микрочипах

2.3.8 Реактивы

2.4 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Регуляция концентрации одновалентных катионов при электростимуляции миотубул: кальций зависимые и независимые компоненты

3.2 Влияние электростимуляции миотубул на фосфорилирование регуляторных каскадов

3.3 Роль одновалентных катионов в регуляции транскрипции генов при

электростимуляции миотубул

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А Платформа Affymetrix для анализа экспрессии генов

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Гены, экспрессия которых активируется EPS в отсутствие

никардипина

ПРИЛОЖЕНИЕ В Гены, экспрессия которых ингибируется EPS в отсутствие

никардипина

ПРИЛОЖЕНИЕ Г Гены, экспрессия которых активируется EPS в отсутствие

и в присутствии никардипина

ПРИЛОЖЕНИЕ Д Гены, экспрессия которых ингибируется EPS в отсутствие

и в присутствии никардипина

ПРИЛОЖЕНИЕ Е Гены, экспрессия которых активируется как уабаином, так

и EPS посредством Ca2+ опосредованной сигнализации

ПРИЛОЖЕНИЕ Ж Гены, экспрессия которых ингибируется как уабаином,

так и EPS посредством Ca2+ опосредованной сигнализации

ПРИЛОЖЕНИЕ И Гены, экспрессия которых активируется как уабаином, так

и EPS посредством Ca2+ -независимой сигнализации

ПРИЛОЖЕНИЕ К Гены, экспрессия которых ингибируется как уабаином, так и EPS посредством Ca2+ -независимой сигнализации

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансмембранные градиенты одновалентных катионов и регуляция экспрессии генов миокинов при электростимуляции миотубул в культуре»

Актуальность темы исследования

В последнее десятилетие сформировалась концепуция, расматривающая скелетные мышцы как зависимый от физических упражнений эндокринный орган, секретирующий десятки цитокинов и регуляторных гликопротеинов, называемых миокинами по аналогии с адипокинами и гепатокинами, то есть белками, секретируемыми адипоцитами и гепатоцитами соответственно [58, 62, 109].

Миокины вовлекаются в межклеточную коммуникацию и являются важными элементом поддержания гомеостаза и адаптации организма к физической нагрузке [23]. Такая роль миокинов обеспечивается разнообразием их эффектов: миокины способны модулировать функцию клеток иммунной системы, локальный кровоток, энергетический метаболизм, процессы пролиферации и дифференцировки миобластов [24].

Значительные перспективы имеет исследование роли миокинов в коррекции различных расстройств. Показано изменение продукции миокинов при сахарном диабете [154, 57, 74], ожирении [110, 116, 20], остеопорозе [40, 68], а также при метаболических нарушениях [56]. Это позволяет рассматривать миокины как возможный механизм, через который реализуются терапевтические эффекты физической активности при различных заболеваниях. Выяснение этих механизмов раскрывает возможности эффективной комбинации режимов двигательной активности с различными методами фармакотерапии. Однако, несмотря на наличие большого числа исследований эндокринной функции мышц, молекулярные механизмы продукции миокинов при различных видах физической нагрузки остаются малоизученными.

Культивируемые клетки скелетных мышц, подвергнутые импульсной электростимуляции (EPS), широко используются в качестве модели тренировки скелетных мышц in vitro. Этот подход основан на том, что

миотубулы C2C12 обнаруживают выраженные сократительные ответы

9+

[28, 45, 105] и повторяющиеся переходные процессы [Ca ]i [45], запускаемые EPS. Кроме того, в дифференцированных миотубулах, полученных из скелетных мышц мышей линии клеток C2C12 EPS приводила к метаболическим и адаптационным изменениям, обнаруженных в свежеизолированных тренированных мышцах [28, 91]. Более того, в миотубулах C2C12 EPS запускает секрецию нескольких миокинов, зависимых от физических упражнений [28, 151, 90].

Степень разработанности темы исследования

Фактором, потенцирующим продукцию миокинов мышечной тканью, является мышечной сокращение [110]. По этой причине наибольшее распространение получила точка зрения, что Ca2+ -чувствительные протеинкиназы и фосфатазы и AMP-активированная протеинкиназа (AMPK) и передача сигналов, опосредованная фактором HIF-la, являются основными путями сопряжения возбуждения и транскрипции, способствующими

высвобождению миокинов при физических нагрузках [52]. Помимо запуска

2+

сокращения мышц, увеличение [Ca ]i с ~ 0,1 до 1 мкМ влияет на экспрессию сотен генов.

Однако в последнее время все больше фактов указывают на наличие кальций - независимых механизмов запуска продукции миокинов, среди которых наибольший интерес привлекает гипотеза о роли одновалентных катионов в регуляции транскрипции генов. В частности, показано, что длительное ингибирование Na+, K+ -АТФазы влияет на экспрессию множества генов в присутствии внеклеточных и внутриклеточных хелаторов Ca2+ [67] и ингибиторов Ca2+ -опосредованных сигнальных путей [134].

Известно, что физическая нагрузка сопровождается увеличением в скелетной мускулатуре соотношения [Na+]i/[K+]i. В исследованиях на гладкомышечных клетках было показано, что увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i является достаточным условием изменения транскрипции генов [67].

Все изложенное позволяет предположить, что наряду с кальций-зависимыми сигнальными путями, повышение отношения [Ыа+У[К+] так же вносит вклад в продукцию миокинов.

Таким образом, основная проблема, на решение которой направлено данное исследование, заключается в исследовании роли [Ыа+У[К+] чувствительных, Са2+ - независимых механизмов запуска продукции миокинов в скелетных мышцах.

Соответственно, в процессе работы проверялись две взаимосвязанные гипотезы:

- во-первых, оценивалась способность электростимуляции модулировать внутриклеточные концентрации одновалентных катионов, и изучался вклад кальций-независимых сигнальных путей в реализацию эффектов электростимуляции миотубул на внутриклеточную концентрацию №+ и К+;

- во-вторых, определялась роль одновалентных катионов в регуляции транскрипции генов при электростимуляции миотубул, включая гены, кодирующие основные миокины.

Цель: исследовать изменение концентрации одновалентных катионов и ее роль в регуляции экспрессии генов миокинов при электростимуляции миотубул в культуре.

Задачи:

1. Изучить влияние электростимуляции и ингибитора Ка+,К+-АТФазы уабаина на концентрацию одновалентных катионов в миотубулах С2С12;

2. Изучить влияние электростимуляции и модуляторов содержания ионов кальция на концентрацию одновалентных катионов в миотубулах С2С12;

3. Изучить влияние электростимуляции миотубул на фосфорилирование регуляторных каскадов основных факторов транскрипции;

4. Изучить роль одновалентных катионов в регуляции транскрипции генов при электростимуляции миотубул.

Научная новизна исследования

Впервые выполнено комплексное исследование изменения концентрации моновалентных катионов в культуре миотубул под воздействием импульсной электростимуляции и угнетения Na-K-АТФазы уабаином, а также роль этого процесса в регуляции транскрипции генов миокинов.

Впервые показано, что электростимуляция культивируемых миотубул C2C12 приводит к изменению трансмембранного градиента одновалентных катионов, увеличивая содержание Na+i на ~70% и уменьшая содержание K+i на 70%. При этом низкие концентрации уабаина не влияют на концентрацию [K+]i, но увеличивают концентрацию [Na+]i на 25%, тогда как высокие концентрации уабаина имитируют действие электростимуляции на концентрацию одновалентных катионов в миотубулах.

Впервые показано, что электростимуляция увеличивает чувствительность миотубул C2C12 к низким дозам уабаина.

Впервые показано, что электростимуляция миотубул C2C12 сопровождается ритмическими увеличениями концентрации [Ca2+], которые полностью блокируются никардипином. При этом никардипин не оказывает влияния на внутриклеточное содержание одновалентных катионов в контрольных миотубулах C2C12, а также прирост Na+i, вызванный их электростимуляцией.

Впервые показано, что электрическая импульсная стимуляция увеличивает фосфорилирование CREB, ATF-1, Akt, ERK и p38 MAPK без какого-либо воздействия на фосфорилирование ацетил-CoA-карбоксилазы и Unc-51-подобной киназы-1, активирующей аутофагию, то есть нижестоящих маркеров активации AMPK. В отличие от CREB, ATF-1 и MAPK, увеличение фосфорилирования Akt устранялось никардипином.

Впервые показано, что в миотубулах, подвергнутых электростимуляции, а также в миотубулах, подвергнутых приблизительно тому же самому повышению [Na+]i/[K+]i соотношения в присутствии уабаина, изменяется экспрессия 456 транскриптов, которые подразделяются на уабаин-чувствительные гены, дифференцированная экспрессия которых в подвергнутых электростимуляцией клетках происходит через Ca2+-независимые пути и Ca^-опосредованную сигнализацию.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты раскрывают целый ряд важных физиологических закономерностей, характеризующих диссипацию концентрации моновалентных катионов в культуре миотубул под воздействием импульсной электростимуляции и угнетения Na-K-АТФазы уабаином, а так же роль этого процесса в регуляции транскрипции генов миокинов.

Результаты диссертации могут быть внедрены в учебный процесс кафедры спортивно-оздоровительного туризма, спортивной физиологии и медицины факультета физической культуры Томского государственного университета. Полученные результаты будут использованы при преподавании курсов «Физиология», «Физиология спорта», «Биохимия».

Методология и методы исследования

Методология настоящего исследования основана на представлениях об эндокринной функции скелетных мышц, на концепции об активной роли мышечной ткани как регулятора физиологических функций организма.

Диссертационное исследование выполнено с использованием современных физиологических методов: культивирование миобластов, электростимуляция клеточных культур, определение концентрации ионов методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии, флуоресцентная микроскопия, определение РНК на массивах GeneChip MoGene 1.0 ST (Affymetrix, ThermoFisher Scientific), а также методов статистического анализа полученных результатов.

Исследование проводилось в соответствии с принципами Базельской декларации и было одобрено комиссией по биоэтике Биологического института Томского государственного университета (протокол № 32 от 02.12.2019).

Положения, выносимые на защиту

1. Электростимуляция культивируемых миотубул С2С12 приводит к увеличению содержания №+1 в клетках и уменьшению содержания К+^ высокие концентрации уабаина имитируют действие электростимуляции. Никардипин полностью блокирует колебания [Са ], вызванные электростимуляцией, не влияя на внутриклеточное содержание одновалентных катионов в контрольных миотубулах С2С12, а также прирост [Ыа+]ь вызванный их электростимуляцией;

2. В миотубулах, подвергнутых электростимуляции, а также в миотубулах, подвергнутых приблизительно тому же самому повышению [№+] / [К+] соотношения в присутствии уабаина, изменяется экспрессия 456 транскриптов, которые подразделяются на уабаин-чувствительные гены, дифференцированная экспрессия которых в подвергнутых электростимуляцией клетках происходит через Са2+-независимые пути и Са2+-опосредованную сигнализацию.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов определяется высоким методическим уровнем исследования, использованием современного оборудования, корректным формированием исследуемых групп и использованием методов статистического анализа. Все оборудование, применяемое в работе, имело необходимые сертификаты и своевременно проходило поверку, подбор групп для исследования выполнялся методом рандомизации и в соответствии с критерием репрезентативности. Методы статистического анализа полностью соответствовали размерам выборок и характеру распределения экспериментальных данных.

