Изучение функциональных свойств химозина теленка и его рекомбинантных форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Старовойтова, Виолетта Владимировна

• Старовойтова, Виолетта Владимировна
• кандидат химических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат химических наук Старовойтова, Виолетта Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ХИМОЗИНА ТЕЛЕНКА.

1.1 Первичная структура химозина. Изоформы фермента

1.2 Субстратная специфичность химозина

1.2.1 Расщепление белковых субстратов

1.2.2 Расщепление пептидных субстратов

1.3 Взаимодействие химозина с ингибиторами

1.4 Пространственная структура химозина

1.4.1 Общая характеристика пространственной структуры

1.4.2 Активный центр химозина

1.4.3 Связывание субстрата в активном центре фермента

1.4.4 Сравнение пространственной структуры химозина и других аспартатных протеиназ

1.5 Механизм действия аспартатных протеиназ

1.6 Сайт - специфический мутагенез химозина

1.7 Получение химозина с помощью рекомбинантных ДНК

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1 Выделение химозина и его рекомбинантных форм

2.2 Свойства химозина теленка и его рекомбинантных форм

2.2.1 Физико - химические характеристики ферментов

2.2.2 Гидролиз белковых субстратов: гемоглобина, бычьего сывороточного альбумина, казеината натрия

2.2.3 Гидролиз пептидных субстратов химозином теленка и его рекомбинантными формами

2.2.3.1 Флуорогенные субстраты химозина теленка

2.2.3.2 Компьютерное моделирование комплексов химозина теленка с флуорогенными субстратами

2.2.3.3 Гидролиз флуорогенных субстратов рекомбинантными химозинами

2.2.3.4 Гидролиз субстрата Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-ProNH2 химозином теленка, трансгенным химозином и химозином «Maxiren»

2.2.3.5 Ингибирование химозина теленка и его рекомбинантных форм пепстатином

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Методы исследования. Сорбенты

3.2 Выделение химозина теленка и его рекомбинантных форм

3.2.1 Выделение химозина теленка из препарата сычужного фермента

3.2.2 Выделение трансгенного химозина из молока трансгенных овец

3.2.3 Выделение рекомбинантного химозина из препарата «Махггеп»

3.3 Изучение свойств химозина теленка и его рекомбинантных форм

3.3.1 Определение рН-зависимости протеолитической активности по расщеплению гемоглобина

3.3.2 Определение рН-зависимости протеолитической активности трансгенного химозина по расщеплению бычьего Сывороточного альбумина

3.3.3 Активность ферментов по расщеплению казеината натрия

3.3.4 Определение тирозинового эквивалента

3.3.5 Определение зависимости устойчивости ферментов от рН

3.3.6 Определение зависимости активности ферментов от температуры

3.4 Изучение гидролиза пептидных субстратов химозином теленка и его рекомбинантными формами

3.4.1 Гидролиз флуорогенных субстратов

3.4.2 Определение начальных скоростей гидролиза субстратов

3.4.3 Определение зависимости начальных скоростей гидролиза субстратов от концентрации химозина

3.4.4 Влияние рН на начальные скорости гидролиза субстратов

3.4.5 Определение кинетических параметров гидролиза субстратов

3.4.6 Определение положения связи, расщепляемой химозином во флуорогенных субстратах

3.4. 7 Влияние ДМФА на расщепление химозином флуорогенных субстратов

3.4.8 Гидролиз флуорогенных субстратов рекомбинантными формами химозина

3.4.9 Гидролиз флуорогенных субстратов аспергиллопепсином

3.5. Гидролиз субстрата Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ue-ProNH2 химозином теленка, трансгенным химозином, химозином "Maxiren" 139 3.5 Ингибирование химозина теленка и его рекомбинантных форм пепстатином

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение функциональных свойств химозина теленка и его рекомбинантных форм»

Химозин (реннин) [ЕС 3. 4. 23. 4] - протеолитический фермент, относящийся к классу аспартатных протеиназ. В последнее время от названия реннин практически отказались, чтобы не вызывать путаницу с ренином -аспартатной протеиназой из почек, участвующей в регуляции кровяного давления. Подобно другим аспартатным протеиназам химозин синтезируется слизистой оболочкой желудка новорожденных млекопитающих в виде неактивного предшественника - прохимозина. В кислой среде происходит автокаталитическая активация, в результате которой от N-конца молекулы отщепляется активационный пептид, содержащий 42 аминокислотных остатка [1]

Первичная и пространственная структура химозина в настоящее время достаточно хорошо изучены. Первичная структура имеет высокую степень гомологии с первичной структурой других аспартатных протеиназ. Ферменты обладают одинаковой пространственной организацией, имеют аналогичный каталитический аппарат, близкую геометрию областей специфического связывания субстратов. Однако особенности структуры, влияющие на функциональные свойства химозина, которые отличаются от свойств других аспартатных протеиназ, в настоящее время не выявлены. Так, химозин, по сравнению с другими аспартатными протеиназами, имеет узкую субстратную специфичность. Фермент расщепляет белок молока к-казеин, преимущественно по связи Phel05-Metl06, вызывая нестабильность мицелл казеина, что приводит к образованию творожистого сгустка. Известные низкомолекулярные субстраты химозина большей частью являются фрагментами последовательности к-казеина или их аналогами. Синтез этих соединений и определение активности фермента по таким субстратам довольно сложны, поэтому необходимы новые субстраты химозина, позволяющие разработать удобные и чувствительные методы определения активности фермента.

Химозин используется в пищевой и медицинской промышленности. В последние годы в связи с недостатком сырья для получения сычужного фермента существует проблема поиска альтернативных источников химозина. Один из путей ее решения в использовании рекомбинантных форм фермента.

Физико -химические свойства рекомбинантного химозина до настоящего времени тщательно не изучались. Однако внедрение рекомбинантного фермента в качестве заменителя сычужного требует детального исследования его свойств в сравнеии со свойствами природного фермента. В связи с этим целью работы являлось:

1. Сравнительное изучение свойств химозина теленка со свойствами рекомбинантных ферментов различного происхождения: химозина из молока трансгенных овец и химозина, экспрессированного в дрожжах Kluyveromyces lactis.

2. Изучение гидролиза химозином теленка флуорогенных пептидных субстратов с внутримолекулярным тушением флуоресценции с целью использования их в качестве инструментов для исследования функциональных свойств фермента.

