Изучение самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.14, кандидат физико-математических наук Несмелова, Ирина Владиславовна

• Несмелова, Ирина Владиславовна
• кандидат физико-математических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Несмелова, Ирина Владиславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ЯВЛЕНИЕ САМОДИФФУЗИИ. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О САМОДИФФУЗИИ МОЛЕ КУЛ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ

1.1 Явление самодиффузии макромолекул и методы ее изучения. Коэффициент самодиффузии

1.2 Основные принципы измерения коэффициентов самодиффузии молекул методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля

1.3 Особенности строения молекул белков

1.4 Ассоциация и агрегация в растворах белков

1.5 Самодиффузия молекул глобулярных белков

в растворах

1.5.1 Разбавленные растворы

1.5.2 Концентрированные растворы

1.6 Самодиффузия молекул воды в растворах белков

1.7 Постановка задачи диссертации и выбор объектов исследования

ГЛАВА 2 МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ И ОБЪЕКТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Методика приготовления образцов

2.3 Аппаратура

2.3.1 Характеристики аппаратуры для измерения коэффициентов самодиффузии методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля

2.3.2 Характеристики аппаратуры для измерения времен ядерной спин-спиновой и спин-решеточной

релаксации

2.4 Методика измерений коэффициентов самодиффузии

2.5 Методика измерений времен релаксации

ГЛАВА 3 САМОДИФФУЗИЯ МОЛЕКУЛ ГЛОБУЛЯРНЫХ

БЕЛКОВ И ВОДЫ В РАСТВОРАХ

3.1 Форма диффузионного затухания в растворах

белков

3.2 Концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков

в растворах

3.2.1 Разбавленные растворы

3.2.2 Обобщенная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии белков для исследованных растворов

3.2.3 Критическая концентрация ф*

3.2.4 Описание концентрационных зависимостей коэффициентов самодиффузии молекул

белков в рамках теории брауновских частиц

3.3 Температурные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков

в растворе

3.4 Самодиффузия молекул воды в растворах белков

ГЛАВА 4 СВЯЗЬ ВНУТРИ- И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ

ПРЕОБРАЗОВАНИЙ И САМОДИФФУЗИИ МОЛЕКУЛ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ

4.1 Связь внутри- и надмолекулярных преобразований и

самодиффузии молекул глобулярных белков в растворах при варьировании рН среды

4.1.1 Зависимости коэффициентов самодиффузии молекул белков от рН среды

4.1.2 Влияние ассоциации молекул лизоцима на

концентрационную зависимость их коэффициентов

самодиффузии

4.1.3 Определение константы ассоциации лизоцима по

данным измерений его коэффициентов самодиффузии

самодиффузии молекул глобулярных белков в растворах при варьировании температуры

4.2.1 Зависимости коэффициентов самодиффузии молекул миоглобина и лизоцима от температуры при некоторых значениях рН среды

4.2.2 Влияние разрушения нативной структуры и гелеобразования в растворах лизоцима и РНКазы на

их самодиффузию

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование самодиффузии молекул белков в водных растворах является актуальной проблемой современной биофизики. С одной стороны, знание особенностей самодиффузии молекул белков в широком интервале концентраций и температур необходимо для понимания механизма функционирования белка в клетке и представляет большой интерес для биологов. С другой -молекулы белков идентичны друг другу, обладают уникальной жесткой глобулярной структурой, имеют размеры, более чем на порядок превышающие размеры молекул растворителя - воды, имеют заряд, величину которого можно изменять, варьируя значение рН раствора, и поэтому они представляют собой хорошую модельную систему для изучения растворов заряженных макромолекул.

В настоящее время накоплен экспериментальный материал по изучению особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков в области разбавленных растворов, и показано, что их поведение в разбавленных растворах близко к поведению жестких брауновских частиц. Что касается области концентрированных растворов, то здесь систематического изучения самодиффузии молекул белков не проводилось, причем в настоящее время данные по самодиффузии молекул белков для всей области растворимости белка отсутствуют. Также до сих пор не проводились исследования самодиффузии молекул глобулярных белков при изменении их внутренней структуры и агрегации. Так как эти процессы связаны с изменением размеров кинетических единиц в растворе, то естественно ожидать, что измерения коэффициентов самодиффузии могут оказаться информативными для их изучения.

Одним из наиболее распространенных для изучения особенностей самодиффузии малых и макромолекул в растворах является метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля [1], обладающий такими преимуществами как быстрота проведения эксперимента и небольшое

количество требуемого образца, извлечение информации об объекте на молекулярном уровне без внесения в него сторонних меток.

Целью данной работы являлось изучение особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах в широком интервале концентраций, температур и рН, в том числе при тех значениях этих параметров, при которых происходят изменения внутри-и надмолекулярной структур молекул белков, методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы.

Первая глава посвящена обзору и анализу современных представлений и экспериментальных исследований самодиффузии молекул глобулярных белков и воды в водных растворах. Рассматриваются теоретические основы и особенности применения метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля к изучению трансляционной подвижности молекул. В конце главы формулируется задача диссертации и обосновывается выбор объектов исследования.

Вторая глава содержит краткое описание аппаратуры, используемой в эксперименте. Даются характеристики объектов исследования, описываются методики приготовления образцов, проведения измерений и обработки результатов.

В третьей главе представлены экспериментальные результаты для коэффициентов самодиффузии молекул белков (миоглобина, БСА, лизоцима, барстара) и воды в широком интервале концентраций и температур. Рассматриваются наиболее общие закономерности самодиффузии молекул белков в сравнении с имеющимися в литературе экспериментальными и теоретическими данными по самодиффузии молекул гибкоцепных полимеров и жестких брауновских частиц.

