Характеристики вируса гриппа, влияющие на показатели гуморального иммунного ответа в эксперименте и при вакцинации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Федорова, Екатерина Алексеевна

• Федорова, Екатерина Алексеевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Федорова, Екатерина Алексеевна

Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................5

Раздел 2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ........................................................................................................10

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................10

1.1 Вирус гриппа. Общие сведения.............................................................................................10

1.1.1 Строение вириона................................................................................................................10

1.1.2 Жизненный цикл вируса гриппа........................................................................................10

1.2. Белки вируса гриппа..............................................................................................................12

1.2.1 Белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА).............................................................12

1.2.2 Поверхностные белки вируса гриппа - гемагглютишш и ненраминидаза...................12

1.2.3 Нуклеопротеин (NP)............................................................................................................19

1.2.4 Ml и М2 белки.....................................................................................................................20

1.2.5 Неструктурные белки..........................................................................................................20

1.3 Специфический иммунитет к вирусу гриппа и ЖГВ.......................................................21

1.3.1 Гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа и ЖГВ.................................................22

1.3.2 Клеточный иммунный ответ к вирусам гриппа и ЖГВ...................................................24

1.3.3 Методы оценки гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию..............25

1.3.4 Морская свинка как модель для изучения противогриппозного иммунитета..............28

1.4 Свойства вируса гриппа, которые могут повлиять на иммуногениость гриппозных вакцин..............................................................................................................................................30

1.4.1 Темпсратурочувствительность «диких» вирусов, ее возможные механизмы..............31

1.4.2 Влияние ts-фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногениость вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины........................................................................................ 32

1.4.3 Ингибиторочувствительность «диких» вирусов, ее природа и возможные механизмы ........................................................................................................................................................34

1.4.4 Связь ингибиторочувствительности с иммуногенностыо..............................................37

1.4.5 Связь рецепторной специфичности с иммуногенностыо................................................39

1.5 Кодонпая оптимизации как способ повышения иммуногенности.................................43

1.5.1 Теоретические основы оптимизации кодонного состава................................................43

1.5.2 Использование метода изменения кодонного состава в разработке аттенуированных противовирусных вакцин............................................................................................................45

1.5.3 Повышение иммуногенности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава...........................................................................................................................................47

1.6 Заключение к обзору литературы.........................................................................................50

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................................51

2.1 Вирусологические методы......................................................................................................51

2.2 Методы работы с лабораторными животными.................................................................55

2.3 Методы оценки показателен гуморального нммунного ответа......................................55

2.4 Молекулярно-биологическис методы.................................................................................57

2.5. Методы компьютерного моделирования...........................................................................61

2.6 Методы статистической обработки......................................................................................62

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ....................................................................................................................63

3.1 Отработка модели для постановки опытов по исследованию показателей гуморального иммунного ответа на вирус гриппа..................................................................63

3.1.1 Сравнительный анализ патогенетичесюгх особенностей гриппозной и вакцинальной инфекций у морских свинок........................................................................................................63

3.1.2 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах...............................................................................................................................................67

3.1.3 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с одиночными кодирующими мутациями в гемагглютинине.......70

3.1.4 Заключение..........................................................................................................................71

3.2 Влияние пигнбнторочувствнтслыюсти штамма вируса гриппа на показатели гуморального иммунного ответа у ¡морских свинок...............................................................72

3.2.1 Сравнение ингибитороустойчивого и ингибиторочувствителыюго вариантов вируса A/Singapore/1/57 (H2N2), имеющих аминокислотные замены в рецептор-связывающей области гемагглютшшна, в экспериментах in vitro и in vivo...................................................72

3.2.2 Показатели гуморального иммунного ответа после заражения морских свинок вариантами вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) в экспериментах in vivo..................................75

3.2.3 Характеристика 7:1 и 6:2 реассортантов, унаследовавших нейрамшшдазу от ИЧ или ИУ вируса-родителя.....................................................................................................................78

3.2.4 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и 6:2 реассортантами на основе вируса гриппа A/California/7/2004 (H3N2).............................81

3.2.5 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и 6:2 реассортантами на основе вируса гриппа B/Wisconsin/1/2010..........................................84