Мы разработали эффективную схему выделения химозина в гомогенном состоянии из препарата сычужного фермента, молока трансгенных овец, дрожжевых клеток, трансформированных кДНК фермента. По результатам электрофореза, определения аминокислотного состава, N-концевой последовательности и характеристикам гидролиза белковых субстратов трансгенный химозин и рекомбинантный химозин «Maxiren» идентичны химозину теленка. Определены кинетические характеристики гидролиза серии флуорогенных пептидных субстратов химозином теленка и его рекомбинантными формами. Методом компьютерного моделирования показана эффективность связывания флуорогенных субстратов в активном центре химозина теленка. Обнаружено, что рекомбинантные формы химозина отличаются от природного фермента действием на пептидные субстраты, отношению к ингибитору пепстатину, устойчивостью в зависимости от рН. Высказано предположение, что это связано с локальными конформационными изменениями в субстрат-связывающих участках рекомбинантных форм химозина.

Обзор литературы посвящен рассмотрению структуры и функциональных свойств химозина теленка.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Старовойтова, Виолетта Владимировна

выводы

1. Разработана эффективная схема выделения химозина в гомогенном состоянии из препарата сычужного фермента, молока трансгенных овец, дрожжевых клеток, трансформированных кДНК фермента.

2. По результатам электрофореза, определения аминокислотного состава, N-концевой последовательности и характеристикам гидролиза белковых субстратов показана идентичность трансгенного химозина и рекомбинантного химозина «Maxiren» химозину теленка.

3. Определены кинетические характеристики гидролиза серии флуорогенных пептидных субстратов с внутримолекулярным тушением флуоресценции химозином теленка и его рекомбинантными формами. Методом компьютерного моделирования показана эффективность связывания флуорогенных субстратов в активном центре химозина теленка.

4. Обнаружено, что рекомбинантные формы химозина теленка отличаются от природного фермента действием на пептидные субстраты, отношению к ингибитору пепстатину, устойчивостью в зависимости от рН. Высказано предположение, что это связано с локальными конформационными изменениями в субстрат-связывающих участках рекомбинантных форм химозина.

Заключение

Таким образом, с помощью аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе и ионообменной хроматографии на аминосилохроме С-80 выделены в гомогенном состоянии химозин теленка из препарата сычужного фермента, трансгенный химозин из молока трансгенных овец, рекомбинантный химозин "Maxiren" из дрожжей Kluyveromyces lactis. Предложенная нами для очистки химозина бацитрацин-сефароза оказалась эффективной для выделения химозина из различных источников. Результаты электрофореза в нативных и денатурирующих условиях, данные аминокислотного анализа, а в случае трансгенного химозина еще и N-концевая последовательность, свидетельствуют об идентичности трансгенного химозина и рекомбинантного химозина "Maxiren" химозину теленка. Активность рекомбинантных форм химозина по расщеплению таких белковых субстратов, как гемоглобин, бычий сывороточный альбумин, казеинат натрия и створаживанию молока не отличается от активности по этим субстратам природного химозина теленка.

Показано, что флуорогенные производные пептидов I-VI - достаточно эффективные субстраты химозина. Они имеют несложный аминокислотный состав, что значительно упрощает их синтез, хорошо растворимы в водных средах в присутствии небольшого количества органического растворителя (0.5% ДМФА), чем субстраты, содержащие Dns-группу в качестве флуорофора. Высокая чувствительность метода позволяет работать с низкими концентрациями субстратов. Благодаря этим преимуществами предложенные соединения могут быть использованы для определения активности химозина и структурно -функциональных исследований фермента.

С помощью компьютерного моделирования показано, что пептидная часть молекулы флуорогенных субстратов занимает в активном центре химозина положение, характерное для всех субстратоподобных ингибиторов аспартатных протеиназ и сохраняет стандартную сеть водородных связей с молекулой фермента. Остатки о-аминобензойной кислоты и динитрофенилэтилендиамина вносят свой вклад в связывание с ферментом.

Установлено, что трансгенный химозин и химозин "Maxiren" отличаются от химозина теленка по своему действию на низкомолекулярные субстраты: флуорогенные производные пептидов I-VI и фрагмент к-казеина - гептапептид

LeuSerPheMetAlalleProNHa, в то время как не наблюдается различий по высокомолекулярным субстратам. Рекомбинантные формы химозина гидролизуют пептиды на порядок медленнее (по соотношению величин kcat/Km) природного фермента. Возможно, это связано с локальными конформационными изменениями в участках связывания субстрата в рекомбинантных формах химозина, которые происходят при формировании пространственной структуры фермента в условиях, отличных от природных. Это предположение подтверждается отношением трансгенного химозина и химозина "Maxiren" к ингибитору пепстатину. Так, медленное ингибирование рекомбинантных форм химозина, вероятно, связано с непрочным связыванием пепстатина в субстратсвязывающей зоне фермента. Полученные результаты по устойчивости ферментов подтверждают наше предположение.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1 Методы исследования. Сорбенты.

Бацитрацин-сефарозу синтезировали по методу Степанова и сотр.[125]. Содержание лиганда в сорбенте составляло 6,8 мкмоль/мл.

Аминосилохром С-80 получен в НПО "Биолар" (г. Олайне, Латвия) и содержал 100 мкмоль аминогрупп на 1 г вещества.

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях проводили по методу [126]. Готовили следующие растворы: А, 4 М р-аланин, рН 5.4 устанавливали 12 М НС1; раствор В, 0.31 М Р-аланин, рН 4.8 устанавливали 1 М НС1; раствор С состоял из 30% акриламида и 1.5% N, N' -метиленбисакриламида. Разделяющий гель готовили смешиванием 24 мл раствора С, 15 мл раствора А, 17 мл дистиллированной воды, 4 мл 10% раствора персульфата аммония и 40 мкл ТЕМЕДа. Для приготовления концентрирующего геля смешивали 1.8 мл раствора С, 3 мл раствора В, 7.2 мл дистиллированной воды, 30 мкл 10% раствора персульфата аммония и 6 мкл ТЕМЕДа. Верхний электродный буфер состоял из 40 мМ какодиловой кислоты и 50 мМ р-аланина, рН 5.4 устанавливали добавлением 0.2М NaOH. Нижний электродный буфер представлял собой 60 мМ раствор р-аланина, для установления рН 5.4 добавляли 50 мМ НС1. В каждую дорожку вносили 10-40 мкг белка, растворенного в буфере, содержащем 40мМ какодиловую кислоту и 50мМ Р-аланин. Силу тока поддерживали 40 мА при напряжении 200-250 В. В качестве лидирующего красителя использовали бромфеноловывй синий. Продолжительность электрофореза 4 часа. После электрофореза белковые зоны фиксировали 5% раствором трихлоруксусной кислоты в течение 15 минут, затем промывали водой и проявляли 0.15% раствором кумасси ярко-голубого R-250, содержащего СН3СООН, С2Н5ОН, Н20 в соотношении по объему 10:30:60 и 24 мг CUSO4, в течение 1 часа. Фон отмывали 7% раствором уксусной кислоты.

