Трансляционная подвижность и особенности надмолекулярной организации белков с внутренней неупорядоченной структурой на примере α- и κ-казеинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.07, кандидат наук Мельникова Дарья Леонидовна

• Мельникова Дарья Леонидовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Мельникова Дарья Леонидовна

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика биополимеров - белков с естественной неупорядоченной структурой

1.2 Особенности структуры и функций белков с естественной неупорядоченной структурой

1.3 Межмолекулярные взаимодействия белков с естественной неупорядоченной структурой

1.4 Методы исследования белков с внутренней неупорядоченной структурой

1.5 ЯМР исследования белковых макромолекул

1.6 Теория самодиффузии макромолекул в растворах полимеров

1.7 Учет характеристик локальной подвижности полимерной цепи

1.8 Универсальная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии линейных гибкоцепных макромолекул

1.9 Универсальная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии макромолекул с конформацией, отличающейся от гауссовой

1.10 Трансляционная динамика макромолекул, образующих трехмерную сетку

1.11 Постановка задачи диссертации

Глава 2. МЕТОДЫ И ОБЪКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Базовые положения

2.2 Основные принципы измерения КСД молекул методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля

2.3 Импульсные последовательности для измерения коэффициентов самодиффузии

2.4 Регистрация зависимости формы диффузионного затухания от времени диффузии. Основные принципы учета вкладов, связанных с ядерной магнитной релаксацией

2.5 Регистрация формы диффузионного затухания для отдельных компонент системы в спектрально разрешенном режиме

2.6 Характеристики используемой аппаратуры и условия измерений

2.6.1 Погрешности в экспериментах

2.7 Объекты исследования

2.8 Методика приготовления образцов

Глава 3. САМОДИФФУЗИЯ МОЛЕКУЛ БЕЛКОВ С ВНУТРЕННЕЙ НЕУПОРЯДОЧЕННОСТЬЮ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ НА ПРИМЕРЕ а-КАЗЕИНА

3.1 Форма диффузионного затухания в растворах белков

3.2 Зависимость средних коэффициентов самодиффузии молекул а-казеина от его концентрации в водном растворе и учет локальной подвижности молекул белка

3.3 Сравнение концентрационной зависимости коэффициента самодиффузии для молекул а-казеина с установленными обобщенными концентрационными зависимостями для глобулярных белков и гибкоцепных полимеров

3.4 Влияние времени хранения образца на форму диффузионного затухания

3.5 Обратимость наблюдаемых изменений формы диффузионных затуханий от времени хранения и концентрации

3.6 Зависимость формы диффузионных затуханий от времени диффузии. Признаки образования геля

3.6.1 Зависимость формы диффузионных затуханий от времени диффузии. Признаки молекулярного обмена

3.7 Заключение к главе

Глава 4. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ ПОДВИЖНОСТИ В РАСТВОРАХ а-КАЗЕИНА В ПРИСУТСВИИ АГЕНТА ТСЕР

4.1 Влияние агента ТСЕР на трансляционную подвижность молекул белка в разбавленных растворах а-казеина

4.2 Анализ диффузионных затуханий в спектрально разрешенном режиме в концентрированных растворах а-казеина в присутствии ТСЕР

4.2.1 Трансляционная подвижность молекулярных компонент системы в концентрированном растворе а-казеина в режиме спектрального разрешения на ядрах 31Р

4.3 Особенности влияния агента ТСЕР на формирование надмолекулярной структуры в концентрированных растворах а-казеина

4.4 Заключение к главе

Глава 5. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ ПОДВИЖНОСТИ В РАСТВОРАХ к-казеина

5.1 Форма диффузионных затуханий молекул к-казеина в разбавленных растворах

5.2 Особенности изменений формы диффузионных затуханий в зависимости от времени диффузии в разбавленных и концентрированных растворах

5.3 Влияние ТСЕР на трансляционную подвижность и надмолекулярную структуру в растворах к-казеина

5.4 Зависимость средних коэффициентов самодиффузии молекул к-казеина от концентрации белка в растворе

5.5 Заключение к главе

ВЫВОДЫ

Благодарности

Список публикаций автора по теме диссертации

Список цитируемой литературы

4

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансляционная подвижность и особенности надмолекулярной организации белков с внутренней неупорядоченной структурой на примере α- и κ-казеинов»

Актуальность работы.

Согласно современным представлениям около 10% всех белков даже в нативных функциональных условиях являются внутренне неупорядоченными (или, как их первоначально называли, неструктурированными). Такие белки характеризуются наличием неупорядоченных участков полипептидной цепи и обладают конформационной подвижностью с высокой внутримолекулярной гибкостью, сохраняя при этом функциональную активность. Несмотря на большое число работ, посвященных структурно-динамическим свойствам таких белков, до сих пор остаются открытыми вопросы о том, как функционируют и каково поведение белков с внутренней неупорядоченной структурой в среде подобной клеточной (условия макромолекулярного краудинга). Кроме того, в отличие от компактных глобулярных белков, белкам с внутренней неупорядоченной структурой в большей степени свойственны межмолекулярные взаимодействия белковых молекул между собой, приводящие к образованию ассоциатов, аморфных агрегатов и амилоидоподобных структур. Известно, что именно образование таких агрегатов сопутствует тяжким нейродегенеративным заболеваниям.

Уникальной информацией о структурно-динамических преобразованиях, различного рода межмолекулярных взаимодействиях и механизмах, лежащих в их основе, являются особенности трансляционной подвижности белков с внутренней неупорядоченной структурой. Несмотря на неугасающий интерес со стороны биохимиков и биофизиков во всем мире, эта область знаний, находится на начальных этапах своего развития. Оказалось, что до сих пор не проводились систематические исследования самодиффузии белков с внутренней неупорядоченной структурой в области концентрированных растворов, при которых существенный вклад в трансляционную подвижность могут дать межмолекулярные белок-белок взаимодействия, а также сравнение зависимостей коэффициентов самодиффузии (КСД) с известными обобщенными

концентрационными зависимостями глобулярных белков, линейных гибкоцепных полимеров и дендримеров.

В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал и выявлены закономерности трансляционной подвижности молекул глобулярных белков в широком диапазоне концентраций (для всей области растворимости белка), линейных гибкоцепных полимеров и дендримеров.

В отличие от хорошо структурированных глобулярных белков, которые могут быть успешно охарактеризованы с помощью, например, рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии, характеристика структурно-динамических свойств внутренне неупорядоченных или частично развернутых белков остается сложной задачей.

Целью работы является экспериментальное исследование и установление характерных особенностей трансляционной подвижности и надмолекулярной организации белков с внутренней неупорядоченной структурой на примере водных растворов а- и к-казеина в широком диапазоне концентраций по данным метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить вид концентрационных зависимостей средних коэффициентов самодиффузии молекул белков с внутренней неупорядоченной структурой (а-казеин и к-казеин) и сравнить их с ранее установленными обобщенными концентрационными зависимостями КСД для линейных гибкоцепных полимеров, дендримеров и глобулярных белков.

2. На основе анализа зависимостей формы диффузионных затуханий от концентрации, времени диффузии и других условий эксперимента исследовать признаки самоорганизации белков с внутренней неупорядоченной структурой.

3. Исследовать влияние на трансляционную подвижность молекул а- и к-казеина и их способность к самоорганизации широко известного восстановителя дисульфидных связей ТСЕР.

4. На основе анализа всего комплекса экспериментальных данных оценить возможность определения особых признаков, типичных только для класса белков с внутренней неупорядоченной структурой.

Научная новизна.

Впервые методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР с ИГМП) в широком диапазоне концентраций детально исследованы особенности трансляционной подвижности молекул в водных растворах а-казеина и к-казеина, как типичных представителей нового класса белков - белков с неупорядоченной внутренней структурой.

Показано, что форма диффузионных затуханий (ДЗ) молекул а-казеина описывается простой экспоненциальной функцией в области разбавленных растворов, но по мере увеличения концентрации приобретает сложный вид. Кроме того, форма ДЗ зависит от времени диффузии и времени выдержки образца. При этом для растворов к-казеина эти особенности наблюдаются во всей области концентраций, включая разбавленные растворы.

Установлено, что в концентрированных растворах а- и к-казеина порядка 90% и 40% молекул белка, соответственно, могут быть организованы в надмолекулярную структуру, удовлетворяющую признакам геля. Отличительной особенностью сформированной надмолекулярной структуры, является ее лабильный характер, что подтверждено экспериментами по растворимости в избытке воды. Общим для обеих изученных систем является установленный факт динамического равновесия между свободными молекулами белка и молекулами, входящими в состав сетки геля. Впервые методом ЯМР получены оценки времени жизни молекул а-казеина и к-казеина в сетке геля.

На примере исследованных растворов а-казеина и к-казеина установлен неоднозначный характер влияния на формирование надмолекулярной структуры агента ТСЕР, широко используемого при исследованиях белковых систем в качестве восстановителя дисульфидных связей. Так, в растворах а-казеина ТСЕР предположительно активирует дополнительные химические процессы, которые

приводят к образованию нелабильного и нерастворимого геля. На основе анализа экспериментальных данных сформулирована гипотеза о формировании в присутствии ТСЕР вторичных межмолекулярных -S-S- связей, экранированных для молекул восстановителя. В то же время, в растворах к-казеина наблюдается обратная ситуация: добавление молекул ТСЕР приводит к отсутствию всех, экспериментально регистрируемых до этого, признаков образования геля.

Получены концентрационные зависимости средних коэффициентов самодиффузии молекул белка в исследованных растворах с учетом их нормировки на локальную подвижность. Показано, что вид концентрационной зависимости КСД для растворов к-казеина при выборе в качестве критической концентрации значения 18% с точностью до погрешности эксперимента совпадает с ранее установленным видом обобщенной концентрационной зависимости для линейных макромолекул с конформацией гауссового клубка. При этом, аналогичная концентрационная зависимость молекул белка в растворах а-казеина отличается от всех известных обобщенных зависимостей, как для линейных полимеров, так и для макромолекул с компактной конформацией - дендримеров и глобулярных белков.

Практическая значимость.

Впервые апробирован способ определения и количественной оценки характерного времени жизни молекул в состоянии геля, основанный на анализе данных метода ЯМР с ИГМП.

Данные об особенностях трансляционной подвижности молекул белка с неупорядоченной структурой в концентрированных растворах (условия «self-crowding»), свидетельствующие об образовании надмолекулярной структуры типа геля, методика получения такой информации и использованная система доказательств могут быть востребованы при проведении исследований в более сложных в условиях - условиях, когда окружение для исследуемых молекул белков будет составлено из молекул другого сорта («crowding»).

Проведение исследований белков с внутренней неупорядоченной структурой необходимо для понимания механизмов надмолекулярной организации структур типа трехмерной сетки геля или формирования других типов агрегатов.

