Механизм действия глутаматдекарбоксилазы из E.COLI тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Алмазов, Владимир Петрович

• Алмазов, Владимир Петрович
• кандидат физико-математических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Алмазов, Владимир Петрович

ВВЕДЕНИЕ И ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ГЛАВА I. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ.

§ I. Спектрокинетический подход

§ 2. Метод остановленного потока (обзор)

§ 3. Описание установки, работающей по методу остановленного потока

§ 4. Математическая обработка спектроскопической информации.

§ 5. Квантовохимические методы расчета электронной структуры и спектров молекул.

§ б. Дополнительные методы, использованные в работе.

§ 7. Объекты исследования - фермент, субстраты

ГЛАВА XI. СПЕКТРОСКОПИЯ И ЭЛЕКТРОННАЯ СТРУКТУРА

ШИФФОВЫХ ОСНОВАНИИ ПИРЙДОКСАЛЬ- !>-ФОСФАТА С АМИНОКИСЛОТАМИ И ИХ ХИНОИДНЫХ АНАЛОГОВ.

§ I. Спектроскопия и электронная структура соединений группы витамина Вб (обзор)

§ 2. Спектроскопия и электронная структура ыиффовых оснований пиридоксаль~5Цюсфата с аминокислотами и их хиноидных аналогов.

ГЛАВА Ш. МОДЕЛЬ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЯ.

§ I. Механизм действия глутаматдекарбоксилазы литературный обзор).

§ 2. Экспериментальное исследование взаимодействия глутаматдекарбоксилазы с субстратами.

ГШ 1У. ЭЛЕКТРОННАЯ СТРУКТУРА КОФЕВЕЕНТ-СУБСТРАТНЫХ КШГШЕКСОВ И ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ФУШЩИОИАЛЫЮЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ ИИРИДОКСАЛЕВОГО КАТАЛИЗА.

§ I. Стадии ферментативной реакции декарбоксилирования.-¿

§ 2. Электронно-конформационные соотношения в кофермент-субстратных комплексах.

§ 3. Электронная структура карбаниона и влияние зарядового окружения на реакционную способность карбаниона

§ 4. Влияние зарядового окружения на функциональные свойства кофермент-субстратных комплексов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм действия глутаматдекарбоксилазы из E.COLI»

Большие успехи, достигнутые за последние годы в изучении жизненно важных биологических процессов, связаны в значительной степени с выяснением физико-химических основ этих процессов на молекулярном уровне. Одним из важнейших разделов современной молекулярной биологии является энзимология, позволяющая подойти к пониманию механизмов регуляции биологических процессов. В свою очередь выяснение механизмов, лежащих в основе каталитического действия ферментов, является одной из фундаментальных задач энзи-мологии. Для глубокого понимания, как работает фермент, необходимо знание последовательности стадий ферментативной реакции, природы образующихся фермент-субстратных комплексов, роли различных функциональных групп кофермента и белка в активном центре фермента. В последее время все большее признание находят идеи, высказанные в работе Иванова и Карпейского /I/ о существенной роли фактора индуцированного соответствия, согласно которому в процессе образования и превращения фермент-субстратных комплексов происходит изменение взаимной пространственной ориентации функциональных групп белка, кофактора и субстрата. Причем, формирование оптимальных условий протекания каждой из последовательных стадий ферментативной реакции становится возможным и необходимым в результате конформационных и электронных изменений в фермент-субстратном комплексе на предыдущей стадии, т.е. каждая предыдущая стадия подготавливает все необходимые условия для последующей.

Среди разнообразных ферментов весьма существенную роль играют так называемые пиридоксалевые ферменты, коферментом которых является либо пиридоксаль-фосфат (ПЛФ), либо пиридоксамин-З^-фос-фат (ШФ). Эти ферменты катализируют разнообразные превращения аминокислот и аминов. Причем, эти превращения являются ключевыми звеньями в процессах метаболизма азота и серы. Разработка проблем пиридоксалевого катализа важна как для понимания физиологической регуляции процессов обмена, так и для сознательного управления процессами обмена, для воздействия на активность пиридоксалевых ферментов различными природными и синтетическими агентами. Кроме того, пиридоксалевые ферменты важны при решении практических задач в микробиологии, физиологии питания, клинической медицине и т.д. Пиридоксалевые ферменты катализируют реакции переаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и другие /2,3/.

Принципиальная схема реакций, катализируемых пиридоксалевы-ми ферментами была предложена в работах А.Е.Браунштейна и М.М.Шемякина /2/ и Снелла с сотрудниками /3/. Кроме того, было показано /3/, что практически все типы превращений аминокислот, вызываемые пиридоксалевыми ферментами можно наблюдать в модельных реакциях с участием ПДФ. '

Среди разнообразных пиридоксалевых ферментов, катализирующих превращения аминокислот, наиболее изученными в настоящее время являются трансаминазы /4/. Наряду с этим, очень важное физиологическое значение имеет другая группа пиридоксалевых ферментов декарбоксилазы аминокислот. Среди этой группы глутаматдекарбо-ксилаза (К§ 4.1.1.15) представляет особый интерес, т.к. она превращает глутаминовую кислоту в ^-аминомасляную, которая является медиатором процесса торможения в центральной нервной системе /5/. Однако, до последнего времени механизм действия этого фермента был изучен недостаточно подробно.

В рамках теории пиридоксалевого катализа общая схема ©(-декарбоксилирования глутаминовой кислоты представлена на рис. I.