Основные результаты проведенных исследований по теме диссертации обсуждены на всероссийских и международных конференциях и съездах: 42nd FEBS Congress «From Molecules to Cells and Back» (Jerusalem, Israel, 2017); «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2017); XXIII съезд Физиологического общества имени И.П. Павлова (Воронеж, 2017); «Olympic sport and sport for all» (Tbilisi, 2018); 8th international congress of pathophysiology (Bratislava, Slovakia, 2018); 43rd FEBS Congress «Biochemistry Forever» (Prague, Czech Republic, 2018); «Нейронаука для медицины и психологии» (Крым, Судак, 2018, 2019, 2020); «Инновационные преобразования в сфере физической культуры, спорта и туризма» (Ростов-на-Дону, 2019); VI съезд физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2019); «Skeletal muscle research - from cell to human» (Ljubljana, Slovenia, 2019).

Публикации по теме диссертации:

По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 7 статей в журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук (из них 4 статьи в зарубежных научных журналах, входящих в Web of Science, 3 статьи в российских научных журналах, входящих в Web of Science, 1 статья в российском научном журнале, входящем в Pubmed), 1 статья в сборнике материалов конференции, представленном в издании, входящем в Web of Science, 1 монография (в соавторстве), 11 публикаций в сборниках материалов международных и всероссийских научных и научно-практической конференций, конгрессов, форума, съезда.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Автором разработано теоретическое обоснование подходов к исследованию динамики ионных градиентов в культуре миотубул с использованием импульсной электростимуляции, сформулированы цель и

задачи, разработан дизайн исследования. Самостоятельно выполнены экспериментальные исследования, проведена статистическая обработка результатов исследования, их научный анализ и обсуждение, сформулированы выводы и положения, выносимые на защиту.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка условных обозначений и сокращений, списка литературы (157 источников, из них 151 на иностранном языке), девяти приложений. В работе содержится 2 таблицы и 20 рисунков. Объем работы составляет 110 страниц.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физическая нагрузка как фактор изменения ионных градиентов

Длительное возбуждение скелетных мышц приводит к изменению трансмембранного градиента одновалентных катионов за счет притока Ка+ через потенциал-зависимые натриевые каналы (Кау), что, в свою очередь,

приводит к деполяризации и выходу К+ через потенциал зависимые К+-

2+ _1_ каналы (Ку) и Са -активируемые К каналы (КСа) (рисунок 1) [60].

2+-

1 - потенциал-зависимые №+-каналы; 2 - К+-каналы; 3 - потенциал-зависимые Са канала L-типа; 4 - канала выхода Са из саркоплазматического ретикулума (SR); 5 -Ка+/К+-АТФаза, 6 - Ка+/Са2+ обменник; 7 - Са2+-АТФаза; Ет

- электрическии

мембранный потенциал [101] Рисунок 1 - Основные транспортеры ионов, участвующие в сопряжении возбуждения и сокращения в скелетных мышцах

Как у человека, так и у экспериментальных животных интенсивные физические упражнения способствуют увеличению [Ка+] в 3-4 раза и

уменьшению [К+] до 50% в скелетных мышцах за счет активации ионных каналов, а также путем частичной инактивации №+, К+- АТФазы. Выход К+ из мышечных клеток во время упражнений приводит к повышению [К+] в интерстициальной жидкости скелетных мышц от 4 до 5 до 11-15 мМ. У людей интенсивные динамические и статические упражнения приводят к 2-кратному повышению уровня [К+] в венозной крови из-за его выхода из скелетных мышц, то есть основного источника внутриклеточного К+ [30, 79, 80, 88, 132].

1.2 Изменение внутриклеточной концентрации натрия и калия как фактор регуляции транскрипции и трансляции

В ряде работ было показано [97, 144], что диссипация электрохимических градиентов одновалентных катионов, вызванная ингибированием №+, К+- АТФазы, приводит к активации с-БОБ и других Ш^, а также фактора роста опухоли в, легких цепи миозина, актина скелетных мышц, атриального натрийуретического фактора и морталина. Используя технологию Affymetrix, сравнили эффекты ингибиторов №+,К+-АТФазы на транскриптомы сосудистых гладкомышечных клеток крысы (КУБЫС), эндотелиальных клеток пупочной вены человека (НЦУЕС) и клеточную линию аденокарциномы человека (клеточная линия НеЬа). Было обнаружено, что устойчивое повышение внутриклеточного соотношения [№+У[К+] приводит к изменению экспрессии набора генов, специфичных для каждого типа клеток [67]. Можно предположить, что это явление вызвано увеличением [Са2+] и активацией Са2+-чувствительных путей. Чтобы установить, зависят ли изменения экспрессии генов от увеличения [Са2+]1, были выполнены эксперименты в безкальциевых средах, дополненных внеклеточными (ЭГТА) и внутриклеточными (ВАРТА) хелаторами

Са2+.

Однако в этих условиях зафиксировали увеличение, а не уменьшение количества как общих, так и специфичных для разных типов клеток №+1/К+1 -

зависимых генов. Эти результаты позволяют предположить, что транскриптомные изменения, вызванные подъемом соотношения [Ка+]1/[К+]1, по крайней мере, частично опосредованы Са2+ -независимым механизмами.

Полномасштабное ингибирование Ка+,К+-АТФазы путем 3-х часовой инкубации ЯУБМС в безкалиевой среде, привела к повышению [№+] и снижению [К+] соответственно в ~7 и 10 раз. Такое же повышение соотношения [№+У[К+] наблюдалось после 3 ч ингибирования №+,К+-

АТФазы, вызванного добавлением 3 мМ уабаина. Так же было показано, что Са2+

- истощение, вызванное добавлением 50 мМ ЭГТА и 10 мМ ВАРТА-АМ к безкальциевой среде, приводило к повышению [№+] и уменьшению [К+]

в ~3 и 2 раза соответственно. Отмечался ~3-кратный прирост скорости входа

22 + № и ~2-кратное повышение проницаемости ЯУБМС для К , измеренное,

как скорость притока 86ЯЬ в присутствии ингибиторов №+,К+-насоса (уабаин)

и №+,К+ 2С1- - котранспорта (буметанид). Небольшой прирост уабаин-

чувствительного притока 86ЯЬ, вероятно, опосредован подъемом [№+] и

активацией Ка+,К+-АТФазы. Так же можно отметить, что истощение Са2+

привело к почти полному ингибированию №+, К+, 2С1- - котранспорта,

измеренного как устойчивая к уабаину, чувствительная к буметаниду

компонента скорости притока 86ЯЬ. Эти результаты согласуются с данными

об активации этого обменника внутриклеточным

Са2+[129] и его

ингибировании в присутствии ЭГТА [101].

+ + 22 Интересно, что ни соотношение [№ ]1/[К ]1, ни скорость входа № не

изменились после 3-х часовой инкубации в среде без Са2+, не имеющей ЭГТА

и ВАРТА-АМ. Оба параметра резко увеличивались после добавления

внеклеточного

Са2+

-хелатора ЭГТА. В отличие от ЭГТА, внутриклеточный

Са2+

-хелатор ВАРТА-АМ не оказывал никакого влияния на базовый вход

22 ~ь ~ь

№ и соотношение [№ ]/[К ]1, а также на их прирост, вызванный ЭГТА.

Эти результаты свидетельствуют, что увеличение проницаемости для

одновалентных катионов опосредовано удалением кальция, связанного с

внешней поверхностью плазматической мембраны [66].

Общее число транскриптов с выраженными изменениями в RVSMC, инкубируемых в течение 3 ч в безкалиевой среде, или в присутствии Ca2+-хелаторов, составило 3677 и 4610, соответственно. Оба воздействия увеличили до ~25 раз и уменьшили до 8 раз содержание 1281 и 711

транскриптов соответственно. Дальнейший анализ показал высокую

12 2 достоверность (Р <10- ) и положительную (R>0,51) корреляцию между

уровнями измененных транскриптов, идентифицированных в клетках,

подвергнутых ингибированию Na+, ^-АТФазы в среде без K+ или в среде без

Ca2+, содержащей внеклеточные и внутриклеточные хелаторы Ca2+[66].

75% из 41 гена, экспрессия которых повышается в присутствии Ca2+ хелаторов, также подвергались повышенной экспрессии в среде без K+. Список генов, экспрессия которых резко активизируется обоими факторами, дополнился генами, участвующими в регуляции транскрипции, такими как цАМФ- зависимый фактор транскрипции Atf3, белки раннего ответа Egr1, Egr2 и Egr3, белки группы A Nr4a1, Nr4a2 и Nr4a3, белок немедленного раннего ответа ler2, Hey2, Mafk, Jun-B и Hes1, репрессор Snai1, корегулятор транскрипции Btg2 и транскрипт, индуцируемый повреждением ДНК, Ddit. Так же отмечалось повышение уровня мРНК, кодирующей натрийуретический пептид B-типа Nppb, сигнальные белки (протеинкиназа Trib3, серин / треонин-протеинкиназа Plk2; регулятор передачи сигналов G-protein Rgs2, инозит-трифосфат-3-киназа C Itpkc) и белки, участвующие в регуляции клеточных циклов роста и дифференцировки (фактор ингибирования лейкемии Lif, ингибитор циклинзависимой киназы Cdkn1a, белок, индуцируемый повреждением ДНК Gadd45a, белок суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Tnfsf18) [66].

Для уточнения роли повышения соотношения [Na+]i/[K+]i в регуляции экспрессии генов, вызванной истощением

Ca2+,

проводилась инкубация

RVSMC в контрольной среде с высоким Na+, низким K+ и искусственной среде с высоким K+, низким Na+. Диссипация трансмембранных градиентов моновалентных катионов в среде с высоким K+, низким Na+ полностью

нивелировала действие ЭГТА на внутриклеточное содержание Na+ и K+. На основании этих данных, использовали цепную реакцию полимеризации в реальном времени (Real-Time PCR) для сравнительного анализа действия ЭГТА на экспрессию Atf3, Nr4a1 и Erg3 в контроле и среде с высоким содержанием K+, низким Na+. Прирост содержания мРНК в этих генах, наблюдаемый в RVSMC, обработанном ЭГТА, в контрольной среде с низким K+ и высоким Na+, отсутствовал в клетках, обработанных ЭГТА в среде с высоким K+ и низким Na+ [66].

Полученные данные показывают, что транскриптомные изменения в Са -обедненных RVSMC, по крайней мере, частично вызваны повышением [Na+]i/[K+]i соотношения и активацией Са2+-независимого [Na+]i/[K+]i-опосредованного механизма связи возбуждения-транскрипции [53, 67, 100, 145].

Истощение Ca2+ привело к увеличению в 3 раза [Na+]i и 2-кратному ослаблению [K+]i. Это наблюдение согласуется с резким повышением [Na+]i, вызванным добавлением 3,5 мМ ЭГТА в сперму человека, нагруженную флуоресцентным №+-индикатором, который был полностью устранен при добавлении внеклеточного Ca2+ и Mg2+ в микромолярном и миллимолярном диапазоне, соответственно [147].

Список генов, у которых содержание мРНК было увеличено в

Ca2+ -

обедненных клетках более чем в 4 раза, во многом совпадал со списком генов, экспрессия которых изменялась при ингибировании Na +, K + -АТФазы в среде без K+.

Была показана высокодостоверная положительная корреляция в содержании мРНК 2071 гена, экспрессия которых была изменена более чем в 1,2 раза как в Ca2+-обедненных клетках, так и при ингибировании Na +, K + -АТФазы в среде без K+.

