Структурообразующие факторы и механизмы формирования пространственных структур в популяции социальных амеб Dictyostelium dicoideum: Эксперим. исслед. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Кравченко, Валерия Васильевна

• Кравченко, Валерия Васильевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кравченко, Валерия Васильевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. ОШуозгеНит сИясо1с1еит

1.1.1 .Таксономическое положение ВШуо51еИит сИзсогйеит

1.1.2. Жизненный цикл ОШуоз1еИит сИзссяс1еит

1.2. Регуляторные посредники ВШуо81еИит сИ$со1с1еит

1.2.1. Функция аденозин-3'5'-циклофосфата в жизненном цикле В'1с1уо.ч1еИит сИзсо1с1еит

1.2.2. Функция фолиевой кислоты в жизненном цикле ВгМуоь^еИит сИбсо1с1еит

Краткая характеристика физических и химических свойств фолиевой кислоты

Хемотаксисно активная часть молекулы фолиевой кислоты

Инактивация хемотаксисного сигнала фолиевой кислоты

Клеточные рецепторы фолиевой кислоты

Секреция фолиевой кислоты клетками ВШуо81еИит <И5со1с1еит

Биохимические функции птериновых коферментов

1.3. Кольца Лизеганга

1.3.1. Краткая история вопроса

Влияние физико-химических факторов на формирование колец Лизеганга

1.3.2. Теории формирования колец Лизеганга

ГЛАВА II. Методики

Культивирование популяции ВШуо81еИит сИ$со1с1еит

Измерение концентрации фолиевой кислоты

Измерение кислотности субстрата

ГЛАВА Ш. Структурная модификация внешней среды микроорганизмами на примере формирования колец Лизеганга вокруг популяции ОШуон1еИит йЬсо1Леит

3.1. Динамика формирования периодических структур

3.2. Условия формирования колец Лизеганга

3.3. Параметры среды, определяющие формирование колец Лизеганга

Распределение фолиевой кислоты в субстрате при образовании колец Лизеганга

Изменение кислотности среды при образовании колец Лизеганга

Влияние рН на формирование колец Лизеганга

3.4. Модификация колец Лизеганга

3.5. Обсуждение

ГЛАВА IV. Модификации пространственной организации колонии

йксоиЫит под действием изменений внешней среды

4.1. Динамика формирования пространственной структуры колонии ВШуо$1еИит сИясо1с1еит при культивировании на бактериальном газоне

4.2. Кислотность субстрата как структурообразующий фактор колонии Вгс1уоя{е1шт сИясо1с1еит

Модификация пространственной организации популяции

О. (И8со1йеит, растущей на бактериальном газоне

Модификация пространственной структуры колонии О. (Изсохйеит, растущей без бактериального газона

4.3. Влияние распределения фолиевой кислоты на пространственную структуру колонии В1с1уо81еИит сИзсо\(1еит

4.4. Обсуждение

Выводы

Список публикаций Список литературы

62

Условные обозначения

цАМФ - аденозин-3'5'-циклофосфат ФК - фолиевая кислота

ДАФК - 2-дезамино-2гидроксифолиевая кислота FAS - C9-N10 гидролизирующий фермент

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурообразующие факторы и механизмы формирования пространственных структур в популяции социальных амеб Dictyostelium dicoideum: Эксперим. исслед.»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Микроорганизмы привлекают внимание не только микробиологов, но и специалистов в других областях - генетиков, биохимиков, биофизиков, почвоведов. Это связано с тем, что микроорганизмы оказались очень удобными объектами для изучения процессов, лежащих в основе жизни на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Одним из аспектов исследований является анализ социальной жизни микроорганизмов.

Популяция социальных амеб Dictyostelium discoideum (D. discoideum) в естественных условиях развивается в почве в сообществе организмов различной организации. Большой интерес представляет исследование взаимоотношений простейших с другими микроорганизмами, в частности, взаимодействие D. discoideum и Escherihia coli (Е. coli). В природной обстановке микроорганизмы образуют сложные устойчивые микроценозы (0.05-5 мм в диаметре), которые иногда включают и автотрофный компонент; тогда они служат реальной природной структурой, соответствующей представлению о простейшей экосистеме. Изучение механизмов устойчивости и путей метаморфоз в сообществах микроорганизмов представляет интересный аспект исследований.

Почва как среда обитания — сложная система, состоящая из твердой, жидкой и газообразной фаз, которые обладают химическим составом непостоянным во времени. Кроме того, условия жизни почвенных микроорганизмов усложняют колебания различных физических факторов: температуры, влажности, аэрации. Поэтому для успешного развития почвенных микроорганизмов, в частности, D. discoideum большое значение имеет способность простейших противостоять «давлению» внешней среды. Механизм приспособления колоний простейших к различным лимитирующим факторам окружающей среды - одно из важнейших направлений биологических исследований.

Цели и задачи исследования

Живые системы не только приспосабливаются к условиям внешней среды, но и в свою очередь способны на нее заметно влиять. В связи с этим большой интерес представляет анализ воздействия популяций микроорганизмов, в частности, Э. (Изсогйеит как локального биотического фактора биогеоценоза, на окружающую среду. Целью диссертационной работы является анализ взаимодействий в модельной системе «микроорганизмы <-» среда» на примере экспериментального исследования взаимосвязи между структурными изменениями внешней среды, индуцированными популяциями микроорганизмов, с одной стороны, и влиянием этих изменений на поведение самих популяций, с другой. Задачи исследований:

1) определение пространственно-временных характеристик популяционных структур, формируемых социальными амебами О. сИзсо1с1еит\

2) анализ воздействия популяций микроорганизмов на среду обитания;

3) установление взаимосвязи биотических и абиотических факторов, определяющих развитие колонии В. (Изсогйеит,

4) определение модификаций пространственной структуры колонии £>. (Изсогйеит, в зависимости от начальных условий культивирования микроорганизмов.

Научная новизна

1. Впервые описано формирование колец Лизеганга, инициированное жизнедеятельностью микробиологической популяции, и исследован механизм его формирования.

2. Определены пространственно-временные характеристики колоний О. сИясо1с1еит.

3. Показано, что пространственно-временные характеристики колонии хищника (£>. а\iscoideum) в сообществе «хищник о жертва» существенно

зависят от начальных условий культивирования популяции жертвы {Е. coli).

4. Предложен механизм модификаций структуры колоний D. discoideum, спонтанно возникающих при изменении абиотических компонентов среды в ходе культивирования колоний.

Практическая ценность

Результаты диссертационной работы могут быть использованы при исследовании базисных механизмов структурообразования в сообществах микроорганизмов. Такого типа исследования важны при разработке моделей и программ управления ростом и развитием почвенных микроценозов, для решения различных экологических задач (улучшение плодородия почв; ускорение вторичной сукцессии; совершенствование системы очистки почвы от промышленных и сельскохозяйственных ядов). Работа может представлять интерес для исследований эволюционных изменений в сообществах микроорганизмов и их воздействия посредством изменения абиотических компонентов биогеоценозов на развитие высших организмов.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на заседании Ученого Совета ИТЭБ РАН (Пущино, 1996), на конференции молодых ученых Пущинского Научного центра (Пущино, 1997), на международной конференции «Биомеханика 1998» (Москва, 1998), на ежегодном семинаре университета Регенсбурга, Германия (1998).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 7 статей.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на страницах и содержит 18 рисунков.

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Dictyostelium discoideum 1.1.1. Таксономическое положение Dictyostelium discoideum

Впервые вид Dictyostelium discoideum описал и идентифицировал Râper в 1935 г. [1]. В данной работе систематическое положение Dictyostelium discoideum представлено по классификации, разработанной для простейших Международным комитетом протозоологов в 1980 г. [2].

ПОДЦАРСТВО Protozoa Goidfuss, 1818.

ТИП Sarcomas tigophora1 Honigberger Balamuth, 1963 (Саркомастигофо-ры; по-русски этот термин можно перевести как амебы и жгутиконосцы).

ПОДТИП Sarcodina Schmarda, 1871 (Саркодовые).

НАДКЛАСС Rhizopoda von Siebold, 1845 (Корненожки).

КЛАСС Eumycetozoea Zopf, 1884 (Настоящие миксомицеты).

ПОДКЛАСС Dictyostelia (Диктиостелии).

ОТРЯД Dictyostelid2.

СЕМЕЙСТВО Dictyosteliaceae.

Таксономическое положение многих видов простейших на сегодняшний день окончательно не определено. Это связанно с новыми данными, получаемыми в ходе исследований простейших, поэтому, например, подтип Sarcodina на данном этапе развития знаний - сборный и в обозримое время возможны изменения в систематическом положении слизневых грибов.

1 В этот тип ныне включены миксомицеты (класс ЕитусеЮгоа), паразитические плазмодифореи (класс Р1а5шоё1орЬогеа), акразиевые (класс Асгаэеа) - группы амебоидных организмов, которые ранее многие микологи относили к грибам.

