Разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат фармацевтических наук Полевая, Елена Валерьевна

• Полевая, Елена Валерьевна
• кандидат фармацевтических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Полевая, Елена Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Сигнальные молекулы в развитии микробных популяций

1.1.1 Первые наблюдения

1.1.2 Автостимуляторы роста микроорганизмов

1.1.3 Автоингибиторы роста микроорганизмов

1.1.4 Авторегуляторы выживаемости бактерий

1.1.5 «Чувство кворума» у бактерий

1.1.6 Альтернативный вариант «чувства кворума»

1.1.7 Регуляция факторов патогенности неспецифическими сигнальными молекулами

1.2 Макроорганизм и его микрофлора, концепция суперорганизма

1.3 Метаболитные препараты

1.3.1 Принципы конструирования и основные свойства

1.3.2 Ингибирование систем «чувства кворума» - новый

подход к созданию препаратов против патогенности

бактерий

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Культуры бактерий

2.2 Культивирование чистых культур энтеробактерий

2.3 Культивирование смешанных культур энтеробактерий

2.4 Культивирование Ь. р1аШагит 8Р-АЗ и В. Ы^йит 1

2.5 Контроль роста культур бактерий

2.6 Расчет параметров кривой роста культур

2.7 Подготовка проб для хроматографического анализа

2.8 Анализ состава низкомолекулярных карбоновых кислот методом В ЭЖХ

2.9 Анализ состава аминокислот ВЭЖХ

2.10 Анализ состава экзометаболитов методом ГХ-МС

2.11 Определение биологической активности индивидуальных

экзометаболитов и их комплексов

2.11.1 Тест «инициация роста»

2.11.2 Скорость роста культур при высоких плотностях засева

2.11.3 Периодическое культивирование в колбах на качалке

2.11.4 Рост колоний на агаризованной среде

2.11.5 Гемолиз эритроцитов

2.11.6 Амплификация фрагмента гена hlyA

2.11.7 Оценка уровня экспрессии гена hlyA

2.11.8 Секвенирование фрагмента гена hlyA

2.11.9 Антагонистическая активность E.coli VL613

2.11.10 Устойчивость E.coli VL613 к стрессовым воздействиям

2.12 Показатели качества капель и растворов для приема внутрь

2.12.1 Качественный анализ

2.12.2 Потенциометрическое определение рН

2.12.3 Удельная электрическая проводимость

2.12.4 Прозрачность капель для приема внутрь

2.12.5 Микробиологическая чистота

2.12.6 Специфическая активность

2.12.7 Количественное содержание солей карбоновых кислот

и аминокислот

2.1 Статистическая обработка результатов

Глава 3 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ

БАКТЕРИЙ

3.1 Состав экзометаболитов, выделяемых пятью штаммами бактерий семейства Enterobacteriacea, Bifidobacterium bifidum

и Lactobacillus plantarum 8P-A3

3.1.1 Экзометаболиты бактерий семейства Enterobacteriacea

3.1.2 НКК5. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3

3.2 Биологическая активность внеклеточной среды и индивидуальных экзометаболитов

3.2.1 Действие внеклеточной среды на рост бактерий в стационарных условиях при низких плотностях засева (инициация роста)

3.2.2 Инициация роста экзометаболитами

3.2.3 Действие экзометаболитов на рост бактерий на агари-зованной среде

3.3 Изменение концентраций НКК в процессе роста бактерий

3.3.1 Зависимость состава и динамики НКК от способа выращивания посевного материала

3.3.2 Динамика НКК, выделяемых энтеробактериями

3.3.3 Динамика НКК, выделяемых В. bifidum 1 и L. planta-гит 8Р-АЗ

3.4 Изменение концентраций аминокислот в процессе роста бактерий

3.4.1 Зависимость состава и динамики аминокислот от способа выращивания посевного материала

3.4.2 Динамика аминокислот

3.5 Изменение концентраций экзометаболитов в процессе роста смешанных культур бактерий

3.5.1 Смешанные культуры E.coli М-17 и 075; №14; S.enteritidis

3.5.2 Сопоставление изменения численности бактерий и концентрации молочной кислоты

Глава 4 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ

4.1 Комплекс для подавления роста Е.coli Ol 5

4.2Биологическая активность комплекса для подавления роста E.coli Ol5

4.2.1 Действие комплекса на рост бактерий в колбах на качалке

4.2.2 Действие комплекса на рост смешанной культуры

E.coli 015 и М-17

4.2.3 Влияние комплекса на синтез порообразующего токсина гемолизина

4.3 Комплекс для стимуляции роста E.coli VL613

4.4 Биологическая активность комплекса для стимуляции роста E.coli VL613

4.4.1 Влияние комплекса на антагонистическую активность штамма E.coli VL613 в отношении S. enteritidis, E.coli

075 и №14

4.4.2 Действие комплекса на устойчивость E.coli VL613 к

стрессовым воздействиям

4.5 Комплекс для подавления роста S. enteritidis

Глава 5 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА КОМПЛЕКСОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ В ВИДЕ КАПЕЛЬ И РАСТВОРОВ ДЛЯ ПРИЕМА ВНУТРЬ

5.1 Разработка состава капель и растворов для приема внутрь

5.2 Показатели качества капель и растворов для приема

внутрь

5.3 Технологическая схема производства

5.4 Проекты НД на капли и растворы для приема внутрь

5.5 Определение первоначального срока годности капель и растворов для приема внутрь

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ А Акты апробации и внедрения результатов

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Таблицы

ПРИЛОЖЕНИЕ В Фармакопейная статья предприятия (проект).. 179 ПРИЛОЖЕНИЕ Г Технические условия (проект)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Микробиота является важным экстракорпоральным органом человека, влияющим на все стороны его жизнедеятельности. При нарушении количественного и качественного состава нормальных микробиоценозов (дисбактериозе) одновременно происходят трофические и гормональные нарушения, изменяется иммунный статус организма. Состояния дисбактериоза лежат в основе возникновения и развития многих инфекционных и соматических заболеваний человека. Поэтому терапевтическая тактика лечения большинства заболеваний должна включать применение специальных препаратов, предназначенных для восстановления нормальных микробиоценозов.

Причин нарушения равновесия кишечной микрофлоры много, одной из них является прием антибактериальных препаратов, которые подавляют рост и развитие не только патогенных микроорганизмов, но и представителей нормофлоры. Кроме того, антибиотикотерапия способствует селекции резистентных клонов; вызывает аллергии; отрицательно действует на почки, печень и систему кроветворения. В этой связи исключительно важен поиск возможности лечения инфекционных заболеваний путем элиминации из микробиоценозов патогенных штаммов и/или снижения уровня их патоген-ности без отрицательного воздействия на макроорганизм.

Основным способом коррекции дисбактериозов является прием про-биотических и пребиотических препаратов. Первые из них содержат живые микроорганизмы или вещества микробного происхождения, вторые - вещества немикробного происхождения, стимулирующие рост и повышающие пробиотический потенциал «полезных» представителей нормофлоры. Результат применения подобных препаратов обычно положительный, однако все происходящие изменения в микробиоценозе носят неконтролируемый характер.

В настоящее время к группе наиболее перспективных для регуляции равновесия состава кишечной микрофлоры относятся препараты на основе

бактериальных метаболитов. Однако российский фармацевтический рынок, ограничен всего двумя препаратами, которые производятся в ЕС: жидкий пробиотик «Хилак форте», содержащий молочную кислоту и продукты обмена веществ трех представителей нормальной микрофлоры и таблетиро-ванный синбиотик «Закофальк», содержащий масляную кислоту и инулин.

Таким образом, отечественных лекарственных препаратов на основе бактериальных экзометаболитов, регулирующих нарушения микрофлоры кишечника и предназначенных для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, в настоящее время не существует.

Целью работы является разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов, предназначенных для подавления роста патогенных бактерий и снижения уровня их патогенности, для стимуляции роста и повышения пробиотического потенциала нормофлоры, а также разработка технологии производства комплексов в виде капель и раствора для приема внутрь.

В процессе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать состав и динамику низкомолекулярных карбоновых кислот и аминокислот:

а) в процессе роста штаммов E.coli М-17, VL613, №14, 075 и S. enteritidis var.Issatchenko;

б) в процессе роста и инкубации штаммов молочнокислых бактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ;

в) в процессе роста смешанных культур E.coli М-17 и E.coli 075, М-17 и №14, М-17 и S. enteritidis.

2. Изучить действие экзометаболитов на рост E.coli М-17, VL613, №14, 075 и S. enteritidis.

3. Разработать технологию биологически активных комплексов на основе экзометаболитов бактерий.

4. На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать комплекс, подавляющий рост и понижающий уровень патогенности патогенно-

го штамма E.coli 015.

5. На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать биологически активный комплекс, стимулирующий рост пробиотического штамма Е.coli VL613.

6. Провести микробиологические и молекулярно-биологические исследования активности комплексов бактериальных экзометаболитов.

7. Разработать технологию производства биологически активного комплекса для подавления роста патогенного штамма E.coli Ol5 в виде капель для приема внутрь.

8. Предложить показатели качества комплекса бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli Ol5 в виде капель для приема внутрь и на основании полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи предприятия.

9. Разработать технологию производства биологически активного комплекса для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613 в виде раствора для приема внутрь. Предложить показатели качества комплекса и на основании полученных результатов разработать проект технических условий.

Научная новизна

• Впервые проведен комплексный анализ состава метаболитов, выделяемых бактериями семи штаммов: E.coli М-17, VL613, №14, 075, S. enteritidis var.Issatchenko, В. bifidum 1, L. plantarum 8P-A3. Идентифицировано более 40 соединений.

• Исследована динамика внеклеточных карбоновых кислот и аминокислот в процессе культивирования E.coli М-17, VL613, №14, 075, S. enteritidis var.Issatchenko, В. bifidum 1, L. plantarum 8P-A3. Установлено, что растущая культура активно обменивается экзометаболитами со средой, выделяя их на одних стадиях и поглощая на других, при этом концентрация экзометаболитов (карбоновых кислот) коррелирует со скоростью их роста.

• Проведен анализ изменений состава и динамики внеклеточных карбоновых кислот при выращивании смешанных культур E.coli М-17 и 075, М-17

и №14, М-17 и S. enteritidis по сравнению с чистыми культурами. Установлено, что смешанные культуры значительно отличаются от чистых по динамике и концентрации карбоновых кислот.

• Показано, что экзометаболиты стимулируют, подавляют либо не оказывают влияния на рост культур E.coli М-17, VL613, №14, 075, S. enteritidis var.Issatchenko.

• Впервые разработана технология биологически активных комплексов на основе синтетических аналогов экзометаболитов. Показано, что при получении комплексов может использоваться два подхода. Первый подход основан на анализе активности предварительно идентифицированных экзометаболитов и их сочетаний, второй подход - на использовании в качестве прототипа состава внеклеточной среды с требуемой активностью.

• Впервые на основе синтетических аналогов экзометаболитов бактерий разработан биологически активный комплекс, предназначенный для подавления роста патогенного штамма E.coli 075 и обладающий антипатогенной активностью в отношении токсина гемолизина А;

• Зарегистрирована заявка на патент «Средство, ингибирующее жизнедеятельность бактерий Escherichia coli 075 №5557» № 2012140940 от 26.09.2012.

• Показана возможность использования разработанных подходов для создания комплекса, предназначенного для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613, повышения его антагонистической активности и устойчивости к стрессовым факторам.

Практическая значимость

1. Разработанные подходы позволяют создавать аналогичные комплексы для регуляции роста продуцентов биологически активных веществ; а также лекарственные препараты с антипатогенной активностью.

2. Разработана технология производства биологически активного комплекса для подавления роста и снижения уровня патогенности штамма E.coli 075 в виде капель для приема внутрь, позволяющая добиться эффективного смешения восьми экзометаболитов в соотношении от 0,15 до 77 %.

Предложены показатели качества и разработан проект фармакопейной статьи предприятия.