3.2.6 Заключение..........................................................................................................................87

3.3 Отдельные аминокислотные замены в молекуле гемагглютшшна н их влияние на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными штаммами...............................................................................................................88

3.3.1 Гетерогенность в аминокислотном составе гемагглютинина популяции дикого вируса A/New Caledonia/20/99 (II INI) и реассортантов, полученных на его основе в развивающихся куриных эмбрионах и клетках MDCK...........................................................88

3.3.2 Картирование аминокислотных отличий в гемагглютинине клонов дикой популяции A/New Caledonia/20/99 (НINI) и вакцинных реассортантов, подготовленных на их основе ........................................................................................................................................................91

3.3.3 Показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок, вакцинированных штаммами, подготовленными на основе вариантов вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1), имеющих одиночные аминокислотные отличия в гемагглютинине.......................................93

3.3.4 Заключение..........................................................................................................................96

3.4 Влияние оптимизации кодонного состава гемагглютинина на свойства вирусов гриппа и показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo..............97

3.4.1 Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе..............................................................................97

3.4.2 Фенотипические свойства вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине..........................................................................................................................101

3.4.3 Показатели гуморального иммунного ответа после введения вирусов НШ1 и Н51\Г1 с

измененным составом кодонов в гемагглютишше в экспериментах ш vivo........................106

3.4.4 Отработка методики получения вакцинных штаммов ЖГВ на основе штаммов для инактивированной вакцины (PR8 реассортантов)..................................................................108

3.4.5 Реассортация вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57................................... 112

3.4.6 Заключение........................................................................................................................115

3.5 Связь фснотипичсских признаков «диких» родительских вирусов с иммуиогеиностыо вакцинных штаммов, подготовленных на их основе:

ретроспективный анализ данных клинических испытаний живой гриппозной вакцины

..........................................................................................................................................................116

3.5.1 Влияние /¿'-фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных

штаммов живой гриппозной вакцины......................................................................................116

3.5.2 Влияние ингибиторочувствительности «дикого» родительского................................119

3.5.3 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ.............................................................................................................................120

3.5.4 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на выраженность клинических реакций при введении ЖГВ...................................................................................................... 121

3.5.5 Заключение........................................................................................................................122

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................................................123

Раздел 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................................138

ВЫВОДЫ:.........................................................................................................................................139

Благодарность...................................................................................................................................140

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................141

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА...................................................................142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................147

ПРИЛОЖЕНИЯ

179

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристики вируса гриппа, влияющие на показатели гуморального иммунного ответа в эксперименте и при вакцинации»

Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Вакцинопрофилактика гриппа, как и многих других вирусных инфекции, остается эффективным средством предупреждения развития этого заболевания. Существует два основных направления специфической профилактики гриппа -вакцинопрофилактика с помощью инактивированной (ИГВ) и живой гриппозной реассортантной (ЖГВ) вакцин. Преимущество ЖГВ заключается, во-первых, в возможности наращивания больших объемов препарата в короткие сроки, что особенно важно в случае возникновения угрозы новой пандемии и в странах с высокой плотностью населения, во-вторых - в стимуляции более широкого спектра факторов адаптивного иммунитета, в том числе во «входных воротах» инфекции [33-35, 38, 314]. Эксперты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют применение ЖГВ наряду с ИГВ, поскольку в результате вакцинации этим препаратом у привитых возникает перекрестный иммунитет к разным вариантам вируса гриппа [345].

На количественные и качественные характеристики поствакцинального адаптивного иммунного ответа к ЖГВ могут в комплексе влиять гено- и фенотипические признаки как вакцинируемых людей, так и вакцинного штамма. Если первая сторона этого вопроса изучена довольно основательно, то вторая - значительно слабее. Настоящая работа посвящена исследованию связи между некоторыми биологическими признаками вируса гриппа (чувствительность к повышенной температуре и к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови, наличие отдельных или множественных аминокислотных замен в белках) и интенсивностью гуморального иммунного ответа на этот возбудитель.