Калянкар и Снелл /8/ сформулировали механизм ©(-декарбоксилирования, изучая модельную реакцию декарбоксилирования между н

К-К-СООН л/Ч

7\л я инг + I ст> I

Рис. I Общая схема механизма о(.-декарбоксилирования глутаминовой кислоты /2,3,6,7/. пиридоксалем и ^-алкил-замещенными аминокислотами. В дополнение к схеме, указанной выше, они установили, что в этих системах наряду с декарбоксилированием происходит последующее переаминирование в результате чего кроме СС^ и амина образуются кетон и ШФ. Б.С.Сухарева и А.Е.Браунштейн /9/ обнаружили образование ШФ при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы с природным субстратом - глутами-новой кислотой и ее аналогами (аспарагииовой кислотой, оС-метил-глутаминовой кислотой). Хантли и Метцлер /10/ также наблюдали при взаимодействии глутаматдекарбоксилазы с (А-метилглутаминовой кислотой наряду с декарбоксилированием побочную реакцию переаминирова-ния. В результате этих исследований для ферментативного декарбо-ксилирования был предложен механизм, аналогичный предложенному Калянкаром и Снеллом для модельной реакции декарбоксидирования, т.е. с учетом побочной реакции переаминирования.

Однако, все известные схемы ферментативного декарбоксидирования не учитывали зарядовых, таутомерных и электроннснконформа-ционных соотношений в кофермент-субстратном комплексе, что обязательно для действительного понимания механизма действия глутаматдекарбоксилазы. Поэтому необходимо было выяснить природу кофермент- субстратных комплексов, возникающих в ходе ферментативной реакции. Только наличие такой информации может позволить создать достаточно исчерпывающую модель ферментативного декарбоксидирования, адекватно описывающую все известные экспериментальные результаты.

Таким образом, цели настоящего исследования могут быть сформулированы следующим образом.

I. Экспериментальное обнаружение и идентификация промежуточных кофермент-субстратных комплексов и разработка на основе этих обнаруженных кофермент-субстратных комплексов модели фердентативного декарбоксилирования, учитывающую зарядовые и таутомерные соотношения.

2. Выяснение взаимосвязи между пространственным строением, электронным строением и функциональной специфичностью кофермент-субстратных комплексов на различных стадиях ферментативной реакции, а такие влияния на эту функциональную специфичность микрогетерогенного окружения кофермент-субстратных комплексов.

Для получения экспериментальной информации об изучаемой ферментативной реакции нами был выбран спектрокинетический вариант метода остановленного потока (МОП), позволяющий следить во времени за спектрами поглощения различных кофермент-субстратных комплексов. Для реализации этого подхода необходимо было разработать и создать прибор, работающий по МОП с минимально возможным расходом фермента. Кроме того, т.к. предполагалось, что идентификация промежуточных продуктов будет производится на основе сопоставления экспериментальных спектрокинетических данных с результатами кван-товохимических расчетов спектров возможных промежуточных продуктов, то необходимо было также провести детальное исследование спектральных свойств и электронной структуры различных ионных и таутомерных форм альдиминов Ш1Ф с аминокислотами и их хиноидных аналогов. Знание электронной структуры этих соединений необходимо для решения сформулированной выше второй задачи настоящего исследования. Основные результаты проведенного экспериментально-теоретического исследования механизма действия глутаматдекарбоксилазы составляют предмет диссертации, которая состоит из введения, четырех глав и выводов. В диссертации нет единого литературного обзора, который разбит на несколько частей, приведенных в соответствующих главах. В первой главе рассматривается спектрокинетический подход, дан обзор МОП, описана конструкция созданной установ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Алмазов, Владимир Петрович

ВЫВОДЫ

1. В результате спектрокинетического исследования взаимодействия глутаматдекарбоксилазы с субстратами впервые обнаружены промежуточные продукты, имеющие полосы поглощения при 450, 365, 345, 333 нм. Природа этих продуктов выяснена из сопоставления спектроскопических данных с результатами квантовохимических расчетов. Сопоставление теории и эксперимента позволило также определить ионное и таутомерное состояния промежуточных кофермент-субстратных комплексов. Такими промеясу точными комплексами являются: биполярная и нейтральная форма карбаниона, внешний альдимин ПЛФ с субстратом, в биполярной форме с протонированным и непрото-нированным. альдиминным азотом, тетраэдрический комплекс. Исходя из установленных промежуточных кофермент-субстратных комплексов была предложена модель реакции ферментативного декарбоксилирования, в которой представлены все обнаруженные кофермент-субстратные комплексы с учетом их ионного и таутомерного состояния, адекватно описывающая все известные экспериментальные данные.

2. Анализ электронной структуры промежуточных кофермент-субстратных комплексов позволил установить ее взаимосвязь с функциональной специфичностью этих комплексов:

- 146 а) Показано, что возможность осуществления различных реакций, катализируемых пиридоксалевыми ферментами зависит от взаимного пространственного расположения аминокислоты и пиридинового цикла с альдиминной группой. Максимальная лабилизация разрываемой связи достигается тогда, когда эта связь оказывается расположенной в плоскости, перпендикулярной плоскости шиффова основания. б) Анализ электронной структуры молекулы карбаниона в различных таутомерных состояниях и с различными заместителями у атома показал,- что функциональная специфичность на стадии атаки протоном молекулы карбаниона определяется соотношением зарядов на атомах и С^)» что находится в соответствии с результатами изучения реакций, катализируемых такими пиридоксалевыми ферментами как трансаминаза и декарбоксилаза. в) Анализ возможной микрогетерогенности в активном центре фермента показал, что зарядовое окружение в активном центре может оказывать влияние на функциональные свойства кофермент-субстратных комплексов. Так, при оптимальном для ослабления связи ^(с^О ~ зарядовом окружении величины, характеризующие ослабление связей, оказываются того же порядка, что и при лабилизации этих же связей при достижении оптимальной конформации альдимина ГШФ.

3. Проведено детальное теоретическое исследование электронной структуры и спектров различных ионных и таутомерных форм альдиминов ПЛФ с аминокислотами и их хиноидных аналогов. Показано, что имеет место очень хорошее соответствие между результатами квантовохимических расчетов и экспериментальными данными. Так, теория правильно предсказывает не только направление спектральных сдвигов, сопровождающих введение в молекулу разных заместителей,

- 147 но и величины этих сдвигов. Для наиболее длинноволновой полосы поглощения расхождение между экспериментом и теорией не превышает, как правило, 0.1 эВ, а в большинстве случаев это расхождение меньше 0.05 эВ. Таким образом, для изученных соединений, как и для других аналогов витамина В^, специальный выбор системы квантсь вохимических параметров позволяет использовать результаты кванто-вохимических расчетов в аналитических целях.