2 Представителей этого отряда также называют слизневыми грибами.

8

1.1.2. Жизненный цикл ШауоъгеНит йксо1йеит

В жизненном цикле £>. <Изсо1(1еит, схема которого представлена на рис. 1 [3], выделяют две фазы - одноклеточную и многоклеточную. В одноклеточной фазе популяция развивается в виде свободноживущих миксамеб, увеличивающих свою численность в результате вегетативного деления [4]. Миксамебы, или, как их часто называют, вегетативные амебы питаются различными бактериями [5]. При истощении запасов питания стадия вегетативного роста (или одноклеточная фаза развития) популяции завершается. Голодающие миксамебы - преагрегационные амебы - в течение нескольких часов претерпевают изменения в метаболизме, позволяющие им объединяться [5].

плодовое тело

формирование плодового тела

А

миграция

формирование псевдоплазмодия

миксамебы

о

-А

^>6 ч

голодание

\

\

ранняя ' агрегация

поздняя агрегация

РИС. 1. Схема жизненного цикла £>. (И$со1йеит [3].

Миксамебы - диаметр около 10 цм, время между двумя делениями - 3 ч.; псевдоплазмодий - длина составляет приблизительно 1.5-2.5 мм, ширина - 0.2-0.5 мм; высота плодового тела приблизительно 2-5 мм [5].

Вторая фаза жизненного цикла В. сИ$со1с1еит начинается со стадии агрегации. Сильно удлиненные преагрегационные амебы [65] двигаются к центральной объединяющей клетке. Движущиеся клетки собираются в ра-диально направленные потоки, разветвленные в дистальных концах. Эта стадия завершается образованием конического агрегата, который трансформируется в сигароподобную структуру, называемую псевдоплазмодием3 (отличие от истинного плазмодия в том, что клетки сохраняют свою целостность) [6]. Псевдоплазмодии, проявляющие фототаксис, термотаксис и осмотаксис [3], мигрируют подобно червям на значительные расстояния. Подвижность псевдоплазмодиев /). сИ8со1йеит является систематическим признаком данного вида [7].

Многоклеточная фаза жизненного цикла I). сИ$со1с1еит продолжается формированием плодового тела из слизевика после его остановки. В образовании плодового тела в зависимость от условий может принять участие от 10 до 100000 клеток [1]. Зрелое плодовое тело состоит из спор, ножки, образованной из вакуолизировынных паренхимных клеток и покрытой целлюлозой капсулой и базального диска [6] (развитие базального диска, характерное только плодовых тел /). (И8со1с1еит, является еще одним систематическим признаком этого вида [7]). В благоприятных условиях из проросших спор возобновляется развитие вегетативных амеб.

Жизненный цикл £>. сИ$со1с1еит завершается в течение 2-3 дней [6].

1.2. Регуляторные посредники ВШуоПгИит йксо 'ьйеит

Процессы жизненного цикла различных слизневых грибов регулируются внеклеточными сигналами. Обнаружена большая группа соединений, которые являются межклеточными посредниками: аденозин-3'5'-циклофосфат [8], фолиевая кислота [9], птериновые производные [10], фактор поворачивания (БТР) [11], фактор плотности (СМР) [12,13], репелленты

3 В специальной литературе для обозначения этой стадии развития слизневых грибов наиболее часто пользуются другим термином - слизевик.

10

[14,15], активаторы и ингибиторы прорастания спор [16,17] и др. Регулятор-ные посредники вида D. discoideum исследованы в разной степени.

Среди множества сложных межклеточных взаимодействий в регуляции процессов роста и развития клеток D. discoideum огромную роль играет хемотаксис. В зависимости от стадии жизненного цикла клетки D. discoideum проявляют хемотаксисную чувствительность к разным аттрактантам. ФК является аттрактантом одноклеточной фазы развития; цАМФ проявляет своё действие на стадии агрегации. Механизм взаимодействия клеток D. discoideum с вышеназванными аттрактантами аналогичен гормональным регуляторным механизмам позвоночных. В связи с этим, будучи простым объектом наблюдения, D. discoideum широко используется для исследований молекулярного механизма гормонально-подобных сигналов. Эти исследования были начаты с изучения функции и механизма воздействия цАМФ при формировании псевдоплазмодия и плодового тела.

1.2.1. Функция аденозин-3'5'-циклофосфата в жизненном цикле

Dictyostelium discoideum

В начале столетия Olive и Potts предположили, что преагрегирующие амебы приобретают способность реагировать на хемотаксисный сигнал [5]. Первые эксперименты, подтвердившие хемотаксисный контроль агрегации амеб, были выполнены Runyon в 1942 г. [5]. Bonner в 1947 г. на основе экспериментальных наблюдений выдвинул предположение, что агрегирующие амебы секретируют хемоаттрактант [18]. Только в 1969 году было установлено, что таким хемоаттрактантом является цАМФ [8], пороговая концентрация которого для хемотаксисного ответа клеток составляет 10"6 - 10"7 М. Чувствительность к цАМФ амебы приобретают в течение 4-х часов голодания [5]. Таким образом, первичным проявлением изменения метаболизма голодающих амеб является секреция цАМФ преагрегирую-щими амебами и их способность к хемотаксисному ответу на этот аттрак-тант.

Амебы, чувствительные к цАМФ, реагируют на этот аттрактант временной активизацией аденилатциклазы, в результате внутренний уровень цАМФ поднимается [19], и клетки начинают выделять новые порции цАМФ во внеклеточную среду [20]. Количество цАМФ, выделяемого каждой клеткой, пропорционально внутриклеточной концентрации цАМФ [21]. Движение каждой клетки направлено к ближайшей клетке, секретирующей цАМФ. Таким образом, амебы собираются в потоки, направленные в сторону автоколебательного центра цАМФ [22]. Временной интервал голодания амеб является фактором, определяющим автоколебательный центр импульсов цАМФ, инициирующих агрегацию клеток.

Агрегация амеб завершается образованием многоклеточной конической структуры, формирование которой сопровождается начальными этапами дифференциации. Поэтому сформированный агрегат уже состоит из двух основных типов клеток, среди которых 80 % составляют «ргеэрог»-клетки и 20 % - «ргес1а1к»-клетки [3]. В дальнейшем менее 1 % клеток подобных «ргес1а1к»-клеткам образуют базальную пластинку. Образование новых типов клеток сопровождается активизацией различных генов [23], инициация которых наблюдается при микромолярных концентрациях цАМФ [24]. Различия между этими типами клеток усиливаются в ходе формирования и миграции псевдоплазмодия. Так например, в «ргезрог»-клетках накапливаются специфические преспоровые антигены [25], специфические преспоровые ферменты [26], увеличивается количество преспоро-вых вакулей [27]. При этом «концевая доминанта» агрегата, а впоследствии псевдоплазмодия продолжает секретировать цАМФ в виде отдельных порций. На рис. 2 представлена схема развития плодового тела И. сИзсо1йеит.

Исследование механизма воздействия цАМФ на клетки О. сИзсо1с1еит позволило выявить, что цАМФ является не только инициатором агрегации, но и играет роль морфогена [28}. Интересно, что в обоих случаях цАМФ функционирует как первичный, так и вторичный медиатор [28].

___^

0 2 4 6 8 10 12

st

pst^ st psp-

pst;.

El* psp pst

PsPHj brf-V

ЬГчИк

psp

1ГГН

psp pst

14

16

18

20

22 24 26

Время (ч)

РИС. 2. Схема формирования плодового тела D. discoideum [34].

Psp - «рге5рог»-клетки, pst - «prectalkw-клетки, br - клетки, формирующие

базальную пластинку, st - клетки ножки.

Анализ взаимодействия цАМФ с клеточной поверхностью позволили выделить четыре взаимопревращающихся рецепторные формы: Ан, AL, Bs, Bss с различными константами и скоростями диссоциации [29], кроме того в последнее время был выделен еще один рецептор (С) тщательный анализ, которого еще предстоит провести [3]. Трансдукция внеклеточного сигнала цАМФ в течение хемотаксисной агрегации амеб и во время дифференциации осуществляется одними и теми же рецепторам [30]. Однако хемотаксис-ная реакция инициируется импульсами цАМФ в наномолярных дозах через 5 минут, а для индукции генной экспрессии требуется стимуляция цАМФ в микромоллярных дозах в течение нескольких часов [24].

Большое значение в процессах агрегации и дифференциации отводят аденозину - естественному ингибитору цАМФ [30]. Показано, что аденозин подавляет импульсы цАМФ в течение агрегации D. discoideum [31] и способствует сохранению единственной «концевой доминанты» при формировании псевдоплазмодиев и плодовых тел [32]. Накопление аденозина проис-

ходит в результате гидролитического расщепления молекул цАМФ под действием фосфодистеразы [33].