Степень разработанности темы. Развитие иммунного ответа на ЖГВ и вирусы гриппа изучается как в экспериментальных работах [47, 49], так и с эпидемиологической точки зрения [34, 283]. Накоплены данные о закономерностях его формирования при гриппозной инфекции и вакцинации [33-34, 41]. Разработан комплексный метод оценки гуморального противогриппозного иммунитета [33, 39].

В отдельных работах описана связь иммунного ответа организма с такими фенотипическими признаками вирусов гриппа А, как чувствительность к высокой температуре инкубации, чувствительность к неспецифическим сывороточным ингибиторам [14, 30-31, 78-79, 321]. Однако в данных работах изучен только один показатель иммунного ответа: антигемагглютинирующие антитела. Периодически появляются новые сведения об одиночных мутациях, влияющих на иммунный ответ [97-98, 156, 188], и экспериментальные исследования

в этом направлении позволят дополнить знания о роли определенных аминокислотных позиций в белках вируса гриппа.

IIa настоящий момент активно развивается направление оптимизации кодонного состава генетических конструкций, используемых в противовирусных вакцинных препаратах. Данный прием позволяет повысить иммуногенность ДНК-вакцин [165, 364], в том числе гриппозных [96, 316, 331]. В литературе описано получение аттенуированного штамма полиовируса с деоптимизированным кодонным составом [90]. Сведения о применении этой методики по отношению к живому вирусу гриппа в литературе отсутствуют.

Таким образом, литературные данные о влиянии биологических свойств вируса гриппа на формирование поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа, разрозненны и не позволяют сделать окончательный вывод о том, какие свойства «дикого» вируса гриппа дают возможность повысить иммуногенность вакцинных штаммов в отношении индукции гуморального иммунитета.

Целью работы явилось изучение отдельных биологических свойств вирусов гриппа, влияющих на показатели гуморального иммунного ответа при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. В соответствии с поставленной целыо были сформулированы следующие задачи:

1. Обосновать возможность использования морских свинок как модели для изучения

гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию и вакцинацию живой гриппозной вакциной.

2. На базе этой модели изучить связь количественных показателей гуморального иммунного

ответа с чувствительностью вирусов гриппа к неспецифическим сывороточным ингибиторам и наличием одиночных аминокислотных замен в гемагглютинине.

3. Охарактеризовать штаммы вируса гриппа с искусственно измененным составом кодонов в

гене, кодирующем гемагглютинин, и оценить влияние изменения кодонного состава на показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo.

4. На основе анализа результатов клинических испытаний оценить влияние свойств температуро- и ингибиторочувствительности «дикого» родительского вируса на интенсивность гуморального ответа у людей, привитых живой гриппозной вакциной.

Научная новизна. Впервые обоснована возможность использования морских свинок как модели для изучения гуморального иммунного ответа на ЖГВ.

Впервые исследованы свойства живых вирусов гриппа А с измененным составом кодонов сегмента генома, кодирующего гемагглютинин, в экспериментах in vitro и in vivo и показана перспективность кодонной оптимизации гемагглютинина живого вируса гриппа А применительно к повышению его иммуногенности.

Впервые в опытах ш vivo и по материалам клинических испытаний проведен сравнительный анализ иммуногенности реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на основе «диких» вирусов гриппа А и В, с разным уровнем ингибиторо- и температуроустойчивости. Установлена связь этих свойств с выраженностью гуморального иммунного ответа.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа включает как теоретические, так и практические аспекты. Полученные данные о влиянии на иммуногенность изученных фенотипических свойств вирусов гриппа А и В, аминокислотных замен в гемагглютинине, изменения кодонного состава гемагглютинина дополняют знания о механизмах развития постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа к этому возбудителю. Решен ряд практических задач:

Обоснована возможность использования морских свинок в качестве модельного объекта для изучения показателей гуморального иммунного ответа к вирусам гриппа А и В.

Разработана схема оценки показателей гуморального иммунного ответа к ингибиторочувствительпым вирусам гриппа А и В у морских свинок.

Сформулированы принципы отбора «диких» вирусов гриппа А и В для использования в качестве источников антигенных детерминант при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, позволяющие повышать показатели гуморального иммунного ответа.

Показана перспективность применения методики направленного изменения кодонного состава НА живых вирусов гриппа А для повышения их иммуногенности при интраназальном введении.

