Теоретический анализ пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса ризопуспепсина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат химических наук Кашпаров, Илья Валерьевич

• Кашпаров, Илья Валерьевич
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кашпаров, Илья Валерьевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ

АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ

Часть 1. Концепции ферментативного катализа

Часть 2. Химия протеолиза

Часть 3. Рентгеноструктурный анализ аспартатных протеиназ

Часть 4. Современные представления о механизме каталитического акта

аспартатных протеиназ

ГЛАВА II. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Часть 1. Конформационная и электронная задачи катализа

Часть 2. Постановка задачи и план исследования

Часть 3. Метод теоретического конформационного анализа.

Потенциальные функции и эмпирические параметры

ГЛАВА III. СТРУКТУРНАЯ МОДЕЛЬ СУБСТРАТ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО

УЧАСТКА РИЗОПУСПЕПСИНА И АПРОБАЦИЯ РАСЧЕТНОГО МЕТОДА

Часть 1. Объекты исследования

Часть 2. Структурная модель активного центра

Часть 3. Комплекс ризопуспепсина с пептидным ингибитором

ГЛАВА IV. НЕВАЛЕНТНЫЕ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ

РИЗОПУСПЕПСИНА

Часть 1. Фермент-субстратный комплекс михаэлиса

Часть 2. Комплекс ризопуспепсина с промежуточным тетраэдрическим

соединением

ГЛАВА V. СХЕМА КАТАЛИТИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ

РИЗОПУСПЕПСИНА

ВЫВОДЫ

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Теоретический анализ пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса ризопуспепсина»

ВВЕДЕНИЕ.

Аспартатные протеиназы относятся к классу широко распространенных эндо-пептидаз, обнаруживаемых практически во всех таксономических группах животных, растений, микроорганизмов и ретровирусах. Их медико-биологическая значимость определяется участием в контроле ряда процессов жизнедеятельности человека, связанных с пищеварением (пепсин), регуляцией кровяного давления (ренин), метаболизме белков и процессинге гормонов (катепсины Б,Е) и некоторых других. Установление роли аспартатных протеиназ в созревании частиц ретровирусов, вызывающих такие заболевания как СПИД, некоторых видов лейкозов, сарком и опухолей молочных желез определило их привлекательность в качестве мишеней для антивирусной терапии. В результате многих исследований стало очевидным, что целенаправленный поиск эффективных лекарственных средств невозможен без знания деталей каталитического механизма действия этих ферментов и понимания структурных основ их специфичности.

В настоящее время представление о механизме каталитического действия аспартатных протеиназ формируется преимущественно на основе данных рентгеност-руктурного анализа. Однако, несмотря на чрезвычайную информативность этого метода, он имеет ряд специфических ограничений. Во-первых, получаемая с его помощью информация касается статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечает на вопрос о динамических конформационных характеристиках трехмерных структур. Во-вторых, этот метод, за редким исключением, позволяет расшифровывать структуры комплексов ферментов лишь с ингибиторами, но не с субстратами. Получаемые данные о многих сериях ингибиторных комплексов демонстрируют отличия этих ингибиторов по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга. Не

зная продуктивного расположения субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими кон-формационных перестроек, — трудно составить достаточно полное и объективное представление о специфике каталитической реакции.

Поэтому для решения задачи о каталитическом механизме действия аспартатных протеиназ полезно привлечение методов теоретического конформаци-онного анализа и компьютерного моделирования. Преимущество теоретического подхода заключается в его принципиальной возможности исследовать любые конформационные состояния и количественно оценивать основные факторы, формирующие наиболее вероятные пространственные формы.

Настоящая работа посвящена теоретическому анализу пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса аспартатной протеиназы ризопуспепсина на стадиях комплекса Михаэлиса и промежуточного тетраэдрического соединения. Основные задачи данного исследования состояли в а) выборе структурной модели субстрат-связывающего участка молекулы фермента и апробации расчетного метода; б) предсказании энергетически предпочтительных конформационных состояний субстрата в активном центре ризопуспепсина на стадии образования невалентного комплекса и их последующем анализе с целью оценки продуктивности расположения гидролизуемой пептидной группы относительно каталитически активных групп фермента; в) моделировании структуры тетраэдрического промежуточного соединения в комплексе с ризопуспепсином и ее анализе с целью установления факторов, существенных для протекания катализа; г) создании рабочей модели каталитического механизма ризопуспепсина для ее последующего теоретического анализа квантовохимическими методами.

Диссертация состоит введения, основной части, включающей пять глав, а также выводов и библиографии.

Изложению оригинальной части работы предшествует литературный обзор (Глава I). Он состоит из 4 частей. В двух первых рассмотрены представления о протеолитических реакциях аспартатных протеиназ, сложившиеся в период до становления рентгеноструктурного анализа. Две последующие части посвящены рассмотрению результатов рентгеноструктурного анализа аспартатных протеиназ и стереохимических моделей каталитического акта, предложенных на основании полученных структурных данных.

Во второй главе рассматриваются основы теоретического подхода к решению проблем ферментативного катализа, а также предполагаемый план исследования.

Глава III посвящена вопросам выбора структурной модели субстрат-связывающего участка ризопуспепсина и апробации расчетного метода на примере моделирования ингибиторного комплекса ризопуспепсина, структура которого известна. В этой же главе рассмотрена и экспериментальная часть диссертации. В ней описан использованный нами метод поиска и расчета наиболее энергетически предпочтительных конформационных состояний олигопептидных лигандов (субстратов и субстратоподобных ингибиторов) в активных центрах ферментов.

В главе IV рассмотрены результаты моделирования пространственной структуры комплексов ризопуспепсина с гексапептидным субстратом на разных стадиях каталитической реакции. Глава разбита на две части, каждая из которых отражает результаты полученные для конкретной модели (субстрат в комплексе Михаэлиса и на стадии промежуточного тетраэдрического соединения).

В главе V рассмотрена схема каталитического механизма ризопуспепсина, предложенная на основании полученных расчетных данных.