В четвертой главе проводится исследование самодиффузии молекул белков в растворах, где путем изменения рН среды, концентрации белка и температуры достигались изменения во внутримолекулярной и надмолекулярной (агрегация, ассоциация,

гелеобразование) структурах белков. Анализируются возможности метода ЯМР с ИГМП в исследованиях указанных явлений.

На защиту выносятся следующие основные результаты:

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.

Научная новизна.

1) При исследовании самодиффузии молекул глобулярных белков проведен учет индивидуальных свойств молекул белков, в частности их склонности к ассоциации, и построена обобщенная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков; проведено сравнение особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков с результатами, характерными для молекул гибкоцепных полимеров, а также с моделью жестких брауновских частиц. Показано, что согласование экспериментальных данных с теорией растворов брауновских частиц для диапазона исследованных концентраций может быть достигнуто путем введения нормированной концентрации (ср-£), где - отношение критической концентраций ф0 в растворах жестких брауновских сфер и критической концентрации ф в растворах белков. ф0 находилась из пересечение асимптоты с нулевым наклоном и касательной с наклоном (ф) 3, проведенных к теоретической

кривой, представленной в логарифмических координатах.

2) Предложено для расчета константы равновесия реакции ассоциации молекул белков использовать КСД молекул белков. Метод расчета описан на примере исследования растворов лизоцима для модели неопределенной ассоциации.

3) Проведено детальное исследование самодиффузии молекул белков в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНКазы при рН=2.5, для которых при повышении температуры характерно не только разрушение внутримолекулярной структуры, но и образование оптически прозрачного геля при высоких концентрациях. Показано, что образование прозрачного геля в этих растворах проявляется в

аномальном уменьшении коэффициента самодиффузии молекул белка с ростом температуры, уменьшении амплитуды спинового эхо, отклонении формы компоненты диффузионного затухания, характеризующей молекулы белка в растворе, от экспоненциальной.

Аппробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: Всес. Конф. "Структура и молекулярная динамика полимерных систем" (Йошкар-Ола, 1994); 17, 18 Congress AMPERE "Magn. Res. and Related Phenomena" (Kazan, 1994; Canterbery, Great Britain, 1996); XVI, XVII International Conferences on Magnetic Resonance in Biological Systems (Veldhoven, Netherlands, 1994; Keystone, Colorado, USA, 1996); International Symposium: "Molecular mobility and order in polymer systems" (Sankt-Petersburg, 1994); 39 Annual Biophysical Society Meeting (San Francisco, USA, 1995); 7th Chianti Workshop on Magnetic Resonance (San Miniato (Pisa), Italy, 1997); 5 Всероссийском семинаре по спектроскопии ЯМР (Москва, 1997); ежегодных итоговых конференциях Казанского Государственного Университета за 1994-1995 гг. и Казанского Института Биологии за 1996-1997 гг.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Из них 4 статьи в центральной печати, 1 статья в сборнике, 9 тезисов.

Заключение диссертации по теме «Теплофизика и теоретическая теплотехника», Несмелова, Ирина Владиславовна

выводы.

1. Методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля экспериментально исследованы зависимости коэффициентов самодиффузии молекул воды и глобулярных белков (миоглобина, бычьего сывороточного альбумина (БСА), барстара, лизоцима, рибонуклеазы А (РНКазы)) в растворах в широком интервале концентраций, температур и pH.

2. Впервые установлен вид единой универсальной концентрационной зависимости приведенных (D/Do) коэффициентов самодиффузии D молекул глобулярных белков в водных растворах, не зависящей от природы и свойств молекул белков и отражающей наиболее общие закономерности их трансляционной динамики. Для этого использованы приведенные концентрации (ф/ф), где ф - динамическая критическая концентрация, которая зависит от индивидуальных свойств молекул белков. Установлено, что величина ф зависит, в частности, от степени ассоциирования молекул белка в растворе: уменьшается под влиянием этого фактора.

Показано, что обобщенные концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул белков и гибкоцепных полимеров различаются. Это различие проявляется в существовании на обобщенной концентрационной кривой КСД белков более резкого перехода от асимптоты с нулевым наклоном к участку с наибольшим наблюдаемым наклоном.

3. Установлено, что исходные экспериментальные концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул белков в растворах в большинстве исследованных объектов не совпадают с теоретической зависимостью, рассчитанной с учетом гидродинамических и потенциальных взаимодействий для модели жестких брауновских сфер в растворах.

Показано, что согласование экспериментальных данных с теорией растворов брауновских частиц для диапазона исследованных концентраций может быть достигнуто путем введения нормированной концентрации (ф-£), где а ф0 критическая концентрация в растворах жестких брауновских сфер, которая находилась из пересечение асимптоты с нулевым наклоном и касательной с наклоном (ф) \ проведенных к теоретической кривой, представленной в логарифмических координатах.

4. В результате исследования температурных зависимостей коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков на примере растворов миоглобина и БСА обнаружено, что энергия активации самодиффузии молекул белка постоянна во всем исследованном диапазоне концентраций, что соответствует модели жестких брауновских сфер. Отклонение от поведения брауновских частиц у молекул белков проявляется в незначительном (на 15-20%) превышении значения энергии активации их самодиффузии по сравнению с энергией активации самодиффузии молекул растворителя - воды.

5. Показано, что концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул воды в растворах разных белков примерно одинаковы и имеют экспоненциальный вид. Из анализа температурных зависимостей средних по образцу коэффициентов самодиффузии молекул, регистрировавшихся в растворах с разным процентным содержанием воды в интервале от +35 до -35 °С, оценено, что в растворе миоглобина содержится 0.43 г гидратной воды на 1г белка. Показано, что при температурах выше 0 °С специфический для систем белок-вода вклад гидратной воды не проявляется ни в форме диффузионного затухания, ни в ее зависимости от времени диффузии, что связывается с быстрым молекулярным обменом свободная вода - гидратная вода.