Отработаны приемы, позволяющие повысить эффективность реассортации вирусов, содержащих внутренние гены от высокоурожайного вируса A/PR/8/34 с холодоадаптированным донором аттенуации.

Методология и методы исследования. Основной методологической базой явились экспериментальные исследования на морских свинках. Были использованы вирусологические, серологические, иммунологические и молекулярно-биологические методы (см. «Материалы и методы»).

Личный вклад автора. Автором лично спланирована, подготовлена и проведена экспериментальная часть данного исследования: работа с вирусами и с животными, исследование биоматериалов, молекулярно-биологический анализ. Осуществлена статистическая обработка полученных данных. Автором систематизированы и проанализированы архивные данные клинических испытаний вакцинных штаммов, проведенных в разные годы силами коллектива отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева

Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» (ФГБНУ «ИЭМ»),

Положения, выносимые на защиту.

Морские свинки могут быть использованы как модель для изучения поствакцинального и постинфекционного гуморального иммунного ответа к вирусам гриппа.

Вакцинные штаммы, подготовленные на основе устойчивых к температуре и неспецифическим сывороточным ингибиторам «диких» вирусов гриппа, обладали повышенной иммуногенностыо в отношении индукции гуморального иммунного ответа.

Одиночные аминокислотные замены ТИП в НА1 и D112N в НА2 гемагглютшшна вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1), приводили к снижению показателей гуморального иммунного ответа у экспериментальных животных.

Полученные данные о применении метода кодонной оптимизации гемагглютшшна вируса гриппа А открывают перспективы конструирования высоко иммуногенных живых гриппозных вакцин.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность и объективность выносимых на защиту положений и выводов диссертации подтверждается значительным объемом исследований и большим массивом статистически обработанных данных. Результаты были представлены на 16 международных и российских конференциях, в том числе I и II Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (СПб, 2010; 2012); на международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодежь - медицине будущего» (Одесса, Украина, 2011); на 4 и 5 конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI) (Мальта, 2014; Рига, Латвия, 2014); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, 2011); на научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение» (СПб, 2012); на XVI и XVII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (СПб, 2013 и 2014); на международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (СПб, 2013); на VIII Международном конгрессе по контролю за гриппом (ЮАР, Кейптаун, 2013); на 8 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); на научно-практической конференции молодых ученых "От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций: подходы, традиции, инновации" (СПб, 2014); на Международной научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню здоровья (Киев, 2014); на

межлабораторной конференции ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», а также регулярно заслушивались на заседаниях отдела вирусологии им. А. А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» (2010-2014).

Публикации. Основные результаты и положения диссертации, выводы и заключение полностью отражены в 14 научных статьях, 9 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки РФ, или входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования.

10

Раздел 2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа. Общие сведения

Вирус гриппа (р. Ьфиета) относится к сем. Ог1котухоутЛас. Выделяют три рода: вирусы гриппа А, В и С. Природным резервуаром вирусов гриппа А являются птицы, но вирусы гриппа А поражают также широкий круг животных, включая свиней, лошадей, и морских млекопитающих. Ряд подтипов вирусов гриппа А вызывает инфекции у человека. Вирусы гриппа В и С поражают прежде всего человеческую популяцию [264].

1.1.1 Строение вирнона

Вирусы гриппа - оболочечные вирусы с сегментированным геномом, представленным одноцепочечной антисмысловой РНК. Геном вирусов гриппа А состоит из 8 сегментов, в составе вириона связанных в нуклеопротеиновые комплексы [161]. В структуре нуклеопротеинового комплекса РНК связана с белком - нуклеопротеином (ИР), а также с РНК-зависимой-РНК-полимсразой. Полимераза вируса гриппа состоит из трех субъединиц: два основных белка полимеразы (РВ1, РВ2) и кислый белок полимеразного комплекса (РА). В процессе упаковки РНК в нуклеопротеин КР образует так называемый кор, вокруг которого РНК формирует спиральную структуру [161]. Геном, упакованный в нуклеопротеиновый комплекс, окружен матриксным белком М1 и окружен липидной оболочкой, которая представляет собой фрагмент билипидного слоя мембраны хозяйской клетки, содержащий вирусные белки: гемагглютшшн (НА), нейраминидазу (ИА) и белок М2 [189]. Гемагтлютинин и нейраминидаза являются основными антигенными детерминантами вируса, и вариации в их структуре приводят к появлению новых эпидемических и пандемических штаммов вируса гриппа. На настоящий момент насчитывается 18 сероподтипов гемагглютинина и 11 — нейраминидазы [350]. В вирионе также присутствует ИЕР (ранее обозначавшийся как N82), в комплексе с белком М1 [356].