Выравнивание трансмембранных градиентов Na+ и K+ в среде с высоким K+ и низким Na+ устраняет увеличение отношения [Na+]i/[K+]i, а

также резкое повышение содержания мРНК Atf3, Nr4a1 и Erg3, вызванное 3-

часовой инкубацией VSMC в среде без Ca , содержащей ЭГТА.

Приводимые данные убедительно свидетельствуют о том, что

увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i, наблюдаемое в Са2+-обедненных

клетках, вызвано повышением проницаемости плазматических мембран для

моновалентных катионов. Действительно, было показано, что в клетках

гладких мышц пупочной вены крыс истощение Са2+ привело к почти 322 86

кратному повышению скорости притока Na и Rb, измеренного в присутствии ингибиторов Na+, К+-АТФазы и Na+, K+, 2Cl- - котранспорта. Так же важно отметить, что повышенная проницаемость моновалентных катионов, наблюдаемая в Ca2+-обедненных клетках, вероятно, вызвана ослаблением внеклеточного, а не внутриклеточного Ca2+. Действительно, в отличие от внеклеточного Са2+-хелатора ЭГТА, ни [Na+]i/[K+]i соотношение, ни проницаемость для

Na+

не влияли на Са2+-свободную среду без хелаторов

Са2+,

а также при добавлении внутриклеточного Са - хелатора BAPTA-Am в покое.

Было показано, что в отсутствие внеклеточного Ca2+ потенциал-зависимые каналы T-типа проницаемы для Na+ [141]. Такое же явление было обнаружено и при изучении проницаемости pH-чувствительных

Ca2+-

каналов [29], Ca -зависимых Ca каналов (CRAC) [41,82], а также каналов транзиторного рецепторного потенциала (TRPM4, TRPM6, TRPM7). С использованием клеток базофильного лейкоза крыс показано, что в среде без Ca2+ каналы CRAC проницаемы для Li+ и Rb+ [14]. В астроцитах и фибробластах 3T3 ослабление [Ca2+]o и [Mg2+]o активируют гемиканалы коннексина, проницаемые для низкомолекулярных красителей, АТФ и NAD+[25,140]. Относительный вклад этих ионных транспортеров в повышение проницаемости плазматических мембран для Na+ и К+, зарегистрированной в Ca - обедненном RVSMC, остается неизвестным.

Таким образом, можно заключить, что устойчивые транскриптомные изменения, вызванные истощением Ca2+ в присутствии внеклеточного Ca2+-

хелатора ЭГТА, по меньшей мере, частично опосредованы повышением соотношения [Ка+]/[К+] и активацией Са2+1-независимого [Ка+У[К+] -опосредованного механизма связи возбуждения-транскрипции.

Было показано, что устойчивое ингибирование Ка+, К+ -АТФазы приводит к резкому увеличению мРНК, кодирующих фактор роста эндотелия 1 (Е§г1), фактор активирующий транскрипцию 3 (А1£3), подсемейство ядерных рецепторов группы 1 (№4а1) и простагландин-эндопероксидсинтазу 2 (Р1§б2) [134].

Используя два независимых подхода для ингибирования №+, К+ -АТФазы (уабаин и безкалиевая среда), авторы зарегистрировали очень значительную положительную корреляцию с ростом содержания мРНК. Это свидетельствует, что выявленные изменения вызваны повышением соотношения [Ыа+У[К+У а не изменением содержания №1+ или К1+ по отдельности. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что усиленная транскрипция №4а1 и обусловлена усиленным притоком

Са2+ через управляемые напряжением каналы Са2+ Ь-типа и активацией

Са2+/СаМ

-зависимых протеинкиназ (Р1§б2) и протеинфосфатаз (№4а1) (рисунок 2). В пользу этой гипотезы так же свидетельствует целый ряд имеющихся данных.

Во-первых, повышенное содержание мРНК №4а1 и Р1§б2, индуцированное ингибированием №+, К+ -АТФазы под действием уабаина

или безкалиевой среды, угнеталось в ЯУБМС в присутствии

2_|_

внутриклеточного

Са2+

-хелатора ВАРТА и в безкальциевой инкубационной среде. Во-вторых, показано, что уабаин увеличивал скорость входа 45Са2+, чувствительного к никардипину, но не к соединению КВ-Я7943, демонстрируя тем самым активацию потенциал-зависимых Са2+-каналов Ь-типа, а не Ка /Са -обменника [134].

Важно отметить, что добавление никардипина приводило к ослаблению прироста содержания мРНК №4а1 и Р1§б2, индуцируемого уабаином [134].

В-третьих, А7 и '-7 в качестве наиболее сильных антагонистов СаМ резко ослабили прирост содержания мРНК №4а1 и в ЯУБМС,

обработанных уабаином [134].

В-четвертых, ингибитор Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы СаМК11 соединение КК-93 и Са /кальмодулин-зависимой протеинфосфатазы кальцинейрина циклоспорин А резко снижали уабаин-зависимые приросты транскрипции и №4а1 соответственно [134].

В совокупности, приведенные выше данные убедительно свидетельствуют о том, что диссипация трансмембранного градиента одновалентных катионов, вызванная ингибированием Ка+, К+ -АТФазы, увеличивает транскрипцию и №4а1 посредством СаМКП-

опосредованного фосфорилирования СЯЕВ и кальцинейрин-опосредованного дефосфорилирования ОТАТ, соответственно (рисунок 2). Диссипация трансмембранного градиенты одновалентных катионов, вызванная ингибированием Ка+, К+-АТФазы (1) или другими стимулами приводит к деполяризации плазматической мембраны, активации потенциал зависимых Са2+ каналов (2), повышению [Са2+] и его взаимодействию с кальмодулином

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Милованова Ксения Геннадьевна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки: в 3 томах / Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис, А. В. Дюба, Б. П. Копнин, М. Рэфф, П. Уолтер, А. Светлов - М., Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», Институт компьютерных исследований. - 2013. - С. 881-885.

2. Покровский В. М. Физиология человека / В. М. Покровский. - М.: Медицина, 2003. - 664 с.

3. Северин Е. С. Биохимия / Е. С. Северин. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. -

779 с.

4. Симбирцев А. С. Цитокины: классификация и биологические функции / А. С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т. 3 (2). -С. 16-22.

5. Шишкин С. С. Миостатин и другие биохимические факторы, регулирующие рост мышечной ткани у человека и ряда высших позвоночных / С. С. Шишкин // Успехи биологической химии. - 2004. - Т. 44. - С. 209-262.

6. Щербаков В. И. Роль миокинов в регуляции энергетического обмена / В. И. Щербаков, Г. А. Скосырева, Т. И. Рябичев // Бюллетень сибирской медицины. - 2012. - Т. 11 (3). - С. 173-178.

7. Abramochkin D. V. Inhibition of the cardiac ATP-dependent potassium current by KB-R7943 / D. V. Abramochkin, M. Vornanen // Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. -2014. - Vol. 175. - P. 38-45.

8. Akimova O. A. Critical role of the a1-Na+,K+-ATPase subunit in insensitivity of rodent cells to cytotoxic action of ouabain / O. A. Akimova, A. M. Tverskoi, L. V. Smolyaninova, O. D. Lopina, N. O. Dulin, S. N. Orlov // Apoptosis. - 2015. - Vol. 20. - P. 1200-1210.

9. Alderton W. K. Nitric oxide synthases : structure, function and inhibition / W. K. Alderton, C.E. Cooper, R. G. Knowles // Biochemical Journal. - 2001. -Vol. 615. - P. 593-615.

10. Allen D. L. Expression and function of myostatin in obesity, diabetes, and exercise adaptation / D. L. Allen, D. S. Hittel, A. C. McPherron // Medicine & Science in Sports & Exercise. - 2011. - Vol. 43 (10). - P. 1828-1835.

11. Amorium F. Effects of whole-boody heat accilimation on cell injury and cytokine responses in perpheral blood mononuclear cells / F. Amorium, P. Yamada, R. Robergs, S. Schneider, P. Moseley // European Journal of Applied Physiology. - 2011. - Vol. 111 (8). - P. 1609-1618.

12. Asea A. HSP70 stimulates cytokine production through aCD14-dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine / A. Asea, S. K. Kraeft, E. A. Kurt-Jones, M. A. Stevenson, L. B. Chen, R. W. Finberg, G. C. Koo, S. K. Calderwood // Nature Medicine. - 2000. -Vol. 6. - P. 435-442.

13. Ausin L. Stimulation of myoblast proliferation in culture by leukaemia inhibitory factor and other cytokines / L. Austin, A.W. Burgess // Journal of the Neurological Sciences. - 1991. - Vol. 101 (2). - P. 193-197.

14. Bakowski D. Monovalent cation permeability and Ca2+block ofthe store-operated Ca2+current ICRAC in rat basophylic leukemia cells / D. Bakowski, A. B. Parekh // Pfluger Arch. - European Journal of Physiology. -2002. - Vol. 443. - P. 892-902.

15. Barlow C. A. Excitation-transcription coupling in smooth muscle / C. A. Barlow, P. Rose, R. A. Pulver-Kaste, K.M. Lounsbury // The Journal of Physiology. - 2006. - Vol. 570. - P. 59-64.

16. Bauer N. Ouabain-like compound changes rapidly on physical exercise in humans and dogs: effects of b-blockage and angiotensin-converting enzyme inhibition / N. Bauer, J. Muller-Ehmsen, U. Kramer, N. Hambarchian, C. Zobel, R. H. Schwinger, H. Neu, U. Kirch, E. G. Grunbaum, W. Schoner // Hypertension. - 2005. - Vol. 45. - P. 1024-1028.

17. Bednar M. DNA microarray technology and application / M. Bednar // Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. - 2000. - Vol. 6 (4). - P. 796-800.

18. Besse-Patin A. Effect of endurance training on skeletal muscle myokine expression in obese men: identification of apelin as a novel myokine / A. BessePatin, E. Montastier, C. Vinel, I. Castan-Laurell, K. Louche, C. Dray, D. Daviaud, L. Mir, M. A. Marques, C. Thalamas, P. Valet, D. Langin, C. Moro, N. Viguerie // International Journal of Obesity. - 2014. - Vol. 38. - P. 707-713.

19. Billman G. E. KB-R7943. Kanebo / G. E. Billman // Current opinion in investigational drugs. - 2001. - Vol. 2. - P. 1740-1745.

20. Bluher S. Effects of a 1-year exercise and lifestyle intervention on irisin, adi-pokines, and inflammatory markers in obese children / S. Bluher,

G. Panagiotou, D. Petroff, J. Markert, A. Wagner, T. Klemm, A. Filippaios, A. Keller, C. S. Mantzoros // Obesity. - 2014. - Vol. 22 (7). - P. 1701-1708.

21. Borish L. C. Cytokines and chemokines / L. C. Borish, J.W. Steinke // The Journal of Allergy and Clinical Immunology. - 2003. - Vol. 111 (2). - P. 460475.

22. Broholm C. Exercise induces expression of leukaemia inhibitory factor in human skeletal muscle / C. Broholm, O.H. Mortensen, S. Nielsen, T. Akerstrom, A. Zankari, B. Dahl, B. K. Pedersen // The Journal of Physiology. - 2008. - Vol. 586 (8). - P. 2195-2201.

23. Broholm C. Leukaemia inhibitory factor - An exercise-induced myokine / C. Broholm, B.K. Pedersen // Exercise Immunology Review. - 2010. - Vol. 16. -P. 77-85.