Завершают диссертацию основные выводы и список используемой литературы.

Благодарности.

Автор приносит низкий поклон светлой памяти своего научного руководителя и Учителя, ныне покойного Евгения Митрофановича Попова за постановку темы и неоценимую, отеческую помощь в ее осуществлении, а также своему научному руководителю Льву Давыдовичу Румшу за поддержку и руководство, без которого это исследование не могло бы быть завершено.

Автор благодарит сотрудников лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН Л.М. Гинодмана и Т.В. Ротанову за дружеское участие, обсуждение результатов, полезные рекомендации и помощь в работе. Сугубая благодарность Т.М. Ивановой и Д.А. Левицкому за неоценимую помощь в подготовке рукописи и ее обсуждение.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кашпаров, Илья Валерьевич

ВЫВОДЫ.

1. Предложена структурная модель субстрат-связывающего участка рнзопуспепсина и апробирован метод расчета, позволяющий предсказывать геометрию олигопептидных лигандов в активном центре этого фермента.

2. На основании предложенной модели путем априорного расчета предсказана продуктивная ориентация специфического субстрата в активном центре ризопуспепсина.

3. Определена вероятная структура комплекса ризопуспепсина с тетраэдрическим промежуточным соединением. В соответствии с расчетной геометрией донором протона для атома азота расщепляемой связи может являться одна из гидроксильных групп промежуточного соединения, а именно та, которая располагается между каталитическими остатками аспарагиновых кислот Азр35 и Азр218 ризопуспепсина.

4. На основании геометрии расчетных структур невалентных комплексов ризопуспепсина с субстратом и промежуточным тетраэдрическим соединением предложена модель каталитического механизма, позволяющая объяснить способность ряда аспартатных протеиназ функционировать в щелочном диапазоне значений рН.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кашпаров, Илья Валерьевич, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Eyring, Н., Lamry, R., and Spikes, J. Mechanisms of Enzyme Action. 1954. Baltimore, J. Hoplins Univ. Press.

2. B.K. Антонов, Химия протеолиза, Наука, Москва, (1991).

3. J.B.S. Haldane, Enzymes, Longmans, (1930).

4. L. Pauling,"How my interest in proteins developed", Protein. Sci. 2:1060-1063 (1993).

5. Э. Фишер, Избранные труды, Наука, М., (1979).

6. D.E.J. Koshland,"Molecular basis of enzyme catalysis and control", Pure. Appl. Chem. 25:119-133 (1971).

7. D.E.J. Koshland, K.W. Carraway, G.A. Dafforn, J.D. Gass, and D.R. Storm, "The importance of orientation factors in enzymatic reactions", Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 36:13-20 (1972).

8. В. Дженкс, Катализ в Химии и энизимологии, Мир, М., (1972).

9. F. Karush,"Affinity and the immune response", Ann. N.Y. Acad. Sci. 169:56-64 (1970).

10. K.U. Linderstrom-Lang and J.A. Shellman, The Enzymes, Academic Press, New York, (1959).

11. Э.С. Бауэр, Теоретическая Биология, ВИЭМ, М., (1935).

12. Ю.И. Хургин, Д.С. Чернавский, and С.Э. Шноль, Молекулярная Биология, (1967).

13. JI.A. Блюменфельд, Проблемы биологической физики, Наука., М., (1974).

14. G.R. Delpierre and J.S. Fruton,"Inactivation of pepsin by diphenyldiazomethane", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54:1161-1167 (1965).

15. L.V. Kozlov, L.M. Ginodman, and V.N. Orekhovich,"[Inactivation of pepsin with diazocarbonyl compounds]", Biokhimiia 32:1011-1019 (1967).

16. R.L. Lundblad and W.H. Stein, "On the reaction of diazoacetyl compounds with pepsin", J. Biol. Chem 244:154-160 (1969).

17. J.A. Hartsuck and J. Tang,"The carboxylate ion in the active center of pepsin", J. Biol. Chem 247:2575-2580 (1972).

18. M.L. Bender, F.J. Kezdy, and J. Feder,"The kinetics of the trypsin-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl alpha- N-benzyloxycarbonyl-L-lysinate hydrochloride ", J. Am. Chem. Soc. 87:4953-4954 (1965).

19. M.L. Bender and F.J. Kezdy, "The trypsin-catalyzed hydrolysis of the p-nitrophenyl, methyl, and benzyl esters of alpha-N-benzyloxycarbonyl-L-lysine ", J. Am. Chem. Soc. 87:4954-4955 (1965).

20. M.L. Bender, F.J. Kezdy, and J. Feder, "Transient formation of an inactive intermediate in the reaction with alpha-N-benzoyl-L-arginine ethyl ester and alpha-N-benzoyl-L-arginine", J. Am. Chem. Soc. 87:4955-4957 (1965).

21. Э. Фершт, Структура и механизм действия ферментов, Мир, М., (1980).

22. J.R. Knowles, "On the mechanism of action ofpepsin", Philos.Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 257:135-146 (1970).

23. J.S. Fruton, "The specificity and mechanism of pepsin action", Adv Enzymol Relat Areas Mol. Biol. 1970. 33:401-443

24. I.V. Berezin, N.F. Kazanskaia, and A.A. Klesov, "Kinetics of the hydrolysis reaction catalyzing alpha-chymotrypsin and trypsin in the presence of added nucleophilic agents", Biokhimiia 36:108-117 (1971).

25. R.M. Epand,"Evidence against the obligatory formation of an acyl enzyme intermediate in the alpha-chymotrypsin catalyzed reactions of amides", Biochem. Biophys. Res. Commun. 37:313-318 (1969).

26. J. Fastrez and A.R. Fersht, "Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides andanilides by chymotrypsin", Biochemistry 1973.May.22. 12:2025-2034 (1973).