3. Материалы по составу и динамике экзометаболитов семи штаммов бактерий; подходы к конструированию биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (СПХФА) при изучении дисциплины «Технология продуктов микробного синтеза» (акт внедрения от 14.12.2012).

4. На базе ООО «Биотроф» показана возможность включения в рацион животных совместно с биопрепаратом на основе штамма E.coli VL613 комплекса бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста данного штамма. Совместное использование биопрепарата и комплекса в концентрации 10 мкг/голову позволило уменьшить дозировку биопрепарата в 4 раза. Кроме того, среднесуточный привес массы у животных, получавших совместно с биопрепаратом комплекс экзометаболитов, увеличился на 10 % по сравнению с приростом в контрольной группе (акт апробации от 09.01.2013г.).

Апробация работы

Основные результаты исследований были доложены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (СПб, 2009), 6-й объединенной научной сессии и 2-ом Международном конгрессе по про-биотикам «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009» (СПб, 2009), 12-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2010» (СПб, 2010), 1-ой европейской студенческой конференции по микробной коммуникации «1st European Student Conference on Microbial Communication» (Йена, Германия, 2010), 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущи-но, 2010), Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (СПб, 2010, 2011, 2012), 13-ом Славяно-балтийском научном форуме

«Санкт-Петербург - Гастро - 2011» (СПб, 2011), Х-ом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (СПб, 2012). Публикации

Основное содержание диссертации представлено в 18 публикациях, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России «Получении и изучение фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) с целью создания инновационных лекарственных средств» (№01201252027 государственной регистрации) и планом научно-исследовательских работ Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России. Основные положения, выносимые на защиту:

• Штаммоспецифичность качественного и количественного состава экзо-метаболитов, а также их действия на рост бактериальных культур.

• Технология биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов.

• Разработка состава и технологии биологически активного комплекса бактериальных экзометаболитов, предназначенного для подавления роста и экспрессии гена фактора патогенности патогенного штамма E.coli 075.

• Разработка состава и технологии биологически активного комплекса бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста и повышения про-биотического потенциала пробиотического штамма E.coli VL613.

• Технология производства и показатели качества комплексов в виде капель и раствора для приема внутрь.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Сигнальные молекулы в развитии микробных популяций

1.1.1 Первые наблюдения

В микробиологии начало изучению процессов саморегуляции положили пионерские работы конца 19 века. Уже в то время в вопросах физиологии роста микроорганизмов исследователи выделяли две основные проблемы. Первая из них заключалась в том, почему бактерии перестают расти после достижения определенной плотности культуры, а вторая - почему они не растут сразу после засева в свежую питательную среду (то есть причины стационарной фазы и лаг-фазы роста). На основании обширного экспериментального и теоретического материала возникла концепция, в соответствии с которой развивающаяся микробная культура рассматривалась как саморегулируемая система, функционирование которой определяется не только изменением внешних условий, но и влиянием автометаболитов, контролирующих скорость роста и этапность развития культуры. Авторегуля-торные метаболиты позволяют поддерживать связь на расстоянии особям одного и того же вида.

Относительно механизмов действия этих веществ существуют два различных мнения. Большинство авторов считает, что авторегуляторным действием обладают специализированные вещества-регуляторы или феромоны, которые выделяются клетками в небольших количествах непосредственно для регулирования скорости роста популяции в соответствии с условиями развития. Эти авторегуляторы не используются микроорганизмами ни в конструктивном, ни в энергетическом обменах. Согласно другой точке зрения наряду со специализированными веществами (феромонами) регуляторами роста на популяционном уровне могут являться обыкновенные эк-зометаболиты. Биологический эффект (стимулирование, ингибирование) зависит от состава и концентрации последних.

Существуют основания полагать, что в той или иной мере справедливы обе концепции и в регуляции смены циклов развития популяции могут

принимать участие как специализированные вещества-регуляторы, так и неспецифические экзометаболиты, продукты энергетического или конструктивного метаболизма бактерий.

Все соединения, влияющие на численность популяции (независимо от того являются они специализированными регуляторами или нет), могут быть подразделены на две основные группы. К первой из них относятся соединения, оказывающие воздействие на продолжительность лаг-фазы и скорость роста культуры - автостимуляторы и автоингибиторы роста. Ко второй - вещества, влияющие аналогичным образом на выживаемость в популяции при голодании или в стрессовых ситуациях, то есть ускоряющие или замедляющие гибель бактерий.

1.1.2 Автостимуляторы роста микроорганизмов

Изучение автостимуляторов роста началось в конце 19 века и было тесно связано с работами Мюллера и других исследователей, посвященными периодизации роста культур микроорганизмов. В начале 20 века О.Раном было начато систематическое изучение бактериальных автостимуляторов. Ран обнаружил, что продолжительность лаг-периода обратно пропорциональна концентрации микроорганизмов в среде. Кроме того, им было показано, что помимо концентрации бактерий на продолжительность влияет и внеклеточная среда. На основании своих экспериментов Ран заключил, что максимальная скорость роста культуры может быть достигнута при определенной концентрации некоего термостабильного вещества, образуемого и выделяемого в среду самими бактериями. Чем выше была концентрация клеток, тем меньше времени требовалось для достижения необходимой для роста концентрации этого вещества и, следовательно, быстрее завершался лаг-период.

Аналогичные результаты вскоре были получены и некоторыми другими авторами. Так, например, Чесней показал, что при засеве отмытыми клетками, продолжительность лаг-периода была больше, чем при использовании не отмытых. Это могло свидетельствовать о том, что при пересеве

культуры стимулирующие рост вещества выделялись из внутриклеточного пространства или диссоциировали с поверхности бактерий [86].

Впоследствии стимулирующее действие фильтратов культуральной жидкости не раз подтверждалось и в более поздних работах.

Ланкфорд с соавторами изучал динамику стимуляторов при выращивании B.megaterium. Стимуляторы выделялись на всех стадиях роста культуры, а изменение стимулирующей активности в среде носило явно выраженный периодический характер. В связи с этим авторы полагали, что наличие этих соединений было необходимо для поддержания роста на всех стадиях культивирования [109]. В дальнейшем аналогичные изменения стимулирующей активности отмечались и при выращивании E.coli М-17.

Действие автостимуляторов, по-видимому, не ограничивается ускорением процесса деления клеток. Имеются основания полагать, что эти вещества способствуют репарации повреждений клеток, полученных при различных стрессовых воздействиях [8, 121].

Относительно природы автостимуляторов роста в ранних работах высказывались различные предположения. Так, например, предполагалось, что в их качестве могут выступать определенные аминокислоты [55]. По мнению других авторов автостимуляторы могут быть кофакторами определенных ферментов [73], а также комплексообразующими соединениями [83]. Одно из них, «шизокинен», повышало эффективность транспорта ионов железа у ряда представителей рода Bacillus. У E.coli аналогичные функции выполняет энтерохелин [82].

1.1.3 Автоингибиторы роста микроорганизмов

Сведения о веществах, накапливающихся во внеклеточной среде и специфически ингибирующих рост культуры, появились одновременно с исследованиями автостимуляторов роста в трудах Гарре, Пастера, а затем и ряда других авторов [128, 131]. Из ранних работ значительный интерес представляют эксперименты Бейла. При исследовании различных видов бактерий Бейл обнаружил, что для каждой из культур существует опреде-

ленная максимальная концентрация клеток (М-концентрация), выше которой культура не растет даже при наличии избытка питательных веществ. Если исходная плотность помещенной в свежую питательную среду культуры совпадала с М-концентрацией, роста бактерий не наблюдалось, а при засеве культур большей плотности происходила быстрая гибель бактерий, в результате которой концентрация клеток устанавливалась на уровне М-концентрации.

Первоначальные сведения о природе автоингибиторов носили достаточно противоречивый характер. Так, например, в работах некоторых авторов было показано, что эти соединения являются термостабильными веществами и не могут быть удалены из среды путем фильтрования. В других исследованиях, напротив, нагревание и фильтрация приводило к инактивации и удалению этих веществ [88].

При выращивании Brucella abortus ингибирующим рост фактором оказался D-аланин [79]. Ингибирующий фактор Staphylococcus epidermidis не являлся бактериоцином, имел небелковую природу, поскольку не инак-тивировался при обработке протеолитическими ферментами [123].

Низкомолекулярные автоингибиторы роста были выявлены при выращивании термофильных штаммов Bacillus, Clostridium oedematiens, E.coli М-17 и др. микроорганизмов [8, 28, 53, 87].

Действие автоингибиторов могло проявляться как на жидких, так и на плотных средах [32]. Рост некоторых микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред сопровождался экскрецией летучих автоингибиторов [61]. В работе Эль-Регистан с соавторами [71] показано наличие ав-тоингибирующих факторов для большой группы про- и эукариотических микроорганизмов. Способность образовывать эти факторы не зависела от среды выращивания микроорганизмов.

В ряде работ отмечалось ингибирующее действие продуктов катаболизма бактерий, таких как ацетат, смесь органических кислот, этанол и другие вещества. Предполагалось, что ингибирование этими соединениями

имеет неспецифический характер, а их накопление связано с ингибировани-ем определенных метаболических путей [19, 25, 58, 61].

1.1.4 Авторегуляторы выживаемости бактерий

До недавнего времени сведения об этой группе авторегуляторов были крайне немногочисленны. Можно предположить, что должно существовать два вида подобных регуляторов - позитивные, то есть замедляющие гибель бактерий и негативные или ускоряющие гибель клеток.

Стадия выживания, и в особенности популяционный ее аспект, до недавнего времени практически не привлекали внимания исследователей. Значительно больше подобных фактов имеется в экологии животных и растений. Обобщением этих фактов является так называемый принцип Олли [34], согласно которому наивысшая выживаемость растений и животных достигается при определенной плотности популяции. Аналогом этого принципа в микробиологии является представление о существовании некой максимальной концентрации бактерий (М-концентрации). Имеющиеся в литературе сведения позволяют полагать, что определяющую роль в этом процессе играют выделяемые клетками метаболиты, которые можно подразделить на две группы. К первой относятся вещества, способствующие быстрому автолизу клеток, ко второй - соединения, не вызывающие быстрого автолиза, но увеличивающие скорость гибели клеток.

К первой группе относится фактор с12, выделенный из микроорганизмов различных таксономических групп. Его активным началом являются ненасыщенные жирные кислоты. Повышение уровня фактора с!2 приводит к нарушениям структуры цитоплазматической мембраны, а затем - к изменениям энергообеспечивающих процессов клетки. Увеличение концентрации фактора &2 служит одной из причин спонтанного автолиза микроорганизмов на стационарной фазе роста [5, 27, 30, 71].

Авторегуляторы, увеличивающие скорость гибели микроорганизмов, но не способствующие автолизу клеток были обнаружены в составе внеклеточных сред дефектного по синтезу триптофана штамма В.яиЫШз [114] и

при голодании K.aerogenes в присутствии ускоряющего гибель субстрата [133]. Действие первых на клетки, по-видимому, являлось обратимым, поскольку жизнеспособность бактерий восстанавливалась при добавлении триптофана или разбавлении внеклеточной средой, формируемой микроорганизмами в процессе голодания. Ускоряющие гибель соединения, увеличивающие проницаемость (т.е. усиливающие деградацию) поверхностных структур бактерий, но не способствующие деградации РНК и ДНК были обнаружены в среде голодания E.coli М-17.

1.1.5 «Чувство кворума» у бактерий

Многие исследователи долгое время считали, что бактерии ведут себя как самостоятельные индивидуумы, не способные к групповой организации и коммуникации. Считалось, что при инфекционном поражении бактериальная популяция является лишь суммой отдельных бактерий. Питер Гринберг, профессор Вашингтонского университета, назвал такую точку зрения «теорией волка-одиночки». Идея, что бактериальная популяция может функционировать как группа и что отдельные ее представители могут реагировать на присутствие друг друга, скептически воспринималась научным миром. Считалось, что такое взаимодействие присуще только высшим организмам, например, человеку. Однако работа, проведенная группой американских микробиологов, подорвала эту теорию, благодаря чему в настоящее время считается, что бактерии продуцируют и воспринимают химические сигналы как организованные группы и такое поведение способствует координации деятельности всей бактериальной популяции [101].