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии Ds-Na проводили по методу Лэммли [127]. Для приготовления образцов к 1 мл раствора фермента с концентрацией 1 мг/мл добавляли 250 мкл 35% трихлоруксусной кислоты при 4° С. Через 2 часа осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 1 мл буфера для образцов, содержащего 0.01М дитиотриэтол, 1% додецилсульфата натрия, 8М мочевину, бромфеноловый синий, сахарозу. Образцы кипятили в течение 5 минут и вносили 10-25 мкг белка в каждую дорожку. В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор стандартов фирмы «Promega», содержащий следующие белки: фосфорилазу Б (97.4 кДа), бычий сывороточный альбумин (66.2 кДа), глутаматдегидрогеназу (55 кДа), овальбумин (42.7 кДа), альдолазу (40 кДа), карбоангидразу (31 кДа), ингибитор трипсина из сои (21.5кДа). Для определения молекулярной массы строили калибровочную кривую зависимости относительной подвижности белка от логарифма молекулярной массы.

Определение аминокислотного состава ферментов. Ферменты гидролизовали 5,7 М НС1 при 105 0 в вакуумированных ампулах в течение 48 ч. Для определения полуцистина белок предварительно окисляли надмуравьиной кислотой по методу Мура [128]. Гидролизаты исследовали на аминокислотном анализаторе Hitachi-835 (Япония).

Аминоконцевую последовательность трансгенного химозина определяли по методу Эдмана на белковом секвенаторе модели 816 фирмы "Knauer" (Германия), снабженном анализатором ФТГ-аминокислот модели 120А ("Applied Biosystems", США), в Институте молекулярной биологии РАН.

Молокоствораживающую активность определяли по методу [129]. К 3 мл 0,5%-ного раствора сухого обезжиренного молока в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,6, и в 0,03 М СаС12, предварительно прогретого при 37° в течение 3 мин, прибавляли такое количество раствора химозина, которое соответствовало 1 мкг фермента, перемешивали и выдерживали в водяной бане при 37°, периодически перемешивая стеклянной палочкой. Отмечали по секундомеру время появления хлопьев. Удельную активность (е.а./о.е.) рассчитывали по формуле:

1000/ ^280 Vt, где ^280 - оптическая плотность исследуемого раствора фермента при 280 нм; V - объем добавляемого раствора фермента мл; t - время створаживания, с.

3.2 Выделение химозина теленка и его рекомбинантных форм

3.2.1 Выделение химозина теленка из препарата сычужного фермента

5 г препарата сычужного фермента (ОАО "Московский завод сычужного фермента", Россия) перемешивали в 50 мл ОДМ Na-ацетатного буфера, рН 5,4, 2 ч. Полученную суспензию диализовали против ОДМ Na-ацетатного буфера, рН 5,4, и центрифугировали 30 мин (15000 об/мин, 4°). Супернатант (60 мл) наносили на колонку с 20 мл бацитрацин-сефарозы, уравновешенную 0,1М Na-ацетатным буфером, рН 5,4. Колонку промывали ОДМ Na-ацетатным буфером, рН 5,4, и 1 М NaCl в ОДМ Na-ацетатном буфере, рН 5,4, до ^280 ^ ОД в элюате. Фермент элюировали 10 %-ным и 20 %-ным раствором изопропилового спирта в 1М NaCl в ОДМ Na-ацетатном буфере, рН 5,4. За ходом хроматографии следили по изменению оптической плотности при 280 нм и активности по створаживанию молока. Фракцию химозина, десорбированную 10 %-ным раствором изопропилового спирта в 1М NaCl в ОДМ Na-ацетатном буфере, рН 5,4, обессоливали на сефадексе G-50 (грубом), урановешенном ОДМ Na-ацетатным буфером, рН 5,4, и наносили на колонку с аминосилохромом С-80, уравновешенную ОДМ Na-ацетатным буфером, рН 5,4. Химозин элюировали 0,005 М НС1. Пепсин быка элюировали 0,05 М НС1. После ионообменной хроматографии фракция химозина имела рН 3,5. Добавлением 4М Na-ацетатного буфера устанавливали рН 5,4. Раствор фермента обессоливали на сефадексе G-50 (грубом), уравновешенном водой, и лиофилизовали.

3.2.2 Выделение трансгенного химозина из молока трансгенных овец

Препарат молокоствораживающего фермента из молока трансгенных овец был предоставлен Биотехнологическим центром РАСХН. Для его получения свежее или размороженное молоко трансгенных овец разбавляли водой при комнатной температуре из расчета 4 л воды на 1 л молока. Добавлением концентрированной соляной кислоты рН цельного молока понижали от 6,5-6,7 до 4,5 и через 10-15 мин отделяли выпавший в осадок казеин. Концентрированной соляной кислотой устанавливали рН сыворотки 1,7 и добавляли поваренную соль "Экстра" тонкого помола из расчета 250 г соли на

1 л сыворотки. Тщательно и медленно перемешивали смесь до полного растворения соли. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Полученную пастообразную массу сушили лиофильно. Из 1 л молока получали 50 г ферментной массы.

30 г препарата молокоствораживающего фермента из молока трансгенных овец перемешивали 3 ч с 300 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, рН 5,4, при комнатной температуре и диализовали против того же буфера (4°) для удаления соли, несколько раз производя замену буфера. Суспензию центрифугировали (15 000 об/мин, 4°, 30 мин), при этом отделялся осадок. Однако полученный супернатант даже после фильтрования представлял суспензию, которую наносили на колонку с 40 мл аминосилохрома, уравновешенную 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,4. Колонку промывали 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,4. За ходом хроматографии следили, измеряя активность по створаживанию молока. Фракция, не задержанная колонкой, и промывные воды не содержали фермента, обладающего молокоствораживающей активностью. Фермент элюировали 5 мМ НС1. Полученный раствор фермента имел рН 3,5. Добавлением 4 М Na-ацетатного буфера устанавливали рН 5,4. Раствор фермента обессоливали на Сефадексе G-25 (грубом), уравновешенном 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,4. Для дальнейшей очистки использовали аффинную хроматографию на бацитрацин-сефарозе. Раствор фермента в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 5,4, полученный после обессоливания на Сефадексе G-25, наносили на колонку с бацитрацин-сефарозой, уравновешенную 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,4. Колонку промывали 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,4, до Агso ^ 0,1, затем 1 М раствором NaCl в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 5,4. Фракции, не задержанные колонкой и элюат 1 М NaCl в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 5,4, не содержали фермента, обладающего молокоствораживающей активностью. Активный фермент элюировали 10%-ным раствором изопропилового спирта в 1 М растворе NaCl в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 5,4, обессоливали на Сефадексе G-25 (грубом), уравновешенном водой и лиофилизовали.