4. Разработан и создан прибор, реализующий метод остановленного потока в сочетании с измерением поглощения, кругового дихроизма и флуоресценции, у которого объем измерительной кюветы меньше 10 мкл, что позволило реализовать спектрокинетический вариант метода остановленного потока. На базе этой же установки создана установка, работающая по методу химической остановки реакции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Алмазов, Владимир Петрович, 1985 год

1. 1.anov V.l., Karpeisky M.Ya. Dynamic three-dimensional model for enzymic transamination. Adv.enzymol., 1969,v. 32, p.21-53.

2. Браунштейн A.E., Шемякин M.M. Теория процессов аминокислотного обмена, хватали зируемых пири д оке алевыми энзимами. -Биохимия, 1953, т.18, № 4, с.393-411.

3. Metzler D.E., Ikawa М., Snell Е.Е. A general mechanism for vitamin Bg catalysed reactions. J. Am.Chem.Soc., 1954, v.76, No.3, p.648-652.

4. Braunstein A.E. Amino group transfer. In.: The enzymes. (Boyer P.D. ed.), N.Y., Acad.Press 3rd ed., 1973, v.9,p.379-481.

5. Сытинский И.А. Гамма-аминомасляная кислота в деятельности нервной системы. Л.: Наука, 1972, с. 3-196.

6. Girard В.М., Snell Е.Е. Vitamin Bg function in transamination and decarboxylation reactions. In.: Comprehensive Biochemistry (Plorkin M. and Stots E.H., eds.), Amsterdam: Elsevier, 1964, v. 15, p.138-199.

7. Westheimer P.H. Enzyme models. In: Enzymes (Boyer P.D. ed.) N.T.: Acad.Press, I ed., 1959, v.I, p.259-301.

8. Kalyankar G.D., Snell E.E. Pyridoxal-catalysed decarboxylation of amino acids. Biochemistry, 1962, v.I, No.4,p. 594-600.

9. Сухарева B.C., Браунштейн A.E. Исследование природы взаимодействий глутаматдекарбоксилазы е.coli с субстратом и его аналогами. Мол.биол., 1971, т.5, J£ 2, с 302-317.

10. Huntley Т.Е., Metzler D.E. The reaction of o^-raethylglu-tamate with glutamic acid decarboxylase. Symposium onpyridoxal enzymes. Marusen Company Ltd., Tokyo, 1968, p.81-84.

11. И. Соловьянов A.A., Белецкая И.П. Исследование кинетики быстрых органических реакций в жидкой фазе струевыми и релаксационными методами. Жерн.Всес.хим.об-ва им.Д.И.Менделеева, 1974, т.19, В 3, с.275-284.

12. Roughton F.J.W., Chance В. Rapid reactions. In.: Technique of organic chemistry. (Friess S.L., Lewis E.S., Weissberger A. eds. ) N.I. Interscience, 1963, v.8, part 2, p.703-792.

13. Gibson Q.H. Rapid mixing: stopped flow. In.: Method in enzymology (Kustin K.ed.), N.Y. and London, Acad.Press, 1969, v.I6, p.187-228.

14. French Т.О., Hammes G.G. The temperature-jump method. In.: Method in enzymology (Kustin K. ed.), N.Y. and London, Acad. Press, 1969, v.I6, p.3-30.

15. Алмазов В.П., Твердохлебов E.H. Применение метода остановленной струи в молекулярной биологии. В кн.: Итоги науки и техники. Молек.биология, т.6, Физические методы в молекулярной биологии. 1975, с.153-233.

16. Hammes G.G. Relaxation spectrometry of biological systems. -In.: Adv. in protein chemistry (Anfinsen C.B., Anson M.L., Edsail J.Т., Richards P.M., eds.), N.Y. and London, Acad. Press, 1968, V.23, p.1-57

17. Rapid mixing and sampling techniques in biochemistry. (Chance В., Eisenhardt R.H., Gibson Q.H. , Lonberg-holm K.K., eds.) -Symposium of the international union of biochemistry. N.Y. and London,Acad.Press, 1964, p.3-190.

18. Schechter A.N. Measurement of fast biochemical reactions. -Science, l97o, v.I70, p.273-280.

19. Колдин Е.Ф. Быстрые реакции в растворе. М.: Мир, 1966,с.II 91.

20. Березин И.Б., Варфоломеев С.Д., Мартинек К. Промежуточные соединения в ферментативном катализе и их исследование методами химической кинетики. Усп.Химии, 1974, т.Ж, вып.5,с.835-862.

21. Чане Б. Струевые методы. В кн.: Методы исследования быстрых реакций (Хеммис Г. ред.), М.: Мир, 1977, с. 15-78.

22. Hiromi К. Recent development in the stopped flow method for the study of fast reactions. In.: Methods of biochemical analysis, (Glick D. ed.), N. Y., Wiley-Interscience, 1978, v.26, p.137-164.

23. Holzwarth J.P. Past continuous flow. In.: Techniques and application of fast reaction in solution. (Gettins W.J., Wyn-Jones E. eds.), Dordrecht, Reidel Publishing Co., 1979» p.13-24.

24. Nakamura T. A new flow apparatus for steady and stopped flow measurements. J.Biochem., 1970, v.70, N0.6, p.961-966.

25. Roughton F.J.W. Kinetics of hemoglobin. VI. Competition of carbon monoxide and oxygen for hemoglobin. Eroc.Roy.Soc., (London), 1934, В 115, P- 473-495.

26. Gibson Q.H. Stopped-flow apparatus for the study of rapid reactions. Discussions of the Faraday Society, 1954, v.I7, p.137-139.

27. Gibson Q.H., Milnes L. Apparatus for rapid and sensitive spectrophotometry. Biochem., J., 1964, v.91, No.I, p.161-171.

28. Даффи Д., Штерк X. Энергетическая модель процесса быстрого перемешивания жидкостей. Приб.для научн.иссл., 1969, № 6, с.40-43.