Позднее способность бактерий ощущать плотность собственной популяции и реагировать на нее соответствующими физиологическими изменениями получила название «чувства кворума» (quorum sensing, QS). С развитием возможностей молекулярной биологии это определение уточнилось: чувство кворума - это особый тип регуляции экспрессии генов в ответ на изменения плотности клеточной популяции. QS системы включают низкомолекулярные сигнальные молекулы, названные автоиндукторами (АИ),

легко диффундирующие через клеточную стенку, и регуляторные белки, с которыми связываются автоиндукторы. По мере того, как популяция бактерий увеличивается и достигает критического уровня, АИ накапливаются до необходимого порогового значения и взаимодействуют с соответствующими регуляторными белками, что приводит к резкой активации (индукции) экспрессии определенных генов у бактерий. При помощи АИ осуществляется коммуникация бактерий - передача информации между отдельными клетками бактерий, принадлежащими к одному и тому же или к разным видам, родам и даже семействам.

Благодаря QS регуляции бактерии получают возможность скоординированно контролировать экспрессию генов во всем сообществе. В подобном поведении бактерий проявляются черты сходства с многоклеточными организмами. Передача информации от клетки к клетке с использованием QS систем, приводящая к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям среды и их выживанию в природных условиях [18, 26, 72, 89, 102, 130].

Впервые QS регуляцию обнаружили в начале 70-х годов у светящейся морской бактерии Vibrio fischeri. Способность этой бактерии к биолюминесценции посредством синтеза люциферазы, кодируемой lux-опероном (luxCDABE), и биолюминесценция наблюдаются только при высокой плотности популяции бактерий (до 10й кл./мл). V. fischeri живет в симбиозе с некоторыми морскими животными в специализированном световом органе животного. В этой симбиотической ассоциации животное-хозяин обеспечивает бактерию питательной средой, а бактерия хозяина - светом.

Как отмечалось выше, довольно долго считалось, что QS регуляция -это весьма редкий случай, однако выяснилось, что этот тип регуляции широко распространен у бактерий различных таксономических групп. В настоящее время QS регуляция обнаружена у более чем 50 видов бактерий [139]. В качестве автоиндукторов QS систем бактерии используют различные соединения, и количество вновь обнаруженных АИ увеличивается. При

этом один вид бактерий может использовать и узнавать более чем один тип сигнальных молекул.

Способность бактерий функционировать в группах играет важную роль в развитии ряда инфекционных заболеваний. Показано, что QS-регуляция играет важнейшую роль в формировании биопленок [78, 110, 117]. Хроническая природа некоторых инфекций мочеполового тракта также связана со способностью бактерий Escherichia coli образовывать биопленки. На сегодняшний день весь арсенал лекарственных средств для лечения бактериальных инфекций ограничивается антибиотиками, предотвращающими или останавливающими рост отдельных бактерий. Разработка таких препаратов не принимает во внимание уникальность бактериальных сообществ. Более того, способность бактерий существовать в виде биопленок создает большие трудности, так как при этом значительно повышается устойчивость к антибактериальным и дезинфицирующим средствам, к воздействию неблагоприятных факторов среды, таких как низкие или высокие значения рН, высокая осмотическая сила и другие, а также к иммунной защите организма-хозяина. Таким образом, биопленки приводят к устойчивым инфекциям, не поддающимся общепринятому лечению антибиотиками. Тот факт, что QS может быть важным фактором регуляции вирулентности бактерий, обусловил новое направление исследований, связанных с использованием QS в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями. Предполагается, что подавление функционирования QS систем может фактически превратить патогенные бактерии в непатогенные без применения антибиотиков и других лекарственных средств. В настоящее время этот подход рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии [65].

1.1.6 Альтернативный вариант «чувства кворума»

Микроорганизмы для осуществления QS-регуляции выделяют в среду незначительные количества специфических соединений (автоиндукторов). К ним относят, прежде всего ацилированные лактоны гомосерина, короткие

пептиды и некоторые другие соединения [14, 35, 36, 69, 70]. Однако регуля-торными функциями обладают не только специализированные вещества. По мере развития науки растет список «обычных» метаболитов, выполняющих схожие функции, и это наводит на мысль, что их вклад в регуляцию до сих пор недооценивался.

Последние исследования показали, что инициация роста культуры бактерий, скорость ее роста, его остановка и гибель бактерий зависят от концентрации определенных низкомолекулярных экзометаболитов - соединений, выделяемых бактериями в окружающую среду. Раньше эти соединения рассматривались как побочные или избыточные продукты метаболизма, а их выделение в среду объяснялось несбалансированностью внутриклеточных биосинтетических процессов, то есть, по существу, - перепроизводством. Внеклеточная среда при этом выполняла функции некой «свалки» для выброса или хранения ненужных в данный момент соединений.

В действительности наличие этих соединений в среде культивирования далеко не безразлично культуре. Так, например, изучение динамики развития микробных популяций, показало, что после пересева рост культуры не начинается до тех пор, пока в среде не накапливается некоторое количество низкомолекулярных метаболитов - так называемых автостимуляторов роста. Все попытки идентифицировать эти соединения оставались безуспешными вплоть до 1998 года, когда авторы установили, что автостимуляторами роста E.coli М-17 являются янтарная и глутаминовая кислоты [12]. Изучение свойств других метаболитов показало, что многие из них также выполняют важные регуляторные функции.

Так у E.coli М-17 функции автостимуляторов роста, помимо янтарной и глутаминовой кислот, могут выполнять уксусная кислота (ацетат) или аминокислоты лизин и метионин, функции автоингибиторов роста - уксусная, молочная, муравьиная и аспарагиновая кислоты. Цистеин и метионин являются регуляторами ред-окс потенциала. Глицин при определенных условиях выполняет функции регулятора бактериального апоптоза. Кроме то-

го, существуют еще и метаболиты-синергисты, которые действуют только вместе, а поодиночке практически не влияют на рост культуры [14].

В разных ситуациях одни и те же функции могли выполнять различные соединения. Так, например, при пересеве быстро растущей культуры Е.соИ М-17 функции стимулятора ее роста в новой среде выполнял ацетат [14, 36]. Если же в свежую среду поместить голодающую культуру, то вместо ацетата эти же функции выполнял сукцинат.

Одни и те же метаболиты по-разному действовали на бактерии разных штаммов и видов, что позволяло думать о том, что метаболиты могут играть значительную роль в экологических взаимоотношениях бактерий. Наличие у метаболитов регуляторных функций нашло подтверждение и в ряде других исследований [76, 107]. Так, например, методами геномики и протеомики было показано, что добавление ацетата в среду культивирования Е.соИ приводит к повышению экспрессии по крайней мере 37 белков и понижению количества 60 других энзимов. В результате этой глобальной энзиматической перестройки выживаемость бактерий в экстремальных условиях повышалась в 50-400 раз.

Аналогичным образом было показано, что другой типичный экзоме-таболит Е.соИ, формиат, подавлял синтез 10 из 37 индуцировавшихся ацетатом белков. Имеются сведения об аналогичном регуляторном действии рН и пропионата и синергетическом действии рН и короткоцепочечных жирных кислот [132]. Эти результаты объясняют механизмы индивидуального действия и взаимовлияния экзометаболитов. При наличии в среде двух и более регуляторных экзометаболитов экспрессируются, по-видимому, преимущественно те белки, которые не подвержены разнонаправленной регуляции со стороны этих соединений.

1.1.7 Регуляция факторов патогениости неспецифическими сигнальными молекулами

Индукцию факторов патогенности обычно связывают с действием специфических регуляторов «чувства кворума». В литературе, однако, по-

степенно накапливаются данные и об участии в данном процессе «простых» экзометаболитов бактерий. Так, например, для двух сероваров Salmonella enterica (Enteritidis и Typhimurium) действие масляной кислоты, типичного продукта кишечной микрофлоры, приводило к подавлению экспрессии 19 генов патогенности общих для обоих сероваров, причем 17 из этих генов, включая 2 регуляторных (hilD и invF), располагались на островке патогенности SPI1 {Salmonella pathogenicity island 1). Один из оставшихся генов (iатрН) являлся гомологом пенициллинсвязывающего белка Е. coli, другой (sopE2) - секреторный белок типа III - относился к белкам, обеспечивающим процесс инвазии [97].

Пропионовая и масляная кислоты ингибируют рост энтерогеморраги-ческой E.coli 0157:Н7 и увеличивают экспрессию генов вирулентности, отвечающих за колонизацию кишечника штаммом [135].

Высокие концентрации ацетата и пониженные значения рН подавляют синтез шига-токсина патогенными штаммами E.coli 0157:Н7 in vivo и in vitro. Увеличивая концентрацию ацетата в кишечнике определенные пробио-тические штаммы обеспечивают сохранение жизни лабораторных животных при их заражении патогенными бактериями [84].

Известно также, что уксусная кислота и некоторые другие короткоце-почечные жирные кислоты (КЖК) способны индуцировать экспрессию генов вирулентности независимо от классического «чувства кворума» и белков фо^-регулона [92]. Так, например, штамм S. enterica серовар Typhimurium, имеющий делецию генов ацетаткиназы и фосфотрансацетилазы (iackA-pta), выделял в культуральную среду в 68 раз меньше формиата, чем дикий тип, и по этой причине оказался неспособен к инвазии и экспрессии генов SPI1. Добавление формиата восстанавливало его инвазивность и экспрессию генов SPI1, в том числе и двух важнейших регуляторных генов hilA и hilD. В опытах на мышах было показано, что в дистальном отделе подвздошной кишки, предпочтительным участком инвазии этого штамма (S. enterica), концентрация формиата соответствует требуемой для инвазии,

тогда как в других участках кишечника формиат отсутствует или присутствует в меньших концентрациях. Таким образом, при взаимодействии с хозяином формиат может регулировать не только процесс инвазии, но и определять место ее протекания [105]. Имеются и другие примеры подобной регуляции [97, 103].

При изучении влияния аминокислот на продукцию холерного энтеро-токсина тремя штаммами Vibrio cholerae (cholerae 569В, el to г 1310, cholerae 0139 M045) было показано [33], что токсинообразование у каждого из штаммов определяется индивидуальным в качественном и количественном отношении набором аминокислот. Для каждого из штаммов были подобраны аминокислотные композиции, обеспечивающие наиболее высокую продукцию энтеротоксина. Все это подтверждает положение о специфичности действия экзометаболитов и, кроме того, означает, что вирулентность того или иного штамма будет зависеть от состава метаболитов кишечника, причем для людей с разным метаболическим составом кишечника максимально вирулентными окажутся разные штаммы.

Таким образом, все приведенные выше данные позволяют полагать, что развитие микробиоты, также как и развитие других органов человека, осуществляется при постоянном взаимодействии клеток, в котором участвуют как минимум два типа соединений - специфические индукторы «чувства кворума» и неспецифические метаболиты. Первые действуют по принципу «switch on - switch off» (включил-выключил) и участвуют в процессе развития только на определенных его стадиях. Метаболиты бактерий действуют постоянно, осуществляют плавную регуляцию метаболизма на всех стадиях роста и голодания бактерий. Это позволяет популяции развиваться как единому целому и своевременно реагировать на изменения в среде обитания или даже упреждать их. Интегрирующее действие тех и других регуляторов обеспечивает единство микробиома точно также как обеспечивается единство других органов суперорганизма.