27. V.K. Antonov, L.M. Ginodman, Y.V. Kapitannikov, T.N. Barshevskaya, A.G. Gurova, and L.D. Rumsh, "Mechanism of pepsin catalysis: general base catalysis by the active- site carboxylate ion", FEBS Lett. 1978.Apr.l. 88:87-90 (1978).

28. V.K. Antonov, "New data on pepsin mechanism and specificity", Adv. Exp. Med. Biol. 1977. 95:179-198 (1977).

29. M.F. Perutz and F.S. Mathews, "An x-ray study of azide methaemoglobin", J. Mol. Biol. 21:199-202 (1966).

30. M.F. Perutz, "Some molecular controls in biology", Endeavour 26:3-8 (1967).

31. J.S. Kendrew, G. Bodo, and H.M. Dintzis, Nature 181:662-665 (1958).

32. C.C. Blake, D.F. Koenig, G.A. Mair, A.C. North, D.C. Phillips, and V.R. Sarma, "Structure of hen egg-white lysozyme. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 Angstrom resolution", Nature 206:757-761 (1965).

33. H.W. Wyckoff, K.D. Hardman, N.M. Allewell, T. Inagami, L.N. Johnson, and F.M. Richards, "The structure of ribonuclease-S at 3.5 A resolution", J. Biol. Chem 242:3984-3988 (1967).

34. H.W. Wyckoff, K.D. Hardman, N.M. Allewell, T. Inagami, D. Tsernoglou, L.N. Johnson, and F.M. Richards, "The structure of ribonuclease-S at 6 A resolution", J. Biol. Chem 242:3749-3753 (1967).

G. Kartha, J. Bello, andD. Harker, "Tertiary structure of ribonuclease", Nature 213:862-865 (1967).

36. B.W. Matthews, P.B. Sigler, R. Henderson, and D.M. Blow, "Three-dimensional structure of tosyl-alpha-chymotrypsin", Nature 214:652-656 (1967).

37. W.N. Lipscomb, J.A. Hartsuck, F.A. Quiocho, and G.N.J. Reeke, "The structure of carboxypeptidase A. IX. The x-ray diffraction results in the light of the chemical sequence", Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 64:28-35 (1969).

38. W.N. Lipscomb, J.A. Hartsuck, G.N.J. Reeke, F.A. Quiocho, P.H. Bethge, M.L. Ludwig, T.A. Steitz, H. Muirhead, and J.C. Coppola, "The structure of carboxypeptidase A. VII. The 2.0-angstrom resolution studies of the enzyme and of its complex with glycyltyrosine, and mechanistic deductions", Brookhaven Symp. Biol. 21:24-90 (1968).

39. N.S. Andreeva, A.E. Gustchina, A.A. Fedorov, N.E. Shutzkever, and T.V. Volnova, "X-ray crystallographic studies of pepsin", Adv. Exp. Med. Biol. 95:23-31 (1977).

40. I.N. Hsu, L.T. Delbaere, M.N. James, and T. Hofmann, "Penicillopepsin: 2.8 A structure, active site conformation and mechanistic implications", Adv. Exp. Med. Biol. 1977. 95:61-81 (1977).

41. I.N. Hsu, L.T. Delbaere, M.N. James, and T. Hofmann, "Penicillopepsin from Pénicillium janthinellum crystal structure at 2.8 A and sequence homology with porcine pepsin", Nature 1977.Mar.10. 266:140-145 (1977).

42. E. Subramanian, I.D. Swan, M. Liu, D.R. Davies, J.A. Jenkins, I.J. Tickle, and T.L. Blundell, "Homology among acid proteases: comparison of crystal structures at 3A resolution of acid proteases from Rhizopus chinensis and Endothia parasitica", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977.Feb. 74:556-559 (1977).

43. A.M. Silva, A.Y. Lee, S.V. Gulnik, P. Maier, J. Collins, T.N. Bhat, P.J. Collins, R.E. Cachau, K.E. Luker, I.Y. Gluzman, S.E. Francis, A. Oksman, D.E. Goldberg, and J.W. Erickson, "Structure and inhibition of plasmepsin II, a hemoglobin-degrading enzyme from Plasmodium falciparum", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996.Sep.17. 93:10034-10039 (1996).

44. A.M. Silva, A.Y. Lee, J.W. Erickson, and D.E. Goldberg, "Structural analysis of plasmepsin II. A comparison with human asparticproteases", Adv. Exp. Med. Biol. 1998. 436:363-373 (1998).

45. C.F. Aguilar, N.B. Cronin, M. Badasso, T. Dreyer, M.P. Newman, J.B. Cooper, D.J. Hoover, S.P. Wood, M.S. Johnson, and T.L. Blundell, "The three-dimensional structure at 2.4 A resolution of glycosylated proteinase A from the lysosome-like vacuole of Saccharomyces cerevisiae", J. Mol. Biol. 267:899-915 (1997).

46. C.F. Aguilar, V. Dhanaraj, K. Guruprasad, C. Dealwis, M. Badasso, J.B. Cooper, S.P. Wood, and T.L. Blundell, "Comparisons of the three-dimensional structures, specificities and glycosylation of renins, yeast proteinase A and cathepsin D", Adv. Exp. Med. Biol. 362:155-166 (1995).

47. D. Bailey, J.B. Cooper, B. Veerapandian, T.L. Blundell, B. Atrash, D.M. Jones, and M. Szelke, "X-ray-crystallographic studies of complexes ofpepstatin A and a statine-containing human renin inhibitor with endothiapepsin", Biochem. J. 289 ( Pt 2):363-371 (1993).

48. E.T. Baldwin, T.N. Bhat, S. Gulnik, M.V. Hosur, R.C. Sowder, R.E. Cachau, J. Collins, A.M. Silva, and J.W. Erickson, "Crystal structures of native and inhibited forms of human cathepsin D: implications for lysosomal targeting and drug design", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6796-6800 (1993).

49. R. Bott, E. Subramanian, and D.R. Davies, "Three-dimensional structure of the complex of the Rhizopus chinensis carboxyl proteinase and pepstatin at 2.5-A resolution", Biochemistry 21:6956-6962 (1982).