Результаты, полученные в данной работе, с одной стороны, дополняют современные представления о механизмах воздействия агента ТСЕР на внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи молекул белков в концентрированных растворах. С другой стороны, полученные на примере концентрированных растворов а-казеина и к-казеина экспериментальные данные свидетельствуют о неоднозначности результатов применения подобных восстанавливающих молекулярных агентов и указывают на необходимость более осторожного их применения и в других исследованиях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальные результаты детального исследования особенностей трансляционной подвижности и надмолекулярной структуры в водных растворах а- и к-казеина, в том числе и при наличии ТСЕР, полученные методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля в спектрально-разрешенном режиме. Данные о регистрации признаков аномальной диффузии и молекулярного обмена в исследованных системах, полученные на основе анализа зависимостей диффузионных затуханий от времени диффузии и от других параметров применяемых импульсных последовательностей.

2. В растворах молекул а-казеина признаки надмолекулярной организации наблюдаются только в концентрированных растворах в отличие от растворов к-казеина, для которого эффекты ассоциации/агрегации регистрируются во всем диапазоне исследованных концентраций от 0.1 до 40 %.

3. Как для растворов а-казеина, так и для растворов к-казеина при высоких концентрациях, характерны признаки образования надмолекулярной структуры типа трехмерной сетки геля. При этом молекулы белка, входящие в структуру геля, находятся в динамическом равновесии со свободными молекулами белка.

4. Впервые полученные данные о характерных временах жизни молекул в состоянии геля и о соотношении долей молекул белка в состоянии геля и в свободном состоянии. Так, для водного раствора а-казеина с концентрацией 15%, доля молекул белка в состоянии геля достигает значения 90%, со средним временем жизни в этом состоянии порядка 3,5 с., а для раствора к-казеина с концентрацией белка 20% такие же характеристики имеют значения ~37% и ~1 с, соответственно.

5. Данные о неоднозначности механизма влияния молекулярного агента ТСЕР, широко используемого в экспериментах с белками с целью восстановления дисульфидных связей между цистеиновыми остатками. Так в разбавленных растворах а-казеина признаки влияния ТСЕР отсутствуют, а в растворах к-казеина они обнаруживаются во всем диапазоне исследованных концентраций белка. При этом, в концентрированных растворах к-казеина его присутствие приводит к исчезновению признаков геля, в то время как в концентрированных растворах а-казеина результат обратный: формируется необратимая структура геля с прочными межмолекулярными связями, за которые могут быть ответственны вторичные межмолекулярные связи, пространственно недоступные для молекул ТСЕР.

6. Вид концентрационной зависимости КСД для растворов к-казеина при выборе в качестве критической концентрации значения 18% с точностью до погрешности эксперимента совпадает с ранее установленным видом обобщенной концентрационной зависимости для линейных макромолекул с конформацией гауссового клубка. В то же время концентрационная зависимость молекул белка в растворах а-казеина отличается от всех известных обобщенных зависимостей, как для линейных полимеров, так и для макромолекул с компактной конформацией -дендримеры и глобулярные белки, что, в отличие от растворов к-казеина, предлагается трактовать как результат существования для а-казеина некоторой пороговой (порядка 4-5%) концентрации белка, при которой индуцируются процессы надмолекулярной организации.

Достоверность полученных результатов.

Экспериментальные результаты исследования воспроизводимы, что подтверждается их повторяемостью при сравнении данных, измеренных, либо в разные периоды времени, либо для вновь приготовленных образцов.

Достоверность обнаруженных зависимостей диффузионных затуханий от времени диффузии и последующих выводов подтверждена результатами проведения контрольных экспериментов при других параметрах импульсной последовательности, позволяющих исключить неоднозначность трактовки первичных экспериментальных данных.

Сформулированные на примере исследованных систем выводы, касающиеся неоднозначности влияния на формирование в исследованных системах надмолекулярных структур восстанавливающего -Б-Б- связи агента ТСЕР, не противоречат ряду литературных источников. При этом, сам факт обнаруженной разнонаправленности результата действия ТСЕР на свойства гелевой структуры в исследованных растворах может быть логически связан, как минимум, с существенно различающимся расстоянием между двумя цистеинами, входящими, соответственно, в структуру молекул аэг-казеина и к-казеина.

Достоверность численных значений коэффициентов самодиффузии, определяемых из анализа экспериментальных диффузионных затуханий определена погрешностью регистрации амплитуд сигнала стимулированного эхо, которая за счет применения режимов накопления сигнала во всех случаях не превышала 10%.

Корректность сопоставления диффузионных затуханий тому или иному молекулярному компоненту исследуемой системы обеспечивалась проведением измерений в спектрально-разрешенном режиме с использованием резонанса ядер как водорода (!И), так и фосфора (31Р).

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и международных конференциях: «Магнитный резонанс и его приложения» (Санкт-Петербург, 2017); «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2017, 2018); «Ломоносов-2018» (Москва, 2018); «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» (Казань, 2018); «MODERN DEVELOPMENT OF MAGNETIC RESONANCE» (Казань, 2018).

Публикация результатов исследований.

Непосредственно по материалам, включенным в диссертацию, опубликовано 2 статьи в журналах, индексируемых Web of Science и 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.

Полный список научных работ автора в области развития методик ЯМР и его приложений дополнительно содержит: 2 статьи в журналах, индексируемых Scopus; два патента РФ; 8 тезисов и материалов конференций.

Личный вклад автора.

Подготовка образцов для ЯМР исследований, постановка и выбор оптимальных параметров в применяемых импульсных последовательностях для обеспечения исследований процессов самодиффузии молекул белка в спектрально-разрешенном режиме в зависимости от времени диффузии, времени хранения образца и других параметров. Интерпретация результатов эксперимента, постановка и проведение дополнительных экспериментов, обеспечивающих получение доказательств достоверности основных получаемых результатов. Подготовка материалов для публикаций.

Обсуждение материалов публикаций осуществлялось совместно с соавторами статей.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, включающего 217 наименований. Работа содержит 167 страниц машинописного текста, в том числе 3 таблицы и 42 рисунка.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе дается краткий обзор литературных данных, касающихся обсуждения особенностей белков с неупорядоченной структурой и результатов их исследования. Также рассмотрены результаты многочисленных работ по изучению трансляционной подвижности линейных макромолекул в растворах, а также молекул с компактной структурой - глобулярных белков, полученные методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Особое внимание обращено на методические разработки применения этого метода в сложных молекулярных системах. В конце главы формулируются задачи настоящего исследования.

1.1 Общая характеристика биополимеров - белков с естественной неупорядоченной структурой

Полимерами (от греч. polus - много и meros - части, сегменты) называются соединения, молекулы которых построены из множества чередующихся атомов или атомных группировок, соединенных химическими связями в длинные цепи [1]. На настоящий момент времени известно огромное количество полимеров. Их можно классифицировать по происхождению, строению, топологической структуре и составу. Однако стоит выделить такие высокомолекулярные соединения как биополимеры, обладающие множеством уникальных свойств

[2,3]:

- нуклеиновые кислоты способны кодировать, хранить и передавать генетическую информацию на молекулярном уровне, являясь материальным субстратом наследственности;

- другой класс биополимеров - мышечные белки, способные превращать химическую энергию в механическую работу; эта их сократительная функция лежит в основе мышечной деятельности белков;

- ферменты, глобулярные белки, обладают каталитической функцией, они с большей скоростью и избирательностью осуществляют в живой природе все химические реакции обмена, распада одних и синтеза других веществ.

Главной отличительной особенностью биополимеров от синтетических полимеров является то, что молекулы белка полностью идентичны друг другу, имеют одинаковую массу, строение и размеры.

На современное представление структуры и функций белка по-прежнему сильно влияет догма молекулярной биологии 19-го века, созданная ключевой парадигмой Эмиля Фишера для ферментативного катализа [4] (сама догма звучит так: один ген - один белок - одна функция). А проведенная в конце 1950 -х годов основополагающая работа над структурой миоглобина [5], а затем работы Анфинсена по взаимосвязи структуры белка с их аминокислотной последовательностью укрепили общее понимание белков как «строго упорядоченных биологических машин». Несмотря на то, что научным сообществом признавалось возможное наличие некоторой степени конформационной гибкости белковой молекулы (индуцированная посадка Кошланда или аналогичные механизмы [6]), белки все равно считались однозначно точно определенными с точки зрения их формы, объема, структуры, пространственной конфигурации и способа укладки полипептидной цепи.

Идея о существовании в природе белков с четко определенной структурой и выполняемой функцией не прижилась надолго. Первое косвенное свидетельство того, что белок функционирует, принимая целый набор конформаций, появилось еще в 1950 году [7]. В результате этого экспериментального исследования бычьего сывороточного альбумина Фред Каруш установил способность различных сайтов этого белка существовать во многих молекулярных конфигурациях с одинаковыми энергиями. Затем в 1971 году появилась первая рентгеновская структура белка (внеклеточная нуклеаза из Staphylococcus aureus) с отсутствующей областью некоторых участков полипептидной спирали на картах электронной плотности [8; 9]. Как правило, основным результатом рентгеноструктурного анализа белковых кристаллов является распределение

электронной плотности внутри элементарной ячейки кристалла [9]. Отсутствие на картах электронной плотности некоторых белков небольших участков аминокислот, связанных пептидной связью, дало основание считать такие участки белков гибкими, а их атомы - обладающими большим уровнем подвижности и, как следствие этого, считать такие участки молекулы биополимера неупорядоченными или неструктурированными. С тех пор было признано существование белков, которые характеризуются высокой гибкостью и наличием неупорядоченных участков полипептидной цепи, но при этом сохраняют своё функционально-активное состояние. Однако по многим причинам они не были в центре внимания. В основном на это в значительной степени повлияли проблемы экспериментального характера: внутренне неупорядоченные белки (ВНБ) нелегко было кристаллизовать для проведения экспериментов рентгеновской дифракции, и большинство биохимических процедур приготовления образцов было сильно смещено в сторону компактных, глобулярных белков [11; 12]

Понадобилось некоторое время, фактически до начала второго тысячелетия, чтобы белки с внутренней неупорядоченной структурой получили признание важной части белковой вселенной, а не рассматривались как случайные особенности избранных белков [13 - 15]. В настоящее время ВНБ образуют четвёртый класс (или «племя») внутри белкового царства, наряду с глобулярными, фибриллярными и трансмембранными белками. В настоящее время получены бесспорные экспериментальные доказательства того, что они вносят вклад в значительную долю как эукариотических, так и прокариотических протеомов, что является важным развитием эволюции [16; 17].

В настоящее время очевидно, что изучение структурно-динамических свойств, процессов агрегации и внутри- и межмолекулярного взаимодействия белков с внутренне неупорядоченной структурой имеет не только фундаментальное, но и практическое значение. Оказалось, что в результате нарушений регуляции и специфическом связывании ВНБ способны образовывать упорядоченные агрегаты - амилоидные фибриллы. Установлено, что именно

такие образования являются причиной многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона [11; 17; 18].