1.2 Макроорганизм и его микрофлора, концепция

суперорганизма

Большинство живых существ на Земле в действительности являются «суперорганизмами» - сложными симбиотическими комплексами. Симбио-тические системы, или «суперорганизмы», занимают в иерархии биосистем промежуточное положение между организмами и экосистемами. Рассматривать организм человека как «суперорганизм» впервые предложил в 2000 году нобелевский лауреат Джошуа Ледерберг [111], по его мнению, метаболизм «суперорганизма» основан на интеграции метаболизма хозяина и микрофлоры. Это предположение подтвердила в 2006 году группа американских ученых, ими было установлено, что метаболизм человека во многом определяется микроорганизмами, составляющими кишечную флору [100]. По мнению исследователей, человек вместе с живущими в его кишечнике микроорганизмами представляет собой единый «суперорганизм». Обмен веществ этого «суперорганизма» в значительной степени определяется ферментами, гены которых локализованы не в человеческих хромосомах, а в геномах симбиотических микробов

Изучение микробной ДНК, выделенной из содержимого человеческого кишечника, позволило американским ученым показать высокое видовое разнообразие кишечной флоры и ее важную роль в обмене веществ. По имеющимся оценкам, в кишечнике взрослого человека присутствует более 1 кг микроорганизмов, относящихся к сотням различных видов.

На основе проведенного анализа авторы выделили наиболее важные метаболические функции, которые выполняют микроорганизмы в человеческом кишечнике. Это, прежде всего, переваривание растительных полисахаридов, которые не могут перевариваться ферментами, закодированными в геноме человека. Эти трудноусваиваемые углеводы ферментируют в основном бактерии, выделяя в качестве конечных продуктов обмена низкомолекулярные органические кислоты (уксусную, пропионовую, масляную). Впоследствии эти кислоты активно всасываются кишечным эпителием. В «со-

вокупном геноме» кишечной флоры сильно повышено процентное содержание генов, связанных с синтезом незаменимых аминокислот и витаминов. Кроме того, микрофлора располагает большим арсеналом ферментов для обезвреживания токсичных веществ, присутствующих в повседневной пище. Таким образом, микробные геномы служат важным дополнением геному человека. По мнению авторов, человека следует рассматривать как «суперорганизм», чей обмен веществ обеспечивается совместной работой ферментов, закодированных не только в геноме Homo sapiens, но и в геномах сотен видов симбиотических микробов.

Концепция «суперорганизма» предполагает, что микрофлора принимает активное участие не только в пищеварении, но и в регуляции метаболизма хозяина путем обмена с ним определенными регуляторными веществами. Совокупность низкомолекулярных метаболитов человека - его мета-болом складывается из собственных метаболитов макроорганизма, метаболитов бактерий и метаболитов, произведенных «совместными усилиями» человека и микрофлоры [104, 119].

Два органа «суперорганизма» взаимодействуют друг с другом обмениваясь метаболитами и регуляторными соединениями. Основными метаболитами микрофлоры являются газообразные Н2, С02, СН4, этилен, NH3, монокарбоновые кислоты Ci-C6, янтарная и молочная кислоты, аминокислоты, в том числе и ряд необычных аминокислот, таких как (3-аланин и у-аминомасляная кислота. Содержание основных низкомолекулярных жирных кислот (уксусная, пропионовая и масляная) в толстой кишке составляет около 100 мМ на 1 кг, из них около 60 молярных процентов приходится на уксусную кислоту и приблизительно по 20% на пропионовую и масляную. Концентрация молочной кислоты около 3,1 мМ/кг, а янтарной 1,7-3,1 мМ/кг [66]. КЖК являются важным источником питания клеток кишечного эпителия и одновременно подавляют развитие ряда патогенных микроорганизмов [3, 4, 24], а дикарбоновые кислоты и аминокислоты (в частности, янтарная и глутаминовая) используются хозяином для регуляции процессов в собст-

венном организме. Помимо КЖК, микробиота поставляет хозяину витамины группы В, в частности В|2, витамин К, синтезирует [3-аланин, необходимый для синтеза пантотеновой кислоты (витамин Вз), участвует в рецикле макро- (железо) и микроэлементов (цинк, кобальт и др.).

Важной иллюстрацией способности микробиоты поставлять хозяину сигнальные молекулы является образование у-аминомасляной кислоты (ГАМК) в реакции декарбоксилирования глутамата. ГАМК является одним из основных нейромедиаторов. Имеющиеся данные позволяют предположить существование единой системы ГАМК (синтезированной в ГАМК-ергических синапсах центральной нервной системой и микробиотой), управляющей реакциями торможения. Кроме того, бактериальная ГАМК влияет на моторную деятельность толстой кишки. Снижение ее выработки микробиотой и поступления в нервные ткани толстой кишки может приводить к снижению порога болевой чувствительности [3]. Местные и системные эффекты могут оказывать бактериальные серотонин и гистамин, норад-реналин, дофамин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, |3-аланин, холин, алкилхолины, фосфорилхолин, цАМФ, цГМФ, масляная кислота и некоторые другие.

Метаболиты бактерий способны оказывать непосредственное регуля-торное воздействие на ткани или органы хозяина. Исследования, проведенные под руководством доктора медицинских наук Н.И Чалисовой в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН, показали, что развитие тканей и органов может регулироваться не только специализированными пептидными соединениями, но и отдельными аминокислотами. Так, например, при культивировании органотипических культур тканей было показано, что положительное влияние на пролиферацию клеток в эксплантатах миокарда молодых крыс оказывают аспарагин, гистидин, лизин, серин, аргинин, глутаминовая кислота и изолейцин, на подкорковую структуру головного мозга стимулирующее пролиферацию действие оказывали глутамин, аргинин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, триптофан. Подавляли развитие экс-

плантатов головного мозга глицин, тирозин, треонин. Аналогичные результаты были получены и в отношении многих других тканей [67]. Подобное регуляторное действие могут оказывать и карбоновые кислоты [16].

Нормальной микрофлоре принадлежит важнейшая роль в формировании иммунобиологической реактивности хозяина. Ее представители обеспечивают колонизационную резистентность, продуцируют разнообразные антибиотические соединения и таким образом предохраняют органы, сообщающиеся с внешней средой, от внедрения и размножения патогенных микроорганизмов. Микрофлора обладает выраженным морфокинетическим действием, особенно по отношению к слизистой оболочке тонкой кишки, что существенно отражается на физиологических функциях пищеварительного канала. Микробные ассоциации оказывают значительное влияние на работу печеночных клеток, служат существенным звеном в печеночно-кишечной циркуляции солей желчных кислот, холестерина и желчных пигментов, модулируют активность печеночных цитохромов и осуществляют синтез подобных им цитохромов (Р-450). Микрофлора разлагает муцины, утилизирует белки, гликопротеины, стерины, пептиды и другие соединения, образуя при этом новые пептиды, аминокислоты, амины, гормоны, витамины, жирные кислоты, дефенсины, нейропептиды, ферменты, окись азота и другие биологически активные вещества, способные осуществлять регуля-торные функции в организме хозяина. Кишечная микрофлора участвует в регуляции апоптоза, репликации и фенотипической экспрессии генов эука-риотических клеток, оказывает влияние на поведенческие реакции человека: аппетит, сон, настроение, циркадные ритмы [35]. Выделяемое в процессе жизнедеятельности микрофлоры тепло вносит важный вклад в поддержание температурного гомеостаза макроорганизма [4].

В предыдущем разделе (раздел 1.1) описывалась важная роль микробных метаболитов в жизнедеятельности бактерий. Их участие в регуляции биолюминесценции, вирулентности, экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков, в формировании

биопленок, споруляции, агрегации, конъюгации, и в развитии микробных популяций: метаболиты являются автостимуляторами, автоингибиторами роста, а также регулируют выживаемость бактерий (см. раздел 1.1).

В совокупности все приведенные данные подтверждают предположение о том, что выделяемые бактериями микробиоценоза специфические соединения и неспецифические метаболиты выполняют регуляторные функции на нескольких иерархических уровнях. На первом (популяционном) уровне метаболиты, выделяемые клетками популяции бактерий одного штамма, регулируют развитие этой популяции. На втором уровне эти же метаболиты обеспечивают взаимодействие выделяющей их популяции с популяциями других видов, при этом одни и те же метаболиты оказывают различное действие на разные популяции. Микробиоценоз в целом формирует некое поле метаболитов, интегрирующее развитие отдельных популяций и обеспечивающее его функционирование как единого целого. Совокупное действие метаболитов благоприятно для всех частей микробиоценоза и, в то же время, является барьером на пути внедрения чужеродной микрофлоры. На третьем уровне пул производимых микробиоценозом метаболитов вступает во взаимодействие с организмом хозяина, оказывает на него регуляторное действие и используется им в качестве субстрата. Кроме того, можно полагать, что карбоновые кислоты, выделяемые самими тканями или органами, могут выполнять функции аутокринных, паракринных (воздействуя на собственные клетки и близлежащие клетки той же ткани или органа) или эндокринных регуляторов.

1.3 Метаболитные препараты 1.3.1 Принципы конструирования и основные свойства Анализ действия лекарственных средств показывает, что их назначение отвечает двум основным стратегиям. Первая стратегия состоит в воздействии на какое-либо метаболическое или регуляторное звено в организме. Вторая стратегия ориентирована на подавление возбудителя болезни или устранение последствий его атаки на организм хозяина. Однако эти

стратегии лекарственной терапии не учитывают симбионтных отношений хозяина и его микробиоты. Важность таких отношений уже была описана в разделе 1.2.

В настоящее время становится все более привлекательным подход, основанный на прямом использовании многочисленных метаболических, регуляторных, иммунологических и других взаимоотношений в системе хозяин - микробиота и восстановлении этих связей, когда они оказались нарушенными. Такие лекарственные средства должны представлять собой не антибиотики, синтетические химиопрепараты или бакпрепараты, а метаболиты, которыми в норме обмениваются организм и микрофлора, либо сигнальные молекулы или иные объекты, обеспечивающие нормальные связи в системе хозяин — микрофлора.

В.Н. Бабин с соавторами рассматривает несколько стратегий создания новых лекарственных средств [4]. Первая стратегия заключается в адресном воздействии на те или иные виды бактерий или их ассоциации таким образом, чтобы они сами продуцировали для организма метаболиты, витамины, антибиотики, регуляторы, необходимые при данной патологии. Второе направление - химический синтез тех метаболитов, сигнальных молекул и других соединений, утрата которых произошла при данном заболевании. Третья стратегия опирается на применение выращенных in vitro штаммов индигенных микроорганизмов. Она тесно связана со второй стратегией и широко используется в настоящее время. По мнению авторов сочетание этого подхода с предыдущим может заметно увеличить эффективность терапии бактериальными препаратами. Четвертый путь может состоять в синтетической модификации метаболитов, сигнальных молекул и других объектов бактериальной природы.

Одним из примеров адресного воздействия на микробиоценоз человека может являться применение специфических для пострадавшего вида бактерий аттрактантов, помогающих ему вернуться в утраченную экологическую нишу. Известные к настоящему времени аттрактанты, как правило,

представляют собой циклические нуклеотиды, 1-формилированные ди-, три- и тетрапептиды, либо некоторые азотистые гетероциклы.

Известно, что микробиота способна синтезировать антибиотические соединения - бактерио- и микроцины, которые позволяют освобождаться от патогенной микрофлоры, не затрагивая организм хозяина. Можно полагать, что существует возможность целенаправленного химиотерапевтического управления микрофлорой путем "подталкивания" ее к синтезу микроцинов определенными синтетическими средствами [4].

Второй подход, как отмечалось ранее, основан на идее заместительной терапии с применением метаболитов или сигнальных веществ, в норме продуцируемых микрофлорой, но утрачиваемых в патологических состояниях. В частности, в нейрофармакологии широко применяются у-аминомасляная кислота (ГАМК, он же аминалон) и у-оксибутират натрия. Эти нейротрансмиттеры продуцируются в норме микрофлорой и участвуют в регуляции моторной деятельности желудочно-кишечного тракта. Помимо природных бактериальных метаболитов в терапии могут использоваться и химически модифицированные соединения. Так например, гидрохлорид у-амино-п-фенилмасляной кислоты (фенибут), который может рассматриваться как п-фенилированное производное ГАМК. Обладая сходным с ами-налоном фармакологическим спектром, в отличие от ГАМК, он не продуцируется ни в нейронах, ни микрофлорой и является полностью синтетическим производным.

