Тирозин - фенол-лиаза: Структура и функция тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор химических наук Демидкина, Татьяна Викторовна

• Демидкина, Татьяна Викторовна
• доктор химических наук
• 1998

Оглавление диссертации доктор химических наук Демидкина, Татьяна Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение

Глава 1. Обзор литературы "Структурные и функциональные

исследования пиридоксаль — Р — зависимых ферментов".

1.1. Катализ с участием пиридоксаль — Р

1.2. Классификация пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.3. Пространственные структуры пиридоксаль — Р — зависимых 15 ферментов

1.4. Контроль реакционной специфичности 31 пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.5. Обеспечение субстратной специфичности 35 пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.6. Роль отдельных аминокислотных остатков 43 пиридоксаль — Р — зависимых ферментов

1.7. Роль моновалентных катионов в ферментативном катализе

Глава 2. Результаты и обсуждение

2.1. Очистка тирозин — фенол—лиазы и исследование 69 физико — химических параметров фермента

2.1.1. Получение гомогенных препаратов фермента 71 из Citrobacter intermedius и из Erwinia herbicola

2.1.2. Исследование четвертичной структуры фермента

2.1.3. Клонирование и секвенирование гена 73 тирозин — фенол — лиазы из Citrobacter freundii

2.2. Исследование каталитических свойств тирозин — фенол —лиазы

2.2.1. Исследование факторов, определяющих субстратную 78 специфичносить тирозин — фенол—лиазы

2.2.2. Влияние моновалентных катионов 88 на тирозин — фенол—лиазу

2.2.3. Трансаминирование — побочная реакция, катализируемая

тирозин — фенол—лиазой

2.3. Кристаллизация и структурные исследования тирозин — фенол —лиазы

2.3.1. Получение кристаллов апофермента и холофермента

2.3.2. Четвертичная структура тирозин — фенол —лиазы

2.3.3. Вторичная, третичная структура 116 и доменное строение субьединиц

2.3.4. Пространственная структура холофермента и локализация 119 центра связывания моновалентного катиона в пространственной структуре холофермента

2.3.5. Кристаллизация и структурные исследования 127 фермент — ингибиторных комплексов

тирозин — фенол—лиазы

2.4. Исследование мутантных форм тирозин — фенол —лиазы

2.5. Химический механизм реакции Р — элиминирования, 153 катализируемой тирозин — фенол —лиазой

Глава 3. Методы исследования

Основные результаты и выводы

Список цитированной литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тирозин - фенол-лиаза: Структура и функция»

ВВЕДЕНИЕ.

Ферменты, содержащие в качестве кофермента пиридоксаль — 5' — фосфат, катализируют разнообразные реакции метаболизма аминокислот — трансаминирование, Р — элиминирование, 0 — замещение, а,Р — декарбоксилирование, альдольное расщепление, рацемизацию. Пиридоксаль — 5' — фосфат (пиридоксаль — Р) является уникальным коферментом, поскольку ни один из известных ныне коферментов не участвует в катализе столь разнообразных реакций, Субстратную и реакционную специфичность каждого конкретного пиридоксаль — Р— зависимого фермента обеспечивает его белковая часть,

Несмотря на физиологическую важность реакций, катализируемых этими ферментами, и медицинскую и коммерческую ценность продуктов этих реакций, структурные основы механизма действия этих ферментов исследованы до сих пор недостаточно. До 1993 г. пространственные структуры были определены только для ферментов, принадлежащих к классу трансфераз. В 1993 г. были определены пространственные структуры двух пиридоксаль — Р — зависимых ферментов — тирозин — фенол — лиазы и диалкилглициндекарбоксилазы, Позднее были определены трехмерные структуры еще нескольких ферментов.

Определение пространственных структур для разных классов пиридоксаль — Р — зависимых ферментов и для ферментов одного класса, но использующих различные аминокислоты в качестве субстратов, позволит получить новые важные данные для понимания одной из основных проблем биологии — проблемы взаимосвязи структура — функция ферментов, выяснить пути эволюции пиридоксаль — Р — зависимых ферментов и создать

фундамент для конструирования ферментов, обладающих оптимальными свойствами для их применения в биотехнологии и медицине.

Данная работа посвящена исследованию структуры и механизма действия одного из малоизученных пиридоксаль — Р — зависимых ферментов — тирозин — фенол — лиазы (КФ 4.1.99.2), участвующей в метаболизме L — тирозина.

Главной целью настоящей работы явилось исследование механизма действия тирозин — фенол —лиазы с использованием кинетических, спектральных методов, рентгеноструктурного анализа и сайт — направленного мутагенеза, В ходе исследования были сформулированы следующие основные задачи: исследование физико-химических и каталитических характеристик фермента; определение пространственной структуры фермента и фермент — ингибиторных комплексов; выяснение роли белковой части в обеспечении субстратной и реакционной специфичности тирозин — фенол —лиазы.

В работе получен ряд приоритетных результатов: определена аминокислотная последовательность тирозин — фенол — лиазы из С. freundii и установлено местоположение остатка лизина , связывающего кофермент; получены кристаллы и определены трехмерные структуры ano— и холоферментов тирозин — фенол —лиазы из двух бактериальных источников и двух фермент—ингибиторных комплексов, моделириующих элементарные стадии реакции {5 —элиминирования; исследованы факторы, определяющие субстратную и реакционную специфичность фермента; показано, что тирозин — фенол —лиаза вступает в реакцию побочного трансаминирования; исследовано влияние моновалентных катионов на фермент и определены структурные основы этого влияния; получены и

исследованы мутантные формы фермента, содержащие замену аминокислотных остатков активного центра фермента. На основе полученных данных предложен механизм действия фермента.

Практическая ценность работы в первую очереь состоит в том, что определение пространственной структуры тирозин — фенол —лиазы из С freundii, выполненное методом тяжелоатомных производных, позволило использовать эту структуру как базовую для решения пространственных структур других ферментов методом молекулярного замещения. Использование метода молекулярного замещения вместо метода тяжелоатомных производных для решения пространственных структур белков существенно ускоряет решение трехмерной структуры нового белка. Пространственные структуры тирозин — фенол —лиазы из Erwinia herbicola и триптофан — индол —лиазы из Proteus vulgaris были решены этим методом.

Установление пространственной структуры тирозин — фенол —лиазы внесло важный вклад в понимание путей эволюции пиридоксаль — Р — зависимых ферментов; полученные нами данные были использованы при создании современной классификации этих ферментов.

Клонирование и экспрессия гена тирозин — фенол —лиазы в клетки Escherichia coli позволили получать значительное количество белка, что необходимо для развития работ по исследованию антимеланомной активности фермента и для использования тирозин — фенол —лиазы в биотехнологии для синтеза аналогов L —тирозина, применяемых в фармакологии и в медицине.

Работа выполнена в ИМБ РАН в сотрудничестве с ИК РАН, ИНЭОС РАН. В работе также принимали участие коллеги из универститетов штатов

Джорждия и Нью-Йорк (США), университета г. Йорк (Великобритания) и Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гамбурге. Вклад отечественных и зарубежных коллег отражен в публикацих по теме диссертации.

Работа выполнены при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований, Научного совета по белковой инженерии, медицинского института им. Г. Хьюза (США), международного фонда Фогарти (США), национального научного фонда Швейцарии.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Демидкина, Татьяна Викторовна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

I. Исследованы физико-химические характеристики тирозин — фенол- лиазы:

1) Определены: молекулярная масса, количество субьединиц, N— и С —концевые аминокислоты, изоэлектрическая точка белка. Показано, что в тетрамерной молекуле субьединицы химически идентичны и каталитически компетентны.

2) Ген тирозин — фенол—лиазы из С. freundii клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli; аминокислотная последовательность белка определена по структуре кДНК и подтверждена определением аминокислотных последовательностей пептидов бромцианового гидролизата белка. Установлено, что остаток лизина активного центра, связывающий кофермент, занимает положение 257 в аминокислотной последовательности фермента.

II. Исследованы каталитические характеристики фермента:

1) Иссследовано влияние моновалентных катионов на каталитические и спектральные характеристики фермента.

Установлено, что моновалентные катионы являются неконкурентными активаторами тирозин — фенол —лиазы. Показано, что моновалентные катионы влияют на соотношение скоростей основной и побочной реакций, катализируемых ферментом и таутомерное равновесие кетоенамин — енолимин "внутреннего" альдимина холофермента.

2) Показано, что тирозин — фенол—лиаза вступает в реакцию побочного трансаминирования и определены кинетические параметры этой реакции для ряда субстратов и ингибиторов.

3) Исследовано взаимодействие фермента с рядом субстратов и ингибиторов. Установлен вклад отдельных фрагментов L —тирозина в эффективность его связывания.

III. Установлены принципы пространственной организации молекулы фермента:

1) Найдены условия получения кристаллов апофермента и холофермента тирозин — фенол —лиазы из С freundii и Erwiriia herbicola, пригодных для рентгеноструктурного анализа.

2) Пространственные структуры ano— и холофермента тирозин — фенол—лиазы из С. freundii определены и уточнены при разрешении 2.ЗА и 2.5А при участии диссертанта.

3) Пространственные структуры ano— и холофермента тирозин — фенол —лиазы из Е. herbicola определены и уточнены при разрешении 2,ЗА и 2.5А при участии диссертанта.

Установлено, что тетрамер фермента организован из двух каталитических димеров, в каждом из которых активные центры образованы остатками обеих субьединиц. Идентифицированы аминокислотные остатки фермента, принимающие участие в связывании кофермента, субстрата, моновалентного катиона — активатора, в субьединичных взаимодействиях.

IV. Установлены структурные закономерности механизма действия фермента:

1) Найдены условия получения кристаллов фермент — ингибиторных комплексов тирозин — фенол—лиазы с 3—(4' — гидроксифенил)пропионовой кислотой и N — (пиридоксил — 5' — фосфат) — L —тирозином, моделирующих элементарные стадии реакции р — элиминирования.

2) Пространственные структуры фермент — ингибиторных комплексов тирозин — фенол—лиазы с 3—(4' — гидроксифенил)пропионовой кислотой и N— (пиридоксил— 5' — фосфат) — L —тирозином определены и уточнены при разрешении 2.7А и 2.0 А соответственно при участии диссертанта.

3) Анализ пространственных структур позволил идентифицировать аминокислотные остатки фермента — возможные кандидаты на роль каталитических остатков.

4) Получены и исследованы мутантные формы фермента, содержащие замены остатков Туг71 и Arg381. Установлено, что эти остатки принимают участие в обеспечении стадии элиминирования фенола в реакции

Р — элиминирования Ь —тирозина, катализируемой тирозин — фенол —лиазой.

V. На основании полученных результатов предложен механизм реакции Р-элиминирования, катализируемой тирозин - фенол—лиазой.

