Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат технических наук Киселев, Евгений Геннадьевич

• Киселев, Евгений Геннадьевич
• кандидат технических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат технических наук Киселев, Евгений Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Обзор литературы

1.1 Синтез разрушаемых биополимеров - актуальные направления исследований

1.2 Разрушаемые полигидроксиалканоаты: продуценты, субстраты, условия и эффективность биосинтеза

1.2.1 Продуценты и условия биосинтеза полигидроксиалка-ноатов

1.2.2 Субстраты для синтеза полигидроксиалканоатов

1.2.3 Технологические факторы, влияющие на эффективность процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов

1.2.4 Современные масштабы производства полигидроксиалканоатов и сферы применения

1.3 Потенциал водородокисляющих бактерий для получения полигидроксиалканоатов

ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования и методы культивирования водородокисляющих бактерий

2.2 Методы контроля и определения параметров процесса выращивания бактерий в режиме синтеза полигидроксиалканоатов

2.3 Статистические методы обработки результатов

ГЛАВА 3 Кинетические и продукционные характеристики водородокисляющих бактерий в режиме синтеза резервных полигидроксилаканоатов

3.1 Характеристики роста и синтеза полигидроксиалканоатов автотрофной культурой бактерий Сирг1аУ1с1т еШгоркш В-10646 в режиме аккумуляции

3.1.1 Характеристики автотрофной культуры бактерий С. еШгоркт В-10646 в режиме аккумуляции полигид-роксиалканоатов в хемостате

3.1.2 Исследования режимов автотрофного периодического выращивания Сирг1см1с1и8 еШгоркт В-10646 с целью увеличения выходов полигидроксиалканоатов и сокращения длительности процесса

3.1.3 Синтез полигидроксиалканоатов С. еШгоркт В-10646 в хемостатно-периодическом процессе культивирования

3.2 Характеристики роста и синтеза полигидроксиалканоатов бактериями С. еШгоркш В-10646 при гетеротрофных условиях питания

3.2.1 Влияние физиологической активности посевного материала С. еШгоркш 5-10646 на длительность лаг-фазы, урожай биомассы и выходы полигидроксиалканоатов

3.2.2 Влияние концентрации клеток в посевном материале на рост и синтез полигидроксиалканоатов культурой С. еи^оркиз В

3.3 Принципы организации процесса культивирования водородных бактерий для получения полигидроксиалканоатов различного химического строения

Резюме

ГЛАВА 4 Сравнительное исследование методов экстракции полигидроксиалканоатов из биомассы бактерий

4.1 Экстракция полигидроксиалканоатов органическими растворителями

4.2 Исследование безреагентного метода экстракции по-лигидроксиалканоатов

4.3 Разработка комбинированного методы экстракции полигидроксиалканоатов

Резюме

ГЛАВА 5 Технология синтеза полигидроксиалканоатов и её технико-экономическое обоснование

5.1 Исходные данные для проектирования опытного производства полигидроксиалканоатов

5.2 Технология производства полигидроксиалканоатов

5.2.1 Блок-схема цикла опытного производства

5.2.2 Технологическая схема опытного производства

5.3 Материальные затраты на синтез полигидроксиалканоатов

5.4 Технико-экономическя оценка процессов синтеза полигидроксиалканоатов бактериями С. еи^орЬиБ В

Резюме

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями»

Биотехнологические процессы обеспечивают производство широкого спектра целевых продуктов медицинского, пищевого, кормового, и технического назначения. Ценным продуктом биотехнологии являются макромолекулы запасной природы - полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот полигидроксиалканоаты (ПГА) - термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы. Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с тем, что объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. т/год; основная их часть скапливается на свалках и аккумулируется в Мировом океане, создавая глобальную экологическую проблему [119, 33]. Острота проблемы связана также с экономической ситуацией, так как до 98 % полимерных материалов производится из невозобновляемого ископаемого сырья - нефти и газа, запасы, которых истощаются.

В настоящее время все большее значение приобретают экологически чистые материалы, получаемые из возобновляемого сырья, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (это так называемые биополимеры). Фундаментальные исследования потенциала биологических агентов и биосистем, ориентированные на получение научной основы для развития индустрии экологически чистых полимерных материалов - актуальное и высокорейтинговое направление критических технологий мирового уровня. Конструирование биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров; получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.

Среди применяемых и активно разрабатываемых новых биоразрушаю-щихся полимеров, наряду с полилактидами важное место занимают полигидроксиалканоаты. Эти полимеры активно исследуются за рубежом; в сфере коммерциализации ПГА заняты многие фирмы и промышленные компания («Монсанто К°», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambel» и др). В России индустрия разрушаемых полимеров не создана; исследования, направленные на разработку биотехнологических процессов синтеза собственно ПГА - в сфере внимания нескольких академических институтов (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институт биофизики СО РАН).

Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 40-50 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % - на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.

Одним из перспективных продуцентов ПГА являются водородокис-ляющие бактерии, характеризующиеся способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях СОг и Н2 и также на органических субстратах [22, 23, 35]. Исследование закономерностей синтеза ПГА на различных субстратах, проведение сравнительной оценки эффективности технологических режимов является важнейшей фундаментальной задачей, решение которой составит научно-практическую основу для создания в будущем отрасли производства этих биополимеров.

В ИБФ СО РАН имеется значительный задел по биотехнологии ПГА. В 2005 г. было создано опытное производство на фруктозе с использованием культуры R.eutophus В5786, производительностью до 50 кг в год при выходах по биомассе и ПГА до 50 г/л и 80-85 %. Полученные продукционные показатели значительно ниже достигнутых к настоящему времени за рубежом.

Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку эффективной технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико-экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Киселев, Евгений Геннадьевич

ВЫВОДЫ:

1. Введен в культуру штамм С ирпатйиБ еШгоркш В10646. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры при автотрофных и гетеротрофных условиях питания в режиме синтеза резервных полигидроксиалканоатов, показано, что максимальные выходы полимеров на газовом субстрате (смеси Н2, С02 и 02) составляют (75±5) % при экономических коэффициентах по Н2, 02, С02= 1,1; 0,25; 0,36; на глюкозе -(90±5) % при экономическом коэффициенте 0,3.

2. На основе сравнительного исследования проточного и периодического способов выращивания С.еМгоркт в автотрофной культуре в ферментере с коэффициентом массопереноса по кислороду 460 ч"1, различающихся режимом подачи в культуру потока лимитирующего субстрата (азота), стимулярующего аккумуляцию полигидроксиалканоатов, предложен хемостатно-периодичсский процесс, обеспечивающий продуктивность процесса по биомассе и полимеру до 0,71 и 0,57 г/л-ч при длительности ферментационного цикла не более 70 ч.

3. Реализован и исследован периодический процесс синтеза полигидроксиалканоатов культурой С.еШгоркт на глюкозе при изменении внутриклеточного пула ПГА, физиологической активности и плотности инокулята, режима транспорта кислорода. Установлено, что при текущей концентрации глюкозы от 5 до 35 г/л и исходном содержании полимера в инокуляте не выше 10 %, при регулируемой подаче воздуха в культуру по ходу ее развития, концентрация биомассы и содержание полимера достигают (110±10) г/л и (90±5) % продуктивность процесса, 1,7 и 1,45 г/л-ч соответственно, что в 2 раза выше ранее достигнутых показателей культурой Я. еШоркш В5786 на фруктозе.

4. Разработаны режимы синтеза полигидроксиалканоатов различного химического состава, включающие дозированную подачу в культуру второго углеродного субстрата - солей алкановых кислот (валерата, гексаноата) и у-бутиролактона, в пределах установленных допустимых концентраций, без изменения схемы ведения двустадийного периодического режима культивирования при лимитировании роста бактерий по азоту. Синтезированы образцы, различающиеся степенью кристалличности, от 12 до от 76 % и термостабильностью.

5. На основании проведённых исследований процессов экстракции из биомассы клеток с использованием поверхностно-активных веществ, неполярных растворителей, их смесей с этанолом при варьировании параметров процесса. Разработан метод экстракции, обеспечивающий выход высокоочищенного полимера свыше 96 % без существенного изменения молекулярно-массовых характеристи к

6. Выполнено технико-экономическое обоснование производства при различных субстратных сценариях. Определены основные затраты на синтез полигидроксиалканоатов автотрофном и гетеротрофном режимах. Показано, что в зависимости от типа ростового субстрата (глюкоза, фруктоза или (Н2+С02+02)), затраты на получение полимера варьируются от 230 до 730 руб/кг, при прогнозной производительности 100 ООО т/г.

7. На основании экспериментальных данных и их анализа разработана технология эффективного синтеза ПГА на глюкозе с использованием водородных бактерий С. еиКоркиБ.

Технология реализована в проекте опытного производства «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов». Проект прошел государственную экспертизу (положи тельное заключение экспертизы № 241-50196-12).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена технико-технологическим исследованиям биотехнологического процесса получения биоразрушаемых полимеров - полигидроксиалканоатов (ПГА). Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с глобальной экологической проблемой аккумуляции в биосфере не разрушаемых синтетических пластмасс. Поэтому экологически чистые материалы, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (биополимеры) приобретают все большее значение. Освоение новых биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров; получение научной основы для конструирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.

ПГА - термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы, активно исследуются за рубежом; количество опытных и промышленных предприятий с 2000 г. увеличивается экспоненциально.

Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 4050 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % -на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.

Водородокисляющие бактерии, характеризующиеся способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях С02 и Н2 и также на органических субстратах, являются одним из наиболее перспективных продуцентов ПГА. Исследование закономерностей синтеза

ПГА на различных субстратах, проведение сравнительной оценки эффективности технологических режимов является важнейшей фундаментальной задачей, решение которой обеспечит научно-практическую основу для создания в будущем отрасли производства этих биополимеров.

В ИБФ СО РАН имеется значительный задел по биотехнологии ПГА. В 2005 г. было создано опытное производство на фруктозе с использованием культуры Я.еШорНш В5786, производительностью до 50 кг в год при выходах по биомассе и ПГА до 50 г/л и 80-85 %. Полученные продукционные показатели значительно ниже достигнутых к настоящему времени за рубежом.

Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку эффективной технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико-экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.