50. S.M. Cutfield, E.J. Dodson, B.F. Anderson, P.C. Moody, C.J. Marshall, P.A. Sullivan, and J.F. Cutfield, "The crystal structure of a major secreted aspartic proteinase from Candida albicans in complexes with two inhibitors", Structure 3:1261-1271 (1995).

51. M.N. James, A. Sielecki, F. Salituro, D.H. Rich, and T. Hofmann, "Conformational flexibility in the active sites of aspartyl proteinases revealed by a pepstatin fragment

binding topenicillopepsin", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982.Oct. 79:6137-6141 (1982).

52. K. Suguna, E.A. Padlan, R. Bott, J. Boger, K.D. Parris, and D.R. Davies,

"Structures of complexes of rhizopuspepsin with pepstatin and other statine-containing inhibitors", Proteins 13:195-205 (1992).

53. N.S. Andreeva, A.S. Zdanov, A.E. Gustchina, and A.A. Fedorov, "Structure of ethanol-inhibited porcine pepsin at 2-A resolution and binding of the methyl ester of phenylalanyl-diiodotyrosine to the enzyme", J. Biol. Chem 259:11353-11365 (1984).

54. A. Sali, B. Veerapandian, J.B. Cooper, S.I. Foundling, D.J. Hoover, and T.L. Blundell, "High-resolution X-ray diffraction study of the complex between endothiapepsin and an oligopeptide inhibitor: the analysis of the inhibitor binding and description of the rigid body shift in the enzyme", EMBO. J. 8:2179-2188 (1989).

55. A.R. Sielecki, K. Hayakawa, M. Fujinaga, M.E. Murphy, M. Fraser, A.K. Muir,

C.T. Carilli, J. A. Lewicki, J.D. Baxter, and M.N. James, "Structure of recombinant human renin, a target for cardiovascular- active drugs, at 2.5 A resolution", Science 243:1346-1351 (1989).

56. M.N. James, A.R. Sielecki, K. Hayakawa, and M.H. Gelb, "Crystallographic analysis of transition state mimics bound to penicillopepsin: difluorostatine- and difluorostatone-containingpeptides", Biochemistry 31:3872-3886 (1992).

57. B. Veerapandian, J.B. Cooper, A. Sali, T.L. Blundell, R.L. Rosati, B.W. Dominy,

D.B. Damon, and D.J. Hoover, "Direct observation by X-ray analysis of the tetrahedral "intermediate"of asparticproteinases", Protein. Sci.. 1:322-328 (1992).

58. K.D. Parris, D.J. Hoover, D.B. Damon, and D.R. Davies, "Synthesis and crystallographic analysis of two rhizopuspepsin inhibitor complexes", Biochemistry 31:8125-8141 (1992).

59. N.S. Andreeva, A.A. Fedorov, A.E. Gushchina, R.R. Riskulov, and N.E. Shutskever,"X-ray structural analysis ofpepsin. V. Conformation of the main chain of the enzyme", Mol. Biol. (Mosk) 12:922-936 (1978).

60. N.S. Andreeva, A.S. Zhdanov, A.A. Fedorov, A.E. Gushchina, and N.E. Shutskever, "X-ray analysis ofpepsin. VI. Atomic structure of the enzyme at 2- angstrom resolution", Mol. Biol. (Mosk) 18:313-322 (1984).

61. A.R. Sielecki, A.A. Fedorov, A. Boodhoo, N.S. Andreeva, and M.N. James, "Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at 1.8 A resolution", J. Mol. Biol. 214:143-170 (1990).

62. M.N. James and A.R. Sielecki, "Molecular structure of an aspartic proteinase zymogen, porcine pepsinogen, at 1.8 A resolution", Nature 1986.Jan.2. 319:33-38 (1986).

63. G.L. Gilliland, E.L. Winborne, J. Nachman, and A. Wlodawer, "The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3 A resolution", Proteins 8:82-101 (1990).

64. E.A. Gustchina, P. Majer, L.D. Rumsh, L.M. Ginodman, and N.S. Andreeva, "Post X-ray crystallographic studies of chymosin specificity. The role of histidine-proline cluster of kappa-casein in catalytic reactions", Adv. Exp. Med. Biol. 436:179-184 (1998).

65. M.G. Safro and N.S. Andreeva, "On the role of peripheral interactions in specificity of chymosin", Biochem. Int. 20:555-561 (1990).

66. M.G. Safro, N.S. Andreeva, and T.L. Blundell, "The role of peripheral interactions in chymosin specificity", Mol. Biol. (Mosk) 21:1582-1589 (1987).

67. M.G. Safro, N.S. Andreeva, and A.S. Zhdanov,"X-ray study of chymosin. I. Molecular replacement at a 3 angstroms resolution", Mol. Biol. (Mosk) 19:400405 (1985).

68. C.H. Wong, T ,J. Lee, T.Y. Lee, T.H. Lu, and I.H. Yang,"Structure of acid protease from Endothiaparasitica in cross-linkedform at 2.45-A resolution", Biochemistry 1979.Apr.17. 18:1638-1640

69. T.L. Blundell, J.A. Jenkins, B.T. Sewell, L.H. Pearl, J.B. Cooper, I.J. Tickle, B. Veerapandian, and S.P. Wood, "X-ray analyses of asparticproteinases. The three-dimensional structure at 2.1 A resolution of endothiapepsin", J. Mol. Biol. 1990.Feb.20. 211:919-941

70. K. Suguna, R.R. Bott, E.A. Padlan, E. Subramanian, S. Sheriff, G.H. Cohen, and D.R. Davies, "Structure and refinement at 1.8 A resolution of the aspartic proteinase from Rhizopus chinensis", J. Mol. Biol. 196:877-900 (1987).

71. J. Yang, A. Teplyakov, and J.W. Quail, "Crystal structure of the aspartic proteinase from Rhizomucor miehei at 2.15 A resolution", J. Mol. Biol. 268:449-459 (1997).