Приношу глубокую благодарность

Э.Г. Арутюняну и А. А. Антсону за длительное научное сотрудничество и их усилия в организации и обеспечении ренгеноструктурных исследований; Н.Г. Фалееву, И.В. Мягких, В.К. Казакову, И.И. Томиной, А.Г. Габибову, E.H. Хурс, М.В. Барболиной, Н.И. Синицыной, Н.К. Фогельман, Г.С. Филиной Н.П. Бажулиной, A.M. Крицыну за участие в работе и дружескую поддержку при ее написании;

Р. Филлипсу и П. Голлнику, чье участие в работе, возможность выполнения отдельных экспериментов в их лабораториях и финансовая поддержка работы в рамках совместных грантов во многом способствовали выполнению работы; всем сотрудникам ИМБ РАН за благожелательное отношение к работе и помощь при ее выполнении и написании.

Заключение.

Пиридоксаль — Р — зависимые ферменты имеют большое значение для жизнедеятельности клеток как прокариот так и эукариот, поскольку катализируют реакции на основных метаболических путях клеток. Данные, приведенные в обзоре, свидетельствуют о том, что, несмотря на важность пиридоксаль — Р — зависимых ферментов, структурные основы механизма действия этих ферментов были и остаются малоизученными. В банках данных пространственных структур представлено лишь несколько структур. Решение, начиная с 1993 года, в дополнение к трехмерной структуре аспартатаминотрансферазы, трехмерных структур сразу нескольких представителей этого большого семейства, несомненно, приведет к стимулированию исследований структурно — функциональных закономерностей пиридоксаль — Р — зависимого катализа.

Одним из наименее изученных вопросов механизма действия пиридоксаль — Р — зависимых ферментов является вопрос о роли моновалентных катионов в катализе.

Исследования структуры и механизма действия тирозин — фенол — лиазы, представленные в диссертационной работе, привели к приоритетным результатам, которые позволяют не только глубже понять механизм действия этого фермента, но также и закономерности функционирования и эволюции пиридоксаль — Р — зависимых ферментов в целом.

ГЛАВА 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Очистка тирозин - фенол-лиазы. и исследование физико-химических параметров фермента.

Бактериальная тирозин — фенол —лиаза катализирует обратимую реакцию Р — элиминирования и реакцию (3 — замещения Ъ —тирозина с образованием фенола, пирувата и аммиака. Фермент найден во многих микроорганизмах, принадлежащих к энтеробактериям (159) а также у некоторых насекомых (160).

Химический механизм реакции Р — элиминирования, предложенный Мецлером и Дэвисом (38), представлен на рис. 9, Он включает следующие основные стадии: 1) образование основания Шиффа или внешнего альдимина (III) между альдегидной группой кофермента и а — аминогруппой аминокислоты — субстрата, 2) отрыв С —а —протона с образованием хиноидного промежуточного производного (IV), 3) таутомеризацию фенольного фрагмента в циклогексадиеноновый (V) с последующим элиминированием фенола.

Тирозин — фенол —лиаза обладает широкой субстратной специфичностью и эффективно катализирует реакцию Р — элиминирования Ь — серина, Ь — цистеина и ряда аминокислот, содержащих хорошую уходящую группу при Р — углеродном атоме, таких, как Б — (о — нитрофенил) — Ь —цистеин), О —бензоил—Ь —цистеин, р —хлораланин (161).

VIII

I + н

VII

Рис. 9. Механизм реакции р — элиминирования, катализируемой тирозин — фенол—лиазой.

Тирозин — фенол —лиаза представляет значительный интерес для биотехнологии и медицины. Фермент может использоваться для синтеза L — тирозина и L —3,4 —диоксифенилаланина (L —ДОФА, 161). Введение мышам тирозин — фенол — лиазы понижает уровень L —тирозина в плазме и приводит к ингибированию роста меланомной опухоли (162).

В данной работе исследовались каталитические и структурные свойства в основном фермента из С. freundii. Кристаллизация и определение трехмерной структуры были выполнены и для фермента из Е. herbicola. Гомология аминокислотных последовательностей двух ферментов составляет 95 % (163), однако в литературе имелись данные, что их кинетические параметры в реакции ß — элиминирования отличаются (164). Учитывая высокую степень гомологии первичных структур фермента из двух источников, можно было ожидать, что их пространственные структуры должны быть идентичны, что и показали выполненные нами исследования. Тонкие различия механизма действия этих ферментов требуют сравнительного исследования структур интермедиатов для этих ферментов. Основной причиной использования в работе фермента из двух источников было то, что наличие двух подобных объектов часто помогает решить проблемы, связанные с кристаллизацией фермента и его комплексов.

2.1.1. Получение гомогенных препаратов фермента из Citrobacter Intermedius и из Erwinia herbicola.

Впервые гомогенные препараты тирозин — фенол —лиазы были получены японскими исследователями в 1970 г. из клеток С. intermedius (165) ив 1972 г. из клеток Е. herbicola (166),

Работы по установлению структуры и исследование механизма действия фермента нами были начаты в 1980 г. в лаборатории химических основ биокатализа ИМБ РАН под руководством академика А.Е. Браунштейна. Одной из основных задач, поставленных в начале нашего исследования, было определение пространственной структуры фермента. Поиск условий кристаллизации белка и определение его пространственной структуры методом тяжелоатомных производных требуют значительных количеств высокоочищенных препаратов.

Нами был разработан метод выращивания клеток С. in.termed.ius с использованием так называемой "бедной" среды, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота Ь —тирозин (167). Этот метод позволил увеличить содержание фермента в клеточном экстракте более чем на порядок по сравнению с данными японских авторов. Это, в свою очередь, позволило разработать более простой метод очистки фермента (168)) и значительно повысить его выход (50.6 %) по сравнению со способом очистки тирозин — фенол—лиазы, описанным в литературе. Разработанный нами метод очистки позволил получать высокоочищенные препараты тирозин — фенол —лиазы из С. intermedius с удельной активностью в полтора раза выше, чем описанная в литературе.

Нами был также разработан метод очистки тирозин — фенол —лиазы из клеток Е. ЬегЫсо1а, позволивший получить гомогенные препараты фермента с высоким выходом и удельной активностью, превышающей описанную в литературе более чем в три раза (169).

Получение высокоочищенных препаратов тирозин — фенол —лиазы из двух источников послужило фундаментом всей последующей работы.

2.1.2. Исследование четвертичной структуры фермента.

Литературные данные о четвертичной структуре фермента свидетельствовали, что тетрамер фермента имеет молекулярную массу около 200000 Да, состоит из четырх субьединиц с одинаковой молекулярной массой, две из которых связывают кофермент (170). Связывание пиридоксаль — Р только двумя субьединицами тетрамера могло означать, что две другие субьединицы не участвуют непосредственно в катализе и, в принципе, могут иметь отличную от каталитических субьединиц первичную структуру. Среди пиридоксаль — Р — зависимых ферментов четвертичная структура типа а2{32 была известна для триптофансинтазы. Все остальные пиридоксаль — Р — зависимые ферменты состоят из каталитически и химически идентичных субьединиц.

Нами было выполнено самостоятельное исследование субьединичной структуры тирозин — фенол —лиазы из С. intermedins.

Гель — фильтрация белка в нативных и денатурирующих условиях подтвердила, что фермент является тетрамером с молекулярной массой 180 ± 20 кДа, молекулярная масса мономера составила 45 ± кДа. Данные определения аминокислотного состава белка показали, что полипептидная цепь, состоящая из 409 аминокислот, содержит 23 остатка лизина и 22 остатка аргинина (171).

Пептидные карты триптического гидролизата белка содержали 38 пептидов, в нерастворимой части гидролизата остававлось 3 — 4 пептида, что свидетельствовало об идентичности аминокислотного состава субьединиц

171).

Анализ N — концевой аминокислоты дансильным методом показал, что N —концевая группа белка закрыта. В качестве С —концевой аминокислоты с помощью карбоксипептидаз А была определена одна аминокислота — Не

172). Изоэлектрическая точка белка находилась при рН 4.95 (168).

Спектрофотометрическое титрование апофермента пиридоксаль — Р показало, что тетрамер связывает четыре молекулы кофермента, все четыре центра связывания кофермента идентичны и константа диссоциации пиридоксаль — Р составила 5.8х10-5 M (171).

Совокупность полученных результатов позволила заключить, что тетрамер тирозин — фенол—лиазы состоит из четырех химически и каталитически идентичных субьединиц.

2.1.3. Клонирование и секвенирование гена тирозин - фенол-лиазы.

Выше упоминалось, что мы выделяли тирозин — фенол—лиазу из двух бактериальных источников — из С. intermedius и из Е. herbicola. В университете штата Джорджия (США) филлипс исследовал фермент, выделенный из клеток Citrobacter freundii. Мы сравнили каталитические параметры ферментов из клеток С. intermedius и С. freundii в реакции oc,ß — элиминирования L —тирозина (неопубликованные данные), они оказались идентичны. Сравнение молекулярных масс ферментов методом масс — спектрометрии (неопубликованные данные) показало, что молекулярные массы (53.437 ± 4.3 Da) ферментов из двух источников также идентичны.

Последовательность 17 N —концевых аминокислот тирозин — фенол —лиазы из С. intermedius была определена в ИМБ РАН C.B. Шляпниковым (неопубликованные данные). Перед процедурой секвенирования на автоматическом секвенаторе белок подвергали обработке 0.5 N HCl, поскольку, как упоминалось выше, N —конец белка был закрыт. Последовательность 17 N —концевых аминокислот фермента из С. freundii оказалась тождественна N —концевой последовательности, определенной для фермента из С. freundii в университете штата Джорджия (США).

Совместно с Голлником (универститет штата Нью-Йорк, США) и Филлипсом (универститет штата Джорджия, США) ген тирозин — фенол — лиазы из С. &еипс1И был клонирован и аминокислотная последовательность фермента была определена по структуре гена (18). Полная структура гена (2100 пар нуклеотидов) и аминокислотная последовательность белка (456 аминокислот) показаны на рис. 10. Последовательность 456 аминокислот кодируется одной открытой рамкой считывания. Определенная независимо японскими учеными аминокислотная последовательность тирозин — фенол —лиазы из С. ШеттесИиэ оказалась, как мы и предполагали, идентичной аминокислотной последовательности тирозин — фенол —лиазы из С. ЯгеизкШ (173).

Для определения в аминокислотной последовательности фермента местоположения остатка лизина, связывающего пиридоксаль — Р, альдиминную связь в холоферменте восстанавливали ЫаВ3Н4. Из бромцианового гидролизата в индивидуальном виде было очищено пять пептидов, из которых один содержал радиоактивность в количестве, соответствующем содержанию остатков аминокислот, определенному по данным аминокислотного анализа. Для пептида, содержавшего радиоактивность, четвертый шаг секвенирования содержал количество радиоактивности, практически соответствовавшее количеству радиоактивности в исходном пептиде и давал неидентифицируемый продукт. Очевидно, что этот цикл соответствовал отщеплению остатка N — (5'— фсфопиридоксил) — Ь — лизина. На рис. 10 последовательности пептидов бромцианового гидролиза, выделенных в гомогенном состоянии, подчеркнуты.