В работе исследован новый штамм водородокисляющих бактерий -Сирпау1с1из еМгоркш В-10646, обладающий способностью к росту на глюкозе, устойчивостью к у-бутиролактону, солям алкановых кислот и характеризующийся способностью к синтезу ПГА различного химического строения в автотрофных и гетеротрофных условиях. Штамм введен в культуру и исследованы в различных режимах выращивания бактерии; получены новые данные о закономерностях синтеза резервных полигидроксиалканоатов (ПГА), необходимые для разработки технологии их получения. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры в условиях автотрофного (смеси Н2, С02 и 02) и гетеротрофного (глюкоза) питания; определены эффективность использования субстратов и материальные затраты на образование ПГА. Установлены оптимальные для биосинтеза стартовая концентрация и физиологическая активность инокулята, режимы подачи кислорода и лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего внутриклеточную аккумуляцию ПГА. Это позволило разработать хемостатно-периодические режимы с выходами биомассы клеток и ПГА до (40±10) г/л и (75±5) % в автотрофном режиме и (110±10) г/л и (90±5) % на глюкозе. Изменение режима углеродного питания, заключающегося в регламентированной подаче в культуру второго углеродного субстрата (валерата, гексаноата, у-буторолактона), позволило получить образцы, различающиеся физико-химическими свойства в широких пределах.

Вторым по значимости и затратности элементом технологии производства ПГА является способ выделения полимера из биомассы клеток. Известные методы экстракции ПГА не отвечают всем необходимым требованиям (экологичность, невысокие затраты на реагенты, полнота извлечения и чистота полимера). Это актуализирует совершенствование методов экстракции как необходимое условие повышения эффективности процесса в целом и снижения стоимости полимера как конечного продукта биотехнологии.

В результате выполненного сравнительного исследования различных методов экстракции ПГА из биомассы бактерий, показано, что различные реагенты и технология ведения процесса по-разному влияют на самые важные показатели - полноту извлечения полимера и степень его чистоты.

Применение хлороформа делает необходимым использование большого количества летучих и токсичных реагентов. При использовании дихлорметана полнота извлечения повышается, но возникает необходимость в реализации процедуры разделения смеси «экстрагент-осадитель». В результате работы подобрана пара растворитель - осадитель (дихлорметан -гексан), которая не образует между собой азеотропную смесь, что делает возможным вернуть в процесс до 90 % реагентов. В результате снижается расход растворителей с 73,5 кг/кг ПГА (хлороформ - гексан) до 63,7 кг/кг ПГА (дихлорметан - этанол - гексан). При исключении из этого состава этанола возможно снижение расхода до 7,8 г/г ПГА, но в этом случае необходима дополнительная обработка биомассы с целью разрушения мембранных комплексов, или последовательная обработка сначала спиртом, а затем дихлорметаном.

Безреагентный метод позволяет более экономичным способом получать высокие выходы полимера, не загрязненного примесями жирных кислот липополисахаридной фракции клеточных мембран. Этот полимер пригоден для технических целей, но не пригоден для биомедицины. Разработанный комбинированный метод позволяет снизить количество загрязнений в полимере и расход реагентов.

В результате использования комбинированного метода удалось сократить объём органических растворителей используемых в процессе и как итог снизить их расход до 4,4 кг/кг ПГА. Комбинированный метод позволил достичь высокой степени извлечения ПГА - порядка 98,5 - 99,0 %; конечный продукт полученный таким способом не содержит эндогенных примесей и может применяться в медицинских целях.

При обработке данных многофакторного эксперимента получено уравнение регрессии, описывающие влияние факторов на параметр оптимизации.

У=82,574+0,875-Х1+0,046 Х2+0,050-Х3

Установлено, что полученное уравнение множественной регрессии в целом является статистически значимым и адекватно описывает изучаемое явление

Используя метод крутого восхождения по поверхности отклика, найдены оптимальные параметры процесса: концентрация ДДС-ГчГа - 5 %; температура 60 °С; время обработки 40 минут.

Анализ молекулярно-массового распределения показал, что ПЗГБ выделенный из биомассы, имеет очень большую полидисперсность от 2,8 до 3,5 и Мв от 6,5-105 до 7,0-105, г/моль. Использование многократной экстракции позволяет осуществить разделение ПЗГБ на более узкие фракции по молекулярной массе. Такое фракционирование может быть полезно в процессе изготовления различных изделий. Так низкомолекулярные фракции могут использоваться для создания наноструктур, а более высокомолекулярные могут применяться в производстве тканых материалов и изделий получаемых методами литья из расплавов или растворов.

На основе полученных экспериментальных данных определены удельные затраты на синтез ПГА основного ростового субстрата при различных режимах выращивания, которые отличаются на порядок. На производства целевого продукта (гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты, ПЗГБ) в автотрофном процессе в качестве основного ростового субстрата расходуется газовая смесь С02/02/Н2; при гетеротрофном -глюкоза (или фруктоза) и воздух. С учетом достигнутых продукционных показателей и определенных экспериментально удельных затрат при прогнозировании производства объемом 100 000 т/год при различных субстратных сценариях проведепы расчеты, показавшие возможность получения продукта стоимостью от 228 до 721,4 руб/кг.

Анализ полученных результатов и выполненные расчеты лабораторных процессов синтеза ПГА в автотрофном и гетеротрофном режимах показал целесообразность выбора для масштабирования вариант процесса, реализуемой на глюкозе в качестве основного ростового субстрата. В основе проекта - экспериментально достигнутые показатели процесса синтеза ПГА культурой С. eutrophus В10646 на глюкозе, которые включают хемостатно-периодический двустадийный (лимит азота/среда без азота) процесс при стартовой концентрации инокулята (10±2) г/л в течение 65 ч до выхода по X, г/л и ПГА %, соответственно, (110±10) г/л и (85±5) %, при расходе глюкозы (2,9±0,1) кг/кг и воздуха 200 м /кг; при комбинированном способе экстракции полимера; продуктивности процесса по биомассе и ПГА, соответственно, 1,7 и 1,4 г/л ч.