6. Проведено детальное исследование самодиффузии и формирования надмолекулярных структур (ассоциации и агрегации) молекул миоглобина и лизоцима в растворах при изменении рН среды.

На примере миоглобина показано, что изменение только заряда белка не приводит к существенному изменению коэффициента самодиффузии молекулы,- Напротив, агрегация молекул, сопровождающая процесс денатурации белка, которая проявилась в растворах миоглобина при значениях рН<4.0 и рН>11.0, и ассоциация, происходящая в растворах лизоцима при рН>4.0, приводит к ощутимому уменьшению регистрируемого коэффициента самодиффузии.

Впервые для расчета константы равновесия реакции ассоциации к молекул белка предложено использовать данные измерений его коэффициентов самодиффузии. На примере растворов лизоцима (рН>4.0) рассчитанное значение к в модели неопределенной ассоциации составило 320.5±0.5 л/М, что соответствует литературным данным (147-690 л/М) из других методов исследования.

7. Проведено детальное исследование само диффузии молекул белков в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНКазы при рН=2.5, для которых при повышении температуры характерно не только разрушение внутримолекулярной структуры, но и образование оптически прозрачного геля при высоких концентрациях.

Установлено, что в результате разрушения внутримолекулярной структуры, объем молекул лизоцима и РНКазы в растворах при указанных условиях увеличивается примерно в два раза.

Впервые показано, что процесс гелеобразования в растворах данных белков может проявляется в уменьшении коэффициентов самодиффузии молекул белков с ростом температуры и изменении формы диффузионного затухания. Установлено, что не все молекулы белка входят в сетку геля; оценка доли вступивших в сетку геля молекул может быть проведена по уменьшению амплитуды сигнала спинового эхо.

В заключение, автор сердечно благодарит научного руководителя д.ф-м.н. Скирду В.Д. и научного консультанта проф. Федотова В.Д. за предоставленную возможность работать над диссертацией, общую постановку задачи, постоянное внимание и помощь при выполнении работы; Файзуллина Д.А. за предоставленный экспериментальный материал по ИК-спектроскопии растворов лизоцима и полезное обсуждение результатов; коллектив кафедры молекулярной физики КГУ и лаборатории молекулярной биофизики КИБ за постоянную поддержку при выполнении данной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Несмелова, Ирина Владиславовна, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Маклаков А.И., Скирда В .Д., Фаткуллин Н.Ф. Самодиффузия в растворах и расплавах полимеров. - Казань: Казанский Государственный университет, 1987, 224с.

2. Резибуа П., Де Ленер М. Классическая кинетическая теория жидкости и газов. - М.: Мир, 1980, 423с.

3. Эйнштейн А., Смолуховский М. Брауновское движение. Сб. ст. -Л.: ОН-ТИ, 1934, 607с.

4. Чалых А.Е. Диффузия в полимерных системах. - М.: Химия, 1987, 311с.

5. Kugler J., Fisher E.W., Penscher M., Eisenbach C.D. Small angle neutron scattering studies of poly(ethylen oxide) in the melt. - Macromolec. Chem., 1983, v. 184, p. 2325-2334.

6. Leger L., Hervet H., Rondelez F. Reptation in entangled polymer solutions by forced rayleigh light scattering. - Macromolecules, 1981, v. 14, p. 1732-1738.

7. Mulls R. Isotropic self-diffusion in liquids. - Ber. Bunsenges. Phys. Chem., 1971, p. 195-199.

8. Callaghan P.T. Pulsed field gradient nuclear magnetic resonance as a probe of liquid state molecular organization. - Aust. J. Phys., 1984, v. 37, p. 359-387.

9. Karger J., Pfeifer H., Heink W. Principles and application of self-diffusion measurement by nuclear magnetic resonance. - Adv. Magn. Res., 1988, v. 12, p. 1-89.

10. Stilbs P. Fourier transform pulsed-gradient spin-echo studies of molecular diffusion. - Progress NMR Spectroscopy, 1987, v. 19, p. 1-45.

11. Skirda V.D., Sundukov V.I., Maklakov A.I., Zgadzai O.E., Gafurov I.R., Vasiljev G.I. On the generalized concentration and molecular mass dependencies of macromolecular self-diffusion in polymer solutions. -Polymer, 1988, v.29,p. 1294-1300.

12. Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер. с англ., Под ред. Скроцкого Г.В. -М.: ИЛ, 1963, 552с.

13. Сликтер Ч. Основы теории магнитного резонанса. Пер. с англ., Под ред. Скроцкого Г.В. - М.: Мир, 1981, 448с.

14. Fedotov V.D., Schneider H. Structure and dynamics of bulk polymers by NMR-methods.- Berlin a.o.: Springer, 1989, 176p- (NMR. Basic principle and progress. N21).

15. Леше А. Ядерная индукция. Пер. с нем., Под ред. Бородина П.М. - М.: ИД, 1963,684с.

16. Фаррар Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. Пер. с англ., Под ред. Федина Э.П. - М.: Мир, 1973, 164с.

17. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях. Пер. с англ., Под ред. Салихова К.М. - М.: Мир, 1990, 709с.

18. Вашман А.А, Пронин И.С. Ядерная магнитная релаксационная спектроскопия. - М.: Энергоатомиздат, 1986, 232с.

19. Hahn E.L. Spin Echoes. - Phys. Rev., 1950, v. 80, p. 580-586.

20. Carr H. Y., Purcell E.M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. - Phys. Rev., 1954, v. 94, p. 630-635.

21. Stejscal E.O., Tanner J.E. Self-diffusion measurements: spin-echoes in presence of a time dependent field gradient. - J. Chem. Phys., 1965, v. 42, p. 288292.