1.1.2 Жизненный цикл вируса гриппа

Вход внриона гриппа в клетку происходит после взаимодействия гемагглютинина с рецептором клеточной поверхности, содержащим сиаловую кислоту [297]. После связывания с рецептором, вирус попадает внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в клатрин-окаймленной везикуле. Снижение рН внутри эндосомы до значений 5,0-6,0 вызывает

структурные изменения в молекуле гемагглютинина, приводящие к слиянию оболочки вируса с мембраной эндосомм, в результате чего вирион попадает в цитоплазму [151].

Для обеспечения слияния, молекула гемагглютинина НАО подвергается расщеплению на субъединицы НА1 и I1A2, что обеспечивает освобождение пептида слияния, расположенного на N-конце субъединицы НА2.

Белок М2, минорный компонент оболочки вируса гриппа, является протонной помпой, пропускающей ионы Н+ внутрь оболочки вируса до слияния мембран, обеспечивая диссоциацию М1-капсида от рибонуклсопротеинового комплекса [342], что обеспечивает эффективный транспорт генетического материала вируса в цитоплазму зараженной клетки. Далее генетический материал транспортируется в ядро клетки, за счет взаимодействия белка NP вируса с компонентами клеточного цитоскелета [246].

В ядре клетки генетический материал вируса транскрибируется вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой с получением мРНК, на основе которых производится синтез вирусных белков [147]. В процессе репликации вируса с генетических сегментов, состоящих из антисмысловой РНК, вирусной полимеразой считываются смысловые копии, которые служат матрицей для синтеза антисмысловых генетических сегментов, предназначенных для упаковки в новые вирионы, что также осуществляется РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса [262].

Сборка вирионов начинается в ядре клетки с присоединения NP к сегментам РНК и формирования рибонуклеопротеиновых комплексов. Отдельные белки NP формируют комплексы, вокруг которых происходит упаковка РНК-сегмента. Концевые участки РНК содержат сигналы упаковки, обеспечивающие упаковку сегментов в вирион. Каким образом детерминируется состав сегментов в вирионе при упаковке, до сих пор неизвестно точно, но предполагается, что процесс детерминируется РНК-РНК взаимодействиями между сегментами, поскольку зрелые вирионы вируса гриппа редко содержат неправильный или избыточный набор генетических сегментов [161]. Для окончательной сборки вириона упакованный в рибонуклеопротеиновый комплекс генетический материал покидает ядро клетки, в данном процессе задействованы белки NEP и М1. Далее нуклеокапсид, в комплексе с белком NEP, перемещается к области raft-микродоменов мембраны и там выходит из клетки, в процессе выхода приобретая оболочку, в которой содержатся белки НА, NA и М2 [241]. Основную роль в процессе отпочковывания от мембраны играет белок М1, который взаимодействует с мембраной клетки N-концевым доменом [361].

Для окончательного освобождения вириона необходима работа нейрамшшзады: она предотвращает агрегацию вирионов непосредственно после выхода и разрушает связь между сиало-содержащими рецепторами клеточной поверхности и высвобождающимися вирионами [203].