Исследованию механизма формирования двух типов клеток из первоначально гомогенной массы уделяется большое внимание в связи с тем, что он представляет простую модельную систему эмбрионального развития. Более детально с этими и другими аспектами исследований роли цАМФ в жизненном цикле простейших можно познакомиться в работах [3,34,35].

1.2.2. Функция фолиевой кислоты в жизненном цикле Dictyostelium discoideum

В 1972 году Pan, Hall и Bonner [9] обнаружили, что Е. coli выделяют вещество, являющееся аттрактантом для различных слизневых грибов, в том числе, для вегетативных амеб D. discoideum. Дальнейшими исследованиями они выявили, что это вещество, предварительно названное ими бактериальным фактором, проявляло свойства ФК [9].

Анализ хемотаксисной реакции на ФК слизневых грибов, находящихся в стадии вегетативных амеб и стадии агрегации, показал, что клетки проявляли хемотаксисную чувствительность к ФК независимо от стадии жизненного цикла [9,36]. Однако для клеток D. discoideum была выявлена избирательная чувствительность к этому аттрактанту. Так, выраженную хемотаксисную реакцию имеют вегетативные амебы D. discoideum, в то время как агрегирующие клетки этого вида вообще не реагировали на ФК [36]. Для объяснения такой реакции клеток D. discoideum было выдвинуто следующее предположение [37]. Клетки сохраняют ответ к фолатам все стадии развития, но в стадии дифференциации сохраняется хемокинез к фолатам, а векторная природа движения теряется. Возобновление хемотаксисного ответа развивается на последних стадиях дифференциации клеток.

Хемотаксис к ФК и родственным соединениям (фолатам и птериди-нам), обнаруженный для всех видов слизневых грибов, как предполагают,

является необходимым компонентом механизма поиска пищи. Хемотаксис-ная реакция клеток проявляется при концентрации фолатов и птеринов 10-7-10-4 М [36].

Краткая характеристика физических и химических свойств фолиевой кислоты

Фолиевая кислота, выделенная впервые из листьев шпината [38], входит в группу циклических соединений - фолатов, которые являются производными циклических систем "птеридинов" и "птеринов". Если птеридины (например, пирамидо[4.5-Ь]пиразин) имеют во втором положении амино-, а в четвертом - оксигруппу, то такие соединения называются птеринами [39].

Соединение птерина с шря-аминобензойной кислотой дает птероевую кислоту. Усложнение молекулы птероевой кислоты путем присоединения остатков глутаминовой кислоты образует ряд фолатов (синоним - птероил-глутаматы).

Фолиевая кислота - синоним птероил-Ь(+)-глутаминовая кислота -содержит один остаток глутаминовой кислоты. Номенклатурное название фолиевой кислоты - 4'-1Ч-[(2-амино-4-окси-6-птерил)метил]аминобензоил-Ь(+)-глутаминовая кислота. Схема структуры ФК показана на рис. 3 [35], а в таблице 1 даны некоторые физико-химические свойства. (Т.к. глутамино-вая кислота - аминокислота, то фолаты в ряде случаев относят к пептидам.)

8

л.

птерин

п-аминобензойная глутаминовая

кислота

кислота

РИС 3. Схема строения ФК [35].

ТАБЛИЦА 1. Физико-химические ФК [40].

Показатель Характеристика

Состояние вещества Желтые гигроскопичные кристаллы

Эмпирическая формула C19H19N7O6

Температура плавления Не имеет определенной температуры плавления (разложение около 250°С)

Растворимость Растворяется в зависимости от рН Не растворяется в воде, органических растворителях

Максимум абсорбции; 8 - молярные коэффициенты экстинции в 0.1 N растворе ЫаОН 255, 282, 365 тр. (максимумы 255 и 365 ггщ относятся к птериновой части молекулы, а максимум 282 тц к л-аминобензойной кислоте) 25800, 25100, 9100 соответственно

Флуоресценция Голубая у продуктов окисления, с абсорбционным максимумом 470 Ш|л

Важным свойством ФК является зависимость растворимости от рН среды (табл. 2) [41]. При этом спектры поглощения ФК (рис. 4), полученные для нейтрального и кислого растворов, значительно отличаются от спектров ФК при высоких значениях рН [42]. Водные

растворы ФК (в ТАБЛИЦА 2. Растворимость ФК в водном буфере при

различных значениях рН [41].

том числе щелочные) на свету (особенно ультрафиолетовом с А, 365 нм) быстро разлагаются с образованием я-аминобензоил-глутаминовой кислоты и 6-формилптерина, окисляющегося в присутствии кислорода воздуха в

рН 3 4 5 6 7

мг/1000мл 2 8 80 2000 14000

6-птеринкарбоновую кислоту [40]. Наибольшая стабильность ФК к высокой температуре (120° С) наблюдается при рН равном 5-10 [41].

Длина волны, А

РИС. 4. Спектр поглощения ФК [42]:

(1) 0.05 N гидроксид кальция, (2) рН 7.07, (3) 0.1 N соляная кислота.

При расщеплении ФК наблюдается образование молекул: (а) 6-метил-птерина или 6-птеринкарбоновой кислоты (основной частью которых является пиримидин, который в свою очередь при расщеплении дает молекулу пиразина); (б) л-аминобензоил-Ь-глутаминовой кислоты, которая в дальнейшем расщепляется на я-аминобензойную кислоту и Ь-глутаминовую кислоту [40].

Отдельные фрагменты молекулы ФК (птерин, я-аминобензойная и глу-таминовая кислоты) и их сочетания являются факторами роста для различных организмов и имеют большое биологическое значение.

Хемотаксисно активная часть молекулы фолиевой кислоты

Исследования производных ФК, полученных заменой радикалов в разных фрагментах молекулы ФК позволили выявить хемотаксисно активную часть молекулы [36]. Замена радикалов в птерине и птеридиновом участке фолатов, показала, что чувствительность клеток й. сИ$со1с1еит по отношению к этим производным снижается, а во многих случаях производные перестают воздействовать на клетки как хемоаттрактант. Производные ФК, полученные заменой радикалов в участке глутаминовой и и-амино-бензойной кислоты фолатов, не влияют на чувствительность клеток И. сИ5со1с1еит к этим соединениям. Для определения минимального фрагмента молекулы фолатов, обладающего хемотаксисной активностью, исследовали производные пиримидинов и пиразинов. Анализ показал, что эти молекулы интактны по сравнению с ФК. Таким образом, из трех составляющих молекулы ФК для хемотаксисной активности требуется птериновая часть молекулы, а глутамат и л-аминобензоат интактны [36].

Сравнительный анализ хемотаксисного ответа вегетативных амеб £>. сИясо1с1еит на широкий ряд производных ФК и птеридина показал существенную разницу в чувствительности клеток. Так хемотаксисный ответ клеток наблюдали при минимальной концентрации фолатов 109 М, а пте-ринов Ю-7 М [36].

Исследования воздействий внешних факторов на птериновую активность ФК показали [36], что тепло, рН и ионные изменения, обычно встречаемые в биологических системах, не влияют на птериновую активность. В то же время под действием УФ света молекулы ФК разрушаются до птерина через два промежуточных соединения, к которым также могут проявлять хемотаксисную активность клетки отряда В'ШуоШеИй.

Инактивация хемотаксисного сигнала фолиевой кислоты

Оптимальный хемотаксисный ответ обычно наблюдается при крутом градиенте аттрактанта, низкая концентрация которого должна сохраняться за клеточным фронтом, формирующим градиент благодаря действию инак-

тивирующих ферментов. Необходимость выполнения этих условий экспериментально показана для цАМФ хемотаксисной реакции [43].

Фермент, выделенный из штаммов D. discoideum, катализирует гидролитическое дезаминирование ФК и птерина, с образованием 2-гидрокси-2-дезамино-фолиевой кислоты [44]. Исследования позволили выяснить, что таким ферментом, выделяемым клетками слизневых грибов, является пте-риндезаминаза (ЕС 3.5.4.11.) [45]. Оптимальное значение pH для птеринде-заминазной активности находится в интервале значений 6.3-6.7, максимальная активность этого фермента наблюдается при pH 6.5 [46].

Различают три типа дезаминазы D. discoideum в зависимости от области локализации: во внеклеточной среде, на поверхности клеточной мембраны и во внутриклеточной среде [44]. При одинаковой субстратной специфичности [47] эти ферменты отличаются по некоторым характеристикам. В зависимости от локализации они имеют различные оптимальные значения pH (pHopt). Так, внеклеточный фермент имеет самое низкое значение pHopt (6.0). Этот же параметр для фермента, связанного с клеточной поверхностью, и внутриклеточного фермента равен 7.0 и 8.0 соответственно [47]. Одинаковую стабильность все три дезаминазы проявили при -18° С в течение менее 48 ч. При 4° С активность внеклеточной дезаминазы составляет 80-90 % от ее активности при 20° С, в то время как активность внутриклеточного фермента при 4° С составляет только 40-50 % от его активности при 20° С [47].