22. Tanner J.E. Pulsed field gradient for NMR spin-echo diffusion measurements. - Rev. Sci. Instrum., 1965, v.36, p. 1036-1037.

23. Бреслер C.E. Введение в молекулярную биологию. Москва-Ленинград, изд-во Наука, 1966, 514с.

24. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Пер. с англ., Под ред. Богданова А.А., Лазуркина Ю.С., Франк-Каменецкого М.Д. в 3 т. - М.: Мир, 1984.

25. Ыаррег М.Н. On the nature of the protein interior. - Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 229, p. 557-566.

26. Richards F.M. The interpretation of protein structures: total volume, group volume, distributions and packing density. - J. Mol. Biol., 1974, v. 82, p. 115.

27. Бычкова B.E., Птицын О.Б. Состояние расплавленной глобулы белковых молекул становится скорее правилом, чем исключением. - Биофизика, 1993, т.38, с. 58-65.

28. Ptitsyn О.В. How the molten globule became. - T/BS, 1995, v.20, p. 376-379.

29. Жоли M. Физическая химия денатурации белков. - М.: Мир, 1968, 364с.

30. Northrup S.H., Boles J.O., Reynolds J.C.L. Electrostatic effects in the brownian dynamics of association and orientation of heme proteins. - J. Phys. Chem., 1987, v. 91, p. 5991-5998.

31. Sophianopoulos K.E. and Van Holde K.E. Evidence for dimerization of lysozyme in alkaline solution. - J. Biol. Chem., (1961), 236, PC82-PC83.

32. Sophianopoulos K.E., Van Holde K.E. Physical studies of muramidase (lysozyme) (2. pH-dependent dimerization). - J. Biol. Chem., 1964, v. 239, p. 2516-2524.

33. Bruzzesi M.R., Chiancone E., Antonini E. - Biochemistry, 1965, v. 4, p. 1796-1800.

34. Pusey M.L. Estimation of the initial equilibrium constants in the formation of tetragonal lysozyme nuclei. - J. Cryst. Growth, 1991, v. 110, p. 60-65.

35. Boue F., Lefaucheux F., Robert M.C., Rosenman I. Small angle neutron scattering study of lysozyme solutions. - J. Cryst. Growth, 1993, v. 133, p. 246250.

36. Wilson L.J., Adcock L.D., Pusey M.L. A dialysis technique for determining aggregate concentrations in crystallizing protein solutions. - J. Phys. D: Appl. Phys., 1993, v. 26, p. B113-B117.

37. Banerjee S.K., Pogolotti A., Rupley J.A. Self-association of lysozyme. Biochemical measurements: effect of chemical modification of TRP-62, TRP-108, and GLU-35. - J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 8260-8266.

38. Fedotov V.D., Feldman Yu.D., Krushelnitsky A.G., Ermolina I.V. NMR and dielectric spectroscopy investigation of protein dynamic structure. - J. Mol. Structure, 1990, v. 219, p. 293-298.

39. Wooten J.B., Cohen J.S. Protein mobility and self-association by deuterium nuclear magnetic resonance. - Biochemistry, 1977, v. 16, p. 3879-3882.

40. Raeymaekers H.H., Eisendrath H., Verbeken A., Van Haverbeke Y., Muller R.N. Nuclear magnetic relaxation dispersion in protein solutions as a probe for protein transformation. Example, the dimerization of lysozyme. - J. Magn. Res., 1989, v. 85, p. 421-425.

41. Horwitz J. a-Crystallin can function as a molecular chaperone. - Biochemistry, 1992, v. 89p. 10449-10453.

42. Carver J.A., Aquilina J.A., Truscott R.J.W. A possible ehaperone-like quaternary structure for a-crystallin. - Exp. Eye Res., 1994, v.59, p. 231-234.

43. Clark A.H., Tuffnell C.D. Small-angle X-ray scattering studies of thermally-induced globular protein gels. - Int. J. Peptide Protein Res., 1980, v. 16, p. 339-351.

44. Clark A.H., Judge F.J., Richards J.B., Stubbs J.M., Sugget A. Electron microscopy of network structures in thermally-induced globular protein gels. - Int. J. Peptide Protein Res., 1981, v. 17, p. 380-392.

45. Белопольская T.B., Казицина С.Ю., Сочава И.В. Калориметрическое исследование образования и плавления термотропного геля в растворах глобулярного белка. - Биофизика, 1989, т. 34, с. 520-521.

46. Белопольская Т.В., Сочава И.В., Казицина С.Ю. Исследование термо-тропных гелей глобулярного белка методом дифференциальной сканирующей калориметрии. I. Зависимость структуры гелей лизоцима от рН. - Биофизика, 1990, т. 35, с. 751-755.

47. Сочава И.В., Белопольская Т.В., Казицина С.Ю. Исследование термо-тропных гелей глобулярного белка методом дифференциальной сканирующей калориметрии. II. Влияние ионной силы раствора и концентрации белка на образование гелей лизоцима разных типов. - Биофизика, 1990, т. 35, с. 756-761.

48. Clark А.Н., Saunderson D.H.P., Suggett A. Infrared and Laser-Raman spectroscopic studies of thermally-induced globular protein gels. - Int. J. Peptide Protein Res., 198L v. 17, p. 353-364.

49. Mayo K.H., Ilyina E., Park H. A recipe for designing water-soluble, |3-sheet-forming peptides. - Protein Sci., 1996, v.5, 1301-1315.

50. Altieri A.S., Hinton D.P., Byrd R.A. Association of biomolecular systems via pulsed field gradient NMR self-diffusion measurements. - J. Am. Chem. Soc., 1995, v. 117, p. 7566-7567.