Получены исходные данные, основанные на экспериментально достигнутых показателях синтеза ПГА культурой С. eutrophus В10646, на основе которых разработан проект опытного производства. Реализация проекта позволит масштабировать процесс для получения опытных партий ПГА в количествах, способных полностью обеспечить и завершить все исследования, провести стандартизацию специализированной продукции и начать выпуск малыми партиями.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Киселев, Евгений Геннадьевич, 2012 год

1. Аналитическая химия. Химические методы анализа/ Под. ред. Петрухина О.М. М.: Химия, 1992. 400 с.

2. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов/ И.П. Ашмарин, H.H. Васильев, В.А. Амбросов. Издательство ленинградского университета, 1971. - 80 с.

3. Барсуков, Л.И. Как собрать мембрану (солюбилизация и реконструкция мембран)/ Л.И. Барсуков// Соросовский образовательный журнал. Т. 8, №1.Серия биология, 2004. С. 10 - 16.

4. Варфоломеев, С.Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов / С.Д. Варфоломеев, C.B. Калюжный. М.: Высш. шк., 1990.-296 с.

5. Волова, Т.Г Биотехнология / Т.Г Волова. Новосибирск : Изд-во СО РАН, 1999.-253 с.

6. Волова, Т.Г. Влияние лимитирования роста на накопление полиоксибутирата у водородокисляющих бактерий / Т.Г. Волова // Всес. конф. Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов Пущино. -1989.-С. 16-24.

7. Волова, Т.Г. Биосинтез на водороде/ Т.Г. ВоловаII Новосибирск : Изд-во СО РАН, 2004. - 397 с.

8. Волова, Т.Г. Получение и исследование микробных гетерополимерных полиоксиалканоатов/ Т.Г. Волова, О.Г. Беляев, И.И. Гительзон, Г.С. Калачева, С.Г. Луковенко, В.Ф. Плотников // Докл. РАН. -1996, а.-Т. 346.-С. 558-561.

9. Волова, Т.Г. Опытное производство разрушаемых биополимеров/ Т.Г. Волова, H.A. Войнов, B.C. Муратов, Н.В. Бубнов, К.В! Гурулев// Биотехнология. 2006. - №6. -С. 28-34.

10. Волова, Т.Г. Синтез сополимеров З-гидроксибутирата-со-4-гидроксибутирата водородокисляющими бактериями/ Т.Г. Волова, Н.О. Жила, Г.С. Калачёва, В.А. Соколенко, Э.Дж. Сински // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. - Т. 47. - С. 494-499.

11. Волова, Т.Г. Динамика активности ферментов клеточного цикла полигидроксиалканоатов у Ralstonia eutropha/ Т.Г. Волова, Г.С. Калачёва, О.В. Горбунова, Н.О. Жила // Прикладная биохимия и микробиология. -2004.-Т. 40.-С. 201-209.

12. Волова, Т.Г. Синтез сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата поли(ЗГБ/ЗГВ). бактериями Ralstonia eutropha/ Т.Г. Волова, Г.С. Калачёва // Микробиология. 2005. - Т. 74, № 1. - С. 63-69.

13. Волова, Т.Г. Полиоксиалканоаты-биоразрушаемые полимеры для медицины/ Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая; под ред. ак. В.И. Шумакова. 2-е изд., перераб. и доп. Красноярск: Изд-во Платина 2006.

14. Волова Т.Г., Способ лечения паховых грыж/Т.Г. Волова, A.B. Яковлев, Е.И. Шишацкая, Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова// Патент РФ № 2427326. 2011 г.

15. Волова, Т.Г. Микробиологический синтез на водороде /Т.Г. Волова, И.А. Терсков, Ф.Я. Сидько. Новосибирск: Наука. - 1985. - 116 с.

16. Воробьёва, Л.И. Промышленная микробиология / Л.И. Воробьёва. -Изд-во МГУ, 1989. 294 с.

17. Гительзон, И.И. Производство белка на водороде/ И.И. Гительзон. -Новосибирск: Наука, 1980.-150 с.

18. ГН 2.1.6.1338-03 Предельно допустимые концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населённых мест, 2003.

19. Емнова, Е.Е. Гидрогеназная активность термофильной водородокисляющей бактерии Pseudomonas thermophila/ Е.Е. Емнова, А.К. Романова //Микробиология, 1977. т.46, №4, С.619-623.

20. Заварзин, Г.А. Водородные бактерии и карбоксидобактерии/ Г.А. Заварзин. М.: Наука, 1975. - 202 с.

21. Заварзин, Г.А. Литотрофные микроорганизмы/ Г.А. Заварзин. М.: Наука, 1972.-340 с.

22. Мальцева, П.М. Основы научных исследований/ П.М. Мальцева, H.A. Емельянова. Киев: Вища школа, 1982.- 190 с.

23. Огородников, С.К. Азеотропные смеси/ С.К. Огородников, Т.М. Лестева, В.Б. Коган. Справочник, Л., 1971. - 848 с.

24. Ошина, Л.А. Промышленные хлорорганические продукты: Справочник/ Л.А. Ошина. М.: Химия, 1978. - 656 с.

25. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток/ С.Дж. Перт. Москва: Мир, 1978. - 259 с.

26. Печуркин, Н.С. Популяционные аспекты биотехнологии// Н.С. Печуркин, A.B. Брильков, Т.В. Марченкова. Новосибирск: Наука Сибирское отделение, 1990. - 172 с.