1 TGTAAATTACCCCAGTAATTGGCGGGAAGTCCAGATGTAAATAACATGAAATAAGGGATT б1 AGCAGGTTTCGGAATAAATAGAAATCCTCTCTATCCCAATAAACATAGTATTATTCACCG 121 TATAAATTCATTCCTGTCCCATCCTCCTGATACCTGCCATTTCCAGAAAATAACGCCCAT 181 GTGTATCAGGCCAAAAAT6AGATCTAACTCACTGAAGCAAATAGCAAACTCTGAAACAAC 241 GCCGTTTTGTACACTTTGCTTTACACTTTTAGTGATGTGAATCACAAATATAAATCCGTG 301 AAGTGATCCGACTCTCACAAAATGGGGTGTACTCATTCAGCAATACAGTATGAGCACAGA 361 CTGGAAAGTTAAGTTTTCAGTATTTCCCCTCTCCACGGGGGCAcCATCGCAAATGGCAAA 421 TCAACACGCAAAAAAAAACTTGTTGAATATGAACGGGTAAAAAAATGACGTGTGATTTGC 481 ATCACCTACATTTACAGCTTTTTAAATTATTGCCAGTGATTAATGTTGACTAGGCTATTT 541 CCATAATCAATTAAATCTTGCATAGTGCCTCCACATTATTTCTCCCCCTGACTCAGGAGG 601 CGAATAGTTATATTTCATCAGACTTTATTGATGAACCAGGTATGCTTTACTTCACATTAA

661 TACGTACATGACCACTGTTACTGGAGAAACAAAATGAATTATCCGGCAGAACCCTTCCGT

MetAsn TyrProAlaGlu ProPhaArq

721 ATTAAAAGCGTTGAAACTGTATCTATGATCCCGCGTGATGAACGCCTTAAGAAAATGCAG IleLysSerValGluThrValSerMetlleProArgAspGluArqLeuLysLysMetGln

781 GAAGCGGGATACAATACTTTCCTGTTAAATTCGAAAGATATTTATATTGACCTGCTGACA GluAlaGlyTyrAsnThrPheLeuLeuAsnSerLysAspIleTyrlleAspLeuLeuThr

841 GACAGTGGCACTAACGCAATGAGCGACAAGCAGTGGGCCGGCATGATGATGGGTGATGAA AspSerGlyThrAsnAlaMetSerAspLysGlnTrpAlaGlyMetMetMetGiyAspGlu

9 01 GCCH'ACGCGGGCAGCGAAAACTTCTATCATCTGGAAAGAACCGTGCAGGAACTGTTTGGC AlaTyrAlaGlySerGluAsnPheTyrHisLeuGluArgThrValGlnGluLeuPheGly

961 TTTAAACATATTGTTCCTACTCACCAGGGGCGCGGCGCAGAAAACCTGTTATCGCAGCTG PheLysHisIleValProThrHisGlnGlyArgGlyAlaGluAsnLeuLeuSerGlnLeu

1021 GCAATTAAACCGGGGCAATATGTTGCCGGGAATATGTATTTCACTACTACCCGTTATCAC AlalleLysProGlyGlnTyrValAlaGlyAsnMetTyrPheThrThrThrArgTyrHis

1081 CAGGAAAAAAATGGTGCGGTGTTTGTCGATATCGTTCGTGACGAAGCGCACGATGCCGGT GlnGluLysAsnGlyAlaValPheValAspIleValArgAspGluAlaHisAspAlaGly

1141 CTG AAT ATTGCTTTTAAAGGTGATATCGATCTTAAAAAATTACAAAAACTGATTGATGAA LeuAsnlleAlaPheLysGlyAspIleAspLeuLysLysLeuGlnLysLeuIleAspGlu

1201 AAAGGCGCCGAGAATATTGCCTATATTTGCCTGGCAGTCACGGTTAACCTCGCAGGCGGG LysGlyAlaGluAsnlleAlaTyrlleCysLeuAlaValThrValAsnLeuAlaGlyGly

1261 CAGCCGGTTTCCATGGCTAACATGCGCGCGGTGCGTGAACTGACTGCAGCACATGGCATT GlnProValSerMetAlaAsnMetArgAlaValArgGluLeuThrAlaAlaHisGlylle

1321 АААСТСТТСТАССАСССТАСССССТСССТАСААААССССТАСТТТАТСАААСАССААСАС Ьуз7а1РЬеТугАзрА1аТЬгАг«?СуаУа1С1иАвпА1аТугРЬв11вЬу8С1иС1пС1и

1381 САССССГТТСАСААСААСАССАТСХ;САСАСАТССТССАТ6А6АТСТТСАССТАСССССАС

GlnGlyPheGluAsnLysSerIleAlaGluIleValHisGluMetPhвSвrTyrAlaAsp

1441 ССТТСТАССАТСАСТССТААААААСАСТСТСТССТСААТАТСССССССТТССТСТССАТС С1уСу8ТЬгМвй5егС1уЬувЬувА8рСувЬвиУа 1Аап11еС1уС1уРЬвЬвиСуаМвй

1501 ААСС АТСАССАААТСТТСТСТТСТСССАААСАСТТАСТССТТСТСТАССААСССАТСССА AsnAspAspGluHвtPhвSвrSerAlaLysGluLвuValValValTyгGlцGlyMвtPro

1561 ТСТТАССССССССТССССССАССССАСАТССААСССАТССССАТТССТСТСССССААССС SerTvrGlvGlvLeuAlaGlyAгqAspMвtGluAlaMetAlaIleGlyLвuArqGluAla

1621 АТССАСТАТСАСТАСАТССАССАСССССТСААССАССГТСССТАТСТСССССАСААССТС Ме^С1пТугС1иТуг11еС1иН1зАгдУа1Ьу8С1пУа1АгдТугЬвиС1уАарЬув1ли

1681 АААСССССТССТСТАСССАТТСТТСААССССТССССССТСАТССССТАТТССТССАТССС ЬузА1аА1аС1уУа1Рго11еУа1С1иРгоУа1С1уС1уН18А1аУа1Р11еЬеиА8рА1а

17 41 ССТСССТТСТСТСАССАТСТСАСССАССАССАСТТССССССССАААСССТСССТСССАСТ АгдРгоРЬвСу8С1иН1зЬвиТЬгС1пАБрС1иРЬвРгоА1аС1п5вгЬвиА1аА1а5вг

1801 АТСТ АТСТССАААСССС ССТАССТАСТАТССАССССССААТТАТСТСТССССССССТААТ IleTyrValGluThrGlyValArgSвrMвtGluArgGlyIlвIleSвrAlaGlyArgAsn

1861 ААССТСАСТССТСААСАССАСАСССССАААСТССАААСССТСССТСТСАСТАТТССАССС Абп Уа ИЪг в 1у в 1иШзН1 зАгдРгоЬувЬеиС 1иТЬгУа 1Агд1лиТЬг 11вРгоАгд

1921 ССССТТТАТАСТТАСССССАТАТССАТСТАСТСССТСАСССТАТТАТТАААСТТТАССАС АгдУа lTyrThrTyrAlaHisMвtAspValValAlaAвpGly 11в11вЬувЬвиТугв1п

1981 САСАААСААвАТАТТСССвСССТСААСТТТАТТТАСбАвСССААвСАССТСССТТТСТТТ Н1зЬувС1иА8р11еАгдС1у1

2041 асгссассстттсастататстааатаатааттатсссссслтсггсассатссстссттт

ТЫ А1 а Аг дРЬеАэрТу г 11еЕп<1 2101 ТТТСАТТТСГТТТССАТСААСАССААСТССТТТ

Рис. 10. Нуклеотидная последовательность гена тирозин фенол—лиазы и аминокислотная последовательность фермента. Подчеркнуты последовательности, определенные секвенированием N — концевого участка белка и секвенированием пептидов бромцианового гидролизата. Остаток лизина, связывающий пиридоксаль—Р, отмечен звездочкой.

Остаток лизина, связывающий кофермент (отмечен звездочкой), занимает положение 257 в полипептидной цепи тирозин — фенол —лиазы,

Определение аминокислотной последовательности фермента явилось одним из решающих шагов в установлении его трехмерной структуры.

Экспрессия тирозин — фенол —лиазы в клетках Е. coli, содержащих плазмиду pTZTPL, составляла около 30%. В дальнейшем выращивание бактериальной массы и выделение рекомбинантного фермента проводили по методике, описанной в работе (174).

2.2. Исследование каталитических свойств тирозин - фенол-лиазы.

2.2.1. Исследование факторов, определяющих субстратную специфичность тирозин - фенол-лиазы.

Большинство пиридоксаль — Р — зависимых ферментов, принадлежащих к классу лиаз, в том числе и тирозин — фенол —лиаза, обладают довольно широкой субстратной специфичностью. Для выяснения факторов, определяющих субстратную специфичность тирозин — фенол-лиазы, мы исследовали взаимодействие фермента с рядом L — аминокислот, часть из которых являются аналогами L —тирозина (175) а также с аминокислотами различного строения (176).

Большинство из них оказались конкурентными ингибиторами фермента, образующими хиноидный комплекс и катализирующими обмен С —а —протона в D20 (табл. 2). Тирамин, ß — фенилэтиламин и триптамин проявляли очень слабый ингибирующий эффект. Следовательно, наличие карбоксильной группы у а — углеродного атома субстрата является одним из главных факторов, ответственных за эффективность связывания субстрата с активным центром тирозин — фенол-лиазы.

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Демидкина, Татьяна Викторовна, 1998 год

Список цитированой литературы

1. Браунштейн, А. Е.г Шемякин, М.М. (1953). Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. Биохимия, т. 18, с. 393 — 411.

2. Mezler, D.E., Ikawa, М., and Snell, Е.Е. (1954). A general mechanism for vitamin B6 —catalysed reactions. J. Am, Chem. Soc., v. 76, p. 648 — 652.

3. Dunatan, H.C. (1966) Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. Proc. Natl. Sci. USA, v. 55, p. 712 — 716.

4. Jansonius, J.N., Eichele, G., Ford, G.C., Picot, D., Thaller, C., and Vincent, M. (1985) Spatial and covalent structures of aspartate aminotransferases. In Transaminases (Christen, P. and Mezler, D.E., eds) pp. 109—137, John Wiley and Sons, New York.

5. Toney, M.D., Hohenester, E., Keller, J.W., and Jansonius, J.N. (1995) Structure and mechanistic analysis of two refined crystal stuctures of the pyridoxal phosphate — dependent enzyme dialkylglycine decarboxylase J. Mol. Biol., v. 245, p. 151-179.

6. Antson, A.A., Dodson, G.G., Wilson, K.S., Pletnev, S.V., Harutyunyan, E.H., and Demidkina, T.V. (1994). Crystallographic studies of tyrosine phenol — lyase. In: Biochemistry of Vitamin B6 and PQQ (G. Marino, G. Sannia and F. Bossa, eds.), Birkhauser Verlag, Basel/Switzerland, pp. 187—191.