Не менее важно, что физические основы и биофизические свойства белков с внутренней неупорядоченной структурой еще не полностью поняты. Следует обратить внимание на то, что необходимо уметь адекватно описывать это «семейство» белков и правильно соотносить физические свойства ВНБ с их функцией, чтобы лучше понимать структурно-динамические особенности таких белков в целом.

1.2 Особенности структуры и функций белков с естественной

неупорядоченной структурой

На сегодняшний день многие исследователи, работающие с ВНБ, дают лишь частичные описания характерных свойств неупорядоченных белков, так, наиболее распространенное определение состоит в том, что неупорядоченные белки не имеют стабильной третичной структуры в физиологических условиях. Ниже приведен набор других, более конкретных признаков ВНБ:

«Фолдинг (укладка полипептидной цепи) внутренних неупорядоченных белков происходит после взаимодействия с белком-партнером, а для структурированных белков до» [9];

«Функциональная гибкость внутренне неупорядоченных белков определяется сильными изменениями двугранного угла между полипептидными цепями белковой молекулы. В глобулярных белках подобная гибкость соответствует лишь колебаниям вокруг положения равновесия, таким образом, конформация белковой молекулы остается неизменной» [9]

«Мы относим к неупорядоченным участкам, те участки белка, которые находясь в изолированном состоянии (т.е. не взаимодействуют с другими молекулами) не образуют четко определенную 3D структуру, а последовательно производят отбор из доступного большого количества возможных конформаций [16];

«Эти белки ведут себя подобно динамическим ансамблям, в которых положения атомов демонстрируют экстремальные временные флуктуации без конкретных значений равновесия» [11];

«ВНБ не обладают четкой определенной трехмерной структурой, и для них характерен набор возможных конформаций в растворе, сохраняя свою функциональность» [19].

Действительно, трудно дать одно всеобъемлющее определение ВНБ, так как поведение неупорядоченных областей зависит и от среды, и от молекул -партнеров, но, возможно, определение основывается главным образом на функциональной роли таких белков или их неупорядоченных областей.

В настоящее время существует консенсус в отношении использования термина «белки с внутренней неупорядоченной структурой» (или IDP), но до недавнего времени этот класс белков также называли «неструктурированными» или «развернутыми» белками [20]. Оба эти термина вводят в заблуждение, потому что определение неструктурированной молекулы белка предполагает полное отсутствие постоянной и/или временной структур (чем не характерны ВНБ). Так, в работе [21], утверждается, что глобулярные белки в частично свернутых промежуточных состояниях, так и искусственно развернутые сильными денатурантами, такими как мочевина или хлорид гуанидиния (GgmCl), глобулярные белки, переходя из нативно свернутого в расширенное неупорядоченное состояние, не представляют собой идеального гауссова клубка и находятся в состояниями с частичным сохранением вторичной и флуктуирующей третичной структурой, при которых вероятны изменения пространственной ориентации (конфигурации) полипептидной спирали белка [21]. Это состояние называется состоянием расправленной глобулы (MG - Molten globule), то есть в форме традиционно считающейся промежуточной на пути к нативной, «плотно упакованной», структуре [22; 23]. Именно состоянием расплавленной глобулы были описаны состояния для N-концевого домена фосфоглицераткиназы при добавлении GdmCl [24], a-лактальбумина [25] и апомиоглобина (белковая часть миоглобина) [26], цитохром с [27] при низких значениях pH. Однако, не смотря на

то, что ВНБ адаптируют конформации расплавленной глобулы [11], они не являются неструктурированными, а относятся к неупорядоченным.

Кроме того, другой термин «развернутый» некорректно применять к ВНБ, поскольку он предполагает, что молекула белка находится не в своем природном нативном состоянии, или, что такое состояние единственное. Подобные состояния характерны лишь для некоторых ВНБ, для которых фолдинг осуществляется лишь при взаимодействии с партнером [28]. Наконец, ВНБ явно не являются «неправильно свернутыми» белками. Наличие ансамбля конформаций, которое свойственно ВНБ является их естественным состоянием [17; 29].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мельникова Дарья Леонидовна, 2019 год

- - - . - - - -

г а

ч

О 10"2

Л

(Л

10"3

V

10"4

10"5

□ в -1- Пп. р^утегэ, • р -2- к-каве1п, ф>=18% А I -3- а-каве1п, ф>=3%

||||||| I I

0,01

0,1

ф/ф

Л

10

1

Рисунок 5.18 - Зависимость средних значений коэффициентов самодиффузии молекул а- и к-казеина в водных растворах в приведенных координатах в сравнении с универсальной концентрационной зависимостью коэффициентов самодиффузии макромолекул [148].

Для сопоставления полученных концентрационных зависимостей КСД молекул белка с обобщенной кривой [148] мы использовали формальную процедуру подбора значения, так называемой концентрации перекрывания ф, до достижения максимального совпадения кривых. В данном случае, для растворов а-казеина кривая на рисунке 5.18 построена при ф = 3%, а для к-казеина - при ф= 18%. В качестве Э(0) использовались значения измеренных средних КСД, экстраполированные на нулевую концентрацию.

5.5 Заключение к главе 5

Обсуждая полученные результаты в целом, отметим следующее.

В отличие от растворов а-казеина, где надмолекулярная структура формировалась, по нашим данным, только в концентрированных растворах, растворы к-казеина демонстрируют склонность к образованию лабильных надмолекулярных структур во всем исследованном диапазоне концентраций. Этот результат достаточно удивителен и может свидетельствовать о возможности для молекул к-казеина даже при редких контактах белок-белок формировать достаточно долгоживущие ассоциаты.

Одинаковым для обеих систем является то, что данные метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля вполне однозначно указывают на формирование трехмерной структуры геля в концентрированных растворах. Также для обеих системы впервые зафиксировано и охарактеризовано состояние динамического равновесия между свободными молекулами белка и молекулами, входящими в состав структуры геля.

Результат воздействия ТСЕР в растворах к-казеина на первый взгляд окажется ожидаемым. Но это так, если согласиться с имеющейся в литературе точкой зрения относительно участия в механизме образовании ассоциатов дисульфидных связей. В то же время такой результат противоречит нашим данным, согласно которым эти структуры лабильны и имеют конечное время жизни.

В концентрированных растворах к-казеина влияние ТСЕР оказалось противоположным тому, что мы наблюдали для а-казеинов. Согласно нашим данным, в одном случае (а-казеин) его присутствие приводит к формированию еще более устойчивого геля с признаками межмолекулярных химических связей, а в другом (к-казеин) - признаки геля исчезают.

В любом случае можно констатировать, что общим для обеих изученных систем является образование надмолекулярной структуры типа геля в концентрированных системах при отсутствии каких-либо химических добавок.

Неоднозначное влияние на сформированную структуру геля восстанавливающего агента ТСЕР говорит, судя по всему о том, что механизм его влияния не ограничивается только придаваемой ему изначально функцией восстановления дисульфидных связей. Возможно, немаловажную роль играют и другие его свойства, например, свойство электролита.

Для растворов а-казеина мы наблюдали явное несовпадение концентрационной зависимости коэффициентов самодиффузии белка с известными обобщенными кривыми. В том же время для растворов к-казеина формально удается добиться очень хорошего совпадения с видом установленной обобщенной зависимости для линейных гибкоцепных полимеров. На первый взгляд это странный результат, так как тот фактор, который мы использовали при объяснении результатов для а-казеина, в растворах к-казеина должен был бы сработать еще сильнее, поскольку в отличие от а-казеина процессы надмолекулярной организации наблюдаются во всей области исследованных концентраций белка в растворе. С другой стороны, возможно, именно это обстоятельство и оказалось главным. Фактически это означает, что трудно учитываемый фактор искажения вида концентрационной зависимости средних коэффициентов самодиффузии молекул белка в случае к-казеина равномерно «размазан» по всей области концентраций и, по сути нивелируется на этапах нормировки на значения Do и ф. Тогда, следуя такой логике, можно заключить, что результат для растворов а-казеина объясняется как раз тем, что в разбавленных растворах этого белка фактор, связанный с формированием

надмолекулярных образований, не срабатывает в области малых концентраций белка по причине своего отсутствия и начинает проявляться только при концентрациях выше некоторой критической. Согласно нашим данным, значение такой критической концентрации для растворов а-казеина лежит в диапазоне 35% и разделяет области, где признаки межмолекулярных образований не наблюдаются вообще (область разбавленных растворов), и где таковые явно проявляются в виде спектра коэффициентов самодиффузии.

141 ВЫВОДЫ

1. Впервые методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля экспериментально установлено формирование трехмерной структуры геля в концентрированных водных растворах молекул а- и к- казеина, как представителей белков с внутренней неупорядоченной структурой. Получены оценки характерных размеров (40 - 50 нм) между узлами сетки геля.

2. Впервые по данным ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля зафиксировано и охарактеризовано состояние динамического равновесия между свободными молекулами (а- или к- казеина) и молекулами, входящими в состав структуры геля. Получены оценки времен жизни молекул белка в составе структуры геля: ~3,5 с для а-казеина, и <1 с для к- казеина.

3. Установлено, что именно эффект самоорганизации, проявляющийся в системе а-казеин/вода только выше определенной критической концентрации, является причиной аномально сильной концентрационной зависимости средних значений коэффициентов самодиффузии молекул а-казеина в области высоких концентраций, не совпадающей ни с одной из известных обобщенных концентрационных зависимостей средних коэффициентов самодиффузии, ранее установленных для линейных гибкоцепных полимеров, а также для дендримеров и глобулярных белков.

4. Показано, что, в отличие от растворов а-казеина, растворы к-казеина демонстрируют склонность к образованию лабильных надмолекулярных структур - долгоживущих ассоциатов - во всем исследованном диапазоне концентраций. Предположительно, именно по этой причине вид полученной концентрационной зависимости средних коэффициентов самодиффузии молекул к-казеина формально совпадает с видом аналогичной обобщенной функции, характерной для линейных гибкоцепных полимеров.

5. Доказано, что в концентрированных растворах а-казеина молекулы ТСЕР, обладающие функцией восстановления -Б-Б- связей, активируют

дополнительные химические процессы, которые приводят к образованию нелабильного и нерастворимого геля. Предполагается, что основной причиной такого результата является формирование вторичных межмолекулярных дисульфидных связей, пространственно экранированных для дальнейшего доступа молекул ТСЕР.

6. На примере исследованных растворов а- и к-казеина доказано, что стандартная процедура введения молекул ТСЕР в растворы белков с целью обеспечения ими функции восстановления связей, может привести к

неоднозначным результатам по воздействию на формирующуюся надмолекулярную структуру. Так в водных растворах к-казеина молекулы ТСЕР полностью разрушают надмолекулярную структуру, в растворах а-казеина -укрепляют.