24. Broholm C. LIF is a contraction-induced myokine stimulating human myocyte proliferation / C. Broholm, M. J. Laye, C. Brandt, R. Vadalasetty,

H. Pilegaard, B. K. Pedersen, C. Scheele // Journal of Applied Physiology. - 2011. - Vol. 111 (1). - P. 251-259.

25. Bruzzone S. Connexin 43hemichannels mediate Ca2+-regulated transmembrane NAD+fluxes in intact cells / S. Bruzzone, L. Guida, E. Zocchi, L. Franco, A. De Flora // FASEB Journal. - 2001. - Vol. 15. - P. 10-12.

26. Buford T. W. Resistance exercise-induced changes of inflammatory gene expression within human skeletal muscle / T. W. Buford, M. B. Cooke,

D. S. Willoughby // European Journal of Applied Physiology. - 2009. -Vol. 107. - P. 463-471.

27. Bumgarner R. Overview of DNA microarrays: types, applications and their future / R. Bumgarner // Current Protocols in Molecular Biology. - 2013. -Chapter 22 - Unit 22.1.

28. Burch N. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle / N. Burch, A. S. Arnold, F. Item, S. Summermatter, S. S. Brochmann, M. Christe, U. Boutellier, M. Toigo, C. Handschin // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - P. 10970.

29. Cain. K. Physiological concentrations of K+inhibit cytochrome c-dependent formation of the apoptosis some / K. Cain, C. Langlais, X. M. Sun, D. G. Brown, G. M. Cohen // Journal of Biological Chemistry. - 2001. -Vol. 276. - P. 41985-41990.

30. Cairns S. P. Do multiple ionic interactions contribute to skeletal muscle fatigue? / S. P. Cairns, M.I. Lindinger // The Journal of Physiology. - 2008. -Vol. 586. - P. 4039-4054.

31. Cao J. Cap-dependent translation initiation factor, eIF4E, is the target for ouabain-mediated inhibition of HIF-1a / J. Cao, L. He, G. Lin, C.Hu, R.Dong, J. Zhang, H. Zhu, Y. Hu, C. R. Wagner, Q. He, B. Yang // Biochemical Pharmacology. - 2014. - Vol. 89. - P. 20-30.

32. Carroll C. C. The influence of acute resistance exercise on cyclooxygenase-1 and -2 activity and protein levels in human skeletal muscle / C.C. Carroll, D. T. O'Connor, R. Steinmeyer, J. D. Del Mundo, D. R. McMullan, J. A. Whitt, J. E. Ramos, R. J. Gonzales // American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. - 2013. - Vol. 305 (1). -P. 24-30.

33. Catoire M. Identification of human exercise-induced myokines using secretome analysis / M. Catoire, M. Mensink, E. Kalkhoven, P. Schrauwen, S. Kersten // Physiological Genomics. - 2014. - Vol. 46 (7). - P. 256-267.

34. Catoire M. Fatty acid-inducible ANGPTL4 governs lipid metabolic response to exercise / M. Catoire, S. Alex, N. Paraskevopulos, F. Mattijssen, Gogh I Evers-van, G. Schaart, J. Jeppesen, A. Kneppers, M. Mensik, P. J. Voshpol, G. Olivecrona, N. S. Tan, M. K. C. Hesselink, J. F. Berbee, P. C. N. Rensen, E. Kalkhoven, P. Schrauwen, S. Kersten // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2014. - Vol. 111. - P. 1043-1052.

35. Cocks M. Sprint interval and endurance training are equally effective in increasing muscle microvascular density and eNOS content in sedentary males / M. Cocks, C. S. Shaw, S. O. Shepherd, J. P. Fisher, A. M. Ranasinghe, T. A. Barker, K. D. Tipton, A. J. Wagenmakers // The Journal of Physiology. -2013. - Vol. 591 (3). - P. 641-656.

36. Coffey V. G. The Molecular Bases of Training Adaptation / V. G. Coffey, J. A. Hawley // Sports Medicine. - 2007. - Vol. 37. - P. 737-763.

37. Cohen T. Interleukin 6 induces the expression of vascular endothelial growth factor / T. Cohen, D. Nahari, L. W. Cerem, G. Neufeld, B. Z. Levi // Journal of Biological Chemistry. - 1996. - Vol. 271. - P. 736-741.

38. Curtis-Prior P. The Eicosanoids / P. Curtis-Prior. - Wiley, 2004. - 654 p.

39. Danilov K. Electrical pulse stimulation decreases electrochemical Na+ and K+ gradients in C2C12 myotubes / K. Danilov, S. V. Sidorenko, K. Milovanova, E. A. Klimanova, L. V. Kapilevich, S. N. Orlov // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2017. - Vol. 493. - P. 875-878.

40. Datta N. S. Muscle-bone and fat-bone interactions in regulating bone mass: do PTH and PTHrP play any role? / N. S. Datta // Endocrine. - 2014. -Vol. 47. - P. 389-400.

41. DeHaven W. I. Calcium inhibition andcalcium potentiation of Orai1, Orai2, and Orai3 calcium release-activated calcium channels / W. I. DeHaven, J. T. Smyth, R. R. Boyles, J. W. Putney // Journal of Biological Chemistry. - 2007. - Vol. 282. - P. 17548-17556.

42. Dominguez-Rodriguez A. The other side of cardiac signaling: transcriptional control / A. Dominguez-Rodriguez, G. Ruiz-Hurtado, J.-P. Benitah, A. M. Goez // Frontiers in Physiology. - 2012. - Vol. 3. - P. 452.

43. Dulhunty A. F. Core skeletal muscle ryanodine receptor calcium release complex / A. F. Dulhunty, L. Wei-LaPierre, M. G. Casarotto // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. - 2017. - Vol. 44. - P. 44533.

44. Egan B. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation / B. Egan, J. R. Zierath // Cell Metabolism. - 2013. - Vol. 17. -P. 162-184.

45. Fujita H. Accelerated de novo sarcomere assembly by electric pulse stimulation in C2C12 myotubes / H. Fujita, T. Nedachi, M. Kanzaki // Experimental Cell Research. - 2007. - Vol. 313. - P. 1853-1865.

46. Garaizar J. DNA microarray technology: a new tool for the epidemiological typing of bacterial pathogens? / J. Garaizar, A. Rementeria, S. Porwollik // FEMS immunology and medical microbiology. - 2006. - Vol. 47 (2). - P. 178-189.

47. Gibson O. R. Extracellular Hsp72 concentration relates to a minimum endogenous citeria during exercise-heat exposure / O. R. Gibson, A. Dennis, T. Parfitt, L. Taylir, P. W. Watt, N. S. Maxwell // Cell Stress Chaperones. -2014. - Vol. 19. - P. 389-400.

48. Gjevestad G. O. Gene expression is differentally regulated in skeletal muscle and circulating immune cells in response to an acute bout of high-load strength exercise / G. O. Gjevestad, H. Hamarsland, T. Raastad, I. Ottestad, J. J. Christensen, K. Eckardt, C. A. Drevon, A. S. Biong, S. M. Ulven, K. B. Holven // Genes & Nutrition. - 2017. - Vol. 12 (8). - P. 1-11.

49. Gonzales A. L. Endogenous cytosolic Ca2+ buffering is necessary for TRPM4 activity in cerebral artery smooth muscle cells / A. L. Gonzales, S. Earley // Cell Calcium. - 2012. - Vol. 51 (1). - P. 82-93.

50. Graff J.Epigenetic regulation of gene expression in physiological and pathological brain processes / J. Graff, D. Kim, M. M. Dobbin, L-H. Tsai // Physiological Reviews. - 2011. - Vol. 91. - P. 603-649.

51. Greve J. M. Functional electrical stimulation (FES): muscle histochemical analysis / J. M. Greve, R. Muszkat, B. Schmidt, J. Chiovatto, T. E. Barros Filho, L. R. Batisttella // Paraplegia. - 1993. - Vol. 31 (12). - P. 764770.

52. Gundersen K.Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise / K. Gundersen // Biological Reviews. - 2011. -Vol. 86. - P. 564-600.

53. Haloui M. Na+i-induced c-Fos expression is not mediated by activation of the 50-promoter containing known transcriptional elements / M. Haloui, S. Taurin, O. A. Akimova, D.-F. Guo, J. Tremblay, N. O. Dulin, P. Hamet, S. N. Orlov // FEBS Journal. - 2007. - Vol. 274. - P. 3257-3267.

54. Hawke T. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology / T. J. Hawke, D. J. Garry // Journal of Applied Physiology. - 2001. - Vol. 91. -P. 534-551.

55. Heizmann C. W. Intracellular calcium-binding proteins: more sites than insights / C. W. Heizmann, W. Hunziker // Trends in Biochemical Sciences. -1991. - Vol. 16. - P. 98-103.

56. Henriksen T. Myokines in myogenesis and health / T. Henriksen, C. Green, B. K. Pedersen // Recent Patents on Biotechnology. - 2012. - Vol. 6 (3). - P. 167-171.

57. Huh J. Y. Irisin in response to exercise in humans with and without metabolic syndrome / J. Y. Huh, A. Siopi, V. Mougios, K. H. Park, C. S. Mantzoros // The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. -2015. - Vol. 100. - P. 453-457.

58. Iizuka K. Skeletal muscle is an endocrine organ / K. Iizuka, T. Machida, M. Hirafuji // Journal of Pharmacological Sciences. - 2014. - Vol. 125 (2). -P. 125-131.

59. Jennings M. D. eIF5 is a dual function GAP and GDI for eukaryotic translational control / M. D. Jennings, G. D. Pavitt, F. Lehmann-Horn // Small GTPases. - 2010. - Vol. 1. - P. 118-123.

60. Jurkat-Rott K. Ion channels and ion transporters of the transverse tubular system of skeletal muscle / K. Jurkat-Rott, M. Fauler // Journal of Muscle Research and Cell Motility. - 2006. - Vol. 27. - P. 275-290.

61. Kainulainen H. Myostatin/activin blocking combined with exercise reconditions skeletal muscle expression profile of mdx mice / H. Kainulainen, K.G. Papaioannou, M. Silvennoinen, R. Autio, J. Saarela, B. M. Oliveira, M. Nyqvist, A. Pasternack, P. A. 't Hoen, U. M. Kujala, O. Ritvos, J. J. Hulmi // Molecular and Cellular Endocrinology. - 2014. - Vol. 399. - P. 131-142.

62. Kapilevich L. V. Skeletal muscle as an endicrine organ: role of [Na+]i/[K+]i-mediated excitation-transcription coupling / L. V. Kapilevich, T. A. Kironenko, A. N. Zaharova, Yu. V. Kotelevtsev, N. O. Dulin, S. N. Orlov // Genes & Diseases. - 2015. - Vol. 2. - 328-336.

63. Karamouzis M. In situ microdialysis of intramuscular prostaglandin and thromboxane in contracting skeletal muscle in humans / M. Karamouzis, H. Langberg, D. Skovgaard, J. Bulow, M. Kjaer, B. Saltin // Acta Physiologica Scandinavica. - 2001. - Vol. 171 (1). - P. 71-76.

64. Klann E. Biochemical mechanisms for translation regulation in synaptic plasticity / E. Klann, T. E. Dever // Nature Reviews Neuroscience. - 2004. -Vol. 5. - P. 931-942.