72. S. Cutfield, C. Marshall, P. Moody, P. Sullivan, and J. Cutfield, "Crystallization of inhibited aspartic proteinase from Candida albicans", J. Mol. Biol. 234:1266-1269 (1993).

73. S. Karlsen, E. Hough, and R.L. Olsen,"Structure and proposed amino-acid sequence of a pepsin from atlantic cod (Gadus morhuaj", Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 54:32-46 (1998).

74. M. Miller, J. Schneider, B.K. Sathyanarayana, M.V. Toth, G.R. Marshall, L. Clawson, L. Selk, S.B. Kent, and A. Wlodawer," Structure of complex of synthetic HIV-1 protease with a substrate-based inhibitor at 2.3 A resolution", Science 246:1149-1152 (1989).

75. M.A. Navia, P.M. Fitzgerald, B.M. McKeever, C.T. Leu, J.C. Heimbach, W.K. Herber, I.S. Sigal, P.L. Darke, and J.P. Springer, "Three-dimensional structure of aspartyl protease from human immunodeficiency virus HIV-1", Nature 1989.Feb.16. 337:615-620

76. A. Wlodawer, M. Miller, M. Jaskolski, B.K. Sathyanarayana, E. Baldwin, I.T. Weber, L.M. Selk, L. Clawson, J. Schneider, and S.B. Kent, "Conservedfolding in

retroviral proteases: crystal structure of a synthetic HIV-1 protease ", Science 245:616-621 (1989).

77. M.E. Fraser, N.C. Strynadka, P.A. Bartlett, J.E. Hanson, and M.N. James, "Crystallographic analysis of transition-state mimics bound to penicillopepsin: phosphorus-containing peptide analogues", Biochemistry 31:5201-5214 (1992).

78. M.E. Fraser, J.H. Meyer, P.A. Bartlett, and M.N. James, "Overcoming the unfavourable entropie contribution ofligand binding with a macrocyclic inhibitor bound to penicillopepsin", Adv. Exp. Med. Biol. 436:355-359 (1998).

79. N.E. Kohl, E.A. Emini, W.A. Schleif, L.J. Davis, J.C. Heimbach, R.A. Dixon, E.M. Scolnick, and I.S. Sigal, "Active human immunodeficiency virus protease is required for viral infectivity", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1988.Jul. 85:4686-4690

80. H. Mitsuya, R. Yarchoan, and S. Broder, Science 249:1542(1989).

81. A.G. Tomasselli, W.F. Hove, and T.K. Sawyer, Chimicaoggi 6-27 (1991).

82. P.M. Fitzgerald, B.M. McKeever, J.F. VanMiddlesworth, J.P. Springer, J.C. Heimbach, C.T. Leu, W.K. Herber, R.A. Dixon, and P.L. Darke, "Crystallographic analysis of a complex between human immunodeficiency virus type 1 protease and acetyl-pepstatin at 2.0-A resolution", J. Biol. Chem 265:14209-14219 (1990).

83. A.L. Swain, M.M. Miller, J. Green, D.H. Rich, J. Schneider, S.B. Kent, and A. Wlodawer, "X-ray crystallographic structure of a complex between a synthetic protease of human immunodeficiency virus 1 and a substrate-based hydroxyethylamine inhibitor", Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87:8805-8809 (1990).

84. K.H. Murthy, E.L. Winborne, M.D. Minnich, J.S. Culp, and C. Debouck, "The crystal structures at 2.2-A resolution ofhydroxyethylene-based inhibitors bound to human immunodeficiency virus type 1 protease show that the inhibitors are present in two distinct orientations", J. Biol. Chem 267:22770-22778 (1992).

85. N. Thanki, J.K. Rao, S.I. Foundling, W.J. Howe, J.B. Moon, J.O. Hui, A.G. Tomasselli, R.L. Heinrikson, S. Thaisrivongs, and A. Wlodawer, "Crystal structure

of a complex of HIV-1 protease with a dihydroxyethylene-containing inhibitor: comparisons with molecular modeling", Protein. Sci. 1:1061-1072(1992).

86. A.M. Mulichak, J.O. Hui, A.G. Tomasselli, R.L. Heinrikson, K.A. Curry, C.S. Tomich, S. Thaisrivongs, T.K. Sawyer, andK.D. Watenpaugh, "The crystallographic structure of the protease from human immunodeficiency virus type 2 with two syntheticpeptidic transition state analog inhibitors", J. Biol. Chem 268:13103-13109(1993).

87. L. Tong, S. Pav, C. Pargellis, F. Do, D. Lamarre, and P.C. Anderson, "Crystal structure of human immunodeficiency virus (HIV) type 2 protease in complex with a reduced amide inhibitor and comparison with HIV-1 protease structures", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:8387-8391 (1993).

88. L. Tong, S. Pav, S. Mui, D. Lamarre, C. Yoakim, P. Beaulieu, and P.C. Anderson, "Crystal structures ofHIV-2protease in complex with inhibitors containing the hydroxyethylamine dipeptide isostere", Structure 3:33-40 (1995).

89. L. Hong, A. Treharne, J.A. Hartsuck, S. Foundling, and J. Tang, "Crystal structures of complexes of a peptidic inhibitor with wild-type and two mutant HIV-1 proteases", Biochemistry 35:10627-10633 (1996).

90. P.L. Beaulieu, D. Wernic, A. Abraham, P.C. Anderson, T. Bogri, Y. Bousquet, G. Croteau, I. Guse, D. Lamarre, F. Liard, W. Paris, D. Thibeault, S. Pav, and L. Tong, "Potent HIV protease inhibitors containing a novel (hydroxyethyl) amide isostere", J. Med. Chem. 40:2164-2176 (1997).

91. M. Miller, M. Geller, M. Gribskov, and S.B. Kent, "Analysis of the structure of chemically synthesized HIV-1 protease complexed with a hexapeptide inhibitor. Parti: Crystallographic refinement of 2 A data", Proteins 27:184-194 (1997).