51. Ilyina E., Roongta V., Pan H., Woodward C., Mayo K. A pulsed-field gradient NMR study of bovine pancreatic trypsin inhibitor self-association. - Biochemistry, 1997, v. 36, p. 3383-3388.

52. Müller J.J. Prediction of the rotational diffusion behavior of biopolymers on the basis of their solution or crystal structure. - Biopolymers, 1991, v. 31, p. 149160.

53. von Poison A. Über die Berechnung der Gestalt von Proteinmolekülen. - Kol-loid-Z, 1939, v. 88, p. 51-61.

54. Kuntz I.D., Kauzmann W. Hydration of proteins and poly peptides. - Adv. Protein Chem., 1974, v. 28, p. 239-345.

55. Dubin S.B., Clark N.A., Benedek G.B. Measurement of the rotational diffusion coefficient of lysozyme by depolarized light scattering: configuration of ly-sozyme in solution. - J. Chem. Phys., 1971, v. 54, p. 5158-5164.

56. Squire P.G., Himmel M.E. Hydrodynamics and protein hydration. - Arch. Biochem. Biophys., 1979, v. 196, p. 165-177.

57. Muramatsu N., Minton A.P. Tracer diffusion of globular proteins in concentrated protein solutions. - Proc. Natl. Acad. Sei., 1988, v. 85, p. 2984-2988.

58. Smith P.E., van Gunsteren W.F. Translational and rotational diffusion of proteins. - J. Mol. Biol., 1994, v.236, p. 629-636.

59. Teller D.C., Swanson E., Haen C. The translational friction coefficient of proteins. - Methods in Enzymology, 1979, v. 61, p. 103-124.

60. Lamanna R., Delmelle M., Cannistraro S. Solvent Stokes-Einstein violation in aqueous protein solutions. - Phys. Rev. E, 1994, v. 49, p. 5878-5880.

61. Fedotov V.D., Feldman Yu.D., Yudin I.D. On the rotational diffusion of globular proteins in aqueous solutions. - Studia Biophysica, 1985, v. 107, p. 83-90.

62. Yudin I.D., Feldman Yu.D., Fedotov V.D. The rotational diffusion of globular proteins in aqueous solutions: interaction with solvent. - Studia Biophysica, 1987, v. 121, p. 193-200.

63. Lamanna R., Cannistraro S. 'H NMR study of water relaxation and self-diffusion in human senim albumin aqueous solutions. — Nuovo Cimcnto, 1991, v.D H,p. 261-271.

64. Brune D., Kim S. Predicting protein diffusion coefficients. - Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, v. 90, p. 3835-3839.

65. Garcia de la Torre J., Bloomfield V.A. Hydrodynamic properties of complex, rigid, biological macromolecules. Theory and applications. - Q. Rev. Biophys., 1981, v. 14, p. 81-139.

66. Fnshman D. Surface fractality of proteins from theory and NMR data. - J. Biomol. Struct. Dyn., 1990, v. 7, p. 1333-1344.

67. Perrin F. - J. Phys. Rad. Ser. VII, 1934, v. 5, p. 497-511. Цит. no: Koenig S. H. Brownian motion of an ellipsoid. A correction to Perrin's results. -Biopolymers, 1975, v. 14, p. 2421-2423.

68. Bloomfield V.A., Dalton W.O., Van Holde K.E. Frictional coefficients of mul-tisubunit structures. I. Theory. - Bipolymers, 1967, v. 5, p. 135-148.

69. Garcia de la Torre J., Bloomfield V.A. Hydrodynamic properties of macro-molecular complexes. I. Translation. - Bipolymers, 1977, v. 16, p. 1747-1763.

70. Garcia de la Torre J. Hydrodynamic properties of macromolecular assemblies. In Dynamic properties of macromolecular assemblies. (Harding S.E., Rowe A. J., ed.) - The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1989, p. 3-31.

71. Garcia de la Torre J. Sedimentation coefficients of complex biological particles. In Analytical ultracentrifugation in polymer science and biochemistry. (Harding S.E., Rowe A.J., Horton J., ed.) - The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1989, p. 335-345.

72. J. Garcia de la Torre, Navarro S., Lopez Martinez M.C., Diaz F.G., Lopez Cascales J.J. HYDRO: A computer program for the prediction of hydrodynamic properties of macromolecules. - Biophys. J., 1994, v. 67, p. 530-531.

73. Connolly M.L. An application of algebraic topology to solid modeling in molecular biology. - Visual Comput., 1987, v. 3, p. 72-81.

74. Oncley J.L. Evidence from physical chemistry regarding the size and shape of protein molecules from ultra-centrifugation, diffusion, viscosity, dielectric dispersion, and double refraction of flow. - Ann. N.Y. Acad. Sci., 1941, v. 41, p. 121-150.

75. Абецедарская Л.А., Мифтахутдинова Ф.Г., Федотов В.Д., Мальцев Н.А. Протонная релаксация в растворах и гелях некоторых белков. - Мол. Биология, 1967, т. 1, с. 451-462.

76. Никитин С .Я., Сарвасян А.Г., Кравченко Н.А. Ультразвуковая велоси-метрия растворов лизоцима. - Мол. Биология, 1984, т. 18, с. 831-838.

77. Чиргадзе Ю.Н., Щеголева Т.Ю. Гидратация полипептидной цепи рубре-доксина по данным пространственной структуры. - Мол. Биология, 1984, т. 18, с. 994-1000.

78. Недев К.Н., Хургин Ю.И. Исследование поверхностного слоя белковой глобулы. Гидратация молекулы а-химотрипсина. - Мол. Биология, 1975, т. 9, с. 761

79. Щеголева Т.Ю. Гидратное окружение белка по данным пространственной структуры. - Биофизика, 1983, т. 28, с. 937-943.