65. Klimanova E. A. Time- and dose-dependent actions of cardiotonic steroids on transcriptome and intracellular content of Na+ and K+: a comparative analysis / E. A. Klimanova, A. M. Tverskoi, S. V. Koltsova, S. V. Sidorenko, O. D. Lopina, J. Tremblay, P. Hamet, L. V. Kapilevich, S. N. Orlov // Scientific Reports. - 2017. - Vol. 7. - P. 45403.

66. Koltsova S. V. Transcriptomic changes in Ca2+-depleted cells: Role of elevatedintracellular [Na+]/[K+] ratio / S. V. Koltsova, J. Tremblay, P. Hamet, S. N. Orlov // Cell Calcium. - 2015. - Vol. 58. - P. 317-324.

67. Koltsova S. V. Ubiquitous [Na+]i/[K+]i-sensitive transcriptome in mammalian cells: evidence for Ca2+i-independent excitationtranscription coupling / S. V. Koltsova, Y. Trushina, M. Haloui, O. A. Akimova, J. Tremblay, P. Hamet, S. N. Orlov // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - e38032.

68. Lai X. Imaging and quantifying solute transport across periosteum: implications for muscle-bone crosstalk / X. Lai, C. Price, X. L. Lu, L. Wang // Bone. - 2014. - Vol. 66. - P. 82-89.

69. Lanctot C. Dynamic genome architecture in the nuclear space: regulation of gene expression in three dimensions / C. Lanctot, T. Cheutin, M. Cremer,

G, Cavalli, T. Cremer // Nature Reviews Genetics. - 2007. - Vol. 8. - P. 104-115.

70. Lashkari D. A. Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis / D. A. Lashkari, J. L. DeRisi, J. H. McCusker, A .F. Namath, C. Gentile, S. Y. Hwang, P. O. Brown, R. W. Davis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. -1997. - Vol. 94. - P. 13057-13062.

71. Lata S. CytoPred: a server for prediction and classification of cytokines / S. Lata, G. P. S. Raghava // Protein Engineering, Design and Selection. - 2008. -Vol. 21 (4). - P. 279-282.

72. Lauritzen H. P. Contraction and AICAR stimulate IL-6 vesicle depletion from skeletal muscle fibers in vivo / H. P. Lauritzen, J. Brandauer, P. Schjerling,

H. J. Koh, J. T. Treebak, M. F. Hirshman, H. Galbo, L. J. Goodyear // Diabetes. -2013. - Vol. 62. - P. 3081-3092.

73. Ledbetter M. L. S. Control of protein synthesis in human fibroblasts by intracellular potassium / M. L. Ledbetter, M. Lubin // Experimental Cell Research. - 1977. - Vol. 105. - P. 223-236.

74. Li Y. Myokine IL-15 regulates the crosstalk of co-cultured porcine skeletal muscle satellite cells and preadipo-cytes / Y. Li, F. Li, B. Lin, X. Kong, Y. Tang, Y. Yin // Molecular Biology Reports. - 2014. - Vol. 41 (11). - P. 75437553.

75. Liu J. The sodium pump and cardiotonic steroids-induced signal transduction protein kinases and calcium-signaling microdomain in regulation of transporter trafficking / J. Liu, Z. Xie // Biochimica et Biophysica Acta. - 2010. -Vol. 1802. - P. 1237-1245.

76. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent, / O. H. Lowry, N.J. Rosebrough, Farr A, R.J. Randall // Journal of Biological Chemistry. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

77. Lubin M. On the role of intracellular potassium in protein synthesis / M. Lubin, H. L. Ennis // Biochimica et Biophysica Acta. - 1964. - Vol. 80. -P. 614-631.

78. Martin T. P. Influence of electrical stimulation on the morphological and metabolic properties of paralyzed muscle / T. P. Martin, R. B. Stein, P. H. Hoeppner, T. P. Martin, R. B. Stein, P. H. Hoeppner, D. C. Reid // Journal of Applied Physiology - 1992. - Vol. 72. - P. 1401-1406.

79. McDonough A. A. Skeletal muscle regulates extracellular potassium / A. A. McDonough, C. B. Thompson, J. H. Youn // American Journal of Physiology - Renal Physiology. - 2002. - Vol. 282. - P. F967-F974.

80. McKenna M. J. Muscle K+, Na+, and Cl disturbances and Na+-K+ pump inactivation: implications for fatigue / M. J. McKenna, J. Bangsbo, J. M. Renaud // Journal of Applied Physiology. - 2008. - Vol. 104. - P. 288-295.

81. Messenger S. W. Ca2+-regulated secretory granule exocytosis in pancreatic and parotid acinar cells / S. W. Messenger, M. A. Falokowski, G. E. Groblewski // Cell Calcium. - 2014. - Vol. 55. - P. 369-375.

82. Minke B. TRP channel proteins signal transduction / B. Minke, B. Cook // Physiological Reviews. - 2002. - Vol. 82. - P. 429-472.

83. Misarkova E. Excitation-contraction coupling and excitation-transcription coupling in blood vessels: their possible interaction in hypertensive vascular remodeling / E. Misarkova, M. Behuliak, M. Bencze, J. Zicha // Physiological Research. - 2016. - Vol. 65. - P. 173-191.

84. Mitchell P. O. A muscle precursor cell-dependent pathway contributes to muscle growth after atrophy / P. O. Mitchell, G. K. Pavlath // American Journal of Physiology. - 2001. - Vol. 281. - P. 1706-1715.

85. Miyatake S. Contracting C2C12 myotubes releas CCL2 in an NF-kB-dependent manner to induce monocyte chemoattraction / S. Miyatake, P. J. Bilan, N. J. Pillon // American Journal Of Physiology-Endocrinology And Metabolism. -2016. - Vol. 310 (2). - P. E160-E170.

86. Mohr T. T. Long term adaptation to electrically induced cycle training in severe spinal cord injured individuals / T. Mohr, J. L. Andersen, F. Biering-S0rensen, H. Galbo, J. Bangsbo, A. Wagner, M. Kjaer // Spinal Cord. - 1997. -Vol. 35 (1). - P. 42370.

87. Murase S. S. Upregulated glial cell line-derived neurotrophic factor through cyclooxygenase-2 activation in the muscle is required for mechanical hyperalgesia after exercise in rats / S. Murase, E. Terazawa, K. Hirate, H. Yamanaka, H. Kanda, K. Noguchi, H. Ota, F. Queme, T. Taguchi, K. Mizumura // The Journal of Physiology. - 2013. - Vol. 591 (12). - P. 3035-3048.

88. Murphy K. T. Analysis of exerciseinduced Na+-K+ exchange in rat skeletal muscle / K. T. Murphy, O. B. Nielsen, T. Clausen // Experimental Physiology. - 2008. - Vol. 93. - P. 1249-1262.

89. Murphy K. T. Ionic mechanisms of excitation-indyced regulation of Na+,K+-ATPase mRNA expression in isolated rat EDL muscle / K. T. Murphy, W. A. Macdonald, M. J. McKenna // American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. - 2006. - Vol. 290. - P. R1397-R1406.

90. Nedachi T. Characterization of contraction-inducible CXC chemokines and their roles in C2C12 myocytes / T. Nedachi, H. Hatakeyama, T. Kono, M. Sato, M. Kanzaki // American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. - 2009. - Vol. 297. - P. 866-878.

91. Nedachi T. Contractile C2C12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle / T. Nedachi, H. Fujita, Kanzak // American

Journal Of Physiology-Endocrinology And Metabolism. - 2008. - Vol. 295. -P. E1191-E1204.

92. Nikolic N. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise / N. Nikolic, S. S. Bakke, E. T. Kase, I. Rudberg, I. F. Halle, A. C. Rustan, G. H. Thoresen, V. Aas // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - P. E33203.

93. Northeim F. Regulation of angiopoietin-like protein 4 during and after exercise / F. Northeim, M. Hjorth, T. M. Langieite, S. Lee, T. Holen, C. Bindesboll, H. K. Stadheim, H. L. Gulseth, K. I. Birkeland, A. Kielland, J. Jensen, K. T. Dalen, C. A. Drevon // Physiological Reports. - 2014. - Vol. 2 (8). - P. E12109.

94. O'Brien J. Investigation of the Almar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity / J. O'Brien, I. Wilson, T. Orton, F. Pognan // FEBS Journal. - 2000. - Vol. 267. - P. 5421-5426.

95. Ogura Y. Elevation of body temperature is an essential factor for exercise-incrased extracellular heat shock protein 72 level in rat plasma / Y. Ogura, H. Naito, S. Akin, N. Ichinoseki-Sekine, M. Kurosaka, R. Kakigi, T. Sugiura, S. K. Powers, S. Katamoto, H. A. Demirel // American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. - 2008. - Vol. 294. -P. R1600-R1607.

96. Ono Y. Skeletal muscle-specific calpain is an intracellular Na+-dependent protease / Y. Ono, K. Ojimam, F. Torii, E. Takaya, N. Doi, K. Nakagawa, S. Hata, K. Abe, H. Sorimachi // Journal of Biological Chemistry. -2010. - Vol. 285. - P. 22986-22998.

97. Orlov S. N. Salt and gene expression: evidence for Na+i, K+i-mediated signaling pathways / S. N. Orlov, P. Hamet // Pflugers Archive - European Journal of Physiology - 2015. - Vol. 467. - P. 475-487.

98. Orlov S. N. Extracellular calcium is required for the maintenance of plasma membrane integrity in nucleated cells / S. N. Orlov, S. L. Aksentsev, S. V. Kotelevtsev // Cell Calcium. - 2005. - Vol. 38. - P. 53-57.

99. Orlov S. N. Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3 / S. N. Orlov, N. Thorin-Trescases, S. V. Kotelevtsev, J. Tremblay, P. Hamet // Journal of Biological Chemistry. - 1999. - Vol. 274. - P. 16545-16552.

100. Orlov S. N. Na+i,K+i,K+i-dependent and -independent signaling triggered by cardiotonic steroids: facts and artifacts / S. N. Orlov, E. A. Klimanova, A. M. Tverskoi, E. A. Vladychenskaya, L. V. Smolyaninova, O. D. Lopina // Molecules. - 2017. - Vol. 22 (4). - P. 635.

101. Orlov S. N. Na+-K+pump and Na+-K+co-transport in cultured vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats: baseline activity and regulation / S. N. Orlov, T. J. Resink, J. Bernhardt, F. R. Buhler // Journal of Hypertension. - 1992. - Vol. 10. - P. 733-740.

102. Ostrowski K. Evidence that interleukin-6 is produced in human skeletal muscle during prolonged running / K. Ostrowski, T. Rohde, M. Zacho, S. Asp, B. K. Pedersen // The Journal of Physiology - 2018. - Vol. 508. - P. 949-953.

103. Otis J. S. Stretch-induced myoblast proliferation is dependent on the COX2 pathway / J. S. Otis, T. J. Burkholder, G. K. Pavlath // Experimental Cell Research. - 2005. - Vol. 310. - P. 417-425.

104. Pan H. Changes of myogenic reactive oxygen species and interleukin-6 in contracting skeletal muscle cells / H. Pan, X. Xu, X. Hao, Y. Chen // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2012. - Vol. 0. - Epub.

105. Park H. Effects of electrical stimulation in C2C12 muscle constructs / H. Park, R. Bhalla, R. Saigal, M. Radisic, N. Watson, R. Langer, G. Vunjak-Novakovic // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2008. -Vol. 2. - P. 279-287.