92. Y. van Boulanger, L. Senecal, and G. Sauve, "Solution structure of the HIV protease inhibitor acetyl-pepstatin as determined by NMR and molecular modeling", J. Biomol. Struct. Dyn. 14:421-428 (1997).

93. A.M. Silva, R.E. Cachau, H.L. Sham, and J.W. Erickson, "Inhibition and catalytic mechanism of HIV-1 aspartic protease", J. Mol. Biol. 255:321-346 (1996).

94. P.Y. Lam, Y. Ru, P.K. Jadhav, P.E. Aldrich, G.V. DeLucca, C.J. Eyermann, C.H. Chang, G. Emmett, E.R. Holler, W.F. Daneker, L. Li, P.N. Confalone, R.J. McHugh, Q. Han, R. Li, J.A. Markwalder, S.P. Seitz, T.R. Sharpe, L.T. Bacheler, M.M. Rayner, R.M. Klabe, L. Shum, D.L. Winslow, D.M. Kornhauser, and C.N. Hodge, "Cyclic HIV protease inhibitors: synthesis, conformational analysis, P2/P2' structure-activity relationship, and molecular recognition of cyclic ureas", J. Med. Chem. 39:3514-3525 (1996).

95. P.K. Jadhav, F.J. Woerner, P.Y. Lam, C.N. Hodge, C.J. Eyermann, H.W. Man, W.F. Daneker, L.T. Bacheler, M.M. Rayner, J.L. Meek, S. Erickson-Viitanen, D.A. Jackson, J.C. Calabrese, M. Schadt, and C.H. Chang, "Nonpeptide cyclic cyanoguanidines as HIV-1 protease inhibitors: synthesis, structure-activity relationships, and X-ray crystal structure studies", J. Med. Chem. 41:1446-1455 (1998).

96. S.F. Martin, G.O. Dorsey, T. Gane, M.C. Hillier, H. Kessler, M. Baur, B. Matha, J.W. Erickson, T.N. Bhat, S. Munshi, S.V. Gulnik, and I.A. Topol, "Cyclopropane-derived peptidomimetics. Design, synthesis, evaluation, and structure of novel HIV-1 protease inhibitors", J. Med. Chem. 41:1581-1597 (1998).

97. Q. Han, C.H. Chang, R. Li, Y. Ru, P.K. Jadhav, and P.Y. Lam, "Cyclic HIV protease inhibitors: design and synthesis of orally bioavailable, pyrazole P2/P2' cyclic ureas with improved potency", J. Med. Chem. 41:2019-2028 (1998).

98. P.J. Ala, E.E. Huston, R.M. Klabe, D.D. McCabe, J.L. Duke, C.J. Rizzo, B.D. Korant, R.J. DeLoskey, P.Y. Lam, C.N. Hodge, and C.H. Chang, "Molecular basis of HIV-1 protease drug resistance: structural analysis of mutant proteases complexed with cyclic urea inhibitors", Biochemistry 36:1573-1580 (1997).

99. P.K. Jadhav, P. Ala, F.J. Woerner, C.H. Chang, S.S. Garber, E.D. Anton, and L.T. Bacheler,"Cyclic urea amides: HIV-1 protease inhibitors with low nanomolar potency against both wild type and protease inhibitor resistant mutants of HIV", J. Med. Chem. 40:181-191 (1997).

100. K. Backbro, S. Lowgren, K. Osterlund, J. Atepo, T. Unge, T. Hulten, N.M. Bonham, W. Schaal, A. Karlen, and A. Hallberg," Unexpected binding mode of a cyclic sulfamide HIV-1 protease inhibitor", J. Med. Chem 40:898-902 (1997).

101. J. Misson, W. Clark, and M.J. Kendall, "Therapeutic advances: protease inhibitors for the treatment of HIV-1 infection", J. Clin. Pharm. Ther. 1997.Apr. 22:109-117

102. K. Suguna, E.A. Padlan, C.W. Smith, W.D. Carlson, and D.R. Davies, "Binding of a reduced peptide inhibitor to the aspartic proteinase from Rhizopus chinensis: implications for a mechanism of action", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:70097013 (1987).

103. M.N. James and A.R. Sielecki, "Stereochemical analysis of peptide bond hydrolysis catalyzed by the aspartic proteinase penicillopepsin", Biochemistry 24:3701-3713 (1985).

104. M.N. James, I.N. Hsu, and L.T. Delbaere, "Mechanism of acid protease catalysis based on the crystal structure of penicillopepsin", Nature 1977.Jun.30. 267:808813 (1977).

105. M.N. James, "An X-ray crystallographic approach to enzyme structure and function", Can. J. Biochem. 58:252-271 (1980).

106. N.S. Andreeva, A.E. Gushchina, and A. A. Fedorov, "[X-ray structural studies of pepsin binding of phenylalanyldiiodotyrosine at 3 A resolution]", Dokl. Akad. Nauk SSSR 259:1261-1264 (1981).

107. L.H. Pearl, "The catalytic mechanism of aspartic proteinases", FEBS Lett.. 214:812 (1987).

108. M. Jaskolski, A.G. Tomasselli, T.K. Sawyer, D.G. Staples, R.L. Heinrikson, J. Schneider, S.B. Kent, and A. Wlodawer, "Structure at 2.5-A resolution of chemically synthesized human immunodeficiency virus type 1 protease complexed with a hydroxyethylene- based inhibitor", Biochemistry 30:1600-1609 (1991).

109. Е.М. Попов, И.В. Кашпаров, and М.Е. Попов,"Представление о механизме действия аспартатных протеиназ. Общая теория биологического катализа.", Успехи биологической химии. 34:40-82 (1994).

110. М.В. Волькенштейн, Молекулярная биофизика, Наука, М., (1975).

111. Е.М. Попов , Структурно-функциональная организация белков , Наука, М., (1992).