143

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.ф.-м.н., профессору Скирде Владимиру Дмитриевичу, чей личный пример, требовательность, постоянная помощь и внимание оказали неоценимое влияние как на научные результаты, так и на развитие личности автора.

Автор благодарит сотрудников кафедры физики молекулярных систем: д.ф.-м.н., проф. Фаткуллина Наиля Фидаиевича, д.ф.-м.н., проф. Филиппова Андрея Васильевича, к.ф.-м.н., инж. Архипова Руслана Викторовича, асс. Александрова Артема Сергеевича, техн., лаб. Тумакаеву Люзию Хафизовну, асп. Иванова Дмитрия Сергеевича за дружескую атмосферу и помощь в работе.

Автор признателен к.ф.-м.н. Несмеловой Ирине Владиславовне за предоставленные образцы для исследований и плодотворное обсуждение экспериментальных результатов.

Отдельные благодарности автор выражает главному инженеру ЦКП ФХИ КФУ Гнездилову Олегу Ивановичу за консультации и поддержку.

Представленные в диссертации ЯМР исследования были выполнены на оборудовании ЦКП ФХИ КФУ спектрометре Bruker AVANCE III 400 WB, оптимизированного для твердого тела, самодиффузии и микротомографии.

Список публикаций автора по теме диссертации

1. Melnikova, D.L. Effect of Intrinsic Disorder and Self-Association on the Translational Diffusion of Proteins: The Case of a-Casein / D.L. Melnikova, V.D. Skirda, I.V. Nesmelova // Journal of Physical Chemistry B. - 2017. - V.121. №14. -P. 2980-2988.

2. Melnikova, D.L. Effect of Reducing Agent TCEP on Translational Diffusion and Supramolecular Assembly in Aqueous Solutions of a-Casein / D.L. Melnikova, V.D. Skirda, I.V. Nesmelova // Journal of Physical Chemistry B. - 2019. - V.123. - P. 2305-2315.

3. Melnikova, D.L. Investigation of a-casein translational mobility by NMR methods / D.L. Melnikova, I.V. Nesmelova, V.D. Skirda // Abstracts of 14th International youth school-conference «Magnetic resonance and its applications». - Saint Petersburg, 2017. - P. 82-84.

4. Мельникова, Д.Л. Трансляционная подвижность и надмолекулярная структура белка альфа-казеина в водных растворах / Д.Л. Мельникова, В.Д. Скирда // Сборник тезисов докладов XXIV Всероссийской конференции "СТРУКТУРА И ДИНАМИКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ". - Йошкар-Ола, 2017. - С. 81.

5. Мельникова, Д.Л. Влияние восстанавливающего агента ТСЕР на процессы гелеобразования в водных растворах белка альфа-казеина / Д.Л. Мельникова, В.Д. Скирда // Сборник тезисов докладов и сообщений на XXV Всероссийской конференции "СТРУКТУРА И ДИНАМИКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ". -Йошкар-Ола: ПГТУ, 2018. - С. 85.

6. Мельникова, Д.Л. Трансляционная подвижность и надмолекулярная организация белков с внутренне неупорядоченной структурой (по данным ЯМР на примере альфа-казеина) [Электронный ресурс] / Материалы Международного молодежного научного форума "ЛОМОНОСОВ-2018" / Отв. ред. И.А. Алешковский, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов. - М.: МАКС Пресс, 2018. - 1 электрон. опт. диск (DVD-ROM); 12 см. - Систем. требования: ПК с

процессором 486+; Windows 95; дисковод DVD-ROM; Adobe Acrobat Reader. -1450 Мб. - 11000 экз.

7. Melnikova, D.L. Towards an alpha-casein translational mobility by NMR / D.L. Melnikova, I.V. Nesmelova, V.D. Skirda // Actual problems of magnetic resonance and its application: program, lecture notes, proceedings of the XX International Youth Scientific School (Kazan, 24-29 September 2018). - Kazan: Kazan University Press, 2018. - P. 112.

8. Melnikova, D.L. Towards an Alpha-Casein Translational Mobility by NMR / D.L. Melnikova, I.V. Nesmelova, V.D. Skirda // Abstracts of the «INTERNATIONAL CONFERENCE "MODERN DEVELOPMENT OF MAGNETIC RESONANCE». -Kazan, 2018. - P.165.

Список цитируемой литературы

1. Клейн, В. И. Термодинамика систем с гибкоцепными полимерами. / В. И. Клейн - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1995. - 736 с.

2. Corey, E. J. Molecules and medicine / E. J. Corey, B. Czako, L. Kürti // John Wiley & Sons. - 2007. - 272 p.

3. Branden, C. Introduction to Protein Structure. / C. Branden and J. Tooze // Garland Science. - 1999. - 410 p.

4. Fischer, E. Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. // Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft. - 1894. - V. 27, Iss. 3. - P. 2985-2993.

5. Kendrew, J. C. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by X-ray analysis / J. C. Kendrew, G. Bodo, H. M. Dintzis, R. G. Parrish, H. Wyckoff, D. C. Phillips // Nature. - 1958. - V. 181, № 4610. - P. 662-666.

6. Koshland Jr, D. E. Enzyme flexibility and enzyme action. Journal of cellular and comparative physiology / D. E. Koshland Jr // J. Cell. Comp. Physiol. - 1959. -V.54, No. S1. - P. 245-258.

7. Karush, F. Heterogeneity of the binding sites of bovine serum albumin1 / F. Karush // J. Am. Chem. Soc. - 1950. - V.72, no. 6. - P. 2705-2713.

8. Arnone, A. A high resolution structure of an inhibitor complex of the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. I. Experimental procedures and chain tracing / A. Arnone, C. J. Bier, F. A. Cotton, V. W. Day, E. E. Hazen, D. C. Richardson, A. Yonath, J. S. Richardson // J. Biol. Chem. -1971. - V. 246. -P. 2302-2316.

9. Uversky, V. N. The case for intrinsically disordered proteins playing contributory roles in molecular recognition without a stable 3D structure / V. N. Uversky, A. K. Dunker // F1000 Biol. Rep. -2013. - V.5, no. 1. - 12 p.

10. Receveur-Brechot, V. Assessing protein disorder and induced folding / V. Receveur-Brechot, J. M. Bourhis, V. N. Uversky, B. Canard, S. Longhi // Proteins. - 2006. - V. 62, no. 1. - P. 24-45.

11. Dyson, H. J. Intrinsically unstructured proteins and their functions / H. J. Dyson, P. E. Wright // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2005. - V. 6, no. 3. - P. 197-208.

12. Serdyuk, I. N. Structured proteins and proteins with intrinsic disorder / I. N. Serdyuk // Molecular Biology. - 2007. - Vol. 41, Iss. 2. - P. 262-277.

13. Dunker, A. K. Intrinsically disordered protein / A. K. Dunker, J. D. Lawson, C. J. Brown et. al. // J. Mol. Graph. Model. - 2001. - V.19, Iss. 1. - P. 26-59.

14. Uversky, V. N. Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions? / V. N. Uversky, J. R. Gillespie, A. L. Fink // Proteins. -2000. -V. 41. - P. 415-427.

15. Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm / P. E. Wright, H. J. Dyson // J. Mol. Biol. - 1999. -V. 293. - P. 321-331.

16. Schlessinger, A. Protein disorder - a breakthrough invention of evolution? / A. Schlessinger, C. Schaefer, E. Vicedo, M. Schmidberger, M. Punta, B. Rost // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2011. - V. 21, Iss. 3. - P. 412-418.

17. Ward, J. J. Prediction and Functional Analysis of Native Disorder in Proteins from the Three Kingdoms of Life / J. J. Ward, J. S. Sodhi, L. J. McGuffin, B. F. Buxton, D. T. Jones // J. Mol. Biol. - 2004. - V. 337. - P. 635-645.

18. Frankel, S. Expression of actin in Escherichia coli: Aggregation, solubilization, and functional analysis / S. Frankel, J. Condeelis, L. Leinwand // J. Biol. Chem.

- 1990. - V. 265, no. 29. - P. 17980-17987.

19. Habchi, J. Introducing protein intrinsic disorder / J. Habchi, P. Tompa, S. Longhi, V. N. Uversky // Chem. Rev. - 2014. - V. 114, Iss. 13. - P. 6561-6588.

20. Oldfield, C. J. Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered protein regions / C. J. Oldfield, A. K. Dunker // Annual review of biochemistry.

- 2014. - Vol. 83. - P. 553-584.

21. Fink, A. L. Discrete intermediates versus molten globule models for protein folding: characterization of partially folded intermediates of apomyoglobin / A. L. Fink, K. A. Oberg, S. Seshadri // Fold. & Des. - 1998. - Vol. 3, no. 1. - P. 19-25.

22. Ptitsyn, O. B. Protein folding: General physical model / O. B. Ptitsyn // FEBS Lett. - 1981. - Vol. 131, Iss. 2. - P. 197-202.

23. Бычкова, В. Е. Расплавленная глобула:45 лет спустя / Бычкова, Г. В. Семисотнов, В. А. Балобанов, А. В. Финкельштейн // Успехи биологической химии. - 2018. - т. 58. - С. 67-100.

24. Cliff, M. J. The denatured state of N-PGK is compact and predominantly disordered / M. J. Cliff, C. J. Craven, J. P. Marston, A. M. Hounslow, A. R. Clarke, J. P. Waltho // J. Mol. Biol. - 2009. -Vol. 385, no. 1. -P. 266-277.

25. Baum, J. Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig alpha-lactalbumin / J. Baum, C. M. Dobson, P. A. Evans, C. Hanley // Biochemistry. - 1989. - Vol. 28, no. 1. - P. 7-13.

26. Fink, A. L. Compact intermediate states in protein folding / A. L. Fink // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. - 1995. -Vol. 24, no 24. - P. 495-522.

27. Pletneva, E. V. Nature of the cytochrome c molten globule / E. V. Pletneva, H. B. Gray, J. R. Winkler // J. Am. Chem. Soc. - 2005. - Vol. 127, no. 44. - P. 15370-15371.

28. Fuxreiter, M. Fuzziness: linking regulation to protein dynamics / M. Fuxreiter // Mol. BioSyst. - 2012. -V. 8, no. 1. - P. 168-177.

29. Janin, J. Protein flexibility, not disorder, is intrinsic to molecular recognition / J. Janin, M. J. E. Sternberg // F1000 Biol. Rep. - 2013. - V. 5, no. 2. - P. 1-7.

30. Peng, Z. More than just tails: intrinsic disorder in histone proteins / Z. Peng, M. J. Mizianty, B. Xue, L. Kurgan, V. N. Uversky // Mol. Biosyst. - 2012. - Vol. 8, Iss. 7. - P. 1886-1901.

31. Babu, M. M. Structural biology. Versatility from protein disorder. / M. M. Babu, R. W. Kriwacki, R. V. Pappu // Science. - 2012. - V. 337, no. 6101. - P. 14601461.