Помимо подхода, основанного на использовании взаимоотношений в системе хозяин - микробиота, при конструировании лекарственных препаратов следует учитывать существование взаимоотношений между бактериями. В серии работ Вахитова и др. были изучены свойства композиции низкомолекулярных метаболитов пробиотического штамма E.coli М-17 (Актофлор) и показано, что композиция селективно стимулирует рост про-биотических бактерий, не только E.coli М-17, но и пробиотических лакто-бацилл и бифидобактерий; увеличивает антагонистическую активность про-

биотических бактерий против патогенных штаммов; при добавлении в смешанные культуры пробиотических и патогенных бактерий способствует вытеснению последних [14, 12, 36]. В ходе дальнейших испытаний выяснилось, что кроме ожидаемых свойств - способности стимулировать рост нормальной микрофлоры, Актофлор обладал иммуномодулирующим действием, ускорял развитие новорожденных животных, оказывал общеоздо-равливающий эффект, подавлял рост опухолевых клеток.

Наличие данных о составе и биологической активности компонентов препаратов позволило авторам поставить задачу создания синтетической композиции, не уступающей по биологическим свойствам натуральному препарату. С этой целью был проанализирован состав и биологическая активность 17 препаратов, полученных при различных условиях выращивания культуры продуцента. При создании искусственной композиции учитывались статистические данные по составу всех препаратов и наиболее активных из них, данные по индивидуальной активности метаболитов, их композиций и динамике в процессе роста культуры. На основании этих данных была создана синтетическая композиция (Актофлор-С), включающая 13 основных соединений, содержащихся в количествах от 0,5 до 60%. Биологическая активность композиции оказалась приблизительно в 8-15 раз выше, чем прототипа - нативного Актофлора, что являлось следствием отсутствия балластных веществ и более оптимальных соотношений компонентов.

В отличие от Актофлора-С другие метаболитные препараты («Хилак форте», «Микростим») включают в себя достаточно сложно стандартизируемые супернатанты, гидролизаты или экстракты пробиотических бактерий. В настоящее время на фармацевтическом рынке широко распространен метаболитный препарат «Хилак форте», представляющий собой беззародышевый водный субстрат продуктов обмена веществ сахаролитических (L. acidophilus, L. helveticus и Е. faecalis) и протеолитических (Е. coli) представителей кишечной микрофлоры (MERCKLE GmbH, Германия). Основными биологически активными компонентами являются короткоцепочечные

жирные кислоты (КЖК). Кроме того, препарат содержит молочную, фосфорную и лимонную кислоты, сорбат калия, буферные соли, лактозу и ряд аминокислот. Содержащиеся в «Хилаке форте» КЖК способствуют нормализации кишечного микробиоценоза и обеспечивают регенерацию поврежденных эпителиальных клеток кишечной стенки, регулируют внутрипрос-ветный рН. Этому способствуют и буферные соли, восстанавливающие рН среды до необходимых физиологических значений. Закисление среды приводит к ингибированию роста патогенных и условно-патогенных бактерий и восстановлению роста нормофлоры, что в свою очередь способствует исчезновению диареи, метеоризма и других диспепсических симптомов [7].

На основе ультрафильтрата культуральной жидкости Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ в ФГУП НПО Микроген МЗ РФ был разработан препарат «Микростим». Действующими веществами препарата являются низкомолекулярные экзометаболиты лактобактерий. «Микростим» обладает выраженной пробиотической активностью, стимулирует рост и активность ки-слотообразования лакто- и бифидобактерий, повышает антагонистическую активность лактобактерий к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Кроме того, «Микростим» оказывает прямое угнетающее влияние на патогенные и условно-патогенные бактерии, повышает их чувствительность к антибиотикам, а также к антибактериальным веществам, продуцируемым лактобактериями [68].

Рынок препаратов, содержащих охарактеризованные бактериальные метаболиты, в настоящее время ограничен препаратом Закофальк («Доктор Фальк Фарма ГмбХ», Германия), в состав которого входит не только бактериальный экзометаболит (масляная кислота), но и пребиотик инулин. Масляная кислота в норме образуется в толстой кишке в результате расщепления нормальной микрофлорой кишки неперевариваемых углеводов, поступающих вместе с пищей. Основная функция масляной кислоты - снабжение энергией клеток слизистой оболочки толстой кишки и поддержание их в здоровом функциональном состоянии. Инулин является растворимым пище-

вым волокном, которое создает питательную среду для микрофлоры кишечника, тем самым, стимулируя рост полезных бактерий (пребиотическое действие). Также в результате метаболизма инулина бактериями кишки образуется эндогенная масляная кислота.

Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о большом значении биологически активных бактериальных метаболитов для организма человека. Метаболиты, продуцируемые разными видами микроорганизмов, оказывают стимулирующее действие на бактерии нормофлоры, проявляют противомикробное, иммуномодулирущее и ряд других действий, поэтому целесообразность разработки препаратов на основе микробных метаболитов не вызывает сомнения.

1.3.2 Ингибирование систем «чувства кворума» - новый подход к созданию препаратов против патогенности бактерий

«Чувство кворума» контролирует экспрессию генов вирулентности в некоторых патогенных бактериях. Ранее в разделе 1.1 было показано широкое распространение этого механизма регуляции генов среди бактерий. На сегодняшний день обнаружено три QS системы, вовлеченные в патогенез: 1) системы LuxR/I -типа, в основном использующиеся грамотрицательными бактериями, у которых сигнальной молекулой является ацилгомосерин лак-тон (АГЛ); 2) пептидные сигнальные системы, используемые в основном грамположительными бактериями, 3) автоиндуктор - 3 (АИ-3) /эпинефрин/ норэпинефрин сигнальная система, которая служит как межвидовая сигнальная система у бактерий и играет важную роль в коммуникации с хозяином.

Ингибиторы LuxRJl QS систем.

Вслед за описанием QS системы Vibrio fisheri гомологи LuxR и Luxl были идентифицированы и у других бактерий. Эти системы регулируют транскрипцию генов, вовлеченных в ряд фенотипических функций, таких как продукция антибиотиков бактериями рода Erwinia, подвижность Yersinia pseudotuberculosis, патогенность и образование биопленок Psedomonas

aeruginosa и некоторых других [75, 98].

Структура сигнальных молекул LuxR/I системы представлена гомосе-ринлактонным кольцом, соединенным посредством амидной связи с вариабельной ацильной цепью. Длина ацильных цепей варьируется от С4 до С!8, а в третьем положении могут присутствовать некоторые модификации (карбонильная группа, ОН-). Субстратами для синтеза сигнальных молекул (АГЛ) являются S-аденозилметионин (SAM) и ацильные цепи, предоставляемые ацилпереносящими белками (АПБ) в процессе метаболизма жиров.

Белки LuxR-типа являются факторами транскрипции, которые при связывании с АГЛ сигналом, регулируют транскрипцию целевых генов. Белки распознают только специфические АГЛы, благодаря этой особенности, сигнальная система LuxR/I главным образом связана с внутривидовой передачей сигнала. Было показано, что связывание ацилгомосерин лактона с LuxR-белками, необходимое условие стабилизации белков. На этом свойстве основывается использование природных антагонистов QS, производных фуранонов. Соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с LuxR рецепторными белками. Связывание фуранонов с рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению белка [96, 106].

Заболеваемость и смертность, связанные с муковисцидозом, обусловлены хронической колонизацией дыхательных путей биопленками Pseudomonas aeruginosa. Известно, что «чувство кворума» контролирует продукцию ряда факторов вирулентности (эластазы, экзотоксина А, пиоцианина и других) и образование биопленок в организме [140].

QS система Р. aeruginosa представляет собой иерархический комплекс. Гены, ответственные за синтез факторов вирулентности, активируются двумя QS- системами типа Luxl/R: Lasl/R и Rhll/R. Белок LasI отвечает за продукцию аутоиндуктора 1Ч-(3-оксододеканоил)-гомосеринлактона (30Ci2-HSL). Белок Rhll - это синтаза N-бутирил-гомосеринлактона (С4-HSL). Система Lasl/R регулирует синтез секретируемых факторов виру-

лентности, ответственных за деструкцию тканей организма-хозяина при инициировании инфекционного процесса: эластазы, протеазы, экзотоксина и щелочной фосфатазы. Эта система активирует также экспрессию генов второй QS-системы P. aeruginosa, Rhll/R, приводя к ее индукции. Комплекс белка RhlR с аутоиндуктором C4-HSL индуцирует экспрессию двух генов, регулируемых QS-системой первого типа. На основе этих механизмов были разработаны подходы, препятствующие связыванию АГЛ с рецепторными белками.

Первый подход заключается в химическом синтезе соединений - аналогов природных АГЛ сигналов [126]. Второй подход основывается на поиске природных соединений, которые имитируют АГЛы и блокируют рецепторы LuxR-типа. Третий подход заключается в использовании ферментов (например, лактоназ), которые способны разрушать АГЛы. Почвенные бактерии Bacillus sp. продуцируют лактоназу, которая гидролизует лактон-ное кольцо. Вероятно, этот фермент необходим Bacillus в соперничестве с другими почвенными бактериями [91, 126].

Ингибирование QS-систем грамположителъных бактерий

Для грамположительных бактерий наиболее подробно изучены несколько систем, принимающих участие в контроле вирулентности Staphylococcus aureus, в регуляции компетентности (т.е. способности принимать экзогенную ДНК при трансформации) Streptococcus pneuminiae, регуляции компетентности и споруляции Bacillus subtilis. В качестве автоиндукторов QS-систем у грамположительных бактерий используются секретируемые пептиды (AIP).

Различные грамположительные бактерии синтезируют различные пептидные сигнальные молекулы. Сигнальный механизм функционирует через каскад фосфорилирование/дефосфорилирование. Сенсорная киназа фосфорилируется, после чего фосфорильная группа переносится на соответствующий белок - регулятор ответа. Фосфорилированный регулятор ответа связывается с ДНК и активирует транскрипцию гена-мишени [112,

Вирулентность S. aureus, контролируемая QS-системами, может ин-гибироваться природными RIP-пептидами (RNA III inhibitig peptide), их химически синтезированными аналогами и гибридными пептидами. Подобное действие показано, например, при использовании нативного RJP-пептида S. aureus YSPXTNF и его синтетических аналогов YSPWTTNF и YKPITNF [119]. Эти пептиды ингибируют фосфорилирование белка TRAP (Target of RNA IH-activating protein) и, в результате, подавляют синтез РНК III, что приводит к ингибированию вирулентности бактерии [127]. Отмечено, что пептиды RIP ингибировали in vivo образование биопленок S. aureus и S.epidermidis [99]. Эффективность пептидов показана на различных животных, инфицированных S. aureus. Одновременное использование RIP-пептидов и антибиотиков усиливало действие каждого из препаратов и приводило к 100%-ному выживанию мышей, инфицированных S. aureus.

Полученные данные подтверждают потенциальную возможность применения пептидов, взаимодействующих с QS-системами стафилококков, для борьбы с инфекциями, вызываемыми этими бактериями. Еще один возможный подход - вакцинация белками-компонентами QS-системы. Например, вакцинация мышей белком RAP (RNA Ill-activating protein) защищала их от инфекции S. aureus [141].

Блокирование распознавания геморрагической E.coli аутоиндуктора-3 (АИ-3) и эпинефрин/норэпинефрин сигналов

Сигнальная молекула АИ-3 продуцируется и утилизируется несколькими видами бактерий и отвечает за активацию генов вирулентности энтер-геморрагической (ЕНЕС) Е. coli 0157:Н7. Кроме того, сигнальная система, в которой участвует АИ-3, используется для коммуникации между прока-риотическими и эукариотическими клетками [113].