7. Alexander, F.W., Sandmeier, E., Mehta, P., and Christen, P. (1994) Evolutionary relationships among pyridoxal — 5' — phosphate — dependent enzymes. Regio — specific a, P, and y — families. Eur. J. Biochem., v. 219, p. 953-960.

8. Yoshimura, T.t Nishimura, K., Ito, J., Esaki, N., Kagamiyama, H., Manning, J.M., and Soda, K. (1993) Unique stereospecificity of D —amino acid aminotransferase and branched — chain L —amino acid aminotransferase for C —4' hydrogen transfer of the coenzyme. J. Am. Chem. Soc., v. 115, p, 3897 — 3900.

9. Sugio, S„ Stoddard, B.L., Petsko, G„ Manning, J.M., and Ringe, D. (1995) Crystal structure of D— amino acid aminotransferase. How the protein controlls stereoselectivity. Biochemistry, v. 34, p. 9661 — 9669.

10. Antson, A.A. , Srtokopytov, B.V.,. Murshudov, G.N, Isupov, M.N., Harutyunyan, E.H., Demidkina, T.V., Vassylyev, D.G., Dauter,Z.,. Terry, H. and Wilson, K.S. (1992) . The polypeptide chain fold in tyrosine phenol — lyase, a pyridoxal —5' — phosphate dependent enzyme. FEBS Lett., v. 302, p. 256 — 260.

11. Ford, J.C., Eichele, G., and Jansonius , J.N. (1980). Three — dimensional structure of a pyridoxal — phosphate — dependent enzyme, mitochondrial aspartate aminotransferase. Proc. Natl. Sci. USA, v. 77, p. 2559 — 2563.

12. Borisov, V.V., Borisova, S.N., Sosfenov, N.I., and Vainstein, B.K. (1980). Electron density map of chicken heart cytosol aspartate aminotransferase, Nature, v. 284, p. 189- 190.

13. Harutyunyan, E.G., Malashkevich, V.N., Tersyan, S.S., Kochkina, Y.M., Torchinsky, Yu.M., and Braunstein, A.E., (1982). 3 — Dimensional structure at 3.2 A resolution of the complex of cytosolic aspartate aminotransferase from chicken heart with 2 —oxoglytarate, FEBS Letters, v. 138, p. 113— 116.

14. Arnone, A., Rogers, P.H., Hyde, C.C., Briley, P.D., Mezler, C.M., and Mezler, D.E. (1985). Pig cytosolic aspartate aminotransferase: the structures of internal aldimine, external aldimine and ketimine and of the (5 — subform.

In: Transaminases (Christen, P. and Mezler, D.E., eds) pp, 138—155, John Wiley and Sons, New York.

15. Kamitori, S., Hirotssu, K., Higuchi, Т., Kondo, K., Inoe, K., Kuramutsu, S., Kagamiyama, H., Higuchi, Y., Yassuoka, N., Kusunoki, M., and Matsuura, Y. (1988). Three — dimesional structure of aspartate aminotransferase from Escherichia coli at 2.8 A resolution. J. Biochem. (Tokyo), v. 104, p. 317 — 318.

16. Hyde, C.C., Ahmed, S.A., Padlan, E.A., Miles, E.W., and Davis, D.R. (1988). Three — dimensional structure of the tryptophan synthase a2b2 multienzyme complex from Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem., v. 263, p. 17857 — 17871.

17. Watanabe, N., Sakabe, K., Sakabe, N., Higashi, Т., Sasaki, K., Aibara, S., Morita, Y., Yonaha, K., Toyama, S., and Fukutani, H. (1989). Crystal — structure analysis of w-amino acid: pyruvate aminotransferase with a newly developed Weissenberg camera and an imaging plate using synchrotron radiation. J. Biochem. (Tokyo), v. 105, p. 1 — 3.

18. Antson, A.A., Demidkina, T.V., Gollnick, P., Dauter, Z.,. Von Tersh, R.L., Long, J. Bereznoy, S.N., Phillips, R.S., Harutyunyan, E.H., and Wilson, K.S. (1993) Three dimensional structure of tyrosine phenol —lyase. Biochem., v. 32, p. 4195 — 4206.

19. Плетнев, C.B., Антсон, A.A., Синицина, Н.И., Даутер, 3., Исупов, М.Н., Хурс, Н.И., Фалеев, Н.Г., Вильсон, К.С., Додсон, Г.Г., Демидкина, Т.В., Арутюнян, Э.Г. (1997). Кристаллографическое исследование тирозин — фенол —лиазы из Erwinia herbicola. Кристаллография, т. 42, с. 877 — 888.

20. Toney, M.D., Hohenester, Е., Cowan, S.W., and Jansonius, J.N. (1993). Dialkylglycine decarboxylase structure: bifunctional active site and alkali metal sites. Science, v. 261, p. 756 — 759,

21. Momany, C., Ernst, S., Ghosh, R., Chang, N.. and Hackert, M.L. (1995). Crystallographic structure of PLP — dependent ornitine decarboxylase from Lactobacillus 30a with 3.0 A resolution. J. Mol. Biol., v. 252, p. 643 — 655.

22. Isupov, M.N., Antson, A.A., Dodson, E.J., Dodson. G.G., Dementieva, I.S., Zakomirdina, L.N., Wilson, K.S., Dauter, Z., Lebedev, A.A., and Harutynyan, E.H. (1998). Crystal structure of tryptophanase. J. Mol. Biol., v. 276, p. 603623.

23. Laber, B., Clausen, T., Huber, R., Messershmidt A.,, Egner U„ Muller — Fahrow A., Pohlenz, H.D. (1996). Cloning, purification and crystallization of E. coli cystathionine (3 —lyase. FEBS Letters, v. 379, p. 94 — 96.

24. Dunatan, H. and Voet, J.G. (1974) Stereochemical evidence for the evolution of pyridoxal — phosphate enzymes of various function from a common ancestor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 71, p. 3888-3891.

25. Toney, M.D., and Kirsch, J.F. (1993) Lysine 258 in aspartate aminotransferase: Enforcer of the Circe effect for amino acid substrates and general —base catalyst for 1,3 —prototropic shift. Biochemistry, v. 32, p. 1471 — 1479.

26. Braunstein, A.E. Amino group transfer (1973). In: The enzymes ( Boyer P.D., ed.) vol. 9, pp. 470-481, Wiley and Sons, New York.

27. Wilson Miles, E. (1985) Transamination as a side reaction of other phosphopyridoxal enzymes In: Transaminases (Christen, P. and Mezler, D.E., eds) pp. 472 — 480, John Wiley and Sons, New York,

28. Vaaler, G.L., and Snell, E.E. (1989) Pyridoxal-5' -phosphate dependent histidine decarboxylase: overproduction, purification, biosynthesis of soluble site — directed mutant proteins and replacement of conserved residues. Biochemistry, v. 28, p,7306-7313.

29. Minelli, A., Chateris, A.T., Voltttorni, C.B., and john, R.A. (1979) Reactions of DOPA decarboxylase with DOPA. Biochem. J.r v. 183, p. 361-368.

30. Akhtar, M., Stevenson, D.E. and Gani, D. (1990). Fern L — methionine decarboxylase: kinetics and mechanism of decarboxylation and abortive transamination, Biochemistry, v. 29, p. 7648 — 7660.

31. Palcic, M.M., Shen, S.J., Schleicher, E., Kumagai, H., Sawada, S., Yamada, H., and Floss, H.G. (1987). Stereochemistry and mechanism of the reactions catalysed by tyrosine phenol —lyase from Escherihia intermedia. Z. Naturforsch., v. C 42, p. 307-318,

32. Faleev, N., Lyubarev, A., Martinkova, N., and Belikov, V.M. (1983) Mechanism and stereochemistry of J3 — elimination of L —tyrosine catalysed by tyrosine phenol — lyase. Enzyme Microb, Technol., v 5, p. 219 — 224.

33. Vederas, J.C., Schleicher, E., Tsai, M.D., and Floss, H.G. (1978). Stereochemistry and mechanism of reactions catalysed by tryptophanase of Escherihia coli. J. Biol. Chem., v. v. 253, p. 5350 — 5354.

34. Sawada, S., Kumagai, H., Yamada, H., and Hill, R.K. (1975). Streochemistry of (3 — replacement reactions catalysed by tyrosine phenol — lyase. J. Am. Chem. Soc., v. 97, p. 4334-4337.

35. Crout, D.H.G., Gregorio, M.V.M., Muller, V.S., Komatsubara, S.f Kisumi, S., and Shibata, I. (1980). Stereochemistry of the conversion of L —threonine and D — threonine into 2 — oxobutanoate by the of L — threonine and D — threonine dehydratases of Serratia marcensces. Eur. J. Biochem., v. 106, p. 97-105.

36. Yang, J., Huang, Y.Z., and Snell, E.E. (1975). Stereochemistry of D —serine dehydratase — catalysed P — elimination reaction. Fed. Proc., v. 43. p. 496 — 501.

37. Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V., Azhayev, A.V. (1987). Transamination catalysed by tyrosine phenol —lyase from Citrobacter intermedins. Eur. J. Biochem., v. 170, p. 311-316.

38. Davis, L. and Mezler, D.E. (1972). Pyridoxal - linked elimination and replacement reactions. In: Enzymes ( Boyer, P.D., ed.) vol. 3, pp. 33 — 74. Wiley and Sons, New York,

39. Tsai, M.D., Schleicher, E., Potts, R„ Skye, G.E., and Floss, H.D. (1978). Stereochemistry and mechanism of the reactions catalysed by tryptophan syntethase and its (3 —subunit. J. Biol. Chem., v. 253, p. 5344 — 5349.

40. Brzovic, P.S., Kayasha, A.M., Miles, E.W., and Dunn, M.F. (1992). Substitution of glutamic acid 109 by aspartic acid alters the substrate specificity and catalytic activity of the (3 — substituted tryptophan syntethase bienzyme complex from Salmonella typhimutium. Biochemistry, v. 31, p. 118—128.

41. Fersht, A.R. (1995). In: Enzyme structure and mechanism (W.H. Freeman and Company, eds.) pp. 314 — 346, New York.

42. Iwasaki, M., Hayashi, H., and Kagamiyama, H. (1994). Protonation state of active —site Schiff base of aromatic amino acid aminotransferase: modulation by binding of ligands amd implication for its role in catalysis. J. Biol. Chem. v. 115, p. 150-155.

43. Hayashi, H. and Kagamiyama, H. (1995). Reaction of aspartate aminotransferase with L —erythro —3— hydroxyaspaprtate: involvemnt of Tyr70 in stabilization of the catalytic intermediates. Biochemistry v. 34, p. 9413-9423.

44. Hayashi, H., Inoe, K., Nagata, T., Kuramitsu, S., and Kagamiyama, H. (1993). Escherichia coli aromatic amino acid aminotransferase: characterization and

comparison with aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 32, p. 1229 — 1239.