106. Peake J. M. Cytokine expression and secretion by skeletal muscle cells: regulatory mechanisms and exercise effects / J. M. Peake, P. D. Gatta, K. Suzuki, D. C. Nieman // Exercise Immunology Review. - 2015. - Vol. 21. - P. 45870.

107. Pedersen B. K. Adolph distinguished lecture: muscle as an endocrine organ: IL-6 and other myokines / B. K. Pedersen, F. Edward // Journal of Applied Physiology. - 2009. - Vol. 107. - P. 1006-1014.

108. Pedersen B. K. Muscle as a secretory organ / B. K. Pedersen // Comprehensive Physiology. - 2013. - Vol. 3. - P. 1337-1362.

109. Pedersen B. K. Muscle as an endocrine organ: focus on muscle-derived interleukin-6 / B. K. Pedersen, M. A. Febbraio // Physiological Reviews. - 2008. -Vol. 88. - P. 1379-1406.

110. Pedersen B. K. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ / B. K. Pedersen, M. A. Febbraio // Nature Reviews Endocrinology. - 2012. - Vol. 8. - P. 457-465.

111. Pedersen B. K. Role of myokines in exercise and metabolism / B. K. Pedersen, T. C. Akerstrom, A. R. Nielsen, C. P. Fischer // Journal of Applied Physiology - 2007. - Vol. 103 (3). - P. 1093-1098.

112. Pedersen B. K. Searching for the exercise factor: is IL-6 a candidate ? /

B. K. Pedersen, A. Steensberg, C. Fischer, C. Keller, P. Keller, P. Plomgaard, M. Febbraio, B. Saltin // Journal of Muscle Research and Cell Motility - 2003. -Vol. 24 (44257). - P. 113-119.

113. Pedersen L. Exercise-induced liver chemokine expression is linked to muscle-derived interleukin-6 expression / L. Pedersen, H. Pilegaard, J. Hansen,

C. Brandt, H. Adser, J. Hidalgo, J. Olesen, B. K. Pedersen, P. Hojman // The Journal of Physiology. - 2011. - Vol. 589. - P. 1409-1420.

114. Pedersen L. Muscle-derived expression of the chemokine CXCL1 attenuates diet-induced obesity and improves fatty acid oxidation in the muscle / L. Pedersen, C. H. Olsen, B. K. Pedersen, P. Hojman // American Journal Of Physiology-Endocrinology And Metabolism. - 2012. - Vol. 302 (7). - P. 831-840.

115. Pezier A. The Na+/Ca2+ exchanger inhibitor, KB-R7943, 12 blocks a nonselective cation channel implicated in chemosensory transduction / A. Pezier, Y. V. Bobkov, B. W. Ahe // Journal of Neurophysiology. - 2009. - Vol. 101. -P. 1151-1159.

116. Pierce J. R. IL-15 concentrations in skeletal muscle and subcutaneous adipose tissue in lean and obese humans: local effects of IL-15 on adipose tissue lipolysis / J. R. Pierce, J. M. Maples, R. C. Hickner // American Journal Of Physiology-Endocrinology And Metabolism. - 2015. - Vol. 308 (12). - P. 11311139.

117. Pourteymour S. Global mRNA sequencing of human skeletal muscle: search for novel exercise-regulated myokines / S. Pourteymour, K. Eckardt, T. Holen, T. Langleite, S. Lee, J. Jensen, K. I. Birkeland, C. A. Drevon, M. Hjorth // Molecular Metabolism. - 2017. - Vol. 29. - P. 352-365.

118. Quinn L. S. Il-15 required for postexercise induction of the pro-oxidative mediators PPARd and SIRT1 in male mice / L. S. Quinn, B. G. Anderson, J. D. Conner, T, Wolden-Hanson, TJ. Marcell // Endocrinology. -2014. - Vol. 155. - P. 143-155.

119. Radzyukevich T. L. The cardiac glycoside binding site of the Na,K-ATPase a2 isoform plays a role in the dynamic regulation of active transport in skeletal muscle / T.L. Radzyukevich, J. B. Lingrel, J. A. Heiny // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2009. -Vol. 106. - P. 2565-2570.

120. Raschke S. Adipo-myokines: two sides of the same coin-mediators of inflammation and mediators of exercise / S. Raschke, J. Eckel // Mediators of Inflammation. - 2013. - Vol. 2013. - Epub - URL: doi.org/10.1155/2013/320724 (access date: 15.05.2021).

121. Raschke S. Identification and validation of novel contraction-regulated myokines released from primary human skeletal muscle cells / S. Raschke, K. Eckardt, Holven Bj0rklund // PLoS One. - 2013. - Vol. 8 (4). - e62008.

122. Reardon K. A. Increased levels of leukemia inhibitory factor mRNA in muscular dystrophy and human muscle trauma / K. A. Reardon, R. M. Kapsa, J. Davis, A. J. Kornberg, L. Austin, P. Choong, E. Byrne // Muscle Nerve. - 2000. - Vol. 23 (6). - P. 962-966.

123. Rebbeck R. T. Skeletal muscle excitation-contraction coupling: who are the dancing partners? / R.T. Rebbeck, Y. Karunasekara, P. G. Board, N.A. Beard, M. G. Casarotto, A. F. Dulhunty // International Journal of Biochemistry and Cell Biology. - 2014. - Vol. 48. - P. 28-38.

124. Rezazadeh S. KN-93 (2-[N-9hydroxyethyl)]-N-(4-meth0xybenzenesulfonyl)]-amino-N-(4-chlorocinnamyl)-n-methylbenzylamine), a calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor, is a direct extracellular blocker of voltage-gated potassium channels / S. Rezazadeh, T. W. Claydon, D. Fedida // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 2006. -Vol. 317. - P. 292-299.

125. Richter A. Comparison of fluorescent tag DNA labeling methods used for expression analysis by DNA microarrays. / A Richter, C. Schwager, C. Schwager, S. Hentze, M. Muckenthaler // Biotechniques. - 2002. - Vol. 33 (3). - P. 620-628.

126. Rochester L. Influence of electrical stimulation of the tibialis anterior muscle in paraplegic subjects. 2. Morphological and histochemical properties / L. Rochester, M. J. Barron, C. S. Chandler, R. A. Sutton, S. Miller, M. A. Johnson // Paraplegia. - 1995. - Vol. 33 (9). - P. 514-522.

127. Rosenblatt J. D. Satellite cell activity is required for hypertrophy of overloaded adult rat muscle / J. D. Rosenblatt, D. Yong, D. J. Parry // Muscle Nerve. - 1994. - Vol. 17 (6). - P. 608-613.

128. Rudnick J. Differential expression of nitric oxide synthases (NOS 1-3) in human skeletal muscle following exercise countermeasure during 12 weeks of bed rest / J. Rudnick, B. Püttmann, P. A. Tesch, B. Alkner, B. G. Schoser, M. Salanova, K. Kirsch, H. C. Gunga, G. Schiffl., G. Lück, D. Blottner // FASEB Journal. - 2004. - Vol. 18 (11). - P. 1228-1230.

129. Russell J. M. Sodium-potassium-chloride cotransport / J. M. Russell // Physiological Reviews. - 2000. - Vol. 80. - P. 212-276.

130. Scheler M. Cytokine response of primary human myotubes in an in vitro exercise model / M. Scheler, M. Irmler, S. Lehr, S. Hartwig, H. Staiger,

H. Al-Hasani, J. Beckers, M. H. de Angelis, H. U Haring, C. Weigert // American Journal of Physiology. - 2013. - Vol. 305 (8). - P. 877-886.

131. Schoner W. Endogenous and exogenous cardiac glycosides: their role in hypertension, salt metabolism, and cell growth / W. Schoner, G. Scheiner-Bobis // American Journal of Physiology. - 2007. - Vol. 293. - P. C509-C536.

132. Sejersted O. M. Dynamics and consequences of potassium shifts in skeletal muscle and heart during exercise / O. M. Sejersted, G. Sjogaard // Physiological Reviews. - 2000. - Vol. 80. - P. 1411-1481.

133. Sidorenko S. V. Transcriptomic changes in C2C12 myotubes triggered by electrical stimulation: role of Ca2+i-mediated and Ca2+i-independent signaling and elevated [Na+]i/[K+]i ratio / S.V. Sidorenko, E. A. Klimanova, K. Milovanova, O. D. Lopina, L. V. Kapilevich, A. V. Chibalin, S. N. Orlov // Cell Calcium. - 2018. - Vol. 76. - P. 72-86.

134. Smolyaninova L. V. Augmented gene expression triggered by Na+,K+-ATPase inhibition: Role of Ca2+i -mediated and -independent excitation-transcription coupling / L. V. Smolyaninova, S.V.Koltsova, S. V. Sidorenko, S.N. Orlov // Cell Calcium. - 2017. - Vol. 68. - P. 5-13.

135. Sorokin A. Protein-tyrosine kinase Pyk2 mediates endothelin-induced p38 MAPK activation in glomerular mesangial cells / A. Sorokin, P. Kozlowski, L. Graves, A. Philip // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - Vol. 276 (24). -P. 21521-21528.

136. Soskic S. S. Regulation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and its potential role in insulin resistance, diabetes and heart failure / S. S. Soskic, B. D. Dobutovic, E. M. Sudar, M. M. Obradovic, D. M. Nikolic, J. D. Djordjevic, D. J. Radak, D. P. Mikhailidis, E. R. Isenovic // The Open Cardiovascular Medicine Journal. - 2011. - Vol. 5. - P. 153-163.

137. Spangenburg E. E. Multiple signaling pathways mediate LIF-induced skeletal muscle satellite cell proliferation / E. E. Spangenburg, F. W. Booth // American Journal of Physiology. - 2002. - Vol. 283 (1). - P. 204-211.

138. Standley R. A. Prostaglandin E2 induces transcription of skeletal muscle mass regulators interleukin-6 and muscle RING finger-1 in humans / R. A. Standley, S.Z. Liu, B. Jemiolo, S.W. Trappe, T. A. Trappe // Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids. - 2013. - Vol. 88. - P. 361-364.

139. Steel J. C. Interleukin-15 biology and its therapeutic implications in cancer / J. C. Steel, T. A. Waldmann, J. C. Morris // Trends in Pharmacological Sciences. - 2013. - Vol. 33 (1). - P. 35-41.

140. Stout C. Modulation of intercellular calcium signaling in astrocytes by extracellular calcium and magnesium / C. Stout, A. Charles // Glia. - 2003. -Vol. 43. - P. 265-273.

141. Suarez-Kurtz G. Currents carried by sodium ions through transient calcium channels in clonal GH3 pituitary cells / G. Suarez-Kurtz, G.M. Katz // Pflugers Archiv. - 1987. - Vol. 410 (3). - P. 345-347.

142. Tamura Y. Upregulation of circulating IL-15 by treadmill running in healthy individuals: is IL-15 an endocrine mediator of the beneficial effects of endurance exercise? / Y. Tamura, K. Watanabe, T. Kantani, J. Hayashi, N. Ishida, M. Kaneki // Endocrine Journal. - 2011. - Vol. 58 (3). - P. 211-215.

143. Tan C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present / C. Tan, B. C. Yiap // Journal of Biomedicine & Biotechnology. - 2009. -Vol. 2009. - P. 574398.

144. Taurin S. S. Na/K pump and intracellular monovalent cations: novel mechanism of excitation-transcription coupling involved in inhibition of apoptosis, / S. Taurin, P. Hamet, S. N. Orlov // Molecular Biology. - 2003. - Vol. 37. -P. 371-381.