29. Клетеник Ю.Б. Конструкция смесителя для исследования кинетики быстропротекающих реакций в растворах струйным методом. Ж.физ.хим., 1963, т.37, № 5, с.1193-1196.

30. Moskowitz G.W., Bowman R.L. Multicapillary mixer of solution. Science, 1966, v.153, No.3734, p. 428-42932. Berger R.L., Balko В., Borcherdt W., Friauf W. High speedoptical stopped-flow apparatus. Rev. Sci. Instr., 1968, v.39, No.4, p. 486-493.

31. Berger R.L., Balko В., Chapman H.W. High resolution mixerfor the study of the kinetics of rapid reactions in solution.-Rev.Sci.Instr., 1968, v.39, No.4, p.493-497»

32. Berger R.L. Some problems concerning mixers and detectors for stopped-flow kinetic studies. Biophys.J., 1978, v.24, No.I,p.2-20.

33. Harvey R.A. A simple stopped-flow photometer. Anal.Biochem., 1969, v.29, No.I, p.58-67.

34. Hiromi K., Ono S., Itoh S., Nagamura T. A versatile stopped-flow apparatus for the measurement of changes in absorption, fluorescence and optical rotation. J.Biochem., 1968, v.64, No.6, p.879-900.

35. Iio T., Hickey 3?.M., Lee Y.N. , Hamori E. Kinetic studies of the conformation changes of poly (deoxyadenylate thymidy-late). - Biochemistry, 1974, v.13, No.14, p. 2915-2923.

36. Nakatani H., Hiromi K. Analysis of signal amplitude in stopped-flow method for enzyme-ligand systems. J.Biochem., 1980, v.87, No.6, p.I805-I8I0.

37. Hollaway M.R., White H.A. A double-beam repid-scanning stopped-flow spectrophotometer. Biochem.J., 1975, v.149, No.I,p.221-23I.

38. Halaka E.G., Babcock G.T., Dye J.L. Kinetic distinction between cytochromes a and a^ in cytochrome (J oxidase. J.Biol. Ghem. 1981, v.256, No.3, p.I084-I087.

39. June D.S. , Suelter C.H., Dye J.L. Kinetics of pH-dependent interconvertion of tryptophanase spectral forms studied by scanning stopped-flow spectrophotometry. Biochemistry, 1981, v.20, No.10, p. 2707-2713.

40. Uehara Y., Tonomura B., Hiromi K. Kinetic studies on the binding of Shrept;OMyces subtilisin inhibitor with subti-lisin BPN. Arch.Biochem.Bioph., 1980, v.202, No.I, p.25©-258.

41. Chen R.i1. , Schechter A.N., Berger R.L. Stopped-flow fluoro-metry with available instrumentation. Anal Biochem., 1969, v.29, No.I, p.68-75.

42. Matherly L.H., Johnson K.A., Phillips A.T. Transient-state kinetic analysis of urocanase. Biochemistry, 1982, v.21, No.II, p. 2795-2798.

43. Stein P.J., Henkens R.W. Detection of intermediates in protein folding of carbonic anhydrase with fluorescence and polarisation. J.Biol.Chem., 1978, v.253, No.22, p.8016-8018.

44. Levison S.A., Portraann A.J., Kierszenbaum P., Dandliker W.B. Kinetic behavior of antihapten antibody of restricted heterogeneity by stopped-flow fluorescence polarisation kinetics.- Biochem. and Biophys.Res.Communs., 1971, v. 43, No.2, p.258-266.

45. Hiromy K., Ohnishi M., Hama lo. Application of the optical rotation stopped-rflow method to kinetic studies of rapid conformational changes of proteins. pH-jump of Taka-amylase A. -J.Biochem., 1974, v.75, No.2, p.433-435

46. Norton 1.0?., Goodall D.M., Morris E.R., Rees D.A. Kinetic evidence for intramolecular conformational ordering of the extracellular polysaccharide (Xanthan) from Xtir/iOmOflQSa,hnpesfris J.Chem.Soc.Chem.Commun. , 1980, p.54-5-547»

47. Reisner D., Buenemann H. A stopped-flow apparatus with light scattering detection and its application to biochemical reactions. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1973, v.70, N0.3, p.890-893»

48. Plaming D.P., Parkhurst L.J. Kinetics of alkaline tetramer-dimer dissociation in liganded human hemoglobin: A laser light scattering stopped-flow study. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1977, v.74, No.9, p.3814-3816.

49. Parker T.G., Dalgleish D.G. The use of light-scattering andturbidity measurements to study the kinetics of extensively aggregating proteins: oL-Casein. — Biopolymers, 1977» v.16, No.II, p.2533-2547.

50. Grimaldi J. , Baldo J., McMurray C., Sykes B.D. Stopped-flow nuclear magnetic resonance spectroscopy. J.Am.Chem.Soc., 1972, V.94, No.22, p.7641-7645.

51. Grimaldi J.J., Sykes B.D. Concavalin A: A stopped-flow nuclear magnetic resonance study of conformational changes induced by Mn++, Ca++ and -methyl-D-Mannoside. J.Biol. Chem., 1975, V.250, No.5, p•I6I8-I624.

52. Bayley P.M., Anson M. Stopped-flow circular dichroism: a new fast-kinetic-system. Biopolymers , 1974, v.13, No.2, p.401-405.

53. Bayley P.M., Martin S.R., Anson M. Principles of rapid kinetic circular dichroism in stopped-flow and temperature-jump systems. Studia biophysica, 1976, "v. B.57, P»53-58»

54. Nitta K., Segawa T., Kuwagima K., Sugai S. Application of stopped-flow circular dichroism to the folding of proteins.- Biopolymers, 1977, v.16, N0.3» p.703-706.

55. Hui bon boa, G., Douzou P. Stopped-flow method of subzero temperatures. AnalBiochem., 1973» v.51» No.I, p.127-136.

56. Hanahan D., Auld D.S. Low temperature of stopped-flow spectrometry. Anal Biochem., 1980, v.108, No.I, p.86-95«

57. Travers P., Barman I.E. Cryoenzymic studies on the transition-state analog complex creatine kinase. ADPMg.Nitrate. Creatine. Eur.J.Biochem., 1980, v.110, No.2, p.405-412.