45. Jansonius, J.N. and Vincent, M.G. (1987). Movement of the aspartate aminontansferase domains. In: Biological Moleculees and Assemblies (Jurnak, F.A. and McPherson, eds.) Vol. 3, pp. 187-285, Wiley, New York.

46. Arnone, A., Briley, P.D., Rogers, P.H., Hyde, C.C., Mezler, C.M., and Mezler, D.E. (1982). Conformational changes in pig heart aspartate aminotransferase. In: Molecular Structure and Bilogical Activity (Griffen, J.F,,Duax, W.L., eds), pp. 57 — 74, Elsevier, New York.

47. Gehring, H., Christen, P. (1978). Syncatalytic conformational changes in mitochondrial aspartate aminotransferases. Evidence from modification and demodification of Cys 166 in the enzyme from chicken and pig. J. Biol. Chem. v. 253, p. 3158-3163.

48. Picot, D., Sandmeier, E., Thaller, C,, Vincent, M., Christen, P., and Jansonius, J.N. (1991). Eur. J. Biochem. v. 196, p. 329-341.

49. Pfister, K., Sandmeier, E., Berchtold, W., Christen, P. (1985). Conformational changes in aspartate aminotransferase. Effect of active site ligands on peptide hydrogen — deuterium exchange. J. Biol. Chem. v. 260, p. 11414— 11421.

50. Gamier, A., John, R.A. (1993). Probes of ligand — induced conformational change in aspartate aminotransferase. Eur. J. Biochem. v. 216, p. 763 — 768.

51. Sandmeier, E. and Christen, P. (1980) Mitochondrial aspartate aminotransferase.. Partially active enzyme derivative produced by limited proteolytic cleavage of native enzyme. J. Biol. Chem. v. 255, p. 10284— 10289.

52. Iriarte, A., Hubert, E., Kraft, K., Martinez - Carrion, M. (1984). Selective tryptic cleavage of native cytoplasmic aspartate transaminase holoenzyme. J. Biol. Chem. v. 259, p.723-728.

53. Kochhar, S., Christen, P. (1992). Mechanism of racemization of amino acids by aspartate aminotransferase. Eur. J. Biochem. v, 203, p. 563 — 569.

54. Jenks, W.P. (1975) Binding energy, specificity, and enzymatic catalysis — the Circe effect. Adv. Enzymol. v. 43, p. 219-410.

55. Hayashi, H., Kuramitsy, S., and Kagamiyama, H. (1991). Replacement of an interdomain residue Val39 of E. coli aspartate aminotransferase effects the catalyric competence without altering the substrate specificity of the enzyme. J. Biochem. (Tokyo) v. 109, p. 699-704.

56. Jager, J., Pauptit, R.A., Sauder, U., and Jansonius, J.N. (1994). Three-dimensional structure of a mutant E. coli aspartate aminotransferase wih increased enzymatic activity. Protein Eng. v. 7, p. 605 — 612.

57. Pan, Q., Tanase, S., Fukumoto, U., Nagashima, F., Rhee, S., Rogers, P.H., Arnone, A., and Morino, Y. (1993). Functional roles of Val37 and Gly38 in the mobile loop of porcine cytosolic aspartate aminotransferase. J. Biol, Chem. v. 268, p. 24758-42765.

58. Schirch, V., Shostak, K., Zamora, M., Guatam-Basak, M. (1991) The origin of reaction specificity in serine hydroxymethyltransferase. J. Biol. Chem. v. 266, p. 759-764.

59. Stover, P., Zamora, M., Shostak, K., Gautam — Basak, M., Schirch, V. Escherichia coli serine hydroxymethyltransf erase. The role of histidine 228 in determining reaction specificity. J. Biol. Chem. v. 267, p. 17679— 17687.

60. Brzovic, P.S., Hyde, C.C., Miles, E.W., Dunn, M.F. (1993). Characterization of the functional role of a flexible loop in the alpha — subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium by rapid — scanning, stopped —flow spectroscopy and site — directed mutagenesis. Biochemistry v. 32, p. 10404 — 10413.

61. Brzovic, P.S., Ngo, K,, Dunn, M.F. (1992) Allosteric interactions coordinate catalytic activity between successive metabolic enzymes in the tryptophan synthase bienzyme complex. Biochemistry v. 31, p. 3831 — 3839,

62. Kirsh, J.F., Eichele, G., Ford, G.C., Vincent, M.G., Jansonius, J.N., Gehring, H., and Christen, P. (1984). Mechanism of aspartate aminotransferase action. J. Mol. Biol. v. 174, p. 497 - 525.

63. Gehring, H. (1984) Transfer of C— a —hydrogen of glutamate to coenzyme of aspartate aminotransferase during transamination reaction. Biochemistry v. 23, p. 6335-6340.

64. Julin, D.A., Wiesinger, H., Toney, M.D., Kirsch, J.F. (1989) Estimation of free energy barriers in the cytoplasmic and mitochondrial aspartate aminotransferase reactions probed by hydrogen — exchange kinetics of C — a —labeled amino acids with solvent. Biochemistry v. 28, p. 3815 — 3821.

65. Toney, M.D., Kirsch, J.F. (1993) Lysine 258 in aspartate aminotransferase: enforcer of the Circe effect for amino acid substrates and general —base catalyst for the 1,3 —prototropic shift. Biochemistry v, 32, p. 1471 — 1479.

66. Toney, M.D., Kirsch, J.F. (1991) The K258R mutant of aspartate aminotransferase stabilizes the quinonoid intermediate. J. Biol. Chem. v. 266, p. 23900-23903.

67. Kuramitsu, S., Inoe, Y„ Tanase, S., Morino, Y., and Kagamiyama, H. (1989). Replacement of active site lysine resideu in E. coli aspartate aminotransferase. Ann. N.Y. Acad. Sci. v. 585, p. 331-338.

68. Ziak, M., Jaussi, R., Gehring, H„ Christen, P. (1990) Aspartate aminotransferase with the pyridoxal —5' —phosphate —binding lysine residue replaced by histidine retains partial catalytic competence. Eur. J, Biochem. v. 187, p. 329-333.

69. Ziak, M., Jager, J., Malashkevich, V.N., Gehring, H., Jaussi, R., Jansonius, J.N., Christen, P. (1993) Mutant aspartate aminotransferase (K258H) without pyridoxal — 5' — phosphate — binding lysine residue, Structural and catalytic properties. Eur. J. Biochem. v. 211, p. 475 — 484.

70. Fasella, P. and Hammes, G.G. (1967). Elementary steps in amino group transfer catalysed by aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 6, p. 1798 — 1810.

71. Cordes, E.H, and Jenks, W.P, (1962). Schiff bases and transaldiminaton reaction. Biochemistry v. 1, p. 773 — 778.

72. Schonbeck, ND, Skalski, M, Shafer, JA (1975) Reactions of pyridoxal -5'-phosphate, 6 — aminocaproic acid, cysteine, and penicilamine. Models for reactions of Schiff base linkages in pyridoxal 5' —phosphate —requiring enymes. J. Biol. Chem. v. 250, p. 5343 — 5351.

73. Yano, T., Kuramitsu, S., Tanase, S., Morino, Y., Kagamiyama, H. (1992) Role of

in the catalytic mechanism of Escherichia coli aspartate aminotransferase: the amino acid residue which enhances the function of the enzyme —bound coenzyme pyridoxal 5'— phosphate. Biochemistry, v. 31, p. 5878-5887.

74. Kirsch, J.F., Toney, M.D. (1991) Bronsted analysis of enzymatic proton transfer reactions through site — directed mutagenesis. Ann. N. Y. Acad. Sci. v. 585, p. 48-57.

75. Goldberg, J.M., Swanson, R.V., Goodman, H.S., Kirsch, J.F. (1991) The tyrosine —225 to phenylalanine mutation of Escherichia coli aspartate aminotransferase results in an alkaline transition in the spectrophotometric and kinetic pKa values and reduced values of both kcat and Km. Biochemistry v. 30, p. 305-312.

76. Inoue, K., Kuramitsu, S., Okamoto, A.t Hirotsu, K., Higuchi, T., Morino, Y., Kagaraiyama, H. (1991) Tyr225 in aspartate aminotransferase: contribution of the hydrogen bond between Tyr225 and coenzyme to the catalytic reaction. J. Biochem. (Tokyo) v. 109, p. 570-576.

77. Yano, T., Mizuno, T., Kagamiyama, H. (1993) A hydrogen — bonding network modulating enzyme function: asparagine—194 and tyrosine —225 of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 32, p. 1810— 1815.

78. Goldberg, J.M., Zheng, J„ Deng, H„ Chen, Y.Q., Callender, R., Kirsch, J.F. (1993) Structure of the complex between pyridoxal 5' —phosphate and the tyrosine 225 to phenylalanine mutant of Escherichia coli aspartate aminotransferase determined by isotope — edited classical Raman difference spectroscopy. Biochemistry v. 32, p. 8092 — 8097.

79. Malashkevich, V.N., Toney, M.D., Jansonius, J.N. (1993) Crystal structures of true enzymatic reaction intermediates: aspartate and glutamate ketimines in aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 32, p. 13451 — 13462.

80. Toney, M.D., Kirsch, J.F. (1987) Tyrosine 70 increases the coenzyme affinity of aspartate aminotransferase. A site — directed mutagenesis study. J. Biol. Chem. v. 262, p. 12403- 12405.

81. Toney, M.D., Kirsch, J.F. (1991) Kinetics and equilibria for the reactions of coenzymes with wild type and the Y70F mutant of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 30, p. 7461 — 7466.

82. Inoue, K., Kuramitsu, S., Okamoto, A,, Hirotsu, K., Higuchi, T., Kagamiyama, H. (1991) Site — directed mutagenesis of Escherichia coli aspartate aminotransferase: role of Tyr70 in the catalytic processes. Biochemistry v. 30, p. 7796-7801.

83. Pan, P., Jaussi, R., Gehring, H., Giannattasio, S., Christen, P. (1994) Shift in pH —rate profile and enhanced discrimination between dicarboxylic and aromatic substrates in mitochondrial aspartate aminotransferase Y70H. Biochemistry v. 33, p. 2757-2760.

84. Toney, M.D., Kirsch, J.F. (1991) Kinetics and equilibria for the reactions of coen2ymes with wild type and the Y70F mutant of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 30, p. 7461 — 7466.

85. McPhalen, C.A., Vincent, M.G., Jansonius, J.N. (1992) X —ray structure refinement and comparison of three forms of mitochondrial aspartate aminotransferase. J. Mol, Biol. v. 225, p. 495 — 517.

86. Hayashi, H., Inoue, Y., Kuramitsu, S., Morino, Y., Kagamiyama, H. (1990) Effects of replacement of tryptophan — 140 by phenylalanine or glycine on the function of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 167, p. 407-412.

87. Danishefsky, A.T., Onnufer, J.J., Petsko, G.A., Ringe, D. (1991) Activity and structure of the active —site mutants R386Y and R386F of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 30, p. 1980—1985.