112. A.J. Pertsin and A.I. Kitaigorodsky, The atom-atom potential method: application to

nronnir mnlprulnr vnlirlv SinrlЛСТРГ-Vpr 1 яCT Rprlin (1

v. -------„„.,„.. , . --J-,., ,

113. Е.М. Попов, Структурная организация белков, Наука, М., (1989).

114. Popov, М. Е., Kashparov, I. V., and Popov, Е. М. Theory and method of an a priory computation of the catalytic acts of aspartic and serine proteinases. (Proceedings of the VHI-th International aspartic proteinase conference, Banff, Alberta, Canada.), 27. 1996.

115. Е.М. Попов, И.В. Кашпаров, and М.Е. Попов,"Механизм действия аспартатных протеиназ. I. Теория и метод.", Биоорганическая химия. 22:323-338 (1996).

116. J.S. Fruton, "The mechanism of the catalytic action ofpepsin and related acid proteinases", Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 44:1-36 (1976).

117. R.W. Harrison and I.T. Weber, "Molecular dynamic simulations of HIV-1 protease with peptide substrate.", Protein Eng. 7:1353-1363 (1994).

118. D.C. Chatfield and B.R. Brooks, "HIV-1 protease cleavage mechanism elucidated with molecular dynamic simulation.", J. Amer. Chem. Soc. 117:5561-5572 (1995).

119. I.T. Weber and R.W. Harrison, "Molecular mechanics calculations on Rous sarcoma virus protease with peptide substrate.", Protein. Sci.. 6:2365-2374 (1997).

120. H.J. Bohm, "The computer program LUDI: a new method for the de novo design of enzyme inhibitors.", J.Comput.-AidedMol.Design. 6:61-78 (1992).

121. H.J. Bohm, "LJJDI: rule-based automatic design of new substituents for enzyme inhibitor leads.", J.Comput.-Aided Mol.Design. 6:593-606 (1992).

122. A.R. Leach, "Ligand docking to proteins with discrete side chain flexibility.", J. Mol. Biol. 235:345-356 (1994).

123. A.R. Leach and I.D. Kuntz, "Conformational analysis of flexible ligands in macromolecular receptor sites.", J. Comput. Chem. 13:730-748 (1992).

124. I.D. Kuntz, J.M. Blaney, S.J. Oatley, R.L. Langridge, and Т.Е. rrin, "A geometric approach to macromolecule-ligand interactions.", J. Mol. Biol. 161:269-288 (1982).

125. J.B. Moon and W.J. Howe, "Computer design ofbioactive molecules: A method for receptor based de novo ligand design.", Proteins: Struct. Funct. Genet. 11:314-328 (1991).

126. I.V. Kashparov, M.E. Popov, and E.M. Popov, "Mechanism of Action ofAspartic Proteases", Adv. Exp. Med. Biol. 436:115-121 (1998).

127. R.A. Scott and H.A. Scheraga,"Невалентные взаимодействия -параметры", J. Chem. Phys. 45:2091-2101 (1966).

128. W.D. Cornell, P. Cieplak, C.I. Bayly, I.R. Gould, K.M. Merz, D.M. Ferguson, D.C. Spellmeyer, T. Fox, J.W. Caldwell, and P. A. Kollman, "A second generation Force Fieldfor the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules.", J. Amer. Chem. Soc. 117:5179-5197 (1995).

129. F.A. Momany, L.M. Carruthers, R.F. McGuire, and H.A. Scheraga, "Intermolecular potentials from crystal data. III. Determination of empirical potentials and application to the packing configurations and lattice energies of hydrocarbons, carboxylic acids, amines, and amides.", The Journal of Physical Chemistry 78:1595-1630(1974).

130. E.M. Popov, Int. J. Quant. Chem. 16:707-737 (1979).

131. F.A. Momany, R.F. McGuire, A.W. Burgess, and H.A. Scheraga, "Energy

parameters in polypeptides. VII. Geometric parameters, partial atomic charges,

nonbonded interactions, hydrogen bond interactions, and intrinsic torsional potentials for the naturaly occuring amino acids.", J. Phys. Chem. 79:2361-2381 (1975).

132. T. Oka and K. Morihara, "Comparative specificity of microbial acid proteinases for synthetic peptides. Primary specificity with Z-tetrapeptides", Arch. Biochem. Biophys. 165:65-71 (1974).

133. W.T. Lowther, Z. Chen, X.L. Lin, J. Tang, and B.M. Dunn, "Substrate specificity study of recombinant Rhizopus chinensis aspartic proteinase", Adv. Exp. Med. Biol. 306:275-279(1991).

134. T. Hofmann, R.S. Hodges, and M.N. James, "Effect of pH on the activities of penicillopepsin and Rhizopus pepsin and a proposal for the productive substrate binding mode in penicillopepsin", Biochemistry 23:635-643 (1984).

135. K. Takahashi, F. Mizobe, and W.J. Change," Inactivation of acid proteases from Rhizopus chinensis, Aspergillus saitoi and Mucor pusillus, and calfrennin by diazoactylnorleucine methyl ester", J. Biochem. (Tokyo) 71:161-164 (1972).

136. K. Takahashi and W.J. Chang, "Specific chemical modifications of acid proteases in the presence and absence ofpepstatin", J. Biochem. (Tokyo) 73:675-677 (1973).

137. K. Takahashi and W.J. Chang, "The structure and function of acid proteases. V. Comparative studies on the specific inhibition of acid proteases by diazoacetyl-DL-norleucine methyl ester, 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy) propane and pepstatin", J. Biochem. (Tokyo) 80:497-506 (1976).

138. P. Sepulveda, K.W. Jackson, and J. Tang, "The amino terminal sequences of acid proteases-human pepsin and gastricsin and the protease of Rhizopus chinensis", Biochem. Biophys. Res. Commun. 63:1106-1112 (1975).