27. Савельева, Н.Д. Отношение водородных бактерий к окиси углерода/ Н.Д. Савельева// Микробиология. 1979. - Т. 48, вып. 2. - С. 360-362.

28. Савельева, Н.Д. К систематике водородных бактерий/ Н.Д. Савельева, Т.Н. Жилина // Микробиология. 1968. - Т. 309. - N. 1. - С. 223226.

29. Семчиков, Ю.Д. Высокомолекулярные соединения/ Ю.Д. Семчиков. Москва. Академия., 2008. - 368 с.

30. Стасишина, Г.Н. Штамм бактерий Alcaligenes eutrophus-продуцент белковой биомассы / Г.Н. Стасишина, Т.Г. Волова // Патент РФ № 2053292. -БИ. 1996. - № 1.

31. Фомин, В.А. Биоразлагаемые полимеры, состояние и перспективы использования / В.А. Фомин, В.В. Гузеев // Пластические массы. 2001.-№ 2.-С.42-46.

32. Холмберг, К. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах / Йёнссон Б., Кронберг Б., Линдман Б. М. Бином, 2010. — 528 с.

33. Шабанов, В.Ф. Фундаментальные основы комплексной переработки углей КАТЭК для получения энергии, синтез-газа и новых материалов с заданными свойствами / В.Ф. Шабанов, Б.Н. Кузнецов, М.Л. Щипко, Т.Г. Волова. Новосибирск. Изд-во Наука. - 2005. -231 с.

34. Akiyama, М. Environmental life cycle comparison of polyhydroxyalkanoates produced from renewable carbon resources by bacterial fermentation/ M. Akiyama, T. Tsuge Y. Doi // Polym. Degrad. Stab. 2003. - Vol. 80.-P. 183-194.

35. Anderson, A.J. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates / A.J. Anderson, E.A. Dawes // Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 54. - P. 450-472.

36. Ashby, R.D. Poly(hydroxyalkanoate) biosynthesis from triglyceride substrates/ R.D. Ashby, T.A. Foglia // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. -Vol.49.-P.431-437.

37. Audic, J.L. Non-food applications of milk components and dairy co-products: a review/ J.L. Audic, B. Chaufer, G. Daufin // Lait. 2003. - Vol. 83. -P. 417^138.

38. Avelle, M. Review Properties of blends and composites based on poly(3-hydroxy)butyrate (PHB) and poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) (PHBV) copolymers/ M. Avelle, E. Martuscelli, M. Raimo // J. Materials Science. 2000 a. - Vol. 35. - P. 523-545.

39. Borman, E.J. Growth-associated production of polyhydroxybutyric acid by Azotobacter beijernckii from organic nitrogen substrates/ E.J. Borman, M. Leibner, B. Beer // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 48. - P. 8488.

40. Braunegg, G. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (Rewiew article)/ G. Braunegg, G. Lefebvre, K. F. Genzer, // J. of Biotechnol. 1998. - Vol. 65. - P. 127-161.

41. Breitenbach, A. Biodegradable semi-crystalline comb polyesters influence the microsphere production by means of a supercritical fluid extraction technique (ASES)/ A. Breitenbach, D. Mohr, T. Kissel // J. Control. Rel. 2000. - V. 63,1.1-2. - P. 53-68.

42. Chanprateep, S. Biosynthesis and biocompatibility of biodegradable poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)/ S. Chanprateep, K. Buasri, A. Muangwong, P. Utiswannakul // Polymer Degradation and Stability. 2010. -Vol. 95.-P. 2003-2012.

43. Chen, G.Q. A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials industry/ G.Q. Chen // Chem. Soc. Rev. 2009. - Vol. 38. - P. 24342446.

44. Chen, G.Q. Plastics Completely Synthesized by Bacteria: Polyhydroxyalkanoates in Plastrics from Bacteria-Natural Functions and Applications/ G.Q. Chen, Steinbüchel, A. Chen // New York. 2010. - P. 17-37.

45. Chen, G.Q. Industrial scale production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)/ G.Q. Chen, G. Zang, S.J. Park, S.Y. Lee // App. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 57. - P. 55-55.

46. Chen, H.J. Identification and Characterization of a Novel Intracellular Poly(3-Hydroxybutyrate) Depolymerase from Bacillus megaterium/ H.J. Chen, S.C. Pan, G.C. Shaw // Appl. Environ. Microbiol. 2009. - Vol. 75. - P. 52905299.

47. Choi, J. Efficient and economical recovery of poly-(3-hydroxybutyrate) from recombinant Escherichia coli by simple digestion with chemicals/ J. Choi, S.Y Lee. // Biotechnol. Bioeng. 1999, a. - Vol. 62. - P. 546-553.

48. Choi, J. Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation/ J. Choi, S.Y Lee. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, b. - Vol. 51. - P. 13-21.

49. Choi, J. Process analysis and economic evaluation for poly(3-hydroxybutyrate) production by fermentation/ J. Choi, S.Y Lee. // Bioprocess Eng.- 1997.-Vol. 17.-P. 335-342.

50. Cromwick, A.M. The microbial production of poly(hydroxyalkanoates) from tallow/ A.M .Cromwick, T. Foglia, R.V. Lenz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 46. - P. 464-469.

51. De Koning, G. Poly(hydroxyalkanoates) from fluorescent Pseudomonas in retrospect and prospect/ G. De Koning, M. Kellerhals, C. Van Meurs, B Witholt // J. Environ. Polym. Degrad. 1996. - Vol. 4. - P. 243-251.