88. Inoue, Y., Kuramitsu, S., Inoue, K., Kagamiyama, H., Hiromi, K., Tanase, S,, Morino, Y, (1989) Substitution of a lysyl residue for arginine 386 of Escherichia coli aspartate aminotransferase, J. Biol. Chem. v. 264, p. 9673 — 9681.

89. Cronin, C.N., Kirsch, J.F. (1988) Role of arginine-292 in the substrate specificity of aspartate aminotransferase as examined by site — directed mutagenesis. Biochemistry v. 27, p. 4572 — 4579.

90. Hayashi, H., Kuramitsu, S., Inoue, Y., Morino, Y., Kagamiyama, H. (1989) [Arg292----Val] or [Arg292----Leu] mutation enhances the

reactivity of Escherichia coli aspartate aminotransferase with aromatic amino acids. Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 159, p. 337 — 342.

91. Seville, M„ Vincent, M.G., Hahn, K. (1988). Modelling of the three-dimensional structure of bacterial aspartate aminotransferase. Biochemistry v. 27, p. 8344-8349.

92. Jager, J., Solmajer, T., Jansonius, J.N. (1992). Computational approach towards the three — dimensional structure of E. coli tyrosine aminotransferase. FEBS Letters v. 306, p. 234-238.

93. Kirsh, J.F. and Onuffer, J.J (1994). Change of a substrate specificity of aspartate aminotransferase (1994). In: Biochemistry of vitamin B6 and PQQ ( Marino, G., Sannia, G., and Bossa, F.. eds), pp. 37 — 41, Birkhauser, Basel.

94. Jansonius, J.N., Genovesio — Taverne, J.C., Henning, M., Hohenester, E., Jenny, M., Malashkevich, V.N., and Toney, M. (1994). Crystal structure of aspartate aminotransferase hexamutant. In: Biochemistry of vitamin B6 and PQQ ( Marino, G., Sannia, G., and Bossa, F.. eds), pp.29 —356, Birkhauser, Basel.

95. Yoshimura, T„ Nishimura, K., Ito, J., Esaki, N., Kagamiyama, H., Manning, J.M. and Soda, K. (1993) Unique Stereospecificity of D —Amino Acid Aminotransferase and Branched — Chain L —Amino Acid Aminotransferase for C—4' Hydrogen Transfer of the Coenzyme. J. Am. Chem. Soc. v. 115, p. 3897 - 3900.

96. Smith, M.A., Kannangara, C.G., Grimm, B., von Wettstein, D. (1991) Characterization of glutamate — 1 — semialdehyde aminotransferase of Synechococcus. Steady—state kinetic analysis. Eur. J, Biochem. v. 202, p. 749-757.

97. Pugh, C.E., Harwood, J.L., John, R.A. (1992) Mechanism of glutamate semialdehyde aminotransferase. Roles of diamino— and dioxo — intermediates in the synthesis of aminolevulinate. J. Biol. Chem. v. 267, p. 1584— 1588.

98. Tyacke, R.J., Harwood, J.L., John, R.A. (1993) Properties of the pyridoxaldimine form of glutamate semialdehyde aminotransferase (glutamate — 1 — semialdehyde 2,1 — aminomutase) and analysis of its role as an intermediate in the formation of aminolaevulinate. Biochem. J. v. 293 (Pt 3), p. 697-701.

99. Grimm, B., Smith, A.J., Kannangara, C.G., Smith, M. (1991) Gabaculine-resistant glutamate 1 — semialdehyde aminotransferase of Synechococcus. Deletion of a tripeptide close to the NH2 terminus and internal amino acid substitution. J. Biol. Chem. v. 266, p. 12495- 12501.

100. Grimm, B., Smith, M.A., von Wettstein, D. (1992) The role of Lys272 in the pyridoxal 5 — phosphate active site of Synechococcus glutamate — 1 — semialdehyde aminotransferase. Eur. J. Biochem. v. 206, p. 579 — 585.

101. Lu, Z. Nagata, S„ McPhic, P., and Miles, E.W. (1993). Replacement of active site lysine residue in tryptophan synthase. J. Biol. Chem. 268, 579 — 585.81.

102. Miles, E.W. (1991) Structural basis for catalysis by tryptophan synthase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, v. 64 , p. 93- 172

103. Dunn, M.F., Aguilar, V„ Brzovic, P., Drewe, W.F., Houben, K.F., Leja, C.A., Roy, M. (1990) The tryptophan synthase bienzyme complex transfers indole between the a— and (3 —sites via a 25 —30 A long tunnel. Biochemistry v. 29, p. 8598-8607.

104. Lane, A.N., Kirschner, K. (1991) Mechanism of the physiological reaction catalyzed by tryptophan synthase from Escherichia coli. Biochemistry v. 30, p. 479 - 484.

105. Ogasahara, K., Hiraga, K.r Ito, W., Miles, E.W., Yutani, K. (1992) Origin of the mutual activation of the a2 and |32 subunits in the a2 P2 complex of tryptophan synthase. Effect of alanine or glycine substitutions at proline residues in the a-subunit. J. Biol. Chem. v. 267, p. 5222-5228.

106. Schirch, L. (1982) Serine hydroxymethyltransferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. v. 53, p. 83-112.

107. Malthouse, J.P.G., Milne, J.J. and Gariani, L.S. (1991) A comparative study of the kinetics and stereochemistry of the serine hydroxymethyltransferase — and tryptophan synthase — catalysed exchange of the pro — 2R and pro — 2S protons of glycine. Biochem. J. v. 274 (Pt 3), p. 807-812.

108. Schirch, V., Shostak, K., Zamora, M., Guatam- Basak, M. (1991) The origin of reaction specificity in serine hydroxymethyltransferase. J. Biol. Chem. v. 266, p. 759-764.

109. Hopkins, S., Schirch, V. (1986) Properties of a serine hydroxymethyltransferase in which an active site histidine has been changed to an asparagine by site — directed mutagenesis. J. Biol. Chem. v. 261, p. 3363 — 3369.

110. Stover, P., Zamora, M., Shostak, K., Gautam - Basak, M., Schirch, V. Escherichia coli serine hydroxymethyltransferase. The role of histidine 228 in determining reaction specificity. J. Biol. Chem. v. 267, p. 17679— 17687.

111. Angelaccio, S., Pascarela, S,, Fattori, E., Bossa, F., Strong, W., and Schirch, V. (1992). Substitution Thr216Ala changes equilubrium of intermediates in serine hydroxymethyltransferase. J. Biol, Chem, v. 266, 17679— 1787.

112. Schirch, D. Delle Fratte, S., Jurescia, S., Angelaccio, S., and Schirch, V. (1993), Site — directed mutagenesis of active site lysine residue. J. Biol. Chem. v. 266, p. 23132-23138.

113. Rhee, S„ Parris, K.D., Ahmed, A., Miles, E.W., and Davis, D.R. (1996). Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long —range changes in the three — dimensionla structure of the tryptophansynthase. Biochemistry v. 35, p. 4211-4221.

114. Gursky O., Li Y., Badger J., Caspar D.L. (1992). Monovalent cation binding to cubic insulin crystals. Biophys. J. v. 61, p. 604 — 611.

115. Badger J., Kapulsky A., Gursky O., Bhyravbhatla B., Caspar D.L. (1994); Structure and selectivity of a monovalent cation binding site in cubic insulin crystals. Biophys. J. v. 66, p. 286-292.

116. Larsen T.M., Laughlin L.T., Holden H.M., Rayment I., Reed G.H, (1994). Structure of rabbit muscle pyruvate kinase complexed with Mn2 + , K + , and pyruvate. Biochemistry v. 33, p. 6301 — 6309.

117. Kooystra P.J., Kalk K.H., Hoi W.G. (1988). Soaking in Cs2S04 reveals a cesium — aromatic interaction in bovine —liver rhodanese. Eur. J. Biochem. v. 177, p. 345-349.

118. Lijk L.J., Torfs C.A., Kalk K.H., De Maeyer M.C., Hoi W.G. (1984). Differences in the binding of sulfate, selenate and thiosulfate ions to bovine liver rhodanese, and a description of a binding site for ammonium and sodium ions. An X —ray diffraction study. Eur. J. Biochem. v. 142, p. 399 — 408.

119. Pantoliano M.W., Whitlow M., Wood J.F., Rollence M.L., Finzel B.C., Gilliland G.L., Poulos T.L., Bryan P.N. (1988). The engineering of binding affinity at metal ion binding sites for the stabilization of proteins: subtilisin as a test case. Biochemistry v. 27, p. 8311 — 8317.

120. Walsh, C. (1977). In: Enzymatic reaction mechanism (Freeman, G., ed.) San Francisco, 777 — 779.

121. Dunn M.F., Biellmann J. —F.r Branlant G. (1975), Roles of zinc ion and reduced coenzyme in horse liver alcohol dehydrogenase catalysis. The mechanism of aldehyde activation. Biochemistry v. 14, p. 3176 — 3182.

122. Bertini I., Lanini G., Luchinat C., Haas C., Maret W., Zeppezauer M. (1987) .The influence of anions and inhibitors on the catalytic metal ion inCo(II) — substituted horse liver alcohol dehydrogenase. Eur. Biophys. J. v. 14, p. 431-439.

123. Perutz M.F. (1989). Mechanisms of cooperativity and allosteric regulation in proteins. Q. Rev. Biophys. v. 22, p. 139 — 237.

124. Colman P.M., Jansonius J.N., Matthews B.W. 1972. The structure of thermolysin: an electron density map at 2 — 3 A resolution. Mol. Biol. v. 70, p. 701-724.

125. Matthews B.W., Weaver L.H. (1974). Binding of lanthanide ions to thermolysin. Biochemistry v. 13, p. 1719—1725

126. Voordouw G., Roche R.S. (1975). The role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. II. Studies on thermolysin, the thermostable protease from Bacillusthermoproteolyticus. Biochemistry v. 14, p. 4667 — 4673.

127. Epstein M., Levitzki A., Reuben J. (1974). Binding of lanthanides and of divalent metal ions to porcine trypsin. Biochemistry v, 13, p. 1777— 1782.

128. Gabel D, Kasche V. (1973. Autolysis of beta — trypsin. Influence of calcium ions and heat. Acta Chem. Scand. v. 27, p. 1971 — 1981.

129. Matthews BW, Weaver LH, Kester W.R. (1974). The conformation of thermolysin. J. Biol. Chem. v. 249, p. 8030-8044.

130. Ramachandran C„ Goris J., Waelkens E., Merlevede W., Walsh D.A. (1987). The interrelationship between cAMP — dependent alpha and beta subunit

phosphorylation in the regulation of phosphorylase kinase activity. Studies using subunit specific phosphatases. J. Biol. Chem. v. 262, p. 3210 — 3218.

131. Peracchi, A., Mozzarelli, A., Rossi, G.L. 1995. Monovalent cations affect dynamic and functional properties of the tryptophan synthase a2b2 complex. Biochemistry v. 34, p. 9459-9465

132. Woehl, E.U., Dunn, M.F. 1995. Monovalent metal ions play an essential role in catalysis and intersubunit communication in the tryptophan synthase bienzyme complex. Biochemistry v. 34, p. 9466 — 9474.