80. Wang J.H., Anfinsen C.B., Polestra F.M. The self-diffusion coefficients of water and ovalbumin in aqueous solutions at 10°C. - J. Am. Chem. Soc., 1954, v. 76, p.4763-4765.

81. Moll W. The diffusion coefficient of haemoglobin. - Respir. Physiol., 1966, v. l,p. 357-365.

82. Keller K.H., Friedlander S.K. Diffusivity measurements of human methemo-globin. - J. Gen. Physiol., 1966, v. 49, p. 681-687.

83. Veldkamp W.B., Votano J.R. Effects of intermolecular interaction on protein diffusion in solution. - J. Phys. Chem., 1976, v. 80, p. 2794-2801.

84. Alpert S.S., Banks G. The concentration dependence of the hemoglobin mutual diffusion coefficient. - Biophys. Chem., 1976, v. 4, p. 287-296.

85. Minton A.P., Ross P.D. Concentration dependence of the diffusion coefficient of hemoglobin. - J. Phys. Chem., 1978, v. 82, p. 1934-1938.

86. Ross P.D., Minton A.P. Hard quasispherical model for the viscosity of hemoglobin solutions. - Biochem. Biophys. Res. Com., 1977, v. 76, p. 971-976.

87. Everhart C.H., Jonson C.S. The determination of tracer diffusion coefficients for proteins by means of pulsed field gradient NMR with applications to hemoglobin. - J. Magn. Res., 1982, v.48, p. 466-474.

88. Keller K.H., Canales E.R., Yum S.I. Tracer and mutual diffusion coefficients of proteins. - J. Phys. Chem., 1971, v. 75, p. 379-387.

89. Riveros-Moreno V., Wittenberg J.B. The self-diffusion coefficients of myoglobin and hemoglobin in concentrated solutions. - J. Biol. Chem., 1972, v. 247, p. 895-901.

90. Gros G. Concentration dependence of the self-diffusion of human and lumbri-cus terrestris hemoglobin. - Biophys. J., 1978, v. 22, p. 453-468.

91. Schor R., Serrallach E.N. Theoretical studies of the translational diffusion coefficient of charged macromolecules applied to bovine serum albumin. - J. Chem. Phys., 1979, v. 70, p. 3012-3015.

92. Gibbs SJ., Chu A.S., Lightfoot E.N., Root T.W. Ovalbumin diffusion at low ionic strength. - J. Phys. Chem., 1991, v. 95, p. 467-471.

93. Batchelor G.K. Brownian diffusion of particles with hydrodynamic interaction

- J. Fluid Mech., 1976, v. 74, p. 1-29.

94. Batchelor G.K. Diffusion in a dilute polydisperse system of interacting spheres.

- J. Fluid Mech., 1983, v. 131, p. 155-175.

95. Batchelor G.K. Sedimentation in a dilute polydisperse system of interacting spheres. I. General theory. - J. Fluid Mech., 1982, v. 119, p. 379-408.

96. Kops-Werkhoven M.M., Fijnaut H.M. Dynamic behavior of silica dispersions studied near the optical matching point. - J. Chem. Phys., 1982, vol.77, p. 2242-2253.

97. Pusey P.N., Tough R.J.A. Particle interactions. In Dynamic light scattering. Aplications of photon correlation spectroscopy. (Pecora R., ed.), Plenum Press, New York, 1985, p. 85-179.

98. Aquirre J.L., Murphy T.J. Brownian motion of N interacting particles. II. Hy-drodynamical evaluation of the diffusion tensor matrix. - J. Chem. Phys., 1973, v. 59, p. 1833-1840.

99. Phillies G.D.J., Peczak P. The ubiquity of stretched-exponential forms in polymer dynamics. - Macromolecules, 1988, v. 21, p. 214-220.

100. Dwyer J.D., Bloomfield A. Brownian dynamics simulations of probe and self-diffusion in concentrated protein and DNA solutions. - Biophys. J., 1993, v. 65, p. 1810-1816.

101. Anderson J.L. Prediction of the concentration dependence of macromolecular diffusion coefficients. - Ind. Eng. Chem. Fundam., 1973, v. 12, p.488-490.

102. lino M., Okuda Y. Concentration dependence of brownian motion and the viscosity of hemoglobin solutions. - Jpn. J. Appl. Phys., 1997, v. 36, p. 37863790.'

103. Mooney M. The viscosity of a concentrated suspension of spherical particles. -J. Colloid Sci., 1951, v. 6, p. 162-170.

104. Wang J.H. Theory of the self-diffusion of water in protein solutions. A new method for studying the hydration and shape of protein molecules. - J. Am. Chem. Soc., 1954, v. 76, p.4755-4763.

105. Clark M.E., Burnell E.E., Chapman N.R., Hinke J.A.M. Water in barnacle muscle. IV. Factors contributing to reduced self-diffusion. - Biophys. J., 1982, v. 39, p. 289-299.

106. Kimmich R., Gneiting T., Kotitschke K., Schnur G. Fluctuations, exchange processes, and water diffusion in aqueous protein systems. A study of bovine serum albumin by diverse NMR techniques. - Biophys. J., 1990, v. 58, p. 1183-1197.

107. Kotitschke K., Kimmich R., Rommel E., Parak F. NMR study of diffusion in protem hydration shells. - Progr. Coll. Polym. Sci., 1990, v. 83, p. 211-221.

108. Bodo G., Dintzis H.M., Kendrew J.C., Wyckoff H.M. The crystal structure of myoglobin. V. A low-resolution three-dimentional Fourier synthesis of sperm-whale myoglobin crystals. - Proc. Roy. Soc. (London), 1959, v. A253, p. 70102.

109. Kendrew J.C., Dickerson R.E., Strandberg B.E., Hart R.G., Davies D.R., Phillips D.C., Shore V.C. Structure of myoglobin. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 A resolution. - Nature, 1960, v. 185, p. 422-427.