145. Taurin S. c-Fos expression in ouabain-treated vascular smooth muscle cells from rat aorta: evidence for an intracellular-sodium-mediated, calcium-independent mechanism / S. Taurin, N. O. Dulin, D. Pchejetski, R. Grygorczyk, J. Tremblay, P. Hamet, S. N. Orlov // The Journal of Physiology. - 2002. -Vol. 543. - P. 835-847.

146. Tomes C. N. The proteins of exocytosis: lessons from the sperm model / C. N. Tomes // Biochemical Journal. - 2015. - Vol. 465. - P. 359 -370.

147. Torres-Flores V. Intracellular sodium increase induced by external calcium removal in human sperm / V. Torres-Flores, N. L. Garcia-Sanchez, M. T. Gonzalez-Martinez // Journal of Andrology. - 2008. - Vol. 29. - P. 63-69.

148. Tulpan D. Recent patents and challenges on DNA microarray probe design technologies / D. Tulpan // Recent patents on DNA & gene sequences. -2010. - Vol. 4 (3). - P. 210-217.

149. Uddin M. Examination of the cellular mechanisms by which marinobufagenin inhibits cytoblast function / M. Uddin, D. Horvat, S. S. Glaser, B. M. Mitchell, J. B. Puschett // Journal of Biological Chemistry. - 2008. -Vol. 283. - P. 17946-17953.

150. Weinheimer E. M. Resistance exercise and cyclooxygenase (COX) expression in human skeletal muscle: implications for COX-inhibiting drugs and protein synthesis / E. M. Weinheimer, B. Jemiolo, C. C. Carroll, M. P. Harber, J. M. Haus, N. A. Burd, J. K. LeMoine, S. W. Trappe, T. A. Trappe // American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. -2007. - Vol. 292. - P. R2241-R2248.

151. Whitham M. Contraction-induced interleukin-6 gene transcription in skeletal muscle is regulated by c-Jun terminal kinase/activator protein-1 / M. Whitham, M. H. Chan, M. Pal, V. B. Matthews, J. Prelovsek, F. T. Wunderlich, G. I. Lancaster, M. A. Febbraio // Journal of Biological Chemistry. - 2012. -Vol. 287. - P. 10771-10779.

152. Wiczer B. M. KB-R7943, a plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger inhibitor, blocks opening pf the mitochondrial permeability transition pore / B. M. Wiczer, R. Marcu, B. J. Hawkins // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2014. - Vol. 444. - P. 44-49.

153. Wiltgen M. DNA microarray analysis: principles and clinical impact / M. Wiltgen, P. G. Tilz, W. Ansorge, M.W. Hentze // Hematology (Amsterdam, Netherlands). - 2007. - Vol. 12 (4). - P. 271-287.

154. Yang M. Circulating levels of irisin in middle-aged first-degree relatives of type 2 diabetes mellitus - correlation with pancreatic P-cell function / M. Yang, P. Chen, H. Jin // Diabetology & Metabolic Syndrome - 2014. - Vol. 6 (1). - P. 133-139.

155. Yano S. Glucose uptake in rat skeletal muscle L6 cells is increased by low-intensity electrical current through the activation of the phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI-3K)/Akt pathways / S. Yano, S. Morino-Koga, T. Kondo, M. A. Suico, T. Koga, Y. Shimauchi, S. Matsuyama, T. Shuto, T. Sato, E. Araki, H. Kai // Journal of Pharmacological Sciences. - 2010. - Vol. 115. - P. 94-98.

156. Zlotnik A. The chemokine superfamily revisited / A. Zlotnik, O. Yoshie // Immunity. - 2012. - Vol. 36. - P. 705-716.

157. Zohar H. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA / H. Zohar, S. J. Muller // Nanoscale. - 2011. - Vol. 3 (8). - P. 3027-3039.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

(справочное)

Платформа Affymetrix для анализа экспрессии генов

В основе работы микрочипов лежит явление гибридизации. При наличии небольших количеств ДНК исследуемого образца осуществляют амплификацию. Для РНК сначала осуществляется обратная транскрипция, что впрочем, необязательно: существуют чипы, работающие как с ДНК, так и с РНК. Проверка образцов ДНК/РНК заключается в мечении образцов различными флуоресцентными метками для последующего обнаружения и нанесении образцов на микрочип. ДНК-микрочип с нанесённым на него образцом инкубируют некоторое время, чтобы произошла гибридизация комплементарных одноцепочечных молекул, после чего чип промывают. Все некомплементарные ДНК/РНК образца смываются с чипа. После этого производят сканирование микрочипа при помощи лазера, который вызывает флуоресценцию меченых молекул образца. Подключённый к компьютеру микроскоп оценивает флуоресценцию каждого сайта ДНК-микрочипа, а, следовательно, и устанавливает последовательности гибридизованных ДНК, что позволяет установить последовательность ДНК, РНК из образца [1]. Базовый протокол может быть представлен в следующем виде [148]:

1. Выделение ДНК/РНК.

На этом этапе выделяется либо мРНК (GEM), либо фрагменты геномной ДНК (MCGH, SNPM) из интересующих образцов. Сейчас это легко осуществляется специальными коммерческими наборами [148, 143].

2. Мечение ДНК/РНК.

Этот процесс начинается с обратной транскрипции (если необходимо). Затем производят амплификацию целевого фрагмента при помощи полимеразной цепной реакции. В процессе ПЦР в состав фрагментов ДНК включаются нуклеотиды с флуоресцентными метками [148, 157].

3. Гибридизация.

Здесь флуоресцентно-меченные амплифицированные образцы используются как мишени, для поиска на микрочипе комплементарных цепей, то есть способных образовывать прочные двойные цепи — дуплексы, по правилу комплементарности. Так как одна из цепей образуемого дуплекса меченая, то сигнал от такого дуплекса можно зарегистрировать [148].

4. Промывка

Как только заканчивается гибридизация, чип вынимают из раствора, содержащего образцы меченой ДНК. Сам чип потом тщательно промывается по определённым методикам, используя различные буферные смеси, центрифугирование и так далее [148].

5. Сканирование.

Этот процесс предполагает использование оптических сканирующих проборов, способных детектировать фотоны с точно определённой длинной волны. Каждый сайт чипа освещается пучком света определённой длины волны, что активирует флуоресцентную метку. «Просвечивание» микрочипа производят аргоновыми лазерами. Активированная флуоресцентная метка испускает фотон чуть большей длины волны, который регистрирует прибор. Чем больше фотонов при одном засвете уловит прибор, тем выше интенсивность свечения данной точки, а значит там большое число образовавшихся дуплексов [148].

6. Анализ данных.

Данные - массив значений интенсивности свечения каждого конкретного сайта микрочипа. Используя математические методы сравнения, можно достоверно установить сайты чипа, где произошла гибридизация, а значит, и узнать последовательность ДНК/РНК из образца [148, 153].

Анализ экспрессии генов - это самое частое применение ДНК-микрочипов. РНК, выделенная из культуры клеток, подвергается обратной транскрипции, в результате которой получается меченная кДНК. Иногда требуется ещё один этап транскрипции с кДНК (для чипов, работающих с

РНК), при котором создается меченная кРНК. Существует несколько различных способов внести метки в целевую молекулу: включение флуоресцентно меченых нуклеотидов в процессе синтеза кДНК или кРНК, использование биотин-модифицированных нуклеотидов, которые потом окрашиваются флуоресцентно-меченным стрептавидином, использование во время синтеза модифицированных нуклеотидов, на которые затем можно добавить флуоресцентную метку[125].

Меченная таким образом ДНК или РНК гибридизуется на микрочипе, после чего смывается. В каждой точке чипа детектируется флуоресцентный сигнал. В случае с биотинилированными образцами ДНК-микрочип после гибридизации окрашивается стрептавидином, содержащим флуоресцентные метки. Флуоресценция возбуждается светом лазера и регистрируется, как правило, сканирующим конфокальном микроскопом [27].

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

(обязательное)

Гены, экспрессия которых активируется EPS в отсутствие никардипина

Таблица Б.1 - Гены, экспрессия которых активируется EPS в отсутствие никардипина (Ca -опосредованная сигнализация)

Обозначение Кратность ANOVA p-значение Функциональные

гена изменения категории

Hist1h3c 3.27 4.42E-03 HS

Hist1h3a 3.02 1.89E-02 HS

Olfr764-ps1 2.08 1.99E-02 OVR

Hist1h2bk 2.06 9.40E-03 HC

Mettl7a3 2.02 2.70E-02 O

0ljr1047 1.9 3.11E-02 OVR

Hist1h4n 1.9 7.35E-03 HC

0ljr1251 1.89 3.46E-02 OVR

Mir29a 1.84 4.37E-02 MR

Cst6 1.82 1.06E-02 PS

Mageb3 1.81 2.24E-02 IR

Rpl37 1.79 1.53E-03 PS

Atp6v0c 1.78 4.62E-03 O

Fabp5 1.74 7.39E-03 O

Trav13d-4 1.73 4.29E-02 IR

Depdc7 1.7 7.08E-03 S

Eif4a2 1.7 6.21E-04 PS

Hist1h2ae 1.69 4.65E-02 HC

Ccno 1.68 2.81E-02 O

Mir1957a 1.67 2.99E-03 MR

Mir20a 1.67 6.65E-03 MR

Sowahc 1.65 5.04E-03 O

Gapdh 1.62 2.44E-02 O

Rpl27a 1.61 3.01E-03 PS

0ljr593 1.61 2.89E-03 OR

Ppp1r18os 1.61 2.38E-02 S

Mirlet7f-1 1.61 1.98E-02 MR

Hist1h2bh 1.61 3.41E-02 HC

Mug2 1.6 2.35E-02 O

Olfr1183 1.6 1.44E-02 OVR

Rpl7a-ps3 1.6 4.12E-02 PS

BC094916 1.6 3.55E-02 O

Nkpd1 1.59 2.73E-02 O

Hist2h3b 1.59 6.49E-03 HC

Nxt1 1.59 1.25E-02 O

Mir17hg 1.59 6.06E-04 MR

Actg1 1.59 2.04E-02 O

Примечание: в данной таблице перечислены гены, кодирующие транскрипты, экспрессия которых была активирована EPS при отсутствии никардипина более чем в 1,56 раза. Гистоновые кластеры и обонятельные рецепторы показаны жирным шрифтом и курсивом, соответственно. HC - кластеры гистонов; IR - иммунный / воспалительный ответ; MR - микроРНК; O - другие категории или неизвестная функция; OVR - обонятельные/вомероназальные рецепторы; PS - синтез белка, свертывание и катаболизм; S - сигнализация; TR - регуляция транскрипции.