58. Thorneley R.N.3?. A convenient electrochemical preparation of reduced methyl viologen and a kinetic study of the reaction with oxygen using an anaerobic stopped-flow apparatus.- Biochem. Bioph.Acta, 1974, v.333, N0.3, p.487-496.

59. Pox J.L., Schenkkan D.M. An integrated deoxygenation apparatus for stopped-flow. Rev.Sci.Instr., 1970, v.41, No.II, p.1637-1638.

60. Dewald R.R., Brooks J.M. A termostated glass stopped-flow system. Rev.Sci.Instr., 1970, v.41, No.II, p.I6I2-I6I3•

61. Harvey R.A., Borcherdt W.O. Variable ratio stopped-flow mixing device. Anal.Chem., 1972, v.44, No.II, p.1926-1928.

62. Day J.L., Feldman L.H. Stopped.flow apparatus employing a rapid, scanning monochromator. Rev.Sci.Instr., 1966, v.37, No.2, p.154-157.

63. DeSa R.J., Gibson Q.H. Dual beam stopped-flow spectrophotometer utilizing modulated xenon arcs. Rev.Sci.Instr.,1966,v.37, N0.7, p.900-906.

64. Barman T.E., Brun A., Travers P. A flow-quench apparatus for cryoenzymic studies. Eur.J.Biochem., 1980, v.IIO, p.397-403.75« Ecman J.E., Hammes G.G. Versatile stopped-flow temperature ¿jump apparatus. Rev.Sci.Instr. , 1966, v.37, N0.6, p.746-750.

65. Wong M.M., Heckman R.A., Schelly Z.A. Chemical relaxation of aqueous rhodamine B. J.Phys.Chem., 1973, v.77, No.10, p.1317-1318.

66. Schelly Z.A., Farina R.D., Eyring E.M. A concentration-¿jump relaxation method study on the kinetics of the dimerization of the tetrasodium salt of aqueous cobalt (II)-4,4*,4*',4*''-tetrasulfophtalocyanine.- J.Phys.Chem., 1970, v.74, No.3, p.617-620.

67. Sanderson D., Bittikofer J.A., Pardue H.L. Computer controlled stopped-flow studies application to simultaneous kinetic analysis. - Anal.Chem., 1972, v.44, No.12, p.1934-1939.

68. Bonnell I.R., Defreese J.D. Dual microcomputer controlled stopped-flow spectrometer. - AnalChem., 1980, v.52, p.139-142.

69. Horton G.L., Lowe J.R., Lieske C.N. Cholinesterase inhibition studies by stopped-flow instrumentation and automated date processing. Anal.Biochem., 1977» v.78, No.I, p.213-228.

70. Nishikimi M., Yamanaka N. Kinetic behavior of volume с hange of mitochondria caused by osmotic pressure gradient. J. Biochem., 1971» v.70, Ко.5, p.869-871.

71. Schell P.L. Anwendung der stopped-flow technik für kurse puls-inkubation von zellsuspensionen und mikroorganismen. -Z. Naturforschung, 1971» B. 26b, heft 2, p.174-175•

72. Levin S.W., Levin R.L., Solomon A.K., Pandiscio A., Kirk-wood D.H. Impruved stopped-flow apparatus to measure permeability of human red cells and ghosts. J.Biochem.Biophys. Methods., 1980, v.3, p.255-272.

73. Deranieau D.A., Rothen С., Streit M., Dubler D., Luscher E.F. Stopped-flow laser turbidimeter for studying changes in the shape of cells stimulated by external agents. Anal. Biochem., 1980, v.102, p.288-290.

74. Siano D.B., Metzler D.E. Band shapes of the electronic spectra of complex molecules. J.Chem.Phys., 1969, v.51, No.5» p.1856-1861.

75. Fletcher R., Reeves C.M. Function minimization by conjugate gradients. Computer J., 1964, v.7, No.2, p.149-154.

76. Бородавкин A.B., Будовский Э.И., Морозов Ю.В., Савин Ф.А., Симукова H.A. Электронная структура, УФ-спектры поглощения и реакционная способность компонентов нуклеиновых кислот.- В кн.: Итоги науки и техники, Молекулярная биология,1977, т.14, с.9-77.

77. Boyd R.J., Whitehead М.А. An SCP-MO-CNDO study of equilibrium geometries, force constants and bonding energies: CNDO/BW. Part I. Parametrization. J.Chem.Soc., 1972, No.I, p.73-77.

78. Губанов В.А., Жуков В.П., Литинокий А.О. Полуэмпирические методы молекулярных орбиталей в квантовой химии. М.: Наука, 1976, с.7-89.

79. Del Bene J., Jaffe H.H. Use of the CNDO method in spectroscopy. I. Benzene, pyridine, and the diazines. J.Chem.Phys., 1968, v. 48, No.4, p.1807-1813.

80. Савин Ф.А., Бажулина Н.П., Морозов Ю.В. Электронная структура различных ионных форм триокеипиридина и некоторых его производных. Молек.биология, 1973, т.7, $ 5, с.674-682.

81. Савин Ф.А., Морозов Ю.В. Электронная структура некоторых соединений группы витамина Bg. Молек.биология, 1975, т.9, № 2, с.296-303.

82. Borodavkin a.v., Dolin Yu.S., Morozov Yu.V., Savin P. A. Electronic structure, photoreactivity and UV-spectroscopicproperties of some 5-substituted biological pyrimidine derivatives. Molec.Photochem., 1979» v.9, No.6, p.403-442.

83. Metzler D.E., Snell E.E. Spectra and ionization constants of the vitamin Bg group and related 3-hydroxypyridine derivatives. J.Am-Chem.Soc., 1955, v.77, N0.5, p.2431-2437.