52. Devdatt, L. High temperature PHA extraction using PHA-poor solvents/ L. Devdatt F. Kurdikar, E. Strauser, A.J. Solodar, D.P. Mark // US Patent 6087471.- 2000.

53. Durner, R. Accumulation of poly(R)-3-hydroxyalkanoates. in Pseudomonas oleovorans during growth in batch and chemostat culture with different carbon sources/ R. Durner, M. Zinn, B. Witholt, T. Egli // Biotechnol. Bioeng. 2001. - Vol. 72. - P. 278-288.

54. Elbahloul, Y. Large-scale production of poly(3-hydroxyoctanoic acid) by Pseudomonas putida GPol and a simplified downstream process/ Y. Elbahloul, A. Steinbüchel // Appl. Environ. Microbiol. 2009. - Vol. 75. - P. 643-651.

55. Füchtenbuch, B. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates from low-rank coal liquefaction products by Pseudomonas oleovorans and Rhodococcus rubber/ B. Füchtenbuch, A. Steinbüchel // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. -Vol. 52. - P. 91-95.

56. Fukui, T. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plants oils by Alcaligenes eutrophus and recombinant strain/ T. Fukui, Y. Doi // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 49. - P. 333-336.

57. Gurtovenko, A.A. Interaction of ethanol with biological membranes: The formation of non-bilayer structures within the membrane interior and their significance/ A.A. Gurtovenko, J. Anwar // J. Phys. Chem. B. 2009. V. 113. P. 1983-1992.

58. Hahn, S.K. Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using dispersion of sodium hypochlorite solution and chloroform/ S.K. Hahn, Y.K. Chang, B.S. Kim, H.N Chang, // Biotechnol. Bioeng. 1994. - Vol. 44. - P. 256261.

59. Hazenberg, W. Efficient production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates) from octane by Pseudomonas oleovprans: economic considerations/ W. Hazenberg, B. Witholt // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1997.-Vol. 48.-P. 588-596.

60. Hazer, B. Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medical applications/ B. Hazer, A. Steinbüchel //Appl Microbiol Biotechnol. 2007 . - Vol. 74. - P. 1-12.

61. Hepner, L. Cost analysisnof fermentation processes //Chimia.-1996.-V.50.-P.442-443.

62. Horowitz, D. Methods for purifying polyhydroxy alkanoates // US Patent 6340580.-2002.74. http://en.european-bioplastics.org/75. http://rosagrobiz.com/news/worldapk/76. http://www.chemport.ru/data/chemipedia/article2244.html

63. Huijberts, G.N.M. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas putida KT2442 in continuous cultures/ G.N.M. Huijberts, G. Eggink // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 46. - P. 233-239.

64. Ishizaki, A. Microbial production of poly-D-3-hydroxybutyrate from C02/ A. Ishizaki, K. Tanaka, N. Taga // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. -Vol. 57.-P. 6-12.

65. Jian Yu. // US Patent 7514525. 2009.

66. Jung, K. Two-stage continuous process development for the production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates)/ K. Jung, W. Hazenberg, M. Prieto, B. Witholt // Biotechnol. Bioeng. 2001. - Vol. 72. - P. 19-24.

67. Kim, D.Y. Bacterial Poly(3-hydroxyalkanoates) Bearing CarbonCarbon Triple Bonds/ D.Y. Kim, Y.B. Kim, Y.H. Rhee // Macromol. 1998. -Vol. 32.-P. 4760-4763.

68. Kim, S.W. High production of poly-*-hydroxybutyrate (PHB) from Methylobacterium organophilum under potassium limitation/ S.W. Kim, P. Kim, H.S. Lee, G.M. Lee, H.S. Lee, J.H. Kim, // Biotechnol. Lett. 1996. - Vol. 18. -P. 25-30.

69. Kumar R., Singh S., Singh O.V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives // R. Kumar, S. Singh, O.V. Singh / J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008. - Vol. 35. - P. 377-391.

70. Lee, S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates / S.Y. Lee // Biotechnol. Bioeng. 1996, a. - Vol. 49. - P. 1-14.

71. Lee, S.Y. High cell density cultivation of Escherichia coli/ S.Y. Lee // Trends Biotechnol. 1996, c. - Vol. 14. - P. 90-105.

72. Lee, S.Y. Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria / S.Y. Lee // Trends Biotechnol. -1996, b. Vol. 14. - P. 431-438.

73. Lee, S.Y. Poly(3-hydroxyalkanoate) production from xylose by recombinant E. coli/ S.Y. Lee // Bioprocess Engin. 1998. - Vol. 18. - P. 397-399

74. Lee, S.Y. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli strains: genetic and fermentation studied/ S.Y. Lee, H.N. Chang // Can J. Microbiol.-1995.-V. 41 Suppl 1.-P. 207-215.

75. Madison, L.L. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic/ L.L. Madison, G.W. Huisman // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - Vol. 63. - P. 21-53.

76. Nagata, M. Synthesis, Characterization, and Enzymatic Degradation Studies on Novel Network Aliphatic Polyester/ M Nagata, T Machida, W. Sakai, N. Tsutsumi //. Macromol. -1998.-V.32.-P. 6450-6454.

77. Natano, R.V. Integrated production of biodegradable plastic, sugar and ethanol/ R.V. Natano, P.E. Mantelatto, C.E. Rossell // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 57. - P. 1-5.

78. Neto, J. New strategies in the production of polyhydroxyalkanoates from glycerol and meat and bone meal: PhD thesis. Graz University of Technology, 2006.