32. Liu, Z. Advantages of proteins being disordered / Z. Liu, Y. Huang // Protein Sci. - 2014. - V. 23, no. 5. - P. 539-550.

33. Dunker, A. K. Intrinsic disorder and protein function / A. K. Dunker, C. J. Brown, J. D. Lawson, L. M. Iakoucheva, Z. Obradovic // Biochemistry. - 2002. - Vol. 41. - P. 6573-6582.

34. Плакунов, В. К. Основы динамической биохимии: учебник / В. К. Плакунов, Ю. А. Николаев. - М.: Логос, 2010. - 216 с. - ISBN 978-5-98704493-3.

35. Villalobo, A. The multifunctional role of phospho-calmodulin in pathophysiological processes / A. Villalobo // Biochemical Journal. - 2018. -V. 475, no 24. - P.4011-4023.

36. Kerruth, S. Calmodulin Interaction with Gap Junction Intracellular Loop Peptides / S. Kerruth, C. Coates, S. A. Rezavi, C. Peracchia, K. Török // Biophysical Journal. - 2018. - V. 114, no. 3. - P. 468a.

37. Vogelstein, B. p53: the most frequently altered gene in human cancers / B. Vogelstein, S. Sur, C. Prives // Nature Education. - 2010. - V. 3, no. 9. - 6 p.

38. Oldfield, C. J. Flexible nets: disorder and induced fit in the associations of p53 and 14-3-3 with their partners / C. J. Oldfield, J. Meng, J. Y. Yang, M. Q. Yang, V. N. Uversky, A. K. Dunker // BMC Genomics. - 2008. - V. 9, Iss. 1:S1. - 20 p.

39. Cozzetto, D. The contribution of intrinsic disorder prediction to the elucidation of protein function / D. Cozzetto, D. T. Jones // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2013.

- V. 23, no. 3. - P. 467-472.

40. Van der Lee, R. Classification of intrinsically disordered regions and proteins / R. Van der Lee, M. Buljan, B. Lang et al. // Chem. Rev. - 2014. - V. 114. - P. 6589-6631.

41. Dunker, A. K. The unfoldomics decade: an update on intrinsically disordered proteins / A. K. Dunker, C. J. Oldfield, J. Meng et al. // BMC Genomics. - 2008.

- V. 9, Suppl 2:S1.

42. Vacic, V. Characterization of molecular recognition features MoRFs and their binding partners / V. Vacic, C. J. Oldfield, A. Mohan et al. // J. Proteome Res. -2007. - V. 6., no. 6. - P. 2351-2366.

43. Smith, D. K. From fundamental supramolecular chemistry to self-assembled nanomaterials and medicines and back again - how Sam inspired SAMul / D. K. Smith // Chemical Communications. - 2018. - Vol. 54, Iss. 38. - P. 4743-4760.

44. Marasco, D. Identification of Inhibitors of Biological Interactions Involving Intrinsically Disordered Proteins / D. Marasco, P. Scognamiglio // Int. J. Mol. Sci. - 2015. - V. 16, no. 12. - P. 7394-7412.

45. Disfani, F. M. MoRFpred, a computational tool for sequence-based prediction and characterization of short disorder-to-order transitioning binding regions in proteins / F. M. Disfani, W. L. Hsu, M. J. Mizianty et al. // Bioinformatics. -2014. - V. 28, Iss. 12. - P. 75-83.

46. Cai, Y. D. Support vector machines for predicting protein structural class / Y. D. Cai, X. J. Liu, X. B. Xu, , G. P. Zhou // BMC bioinformatics. - 2001. - V. 2, no. 1. - 3 p.

47. Mandle, A. K. Protein structure prediction using support vector machine / A. K. Mandle, P. Jain, S. K. Shrivastava // IJSC. - 2012. - Vol.3, no.1. - P. 67.

48. Dosztanyi, Z. ANCHOR: web server for predicting protein binding regions in disordered proteins / Z. Dosztanyi, B. Meszaros, I. Simon // Bioinformatics. -2009. - Vol. 25, Iss.20. - P. 2745-2746.

49. Jones, D. T. DISOPRED3: precise disordered region predictions with annotated protein-binding activity / D. T. Jones, D. Cozzetto // Bioinformatics. - 2014. -V. 31, no 6. - P. 857-863.

50. Brangwynne, C. P. Polymer Physics of Intracellular Phase Transitions / C. P. Brangwynne, P. Tompa, R. V. Pappu // Nat. Phys. - 2015. - V.11. - P. 899-904.

51. Latysheva, N. S. How do disordered regions achieve comparable functions to structured domains? / N. S. Latysheva, T. Flock, R. J. Weatheritt, S. Chavali, M. M. Babu // Protein Sci. - 2015. - V. 24. - P. 909-922.

52. Toretsky, J. A. Assemblages: functional units formed by cellular phase separation / J. A. Toretsky, P. E. Wright // J. Cell Biol. - 2014. - V. 206. - P. 579-588.

53. Garma, L. How many protein-protein interactions types exist in nature? / L. Garma, S. Mukherjee, P. Mitra, Y. Zhang // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, Iss. 6 -P. 38913.

54. Spirin, V. Protein complexes and functional modules in molecular networks / V. Spirin, L. A. Mirny // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2003. - V. 100. -P. 1212312128.

55. Mukherjee, S. Protein-protein complex structure predictions by multimeric threading and template recombination / S. Mukherjee, Y. Zhang // Structure. -2011. - V.19. - P.955-966.

56. Lu, L. MULTIPROSPECTOR: an algorithm for the prediction of protein-protein interactions by multimeric threading / L. Lu, H. Lu, J. Skolnick // Proteins. -2002. - Vol. 49. - P. 350-364.

57. Aloy, P. Structure-based assembly of protein complexes in yeast / P. Aloy, B. Bottcher, H. Ceulemans, C. Leutwein et al. // Science. - 2004. - V. 303. - P. 2026-2029.

58. Avena-Bustillos, R. J. Water vapor permeability of caseinate-based edible films as affected by pH, calcium crosslinking and lipid content / R. J. Avena-Bustillos, , J. M. Krochta // Journal of food science. - 1993. - V. 58, no. 4. - P. 904-907.

59. Kester, J. J. Modification of whey proteins to improve functionality / J. J. Kester, T. Richardson //Journal of Dairy Science. - 1984. - Vol. 67, Iss. 11. - P. 2757-2774.

60. Verbeek, C. J. R. Extrusion processing and properties of protein-based thermoplastics / C. J. R. Verbeek, L. E. van den Berg // Macromolecular materials and engineering. - 2010. - V. 295, no. 1. - P. 10-21.

61. Uzman, A. Molecular biology of the cell: Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P. - 2003.

62. Berg, J. M. John L TYMOCZKO a Lubert STRYER. Biochemistry. - 2002.

63. Singh, R. R. Structural stability of human a-thrombin studied by disulfide reduction and scrambling / R. R. Singh, J. Y. Chang // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. - 2003. - Vol. 1651, Iss. 2. - P. 85-92.

64. Bush-Pelc, L. A. Important Role of the Cys191-Cys220 Disulfide Bond in Thrombin Function and Allostery / L. A. Bush-Pelc et al // Journal of Biological Chemistry. - 2007. - V. 282, Iss. 37. - P. 27165-27170.

65. Pineda, A. O. Molecular dissection of Na+ binding to thrombin / A. O. Pineda et al. // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - V. 279, Iss. 30. - P. 3184231853.

66. Aslund, F. Bridge over troubled waters: sensing stress by disulfide bond formation / F. Aslund, J. Beckwith // Cell. - 1999. - Vol. 96, no. 6. - P. 751753.

67. Vogl, T. Mechanism of protein stabilization by disulfide bridges: calorimetric unfolding studies on disulfide-deficient mutants of the a-amylase inhibitor Tendamistat / T. Vogl et al. // Journal of molecular biology. - 1995. - V. 254, no. 3. - P. 481-496.

68. Rajagopalan, L. Role of intramolecular disulfides in stability and structure of a noncovalent homodimer / L. Rajagopalan, C. C. Chin, K. Rajarathnam // Biophysical journal. - 2007. - Vol. 93, Iss. 6. - P. 2129-2134.

69. Wedemeyer, W. J. Disulfide bonds and protein folding / W. J. Wedemeyer et al. // Biochemistry. - 2000. - V. 39, no. 15. - P. 4207-4216.

70. Bulaj G. Formation of disulfide bonds in proteins and peptides //Biotechnology advances. - 2005. - V. 23, no. 1. - P. 87-92.

71. Annis, I. Disulfide bond formation in peptides / I. Annis, B. Hargittai, G. Barany // Methods in enzymology. - Academic Press, 1997. - V. 289. - P. 198-221.

72. Bessette, P. H. Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm / P. H. Bessette et al // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1999. - V. 96, no. 24. - P. 13703-13708.

73. Bulaj, G. Ionization- reactivity relationships for cysteine thiols in polypeptides / G. Bulaj, T. Kortemme, D. P. Goldenberg // Biochemistry. - 1998. - Vol. 37, Iss. 25. - P. 8965-8972.

74. Creighton T. E. Protein folding coupled to disulphide bond formation / T. E. Creighton // Biological Chemistry-Hoppe Seyler. - 1997. - V. 378, no. 8. - P. 731-744.

75. Mansfeld, J. Extreme stabilization of a thermolysin-like protease by an engineered disulfide bond / J. Mansfeld et al. // Journal of Biological Chemistry.

- 1997. - V. 272, no. 17. - P. 11152-11156.

76. Moroder, L. Oxidative folding of cystine -rich peptides vs regioselective cysteine pairing strategies / L. Moroder et al. // Peptide Science. - 1996. - V. 40, no. 2. -P. 207-234.

77. Barone, J. R. Blends of cysteine-containing proteins / J. R. Barone, K. Dangaran, W. F. Schmidt // Journal of agricultural and food chemistry. - 2006. -V. 54, no. 15. - P. 5393-5399.

78. Sawyer, W. H. Thermodenaturation of bovine ß-lactoglobulin: kinetics and the introduction of ß-structure / W. H. Sawyer, R. S. Norton, L. W. Nichol, G. H. McKenzie // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure. - 1971. -Vol. 243, no. 1. - P. 19-30.

79. Lu, B. Y. Rapid and irreversible reduction of protein disulfide bonds / B. Y. Lu, J. Y. Chang // Analytical biochemistry. - 2010. - V. 405, no. 1. - P. 67-72.

80. Cremers, C. M. Oxidant sensing by reversible disulfide bond formation / C. M. Cremers, U. Jakob // Journal of Biological Chemistry. - 2013. - V. 288, no. 37.

- P. 26489-26496.

81. Marino, S. M.Cysteine function governs its conservation and degeneration and restricts its utilization on protein surfaces / S. M. Marino, V. N. Gladyshev // Journal of molecular biology. - 2010. - V. 404, Iss. 5. - P. 902-916.