84. Johnson R.J., Metzler D.E. Analyzing spectra of vitamin Bg derivatives. In.: Method in enzymology (Colowick S.P., Kaplan И.О., eds.), N.Y. - London: Acad.Press, 1970, v.18, part A., p.433-471.

85. Morozov Yu.V., Savin P.A., Budovsky E.I. Electronic structure, spectroscopic, photochemical, and functional properties of compounds of the vitamin Bg group and components of nucleic acids and their analogs. Biology reviews, 1982, v.3,p.167-227.

86. Баяулина Н.П., Ломакин А.Я., Морозов 10.В., Савин Ф.А., Черкашина Л.П., Карпейский М.Я., Флорентьев В.Л. Абсорбционные свойства пиридоксаля, пиридоксалъ-5'-фосфата и дезоксипиридоксаля. Молек.биология, 1970, т.4, с.899-905.

87. Морозов Ю.В., Бажулина Н.П., Черкашина Л.П., Карпейский М.Я.

88. Оптические и люминисцентные свойства витамина В„ и егоопроизводных. 1У. Пиридоксаль и пиридоксаль-5'-фосфат. Спектры поглощения. Биофизика, 1967, т.12, № 3, с.397-406.

89. Bazhulina N.P., Kirpichnikov М.Р., Morozov Yu.V., Savin P.A Electronic structure, luminescence and photochemistry ofpyridoxal and pyridoxal-5'-phosphate oximes. Mol.

90. Phojbochem., 1974, v.6, No.1, p.43-67.

91. Морозов Ю.В. 0 взаимосвязи между электронной структурой, абсорбщонно-шоминисцентными свойствами и фотореакционной способностью у некоторых органических соединений.- Ж.Прикл.Спектр, 1980, т.32, В 6, с.1030-1035.

92. Куклин А.И. Оптические и люминисцентные свойства витамина

93. Морозов Ю.В., Бажулина H.П., Черкашина Л.П., Карпейский М.Я. Оптические и люшниоцентные свойства витамина Bg и его производных. У. Пиридоксаль и пиридоксаль-5'-фосфат. -Люшниоцентные свойства. Биофизика, 1967, т. 12, tè 5,с.773-781.

94. Bazhulina N.P., Kirpichnikov M.P., Morozov Yu.V., Savin F.A., Sinjavina L.B., Florentiev V.L., Photochemistry of aldehyde forms of pyridoxal, pyridoxal-5'~phosphate and their derivatives. -Molec.Photochem., 1974, v.6, No.4, p.567-396.

95. Кирпичников M.П., Морозов Ю.В., Савин Ф.А. Фотохимия три-оксипиридина и некоторых его производных. Р.Е.Х., 1974, т.15, Ji> 241, с. 15Б - 1527.

96. Heinert D., Martell А.Е. Pyridoxine and pyridoxal analogs. V. Synthesis and infrared spectra of schiff bases. J.Am. Chem.Soc., 1962, v.84, No.17, p.3257-3263.

97. Metzler O.E., Cahill A., Metzler D.E. Equilibria and absorption spectra of shiff bases. J.Am-Chem.Soc., 1980, v.102, No.19, p.6075-6082.

98. Пюльман Б., Пюльман А. Квантовая биохимия. M.: Наука, 1965, с.495-516.

99. Karube Yo., Ono Yu., Matsushima Yo., Ueda Yo. The models for the active site of pyridoxal enzymes. Calculations of Sl-jf transitions energies of electronic absorption. -Chem.Pharm.Bull., 1978, v.26, No.9, p.2642-2648.

100. Karube Yo., Matsushima Yo. Molecular species of shiff bases derived from O-hydroxyaromatic aldehydes. I. Spectral assignments. Chem.Pharm.Bull., 1977, v.25» No.10, p.2568-2575.

101. Matsushima Yo., Karube Yo., Kono A. Molecular species of schiff bases derived from O-hydroxyaromatic aldehydes. III. Schiff bases of pyridoxal and its analogs with unsaturated amino acids. Chem.Pharm.Bull., 1979» v.27, N0.5» p.703-709.

102. Anderson F.J., Martell A.E. Peridoxal-phosphate: molecular species in solution. J.Am.Chem.Soc., 1964, v.86, p.715-720.

103. Schirch L., Jenkins W.T. Serine transhydroxymethylase. Properties of the enzyme-substrate complexes of d-alanine and glycine. J.Biol.Chem., 1964, v.239, No.II, p.3801-3807.

104. Jenkins W.T., D'Ari L. Glutamic-aspartic transaminase IX. Equilibria with glutamate and oi-ketoglutarate. J.Biol. Chem., 1966, v.241, No.12, p.2845-2854.

105. Kwiatkowski J.S. Electronic spectra of the 2-oxypurine isomers. Theor.Chim-Acta., 1968, v.II, No.I, p.167-168.

106. Berndt M., Kwiatkowski J.S. Electronic structure and spectra of organic molecules. X. SCP MO CI calculations for the hydroxy derivatives anions of some aromatic molecules. Theor.Chim.Acta, 1970, v.I7, No.I, p.35-48.

107. Воекег Е.А., Snell Е.Е. In.: Amino acid decarboxylases. - The enzymes. :Boyer P.D. ed.), N.Y.: Acad.Press, 3 Ed., 1972, v.6, p.217-253.

108. Gale E.F. The bacterial amino acid decarboxylases. Adv. in Enzym., 1946, v.6, p.I-3I.

109. Мордашев С.P. Энзиматическое декарбоксидирование аминокислот. Усп.совр.биол., 1949, т.28, 3, с.365-386.

110. Острецова И.Б., Сытинский И.А. Декарбоксилаза глутаминовой кислоты. Укр.биох.журн., 1962, т.З, $ 3, с.456-474.

111. Clark W.G., Inhibition of amino acid decarboxylases. In.: Methabolic inhibitors. (Hochster R.M. and Quastel J.H., eds.) N.Y.: Acad.Press, 1963, v.I, p.315-381.

112. Shukuya R., Schwert G. Glutamic acid decarboxylase. I.Isolation procedures and properties of the enzyme. J.Biol. Chem., I960, v.235, N0.6, p.I649-I652.