Скорость секреции и активность этих трех дезаминаз зависят от фазы жизненного цикла. Максимальная секреция внеклеточного фермента наблюдается для вегетативных амеб и, хотя обнаруживается секреция этого фермента и дифференцирующимися клетками D. discoideum [48], его активность значительно уменьшается в течение дифференциации [47]. Однако активность внеклеточной дезаминазы возрастает в первые 1.75 ч. голодания [45]. Фермент расположенный на клеточной поверхности менее активен, чем внеклеточный фермент, но и его активность уменьшается вдвое в течение 6-часового голодания клеток по сравнению с вегетативными амебами

19

[47,45]. Аналогичное снижение активности в течение развития отмечается и для внутриклеточного фермента [47]. Интересно, что дезаминазная активность повышается не только при увеличении концентрации ФК и птерина, но и цАМФ [45], что, по-видимому, обусловлено общим сигнальном путем системы для обоих аттрактантов (ФК и цАМФ).

Сравнительный анализ действия производных ФК на ингибирование связи ФК с дезаминазой и с клеточной поверхностью позволил предположить, что участки связывания ФК с дезаминазой отличаются от участков связывания ФК, вовлеченых в хемотаксис [49].

Исследование кинетических характеристик взаимодействия дезамина-зы с ФК и птерином показал, что клетки секретируют два типа внеклеточной дезаминазы [45]. Неспецифическая дезаминаза обладает низким сродством к ФК и в этом случае ФК и птерин являются конкурентными субстратами. Специфическая дезаминаза, обладающая высоким сродством к ФК, не взаимодействует с птерином, по-видимому, наибольшее ее количество расположено на клеточной поверхности [45].

Различия в локализации дезаминазы и сопутствующие особенности ряда свойств, возможно, объясняются различием выполняемых функций. Внеклеточный фермент участвует в формировании градиента ФК, необходимого для хемотаксиса. Фермент расположенный на поверхности мембраны препятствует насыщению рецепторов ФК. Внутриклеточный фермент необходим для регуляции клеточного развития [50].

Вторым ферментом, регулирующим активность ФК, является C9-N10 гидролизирующий фермент (FAS, folic acid splitting enzyme, C9-N10 bond cleavage), который впервые был определен для вида D. minutum (1980 г.) [51]. Исследование этого фермента в популяции D. discoideum показало, что он присутствует как на клеточной поверхности, так и во внеклеточной среде [52,53], хотя в концентрациях более низких, чем дезаминаза. Основные исследования этого фермента проведены с видом D. minutum, где он выполняет основную функцию инактивации фолатов, а дезаминаза в этом случае является вспомогательным ферментом. FAS расщепляет молекулы ФК и

молекулы производных ФК, после воздействия на них дезаминазы. На рис. 5 представлена схема действия ферментов, инактивирующих ФК [35].

РИС. 5. Схема действия ферментов, инактивирующих ФК [35].

1 — дезаминаза; 2 — FAS.

Продуктом каталитической реакции дезаминазы с ФК является 2-деза-мино-2гидроксифолиевая кислота (дезамино-фолиевая кислота - ДАФК) [54]. Для вида D. discoideum ДАФК хемотаксисно неактивна для физиологических концентраций [44,54], хотя слабый хемотаксисный ответ наблюдается при концентрации ДАФК 0.1 мМ [52]. Ее эффективность как аттрактанта, по крайней мере, в 1000-10000 раз меньше по сравнению с ФК [55]. Будучи хемотаксисно неактивной, ДАФК при высоких концентрациях ингибирует взаимодействие клеток с молекулами ФК, действуя подобно антагонисту ФК [49]. ДАФМ инактивируется при помощи FAS (рис. 5) с образованием я-аминобензоилглутамата и лумазин-6-карбоксиальдегида [51,56].

Клеточные рецепторы фолиевой кислоты

В результате исследований рецепторов ФК клеточной поверхности было выделено несколько классов независимых рецепторов, проявляющих различную специфичность к ФК и ее антагонисту ДАФК [52,54] и взаимодействующих с различными ферментами, инактивирующими данные лиган-ды. Первый из обнаруженных рецепторов - А-рецептор с равной степенью

сродства взаимодействует с ФК и ДАФК. В этом случае ферментом, дезактивирующим фолаты, является FAS. Второй рецептор - B-рецептор связывается избирательно с ФК, проявляя при этом в 100 раз более высокое сродство к ФК, чем к ДФК. В этом случае ФК инактивируется ПДА. Кроме того, эти классы рецепторов, по-видимому, стимулируют синтез различных вторичных медиаторов [57]. Детальное кинетическое исследование А- и B-рецепторов на интактных клетках и на изолированных мембранах позволило обнаружить существование двух взаимопревращающихся субклассов А-рецепторов: Ан - рецепторы с низким сродством к ФК (Ка=60 нМ), AL -рецептор с высоким сродством к ФК (Kd=400 нМ) и трех взаимопревращающихся кинетических типов B-рецепторов (Kd=17 нМ), отличающихся по скоростям реакций (BF, Bs, Bss)[58]. Дальнейшие исследования показали, что существует третий класс рецепторов ФК - С-рецептор, имеющий два субкласса: Cs - быстро взаимодействующий с молекулами ФК (Kd=15 нМ) и CF - медленно взаимодействующий с ФК (Kd=50 нМ) [59]. Интересно, что аналогичные классы рецепторов были выделены и для молекул цАМФ (см. раздел 1.2.1).

Количество рецепторов ФК, расположенных на одной интактной амебе D. discoideum, оценивалось по количеству меченых молекул ФК, связываемых клеткой в пределах 30 сек. Было показано, что на поверхности одной клетки расположено порядка 105 рецепторов [60]. Исследование субклассов А-рецепторов показало, что при взаимодействии с ФК первоначальное соотношение 16 % Ан (рецепторы высокого сродства к ФК) 84 % и AL (рецепторы низкого сродства к ФК) выравнивается при их общем количестве около 16000 [59]. Количество B-рецепторов (приблизительно 550) меньше по сравнению с количеством А-рецепторов, но их сродство к ФК выше [58]. При общем количестве около 1500 С-рецепторов первоначальное соотношение субклассов меняется от 10 % до 3 % Cs и от 90 % до 97 % CF [59]. Кроме того, количество всех типов рецепторов, взаимодействующих с внеклеточной ФК, меняется в зависимости от фазы жизненного цикла D. discoideum. Так, вскоре после конца вегетативной фазы насчитывается

6 104 рецепторов на клетку и 3 104 - спустя 10 часов голодания [61]. Этот небольшой спад, соответствует неспособности клеток отвечать хемотаксисно на ФК уже через 6 часов после окончания роста [61]. По другим данным количество всех типов рецепторов взаимодействующих с внеклеточной ФК незначительно увеличивается в течение 2 часов голодания, но затем уменьшается в процессе агрегации до 10 % и менее от первоначального количества [56]. Считают, что в период раннего развития количество рецепторов ФК и их сродство не изменяется [62].

Анализ специфичности взаимодействия рецепторов с фолатами и пте-ринами позволяет предположить, что несмотря на сходство хемотаксисной активности фолатов и птеринов, эти аттрактанты взаимодействуют с различными рецепторами клеточной поверхности [54]. Такая специфичность рецепторов была выявлена в результате исследования воздействия на клетки 6-аминоптерина, который является специфическим антагонистом пте-рин-индуцированного хемотаксиса [54], метотрексатом и 4-аминофолиевой кислоты, которые подавляют секрецию цАМФ при взаимодействии клеток с ФК (не влияя на секрецию цАМФ, стимулированную птерином) [63].

Сравнительный анализ кинетических параметров рецепторов ФК и совокупного клеточного ответа при воздействии ФК дал сходные результаты с результатами аналогичных исследований для рецепторов цАМФ на клеточной поверхности [62,35]. В то же время цАМФ не препятствует связыванию ФК. Это соответствует предположению о том, что существуют отдельные рецепторы для ФК и цАМФ [54,35].

Попытка идентифицировать белок рецептора ФК показала, что он, вероятно, локализован на поверхности клетки и является гликопротеином [60,62].

Секреция фолиевой кислоты клетками В^уоМеНит ШясоШеит Клетки различных видов семейства ВШуо$1еИасеае продуцируют ФК и пте-рины и в вегетативной стадии, и в стадии агрегации. Концентрация выделяемой ФК, определенная с помощью микробиологического анализа, клет-

ками D. discoideum (71010) в стадии вегетативных амеб составила 5.9 1 (ИМ, а в стадии агрегации - 2.4 10 7М; концентрация ФК, определенная с помощью флуоресценции, составила соответственно 0.64 10"6 М и 1.8-10'6 М. Аналогичные результаты показали еще пять исследуемых видов [36].