139. J.C. Gripon, S.H. Rhee, and T. Hofmann," N-terminal amino acid sequences of acid proteases: acid proteases from Penicillium roqueforti and Rhizopus chinensis and alignment with penicillopepsin and mammalian proteases", Can. J. Biochem. 55:504-506(1977).

140. D. Tsuru, A. Hattori, H. Tsuji, and J. Fukumoto, "Studies on mold protease. 3. Some physiochemicalproperties and amino acid composition of Rhizopus chinensis acid protease", J. Biochem. (Tokyo) 67:415-420 (1970).

141. M. Ohtsuru, J. Tang, and R. Delaney, "Purification and characterization of rhizopuspepsin isozymes from a liquid culture of Rhizopus chinensis", Int. J. Biochem. 14:925-932 (1982).

142. M. Ohtsuru, J. Tang, and R. Delaney, "Liquid culture of Rhizopus chinensis for the production of acid protease rhizopuspepsin", Int. J. Biochem. 14:921-924 (1982).

143. R. Delaney, R.N. Wong, G.Z. Meng, N.H. Wu, and J. Tang, "Amino acid sequence of rhizopuspepsin isozyme pi 5", J. Biol. Chem 262:1461-1467 (1987).

144. K. Takahashi, "The amino acid sequence of rhizopuspepsin, an aspartic proteinase from Rhizopus chinensis", J. Biol. Chem 262:1468-1478 (1987).

145. K. Takahashi, "Determination of the amino acid sequences of the two major isozymes of rhizopuspepsin", J. Biochem. (Tokyo) 103:162-167 (1988).

146. H. Horiuchi, K. Yanai, T. Okazaki, M. Takagi, and K. Yano, "Isolation and sequencing of a genomic clone encoding aspartic proteinase of Rhizopus niveus", J. Bacteriol. 170:272-278 (1988).

147. Z. Chen, G. Koelsch, H.P. Han, X.J. Wang, X.L. Lin, J.A. Hartsuck, and J. Tang, "Recombinant rhizopuspepsinogen. Expression, purification, and activation properties of recombinant rhizopuspepsinogens", J. Biol. Chem 266:11718-11725 (1991).

148. X.L. Lin, M. Fusek, Z. Chen, G. Koelsch, H.P. Han, J.A. Hartsuck, and J. Tang, "Studies on pepsin mutagenesis and recombinant rhizopuspepsinogen", Adv. Exp. Med. Biol. 306:1-8 (1991).

149. K.D. Parris, D.J. Hoover, and D.R. Davies, "Crystal structures of rhizopuspepsin/inhibitor complexes", Adv. Exp. Med. Biol. 306:217-231 (1991).

150. M.N. James and A.R. Sielecki, "Structure and refinement of penicillopepsin at 1.8 A resolution", J.Mol.Biol. 163:299-361 (1983).

151. L.J. Hyland, T.A.J. Tomaszek, and T.D. Meek,"Human immunodeficiency virus-1 protease. 2. Use of pH rate studies and solvent kinetic isotope effects to elucidate details of chemical mechanism", Biochemistry 30:8454-8463 (1991).

152. L. Hong, J.A. Hartsuck, S. Foundling, J. Ermolieff, and J. Tang, "Active-site mobility in human immunodeficiency virus, type I, protease as demonstrated by crystal structure of A28S mutant", Protein. Sci.. 7:300-305 (1998).

153. M.J. Dudek and J.W. Ponder,"Accurate Modeling of the Intramolecular Electrostatic Energy of Proteins.", J. Comput. Chem. 16:791-816 (1995).

154. J.W. Ponder and F.M. Richards, "An efficient newton-like method for molecular mechanics energy minimization of large molecules.", J. Comput. Chem. 8:1016-1024(1987).

155. W.T. Lowther and B.M. Dunn, "Site-directed mutagenesis of rhizopuspepsin: an analysis of unique specificity", Adv. Exp. Med. Biol. 1995. 362:555-558 (1995).

156. J. Wu, J.M. Adomat, T.W. Ridky, J.M. Louis, J. Leis, R.W. Harrison, and I.T. Weber, "Structural basis for specificity of retroviral proteases", Biochemistry 37:4518-4526(1998).

157. R. Smith, I.M. Brereton, R.Y. Chai, and S.B. Kent,"Ionization states of the catalytic residues in HIV-1 protease", Nat. Struct. Biol. 3:946-950 (1996).

158. K.C. Chen and J. Tang, "Amino acid sequence around the epoxide-reactive residues in pepsin", J. Biol. Chem. 247:2566-2574 (1972).

159. K. Medzihradzky, I.M. Voynick, H. Medzihradszky-Schweiger, and J.S. Fruton, "Effect of secondary enzyme-substrate interactions on the cleavage of synthetic peptides by pepsin", Biochemistry 9:1154-1162 (1970).

160. T.R. Hollands, I.M. Voynick, and J.S. Fruton,"Action of pepsin on cationic synthetic substrates", Biochemistry 8:575-585 (1969).

161. J.B. Cooper, S.I. Foundling, A. Hemmings, F.E. Watson, B.L. Sibanda, T.L. Blundell, D.M. Jones, A. Hallett, B. Atrash, and M. Szelke, "Inhibitors of aspartic

proteinases and their relevance to the design of antihypertensive agents", Biochem. Soc. Trans. 15:751-754 (1987).

162. L.C. Katwa, Y. Sun, S.E. Campbell, S.C. Tyagi, A.K. Dhalla, J.C. Kandala, and K.T. Weber, "Pouch tissue and angiotensin peptide generation [In Process CitationJ", J. Mol. Cell. Cardiol. 30:1401-1413 (1998).

163. N.I. Dergousova, Yu.F. Leonova, A.A. Zinchenko, L.D. Rumsh, andN.S. Andreeva, "Mutant of HIV-1 Protease with New Specific properties.", Protein and Peptide Letters 4:321-328 (1997).

164. L.V. Kozlov and L.L. Zavada, "pH-dependence of the mechanism ofpepsin action", Mol. Biol. (Mosk) 9:735-741 (1975).