113. Shukuya R., Schwert G. Glutamic acid decarboxylase. II. The spectrum of the enzyme. J.Biol.Chem., I960, v.235, N0.6, p.1653-1657•

114. Сухарева Б.С., Маликова Л.Г. Субстратная специфичность глутаматдекарбоксилазы E.coli. Молек.биол., 1977, т.II, № 2, с.394-401.

115. Snell Е.Е., De Mari S.J. Schiff base intermediates in enzyme catalysis. In.: The enzymes. (Boyer P.D. ed.); N.Y.: Acad.Press, 3d ed., 1970, Wo.2, p.335-370.

116. Homola A.D., Dekker E.E. Decarboxylation of ^"-hydroxy-glutamate by glutamic decarboxylase of Escherichia coli (АТСС 11246). Biochemistry, 1967, v.6, No.8, p.2626-2634.

117. Strausbauch P.H., Fisher E.H. Chemical and physical properties of Escherichia coli glutamate decarboxylase. -Biochemistry, 1970, v.9, No.2, p.226-233.

118. Strausbauch P.H., Fisher E.H., Cunningham C., Hagar L.P. Crystallization and properties of glutamate decarboxylase from Escherichia coli strain B. Biochem.Biophys. Res.Communs., 1967, v.28, No.4, p.525-530.

119. Кретовнч В.Л., Галяс Э. Биосинтез аминокислот из щавелево-уксусной и пировиноградной кислот в живых тканях прорастающего и созревающего зерна. Биохимия, 1961, т.26,1. I, с.99-104.

120. Richardson М. Studies on the biogenesis of some simple amines and quaternary ammonium compounds in higher plants. Phytochemistry, 1966, v.5, No.1, p.23-30.

121. Krnjevic K. Glutamate and y-aminobutyric acid in brain. Nature, 1970, v.228, So.5267, p.119-124.

122. Tikhonenko A.S., Sukhareva B.S,, Braunstein A.E. Electron-microscopic investigation of Escherichia coli glutamate decarboxylase. Biochem.Biophys.Acta, 1968,v.167, No.3, p.476-479.

123. To C.M. Quaternary structure of glutamate decarboxylase of Escherichia coli as revealed by electron microscopy.- J.Mol.Biol., 1971, v.59, No.I, p.215-217.

124. Shukuya R., Schwert G. Glutamic acid decarboxylase. III. Inactivation of the enzyme at low temperature.- J.Biol.Chem., 1960, v.235, No.6, p.1658-1661.

125. O'Leary, Malic J.M. Kinetics of the binding of pyrido-xal-5'-phosphate to glutamate decarboxylase. J.Biol. Chem., 1971, v.246, No.2, p.544-545.

126. Anderson J., Chang W.H.P. Borohydride reduction of L-glutamate decarboxylase. Arch.Biochem.Biophys., 1965, v.110, No.2, p.346-349.

127. Механик М.Л., Торчинский 10.M. Нонапептид из активногоцентра глутаматдекарбоксилазы E.coli Биохимия, 1970, т.35, В 3, с.504-509.

128. Механик М.Л., Флорентьев B.I., Торчинский Ю.М. Взаимодействие аподекарбоксилазы глутаминовой кислоты с аналогами пиридоксаль фосфата. Молек.биол., 1972, т.6,4, с.586-596.

129. Mechanik M.L., Torchinsky Yu.M., Florentiev V.L., Karpeisky M.Ya. Interaction of the apoenzyme of L-gluta-mate decarboxylase with pyridoxal phosphate analogs. -PEBS Letters, 1971, v.13, N0.3, p.177-180.

130. Klein S.M., Sager R.D. Glycine metabolism IV. Effect ofborohydride reduction on the pyridoxal phosphate-containing glycine decarboxylase from Peptococcus glycinophilus. -J.Biol.Chem., 1967, v.242, No.2, p.301-305»

131. Fiori A., Turano C., Borri Voltattorni C., Minelli A., Codini M. Interaction of L-dopa decarboxylase with substrates: a spectrophotometric study. PEBS Letters, 1975, v.54, No.2, p.122-125»

132. O'Leary M.H., Brummond W.Jr. pH jump studies of glutamate decarboxylase. Evidence for a pH-dependent conformational change. J.Biol.Chem., 1974, v.249, No.12, p.3737-3742.

133. Fasella P. I^yridoxal phosphate. Annual review of biochemistry, 1967, v.36, part I, p.185-210.

134. Tate S.S., Meister A. L-Aspartate- ^-decarboxylase, structure, catalytic activities and allosteric regulation. -Adv.Efizym., 1974, v.35, p.503-543.

135. June D.S., Suelter C.H., Dye J.L. Equilibrium and kinetic study of interaction of amino acid inhibitors with try.pto-phanase: Mechanism of quinonoid formation. Biochemistry, 1981, v.20, No.10, p.2714-2719.

136. Механик М.Л., Торчинсшш Ю.М. Обнаружение карбаниона при декарбоксилировашщ квазисубстратов глутаматдекарбокси-лазой. Биохимия, 1972, т.37, №6, с. I309-I3II.

137. Christen Р., Riordan J.P. Reaction of an aldolase-substrate intermediate with tetranitromethane. Biochemistry, 1968, v.7, No.4, p.1531-1538.

138. Huntley Т.Е., Metzler D.E. Circular dichroism of L-glu-tamic acid decarboxylase. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1967, v.26, No.2, p.109-115.

139. Dunathan H.C. Stereochemical aspects of pyridoxal phosphate catalysis. Advans.Enzymol., 1971» v.35, p.79-134.

140. Торчинский Ю.М., Малахова Э.А., Ливанова Н.Б., Пихелгас В.Я. Индуцированная оптическая активность некоторых пиридоксалевых ферментов. В кн.: Химия и биология пи-ридоксалевого катализа: М.: Наука, 1968, с.166-177.

141. Wilson Е.М., Meister A. Optical rotatory dispersion of L-aspartate ^-decarboxylase and its derivatives. Biochemistry, 1966, v.5, No.4, p.1166-1174.