Предполагают, что необходимость секреции ФК (в низких концентрациях) клетками D. discoideum связана с тем, что ФК увеличивает цАМФ-связывающую активность клеток, облегчая тем самым взаимодействие с внеклеточной цАМФ [64]. Обнаружено, что в любой стадии развития клеток в присутствие ФК (при концентрациях более чем 10 7 М) происходит увеличение количества клеток, взаимодействующих с цАМФ. Подобный стимулирующий эффект ФК наблюдали как при низкой концентрации цАМФ (40 пМ), так и при высокой концентрации (220 пМ). Максимальный ответ на цАМФ клеток, голодавших 30 мин., наблюдали при концентрации ФК 10"6 М, а клеток, голодавших 3 ч. и 7.5 ч. - при концентрации ФК 10"5 М. Наибольшую чувствительность к стимулирующему влиянию ФК на связывание цАМФ проявили клетки, голодавшие 30 мин., связывание цАМФ у них возрастало в 2 раза. Причем наибольшее воздействие на связывание цАМФ оказывают импульсы ФК, а не однократное добавление [64]. Кроме того, было показано, что, если на амебы, голодавшие в течение двух часов, воздействовать импульсами ФК с временным интервалом 7-11 мин., то через 3-3,5 ч. импульсы цАМФ будут синхронизированы с временным интервалом 8 мин. [50]. Если время голодания амеб менее двух часов, то синхронизация импульсов цАМФ не наблюдается. Это исследование позволило предположить, что импульсы ФК стимулируют развитие преагрегационных амеб в агрегационно-компетентные амебы, которые становятся менее чувствительными к низким концентрациям ФК. Другими авторами [45] было показано, что импульсы растворов с низкой концентрацией ФК и птерина вызывают увеличение активности цАМФ-фосфодистеразы и подавляли увеличение активности фосфодистеразного ингибитора. ФК, локализованная внутри клетки, является источником птериновых кофер-ментов, необходимых для синтеза различных органических соединений.

Биохимические функции птериновых коферментов

В живой клетке ФК находится в виде кофермента - 5,6,7,8-тетра-гидрофолиевой кислоты (птериновый кофермент) и ее активных форм, например, 5-Н-формил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты (синонимы - фо-линовая кислота, цитроворумфактор, лейковорин). Из всех различных активных форм кофермента именно фолиновая кислота стабильна и устойчива к окислителям [65]. Другие активные формы неустойчивы и легко подвергаются воздействию окислителей, в том числе кислорода воздуха, превращаясь при этом в ФК (с отщеплением одноуглеродных групп), поэтому коферменты ФК легко претерпевают взаимопревращения [40]. Птериновый кофермент и ее активные формы в соединении со специфическими белками образуют птериноцротеидные ферментные системы, в виде которых и осуществляют свои биокаталитические функции [66].

К настоящему времени установлено [67,68], что ФК участвует в метаболизме одноуглеродистых соединений, из которых строятся такие жизненно важные вещества, как пуриновые и пиримидиновые основания, а следовательно, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и другие соединения. К основным реакциям обмена веществ, катализируемых птериновым кофер-ментом и его активными формами в содержащих их ферментных системах, относятся три типа обратимого переноса одноуглеродистых групп - фор-мильной и формиминой (-СНО и -СН=ЫН), оксиметильной и метильной(-СНгОН и -СНз) [39,40]. Птериновые коферменты катализируют реакции, приводящие к образованию или разрыву связей: С-С, Ы-С, С-Б, С-Н, КГ-Н [39]. Диапазон действия коферментов ФК весьма широк, однако детали механизма реакций с их участием недостаточно изучены.

1.3. Кольца Лизеганга 1.3.1. Краткая история вопроса

В природе многие явления связаны с периодическими процессами. Такие процессы вызывают, например, периодические сокращения сердечной мышцы, сезонные изменения в природе, изменения блеска цефеид и т.п. Одним из наиболее интересных проявлений периодических процессов в природе являются наслоения некоторых минералов (агатов, яшмы, малахитов и др.). Их рассматривают как частный случай структур, называемых кольцами Лизе-ганга.

В ¡896 г. Лизеганг [69] опубликовал результаты экспериментов, в которых отложение осадка (например, хромата серебра в желатине) про-исходпо не непрерывно, а периодически и сопровождалось формированием колец (рис. 6). Эксперименты Лизеганга, ставшие классическими, состояли в следующем: на тщательно вымытую стеклянную пластинку, установленную строго горизонтально, наливался тонким слоем расплавленная желатина или агар, содержащий какой-либо электролит (В). В центр агаризо-ванного раствора после застывания добавлялся раствор другого электролита (А), который при взаимодействии с первым образует осадок.

РИС. 6. Кольца Лизеганга на плоской поверхности [69].

Другой метод получения периодических слоев осадка применил Гатчек [70]. Агаризованный раствор электролита (В) наливается в пробирку, после застывания которого добавляется раствор другого электролита (А), В этом»случае образующийся осадок инициирует формирование параллельных дисков, расположенных перпендикулярно оси пробирки (рис. 7).

Во. Оствальд [71], усовершенствовав метод Гатчека, получил параллельные диски осадков в водном (неагаризованном) растворе электролитов в стеклянных капиллярах. В 1930 г. Морзе [72] опубликовал еще одну методику формирования колец Лизеганга в водной среде. Капля электролита (В) наносилась на предметное стекло, на которое помещалось покровное стекло. В покровном стекле предварительно вы-травли отверстие, через которое поступал раствор второго электролита (А). Результаты исследований показали, что многие соли серебра, свинца марганца, ртути и др. образуют колца Лизеганга в водных растворах [73].

В ряде случаев структуры Лизеганга имеют вид спиралей (рис. В), причем с равной вероятностью наблюдаются как левые, так и правые спирали [75]. Образование спиралей объясняется неравномерностью изменения длины волны на одном и том же радиусе вследствие неоднородности плотности среды. Эти неоднородности вызывают неравномерное изменение скорости диффузии, что было подтверждено экспериментально [75].

РИС. 7. Кольца Лизеганга в пробирке [70).

Влияние физико-хи.пических факторов на формирование колец Лизеганга Большое внимание было уделено анализу влияния различных факторов на формирование колец Лизеганга. Отмечено, что в процессе образования таких структур особенно большое значение имеет концентрация внутреннего (В) и внешнего (А) компонентов реакции [76]. Однако для конечной картины реакции имеют значение не столько абсолютные величины концентраций реагентов, сколько их отношения. Чтобы получить четкие картины колец необходимо, чтобы раствор (В) был менее концентрированный по сравнению с раствором (А). Кроме того, различно влияние изменения концентрации внутреннего и внешнего реактива на пространственную структуру. Изменение концентрации внешнего реактива влияет на характер отложений главным образом количественно, а внутреннего реактива вызывает резкие качественные изменения картины всего процесса. На образование колец существенное влияние оказывает распределение реактивов в системе, т.е. то, какой компонент является внешним, а какой внутренним [73]. Иногда из-за перемены реактивов полностью останавливается процесс формирования колец.

Помимо концентрации реактивов на образование колец Лизеганга оказывает также влияние концентрация отвердителя (желатина или агара) [77]. Расстояние между наслоениями уменьшаются с увеличением концент-

РИС. 8. Структура Лизеганга, в виде спирали [74].

раций реактивов и отвердителя. Наиболее четкие кольца получаются при концентрации желатина 3-5 %, агара 0.5-1 % [77]. Кроме того, на характер колец и их возникновение может оказать влияние выбор отвердителя и даже их сорта.

Влияние кислотности среды также весьма существенно для образования колец Лизеганга. Например, Дезай и Набар [78] отметили, что с уменьшением рН желатины уменьшается расстояние между наслоениями, а при определенных значениях рН наблюдается формирование спиральных структур. Интересные результаты были получены при исследовании влияния электромагнитных волн на образование колец Лизеганга [79]. В частности, было показано, что периодические структуры чувствительны к длине волны. Такую чувствительность можно объяснить образованием дополнительных соединений [79]. Кроме того, было исследовано воздействие постоянных электрических и магнитных полей, температуры, природы среды (газообразная, жидкая, гелеобразная, твердая (гипс)), наличия различных органических и неорганических примесей в среде и пр. [73].

Особенно активно кольца Лизеганга исследовались в начале века. Результаты этих исследований обогащены в блестящей книге Шемякина и Михалева [73].

1.3.2. Теории формирования колец Лизеганга

В ¡922 году Шлейснер [80] сформулировал эмпирическое правило: Хп/Хп-1=К1, отражающее зависимость радиуса колец Лизеганга (х) от их порядкового номера (п); таким образом, радиус колец Лизеганга возрастает в геометрической прогрессии. Правило Шлейснер а широко используется, в частности, для идентификации колец Лизеганга. Кроме того, были найдены и другие эмпирические закономерности, связывающие между собой параметры колец Лизеганга [73]. Закономерность Сюзанны Вейль: п= - связывает порядковый номер кольца (п) с расстоянием между двумя соседними кольцами (Ь). Морзе и Пирс установили, что для всех колец Лизе-

ганга при постоянных начальных условиях существует соотношение хМ=Кг, где х - расстояние между кольцами, X - время, необходимое для диффузии реагента на расстояние х. Известна также закономерность Ябл-жинского (установленная Яблжинским и Шлейснером), которая показывает взаимосвязь между соседними кольцами (Ьп-Ьп-1)/(Ьп-1-Ьп-2):::Кз. Все эти закономерности подтверждены экспериментально, однако величины констант существенным образом зависят от начальных условий реакции и могут колебаться для каждого эксперимента.