3.2.3 Выделение рекомбинантного химозина из препарата «Maxiren»

1 г препарата «Maxiren» (фирма «Gist-brocades», Нидерланды) перемешивали в 5 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, рН 5,4, 2 часа. Полученную суспензию диализовали против 0,1 М Na-ацетатного буфера, рН 5,4 и центрифугировали 30 мин (15000 об/мин, 4°С). Супернатант (9.5 мл) наносили на колонку с 5 мл бацитрацин-сефарозы, уравновешенную 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,4. Колонку промывали 0,1М Na-ацетатным буфером, рН 5,4, и 1 М NaCl в 0,1М Na-ацетатном буфере, рН 5,4, до Ajw < 0,1 в элюате. Фермент элюировали 10 %-ным и 20 %-ным раствором изопропилового спирта в 1М NaCl в 0,1М Na-ацетатном буфере, рН 5,4. Фракцию химозина, десорбированную 10 %-ным раствором изопропилового спирта в 1М NaCl в ОДМ Na-ацетатном буфере, рН 5,4, обессоливали на сефадексе G-50 (грубом), урановешенном водой, и лиофилизовали.

3.3 Изучение свойств химозина теленка и его рекомбинантных форм

3.3.1 Определение рН-зависимости протеолитической активности по расщеплению гемоглобина (рис. 16, табл. 18).

Использовали растворы: 0,06 М НС1, рН 1,3; 0,2 М Na-цитратный буфер, рН 2,6;3,0;3,6; 0,2 М Na-ацетатный буфер, рН 4,0;4,6;5,0. Готовили 2%-ный раствор гемоглобина (препарат фирмы "Реахим") в 0,06 М НС1, рН 1,3, выдерживали при 20° в течение 15 мин и устанавливали рН 3,5 добавлением 2 М раствора КОН. Раствор гемоглобина разливали в пробирки по 1 мл и прибавляли по 3 мл буфера с соответствующим значением рН. Пробирки термостатировали при 37° в течение 5 мин, прибавляли по 0,1 мл раствора фермента в воде, рН 5,6, ^280 = 0,34. Растворы инкубировали в течение 10 мин при 37° и останавливали реакцию добавлением 5 мл 5%-ного раствора ТХУ. Отфильтровывали выпавший осадок через бумажный фильтр Filtrak-89 и определяли в фильтрате оптическую плотность при 280 нм. В контрольном опыте к 1 мл раствора гемоглобина добавляли 3 мл буфера с соответствующим рН. После инкубации в течение 10 мин при 37° добавляли 5 мл 5% ТХУ, затем 0,1 мл раствора фермента, фильтровали и измеряли оптическую плотность. Контрольный опыт проводили для каждого значения рН. Для каждого исследуемого раствора белка проводили два параллельных определения активности, брали среднее значение. Строили график зависимости А-Ак от рН. Удельную активность рассчитывали по формуле: уд = ^280 - Ак / А280 (Ф) X V, где A2so, Ак и ^280 (ф) - оптические плотности при 280 нм фильтрата, контрольного раствора и раствора фермента соответственно; V - объем добавляемого раствора фермента, мл.

За единицу активности принимали количество фермента, которое в приведенных выше условиях расщепляет такое количество гемоглобина, что оптическая плотность при 280 нм гидролизата после осаждения ТХУ равняется единице.

3.3.2 Определение рН-зависимости протеолитической активности трансгенного химозина по расщеплению бычьего сывороточного альбумина рис. 17, табл. 18)

Использовали 0,2 М Na-цитратный буфер, рН 2,6;3,0;3,6 и 0,2 М Na-ацетатный буфер, рН 4,0;4,6;5,0. 600 мг бычьего сывороточного альбумина (препарат фирмы "Serva", Германия) растворяли в 30 мл воды. Раствор альбумина разливали в пробирки по 1 мл и прибавляли 3 мл буфера с соответствующим значением рН. Пробирки термостатировали при 37° в течение 5 мин. Прибавляли по 0,1 мл раствора фермента с концентрацией 1 мг/мл в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,4. Раствор инкубировали в течение 1 ч при 37° и останавливали реакцию прибавлением 5 мл 10%-ного раствора ТХУ. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. В фильтрате определяли оптическую плотность при 280 нм. В контрольном опыте к 1 мл раствора альбумина добавляли 3 мл буфера с соответствущим значением рН. После инкубации в течение 1 ч при 37° добавляли 5 мл 10% ТХУ, затем 0,1 мл раствора фермента, осадок отделяли центрифугированием и измеряли оптическую плотность. Контрольный опыт проводили для каждого значения рН. Строили график зависимости А-Ак от рН. Удельную активность химозина по бычьему сывороточному альбумину рассчитывали также как по гемоглобину.

3.3.3 Активность ферментов по расщеплению казеината натрия (табл. 18)

1% -ный раствор казеината натрия готовили растворением на водяной бане (70°-80°С) при перемешивании в течение 1 часа 500 мг казеината натрия в 50 мл 0.1 М ацетатного буфера, рН 5,7. Добавлением 0.1 М раствора СН3СООН устанавливали рН 5,7 полученного раствора и доводили его объем до 50 мл. 2 мл 1%-ного раствора казеината натрия в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,7, термостатировали при 37° в течение 10 мин и добавляли раствор фермента, содержавший 10 мкг химозина. Через 1 ч реакцию останавливали добавлением 4 мл 5% ного раствора ТХУ. В контрольном опыте 0,1 мл раствора фермента инкубировали при 37° в течение 10 мин и прибавляли 4 мл 5%-ного раствора ТХУ. Через 1 ч в контрольные пробирки добавляли 2 мл 1% раствора казеината натрия. Осадок отфильтровывали, 1 мл фильтрата добавляли к 5 мл 0,5 М раствора ЫагСОз и к этому раствору добавляли 1 мл разбавленного в 3 раза реактива Фолина [130], тщательно перемешивали. Выдерживали при комнатной температуре 20 мин и измеряли оптическую плотность при 670 нм. Удельную активность рассчитывали по формуле: уд=(Авю - Ак)6,1 / ТЭ t с, где A(,jq и Ак - величины поглощения в опыте и контроле, ТЭ - тирозиновый эквивалент, мл / мкмоль; t - время ферментативной реакции, мин; с -концентрация раствора химозина в пробе, мкг/мл. Значение тирозинового эквивалента определяли как Авю раствора тирозина с концентрацией 1 мкмоль/мл.