79. Nöda, I. Biodegradable copolymers and plastic articles comprising biodegradable copolymers // US patent 5489470. 1996, b.

80. Nöda, I. Biodegradable copolymers and plastic articles comprising biodegradable copolymers of 3-hydroxyhexanoat // US patent 5536564. 1996, a.

81. Nöda, I. Films and absorbent articles comprising a biodegradable polyhydroxyalkanoate comprrising 3-hydroxybutyrat and 3-hydroxyhexanoat comonomer units // US Patent 5990271. 1999.

82. Nöda, I. Preparation and properties of a novel class of polyhydroxyalkanoates copolymers //1. Nöda, P.R. Green, M.M. Satkowski, L.A. Schechtman / Biomacromolecules. 2005. - Vol. 6. - P. 580-586.

83. Oeding, V. Ketothiolase from Hydrogenomonas eutropha H 16 and its significance in the regulation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism / V. Oeding, H.G. Schlegel // Biochem. J. -1973.-V.134.-P. 239-248.

84. Omar, S. Optimization of cell growth and poly(3-hydroxybutyrate) accumulation on date syrup by a Bacillus megaterium strain/ S. Omar, A. Rayes, A. Eqaab, I. Viss, A. Steinbüchel // Biotechnol. Lett. 2001. - Vol. 23. - P. 1119-1123.

85. Page, W.J. Growth of Azotobacter vinelandii UWD in fish peptone medium and simplified extraction of poly-/?-hydroxybutyrate/ W.J. Page, A. Comnish // Appl Environ Microbiol.-1993.-V. 59.-P. 4236-4244.

86. Pazur, R.J. Crystal Structure of Syndiotactic Poly(-hydroxybutyrate) from X-ray Fiber and Powder Diffraction Analyses and Molecular Modeling/ R.J. Pazur, P.J. Hocking, S. Raymond, R.H. Marchessault // Macromol.-1998.-V. 32.-P. 6485-6492.

87. Poliakoff, M. Plastic bags, sugar cane and advanced vibrational spectroscopy: taking green chemistry to the third world/ M. Poliakoff, I. Nöda // Green Chem. 2004. - Vol. 6. P. G37-G38.

88. Ramsay, B.A., Ramsay J., Berger E., Chavarie C., Braunegg G. Separation of poly-.beta.-hydroxyalkanoic acid from microbial biomass// B.A. Ramsay, J. Ramsay, E. Berger, C. Chavarie, G. Braunegg / US Patent 5110980,1989.

89. Ramsay, J.A. Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents/ J.A. Ramsay, E. Berger, R. Voyer, C. Chavarie, B.A. Ramsay // Biotechnol. Tech.-1994.-V. 8.-P. 589-594.

90. Ramsay, J.A. Hemicellulose as a potential substrate for production of poly(beta-hydroxyalkanoates)/ J.A. Ramsay, M.C.A. Hassan, B.A. Ramsay // Can. J. Microbiol. 1995. - Vol. 41. - P. 262-266.

91. Rehm B.H. PHA synthases— the key enzymes of PHA synthesis // B.H. Rehm, A. Steinbüchel / Biopolymers Eds.: A. Steinbüchel, Y. Doi. Verlag Wiley, Polyesters I, 3a, 2001. - P. 173-215.

92. Rigaud, J.-L. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: Application to energy-transducing membrane proteins/ J.-L. Rigaud, B. Pitard, D. Levy // Biochim. et biophys. acta. 1995. Vol. 1231. P. 223-246

93. Rodrigues, M.F.A. Byosinthesis of poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxypentoic acid) from unrelated substances by Burkholderia sp./ M.F.A.

94. Rodrigues, L.F. Silva, J.G.C. Gomez, H.E. Valentin, Steibüchel A. //Appl Microbiol Biotechnol.-1995.-V. 43.-P. 880-886.

95. Ryu, H.W. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) in cell density fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with phosphate limitation/ H.W. Ryu, S.K. Hahn, Y.K. Chang H.N. Chang, // Biotechnol. Bioeng. 1997. -Vol. 55.-P. 28-32.

96. Schlegel, H.G. Bin Submersverfahren zur Kultur wasserstoffoxydierenden Bakterien: wachstumphysiologische Untersuchung/ H.G. Schlegel, H. Kaltwasser, G. Gottschalk// Arch. Mikrobiol. 1961. -Bd.38. - P. 209-222.

97. Senior, P.G. The Regulation of poly-/?-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinckii/ P.G. Senior, E.A. Dawes // Biochem. J.- 1973.-V.134.- P.225-238.

98. Solaiman, D.K.Y. Conversion of agricultural feedstock and coproducts into poly(hydroxyalkanoates)/ D.K.Y. Solaiman, R.D. Ashby, T.A. Foglia, // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - Vol. 71. - P. 783-789.

99. Solaiman, D.K.Y. Medium-chain-length poly(ß-hydroxyalkanoate) synthesis from triacylglycerols by Pseudomonas saccharophila/ D.K.Y. Solaiman, R.D. Ashby, T.A. Foglia, // Current Microbiology. 1999. -Vol. 38. -P. 151-154.

100. Stein R.S. Polymer recycling: opportunities and limitations/ R.S. Stein //Proc.Natl.Acad. Sci.-1992.-V. 89.-P.835-838.