ПРИЛОЖЕНИЕ В

(обязательное)

Гены, экспрессия которых ингибируется EPS в отсутствие никардипина

Таблица В.1 - Гены, экспрессия которых ингибируется EPS в отсутствие никардипина (Ca -опосредованная сигнализация)

Обозначение Кратность ANOVA p-значение Функциональные

гена изменения категории

Mir466f-4 -2.53 1.27E-02 MR

Mir3092 -2.16 2.75E-03 MR

Mir3471-1 -2.02 8.19E-04 MR

Mir761 -2.01 2.97E-03 MR

Zfp300 -1.99 4.55E-02 TR

Vmn1r2 -1.95 3.23E-03 OVR

Lce3c -1.95 8.78E-03 O

Vmn2r55 -1.94 5.47E-04 OVR

Ighv1-75 -1.88 2.70E-02 IR

Mir344d-2 -1.87 1.37E-03 MR

Igkv1-135 -1.86 3.17E-02 IR

Mir5123 -1.82 2.28E-03 MR

Mir466j -1.82 5.22E-03 MR

Vmn1r119 -1.76 3.51E-03 OVR

Olfr523 -1.76 2.42E-02 OVR

Mir1839 -1.76 4.82E-02 MR

Mir3473d -1.73 1.20E-02 MR

Mir709 -1.72 1.80E-02 MR

Csf2rb -1.72 3.60E-02 IR

Ighv2-9 -1.72 3.21E-02 IR

Mir15a -1.7 3.01E-02 MR

Ston2 -1.7 7.23E-04 O

Olfr1226 -1.69 3.32E-02 OVR

Vmn1r193 -1.68 3.08E-02 OVR

Mrgpra2b -1.67 3.69E-02 S

Mir206 -1.67 4.68E-03 MR

Vmn2r113 -1.66 4.57E-02 OVR

mt-Tr -1.65 3.51E-02 PS

Vmn1r25 -1.65 4.95E-02 OVR

Oljr1269 -1.65 4.44E-03 OVR

Vmn1r148 -1.64 6.90E-03 PVR

Mir301b -1.64 2.25E-02 MR

Oljr1383 -1.63 4.99E-02 OVR

Cd300lh -1.62 7.72E-03 IR

Krtap4-13 -1.62 1.32E-02 O

Oljr372 -1.61 1.09E-02 OVR

Igkv17-121 -1.61 4.95E-03 IR

Mir103-2 -1.61 1.69E-02 MR

Oljr1219 -1.6 6.24E-03 OVR

Il1r2 -1.6 2.26E-02 IR

Примечание: в этой таблице перечислены гены, кодирующие транскрипты, экспрессия которых была увеличена в клетках, обработанных EPS, более чем в 1,6 раза. МикроРНК и обонятельные / вомероназальные рецепторы показаны жирным шрифтом и курсивом., соответственно. Для функциональных категорий, см. Приложение Б.

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

(обязательное)

Гены, экспрессия которых активируется EPS в отсутствие и в присутствии

никардипина

Таблица Г.1 - Гены, экспрессия которых активируется EPS в отсутствие и в

2 ~ь

присутствии никардипина (Ca -независимая сигнализация)

Обозначение Кратность ANOVA Кратность ANOVA p- Функциональная

гена изменения p-значения изменения value категория

(EPS) (EPS) (никардипин +EPS) (никардипин +EPS)

Hmoxl 6.37 8.00E-06 5.47 3.00E-05 O

Hspala 5.04 1.30E-05 3.77 2.00E-05 PS

Hspalb 4.5 1.70E-04 3.95 6.36E-07 PS

Ier2 3.8 1.04E-04 3.09 1.40E-05 TR

Fos 3.58 2.40E-05 3.14 2.80E-05 TR

Dnajbl 3.57 3.00E-06 3.64 1.90E-05 PS

Hsphl 3.48 2.60E-05 2.95 7.77E-04 PS

Egrl 3.33 8.20E-05 2.95 3.85E-04 TR

Hist1h2bj 3.25 2.10E-02 1.76 1.17E-02 HC

Rgs2 3.04 2.30E-05 2.29 5.33E-04 S

Phldal 3 1.38E-04 3.4 3.55E-04 S

Arc 2.9 3.40E-05 2.85 9.50E-05 S

Ddit3 2.78 3.59E-04 2.28 7.10E-05 TR

Ptgs2 2.74 4.05E-04 2.32 3.60E-05 O

Hist1h2ai 2.69 1.62E-03 14 4.77E-02 HC

Tmem95 2.68 1.20E-05 2.67 1.44E-02 O

Myc 2.58 2.12E-04 2.43 3.68E-04 TR

Egr2 2.56 3.60E-05 2.51 2.70E-04 TR

Hist4h4 2.53 1.98E-04 2.11 6.03E-03 HC

Mir1938 2.44 2.16E-03 2.14 2.81E-03 MR

Atf3 2.41 8.88E-04 2.3 5.42E-04 TR

Hist1h3e 2.39 1.21E-03 2.26 1.59E-03 HC

Fosl1 2.38 1.68E-03 2.39 3.02E-04 TR

Rab26os 2.36 9.91E-04 1.74 7.34E-04 S

Dusp6 2.36 2.52E-03 2.25 3.58E-03 S

Hist1h2bm 2.35 1.94E-03 1.42 2.58E-03 HC

Btg2 2.34 5.95E-04 1.91 3.30E-04 TR

Fosb 2.28 3.60E-04 2.05 3.22E-03 TR

Adm 2.28 8.24E-04 2.06 9.05E-04 S

Dusp5 2.25 2.80E-05 2.04 9.97E-04 S

Mir450b 2.24 2.58E-03 2.58 6.11E-03 MR

Ftl1 2.23 1.99E-03 1.52 5.44E-03 O

BC031361 2.23 3.17E-03 1.44 2.89E-03 O

Snord14e 2.22 1.74E-04 2.06 7.60E-05 O

Id3 2.17 9.58E-07 1.77 3.60E-03 TR

Ccl7 2.16 3.64E-04 1.69 1.90E-05 IR

Примечание: в этой таблице перечислены гены, кодирующие транскрипты, содержание которых в клетках, обработанных EPS, было увеличено более чем в 2,16 раза. Регуляторы транскрипции, включая кластеры гистонов, выделены жирным шрифтом; кластеры гистонов подчеркнуты; белки теплового шока выделены курсивом. Для функциональных категорий, см. Приложение Б.

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

(обязательное)

Гены, экспрессия которых ингибируется EPS в отсутствие и в присутствии

никардипина

Таблица Д.1 - Гены, экспрессия которых ингибируется EPS в отсутствие и в

2 ~ь

присутствии никардипина (Ca -независимая сигнализация)

Обозначение Кратность ANOVA Кратн. ANOVA p- Функцио

гена изменения p-значения изменения значения нальная

(EPS) (EPS) (никардипин+ EPS) (никардипин+ EPS) категория

mt-Ts2 -2.52 4.14E-03 -2.66 5.71E-04 PS

Dleu2 -2.49 6.21E-04 -2.66 3.59E-04 0

n-R5s27 -2.35 3.52E-03 -1.74 8.06E-03 PS

Mir3094 -2.3 1.65E-02 -2.21 1.14E-02 MR

Mir568 -2.22 7.39E-04 -2.35 3.79E-03 MR

Mir721 -2.16 6.98E-04 -1.7 2.18E-03 MR

mt-Tt -2.15 1.60E-05 -2.25 1.05E-03 PS

Mir149 -2.14 1.34E-04 -1.44 2.80E-02 MR

Mir1930 -2.05 1.01E-02 -1.43 4.87E-03 MR

Mir133b -2 3.69E-03 -2.42 5.70E-05 MR

Mir145a -1.95 1.42E-03 -1.85 8.22E-03 MR

Rps15a-ps6 -1.93 1.43E-02 -1.71 1.42E-02 PS

Mir872 -1.91 2.50E-02 -1.7 9.64E-03 MR

Kmt2d -1.88 1.15E-04 -1.62 1.55E-03 0

Gan -1.87 8.80E-05 -1.78 5.34E-03 0

Heatr5b -1.86 3.70E-02 -1.82 1.99E-02 0

mt-Tk -1.82 1.99E-03 -1.62 1.62E-02 PS

Hoxc4 -1.81 3.72E-02 -1.42 6.37E-04 TR

Spaca6 -1.79 4.10E-04 -1.3 1.83E-03 0

Tpd52l2 -1.78 5.71E-03 -2.21 1.84E-04 0

Hoxc5 -1.76 7.22E-04 -2.11 6.99E-04 TR

0lfr1303 -1.76 1.37E-03 -1.72 4.00E-05 0VR

E2f8 -1.75 1.86E-04 -1.85 1.45E-04 PS

Pou2j1 -1.75 2.41E-04 -1.41 1.48E-03 TR

Sorbs2 -1.75 3.78E-03 -1.22 3.50E-03 O

Sumo3 -1.74 7.28E-03 -1.43 1.78E-02 S

Hipk2 -1.74 9.42E-04 -1.51 1.29E-04 S

n-R5s26 -1.73 8.35E-03 -2.56 2.12E-02 PS

Mir16-2 -1.73 6.87E-03 -1.41 2.42E-02 MR

Mir5125 -1.73 7.38E-04 -1.78 9.45E-03 MR

Sh3pxd2a -1.72 8.00E-04 -1.46 6.60E-05 O

Tram2 -1.71 3.02E-03 -1.51 7.65E-04 PS

Tns1 -1.66 5.10E-05 -1.48 8.15E-04 S

Gpatch8 -1.66 6.69E-04 -1.54 4.78E-03 O

Nav1 -1.66 2.83E-04 -1.44 6.15E-04 O

Zbtb39 -1.65 5.07E-03 -1.51 4.04E-03 TR

Srcap -1.65 1.70E-03 -1.49 5.95E-04 TR

Nav2 -1.65 4.68E-04 -1.4 1.23E-02 O

Примечание: в этой таблице перечислены гены, кодирующие транскрипты, содержание которых в клетках, обработанных EPS, уменьшилось более чем в 1,64 раза. МикроРНК и регуляторы транскрипции показаны жирным шрифтом и курсивом, соответственно. Для функциональных категорий, см. Приложение Б.

ПРИЛОЖЕНИЕ Е

(обязательное)

Гены, экспрессия которых активируется как уабаином, так и EPS посредством Ca2+ опосредованной сигнализации

Таблица Е.1 - Гены, экспрессия которых активируется как уабаином, так и EPS посредством Ca2+ опосредованной сигнализации

Обозначение Кратность ANOVA Кратность ANOVA p- Функциональная

гена изменения p-значения изменения значения категория

(EPS) (EPS) (уабаин) (уабаин)

Oljr1251 1.89 3.46E-02 1.46 2.67E-03 OVR

Mir29a 1.84 4.37E-02 1.67 3.08E-02 MR

Rpl37 1.79 1.53E-03 1.4 5.09E-03 PS

Atp6v0c 1.78 4.62E-03 1.6 2.65E-03 O

Eif4a2 1.7 6.21E-04 1.32 8.72E-03 PS

Mir1957a 1.67 2.99E-03 1.56 1.47E-02 MR

Rpl27a 1.61 3.01E-03 1.37 1.19E-02 PS

Oljr1183 1.6 1.44E-02 1.27 4.71E-02 OVR

Ppan 1.56 3.13E-03 1.49 4.96E-03 O

Ndufb11 1.55 3.17E-03 1.52 1.18E-02 O

Ovgp1 1.54 9.40E-03 1.31 3.78E-02 O

Mir328 1.53 9.39E-03 1.73 2.39E-02 MR

Rpl18a 1.51 4.94E-02 1.34 2.76E-02 PS

Ighv3-3 1.48 2.72E-02 1.54 1.15E-02 IR

Rhod 1.46 3.11E-02 1.26 3.77E-03 S

Cd59b 1.46 1.80E-02 1.39 9.61E-03 IR

Atp5e 1.45 8.77E-03 1.24 3.20E-02 O

Kir3dl2 1.45 1.03E-02 1.24 3.84E-02 IR

Adgrl4 1.43 4.05E-03 1.31 1.13E-02 S