82. Maulik Trivedi, M. V. The role of thiols and disulfides on protein stability / M. V. Maulik Trivedi, J. S. Laurence, T. J. Siahaan // Current Protein and Peptide Science. - 2009. - Vol. 10, Iss. 6. - P. 614-625.

83. Woycechowsky, K. J. Native disulfide bond formation in proteins / K. J. Woycechowsky, R. T. Raines // Current opinion in chemical biology. - 2000. -V. 4, Iss. 5. - P. 533-539.

84. Felicia Hammann and Markus Schmid Determination Quantification of Molecular Interactions in Protein Films: A Review Materials 2014, 7(12), 79757996

85. Tan, C. Y. Supramolecular protein assembly supports immobilization of a cytochrome P450 monooxygenase system as water-insoluble gel / C. Y. Tan, H. Hirakawa, T. Nagamune // Scientific reports. - 2015. - V. 5. - P. 8648.

86. Anoop, A. Elucidating the Role of Disulfide Bond on Amyloid Formation and Fibril Reversibility of Somatostatin-14 RELEVANCE TO ITS STORAGE AND SECRETION / A. Anoop, S. Ranganathan // Journal of Biological Chemistry. -2014. - V. 289, no. 24. - P. 16884-16903.

87. Kurouski, D. The impact of protein disulfide bonds on the amyloid fibril morphology / D. Kurouski, I. K. Lednev // International journal of biomedical nanoscience and nanotechnology. - 2011. - Vol. 2, no. 2. - P. 167.

88. Li, Y. Dissecting the role of disulfide bonds on the amyloid formation of insulin / Y. Li, H. Gong et al. // Biochemical and biophysical research communications. - 2012. - Vol. 423, Iss. 2. - P. 373-378

89. Thorn D. C. et al. Amyloid fibril formation by bovine milk as2-casein occurs under physiological conditions yet is prevented by its natural counterpart, asl-casein // Biochemistry. - 2008. - V. 47, no. 12. - P. 3926-3936.

90. Holt, C. Darwinian transformation of a 'scarcely nutritious fluid'into milk / C. Holt, J. A. Carver // Journal of evolutionary biology. - 2012. - Vol. 25, no. 7. -P. 1253-1263.

91. Pan, K. Amyloid-like fibrils formed from intrinsically disordered caseins: physicochemical and nanomechanical properties / K. Pan, Q. Zhong // Soft matter. - 2015. - V. 11, Iss. 29. - P. 5898-5904.

92. Farrell, H. M. Environmental influences on bovine K-casein: reduction and conversion to fibrillar (amyloid) structures / H. M. Farrell et al. // Journal of protein chemistry. - 2003. - V. 22, no. 3. - P. 259-273.

93. Leonil, J. Kinetics of fibril formation of bovine K-casein indicate a conformational rearrangement as a critical step in the process / J. Leonil et al. // Journal of molecular biology. - 2008. - V. 381, no. 5. - P. 1267-1280.

94. Rieloff, E. Assessing the Intricate Balance of Intermolecular Interactions upon Self-Association of Intrinsically Disordered Proteins // E. Rieloff, M. D. Tully, M. Skepo / Journal of molecular biology. - 2019. - V. 431, Iss. 3. - P. 511-523.

95. Uversky V. N. Intrinsically disordered proteins and their (disordered) proteomes in neurodegenerative disorders / V. N. Uversky // Frontiers in aging neuroscience. - 2015. - V. 7. - P. 18.

96. Eliezer D. Biophysical characterization of intrinsically disordered proteins / D. Eliezer // Current opinion in structural biology. - 2009. - V. 19, no. 1. - P. 2330.

97. Кузнецова, И. М. Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков: дис. ... д-ра. биол. наук: 03.00.03 / Кузнецова Ирина Михайловна. - СПб., 2006. - 303 с.

98. Privalov, P. L. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins / P. L. Privalov, S. A. Potekhin // Methods in enzymology. -Academic Press, 1986. - V. 131. - P. 4-51.

99. Кузнецова, И. М. Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков / И. М. Кузнецова, В. Форже, К. К. Туроверов // Цитология. - 2005. - Т. 47. -№. 11. - С. 943-952.

100. Mittag, T. Atomic-level characterization of disordered protein ensembles / T. Mittag, J. D. Forman-Kay // Current opinion in structural biology. - 2007. - V. 17, no 1. - P. 3-14.

101. Liu, J. Loopy proteins appear conserved in evolution / J. Liu, H. Tan, B. Rost // Journal of molecular biology. - 2002. - Vol. 322, Iss. 1. - P. 53-64.

102. Khrapunov, S. Circular dichroism spectroscopy has intrinsic limitations for protein secondary structure analysis / S. Khrapunov // Anal. Biochem. - 2009. -Vol. 389, Iss. 2. - P.174-176.

103. Khrapunov, S. Solution Structure and Refolding of the Mycobacterium tuberculosis Pentapeptide Repeat Protein MfpA / S. Khrapunov, H. Cheng, S. Hegde, J. Blanchard, M. Brenowitz // Journal of Biological Chemistry. - 2008. -V. 283. - P. 36290-36299.

104. Kjaergaard, M. Temperature-dependent structural changes in intrinsically disordered proteins: formation of alpha-helices or loss of polyproline II? / M. Kjaergaard, A. B. Norholm, R. Hendus-Altenburger, S. F. Pedersen, F. M. Poulsen, B. B. Kragelund // Protein Sci. - 2010. -Vol. 19, Iss. 8. - P.1555-1564.

105. LeVine H. 3rd. 1999. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309:274-84.

106. Воропай, Е. С. 2003. Спектральные свойства тиофлавина Т и его комплексов с амилоидными фибриллами / Е. С. Воропай, М. П. Самцов, К. Н. Каплевский, А. А. Маскевич и др. // Ж. прикл. спектр. - T. 70, № 6. - C. 767-773.

107. Nilsson, M. R. Techniques to study amyloid fibril formation in vitro / M. R. Nilsson // Methods. - 2004. - V. 34, no. 1. - P. 151-160.

108. Маскевич, А. А. Флуоресцентные свойства тиофлавина Т при его встраивании в у-циклодестрин / А. А. Маскевич, М. В. Легеда, К. К. Туроверов, И. М. Кузнецова // Сб.: Молекулярные мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. - 2004. - ч. 5. - С.30-32.

109. Hurley, T. D. Structural basis for regulation of protein phosphatase 1 by inhibitor-2 / Hurley TD, Yang J, Zhang L, Goodwin KD, Zou Q, Cortese M, Dunker AK, De Paoli-Roach AA // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282, no.39. -P. 28874-28883.

110. Hanna, R. A. Calcium-bound structure of calpain and its mechanism of inhibition by calpastatin / R. A. Hanna, R. L. Campbell, P. L. Davies // Nature. -2008. - V. 456, Iss. 7220. - P. 409-412.

111. Mittag, T. Atomic-level characterization of disordered protein ensembles / T. Mittag, J. D. Forman-Kay // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2007. - V.17, no. 1. - P. 3-14.

112. Bernado, P. Structural analysis of intrinsically disordered proteins by small-angle X-ray scattering / P. Bernado, D. I. Svergun // Molecular biosystems. - V. 8, Iss. 1. - P.151-167.

113. Uversky, V. N. Unusual Biophysics of Intrinsically Disordered Proteins / V. N. Uversky // Biochim. Biophys. Acta - 2013. - V. 5, № 1834. - P. 932-951.

114. Shi, D. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals / D. Shi, B. L. Nannenga, M. G. Iadanza, T. Gonen // Elife. - V.2. - P.1345.

115. Holcomb, J. Protein crystallization: Eluding the bottleneck of X-ray crystallography / J. Holcomb, N. Spellmon, Y. Zhang, M. Doughan, C. Li, Z. Yang // AIMS Biophys. - 2017. - V.4, Iss. 4. - P. 557-575.

116. Alaimo, M. H. Conformational analysis of the hydrophobic peptide as1-casein (136-196). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) / M. H. Alaimo, H. M. Farrell, M. W. Germann // Protein Structure and Molecular Enzymology. -1999. -V. 1431, Iss. 2. - P. 410-420.

117. Mohan, M. S. Casein Micelles and their Properties: Polydispersity, Association with Vitamin A and Effect of Ultra-High Pressure Homogenization / M. S. Mohan // PhD diss., University of Tennessee. - 2014. - 150 p.

118. Couser, W. G. Nobel Prize in Chemistry: Editor-in-Chief's Comments / W. G. Couser // Journal of the American Society of Nephrology. - 2004. - Vol. 15, no. 4. - P. 1091-1092.

119. Zhang, Y. Quantitating morphological changes in biological samples during scanning electron microscopy sample preparation with correlative superresolution microscopy / Y. Zhang, T. Huang, D. M. Jorgens, A. Nickerson, L. J. Lin, J. Pelz, J. W. Gray, C. S. Lopez, X. Nan // PloS one. - 2017. - V. 12, no. 5. - P. 176839.

120. Michler G. H. Electron Microscopy of Polymers. Springer Science & Business Media - 2008. - ISBN:978-3-540-36350-7.

121. Butler, J. H. Low-voltage scanning electron microscopy of polymers / J. H. Butler, D. C. Joy, G. F. Bradley, S. J. Krause // Polymer. - 1995. -Vol. 36, Iss. 9. - P. 1781-1790.

122. Murphy, P.J. Visualization of recombinant DNA and protein complexes using atomic force microscopy / P. J. Murphy, M. Shannon, J. Goertz // J. Vis. Exp. -2011. - V.53. - P. 3061.

123. Baclayon, M. Sampling protein form and function with the atomic force microscope / M. Baclayon, W. H. Roos, G. J. Wuite // Molecular & Cellular Proteomics. - 2010. - V. 9, no. 8. - P. 1678-1688.

124. Yang, C.W. Imaging of soft matter with tapping-mode atomic force microscopy and non-contact-mode atomic force microscopy / C. W. Yang, S. Hwang, Y. F. Chen, C. S. Chang, D. P. Tsai // Nanotechnology. - 2007. - V. 18, no. 8. - P. 084009.

125. Robenek, H. Recent advances in freeze-fracture electron microscopy: the replica immunolabeling technique / H. Robenek // Biol. Proced. - 2008. - V.10. - P. 919.

126. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy / J. L. Carson // J. Vis. Exp. - 2014. - V. 91. - P. 51694.

127. Kosol, S. Structural Characterization of Intrinsically Disordered Proteins by NMR Spectroscopy / S. Kosol, S. Contreras-Martos, C. Cedeño, P. Tompa // Molecules. - 2013. - V. 18. - P. 10802-10828.

128. Brutscher, B. NMR Methods for the Study of Instrinsically Disordered Proteins Structure, Dynamics, and Interactions: General Overview and Practical Guidelines / B. Brutscher, I. C. Felli, S. Gil-Caballero et al. // Experimental Medicine and Biology. - 2015. - V. 870. - P. 49-122.