110. Kendrew J.C., Watson H.C., Strandberg B.E., Dickerson R.E., Phillips D.C., Shore V.C. A partial determination by x-ray methods and its correlation with chemical data. - Nature, 1961, v. 190, № 4777, p. 666-670.

111. Atanasov B.P., Karshikov A.D. Semi-empirical method for calculation of electrostatic interactions in proteins. - Stud. Biophys., 1985, v. 105, p. 11-22.

112. Blake C., Koenig D., Mair G., North A., Sarma V. Structure of hen egg-white lysozyme. Three-dimensional fourier synthesis of 2A resolution. - Nature, 1965, v. 206, p. 757.

113. Lebedev Yu.O., Abaturov L.V. Dynamic solvent accessibility of rigid conformation of native ribonuclease A. - Structure and chemistry of ribonuclease. Proc. of the 1st Internat. Meeting. - Moscow, 1989, p. 425-433.

114. Sorensen B.R., Shea M.A. Calcium binding decreases the Stokes radius of calmodulin and mutants R74A, R90A, and R90G. - Biophys. J., 1996, v. 71, p. 3407-3420.

115. Lubienski M.J., Bycroft M., Freund S.M.V., Fersht A.R. Three-dimensional solution structure and 13C assignments of barstar using nuclear magnetic resonance spectroscopy. - Biochemistry, 1994, v. 33, p. 8866-8877.

116. Скирда В.Д., Стежко А.Г., Пименов Г.Г. Генератор импульсов тока для ЯМР измерений самодиффузии по методу импульсного градиента. -ПТЭ, 1976, №3, с. 131-133.

117. Скирда В.Д., Севрюгин В.А., Сундуков В.И. Прецезионный стабилизатор интегрального значения импульсов тока в индуктивной нагрузке. -ПТЭ, 1984, №6, с. 122-125.

118. Севрюгин В.А., Скирда В.Д. Датчик релаксометра с катушкой импульсного градиента магнитного поля. - ПТЭ, 1982, № 5, с. 112-113.

119. Дериновский B.C., Смирнов B.C., Маклаков А.И. Ядерный импульсный когерентный релаксометр. - Сб. аспирантских работ. - Изд-во Казанского университета, Казань, 1972, вып. 2, с. 66-76.

120. Идиатуллин Д.Ш., Скирда В.Д., Смирнов B.C. Способ измерения времен продольной релаксации. Положит, решение от 29.03.89 по заявке на изобретение № 4425949/25.

121. Идиатуллин Д.Ш., Смирнов B.C. Генератор последовательностей РЧ импульсов для ЯМР релаксометров широкого применения. - Тез. Докл. Всесоюзн. Конф. «Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве», Казань, 1988, с. 91.

122. Идиятуллин Д.Ш., Скирда В.Д., Смирнов B.C. Способ измерения Т] продольной ядерной магнитной релаксации. Авт. Свид. № 1578608 (СССР). Опубл. БИ 1990, № 26.

123. Несмелова И.В., Федотов В.Д. Самодиффузия молекул миоглобина и воды в растворах. - Высокомол. Соед., 1997, Серия А, том 39, с. 521-526.

124. Севрюгин В.А., Скирда В.Д., Скирда М.В. Обменные процессы в растворах сахаридов. - Ж. Физ. Химии, 1998, т. 72, с. 869-874.

125. Nesmelova I.V., Yagodina L.O. Study of myoglobin dynamics in D2O solutions by pulsed-field gradient NMR, XVI International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Veldhoven, Netherlands, August 1419,1994, in abstract book, p. 157.

126. Ermolina I.V., Krushelnitsky A., Fedotov V.D., Nesmelova I.V. The dynamic behaviour of protein molecules in solutions. Investigation by time-domain dielectric spectroscopy and non-selective 'H NMR relaxation, International Symposium: "Molecular mobility and order in polymer systems", Sankt-Petersburg, Russia, October 3-6,1994, in abstract book, p. 11.

127.1.V.Ermolina, A.G.Krushelnitsky, I.N.Ivoylov, I.V.Nesmelova, V.D.Fedotov. Investigation of molecular motion and interprotein interaction in solutions by TDDS and 1H NMR, 39 Annual Biophysical Society Meeting, February 1216, 1995. San Francisco, USA. p.A343.

128. Nesmelova I.V., Fedotov V.D. Study of self-diffusion of myoglobin molecules in solutions, XXVIII Congress AMPERE, Canterbery, Great Britain, September 1-6, in abstract book II, p. 113b.

129. Несмелова И.В., Федотов В.Д. Некоторые особенности самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах, 5 Всероссийский семинар по спектроскопии ЯМР, Москва, 9-10 декабря, 1997, материалы семинара, с.44.

130. Kanal К.М., Fullerton G.D., Cameron I.L. A study of the molecular sources of nonideal osmotic pressure of bovine serum albumin solutions as a function of pH. - Biophys. J., 1994, v. 66, p. 153-160.

131. Hess W., Klein R. Generalized hydrodynamics of systems of brownian particles. - Advances in physics, 1983, v. 32, p.173-283.

132. Cichocki В., Felderhof B.U. Diffusion coefficients and effective viscosity of suspensions of sticky hard spheres with hydrodynamic interactions. - J. Chem. Phys., 1990, v. 93, p. 4427-4432.

133. Lekkerkerker H.N.W., Dhont J.K.G. On calculation of the self-diffusion coefficient of interacting brownian particles. - J. Chem. Phys., 1984, v. 80, p. 5790-5792.

134. Heyes D.M., Mitchell P.J. Self-diffusion and viscoelasticity of dense hard-sphere colloids. - J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1994, v. 90, p.1931-1940.