101. Steinbüchel, A. Considerations on the structure and biochemistry of bacterial polyhydroxyalkanoic acids inclusions/ A. Steinbüchel, K. Aerts, W. Babel, C. Föllner, M. Liebergesell, M.H. Madkour, F. Mayer, V. Pieper-Fürst, A.

102. Pries, H.E. Valentin, R. Wieczorek //Can. J. Microbiol.- 1995a.-V.41.-№ 1.-P.94-105.

103. Steinbüchel, A. Biochemical and molecular basis of microbial synthesis of polyhydroxyalkanoates in microorganisms/ A. Steinbüchel, S. Hein // Adv Biochem Eng Biotechnol. 2001. - Vol. 71. - P. 81- 123.

104. Steinbüchel, A. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids/ A.Steinbüchel, H.E. Valentin//FEMS Microbiol Lett.-1995 b.-V. 128.-P.219-228.

105. Sun, Z. Fed-batch production of unsaturated medium-chainlength polyhydroxyalkanoates with controlled composition by Pseudomonas putida KT2440/ Z. Sun, J. Ramsay, M. Guay, B. Ramsay // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. - Vol. 82. - P. 657-662.

106. Sun, Z.Y. Carbon-limited fed-batch production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates from nonanoic acid by Pseudomonas putida KT2440 / Z. Y. Sun, J. A. Ramsay, M. Guay, B. Ramsay // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, c. - Vol. 74. - P. 69-77.

107. Tamer, L.M. Optimization of poly(3-hydroxybutyric acid) recovery from Alcaligenes latus: combined mechanical and chemical treatments/ L.M. Tamer, M. Moo-Young, Y. Chisti // Bioprocess Enginner. -1998.-V. 19.-P.459-468.

108. Tan, I.K.P. Saponified palm kernel oil and its major free fatty acids as carbon substrates for the production of polyhydroxyalkanoates in

109. Pseudomonas putida PGA1/ I.K.P. Tan, K. Sudesh, M. Theanmalar, S.N. Gan, I.B. Gordon // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - Vol. 47. - P. 207-211.

110. Tanaka, K. Production of poly(D-3-hydroxybutyrate) from C02, H2 and 02 by high cell density autotrophic cultivation of Alcaligenes eutrophus/ K. Tanaka, A. Ishizaki, T. Kanamaru, T. Kawano // Biotechnol. Bioeng. 1995. - Vol. 45. - P. 268-275.

111. Topiwala, H.C.G. Temperature relationship in continuous culture / H. Topiwala, C.G. Sinelaiz // Biotechnol. Bioeng. 1971. -Vol.13. - P.795-813.

112. Volova, T.G. Autotorophic synthesis of PHAs by Ralstonia eutropha in the presence of carbon monoxide/ T.G. Volova, G.S. Kalacheva, O.V. Altuhova // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002-Vol. 58. - № 5. - P. 675-678.

113. Volova, T.G. Hydrogen-Based Biosynthesis / T.G. Volova // Nova Science Pub.Inc. NY, USA, 2009. 287 p.

114. Volova, T.G. Polyhydroxyalkanoates-Plastic Materials of the 21st Century: production, properties, application/ T.G. Volova // NY: Nova Science Pub, 2004. 282 p.

115. Wallen, L.L. Poly-j-hydroxyalkanoate from activated sluge/ L.L. Wallen, W.K. Rohwedder//Environ. Sei. Technol.- 1974.-V.8.-P.576-579.

116. Wang, F. High cell density culture of metabolically engineered Escherichia coli for the production of poly(3-hydroxybutyrate) in a defined medium/ F. Wang, S.Y. Lee // Biotechnol. Bioeng. -1998.-V.58.-P.325-328.

117. Wong, H.H. Poly(3-hydroxybutyrate) production from they by high density cultivation of recombinant Escherichia coli/ F. Wang, S.Y. Lee // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - Vol. 50. - P. 30-33.140. www.un.org//russian/conferen/wssd/agenda21 ./

118. Yamane, T. Cultivation engineering of microbial bioplastics production/ T. Yamane // FEMS Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 103. - P. 257-264.

119. Yamane, T. Yield of poly-D(-)-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: a theoretical study/ T. Yamane // Biotechnol. Bioeng. 1993. - Vol. 41. -P. 165-170.

120. Yamane, T. Increased PHB productivity by high-cell-density fed-batch culture of Alcaligenes latus, a growth-associated PHB producer/ T. Yamane, M. Fukunage, Y.W Lee // Biotechnol. Bioeng. 1996. - Vol. 50. - P. 197-202.

121. Yang, Y.H Improved detergent-based recovery of polihydroxyalkanoates (PHAs) / Y.H. Yang, C. Brigham, L. Willis, C. Rha, A. Sinskey// Biotechnol Lett. 2011,- V 33: 937-942.

122. Yu, Ga-er. Characterization of low molecular weight poly(3-hydroxybutyrate)s from alkaline and acid hydrolis/ Ga-er Yu. R.H. Marchessault //-2000.-V. 41.-P. 1087-1098.

123. Yun, Y.H. Hyaluronan microspheres for sustained gene delivery and site-specific targeting/ Y.H. Yun, D.J. Goetz, P. Yellen // Biomaterials. 2004. -Vol. 25.-P. 147-157.

124. Zinn, M. Biosynthesis of medium-chain-kength poly(R)-3-hydroxyalkanoates. // Microbiol. Monogr. Plastics from bacteria. Natural functions and applications / Eds. G.-Q. Chen, A. Steinbüchel. Springer. -2010.-Vol. 14.-P. 213-236.