Открытие колец Лизеганага повлекло за собой создание ряда теорий этого явления. Первое теоретическое объяснение было предложено Ви. Оствальдом в 1897 г. [81]. Именно ей в настоящее время отдается предпочтение при разработках математических моделей формирования колец Лизе-

ганга. Согласно этой теории растворы электролитов А и В, диффундируя

и

навстречу друг друга, образуют пересыщенный раствор нового соединения (С), сразу не осаждающееся. Периодичность пространственной структуры обусловлена переходом продукта реакции С из метастабильного состояния в лабильное. Когда концентрация С достигает метастабильной границы, начинается выпадение осадка, что, по Оствальду, и служит доказательством существования метастабильной границы. Образование наслоений усиливается передвижением пересыщенного раствора С, расположенного за метастабильной границей. Этот раствор сносится током диффундирующего внешнего компонента. За метастабильной границей, при встрече потока внешнего реагента с новыми порциями внутреннего, вновь начинается образование перенасыщенного раствора продукта реакции, концентрация которого возрастает, пока вновь не достигнет метастабильной границы. Повторение этих процессов приводит к формированию колец Лизеганга.

В 1922 г. Даар и Четтержи [82] сформулировали коагуляционную теорию формирования колец Лизеганга, согласно которой продукт реакции С перед осаждением сначала образует коллоидный раствор, неспособный к диффузии (для механизма формирования к Лизеганга), затем, вследствие коагуляции коллоидного раствора избытком диффундирующего реагента

А, образуется осадок. Вблизи осадка золь коагулирует и поглощается им, благодаря чему образуется зона, лишенная осадка. В экспериментах Даар и Четтержиьра&о-тах? было показано, что многие осадки способны вызывать коагуляцию и адсорбировать свои золи.

Математическая теория образования колец Лизеганга в одномерном пространстве была предложена в работе Зельдовича с соавторами^ [83]. ^ Дальнейшее развитие теории формирования колец Лизеганга было развито в работах Дии [84]. Разработанная им модель типа «реакция - диффузия»:

=дх2а - каЬ, д1Ь=(02/П1)дх2Ь - каЬ, д,с=(В3/В1)дх2с - каЪ - и, где а, Ъ, с - концентрации реагантов А, В и продукта реакции С соответственно; Б1, £)2, - коэффициенты диффузии реагантов А, В и продукта реакции С соответственно, а функционал и описывает образование осадка из продукта реакции С, - позволила в численных экспериментах верифицировать модель и исследовать её решения в пространстве параметров. Оказалось, что структуры Лизеганга, полученные в модельных экспериментах, могут формироваться только в узкой области параметров, что согласуется с результатами экспериментов.

В 1994 г. Чопард с сотрудниками [85]. предложили модель типа клеточных автоматов и показали, что разработанное ими микроскопическое описание процессов, лежащих в основе образования колец Лизеганга, хорошо согласуется с развитыми ранее [73] макроскопическими моделями. Кроме того, ими была установлена зависимость между шириной кольца (\у) и расстоянием между кольцами (х), выражающуюся соотношением \уп~хпа, где а зависит начальных концентраций компонентов реакции А и В. В численных экспериментах им удалось показать, что флуктуации плотности реагентов могут инициировать формирование структур Лизеганга в виде спиралей.

ГЛАВА П. Методики

Культивирование популяции Dictyostelium discoideum

Популяция Dictyostelium discoideum (D. discoideum) VKMF1933 культивировалась на полусинтетическом субстрате. В работе использовали несколько композиций питательного субстрата. Состав субстрата (I) соответствовал классическим композициям субстрата [1], применяемым для культивирования всех видов Dictyostelium, и содержал: агар - 2 %, глюкозу -0.5%, дрожжевой экстракт - 0.05%, пептон - 0.5%. Субстрат (И) - это модификация субстрата (I), от которого он отличается отсутствием глюкозы.

Для ряда экспериментов перед инокуляцией спор D. discoideum на питательных субстратах I и II при 23° С предварительно формировали бактериальный газон из Escherichia coli (Е. coli В/г), который является основным источником питания амеб D. discoideum. Бактерии в этом случае являются источником накопления ФК в субстрате. Таким образом, мы создавали условия, приближенные к естественным условиям обитания D. discoideum.

В других экспериментах мы использовали модельную систему культивирования D. discoideum без бактериального газона. Питательный субстрат (III), содержащий: агар - 0.5 %, глюкозу - 0.5 %, дрожжевой экстракт -0.05%, обогащался Ю-3 М раствором ФК в соотношении 1:0.01.

Все питательные субстраты были приготовлены на фосфатном буфере (КН2Р04 - 2.25 г/л, К2НРО4ЗН2О - 0.87 г/л, MgS04-7H20 - 0.5 г/л) [1]. Во всех экспериментах температура культивирования равнялась 23° С [1], время культивирования - 4 суток, толщина слоя питательной среды - около 2 мм.

Споры D. discoideum (с 7 или 10 плодовых тел) точечно инокулирова-лись на поверхность агаровой подложки. Вслед за этим начиналось развитие вегетативных амеб и распространение популяции D. discoideum по поверхности агара.

Изображения пространственных структур были получены с помощью видеокамеры SONY ХС711Р, установленной на микроскопе МБС-2, с последующим компьютерным контрастированием.

Измерение концентрации фолиевой кислоты

Для определения концентрации фолиевой кислоты в различных участках субстрата брались по 5 проб диаметром 2 мм каждая (объем одной пробы около 6 мм3) с интервалом 24 часа в течение четырех суток после начала культивирования. Образцы помещались в 0.6 мл 0.1 N [86] раствор NaOH на 30 мин. при 20° С, после чего центрифугировалась 15 мин. при 5000 g. Супернатант отбирался для спектрофотометрического анализа.

Спектры поглощения ФК регистрировались на спектрофотометре Specord UV-VIS. Концентрацию ФК определяли при 200 С, используя коэффициент экстинкции 8365= 9 1 00 для 0.1 N NaOH (см. табл. 1).

Измерение кислотности субстрата

Для определения рН в различных участках субстрата брались по 5 проб (объем одной пробы около 6 мм3) с интервалом 24 часа в течение четырех суток после начала культивирования. Образцы помещались на мембрану из .фильтровальной бумаги, пропитанную 0.9 % раствором NaCl. Измерения рН таких образцов проводились при помощи рН-чувствительного полевого транзистора [87] при 25° С. В качестве электрода сравнения использовался хлорсеребряный-электрод. Значение рН субстрата определяли на основе предварительных калибровок, построенных по стандартным титрам (1.68 и 6.86).

Для определения рН бактериального газона в течение 18 часов после начала культивирования бактериального газона с интервалом 3 часа в раз-

т

личных участках субстрата вырезался образец площадью 50 мм2. Образец помещался на поверхность рН-чувствительного полевого транзистора. Измерения рН проводили при 22° С, используя метод, описанный выше.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Кравченко, Валерия Васильевна

Выводы

Проведен сравнительный анализ развития колонии D. discoideum при культивировании на бактериальном газоне Е. coli - в условиях приближенных к естественным условиям обитания (модель А), и в отсутствии бактериального газона на питательном субстрате, насыщенном фолиевой кислотой (модель Б). Рассматривались два аспекта взаимодействий «среда <-» объект» - воздействие популяции на окружающую среду и воздействие окружающей среды на популяцию.

1. Для экспериментальной модели Б впервые был обнаружен необычный способ влияния популяций микроорганизмов на окружающую среду - формирование колец Лизеганга в питательном субстрате вокруг пространственно локализованной популяции Dictyostelium discoideum. Предложен механизм формирования этих структур.

2. Показано, что образование колец Лизеганга: а) происходит при наличии глюкозы в субстрате; б) сопровождается пространственным перераспределением фолиевой кислоты в субстрате.

3. Выявлено, что фактором, инициирующим возникновение колец Лизеганга, является закисление субстрата продуктами клеточного метаболизма.

4. Для экспериментальной модели А (система хищник - жертва) было обнаружено, что формируются два типа колоний D. discoideum, которые отличаются по распределению клеток по фазам жизненного цикла и по скорости распространения популяции. Установлено, что тип колонии зависит от временного интервала между посевом бактериального газона Е. coli и инокуляцией спор D. discoideum.