135. Beenakker C.W.J., Masur P. Diffusion of spheres in a concentrated suspension. II. - Physica A, 1984, v. 126A, p. 349-370.

136. Medina-Noyola M. Long-time self-diffusion in concentrated colloidal dispersions. - Phys. Rev. Lett., 1988, v. 60, p. 2705-2708.

137. Watzlawek M., Nagele G. Self-diffusion coefficients of charged particles: prediction of nonlinear volume fraction dependence. - Phys. Rev. E, 1997, v. 56, p. 1258-1261.

138. Imhof A., Dhont J.K.G. Long-time self-diffusion in binary colloidal hard-sphere dispersions. - Phys. Rev. E, 1995, v. 52, p. 6344-6357.

139. Tokuyama M., Oppengeim I. Dynamics of hard-sphere suspensions. - Phys. Rev. E, 1994, v. 50, p. R16-R19.

140. Kirkwood J., Riseman J. The intrinsic viscosities and diffusion constants of flexible macromolecules in solution. - J. Chem. Phys., 1948, v. 16, p. 565573.

141. Сундуков В.И. Самодиффузия макромолекул и молекул растворителя в растворе и расплаве полиэтиленоксида. - Канд. дис., Казанский государственный университет, 1986,179с.

142. Несмелова И.В., Ермолина И.В., Федотов В.Д. Динамическое поведение молекул миоглобина в растворе. - В сб: Структура и молекулярная динамика полимерных систем, Йошкар-Ола, 1995, с. 75-77. УДК 513.72

143. Федотов В.Д., Самигуллин Ф.М., Идиятуллин З.Щ. - Журнал Структурной Химии 1964, т. 25, с. 58.

144. Kimmich R., Klammler F., Skirda V.D., Serebrennikova I.V., Maklakov A.I., Fatkullin N. Geometrical restrictions of water diffusion in aqueous protein systems. A study using NMR field-gradient techniques. - Appl. Magn. Res., 1993, v. 4, p. 425-440.

145. Kimmich R., Klammler F., Skirda V.D., Serebrennikova I.V., Maklakov A.I., Fatkullin N. Geometrical restrictions of water diffusion in aqueous protein systems. A study using NMR field-gradient techniques, International workshop "Magnetic Resonance and Dynamics of Proteins", Kazan, USSR, July 1-7, 1991.

146. Takashima S., Asami K. Calculation and measurement of the dipole moment of small proteins: use of protein data base. - Biopolymers, 1993, v. 33, p. 59-68.

147. Barlow D.J., Thornton J.M. The distribution of charged groups in protein. -Biopolymers, 1986,v.25,p. 1717-1733.

148. Friend S.H., Gurd R.N. Electrostatic stabilization in myoglobin. pH dependence of summed electrostatic contributions. - Biochemistry, 1979, v. 18, p. 4612-4619.

149. Acampora G., Hermans J.J. Reversible denaturation of sperm whale myoglobin. I. Deendence on temperature, pH, and composition. - J. Am. Chem. Soc., 1967, v. 89, p. 1543-1552.

150. Nesmelova I.V., Fedotov V.D. Self-diffusion and self-association of lysozyme molecules in solution. - BBA, 1998, v. 1383, p. 311-316.

151. Narasinga Rao M.S., Kegeles G. An ultracentriiuge study of the polymerization of a-chymotrypsin. - J. Am. Chem. Soc., 1958, v. 80, p. 5724-5729.

152. Heyn M.P., Bretz R. The self-association of ATP: thermodynamics and geometry. - Biophys. Chem., 1975, v. 3, p. 35-45.

153. Несмелова И.В., Федотов В.Д. Определение константы ассоциации ли-зоцима по данным измерений коэффициентов самодиффузии. - Мол. Биология, 1998, т.32, с. 664-667.

154. Nesmelova I.V., Fedotov V.D. "Study of protein self-association by pulsed field gradient NMR on example of lysozyme molecules", 7th Chianti Workshop on Magnetic Resonance, San Miniato (Pisa), Italy, May 25-31, 1997, in abstract book, p. 101.

155. Wang F., Hayter J., Wilson L.J. Salt-induced aggregation of lysozyme studied by cross-linking with glutaraldehyde: implications for crystal growth. - Acta Cryst., 1996, v. D52, p. 901-908.

156. Grunvald E., Coburn W.C. Calculation of association constants for complex formation from spectral data. Infrared measurements of hydrogen bonding between ethanol and ethyl acetate, and ethanol and acetic anhydride. - J. Am. Chem. Soc., 1958, v. 80, p. 1322-1325.

157. Гафуров И. Самодиффузия и гелеобразование в растворах желатина и триацетат целлюлозы. - Канд. дис., Казанский государственный университет, 1989, 189с.

158. Ермолина И.В. Диэлектрическая спектроскопия и молекулярное движение глобулярных белков в растворе. - Канд. дис., Казанский государственный университет, 1995,171с.

159. Sosnik T.R., Trewhella J. Denaturated states of ribonuclease A have compact dimensions and residual secondary structure. - Biochemistry, 1992, v. 31, p. 8329-8335.

160. Privalov P.L., Khechinashvili N.N., Atanasov B.P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of ribotrypsino-gen, ribonuclease and myoglobin. - Biopolymers, 1971, v. 10, p. 1865-1890.

161. Nesmelova I.V., Ermolina I.V., Faizullin D.A. Study of translational and rotational diffusion on RNase molecules in aqueous solutions during thermal unfolding, EENC'96, Thirteenth European Experimental NMR Conference, Paris, May 19-24, 1996. in abstract book, p. 195.

162. Nesmelova I.V., Ermolina I.V., Faizullin D.A., Translational and rotational diffusion of RNase molecules during thermal unfolding, XVII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Keystone, Colorado, USA, August 18-23, 1996, in abstract book, p.207.