3.3.4 Определение тирозинового эквивалента

Готовили 1 мМ раствор тирозина в 0.2М НС1. Из этого исходного раствора разбавлением 0.2М НС1 получали растворы тирозина с концентрациями 0.02, 0.04, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3 мкмоль/мл. К 1 мл раствора тирозина каждой концентрации добавляли при постоянном перемешивании 5 мл 0.5 М раствора Na 2СО3 и 1 мл разбавленного в 3 раза реактива Фолина. В контрольном опыте вместо 1 мл раствора тирозина добавляли 1 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Затем измеряли интенсивность окраски при 670 нм. По полученным данным строили линейную зависимость Аш - Л к от концентрации раствора тирозина (рис. 27). Тирозиновый эквивалент (ТЭ) - это А 670 раствора тирозина с концентрацией 1 мкмоль/мл. Для определения ТЭ находили значение Ав7о раствора тирозина с концентрацией 0.01 мкмоль/мл и вычисляли ТЭ как Л67о/0.01 мкмоль/мл. концентрация тирозина, мкмоль/мл

Рис. 27. Определение тирозинового эквивалента. По оси Y отложена оптическая плотность раствора тирозина Аб7о - Ак при 670 нм.

3.3.5 Определение зависимости устойчивости ферментов от рН (рис. 12,13,14)

К 0,9 мл буфера, рН 2,0;2,6;3,0;3,6 (0,2 М Na-цитратный буфер), 4,0;4,6;5,0;5,6 (0,2 М Na-ацетатный буфер), 6,0;6,6;7,0 (0,2 М Ыа-фосфатный буфер) прибавляли 0,1 мл раствора фермента (1 мг/мл) в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 5,4. Растворы инкубировали при 37°. Отбирали пробы по 0,01 мл и определяли удельную активность по створаживанию молока непосредственно после добавления фермента и через 24 и 48 ч инкубации при 37°.

3.3.6 Определение зависимости активности ферментов от температуры рис.15)

Раствор фермента с концентрацией 50 мкг/мл в 0.1 М ацетатном буфере, рН 5.6, инкубировали 15 минут при 28°, 37°, 40°, 50°, 60° С. После этого определяли молокоствораживающую активность фермента при 37° С.

3.4. Изучение гидролиза пептидных субстратов химозином теленка и его рекомбинантными формами

3.4.1 Гидролиз флуорогенных субстратов

Флуорогенные субстраты AbzAlaAlaPhePheAlaAlaDed, AbzAlaAlaPhe-PheAlaAlapNA, AbzAlaPhePheAlaAlaDed, AbzAlaAlaPhePheAlaDed, AbzAla-AlaPhePheDed, AbzAlaAlaPhePhepNA синтезированы ранее в нашей лаборатории И.Ю. Филипповой, Е.Н. Лысогорской, Е.С. Оксенойт [131]. Измерения флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 (Япония).

3.4.2 Определение начальных скоростей гидролиза субстратов

2 мл раствора субстрата в 0,1М ацетатном буфере, рН 3.6, содержащем 0,5% диметилформамида (ДМФА), помещали в термостатированную (22°) кювету и измеряли начальную интенсивность флуоресценции. Затем включали самописец, добавляли 50 мкл раствора фермента, быстро перемешивали и регистрировали изменение флуоресценции в зависимости от времени. Время реакции, за которое происходит изменение флуоресценции, соответствующее гидролизу 10-20% субстрата, составляет 2-3 мин. Для измерения флуоресценции раствора субстрата при полном гидролизе его ферментом 2 мл раствора субстрата инкубировали 24 ч с избытком фермента при 37°. Интенсивность флуоресценции измеряли при X Возб = 315 нм и X исп — 420 нм. Начальную скорость гидролиза вычисляли по формуле:

V0 = It[S]/(I-Io)t, где V() - начальная скорость гидролиза, мкМ/мин; [5] - концентрация субстрата, мкМ; I - флуоресценция при полном гидролизе субстрата ферментом; /0 -начальная флуоресценция субстрата; /t - флуоресценция раствора субстрата спустя время t после добавления фермента; t - время гидролиза мин.

3.4.3 Определение зависимости начальных скоростей гидролиза субстратов от концентрации химозина (рис. 19)

Использовали 5 мкМ раствор субстрата в 0,1М ацетатном буфере, рН 4,0, содержащий 0,5% ДМФА. Растворы химозина с концентрацией 5; 10; 20; 25; 50; 100 мкг/мл в 0,1М ацетатном буфере, рН 5,2, готовили путем разбавления раствора фермента с концентрацией 1 мг/мл.

3.4.4 Влияние рН на начальные скорости гидролиза субстратов (рис. 20)

Для изучения рН - зависимости скорости гидролиза субстратов использовали 5 мкМ растворы субстратов в ОДМ ацетатном буфере, рН 2,5-5,5, содержащие 0,5% ДМФА. Были выбраны концентрации химозина 7 нМ для субстрата (I), 14 нМ для всех остальных субстратов. Определяли начальные скорости ферментативных реакций при различных рН и строили зависимость V0 от рН.

3.4.5 Определение кинетических параметров гидролиза субстратов (рис. 21,

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Старовойтова, Виолетта Владимировна, 2001 год

1. Pedersen V.B., Foltmann В., 1.vestigations on the activation of bovine prochymosin, Eur.J. Biochem., 1979, v. 94, pp.573-580

2. Andren A., Production of prochymosin, pepsinogen and progastricsin, and their cellular and intracellular localization in bovine abomasal mucosa, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1992, v. 52 (Suppl. 210), pp.65-70.

3. Houen G., Madsan M., Harlow K.W., Lonblad P., Foltmann В., The primary structure and enzymic properties of porcine prochymosin and chymosin, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 1996, v.28, pp.667-675.

4. Pungercar J., Strukelj В., Gubensek F., Complete primary structure of lamb preprochymosin deduced from cDNA, Nucleic Acids Research, 1990, v. 18, pp. 4602.

5. Ord T, Kolmer M., Villems R., Saarma M., Structure of the human genomic region to the bovine prochymosin-encoding gene, Gene, 1990, v.91, pp. 241-246.

6. Foltmann В., A Review on Prorennin and Rennin, Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 1966, v. 35, pp. 143-231.

7. Foltmann В., Chymosin: A short review on foetal and neonatal gastric proteases, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1992, v. 52 (Suppl. 210), pp.65-70.

8. Danley D.E., Geoghegan K.F., Structure and Mechanism of Recombinant-derived Chymosin C, J. Biol. Chem., 1988, v. 263, pp. 9785-9

9. Donelly W.J., Carroll D.P., O'Callaghan D.M., Walls D., Genetic polymorphism of bovine chymosin, J. Dairy Res., 1986, v.53, pp.657-64

10. Asato N., Rand A.G., Biochem. J., 1972, v. 129, pp.841-846.

11. Н.Степанов B.M., Лавренова Г.И., Адли К., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Неоднозначность активации прохимозина и множественные формы химозина теленка, Биоорган, химия, 1977, т.З, №5, сс.673-675.