1.2. Белки вируса гриппа

1.2.1 Белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА)

РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гриппа представляет собой гстсротример, состоящий из двух основных (РВ1, РВ2) и одного кислого белка (РА) [68]. Молекулярный вес комплекса составляет около 250 кДа [205]. Субъединицы гетеротримера плотно упакованы в структуру с полостью внутри. При взаимодействии с субстратом комплекс претерпевает конформационные изменения. Центральным компонентом полимеразного комплекса является белок РВ1, который взаимодействует с двумя другими субъединицами. РВ1 взаимодействует с вирусным промотором, осуществляет элонгацию РНК и отщепление кэпа [82]. Субъединица РВ2 необходима для осуществления транскрипции вирусной РНК [201], а также имеет кэп-связывающий сайт [120]. РА необходим для репликации и транскрипции, а также участвует в эндонуколеазном отщеплении кэпированного РНК-праймера [205]. Для эффективной транскрипции и репликации вируса требуется участие всех трех субъединиц комплекса.

Мутации в белках полимеразного комплекса могут привести к значительным изменениям в реализации жизненного цикла вируса. Так, лизин в позиции 627 РВ2, обнаруженный у птичьих штаммов гриппа, приводит к изменению температурного оптимума работы полимеразного комплекса, что связано с изменением вирулентности штаммов [294]. Тирозин в позиции 436 РВ2, треонин в позиции 515 РА приводят к изменению вирулентности вирусов в популяциях водоплавающих птиц [205].

Отдельные аттенуирующие замены в белках полимеразного комплекса описаны для холодоадаптированных доноров живой гриппозной вакцины [157, 181].

1.2.2 Поверхностные белки вируса гриппа - гемагглютиннн и нейрамннидаза 1.2.2.1 Гсмагглютишш

Строение гемагглютинина. Гсмагглютишш вируса гриппа представляет собой интегральный белок липидной оболочки вируса. Он обеспечивает специфическое распознавание рецепторов, прикрепление вирусной частицы к рецепторам на поверхности клетки и плавление мембраны эндосомы для обеспечения выхода вирусной частицы в цитоплазму клетки [297].

Гемагтлютишш - гомотример, трансмембранньтй гликопротеин I типа, цилиндрической формы, размером примерно 135 А в высоту и 35-70 Á в радиусе. Каждый мономер состоит из глобулярной головки и ножки, в негликозилированной форме молекулярная масса мономера около 60 кДа. Глобулярный домен полностью принадлежит субъединице НА1, ножка состоит из частей, принадлежащих как субъединице НА1, так и субъединице НА2 [299]. До

расщепления на цепи НА1 и НА2 каждый мономер представляет собой единую цепь НАО. В процессе синтеза НАО котрансляционно транспортируется в эндоплазматический ретикулум, затем через систему цистерн комплекса Гольджи транспортируется на плазматическую мембрану. НАО расщепляется на субъединицы НА1 (327 аминокислот) и IIA2 (222 аминокислоты), соединенные дисульфидными мостиками. Свободные концы в сайте расщепления (С-конец НА1 и N-конец IIA2) отстоят друг от друга на расстояние 20 Ä. В молекуле НАО в сайте расщепления большая часть вирусов гриппа содержит остаток аргинина, у высокопатогснных штаммов птичьего гриппа в данном участке располагается ряд остатков положительно заряженных аминокислот [303].

Каждый мономер заякорен в мембране спирально уложенным трансмсмбранным пептидом длиной 27-28 аминокислот, расположенным в области С-конца каждой из цепей IIA2, последние 10 аминокислот формируют короткий участок, расположенный в цитозоле [346].

Глобулярные участки гемагглютинина сформированы аминокислотными остатками НА1 116 -261, уложенными в «jelly-roll»-MOTiiB из 8 антипараллельных слоев. Дистальные концы глобулярных участков содержат высококонссрвативные рецептор-связывающие карманы, вокруг которых располагаются высоко вариабельные антигенные сайты [167, 340]. Оставшиеся части НА1 входят в структуру ножки в основном в составе ß-слоев. НА2, которая формирует основную часть ножки, уложена преимущественно в спиральную структуру длиной 80 А. Первые 20 аминокислот субъединицы НА2 представляют собой гидрофобный пептид слияния, необходимый для выхода вируса из эндосомы [167]. Строение пептида слияния является важной детерминантой патогенности вируса гриппа и мутации в данной области влияют на фузогенную активность гемагглютинина и, соответственно, эффективность запуска инфекционного цикла вируса [347]. Пептид слияния богат глицином, что обеспечивает достаточную гибкость в данном участке При нейтральном pH, N-концы пептидов слияния расположены в пространстве между субъединицами тримера в трансмембранном участке. При снижении pH участок претерпевает конформационные изменения, необходимые для установления контакта между гидрофобными областями мембраны эндосомы и молекулы гемагглютинина [167].