133. Suelter, C.H.1970. Enzymes activated by monovalent cations. Science v. 168, p. 789-795.

134. Suelter, C.H. (1974). Monovalent cations and enzymes: activating and inhibition. In: Metal ions in biological systems. (Sigel, H., ed.) Marcell Dekker, New York.

135. Wells C.M., Di Cera E.(1992). Thrombin is a Nai+)-activated enzyme. Biochemistry v. 31,p. 11721-11730.

136. Wedler F.C., Ley B.W.1993. Homoserine dehydrogenase — I (Escherichia coli): action of monovalent ions on catalysis and substrate association — dissociation. Arch. Biochem. Biophys. v. 301,p. 416-423.

137. Bailey G.B., Chotamangsa O., Vuttivej K. (1970). Control of pyridoxal phosphate enzyme reaction specificity studied with alpha — dialkylamino acid transaminase. Biochemistry v. 9, p. 3243 — 3248

138. Lamartiniere C.A., Itoh H., Dempsey W.B. (1971). Dialkylamino acid transaminase from Pseudomonas cepacia. Purification, crystallization, physical, and kinetic properties. Biochemistry v. 10, p. 4783 — 4788.

139. Hogberg-Raibaud A., Raibaud O., Goldberg M.E. (1975). Kinetic and equilibrium studies on the activation of Escherichia coli K12 tryptophanase by

pyridoxal 5'— phosphate and monovalent cations. J. Biol. Chem. v. 250, p. 3352-3358

140. Suelter C.H., Wang J., Snell E.E. 1976). Application of a direct spectrophotometric assay employing a chromogenic substrate for tryptophanase to the determination of pyridoxal and pyridoxamine 5' — phosphates. Anal. Biochem. v. 76(L), p. 221 — 232.

141. Raibaud O., Goldberg M.E. 1977. The reactivity of one essential cysteine as a conformational probe in Escherichia coli tryptophanase, Application to the study of the structural influence of subunit interactions. Eur. J. Biochem. v. 73, p. 591-599.

142. Kazarinoff M.N, Snell E.E. (1980). Some effects of indole on the interaction of amino acids with tryptophanase. J. Biol. Chem, v. 255, p. 6228 — 6233.

143. Tokushige M., Tsujimoto N., Oda T., Honda T., Yumoto N., Ito S., Yamamoto M., KimE.H., Hiragi Y. (1989). Role of cysteine residues in tryptophanase for monovalent cation — induced activation. Biochimie 71, 711 — 720.

144. Kimura S., Asari S., Hayashi S., Yamaguchi Y., Fushimi R., Amino N., Miyai K. (1992). New enzymatic method with tryptophanase for determining potassium in serum. Clin. Chem. v. 38, p. 44 — 47,

145. Demidkina, T.V. and Myagkikh, I.V. (1989). The activity and reaction cpecificity of tyrosine phenol —lyase regulated by monovalent cations. Biochimie v. 71, p. 565 — 571.

146. Morino, Y., and Snell, E.E. (1967). The subunit structure of tryptophanase. J. Biol. Chem. v. 242, p. 5591-5595.

147. Suelter, C.H., Snell, E.E. (1977). Monovalen cations action on tryptophanase. J. Biol. Chem. v. 252, p. 1852- 1857.

148. June, D.S., Kennedy, T.H., Pirece, S.V., Elias, S.V., Suelter, C.H., and Dye, J.L. (1979). Rapid scanning stopped —flow absorption studies of the effect on tryptophanase of a change in pH or K+ concentration: evidence for a slow conformationla change. J. Am. Chem. Soc., v. 101, p. 2218-2223.

149. Phillips, R.S. (1991). Reaction of indole and analogues with amino acid complexes of E. coli tryptophanase affects the formation and breakdown of quinonoid complexes. Biochemistry 30, 5927 — 5934.

150. Chen, H. and Phillips, R.S. (1993). Binding of phenol and analogues to alanine complex of tyrosine phenol —lyase: implication for the mechanism of |3 — elimination and alanine racemization. Biochemistry 32, 1591 — 11599.

151. Dunn, M.F., Brzovic, P.S., Leja, C.A., Pan, P., and Woel, E.U. (1994). Effects of monovalent cations on functional properties of the tryptophan synthase in solution and in the crystal, In: Biochemistry of Vitamin B6 and PQQ ( Matino, G, Sannia, G„ and Bossa, F., eds), 119-124.

152. Oppenheimer, H.L., Labouesse, B., Hess G.P. (1966). Implication of an ionizing group in the control of conformation and activity of chymotrypsin. J. Biol. Chem. v. 241, p. 2720-2730.

153. Fersht, A. (1985). In: Enzyme structure and mechanism (Freeman, G., ed.), New York, p. 1 — 3.

154. Pauling, L. (1948). Am. Sci., v. 51. p. 31-37.

155. Drewe, W.F. Jr., Dunn, M.F. (1985). Detection and identification of intermediates in the reaction of L —serine with E. coli tryptophan synthase via rapid — scanning ultraviolet — visible spectroscopy. Biochemistry v. 24, p. 3977-3987.

156. Drewe, W.F. Jr., Dunn, M.F. (1986). Characterization of the reaction of L-serine and indole with Escherichia coli tryptophan synthase via rapid scanning ultraviolet—visible spectroscopy. Biochemistry v. 25, p. 2494 — 2501.

157. Wedler F.C., Ley B.W. (1993). Homoserine dehydrogenase — I (Escherichia coli): action of monovalent ions on catalysis and substrate association dissociation. Arch. Biochem. Biophys. v. 301, p. 416 — 423.

158. Bendler, F.J., Kezdy, F.J., and Gunter, C.R. ( 1964). The anatomy of an enzymatic catalysis, a —Chymotripsin. J. Am. Chem. Soc. v. 86, p. 3714 — 3719.

159. Enei, H„ Matsui, H„ Yamashita, K„ Okumura, S„ Yamada, H. (1972). Microbiological synthesis of L —tyrosine and 3,4 — dihydroxyphenyl — L — alanine. I. Distribution of tyrosine phenol —lyase im microorganisms. Agricaltural and Biological Chemistry Vol. 36, P.. 1861-1868).

160. Duffey, S.S., Aldrich, J.R., Blum, M.S. (1977) Biosynthesis of phenol and guaiacol by the hemipteran Leptoglussus phyllopus. Compt. Biochem. Physiol, Vol. 56B, P. 101-102).

161. Yamada, H., Kumagai, H. (1975) Synthesis of L — tyrosine — related amino acids by p-tyrosinase. Adv. Appl. Microbiol. Vol. 19, P. 249-288.

162. Meadows, G.G., Di Govannoi,J., Minor, L., Elmer, G.W. (1976) Some biological properties and in vivo evaluation of tyrosine phenol —lyase on growth of B16 melanoma. Cancer Research, Vol. 36, P. 167— 171.

163. Iwamori, S., Okiawa, T., Ishiwata, Ken-Ichi, and Makiguchi, N. (1992) Cloning and expression of the Erwinia herbicola tyrosine phenol —lyase gene in Escherichia coli, Biothechnol. Appl. Biochem. Vol. 16, P. 77 — 85,

164. Kiick, D., Phillips, R. (1988). Mechanistic deductions from kinetic isotope effects and pH studies of pyridoxal phosphate — dependent carbon — carbon

lyases: Erwinia herbicola and Citrobacter freundii tyrosine phenol — lyase. Biochem. Vol. 27, P. 7333-7338.

165. Kumagai, H„ Yamada, H., Matsui, H., Ohkishi, H., Ogata, K. (1970). Tyrosine phenol — lyase. I. Purification, crystallization and properties. J. Biol. Chem. Vol. 245, P. 1767- 1772.

166. Kumagai, H., Kashina, N., Yamada, H., Enei, H., Okumura, S. (1972). Purification, crystallization and properties of tyrosine phenol — lyase from Erwinia herbicola. Agricul. Biol. Chem. Vol. 36, P. 472-482.

167. Фалеев, Н.Г., Садовникова, M.C., Антонова, Т.В., Демидкина, Т.В., Филина, Г,С., Беликов, В.М. Штамм бактерий Citrobacter intermedium — продуцент тирозин — фенол —лиазы. Авторское свидетельство N 1441780, Москва, 1989.

168. Демидкина, Т.В., Мягких, И. В., Фалеев, Н.Г., Беликов, В.М. (1984) Выделение и некоторые свойства тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter intermedius. Биохимия, Т. 49, С. 32 — 37.

169. Pletnev, S.V., Isupov, M.N., Dauter, Z.., Wilson, K.S., Faleev, N.G., Harutyunyan, E.H. and Demidkina, T.V. (1996). Purification and crystals of tyrosine phenol —lyase from Erwinia herbicola. Biochemistry and Molecular Biology International Vol. 38, P. 37-42.

170. Kumagai, H., Yamada, H„ Matsui, H., Ohkishi, H., Ogata, K. (1970). Tyrosine phenol — lyase. II. Cofactor requirement. J. Biol. Chem. Vol. 245, P. 1773 — 1777.

171. Казаков, B.K., Мягких, И.В., Тарусина, И.И., Демидкина, Т.В. (1987). Идентичность субьединиц тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter intermedius. Биохимия Т. 52, С. 11319- 1323.

172. Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V. (1987). Structural and catalytic properties of Citrobacter freundii tyrosine phenol — lyase. In: Biochemistry of Vitamine B6

( P. Christen and T. Corpela, eds) Birkhauser Verlag, Basel/ Switzerland, pp. 221-225.

173. Iwamori, S., Yoshino, S., Ishiwata, K„ Makiguchi, N. (1991). Cloning and sequencing of tyrosine phenol —lyase from Citrobacter intermedius. J. ferment. Bioeng. Vol. 72, P. 147-151.

174. Chen, H„ Gollnick, P., and Phillips, R.S. (1995). Site - directed mutagenesis of His343 —Ala in Citobacter freundii tyrosine phenol —lyase. Effects on the kinetic mechanism and rate — determining step. Eur. J. Biochem. Vol. 229, P. 540-549.

175. Фалеев, Н.Г., Рувинов С.Б., Бахмутов, В.И., С.Б., Демидкина, Т.В., Мягких, И.В. , Беликов, В.М. (1987), Субстратная специфичность тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter intermedius. Электронный и стерический контроль на стадии отщепления ароматического фрагмента. Мол. Биол. 21, 1636-1644.

176. Фалеев, Н.Г., Рувинов, С,Б,, Бахмутов, В,И., С.Б., Демидкина, Т.В., Мягких, И.В. , Беликов, В.М. (1988). Взаимодействие тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter intermedius с аминокислотами и их производными: фактроы, определяющие эффективность связывания. Мол. Биол. 22, 371 — 381.