129. Konrat, R. NMR contributions to structural dynamics studies of intrinsically disordered proteins / R. Konrat // J. Magn. Reson. - 2014. - V. 241, no. 100. -P. 74-85.

130. Taveras, J. M. Nuclear magnetic resonance imaging / J. M. Taveras // American Journal of Roentgenology. - 1982. - V. 139, no. 2. - P. 406-407.

131. Sugiki, T. Modern Technologies of Solution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Three-dimensional Structure Determination of Proteins Open Avenues for Life Scientists / T. Sugiki, N. Kobayashi, T. Fujiwara // Elsevier Computational and Structural Biotechnology Journal. - 2017. - V. 15. - P. 328339.

132. Wuthrich, K. Sequential resonance assignments as a basis for determination of spatial protein structures by high resolution proton nuclear magnetic resonance / K. Wuthrich, G. Wider, G. Wagner, W. Braun // J. Mol. Biol. - 1982. - V. 155, no. 3. - P. 311-319.

133. Wuthrich, K. NMR with proteins and nucleic acids / K. Wuthrich // Europhysics News. -1986. - V. 17, no. 1. - P.11-13.

134. Wider G. Homonuclear Two Dimensional 1H NMR of Proteins. Experimental Procedures / G. Wider, S. Macura, A. Kumar, R. R. Ernst, K. Wuthrich // J. Magn. Reson. - 1984. - V. 56. - P. 207-234.

135. Havel, T. F. An Evaluation of the Combined Use of Nuclear Magnetic Resonance and Distance Geometry for the Determination of Protein Conformations in Solution / T. F. Havel, K. Wuthrich // J. Mol. Biol. - 1985. -V. 182. - P. 281-294.

136. Резибуа П., Де Ленер М. Классическая кинетическая теория жидкости и газов. - М.: Мир, 1980. - 423 с.

137. Stejskal, E. O. Spin diffusion measurements: Spin echoes in the presence of a time-dependent field gradient / E. O. Stejskal, J. E. Tanner // J. Chem. Phys. -1965. - V. 42. - P. 288-292.

138. Tanner, J. E. Use of the Stimulated Echo in NMR Diffusion Studies / J. E. Tanner // J. Chem. Phys. - 1970. - V. 52, no. 5. - P. 2523-2526.

139. Готлиб, Ю. Я. Изучение диффузии малых молекул и звеньев макромолекул в растворах полимеров люминесцентными методами. / Ю. Я. Готлиб, С. П. Козел, Г. И. Лашков и др. // Диффузионные явления в полимерах: Тезисы докладов III Всер. конф. Рига - 1977. - ч.1. - С.43-44.

140. Цветков, В. Н. Структура макромелекул в растворах / В.Н. Цветков, В. Е. Эскин, С. Я. Френкель - М.:Наука, 1965. - 719 с.

141. Де Жен П. Идеи скейлинга в физике полимеров / Де Жен П. - Пер. с англ., М.:Мир,1982. - 384 с.

142. Lozovoi, A. Segmental dynamics of polyethylene-alt- propylene studied by NMR spin echo techniques / A. Lozovoi, C. Mattea, M. Hofmann, K.

Saalwaechter, N. Fatkullin, S. Stapf // The Journal of Chemical Physics. - 2017. - V.146, no. 22. - P. 224901.

143. Skirda V.D., Sundukov V.I., Maklakov A.J. et all // Polimer. 1998. - V. 29. -№7. - P.1294

144. Sundukov V.I. Skirda V., Maklakov A.I. Polymer Bulletin", №14, 1985, p.153-156.

145. Гринберг, Ф. А. Самодиффузия в расплавах полиблочного сополимера полисульфон-полибутадиена / Ф. А. Гринберг, В. Д. Скирда, А. И. Маклаков, Л. З. Рогозина, Г. Г. Никифорова // Высокомолек. соед. - 1987.-T. 29, № 10. - С. 2029-2034.

146. Blum F.D. NMR Measurements of Solvent Self-Diffusion Coefficients in Polymer Solutions / F.D. Blum, S. Pickup, R.A. Waggoner // PLoS One. - 2013. -V.12. - P. 2814.

147. Skirda, V. D. On the Generalized Concentration and Molecular Mass Dependencies of Macromolecular Self-Diffusion in Polymer-Solutions / V. D. Skirda, V. I. Sundukov, A. I. Maklakov, O. E. Zgadzai, I. R. Gafurov, G.I. Vasiljev // Polymer. - 1988. - V. 29. - P. 1294-1300.

148. Маклаков, А. И. Самодиффузия в расплавах полимеров Самодиффузия в растворах и расплавах полимеров / А. И. Маклаков, В. Д. Скирда, Н. Ф. Фаткуллин. - Казань: Казанский университет. - 1987. - 220 с.

149. Скирда, В.Д. Особенности ядерной магнитной релаксации и молекулярного движения в аморфных полимерах: дис. на соискание степени канд. физ.-мат. наук: 01.04.15 / Скирда Владимир Дмитриевич. -Казань, 1978. - 169 с.

150. Маклаков, А.И. Самодиффузия макромолекул в растворах полимеров. / А. И. Маклаков, В. А. Севрюгин, В. Д. Скирда, Н. Ф. Фаткуллин // Высокомолекул. соед. - 1984. - Т. 26А, №12. - С. 2502-2507.

151. Скирда, В. Д. Ядерная релаксация в расплавах полиэтиленгликоля / В. Д. Скирда, А. И. Маклаков // Казанский гос. ун-т. - Казань, 1978. - 26 с.

152. Skirda, V. D. Peculiarities of self-diffusion of alkane molecules in kaolinite / V. D. Skirda, V. I. Sundukov, A. I. Maklakov, M. V. Belousova R.R. // Apl. Magn. Resonance. - 1991. - V. 12. - P. 83.

153. Nesmelova, I. V. Generalized Concentration Dependence of Globular Protein Self-Diffusion Coefficients in Aqueous Solutions. / I.V. Nesmelova, V. D. Skirda, V. D. Fedotov // Biopolymers. - 2002. - V.63. - P. 132-140.

154. Sagidullin, A. I. Self-diffusion of low-generation PAMAM dendrimers with hydroxyl surface groups in solutions: a general regularity / A. I. Sagidullin, V. D. Skirda et al. // Appl. Magn. Reson. - 2003. - V.25. - P. 129-156.

155. Sagidullin, A. I. Generalized concentration dependence of selfdiffusion coefficients in polyallylcarbosilane dendrimer solutions / A. I. Sagidullin, A. M. Muzafarov, M. A. Krykin, A. N. Ozerin, V. D. Skirda, G. M. Ignat'eva // Macromolecules. - 2002. - V. 35. - P. 9472-9479.

156. Andrews, A. L. Conformation and Aggregation of Bovine Beta-Casein / A. L. Andrews, D. Atkinson, M. T. Evans, E. G. Finer, J. P. Green, M. C. Phillips, R. N. Robertson // Molecular Aspects of Thermal Aggregation. Biopolymers. -1979. -V.18. - P. 1105-1121.

157. O'Connell, J. E. Association Behavior of Beta-Casein. / J. E. O'Connell, V. Y. Grinberg, C. G. de Kruif // J. Colloid Interface Sci. - 2003. - V. 258. - P.33-39.

158. Uversky, V. N. Accelerated alpha-synuclein fibrillation in crowded milieu / V. N. Uversky, E. M. Cooper, K. S. Bower, J. Li, A. L. Fink // FEBS Lett. - 2002. - 515. - pp. 99-103.

159. Fukuchi, S. IDEAL:Intrinsically Disordered proteins with Extensive Annotations and Literature / S. Fukuchi, S. Sakamoto et al. // Nucleic Acid Research. - 2012. - V.40. - P.507-511.

160. Colsenet, R. Effect of Casein Concentration in Suspensions and Gels on Polyethylene glycols NMR Self-Diffusion Measurements / R. Colsenet, O. Soderman, F. Mariette // Macromolecules. - 2005. - V.38, № 22. - P. 91719179.

161. Энштейн А., Смолуховский М. Брауновское движение: Сбор. статей. / Пер. с англ. К.И. Федченко; под ред. Б.И. Давыдова. - М.: ОНТИ, 1936. - 608 с.

162. Туницкий, Н. Н. Диффузия и случайные процессы. - Новосибирск: Наука, 1970. - 116 с.

163. Ахизер А. И., Пелешминский С. В. Методы статистической физики. - М.: Наука, 1977. - 368 с.

164. Holz, M. Temperature-dependent self-diffusion coefficients of water and six selected molecular liquids for calibration in accurate 1H NMR PFG measurements / M. Holz, S. R. Heila, A. Saccob // Physical Chemistry Chemical Physics. - 2000. - Is. 20 - P. 4740-4742.

165. Demirci, U. Gels Handbook. Fundamentals of Hydrogels / U. Demirci, A. Khademhosseini // World Scientific. - 2016. - 1172 p.

166. Syme, C.D. Raman Optical Activity Study of Rheomorphism in Caseins, Synucleins and Tau. New Insight into the Structure and Behaviour of Natively Unfolded Proteins / C. D. Syme, E. W. Blanch, C. Holt, R. Jakes, M. Goedert, L. Hecht, L. D. Barron // Eur. J. Biochem. - 2002. - V. 269. - P.148-156.

167. Van Hove, L. Correlations in space and time and Born approximation scattering in systems of interacting particles / L. Van Hove // Phys. Rev. - 1954. - V.95, Iss. 1. - P.249-262.

168. Kunz, C. Human-Milk Proteins: Analysis of Casein and Casein Subunits by Anion-Exchange Chromatography, Gel Electrophoresis, and Specific Staining Methods./ C. Kunz, B. Lonnerdal // Am. J. Clin. Nutr. - 1990. - V.51. - P. 3746.

169. Holt, C. Predicted Secondary Structures of the Caseins in Relation to Their Biological Functions / C. Holt // Protein Eng. - 1988. - V.2. - P.251-259.

170. Sawyer, L. The Secondary Structure of Milk Proteins and Their Biological Function. / L. Sawyer, C. Holt // J. Dairy Sci. - 1993. - V.76. - P.3062-3078.

171. Redwan, E. M. Disorder in Milk Proteins: Caseins, Intrinsically Disordered Colloids / E. M. Redwan, B. Xue, H. A. Almehdar, V. N. Uversky // Curr. Protein Pept. Sci. - 2015. - V. 16, no. 3. - P. 228-242.

172. Byler, D. M. Raman-Spectroscopic Study of Casein Structure / D. M. Byler, H. M. Farrell, H. Susi // J. Dairy Sci. - 1988. - V.71. - P.2622-2629.

173. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry / H. E Swaisgood // Journal of dairy science. - 1993. - V. 76, no. 10. - P. 3054-3061.