N-связанные олигосахариды, оказывающие значительное влияние на функции гемагглютинина, обнаружены в глобулярном домене и в ножке тримера. В глобулярной части расположение сайтов гликозилирования вариабельно, в ножке, как в субъединице НА1, так и в субъединице НА2 - более консервативно [288, 328].

Рецепториый карман. Рецепторный карман вируса гриппа, расположенный в глобулярной части, служит для специфического распознавания рецепторов на клеточной поверхности и связывания с ними. Клеточными рецепторами вируса гриппа являются

терминальные остатки сиаловой кислоты [340]. Рецепторный карман сформирован петлями 120, 130, 150, 220 и спиралью 190 [242]. Аминокислотные остатки, формирующие рецепторный карман вируса гриппа, консервативны среди разных подтипов вируса гриппа. Структурные исследования позволили установить роль отдельных аминокислотных остатков во взаимодействии с рецептором в рецепторном кармане: на рисунке 1 видно ориентацию остатка сиаловой кислоты в рецепторном кармане, показаны водородные связи между молекулой сиаловой кислоты и аминокислотными остатками рецепторного кармана [216].

Рисунок 1. Схематическое изображение рецептор-связывающего сайта гемагглютинина, взаимодействующего с аналогом рецептора вируса гриппа с указанием ключевых позиций, участвующих во взаимодействии с рецептором и водородных связей между отдельными аминокислотными остатками и аналогом рецептора. Желтым показан остаток сиаловой кислоты, серый - участки молекулы гемагглютинина. Красным показаны атомы кислорода, темно-синим - атомы азота. Водородные связи обозначены пунктирными линиями. Иллюстрация из статьи [216]

Консервативный остаток серина 136 формирует водородную связь с карбоксильной группой, которая также соединена водородной связью с амидом пептидной связи 137, гистидин 183 и глутаминовая кислота 190 формируют водородные связи с 9-гидроксильной группой, тирозин 98 соединен водородной связью с 8-гидроксильной группой. 5-ацетамидо азот формирует водородную связь с пептидной связью 135, и метильная группа данного остатка участвует в Ван-дер-Ваальсовом взаимодействии с 6-членным кольцом триптофана 153. 7-гидроксильная группа и ацетамидокарбонил водород связаны водородной связью и формируют Ван-дер-Ваальсово взаимодействие с остатком лейцина 194 [297, 340]. Участие данных функциональных групп во взаимодействии подтверждено структурными исследованиями [340], а также исследованиями свойств белков с мутациями в ключевых аминокислотных позициях [131]. На связывание с эритроцитами влияли замены только в трех из перечисленных

аминокислотных позиции: Y98F, I1183F, и L194A. Эти результаты подтверждают важность водородной связи Туг98 с 8-гидроксильной группой сиаловой кислоты и неполярный контакт Leu194 с N-ацстил-мстильной группой. His183 формирует водородные связи с Туг98, а также с 9-гидроксильной группой сиаловой кислоты. Тгр153 и Туг195, формирующие часть сети водородных связей, наряду с His183 и Туг98, могут быть замещены фенилаланином, вследствие чего наступает только частичное ингибирование связывания [297].

Гсмагглютинин вируса гриппа имеет специфичность к связи, которой остаток сиаловой кислоты соединен с остатком галактозы. В природе встречаются два основных типа связи: Neu5Ac-(2,3)-Gal и Neu5Ac-(2,6)-Gal. Гемагглютинины разных подтипов вирусов имеют разное сродство к этим связям: вирусы гриппа птиц присоединяются преимущественно к остаткам, присоединенным а-2,3 связью, вирусы гриппа человека предпочитают а-2,6 связь [279]. За смену рецепторной специфичности вирусов Н2, НЗ, Нб отвечают аминокислотные остатки в позициях 226 и 228 [98], у вирусов подтипа H1N1 - остатки 190 и 225 [126], у вирусов гриппа В - аминокислотный остаток 198 [335]. Структурные исследования показали, что, хотя аминокислоты в указанных позициях не взаимодействуют с остатком сиаловой кислоты напрямую, при возникновении аминокислотных замен в ключевых позициях изменяется конформация рецептор-связывающего кармана, что изменяет аффинность к рецептору [278].