АИ-3 является ароматической сигнальной молекулой, продуцируемой индигенной микрофлорой. Эпинефрин и норэпинефрин обнаруживаются в желудочно-кишечном тракте. Норэпинефрин синтезируется в адренергиче-

ских нейронах, присутствующих в энтеральной нервной системе [95]. Эпи-нефрин синтезируется центральной нервной системой и в мозговом слое надпочечников и попадает в кишечник через кровяное русло [125]. Оба гормона модулируют сокращение гладкой мускулатуры кишечника. Эпи-нефрин и норэпинефрин узнаются одними и теми же адренергическими рецепторами клеток млекопитающих и выполняют важные функции в желудочно-кишечном тракте человека. АИ-3 и эпинефрин/норэпинефрин являются сигналами-антагонистами. Эти сигналы узнаются мембранными сенсорными киназами, которые передают информацию на сигнальный комплекс, активирующий факторы патогенности: флагелярный регул он, локус сглаживаемости энтероцитов и экспрессию шига токсина. Одной и таких сенсорных киназ у Е. coli является QseC-сенсорная киназа, она также является аналогом адренергического рецептора бактериального происхождения. Узнавание киназой АИ-З/эпинефрин/норэпинефрин сигналов может блокироваться а-адренергическим антагонистом фентоламином [138].

Антибиотики и антидиарейные средства противопоказаны при инфекциях, вызванных ЕНЕС [142]. Так как они усиливают экспрессию и высвобождение сильнодействующего шига-токсина, тем самым, повышая тяжесть гемолитико-уремического синдрома, а также вовлекая в заболевание центральную нервную систему. Отсутствие эффективных лекарственных средств для лечения ЕНЕС инфекций подчеркивает необходимость изучения этих сигнальных каскадов с целью дальнейшего конструирования новых классов антимикробных препаратов. Перекрестная передача сигналов АИ-3 с эпинефрином и норэпинефрином, связанная со способностью адре-нергических антагонистов блокировать распознавание геморрагической E.coli всех трех сигналов, открывает новые перспективы для лечения ЕНЕС инфекций. Более того, антагонисты этого сигнального каскада могут быть использоваться не только против ЕНЕС, но, возможно, также против других патогенов (энтеропатогенной Е. coli (ЕРЕС), Salmonella, Shigella, Yersinia pestis и др.).

Заключение диссертации по теме «Технология получения лекарств», Полевая, Елена Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Комплексный анализ состава экзометаболитов пяти штаммов энтеро-бактерий, а также В. bifidum и L. plantarum позволил идентифицировать более 40 метаболитов, состав которых является специфической характеристикой каждого штамма. Показано, что растущая культура активно обменивается экзометаболитами со средой, выделяя их на одних стадиях и поглощая на других, при этом концентрация экзометаболитов (карбоновых кислот) коррелирует со скоростью их роста.

2. Смешанные культуры характеризуются сложными взаимоотношениями двух штаммов, приводящими к изменению метаболизма каждого из штаммов: так при совместном культивировании E.coli М-17 с патогенными штаммами наблюдается повышенный синтез кислоты молочной, изменяются концентрации и других экзометаболитов.

3. Экзометаболиты (соли карбоновых кислот и аминокислоты) обладают биологической активностью: стимулируют или ингибируют рост бактерий, либо не оказывают на него влияния. Действие экзометаболитов является штаммоспецифичным и зависит от их концентрации. Сочетания экзометаболитов действуют на рост иначе, чем индивидуальные соединения.

4. Разработана технология получения биологически активных комплексов на основе синтетических аналогов экзометаболитов. Показано, что при получении комплексов может использоваться два подхода. Первый подход основан на анализе активности предварительно идентифицированных экзометаболитов и их сочетаний, второй подход - на использовании в качестве прототипа состава внеклеточной среды с требуемой активностью.

5. На основе анализа активности индивидуальных экзометаболитов и их сочетаний разработан комплекс для подавления роста и патогенности штамма E.coli 075, вызывающего острые кишечные инфекции. Комплекс обладает антипатогенной активностью и повышает конкурентоспособность пробиотического штамма E.coli М-17 при выращивании с патогенным штаммом E.coli Ol 5.

6. На основе анализа состава и активности внеклеточной среды разработан комплекс экзометаболитов для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613. Комплекс повышает пробиотический потенциал штамма: стимулирует рост, антагонистическую активность и устойчивость к стрессовым факторам (повышенной температуре, сублимационному высушиванию, желчи).

7. Разработана технология производства биологически активного комплекса для подавления роста и патогенности штамма E.coli 075 в виде капель для приема внутрь.

8. Предложены показатели качества комплекса для подавления роста и патогенности штамма E.coli 075 в виде капель для приема внутрь и разработан проект ФСП.

9. Разработана технология производства биологически активного комплекса для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613 в виде раствора для приема внутрь. Предложены показатели качества и разработан проект ТУ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АГЛ - ацилгомосерин лактон; АИ - автоиндуктор;

БАД - биологически активная добавка к пище; БЛ - питательная среда Блаурокка; ВС - внеклеточная среда;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГАМК - у-аминомасляная кислота;

ГФ - Государственная Фармакопея;

ГХ-МС - газовая хроматография масс-спектрометрия;

ИП - индекс площади;

КЖК - короткоцепочечные жирные кислоты; КОЕ - число колониеобразующих единиц;

МРС-1, -5 - питательная среда J.C. De Man, М. Rogosa и Е. Sharpe;

НКК - низкомолекулярные карбоновые кислоты;

ОП - оптическая плотность;

ОПБ - относительный прирост биомассы;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией;

ПБ - патогенные бактерии;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РБЛ - разбавленная питательная среда Блаурокка;

ЕНЕС - enterohemorrhagic Е. coli, ентерогеморрагическая Е. coli;

QS - quorum sensing, «чувство кворума» у бактерий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Полевая, Елена Валерьевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абросов, Н.С. Экологические механизмы сосуществования в видовой регуляции / Н.С. Абросов, Б.Г. Ковров, O.A. Черепанов - Новосибирск: Наука, 1982.-301 с.

2. Акопян, М. Преобразование энергии, сопряженное с окислением формиата в условиях анаэробного брожения / М. Акопян, А. Поладян, К. Баграмян // Биофизика.- 2006,- Т.51.-Вып.З.- С.466-471.

3. Бабин, В.Н. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры / В.Н. Бабин [и др.] // Росс. хим. ж.- 1994 - Т.38.-№6.- С.66-78.

4. Бабин, В.Н. Новые подходы к разработке лекарственных средств / В.Н. Бабин [и др.] // Росс. хим. ж.- 1996,- Т.40,- №2,- С. 125-130.

5. Бабусенко, Е.С. Ауторегуляция роста и развития метанокисляю-щих бактерий: автореф. дисс....канд. биол. наук: 03.00.23 / Бабусенко Елена Сергеевна. - М., 1992. - 25с.

6. Белобородова, Н.В. Экзометаболиты некоторых анаэробных микроорганизмов микрофлоры человека / Н.В. Белобородова, И.Т. Байрамов, А.Ю. Оленин, Н.И. Федотчева // Биомедицинская химия. - 2011. - Т.57. -Вып.1. - С.95-105.

7. Белоусова, Е.А. Возможности препаратов на основе микробных метаболитов для восстановления кишечной микробиоты / Е.А. Белоусова, Н.В. Никитина, Т.С. Мишуровская, А.Р. Златкина // Consilium medicum. -2005.-№ l.-C. 9-13.

8. Вахитов, Т.Я. Ауторегуляция выживаемости в процессе голодания культур Escherichia coli М-17: Дис...канд. биол. наук: 03.00.07 / Вахитов Тимур Яшерович. - СПб, 1993.-231 с.

9. Вахитов, Т.Я. Колебания численности бактерий в процессе голодания / Т.Я. Вахитов // Биофизика,- 1999.- Т.44,- Вып.З,- С.503-504.

10. Вахитов, Т.Я. Сравнительное изучение действия препаратов ауто-стимуляторов роста Escherichia coli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и

антагонистичекую активность лактобацилл / Т.Я. Вахитов [и др.] // Журн. микробиол. - 2001.- №3.- С. 80-83.

11. Вахитов, Т.Я. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 / Т.Я. Вахитов, Е.Н. Момот, О.Н. Шалаева, JI.H. Петров // Журн. микробиол - 2003 - №6 - С.20-25.

12. Вахитов, Т.Я. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli / Т.Я. Вахитов, Е.А. Протасов, Н.В. Виснольд, Ю.Н. Тол-паров, JI.H. Петров // Журн. микробиол. - 2003. - №2. - С.7-12.

13. Вахитов, Т.Я. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17 / Т.Я. Вахитов, Е.Н. Момот, Ю.Н. Толпаров//Журн. микробиол.-2005-№ 1.-С. 16-21.

14. Вахитов, Т.Я. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий / Т.Я. Вахитов, Л.Н. Петров // Микробиология.- 2006.- Т.75. - №4.- С.483-488.

15. Вахитов, Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях: дисс. докт.биол.наук: 03.00.27 / Вахитов Тимур Яшерович. - СПб, 2007 - 562 с.

16. Вахитов, Т.Я. Модулирующее влияние метаболитов микрофлоры человека и животных на культуру лимфоидной ткани / Т.Я. Вахитов, Н.И. Чалисова, Н.А. Балыкина, Л.Н. Петров, А.Д. Ноздрачев // Доклады Академии наук,- 2009,- Т.428. - №1.- С.121-124.

17. Вахитов, Т.Я. Регуляторные функции аминокислот и их сочетаний у прокариот и в тканях высших организмов / Т.Я. Вахитов, Н.И. Чалисова, Е.В. Полевая, Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон // Успехи современной биологии. - 2012. - Т. 132. - №6. - С.594-600

18. Гинцбург, А.Л. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий / А.Л. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова // Ж. микроб., эпидеми-ол., иммунобиол. - 2003. - №5. - С.86-93.

19. Головлев, Е.Л. О механизме лимитирования роста рекомбинантно-го штамма Escherichia coli / Е.Л. Головлев, Ю.Г. Иваницкая, В.Б. Кешелава

// Микробиология. - 1986. - Т.55. - №5. - С.781-786.

20. ГОСТ 7933-89 Картон для потребительской тары. Общие технические условия. - М.: Издательство стандартов, 1990. - 12с.

21. ГОСТ 17768-90 Средства лекарственные. Упаковка, маркировка, транспортирование и хранение. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2003. -11с.

22. ГОСТ Р 52683-2006 Средства лекарственные для животных. Упаковка, маркировка, транспортирование и хранение. - М.: Стандартинформ, 2007.- 15с.

23. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XII издание. Часть 1. - М. : Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007. - 702с.

24. Домарадский, И.В. Противоречивая микроэкология / И.В. Дома-радский [и др.] // Росс. хим. ж.- 2002,- Т.46.- №3.- С.80-89.

25. Ждан-Пушкина, С.М. Основы роста культур микроорганизмов / С.М. Ждан-Пушкина.- Л.: ЛГУ,- 1983.- 187 с.

26. Завильгельский, Г.Б. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Молекуляр. биология. - 2001. - Т.35. - С.268-277.

27. Коновалова, Е.Ю. Ауторегуляция роста и развития дрожжей Rhodospiridium toruboidis факторами d: дис...канд. биол. наук: 03.00.07 / Коновалова Елена Юрьевна - Л., 1985. - 199с.

28. Коровина, В.П. Изучение механизма регуляции численности популяций в экспериментах на культурах бактерий / В.П. Коровина, Л.А. Сазонова, И.Ш. Вайсман // Экология. - 1974. - №6. - С.5-9.

29. Королюк, A.M. Анализ метаболитной активности, ультраструктуры и геномов производственных штаммов B.bifidum 1 и L.plantarum 8Р-АЗ / A.M. Королюк, Т.Я. Вахитов, Е.В. Полевая, О.В. Рыбальченко, О.В. Аверина, В.А. Емельяненко // Материалы X -го съезда ВНПОЭМП. - Москва,2012 - Т.2. - №1-2. - С. 284.

30. Лойко, Н.Г. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thioalkalivibrio versutus / Н.Г. Лойко, А.Н. Козлова, Г.А. Осипов, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. - 2002. - Т.71. - №3. - С.308-316.

31. Момот, Е.Н. Метаболическая регуляция в процессе роста и голодания культуры Escherichia coli М-17: дис. ... канд.биол.наук : 03.00.07 / Момот Елена Николаевна. - СПб, 2002 - 167 с.