12. Степанов В.М., Лавренова Г.И., Адли К., Гончар М.В., Баландина Г.Н., Славинская М.М., Стронгин А.Я., Биоспецифическая хроматография химозина, Биохимия, 1976, т.41, вып.2, сс. 294-303.

13. Foltmann В., Pedersen V.B., Kauffman D., Wybrandt G., The Primary Structure of Calf Chymosin, J. Biol. Chem., 1979, v. 254, N 17, pp 8447-8456.

14. Tang J., Sepulveda P., Marciniszyn J., Amino-acid sequence of porcine pepsin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, v.70, pp. 3437-9.

15. Foltmann В., Redersen V.B., Jacobsen H., Kauffman D., Wybrandt G., The complete amino acid sequence of prochymosin, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 1977, v.74, pp. 2321-4

16. Hsu I.N., Delbaere L.T.J., James M.N.G., Hofmann Т., Nature, 1977, v.266, pp.140-145.

17. Foltmann В., Pedersen v.B., Comparison of the primary structures of acidic proteinases and of their zymogens, Conference on acidic proteinases, Oklahoma Med. Research Found., USA, 1976.

18. Hidaka M., Sasaki K., Uozumi Т., Beppu Т., Cloning and structural analysis of the calf prochymosin gene, Gene, 1986, v. 43, pp.197-203.

19. Berridge N.J., The purification and crystallization of rennin, Biochem. J., 1945, v. 39, pp. 179-186

20. Foltmann В., Studies on rennin: On the limited proteolysis of A-rennin and the proteolytic activity of chromatographically purified fractions of rennin, Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 1964, v. 34, pp. 319-325

21. Foltmann В., Studies on Rennin. On the Crystallization, Stability and Proteolytic Activity of Rennin, Acta Chem. Scand., 1959, v.B, pp. 1927-1935

22. Forster J.F., Plasma albumin, in The Plasma Proteins. Edited by F.W. Putnam, Prot Acad. Press, New York, 1960, V. 1, pp. 179-239

23. Fish J.C., Activity and specificity of rennin, Nature, 1957, v. 180, p.345

24. Bang Jensen V., Foltmann В., Rombauts W., Studies on Rennin. On the Proteolytic Specificity of Rennin, Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 1964, v. 34, N 13, pp. 327-343.

25. Nedjar S.,Humbert G., Deaut J.Y., Linden G., Specificity of chymosin on immobilized bovine B-chain insulin, Int. J. Biochem., 1991, v.23, №3, pp.377-381.

26. Sanger F., Tuppy H., The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 2. The investigation of peptides from enzymic hydrolysates, Biochem. J., 1951, v.49, pp. 481-490

27. Степанов B.M., Лавренова Г.И., Адли К., Гончар М.В., Баландина Г.Н., Славинская М.М., Стронгин А.Я., Биоспецифическая хроматография химозина, Биохимия, 1976, т.41, вып.2, сс. 294-303.

28. Visser S., Proteolytic enzymes and their action on milk proteins, Netherlands Milk and Dairy Journal, 1981, v.35, pp.65-88

29. Coolbear K.P., Elgar D.F., Coolbear Т., Ayers J.S., Comparative study of methods for the isolation and purification of bovine к casein and its hydrolysis by chymosin, J. Dairy Res., 1996, v. 63, pp. 61-71

30. McSweeney P.L.H., Olson N.F., Fox P.F., Healy A., Hojrup P., Proteolytic specificity of chymosin on bovine asi casein, J. of Dairy Res., 1993, v. 60, pp. 401412

31. Visser S., Slangen K.J., On the specificity of chymosin (rennin) in its action on bovine P-casein, Netherlands Milk and Dairy J., 1977, v.31, pp.16-30

32. Guillou H., Miranda G., and Pelissier J-P., Hydrolysis of (3 casein by gastric proteases, Int. J. Peptide Protein Res., 1991, v 37, pp. 494-501.

33. Carles C., and Dumas B.R., Kinetic of the actionof chymosin (rennin) on a peptide bond of bovine asi. Comparison of the behaviour of this substrate with that of P and к-caseins, FEBS Lett., 1985, v. 185, №2, pp.282-286

34. Visser S., van Roojien P.J., Schattenkerk C., Kerling K., Peptide substrates for chymosin (rennin). Kinetic studies with bovine k-casein-(103-108)-hexappeptide analogues., Biochim. Biophys. Acta., 1977, v.481, pp.171-176

35. Hill R.J., Wake S., The action of rennin on casein: the effect of modifying functional groups on the rennin, Nature, 1969, v.22, pp.635-641

36. Blundel Т., Sibanda B.L., Pearl L., Three-dimensional structure, specificity and catalytic mechanism of renin, Nature, 1983, v. 304, pp.273-274

37. Серкина А.В., Сравнительная характеристика гидролиза белковых и пептидных субстратов химозином и пепсином, Дипл. Работа, Москва, 1994.

38. Schattenkerk C., Voskuyl-Holtkamp I., and Bokhorst R., Polypeptides. XIV. Synthesis of possible rennin substrates, Recl.Trav.Chim.Pays-Bas, 1973, v.92, pp.92116

39. Raymond M.-N.,Gamier J., Bricas E., Cilianu S., Blasnic M., Chaix A., Lefrancier P., Specificity of chymosin (rennin). I. Kinetic parameters of the hydrolysis of synthetic oligopeptide substrates, Biochimie, 1972, v. 54, pp.145-154

40. Raymond M.-N., 1977, Thesis, University of Paris-Sud, Orsay, France

41. Dunn B.M., Kay J., Design, synthesis and analysis of new synthetic substrates for the aspartic proteinases., Biochem. Soc. Trans., 1985, v.13, pp. 1041-1043.

42. Dunn B.M., Jimenez M., Parten B.F., Valler M.J., Rolph C.E., Kay J., A systematic series of synthetic chromophoric substrates for aspartic proteinases., Biochem. J., 1986, v.237, pp. 899-906

43. Литвинова О.В., Баландина Т.Н., Новые хромофорные субстраты аспартильных протеиназ., Биоорган, химия, 1999, т.25, №8, сс.581-583

44. Yonezawa Н., Uchikoba Т., Kaneda М., Izumiya N., Sensitive fluorometric assay for the activity of chymosin, Int. J. Peptide Protein Res., 1996, v. 47, pp. 56-61

45. Takahashi K., Mizobe F., Chang W.-J., Inactivation of acid proteases from Rhizopus chinensis, Aspergillus saitoi and Mucor pusillus, and calf rennin by diazoacetylnorleucine methyl ester, J.Biochem., 1972, v.71, pp.161-164

46. Chang W.-J., Takahashi K., The Structure and Function of Acid Proteases. Inactivation of Bovine Rennin by Acid Protease-Specific Inhibitors, J.Biochem., 1973, v.74, pp.231-237

47. Stepanov V.M., Lobareva L.S., Mal'tsev N.J., Coloured inhibitors of pepsin, Biochim. Biophys. Acta, 1968, v.151, p.719

48. Rajagopalan T.G., Stein W.H., Moore S., The Inactivation of Pepsin by Diazoacetylnorleucine Methyl Ester, J. Biol. Chem., 1966, v.241, p.4295

49. Hunkapille M., Heinze J.E., Mills J.N., Comparative studies of the effect of specific inacivators on human gastricsin and pepsin, Biochemistry, 1970, v.9, p.2897

50. Lundblad R.L., Stein W.H., On the reaction of diazoacetyl compounds with pepsin, J. Biol.Chem., 1969, v.244, p. 154.

51. Tang J., Specific and Irreversible Inactivation of Pepsin by Substrate-like Epoxides, J. Biol.Chem., 1971, v.246, pp.4510-4517.