177. Sundararaju, В., Antson, А. А , Phillips, R. S. Demidkina, Т. V., Barbolina, М. V. , Gollnick, P. Dodson, G. G., and Wilson, K. S. (1997) The crystal structure of Citrobacter freundii tyrosine phenol — lyase complexed with 3 — (4 — hydroxyphenyl)propionic acid, together with site — directed mutagenesis and kinetic analysis, demonstrates that Arginine —381 is required for substrate specificity. Biochemistry 36, 6502 — 6510.

178. Faleev, N.G., Ruvinov, S.B., Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V.r Gololobov, M.Yu., Bakhmutov, V.I., Belikov, V.M. (1987). The substrate specificity of tyrosine phenol —lyase during different stages of enzymatic process. In: Biochemistry of Vitamine B6 (P. Christen and T. Corpela, eds) Birkhauser Verlag, Basel/ Switzerland, pp.211-220.

179. Nagasawa, Т., Utagawa, Т., Goto, J., Kim G.J., Tani, Y,, Kumagai, H., Yamada. H. (1981) Synthesis of L —tyrosine related amino acids by tyrosine phenol — lyase of Citrobacter intermedius. Eur. J. Biochem. Vol. 117, P. 33 — 40.

180. Miles, E.W. (1986) in: Coenzymes and Cofactors (Dolphin, D., Poulson, R. and Avramovitch O., eds.), Wiley and Sons, New York Vol. 1, P. 253-310).

181. Toryata, Т., Nihira, Т., Fukui, S. (1976). Essential role of monovalen cations in the firm binding of pyridoxal — 5 — phosphate to tryptophanase and (3 — tyrosinase. Eur. J. Biochem. Vol. 69, P. 411-419.

182. Мягких И.В., Демидкина Т. В.(1985) Влияние моновалентных катионов на каталитические и спектральные свойства тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter intermedius. Мол. биол. Т, 19, С. 671—678.

183. Morozov, Yu.V., Almazov, V.P., Savin, F.A., Sukhareva, B.S. (1982) Experimental and theoretic investigation of the reaction mechanism of glutamate decarboxylase from E. coli. Studia Biophysica v. 89, p. 15— 122.

184. Демидкина, T.B., Мягких, И.В., Ажаев, А.В., Браунштейн, А.Е. (1986). Трансаминипование — побочная реакция, катализируемая тирозин — фенол—лиазой из Citrobacter intermedius. Мол. Биол. 20, 1053—1061.

185. Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V., Azayev, A.V. (1987), Transamination catalysed by tyrosine phenol —lyase from Citrobacter intermedius. Eur,J. Biochem. 170, 311-316.

186. Сухарева, Б.С., Браунштейн, А. Е. (1971). Исследование природы взаимодействия глутаматдекарбоксилазы Е. coli с субстратом и его аналогами. Мол. биол., Т. 5, С. 302 — 316.

187. Демидкина, Т.В., Мягких, И.В., Малашкевич, В.Н., Арутюнян, Э.Г. (1988). Кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование тирозин — фенол—лиазы из Citrobacter intermedius. Кристаллография 33, 1292-1293.

188. Demidkina, T.V., Myagkikh, I.V., Antson, A.A., Harutyunyan, E.G. (1988). Crystallization and crystal data on tyrosine phenol —lyase. FEBS Lett. 232, 381-382.

189. Шерман, М.Б., Антсон, A.A., Орлова. Е.В., Зограф, О.Н., Демидкина, Т.В. (1990). Электронная спектроскопия тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter intermedius. Докл, АН СССР 312, 1256- 1258.

190. Антсон, A.A., Строкорытов, Б.В., Муршудов, Г.Н., Демидкина, Т.В., Фогельман, Н.К., Пасхина, О.Г,, Хеннинг, М., Некрасов, Ю.В., Попов, А.Н., Рубинский, С.В., Арутюнян, Э.Г. (1992). Пространственная структура тирозин — фенол —лиазы с разрешением 4.5 А. Кристаллография 37, 82-89.

191. Palcic, М.М., Shen, S.J., Schleicher, Е., Kumagai, Н., Sawada, Н., Yamada, Н., and Floss, H.G. (1987). Stereochemistry and mechanism of reaction catalysed by tyrosine phenol —lyase from Escherichia intermedia. Z. Naturforch, Vol. 42c, P. 308-317.

192. Ivanov, V.l. and Karpeisky, M. Ya. (1969). Dynamic three — dimensional model for enzymatic transamination, Adv. Enzymol, Vol. 32, P. 21 — 53.

193. Arnone A., Christen P., Jansonius J.N., Mezler D.E. Hypothetical mechanism of action of aspartate aminotransferase. In Transaminases (Christen, P. and Mezler, D.E., eds) pp. 326 — 357, John Wiley and Sons, New York.

194. Закомырдина, Л.Н., Сахарова, И.С., Торчинский, Ю.М. (1988). Исследование взаимодействия триптофаназы с аналогами субстрата. Мол. биология, Т. 22, С. 187-194.

195. Toney M.D. and Kirsh J.F. (1987). J. Biol. Chem. Vol. 262, P. 12403- 12407.

196. Toney M.D. and Kirsh J.F. (1991). Biochem. Vol. 30, P. 7461-7466.

197. Chen, H.Y., Demidkina, T.V. and Phillips, R.S. (1995). Site - directed mutagenesis of tyrosine —70 to phenylalanine in Citrobacter freundii tyrosine phenol —lyase: evidence for dual roles of tyrosine —70 as a general acid catalyst in the reaction mechanism and in cofactor binding. Biochem. v. 34, p. 12276- 12283.

198. Westheimer F.H. (1995). Coincidences, decarboxylation and electrostatic effects. Tetrahedron, Vol. 51, 3-20.

199. Morino, Y. and Snell, E.E. (1970) Tryptophanase (Escherichia coli B). In: Methods Enzymol. v. 17A, p. 439-446.

200. Freidemann, T.F., Haugen, G.E. (1943). Pyrivic acid. II. The determination of keto acids in blood and urine. J. Biol. Chem. v. 147, p. 415 — 441.

201. Phillips, R.S. (1987). Reaction of О — acyl — L — serines with tryptophanase, tyrosine phenol —lyase and tryptophan synthase, Arch. Biochem. Biophys. v. 256, p. 302-310.

202. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265 — 275.

203. Peterson, E.A., Sober, H.A. (1971). Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of vitamin B6. J. Amer. Chem. Soc. v. 76, p. 169— 175.

204. Davis, B.J. (1964). Disc eletroforesis of proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121, 404-411.

205. Weber, K., Osborn, M. (1969) The reability of molecular weight determination by dodecyl sulfate — polyacrylamide gel electophoresis. J. Biol. Chem. 244, 4406-4412..

206. Versterberg,0., Wadstrom, T., Versterberg, K., Svensson, H. (1967), Studies of extracellular proteins from Staphylococcus aureus. I. Separation and characterization of enzyme and toxines by isoelectric focusing. Biocheim. et Biophys. Acta v. 133, p. 435-445.

207. Andrews, P. (1965). The gel — filtration behavior of proteins related to their molecular weights over a wide range. Biochem. J. v. 96, p. 595 — 606.

208. Klotz, I.M., Hunston, D.L. (1971). Properties of graphical representation of multiple classes of binding sites. Biochemistry v. 76, p. 169— 175.

209. Gray, W.R., Hartley, B.S. (1963). The structure of a chymotryptic peptide from Pseudomonas cytrochrome C —551. Biochem. J. v. 89, p. 379 — 380,

210. Woods, K.R., Wang, K.T. (967). Separation of dansyl —amino acids by polyamide layer chromatography. Biochim, Biophys. Acta v. 133, p. 369 — 370.

211. Ambler, R.P, (1972). Carboxypeptidase A and B. In: Methods in Enzymology v. 35, p. 262-272.

212. Spackman, D.H., Stein, W.H., Moore, S. (1958). Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Anal. Chem. v. 30, p. 1190 — 1206.

213. Simpson, R.J., Neuberger, N.R., Liu, T.Y. (1976). Complete amino acid analysis pf proteins from a single hydrolysate. J. Biol. Chem. v. 251, p. 1936— 1940.

214. Ingram, K. M. (1958). Separation of the peptides by electroforesis and chromatography. Biochim Biophys. v. Acta 28, p. 539 — 545.

215. Klapper, D.G., Wilde, C.E., and Capra, J.D. (1978). Automated amino acid sequence of small peptides utilazing polybrene. Anal. Biochem. 85, 126— 131.

216. Pisano, J.J., Bronzett, T.J., Brewer, H.B. (1972). Advances in the gas chromatographic analysis of amino acid pgenyl— and methylthiohydantoins. Anal. Biochem. v. 45, p. 43 — 59.

217. Friedman, M., Krull, L., Cavins, J.F. (1970). The chromatographic determination of cysteine and cystine residues in a protein as S — Э — (4 — pyridylethyl)cysteine, J. Biol. Chem. v. 245, p. 3868-3871.

218. Titani, K., Hermodson, M.A., Ericsson, L.H., Walsh, K.A., and Neurath, H. (1970). Amino acid sequence of thermolysine. I. Isolation and characterization of the fragments obtained by cleavage with cyanogen bromide. Biochemistry v. 11, p. 2427-2435.

219. Березин, И.В., Клесов, А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. Москва, Издательство МГУ, 1976, с. 45 — 49.

220. Уэбб, Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. Москва, Мир, 1966, с. 156- 194.

221. Kitz, R., Wilson, J.В. (1962). Esters of metanesulfonic acid as irreversible inhibitors of acetylcholinesterase. J. Biol. Chem. v. 237, p. 3245 — 3249,

222. Walker, A.C., Schmidt, C. L.A. (1994). Studies on histidase. Arch. Biochem. v. 5, p. 445-467.

223. Glasoe, P.V., Long, F.A. (1960). J. Phys. Chem. 64, 188-194.

224. Cleland, W.W. (1979). Statistical analysis of enzyme kinetic data. Methods Enzymol. v. 63, p. 103—138.

225. Zabarovsky, E.R. and Allikmets, R.L. (1986). An improved technique for the efficient cinstuction of gene libraries by partial fillin —in of cohesive ends. Gene 42, 119-123.

226. Sambruk, J,, Frisch, E.F., and Manniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor N.Y., Cold Spring Harbor Press, 1989.

227. Benton, W.D. and Davis, R.W. (1977). Screening A,gt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. Science v. 196, p. 180— 182.

228. Sanger, F.S., Niklen, S., and Maniatis, T. (1977). DNA sequiencing with chain — terminating inhibitors. Proc, Natl. Acad. Sei. USA v. 74, p. 5463 — 5467.

229. Kunkel, T.A. (1985). Rapid and efficient site — specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Sei. USA v. 82, p. 488-293.

230. Davis D.K., Segal D.M. (1971), Protein crystallization: microtechnniques involving vapor diffusion, Methods in Enzymology v. 22, p. 266 — 286.

231. Salemme F.R. (1972). A free interface diffusion technique for crystallization of proteins for X —ray crystallography. Arch. Biochem. Biophys, v. 151, p. 533 — 539.