174. Tziboula, A. The role of aS1-casein in the structure of caprine casein micelles / A. Tziboula, D. S. Horne // Int. Dairy J. -1999. - V. 9. - P. 173-178.

175. Rasmussen, L. K. Localization of two interchain disulfide bridges in dimers of bovine alphaS2-casein / L. K. Rasmussen, P. Hojrup, Т. E. Petersen // European Journal of Biochemistry. - 1992. - V. 203, no. 3. - P. 381-386.

176. Huppertz, T. The caseins: Structure, stability, and functionality / T. Huppertz, P. F. Fox, A. L. Kelly // Proteins in food processing. Woodhead Publishing. -2018. - P. 42-92.

177. Kumosinski, T. F. Three-Dimensional Molecular Modeling of Bovine Caseins: к-Casein / T. F. Kumosinski, E. M. Brown, H. M. Farrell // Journal of dairy science. - 1991. - V. 74, no. 9. - P. 2879-2887.

178. Hoagland, P. D. Secondary Structure of Bovine aS2-Casein: Theoretical and Experimental Approaches / P. D. Hoagland, J. J. Unruh, E. D. Wickham, H. M. Farrell // J. Dairy Sci. - 2001. - V. 84. - P.1944-1949.

179. Pepper, L. Interactions Leading to Formation of Casein Submicelles / L. Pepper, H. M. Farrell // Journal of Dairy Science. -1982. - V. 65, no. 12. - P. 22592266.

180. Vreeman, H. J. Purification and some physicochemical properties of bovine kappa-casein / H. J. Vreeman, P. Both, J. A. Brinkhuis // Biochimica et biophysica acta. - 1977. - V. 491, Iss. 1. - P. 93-103.

181. Стройлова, Ю. Ю. Роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином : дис. ... канд. физ.-мат. наук : 03.01.04 : защищена 15.11.10 / Стройлова Юлия Юрьевна. - Москва, 2010. - 215 с.

182. Burns, J. A. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl) phosphine / J. A. Burns, J. C. Bulter, J. Moran, G. M. Whitesides // J. Org. Chem. - 1991. -V.56. - P. 2648-2650.

183. Han, J. C. A Procedure for Quantitative Determination of Tris(2-carboxyethyl)phosphine, an Odorless Reducing Agent More Stable and Effective Than Dithiothreitol / J. C. Han, G. Y. Han // Analytical biochemistry. - 1994. - V. 220, Iss. 1. - P. 5-10.

184. Millero, F. J. Density and viscosity of deuterium oxide solutions from 5-70. deg. / F. J. Millero, R. Dexter, E. Hoff // J. Chem. Eng. Data. -1971. - V.16, no.1. -P. 85-87.

185. McMeekin, T. L. Apparent Specific Volume of a-Casein and в-Casein and the Relationship of Specific Volume to Amino Acid Composition / T. L. McMeekin, M. L. Groves, N. J. Hipp // J. Am. Chem. Soc. - 1949. - V. 71, Iss. 10. - P. 3298-3300.

186. Скирда, В. Д. Особенности трансляционной подвижности макромолекул в расплавах и растворах полимеров / В. Д. Скирда, В. А. Севрюгин, А. И. Маклаков // Докл. АН СССР. - 1983. - Т.269, №3. - С.638-640.

187. Де Жен, П. Идеи скейлинга в физике полимеров. - Пер. С англ.; Под ред. И.М. Лившица. - М.: Мир, 1982. - 368 с.

188. de Gennes, P. G. Scaling Concepts in Polymer Physics / P. G. de Gennes. -Cornell University Press: Ithaca, N.Y. - 1979. - 324 p.

189. Пименов, Г. Г. Концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии молекул растворителя в растворах полимеров / Г. Г. Пименов, О. Э. Згадзай // Высокомолекулярные соединения. - 1985. -Т.27Б, № 12. - С. 899.

190. Севрюгин, В. А. Концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул растворителя в разбавленных растворах полидиметилсилоксана / В. А. Севрюгин, Г. И. Васильев, В. Д. Скирда // Журнал Физической Химии. -1999. - Т.73, № 8. - С.1412.

191. von Hippel, P. H. Casein: Monomers and Polymers / P. H. von Hippel, D. F. Waugh // J. Am. Chem. Soc. - 1955. - V. 77, Iss. 16. - P. 4311-4319.

192. Yamakawa, H. Concetration dependence of the factional coefficient of polymers in solutions / H. Yamakawa // J. Chem. Phys. - 1962. - V.16, no. 11. -P. 2995-3001.

193. Rouse, P. E. Dynamic of Polymer Systems / P. E. Rouse // J. Chem. Phys. -1956. - V.24, no. 2. - P. 269.

194. Skirda, V. D. Translational Mobility of Macromolecules in Networks. / V. D. Skirda, I. R. Gafurov, A. I. Maklakov, M. M. Doroginitskii, G. Flyaisher // Vysokomol. Soedin. B. - 1988. - V.30. - P. 313-314.

195. Gafurov, I. R., NMR Study of the Structure of Aqueous Gelatine Gels and the Process of Their Formation. / I. R. Gafurov, V. D. Skirda, A. I. Maklakov, S. P. Perevezentseva, Y.A. Zimkin // Polymer Science U.S.S.R. - 1989. - V.31. - P. 292-300.

196. Gafurov, I. R. Self-Diffusion and Gelation in Benzyl Alcohol Solutions of Cellulose Triacetate. / I. R. Gafurov, V. D. Skirda, A. I. Maklakov, I. I. Ryskina // Polymer Science U.S.S.R. - 1988. - V.30, Iss. 7. - P. 1644-1645.

197. Skirda, V. D. Detection of Spatial Fluctuations of Segments in Swollen Polybutadiene Networks by Nuclear Magnetic Resonance Pulsed Field Gradient Technique / V. D. Skirda, M. M. Doroginizkij, V. I. Sundukov, A. I. Maklakov, G. Fleischer, K. G. Häusler, E. Straube // Makromol. Chem. - 1988. - V. 9, no. 9. - P. 603-607.

198. Price, W. S. NMR Studies of Translational Motion / W. S. Price -Cambridge University Press: Cambridge, U.K. - 2009. - 393 p.

199. Marchesseau, S. Casein Interactions Studied by the Surface Plasmon Resonance Technique. / S. Marchesseau, J. C. Mani, P. Martineau, F. Roquet, J. L. Cuq, M. Pugniere // J. Dairy Sci. - 2002. - V.85. - P.2711-2721.

200. Horne, D. S. Casein Interactions: Casting Light on the Black Boxes, the Structure in Dairy Products / D. S. Horne // Int. Dairy J. - 1998. -Vol. 8, no. 3. -P.171-177.

201. Euston, S. R. Simulating the Equation of State of Model Globular Proteins Adsorbed at a Surface. / S. R. Euston, M. A. Naser // Langmuir. - 2005. - V.21.

- P. 4227-4235.

202. Burchard, W. Filamentous Supramolecular Structures / W. Burchard // Macromol. Symp. - 2010. - V. 295. - P. 49-58.

203. Maklakov A. I. Self-diffusion in polymer system / A. I. Maklakov, V. D. Skirda, N. F. Fatkullin // Encyclopedia of fluid mechanics. - 1990. - V.9, no. 22. -P.705-745.

204. Скирда, В. Д. Самодиффузия в полимерных системах: (Исследование методом ЯМР с большими значениями импульсного градиента магнитного поля): Дис. .докт. физ.-мат. наук (01.04.14) в форме научного доклада / Казань, 1992. - 58 с.

205. Farrell, H. M. Review of the chemistry of as2-casein and the generation of a homologous molecular model to explain its properties / H. M. Farrell, E. L. Malin, E. M. Brown, A. Mora-Gutierrez // J. Dairy Sci. - 2009. - V. 92. - P. 1338-1711.

206. Thorn, D. C. Casein structures in the context of unfolded proteins / D. C. Thorn, H. Ecroyd, J. A. Carver, C. Holt // International Dairy Journal. - 2015. - V. 46.

- P. 2-11.

207. Kr^zel A. Coordination properties of tris (2-carboxyethyl) phosphine, a newly introduced thiol reductant, and its oxide // A. Kr^zel, R. Latajka, G. D. Bujacz, W. Bal / Inorg. Chem. - 2003. - V. 42, Iss. 6. - P. 1994-2000.

208. Santarino, I. B. Protein reducing agents dithiothreitol and tris (2-carboxyethyl) phosphine anodic oxidation / I. B. Santarino, S. C. Oliveira, A. M. Oliveira-Brett // Electrochemistry Communications. - 2012. - V. 23. - P. 114-117.

209. Melnikova, D. L. Effect of Reducing Agent TCEP on Translational Diffusion

and Supramolecular Assembly in Aqueous Solutions of a-Casein / D. L.

Melnikova, V. D. Skirda, I. V. Nesmelova // J. Phys. Chem. B. - 2019. - V. 123.

- P. 2305-2315.

210. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry / H. E. Swaisgood // Journal of dairy science. - 1993. - V. 76, no. 10. - P. 3054-3061.

211. Fox, P. F. Milk proteins: general and historical aspects / P. F. Fox // Advanced Dairy Chemistry - Proteins. - 2003. - P. 1-48.

212. Dery, S. Insights into the deselenization of selenocysteine into alanine and serine Chemical science / S. Dery, P. S. Reddy, L. Dery, , R. Mousa, R. N. Dardashti, N. Metanis // Chem. Sci. - 2015. - V. 6, no. 11. - P. 6207-6212.

213. Melnikova, D. L. Effect of Intrinsic Disorder and Self-Association on the Translational Diffusion of Proteins: The Case of a-Casein / D. L. Melnikova, V. D. Skirda, I. V. Nesmelova // J. Phys. Chem. B. - 2017. - V.121, no. 14. - P. 2980-2988.

214. Ossowski, S. Aggregation behavior of bovine K-and ß-casein studied with small angle neutron scattering, light scattering, and cryogenic transmission electron microscopy / S. Ossowski, A. Jackson, M. Obiols-Rabasa, C. Holt et al. // Langmuir. - 2012. - Vol. 28, Iss. 38. - P.13577-13589.

215. Rasmussen, L. K. Disulphide-linked caseins and casein micelles / L. K. Rasmussen, L. B. Johnsen, A. Tsiora et al.// Int. Dairy J. - 1999. - V.9. - P. 215-218.

216. Liu, P. A Tris (2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) Related Cleavage on Cysteine-Containing proteins / P. Liu, B. W. O'Mara, B. M. Warrack et al. // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. - 2010. - Vol. 21, Iss. 5. - P. 837-844.

217. Hoagland, P. D. Secondary Structure of Bovine aS2-Casein: Theoretical and Experimental Approaches / P. D. Hoagland, J. J. Unruh, E. D. Wickham, H. M. Farrell // J. Dairy Sci. - 2001. - V. 84. - P.1944-1949.