52. Takahashi K., Chang W.-J., Specific Chemical Modifications of Acid Proteases in the Presence and Absence of Pepstatin, J.Biochem., 1973, v.73, pp.675-677.

53. Hartsuck J. A., Tang J., The carboxylate ion in the active center of pepsin, J. Biol. Chem., 1972, v.247, p.2575.

54. Bott R., Subramanian E., Davies D.R., Three-Dimensional Structure of the Complex of the Rhizopus chinensis Carboxyl Proteinases and Pepstatin at 2.5 A0 Resolution., Biochemistry, 1982, v.21, pp.6956-6962.

55. Fujinaga M., Chernaia M.M., Tarasova N.I., Mosimann S.C., James M.N.G., Crystal structure of human pepsin and its complex with pepstatin, Protein Science, 1995, v.4, pp.960-972.

56. Huang W.-J., Tang J., Modification of an argynil residue in pepsin by 2,3 -butanedione, J.Biol.Chem., 1972, v.247, pp.2704-2710.

57. Hill R.D., Laing R.R., Specific reaction of dansyl chloride with one lysine residue inrennin, Biochim. Biophys. Acta, 1967, v.132, p,188

58. Cheeseman G.C., Effects of some protein modifying agents on the properties of rennin, J.Dairy Res., 1969, v.36, pp.299-312

59. Tarasova N.I., Lavrenova G.I., Stepanov V.M., a-Bromo-4-amino-3-nitroacetophenone, a new reagent for protein modification. Modification of methionine-290 residue of porcine pepsin, Biochem. J.,1980, v.187, №2, pp.345353.

60. Bunn C.W., CamermanN., Phil. Trans. Roy. Soc. London, 1970, v. B257, p. 153

61. Сафро М.Г., Андреева H.C., Докл. Акад. Наук СССР, 1976, т. 229, с. 607

62. Сафро М.Г., Андреева Н.С., Жданов А.С., Рентгеноструктурные исследования химозина. I. Молекулярное замещение при разрешении 3 А0, Молекуляр. Биология, 1985, т. 19, сс. 400-405

63. Newman М., Safro М., Frazao С., Khan G., Zdanov A., Tickle J., Blundell Т., Andreeva N., X-ray Analyses of Aspartic Proteinases IV. Stucture and Refinement at 2.2 A0 Resolution of Bovine Chymosin, J. Mol. Biol., 1991, v. 221, pp. 1295-1309

64. Gilliland G.L., Winborn E.L., Nachman J., Wlodawer A., The Three-Dimensional Structure of Recombinant Bovine Chymosin at 2.3 A0 Resolution, Proteins: Structure, Function and Genetics, 1990, v. 8, pp. 82-101.

65. Andreeva N.S., Zdanov A.S., Gustchina A.E., Fedorov A.A., J. Biol. Chem., 1984, v. 259, pp. 11353-11365

66. Gilliland G.L., Oliva M.T., Dill J., Functional implications of the three-dimensional structure of bovine chymosin, Adv. Exp. Med. Biol., 1991, v. 306, pp. 23-37.

67. Andreeva N., Dill J., and Gilliland G.L., Can Enzymes Adopt a Self-Inhibited form? Results of X-ray Crystallographic Studies of Chymosin, Biochem. Biophys. Res. Commun, 1992, v. 184, pp. 1074-1081

68. Кашпаров И.В., Попов M.E., Андреева H.C., О роли молекул воды, занимающих консервативные положения вблизи активного центра аспартатных протеиназ, Молекулярная биология, 1997, т. 31, N 6, сс. 1030-1035

69. Pearl L.H., and Blundell T.L., The active site of aspartic proteinases, FEBS Lett., 1984, v. 174, pp. 96-101

70. Cooper JB, Newman M.P., X-ray structural studies of mammalian aspartic proteinases, Adv Exp Med Biol 1991, v. 306, pp. 47-61

71. Safro M.G., Andreeva N.S., On the role of peripheral interactions in the specificity of chymosin, Biochem. Int., 1990, v.20, pp. 555-61.

72. Suguna K., Padlan E.A., Smith C.W., Carlson W.D., and Davies D.R., Binding of a reduced peptide inhibitor to the aspartic proteinase from Rhizopus chinensis: implications for a mechanism of action, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1987, v. 74, p. 55

73. Veerapandian В., Cooper J.B., Sali A., Blundell T.L., Rosati R.L., Dominy B.W., Damon D.B., Hoover D.J., Direct observation by X-ray analysis of the tetrahedral "intermediate" of aspartic proteinases, Protein Science, 1992, v. 1, pp.322-328

74. James M.N.G., Sielecki A.R., Hayakava K., Gelb M.H., Crystallographic analysis of transition state mimics bound to penicillopepsin: difluorostatine- and difluorostatone-containing peptides, Biochemistry, 1992, v. 31, p.3872-3886.

75. Suzuki J., Hamu A., Kawasaki H., Nishiyama M., Horinouchi S., Beppu Т., Site-directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220, Asp303 in chymosin, Prot. Eng., 1989, v.4, pp. 69-71.

76. Pitts J.E., Mantafounis D., Engineering the pH-profile of chymosin, Biochem. Soc. Trans., 1991, v.19, p.266S.

77. Suzuki J., Sasaki K., Sasao Y., Hamu A., Kawasaki H., Nishiyama M., Beppu Т., Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Prot. Eng., 1989, v.2, pp. 563-9

78. Quinn D., Pitts J.E., Mantafounis D., Strop P., Modifying the substrate specificity of chymosin, Biochem. Soc. Trans., 1991, v.19, p.267S.

79. Orprayoon P., Pitts J.E., Nugent Ph., Mantafounis D., Lawler S.E., Blundell T.L., Uusitalo J., Penttila M., Protein engineering of the surface loops of chymosin, Biochem. Soc. Trans., 1991, v.l9, p.265S.