142. Johnson G.P., Graves D.J. Circular dichroism and optical rotatory dispersion of glycogen phosphorylase. Biochemistry, 1966, v.5, No.9» p.2906-2911.

143. O'Leary M.H., Payne J.R. ^C NMR spectroscopy of labeled pyridoxal-5'-phosphate. Model studies, D-serine dehydratase and L-glutamate decarboxylase. J.Biol.Chem., 1976; V.25I, N0.8, p.2248-2254.

144. Jenks W.P. Catalysis in chemistry and enzymology. N.Y.: McGraw-Hill, 1969, p.133-146.

145. O'Leary M.H. Enzymatic catalysis of decarboxylation. In.: Bioorgan.Chem., N.I.:Acad.Press, 1977» No.I, p.259-275«

146. Mandeles S., Koppelman R., Hanke M.E. Deuterium studieson the mechanism of enzymatic amino acid decarboxylation. -J.Biol.Chem., 1954, v.209, No.I, p.327-336.

147. Rothberg S., Steinberg D. Studies on the mechanism of enzymatic decarboxylation. J.Am.Chem.Soc., 1957, v.79» No.12, p.3274-3278.

148. Santaniello E., Keinle M.G., Mansocchi A., Bosisio E. Stereochemical course of the decarboxylation of (S)-glutamic acid by glutamate decarboxylase from Escherichia coli. J.Chem. Soc.Lond Chem.Trans., 1979, v.I, p.I677-I699.

149. Leistner E., Spencer I.D. Stereochemistry of the enzymic decarboxylation of L-lysine. J.Chem.Soc.Chem.Communs., 1973, No.10, p.378-379.

150. Yamada H., O'Leary M.H. Stereochemistry of reactions catalysed by glutamate decarboxylase, т Biochemistry, 1978, v.17, No.4, p.669-672.

151. Belleau B., Burba J. The stereochemistry of the enzymic decarboxylation of amino acids. J.Am.Chem.Soc., I960, v.82, No.21, p.5731-5732.

152. Sukhareva В.S., Dunathan H.C., Braunstein A.E. The stereochemistry of the abortive transamination shown by glutamate decarboxylase. PEBS Letters, 1971, v.15, No. p.241-244.

153. Ayling J.E., Dunathan H.C., Snell E.E. Stereochemistry of transamination catalysed by pyridoxamine-pyruvate transaminase. Biochemistry, 1968, v.7, No. 12, p.4537-454-2.

154. Dunathan U.C., Davis L., Cury P.G., Kaplan M. The stereochemistry of enzymatic transamination. Biochemistry, 1968, v.7, No.12, p.4532-4537.

155. Dunathan H.C., Voet J.G. Stereochemical evidence for the evolution of pyridoxalphosphate enzymes of various function from a common ancertor. Proc.Nat.Acad.Sci., U.S.A., 1974, v.71, No.10, p.3888-389 .

156. Dunathan H.C. Mechanism and stereochemistry of transamination. In.: Vitamins and Hormons (Harris U.S., Munson P.L. Diczfalusy E. eds.), N.Y., London, Acad.Press, 1970, v.28, p.399-4X4.

157. Dunathan H.C. Conformation and reaction specificity in py-ridoxal phosphate enzymes. Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A., 1966, V.55, No.4, p.712-716.

158. Bailey G.B., Chotamangsa 0., Vittivej K. Control of pyri-doxal phosphate enzyme reaction specificity studies with 0^-dialkylamino acid transaminase. Biochemistry, 1970, v.9, No.16, p.3243-3248.

159. Gerig J.T., Kwock L. Inhibition of bacterial glutamate decarboxylase by tricarboxylic acid cycle intermediates. -FEBS Letters, 1979, v.105, No.I, p.155-157•

160. Fonda M.L. Glutamate decarboxylase. Inhibition by monocar-boxylic acids. Arch.Biochem.Biophys., 1972, v.153, No.2, p.763-768.

161. Fonda M.L. Glutamate decarboxylase. Substrate specificity and inhibition by carboxylic acids. Biochemistry, 1972, v.II, N0.7, p.1304-1309.

162. Sashchenko L.P., SeverinE.S., Metzler D.E., Ehomutov R.M. Inhibition of L-glutamic acid decarboxylase by cycloglutamates. Biochemistry, 1971» v.10, No.26, p.4888-4894.

163. Kuo D., Rando R.R. Irreversible inhibition of glutamate decarboxylase by o(-(fluoromethyl) glutamic acid. Biochemistry, 1981, v.20, No.3, p.506-5И.

164. Сухарева B.C., Маликова JI.Г. Субстратная специфичностьглутаматдекарб оксилазы Е•с oli . Молек.би ол., 1977, т.II, JS 2, с.394-401.

165. Yamada H., O'Leary M.H. A solvent isotope effect probe for enzyme-mediated proton transfers. J.Am.Chem.Soc., 1977i v. 99, No.5, p.1660-1661.

166. Jenkins W.T., D'Ari L. Glutamic-aspartic ytransaminase XI. Reactivity toward thiosemicarbazide. Biochemistry, 1966, v.5, No.9, p.2900-2905.

167. Fasella P., Giartosia A., Hammes G.G. The interaction of aspartate aminotransferase with ol-methyl aspartic acid. Biochemistry, 1966, v.5, No.I, p.197-202.

168. Карпейский М.Я., Яковлев Г.И., Антонов В.К. Понижает ли фермент энергию активации элементарного акта химической реакции? Биоорган.хим., 1980, т.6, JS 5, с.645-654.

169. В заключение считаю приятным долгом выразить глубокую благодарность моему научному руководителю Ю.В.Морозову, а так же Ф.А.Савину и Б.С.Сухаревой за постоянное внимание к работе и полезные советы при ее обсуждении.

170. Я искренне признателен всем сотрудникам группы молекулярной спектроскопии ИМБ АН СССР, где была выполнена настоящая работа, за дружескую поддержку, готовность оказать помощь, добрые советы, пожелания и внимание.