32. Новикова, И.Ю. Возможные механизмы образования структур в популяциях бактерий, состоящих из подвижных клеток / И.Ю. Новикова // Микробиология. - 1987. - Т.56. - №6. - С. 145-149.

33. Овсова, Л.М. Влияние различных аминокислот и солей аммония в составе синтетической питательной среды на продукцию холерного энтеро-токсина / Л.М. Овсова [и др.] // Журн. микробиол.- 2003 - №3- С. 16-21.

34. Одум, Ю. Экология. Т.2. / Ю. Одум. - Пер. с англ. - М.: Мир, 1986. -376с.

35. Олескин, А.В. Нейрохимия и симбиотическая микрофлора человека: биополитические аспекты / А.В. Олескин // Вестн. Росс. Акад. наук. -2009.-№ 5.-С.431-438.

36. Петров, Л.Н. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов / Л.Н. Петров, В.М. Бонда-ренко, Т.Я. Вахитов, А.А. Воробьев // Вестник Российской АМН,- 2006. -№1- С.38-45.

37. Поздеев, O.K. Молекулярно-генетические основы патогенности энтеробактерий / O.K. Поздеев // Практическая медицина. - 2010. - №41. -С.84-88.

38. Полевая, Е.В. Сравнительное изучение состава и биологической активности экзометаболитов лечебного, производственного и лабораторных штаммов Escherichia coli / Е.В.Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Материалы межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА - Санкт-Петербург, 2009. - С. 120.

39. Полевая, E.B. Состав и биологическая активность низкомолекулярных экзометаболитов различных штаммов Escherichia coli / E.B. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 6-й Объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009». - Санкт-Петербург, 2009. - С. М32.

40. Полевая, Е.В. Карбоновые кислоты и аминокислоты как ауторегу-ляторы роста Escherichia coli. E.B. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 12-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2010». - Санкт-Петербург, 2010. - С. М75.

41. Polevaya, Е. Non-specialized low-molecular exogenous metabolites as regulators of quorum sensing in bacteria / E. Polevaya, T. Vakhitov // 1st European Student Conference on Microbial Communication. - Jena, Germany, 2010. -P.9

42. Полевая, E.B. Карбоновые кислоты и аминокислоты как авторегуляторы роста Escherichia coli / E.B. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 15-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2011. - С.328-329.

43. Полевая, Е.В. Регуляция роста Escherichia coli бактериальными эк-зометаболитами Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Материалы Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург, 2011 - С. 120.

44. Полевая, Е.В. Экзометаболиты как регуляторы роста пробиотиче-ских и патогенных бактерий / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 13 -го Славяно-балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро -2011». - Санкт-Петербург, 2011. - С.М75

45. Полевая, Е.В. ВЭЖХ анализ состава и динамики карбоновых кислот в процессе роста и последующей инкубации производственных штаммов Bifidobacterium bifidum 1 и Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, В.А. Емельяненко, A.M. Королюк // Естественные и техниче-

ские науки. - 2011. - №6. - С.87-92.

46. Полевая, Е.В. Штаммоспецифические особенности в составе и динамике карбоновых кислот при выращивании бактерий Escherichia coli и Salmonella enteritidis / E.B. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2012. - №03(77). - С.1-15 - Режим доступа: http ://ej .kubagro.ru/2012/03/pdf/49.pdf

47. Полевая, E.B. Энтеросорбционные свойства псиллиума (Муко-фалька®) и возможные механизмы его действия при кишечных инфекциях / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, С.И. Ситкин // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2012. - №2. - С. 35-39.

48. Полевая, Е.В.Разработка комплекса авторегуляторов роста штамма Escherichia coli VL 613, улучшающего усвояемость кормов / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Материалы П-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург, 2012. - С.35-36

49. Полевая, Е.В.Механизмы действия псиллиума при кишечных инфекциях / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, С.И. Ситкин // Журн. «Гастроэнтерология Санкт-Петербурга». - 2012. -№2-3. - С.10-13.

50. Полевая, Е.В. Сравнительный анализ состава и динамики аминокислот, выделяемых бактериями в среду культивирования на примере выращивания Escherichia coli и Salmonella enteritidis / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, О.Н. Шалаева, Ю.М. Берсон // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2012. - №06(80). - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/06/pdf/38.pdf

51. Полевая, Е.В. Анализ энтеросорбционных свойств псиллиума / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, С.И.Ситкин // Материалы 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии. - Санкт-Петербург, 2012. - С. М28

52. Полевая, E.B. Разработка комплекса аутостимуляторов роста про-биотического штамма Escherichia coli VL613 / E.B. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии. -Санкт-Петербург, 2012. - С. М28

53. Пшеничное, P.A. Микробная популяция - саморегулируемая система / P.A. Пшеничнов, В.М. Колотов, С.Я. Барихин, А.Г. Ткаченко, М.М. Дедюкина // Экология и популяционная генетика микроорганизмов. - УНЦ АН СССР. - 1975,-С.3-13.

54. Радчук, H.A. Ветеринарная микробиология и иммунология / H.A. Радчук. -М.: Агропромиздат, 1991. -383с.

55. Рубан E.JT. Биосинтез аминокислот микроорганизмами / E.JI. Рубан [и др.] - М.: Наука, 1968. - 293с.

56. СанПиН 2.1.4.1074-01 Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. - М.: Библиотека знаний ROSS, 2002. - 62с.

57. Смирнова, Г.В. Статус глутатиона и экспрессия антиоксидантных генов у Escherichia coli при действии цистина и перекиси водорода / Г.В. Смирнова, Н.Г. Музыка, О.Н. Октябрьский // Биохимия- 2005 - Т.70-№4.-С.1119-1129.

58. Смирнова Г.В. Периодические культуры E.coli в аэробных и анаэробных условиях / Г.В Смирнова., О.Н. Октябрьский // Микробиология. -1985. - Т.54. - №2. - С.252-256.

59. Сычев, К.С. Практическое руководство по жидкостной хроматографии / К.С. Сычев. - М.: Техносфера, 2010. - 272с.

60. Тарков, М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред / М.И. Тарков. - Кишинев: Штиинца, 1972. - 166с.

61. Тиранен, А.Г. Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии / А.Г. Тиранен. - Новосибирск: Наука, 1984. - 104с.

62. TP 201/00/ТС О безопасновти кормов и кормовых добавок. - М.: Таможенный союз, 2010. - 59с.

63. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях / В.Ю. Урбах. - М.: Медицина, 1975. - 295с.

64. Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств» [Электронный ресурс]. - 2010. - Режим доступа: http://www.consultpharma.ru/index.php?option=com_content&view=article&id= 152: fz61 glava2&catid=31: drugs&Itemid=3 6

65. Хмель, И.A. Quorum sensing регуляция экспрессии генов - перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий / И.А. Хмель, А.З. Метлицкая // Молекулярная биология. - 2006. - Т.40. - №2. - С.195-210.

66. Цавкелова, Е.А. Гормоны и гормоноподобные соединения микроорганизмов / Е.А. Цавкелова [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология-2006,- Т.42- №3.- С.- 261-268.

67. Чалисова, Н.И. Модулирующее действие аминокислот в органоти-пической культуре лимфоидной ткани / Н.И. Чалисова, A.B. Комашня // Биоорганическая химия - 2006 - Т.32 - №3- С.284-290.

68. Чистохина, Л.П. Иммунобиологическая характеристика препарата "Микростим" на основе метаболитов лактобактерий : автореферат дис..канд. мед. наук: 03.00.07 / Чистохина Лариса Павловна. - Пермь, 2004. - 24 с.

69. Шпаков, А.О. Пептидные аутоиндукторы бактерий / А.О. Шпаков // Микробиология.- 2009.- Т.78,- №3,- С.291-303.

70. Шпаков, А.О. Сигнальные молекулы бактерий непептидной природы QS-типа / А.О. Шпаков // Микробиология. - 2009- Т.78 - №2. -С.163-175.

71. Эль-Регистан, Г.И. Явление автолиза у микроорганизмов / Г.И. Эль-Регистан, Т.Л. Бабаян // Перспективные направления развития микробиологической промышленности. Обзор, информ. М. ЦБНТИ Минмедбио-прома СССР. - 1987. - Вып.2. - 52с.

72. Ahmer, В.М. Cell-to-cell signaling in Escherichia coli and Salmonella enterica / B.M. Ahmer // Mol. Microbiol. - 2004. - V. 52. - P.933-945.

73. Alexeeva, S. J. Quantitative assessment of oxygen availability: perceived aerobiosis and its effect on flux distribution in the respiratory chain of Escherichia coli / S. Alexeeva, K. J. Hellingwerf, M. J. Teixeira de Mattos // J. Bac-teriol- 2002.-V.184.- №5.- P. 1402-1406.

74. Ameyama, M. Growth stimulation substance for microorganisms produced by Escherichia coli causing the reduction of the lag phase in microbial with pyrroloquinoline quinine / M. Ameyama, E. Shinagawa, K. Matsushita, O. Ada-chi // Agric. Biol. Chem. - 1984. - V.48. - №12. - P.3099-3107.

75. Antunes, L.C.M. Quorum sensing in bacterial virulence / L.C.M. Antunes, R.B. Ferreira, M.C. Buckner, B.B. Finlay // Microbiology. - 2010. - V. 156. - №8. - P.2271-2282.

76. Arnold, C. N. Global analysis of Escherichia coli gene expression during the acetate-induced acid tolerance response / C. N. Arnold [et al.] // J. Bacte-riol.— 2001.- V. 183.-№7.- P.2178-2186.

77. Bonke R. Isolierung eines Fe (II) - bindenden Zuckerphosphats aus dem «low-molecular-mass iron pool» von Escherichia coli und Untersuchungen zum bacteriellen eisentottwechsel: Diss...D. der biol. Wiss. - Tubingen, 1995. -114p.

78. Brackman, G. Quorum Sensing Inhibitors Increase the Susceptibility of Bacterial Biofilms to Antibiotics In Vitro and In Vivo / G. Brackman, P. Cos, L. Maes, H.J. Nelis, T. Coenye // Antimicrob. Agents Chemother. - 2011. - V. 55. -№ 6. - P.2655-2661.

79. Braun, W. Studies of population changes in bacteria and their relation to some general biological problems / W. Braun // The American Naturalists. -1952. - V.86. -№831. -P.355-371.

80. Budrene, E.O. Complex patterns formed by motile cells of Escherichia coli / E.O. Budrene, H.C. Berg // Nature.- 1991,- V.349.- P.630-633.

81. Budrene, E.O. Dynamics of formation of symmetrical patterns by chemotactic bacteria / E.O. Budrene, H.C. Berg // Nature.- 1995,- V. 376.- P.49-53.

82. Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays / S.A. Bustin // Journal of Molecular Endocrinology. - 2000. - V.25. - №2 - P.169-193.

83. Byers, B.R. Iron-chelating hydroxamic acid (schizokinen) active in initiation of cell division in Bacillus megaterium / B.R. Byers, M.V. Powell, C.E. Lankford//J.Bacteriol. - 1967. - V.93. -№1. -P.286-294.

84. Carey, C.M. The effect of probiotics and organic acids on Shiga-toxin 2 gene expression in enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 / C.M. Carey, M. Kostrzynska, S. Ojha, S. Thompson // J. Microbiol. Methods.- 2008. - V.73-№2 - P.125-132.

85. Chen, G.A. Strategy for Antagonizing QuorumSensing / Chen G. [et al.] // Molecular Cell. - 2011. - V. 42. - Is.2. - P. 199-209.

86. Chesny, A.M. The latent period in the growth of bacteria / A.M. Chesny //J. Exptl. Med. - 1916. -№24. - P.387-418.

87. Chou, T.W. Prodaction of an autoinhibitor by a thermophilic bacillus / T.W. Chou, R. Greasham, S.R. Tannenbaum, A.L. Demain // J. Bacteriol. - 1972. - V.l 11. - P.459-464.