5. Анализ воздействия изменений внешней среды, индуцированных ростом клеток, на развитие популяции D. discoideum показал, что: а) резкое падение скорости распространения популяции коррелирует с уменьшением pH субстрата (в моделях А и Б); б.) распределение плотности клеток в колонии коррелирует с перераспределением фолиевой кислоты в субстрате (в модели Б).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кравченко, Валерия Васильевна, 1998 год

Список литературы

1. J.Bonner The cellular slime molds. Princeton, New Jersey: Princeton University Press, 2nd edn., 1967, 204 p.

2. N.Levine, J.Corliss, F.Cox, G.Deroux, J.Grain, B.Honigberg, G.Leabale, A.Loeblich, J.Lom, D.Lynn, E.J.Merinfeld, F.Page, G.Pojansky, V.Sprague, J.Vavra, F.Wallace, J.Weiser. A newly revised classification of the Protozoa. J. Protozool. 1980, v. 27, № 1, p. 37-58.

3. cAMF receptors and signal trandduction in Dictyostelium discoideum. A comparative study with cAMP derivatives. Ed. T.Konijn, P.J.M.Haastert. Alblasserdam: Offsetdrukkerij HavekaB.V., 1990, 110 p.

4. K.B.Raper. Dictyostelium discoideum, a new species of slime mold from decaying forest leaves. J. Agric. Res. 1937, v. 55, p. 289-316.

5. T.Konijn. Chemotaxis in the cellular slime moulds. In: Primitive sensory and communication systems. The taxec and tropisms of micro-organisms and cells. Ed. M.Carlile. London, New York, San Francisko: Academ. Press, 1975, p. 102-153.

6. M.Sussman. Developmental Physiology of the Ameboid Slime Molds. In: Biochemistry andphysiolgy of protozoa. Ed. S.Hutner, A.Lwoff. New York: Academic Press Inc., Publishers, 1955, v. II, p. 201-223.

7. K.Raper. Isolation, cultivation, and conservation of simple slime molds. Quart. Rev. Biol. 1951, v. 26, p. 169-190.

8. J.Bonner, D.Barkley., E.Hall, T.Konijn, J.Mason, G.Keefe, P.Wolfe. Acrasin, acrasinase, and the sensitivty to acrasin in Dictyostelium discoideum. Dev. Biol. 1969, v. 20, № 1, p. 72-87.

9. P.Pan, E.Hall, J.Bonner. Folic Acid as Second Chemotactic Substance in the Cellular Slime Moulds. Nature New Biology. 1972, v. 237, p. 181-182.

10. P.Haastert, R.Wit, Y.Grihpma, T.Konijn. Identification of a pterin as the acrasin of the cellular slame Dictyostelium lacteum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982, v. 79, p. 62706274.

11. P.Fisher, E.Smith, K.Williams. An extracellular chemicalsignal controlingphototactic behavior by D. discoideum slags. Cell. 1981, v. 23, p. 799-807.

12. M.Clarke, N.Dominguez, I.Yuen, R.Gomer. Growing and starving Dictyostelium cells produce distinct density-sensing factors. Developmental Biology. 1992, v. 152, № 3, p. 403-406.

13. R Jain, I.Yuen, C.Taphouse, R.Gomer. A Density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes & Development. 1992, v. 6, p. 390-400.

14. M.Keating, J.Bonner. Negative chemotaxis in cellular slame molds. J. Bacterid.. 1977, v. 130, p. 144-147.

15. P.Kakebeeke, R.Wit, S.Kohtz, T.Konijn. Negative chemotaxis in Dictyostelium and Polysphondylium. Exp. Cell Res. 1979, v. 124, p. 429-433.

16. K.Dahlerg, D.Cotter. Activators of Dictyostelium discoideum spore germination released by bacteria. Microbios Lett. 1978, v.9, p. 139-146.

17. Y.Taya, T. Yamada, S.Nishimura. Correlation between acrasins and spore germination inhibitors in cellular slime molds. J. Bacteriol. 1980, v. 143, № 2, p. 433-441.

18. J. Bonner. Evidence for the formation of cell aggregates by chemotaxis in the development of the slime mold Dictyostelium discoideum. J. Exp. Zool., 1947, v. 106, №3,p. 1-26.

19. R.Yeh, F.Chan, M.Coukell. Independent regulation of the extracellular cyclic AMP phosphodiesterase-inhibitor system and membrane differentiation by exogenous cyclic AMP in Dictyostelium discoideum. Devel. Biol. 1978, v. 66, p.361-374.

20. B.Shaffer. Secretion of cyclic AMP induced by cyclic AMP in the cellular slime mould Dictyostelium discoideum. Nature. 1975, v. 255, p. 549-552.

21. M.Dinauer, S.Mackay, P.Devreotes. Cyclic AMP relay in Dictyostelium discoideum. III. The relationship of cA MP synthesis and secretion during the cAMP signalling response. J. Cell Biol. 1980, v. 86, p. 537-544.

22. T.Konijn, J.Meene, J.Bonner, D.Barkley. The acrasin activity of adenusine 3':5'-cuclic phusphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967, v. 58, p. 1152-1154.

23. D.Blumberg, H.Lodish. Changes in the messenger RNA population during differentiation of Dictyostelium discoideum. Dev. Biol. 1980, v. 78, № 2, p. 285-300.

24. P. Shaap, R.Driel. Enduction of post-aggregative differentiation in Dictyostelium discoideum by cAMF. Evidence of involvement of the cell surface cAMF receptor. Exp. Cell Res. 1985, v. 159, № 2, p. 388-398.

25. M.Hayashi, I.Takeuchi. Quantitative studies on cell differntiation during morphugenesis of the cellular slime mold Dictyostelium discoideum. Dev. Biol. 1976, v. 50, p.302-309.

26. P.Newell, M.Sussman. Regulation of enzyme synthesis by slime mold cell assemblies embarked upon alternative developmental programs. J. Mol. Biol. 1970, v. 49,

p. 627-637.

27. J.Gregg, W.Badman. Morphogenesis and ultrastructure in Dictyostelium. Dev. Biol. 1970, v. 22, №3, p. 96-111.

28

29

30

31

32

33

34

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

J.Bonner. Induction of stalk cell differentiation by cAMP in the cellular slime mold Dictyostelium discoideum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, v. 65, p. 110-113. P.Haastert, R.Wit. Demonstration of receptor heterogeneity and affinity modulation by nonequilibrium binding experiments. The cell surface cyclic AMP receptor of Dictyostelium discoideum. J. Biol. Chem. 1984, v. 259, p. 13321-13328. P.Haastert. Binding of cAMP and adenosine derivatives to Dictyostelium discoideum cell. Relationships of binding, chemotactic and antagonistic activities. J. Biol. Chem. 1983, v. 258, p. 9634-9648.

P.Newell. Cell surface binding of adenosine to Dictyostelium discoideum and ingibition of pulsatile signaling. FEMS Microbiol. Lett. 1982, v. 13, p. 417-421. P.Schaap, M.Wang. Interactions between adenosine and oscillatory cAMP signaling regulate size and pattern in to Dictyostelium. Cell. 1986, v. 45, p. 137-144.

D. Malchow, B. Nagele, H. Schwarta, G. Gerisch. Membrane-bound cyclic AMP phosphodiesterase in chemotactucally responding cells of Dictyostelium discoideum. Eur. J. Biochem, 1972, v. 28., p. 136-142.

Regulation of size and pattern in the cellular slime molds. Ed. T.M.Konijn. Alblasserdam: Offsetdrukkerij Haveka B.V. 1987, 134 p.

Transmembrane Signals in Dictyostelium. Ed. T.Konijn. Alblasserdam: Offsetdrukkerij Haveka B.V. 1987, 194 p.

P.Pan, E.Hall, J.Bonner. Determination of the active portion of the folic acid molecule in cellular slime mold chemotaxis. J. Bacteriol. 1975, v. 122, № 1, p. 185-191. B.Varnum, D.R.Soll. Chemoresponsiveness to cAMF and folic acid during growth, development and dedifferentiation in Dictyostelium discoideum. Differentiation. 1981, v.18,№ 3, p. 151-160.

M.Mitchel, E.Snell, R.Williams. The concentration of «folic acid». J. Am. Chem. Soc., 1941, № 7, v. 63, p. 2284.

Н.Андреева. Ферменты обмена фолиевой кислоты. М.: Наука. 1974, 95 с. В.Березовский. Химия витаминов. (Гл. Птериновые витамины и коферменты) М.: Пищевая промышленность. 1973, с. 459-507.

Н.Андреева. Витамины группы фолиевой кислоты. М.: АН СССР. 1963, 65 с. .

E.Rickes, N.Trenner, J.Conn, J.Keresztesy. Adegradationproduct of rhizopterin. J. Am. Chem. 1947, v. 69, № 11, p. 2751-2752.

M.Darmon, J.Barra, P.Brachet. The role of phosphodiesterase in aggregation of Dictyostelium discoideum. J. Cell Sci. 1978, v. 31, p. 233-243.

44. P.Pan, B.Wurster. Inactivation of the chemoatiraciani folic acid by cellular slime molds and identification of the reaction product. J. Bacteriol. 1978, v. 136, № 3, p. 955-959.