80. Kawaguchi Y., Kosugi S., Sasaki K., Uozumi Т., Beppu Т., Production of Chymosin in Escherichia coli Cells and Its Enzymatic Properties, Agric. Biol. Chem., 1987, v.51, pp.1871-1877.

81. Sugrue R., Marston F.A.O., Lowe P.A., Freedman R.B., Denaturation studies on natural and recombinant bovine prochymosin, Biochem. J., 1990, v.271, pp.541-547.

82. Sheikh A., Freedman R.B., Translation of preprochymosin in vitro. Evidence for folding of prochymosin to the native conformation, Biochem. J., 1990, v.272, pp.659664.

83. Hidaka M., Sasaki K., Uozumi Т., Beppu Т., Cloning and structural analysis of the calf prochymosin gene, Gene, 1986, v. 43, pp. 197-203.

84. Simons G, Rutten G, Homes M, Nijhuis M, van Asseldonk M., Production of prochymosin in Lactococci, Adv Exp Med Biol., 1991, v.306, pp.115-9.

85. Mellor J., Dobson M.J., Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae, Gene, 1983, v.24, pp. 1-14.

86. Goff C.G., Moir D.T., Kohno Т., Gravius T.C., Smith R.A., Yamasaki E., Taunton-Rigby A., Expression of calf prochymosin in Saccharomyces cerevisiae, Gene, 1984, v.27,pp,35-46.

87. Cullen D., Gray G.L., Wilson L.J., Hayenga K.J., Lamsa M.L., Rey M.W., Norton S., Berka R.M., Controlled expression and secretion of bovine chymosin in Aspergillus nidulans, Biotechnology, 1987, v.5, pp. 369-376.

88. Dunn-Coleman N.S., Bloebaum P., Berka R.M., Bodie E., Robinson N., et al., Commercial levels of chymosin production by Aspergillus, Biotechnology, 1991, v.9, pp.976-981.

89. Allen K.E., McNally M.T., Lowendorf H.S., Slayman C.W., and Free S.J., Deoxyglucose-resistant mutants of Neurospora crassa: Isolation and biochemical characterization, J. Bacteriol., 1989, v. 171, pp.53-58.

90. Bodie E.A., Armstrong G.L., and Dunn-Coleman N.S., Strain improvment of chymosin-producing strains of Aspergillus niger var. awamori using parasexual recombination, Enzyme Microb. Technol., 1994, v.16, pp.376-382.

91. Uusitalo J.M., Nevalainen K.M.H., Harkki A.M., Knowles J.K.C., and Penttila M.E., Enzyme production by recombinant Trichoderma reesei strains, J. Biotechnology, v. 17, 1991, pp. 35-50.

92. Kolmer M., Ord Т., and Ulmanem I., Expression of recombinant calf prochymosin in mammalian cell culture, J. Biotechnology, 1991, v.20, pp. 131-140.

93. Brem G., Hartl., Proc. Frontiers of Biotechnology in Agriculture, Sea of Galilee, Israel. 1993, p.23.

94. Mantafounis D., Pitts J., Protein engineering of chymosin; modification of the optimum pH of enzyme catalysis, Prot. Eng., 1990, v.3, pp. 605-9.

95. Koning P.J.De., Ned.Milk-Zuiveltijdsch., 1968, v.22, pp.121-124

96. Clement G.E., Cashell G.S., Biochem. and Biophys. Res. Communs, 1972, v. 47, pp.318-322

97. Проскуряков M.T., Сущинская JI.В., Прикл. биохимия и микробиол., 1971, т.7, сс. 343-347

98. Cuatrecasas P., Anfinsen С.В., Affinity chromatography, Methods Enzymol., 1971, v.22, pp.345-378.

99. Степанов B.M., Руденская Г.Н., Янонис В.В., Остославская В.И., Гончар М.В., Котлова Е.К., Стронгин А.Я., Аффинная хроматография протеиназ на сорбентах, содержащих бацитрацин в качестве специфического лиганда, Биоорган, химия, 1987, v.4, 1256-1263.

100. Foltmann В., Studies on Rennin. On the Crystallization, Stability and Proteolytic Activity of Rennin, Acta Chem. Scand., 1959, v.13, pp. 1927-1935

101. Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Оксенойт E.C., Комаров Ю.Е., Степанов В.М., Флуоресцентные субстраты аспартатных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции, Биоорган, химия, 1986, т. 12, №9, сс. 1172-1180.

102. Undenfriend S, Fluorescence assay in biology and medicine. N.Y.: Acad. Press, 1964.

103. Visser S., Proteolytic enzymes and their action on milk proteins, Netherlands Milk and Dairy Journal, 1981, v.35, pp.65-88

104. И.Ю. Филиппова, E.H. Лысогорская, Г.И. Лавренова, E.C. Оксенойт, Л.И. Суворов, В.В. Старовойтова. Пептидные субстраты с внутримолекулярным тушением флуоресценции для изучения аспартильных протеиназ. - Биоорган, химия, 2000, т. 26, № 3, сс. 197-202.

105. Berman Н.М., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N.,Weissig H., Shindyalov I., Bourne P.E., The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, v.28, pp.235-242

106. Popov E.M., Kashparov I.V., Popov M.E., Uspehi biol. khimii, 1994, v.34, pp.40-42.

107. Guex N„ Peitsch M.C., SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer: an environment for comparative protein modeling, Electrophoresis, 1997, v. 18, pp.27142723

108. Jorgensen W.L., Tirado-Rives J., The OPLS potential functions for proteins. Energy minimizations for crystals of cyclic peptides and crambin, J. Amer. Chem. Soc., 1988, v.l 10, pp.1657-1666

109. Dudek M.J., Ponder J.W., Accurate modeling of the intramolecular electrostatic energy of proteins, J. Comput. Chem., 1995, v. 16, pp.791-816.

110. Ponder J.W., Richards F.M, An efficient Newton-like method for molecular mechanics energy minimization of large molecules, J. Comput. Chem., v.8, pp. 10161024.

111. Степанов B.M., Руденская Г.Н., Янонис В.В., Остославская В.И., Гончар М.В., Котлова Е.К., Стронгин А.Я., Аффинная хроматография протеиназ на сорбентах, содержащих бацитрацин в качестве специфического лиганда, Биоорган, химия, 1987, т. 4, 1256-1263.

112. Malak, С.А.А., Abou El Adab, I.F.G., Vukashinovich, V., Zalunin, I.A., Timokhina, E.A., Lavrenova, G.I., and Stepanov, V.M., Buffalo (Bos. Buffali L.) chymosin purification and properties, Comp.Biochem.Physiol, 1996, v. 113B, N1. 5762.

113. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, (1970) Nature, 227, 680-685.