88. Coblentz, J.M. The effect of metabolites of Escherichia coli on the growth of coli - aerogenes bacteria / J.M. Coblentz, M. Levine // J. Bacteriol. -1947. - V.53. - №4. - P.455-467.

89. Darch, S.E. Density-dependent fitness benefits in quorum-sensing bacterial populations / S.E. Darch, S.A. West, K. Winzer, S.P. Diggle // PNAS. -2012. - V.109. - №.21. - P. 8259-8263.

90. Dean, A.C.R. Growth, function and regulation in bacterial cells / A.C.R. Dean, C.N. Hinschelwood - Oxford: Clarendon Press, 1966. - 439 p.

91. Dong, Y.H. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase / Dong Y.H. [et al.] // Nature. - 2001. -V.411. - P.813-817.

92. El-Gedaily, A. Plasmid virulence gene expression induced by short-chain fatty acid in Salmonella dublin: identification of rpoS-dependent and rpoS-

independent mechanism / El-Gedaily A. [et al.] // J. Bacteriol - 1997 - V. 179-№4.- P. 1409-1412

93. Fath, M. J. ABC transporters: bacterial exporters / M. J. Fath, R. Kolter // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1993. - V.57. - № 4. - P.995-1017.

94. Finlay, B. Common themes in microbial pathogenicity revisited / B. Finlay, S. Falkow // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 1997. -V.61. - №2. - P.136-169.

95. Furness, J.B. Types of neurons in the enteric nervous system / J.B. Furness // Journal of the autonomic nervous system. - 2000. - V.81. - P.87-96.

96. Galloway, W. Quorum Sensing in Gram-Negative Bacteria: Small-Molecule Modulation of AHL and AI-2 Quorum Sensing Pathways / W. Galloway, J.T. Hodgkinson, S.D. Bowden, M. Welch, D.R. Spring // Chem. Rev. -2011. - V.l 11. - P.28-67.

97. Gantois, I. Butyrate Specifically Down-Regulates Salmonella Pathogenicity Island 1 Gene Expression /1. Gantois, R. Ducatelle, F. Pasmans // Appl. Environ. Microbiol.- 2006.-V.72.-№1.-P. 946-949.

98. Geske, G.D. Expanding dialogues: from natural autoinducers to non-natural analogues that modulate quorum sensing in Gram-negative bacteria / G.D. Geske, J.C. O'Neill, H.E. Blackwell // Chem. Soc. Rev. - 2008. - V.37. -P.1432-1447.

99. Giacometti, A. RNA III inhibiting peptide inhibits in vivo biofilm formation by drug-resistant Staphylococcus aureus / A. Giacometti [et al.] // Antim-icrob. Agents Chemother. - 2003. - V.47. - №6. - P. 1979-1983.

100. Gill, S.R. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome / S.R. Gill [et al.] // Science. - 2006. - V.312. - P.1355-1359.

101. Greenberg, E. P. Bacterial communication and group behavior / E. P. Greenberg // J. Clin. Invest.- 2003.-V.l 12,-№ 9,- P. 1288-1290.

102. Henke, J.M. Bacterial social engagements / J.M. Henke, B.L. Bassler // Trends Cell Biol. - 2004. - V. 14. - P.648-656.

103. Herold, S. Differential effects of short-chain fatty acids and iron on ex-

pression of iha in Shiga-toxigenic Escherichia coli / S. Herold, J.C. Paton, P. Srimanote, A.W. Paton // Microbiology. - 2009. - V. 155. - №11. - P. 35543563.

104. Houten, S.M. Endocrine functions of bile acids / S.M. Houten, M. Wa-tanabe, J. Auwerx // EMBO J. - 2006. - V.25. - P.1419-1425.

105. Huang, Y. Formate Acts as a Diffusible Signal To Induce Salmonella Invasion / Y. Huang [et al.] // J. Bacteriol.- 2008.- V.190.- №12.-P. 4233-4241.

106. Jakobsen, T.H. Qualitative and Quantitative Determination of Quorum Sensing Inhibition In Vitro / T.H. Jakobsen, M. Gennip, L.D. Christensen, T. Bjarnsholt, M. Givskov // Methods in Molecular Biology. - 2011. - V. 692. -P.253-263.

107. Kirkpatrick, C. Acetate and formate stress: opposite responses in the proteome of Escherichia coli / C. Kirkpatrick [et al.] // J. Bacteriol - 2001 -V.183 - P.6466-6477.

108. Kobayashi, A. Secretion of an aluminum chelator, 2-isopropylmalic acid, by the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae / A. Kobayashi [et al.] // J. Inorganic Biochemistry. - 2005. - V. 99. - №5. - P. 1260-1263.

109. Lankford, C.E. Inoculum-dependent division lag of Bacillus cultures and its relation to an endogenous factors ("schizokinen") / C.E. Lankford, J.R. Walker, J.B. Reevs, N.H. Nabbut, B.R. Byers, R.J. Jones // J.Bacteriol. - 1966. -V.57. - №3. - P.620-626.

110.Lazar, V. Quorum sensing in biofilms - How to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? / V. Lazar // Anaerobe. - 2011. - V. 17. - Is.6. -P.280-285.

111. Lederberg, J. Infectious history / J. Lederberg // Science. - 2000. -V.288. - Is.5464. - P. 287-293.

112. Lyon, G.J. Peptide signaling in Staphylococcus aureus and other Grampositive bacteria / G.J. Lyon, R.P. Novick // Peptides. - 2004. - V.25. - P. 13891403.

113.Lyte, M. Microbial Endocrinology / M. Lyte, P.E. Freestone - USA:

Springer, 2010. -314 p.

114. Majerfeld, I. Tryptophanless death in Bacillus subtilis /1. Majerfeld, S. Barlati, O. Ciferri // J. Bacteriol. - 1970. - V. 101. - №2. - P.350-354.

115. Makinoshima, H. Fractionation of Escherichia coli cell population at different stages during growth transition to stationary phase / H. Makinoshima, A. Nishimura, A. Ishihama // Molecular Microbiology - 2002 - V.43 - №2 - P.269-278.

116. Mearns-Spragg, A. Cross-species induction and enhancement of antimicrobial activity produced by epibiotic bacteria from marine algae and invertebrates, after exposure to terrestrial bacteria / A. Mearns-Spragg, M. Bregu, K.G. Boyd, J.G. Burgess // Lett. Appl. Microbiol. - 1998. - V.27. - №3. - P. 142-146.

117. Molloy, S. Biofilms: Biofilms take shape / S. Molloy // Nature Reviews Microbiology. - 2012. - V. 13. - №10. - P. 162.

118. Nakanishi, N. Regulation of virulence by butyrate sensing in entero-haemorrhagic Escherichia coli / N. Nakanishi, K.Tashiro, S. Kuhara, T. Hayashi, N. Sugimoto, T. Tobe // Microbiology. - 2009. - V. 155. - №2. - P. 521-530.

119. Nicholson, J.K. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care / J.K. Nicholson, E. Holmes, I.D. Wilson // Nat. Rev. Microbiol. - 2005. - V.3. - P.431-438.

120.Novick, R.P. Quorum sensing in Staphylococci / R.P. Novick, E. Geisinger // Ann.Rev.Genetics. - 2008. - V.42. - P.541-564.

121.0'Toole, G. Biofilm formation as microbial development / G. O'Toole, H. Kaplan, R. Kolter // Annu. Rev. Microbiol. - 2000. - №54. - P.49-79.

122.Perlman, S. Citramalic acid in cerebrospinal fluid of patients with bacterial meningitis / S. Perlman, S.A. Carr // Clinical Chemistry. - 1984. - V.30.-№7. - P.1209-1212.

123. Peschkov, J. The autoinhibition activity of some microbial species / J. Peschkov // Zbl. Bakt., Hyg. 1 Abt. Orig. A. - 1976. - V.235. - P.459-463.

124.Philpott, D. E. coli: Shiga Toxin Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine) / D. Philpott, F. Ebel. - USA.: Humana press Inc., 2003. -

362 p.

125. Purves, D.Neuroscience / D. Purves [et al.] - USA: Sinauer Associates, 2004.- 135p.

126. Rasmussen, T.B. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects / T.B. Rasmussen, M. Givskov // Microbiology. - 2006. - V.152. - P.895-904.

127.Ribeiro, P.D. Treatment efficacy of the lead RNAIII-inhibiting peptide YSPWTNF-NH2 in acquired Staphylococcus aureus sepsis: a histopathological assessment / P.D. Ribeiro, O.D. Ribeiro, A.M. Marcolan, E. Medina-Acosta // Peptides. - 2003. - V.24. - №11. - P. 1829-1836.

128. Rose, S.M. A feedback mechanism of growth control in tadpoles / S.M. Rose // Ecology. - 1960. - V.41. -№1. - P. 188-199.

129. Rossman, R. Mechanism of regulation of the formate-hydrogenlyase pathway by oxygen, nitrate, and pH: definition of the formate regulon / R. Rossman, G. Sawers, A. Bock//Mol. Microbiol.- 1991.-V.5.-P.2807-2814.

130. Rumbaugh, K.F. QuorumSensing and the Social Evolution of Bacterial Virulence / K.F. Rumbaugh [et al.] // Current Biology. - 2009. - V. 19. - Is.4. -P. 341-345.

131. Sinclair, N.A. Factors, which control maximal growth of bacteria / N.A. Sinclair, J.L. Stokes // J. Bacteriol. - 1962. - V.83. - №5. - P. 1147-1154.

132. Stancik, L.M. pH-Dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in Escherichia coli / L.M. Stancik [et al.] // J.. Bacteriol.-2002,- V.184 - P.4246-4258.

133. Strange, R.E. «Substrate accelerated death» of Aerobacter aerogenes / R.E. Strange, F.A. Dark// J. Gen. Microbiol. - 1965. - V.39. -№2. -P.215-228.

134. Thanassi, D.G. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane / D.G. Thanassi, S.J. Hultgren // Curr. Opin. Cell Biology. - 2000. - V.12. - P.420-430.

135. Tobe, T. Activation of Motility by Sensing Short-Chain Fatty Acids via Two Steps in a Flagellar Gene Regulatory Cascade in Enterohemorrhagic Escherichia coli / T. Tobe, N. Nakanishi , N. Sugimoto // Infect. Immun. - 2011. -

V.79. №3,- P. 1016-1024.

136. VanGuilder, H.D. Twenty-five years of quantitative PCR for'gene expression analysis / H.D. VanGuilder, K.E. Vrana, W.M. Freeman // Biotechniques. - 2008. - V.44. - P.619-626.

137. Velliou, E.G. Towards the quantification of the effect of acid treatment on the heat tolerance of Escherichia coli K12 at lethal temperatures / E.G. Velliou, E. Van Derlinden, A.M. Cappuyns, E. Nikolaidou, A.H. Geeraerd, F. Devlieghere, J.F. Van Impe // Food Microbiol. - 2011. - V.28. - №4. - P.702-711.

138. Walters, M. Autoinducer 3 and Epinephrine Signaling in the Kinetics of Locus of Enterocyte Effacement Gene Expression in Enterohemorrhagic Escherichia coli / M. Walters, V. Sperandio // Infect. Immun. - 2006. - V.74. -№10. - P.5445-5455.

139. Waters, C. Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria / C. Waters, B. Bassler//Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 2005. - V.21. - P.319-346

140. Williams, P. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules / P. Williams, M. Camara // Current Opinion in Microbiology. - 2009. -V.12. - Is.2. - P. 182-191.

141. Yang, G. Inhibition of Staphylococcus aureus pathogenesis in vitro and in vivo by RAP-binding peptides / G. Yang, H. Cheng, C. Liu, Y. Xue // Peptides. - 2003. - V.24. - №11. - P.1823-1828.

142. Yoh, M. The stimulating effect of fosfomycin, an antibiotic in common use in Japan, on the production/release of verotoxin-1 from enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 in vitro / M. Yoh, T. Honda // Epidemiol. Infect. -1997. - V.l 19. - P. 101-103.