45. B.Wurster, F.Bek, U.Butz. Folic acid and pterin deaminase in Dictyostelium discoideum: kinetic properties ans regulation by folic acid, pterin and adenosine У ,5'-phosphate. J. Bacteriol.. 1981, v. 148, № 1, p. 183-192.

46. Номенклатура ферментов. Пер. с англ. под ред. А.Браунштейна. М. 1979, 321 с.

47. P.l.J.Kakebeeke, R.J.W. Wit, T.M.Konijn. Folic acid deaminase activity during development in Dictyostelium discoideum. J. Bacteriol., 1980, v. 143, № 1, p. 307-312.

48. R.Blakley, V.Whitehead. Folates andpterines (nutritional, pharmacological, and physiological aspects). A Wiley-Interscience Publication. John Wiley & Sons. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore. 1986, v. 3, p. xi-xiv, 1-47.

49. B.Wurster, U.Butz. Reversible binding of the chemoattractant folic acid to cells of Dictyostelium discoideum. Eur. J. Biochem. 1980, v. 109, № 2, p. 613-618.

50. B.Wurster, K.Schubiger. Oscillations and cell development in Dictyostelium discoideum stimulated by folic acid pulses. J. Cell Sci. 1977, v. 27, p. 105-114.

51. P.Kakebeeke, R.Wit, T.Konijn. A novel chemotaxis regulating enzyme that splits folic acid into 6-hydroxymethylpterin and p-aminobenzoylglutamic acid. FEBS Letters. 1980, v. 115, №2, p. 216-220.

52. R.Wit, R.Bulgakov, J.Pinas, T.Konijn. Relationships between the ligandspecificity of cell surface folate binding sites, folate degrading enzymes and cellular responses in Dictyostelium discoideum. Biochim. Biophys. Acta. 1985, v. 814, p. 214-226.

53. R.Wit, R.Velden, T.Konijn. Characterization of the folic acid C9-C10 cleaving enzyme of Dictyostelium minutum VS. J. Bacteriol., 1983, v. 154, p. 859-863.

54. P.Haastert, R.Wit, T.Konijn. Antagonists of chemoattractant reveal separate receptors for cAMP, folic acid and pterin in Dictyostelium. Experimental Cell Research. 1982, v. 140, №2, p. 453-456.

55. J.Bonner, E.Hall, W.Sachsenmaier, B.Walker. Evidence for a second chemotactic system in the cellular slime mold Dictyostelium discoideum. J. Bacteriol., 1970, v. 102, p. 682-687.

56. B.Varnum, D.Soll. Chemoresponsiveness to cyclic AMP and folic acid during growth, developmentiation in Dictyostelium discoideum. Differentiation. 1981, v. 18, p. 151-160.

57. R.Wit, R.Bulgakov, R.Wit, T.Konijn. Developmental regulation of the pathways of folate receptor-mediated stimulation of cAMP and cGMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Differentiation. 1986, v. 32, № 3, p. 192-199.

58. R.W.Wit, P.Haastert. Binding offolates to Dictyostelium discoideum cells. Demonstration offive classes of binding sites and their inter conversion. Biochimica Biophysica Acta (M). 1985, v. 814, № 2, p. 199-213.

59. D.Malchow, J.Fuchila, B.Jastorff. Correlation of substrate specificity ofcAMP phosphodiesterase in Dictyostelium discoideum with chemotactic activity ofcAMP analogues. FEBS Letters. 1973, v. 34, p. 5-9.

60. R.Driel. Binding of the chemoattractant folic acid by Dictyostelium discoideum cells. Eur. J. Biochem. 1981, v. 115, № , p. 391-395.

61. B.Wurster, U. Butz. Reversible binding of the chemoattracrant folic acid to cells of Dictyostelium discoideum. Eur. J. Biochem. 1980, v. 109, № 2, p. 613-618.

62. G.Gerisch. Chemotactic in Dictyostelium. Annual review of physiology. 1982, v. 44, p. 535-552.

63. P.Devreotes. The effect of folic acid on cAMF-eliciled cAMFproduction in Dictyostelium discoideum. Dev. Biol. 1983, v. 95, p. 154-162.

64. S.Kawai. Folic acid increases the с AMP binding activity of Dictyostelium discoideum cells. Febs Letters. 1980, v. 109, № 1, p. 27-30.

65. W.Allen, R.Posternak, W.Seamon. Polarographic determination and evidence for the structure of leucovorin. J. Am. Chem. Soc. 1952, v. 74, p. 3264-3269.

66. K.O.Donaldson, J.C.J.Keresztesy. Naturally occurring forms of folic acid. Biol. Chem. 1959, v. 234, p. 3235-3240.

67. E.Stokstad, J.Koch. Folic acid metabolism (Review). Physiol. Rev. 1967, 47, № 1, p. 83-116.

68. В.Кретович. Введение в энзимологию. М. Наука. 1967, 336 с.

69. R.Liesegang. IIs Naturwiss. Wochenschr. 1896, v. 11, p. 353.

70. E.Hatschek.//Soc. Chem. Ind., 1911, v. 30, p. 256.

71. Wo. Ostwald. // Ibid., 1926, v. 40, p. 144.

72. H. Morse. II J. Phys. Chem. 1930, v. 34, p. 1554.

73. Ф.Шемякин, П.Михалев. Физико-химические периодические процессы. M.-JL: Изд. АН СССР. 1938, 184 с.

74. T.Bolam. //Nature. 1931, v. 128, p. 222.

75. П.Михалев, Ф.Шемякин. Влияние органических веществ на периодичность реакций. Ж. Ф. X., 1934, т. 5, с. 750-754.

8 Цитируется по работе Ф.Шемякина и П.Михалева "Физико-химические периодические процессы" (1938).

76. Ф.Шемякин. Кольца Лизеганга. Колл. Ж. 1935, т. 1, с. 35-37.

77. Ф.Шемякин, А.Лазарева. Периодические отложения карбоната ртути. ДАН СССР. 1936, т. 3, № 12, с. 371.

78. B.Desai, G.Nabar. Влияние желатины на Ag2Cr04. J. Univ. Bombay. 1932, v. 1, p. 28-30.

79. Ф.Шемякин. Автокатализ. Ж. орг. хим. 1933, № 3, с. 137-143.

80. С.A. Schleussner. // Kolloid-Z. 1922, v. 31, p. 347.

81. W.Ostwald. Lehrbuch der allgemeinen chemie. Engelman, Leipzig. 1897, v. II, № 2, p. 778.

82. N.Dhar, A.Chatteiji. // Kolloid-Z. 1927, v. 4, p. 173.

83. Я.Зельдович, Г.Баренблатт, Р.Салганик. О квазипериодическом выпадении осадков при взаимной диффузии двух веществ (кольца Лизеганга). ДАН СССР. 1961, т. 140, №6, с. 1281-1284.

84. G.Dee. Patterns produced by precipitation at a moving reaction front. Physical Review Letters. 1986, v. 57, № 3, p. 275-278.

85. B.Chopard, P.Luthi, M.Droz. Reaction-diffusion cellular automata model for the formation of liesegengpatterns. Physical Review Letters. 1994, v. 72, № 9, p. 1384-1387

86. Методы химического анализа в производстве витаминов. Под ред. В.Девятина. 1960, 360 с.

87. A.Reshetilov, A.Medvinsky, T.Eliseeva, M.Tsyganov, A.Boronin, G.Ivanitscky. pH tract of expanding bacterial populations. FEMS Microbiol. Lett., 1992, v. 94, p. 59-62.

88. J.Adler. Chemotaxis in bacteria. Science. 1966, v. 153, p. 708-716.

89. С.Бернхард. Структура и функция ферментов. M.: Мир, 1971, 336 с. (Пер. с англ. под ред. А.Браунштейна).

Ълак)уа[1Н0сй1и

Лрлчо благодарю руководителя (гаЯсним Александра Ъерельевича Медвинского за оказанную поддержку, переои^ншнь ко(норую очень /прудно. 3)о£рбжеламельное отношение и внимание, с которыми он вникал в проблемы, возникающие в ходе рабо/ны, помогли соаномнься эйгйй диссертационной рабо/не.

Тлубоко признательна заведующему лаборатории Тенриху Романовичу Шаницкому за мудрие сйв&нм и ценные замечания, ко/норме способствовали продвижению рабо/ни и более высокому уровню подготовки йьекана.

ЛрияИшо выразшпь свою призшинельноань Конанашиину "Борисовичу Лсланиди, Александру Александровичу 2)ееву, /Зшанору Ивановичу смельялеяхо, Анатолию Николаевичу Реишнилову за профессиональную помощь и ободряющую поддержку.

искренне благодарю своих коллег и со(нрудников лаборатории за внимание и дружеское учаание.

Ъиагодарю всех юно прямо или косвенно способствовали рабо/не над диссертацией.