Антигенные сайты НА. Вокруг консервативного рецепторного кармана расположена высоко вариабельная область, постоянно изменяющаяся под действием иммунного пресса -антигенные сайты гемагглютинина [297]. У вирусов подтипа II3N2 описаны антигенные сайты А, В, С, D, Е [357]. Для вирусов подтипа HI описано 4 основных антигенных сайта в головке гемагглютинина - Са, Cb, Sa и Sb [94, 242]. У пандемического вируса A/California/07/09 в состав антигенного сайта Sa входит 13 аминокислот, Sb - 12, Са - 19 аминокислот, СЬ - 6. На рисунке 2 показано расположение основных антигенных сайтов в молекуле гемагглютинина подтипа III.

В состав антигенных сайтов входят аминокислотные остатки, локализованные в глобулярной части молекулы гемагглютинина, формирующие ее поверхность. Общей чертой антигенных сайтов является петлеобразная структура, изменения в которой возможны без влияния на остальшле части молекулы гемагглютинина, а также наличие сайтов гликозилирования [297]. Присоединение олигосахаридов позволяет уйти от воздействия иммунного ответа. Это может происходить двумя путями: во-первых, часть поверхности гемагглютинина покрыта углеводными цепями, приобретенными в клетке хозяина, которые являются для организма «своими» и маскируют вирусный белок ; во-вторых, в процессе антигенного дрейфа отдельные сайты гликозилирования исчезают, другие появляются, что сильно изменяет поверхность гемагглютинина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Федорова, Екатерина Алексеевна, 2015 год

Список источников:

1. Киселева И.В., Руденко Л.Г., Александрова Г.И., Климов А.И., Ларионова Н.В. Штамм А /17/ Нанчанг/ 95/ 4 (НЗЫ2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ № 2128223 Дата приоритета 07.05.1997.

2. Ларионова Н.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И., Киселева И.В. Штамм А /47/ Нанчанг/ 95/ 13 (НЗШ) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ № 2127757 Дата приоритета 07.05.1997.

3. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Науменко З.С., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (НЗК2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ № 2159812 Дата приоритета 15.06.1999 Опубл. БИ 2000.-№33.

4. Киселева И.В. Основы аттенуации вируса гриппа. Автореферат дис......д-ра биол. Наук. -

СПб, 2001: СПб.

5. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Науменко З.С., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/47/Сидней/97/14 (Н31М2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ № 2159809 Дата приоритета 25.05.1999 Опубл. БИ 2000,- №33.

6. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Панама/99/242(НЗШ) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ № 2248394 от 20.03.2005 г.

7. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/47/Панама/99/234 (НЗШ) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ № 2266329 от 20.12.2005 г.

8. Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Киселева И.В., Ларионова Н.В. Штамм вируса гриппа А/17/Вайоминг/03/8 (НЗЫ2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2285723 от 20.10.2006 г.

9. Киселева И.В., Исакова И.И., Александрова Г.И., Рудснко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2315101 от 20.07.2007 г

10. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа А/17/ Калифорния/04/71 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2307162 от 27.09.2007 г

11. Исакова И.Н., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа, ГИСК№147, используемый для получения живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей (вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 II3N2). Патент РФ №2319744 от 19.04.06,- Опубл. БИ 2008.-№8.

12. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей. Патент РФ №2416640 от 11.01.10.- Опубл. БИ 2011 .-№ 11.

13. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей. (А/17/Перт/09/87 (H3N2). Патент РФ на изобретение № 2464311. Зарегистрировано 20.10.2012. Дата приоритета 24.05.2011. Опубл. 20.10.2012 Бюлл. №29.

14. Полежаев Ф.И., Александрова Г.И., Гармашова Л.М., и др . Вакцинный штамм Н/1/2/17 вируса гриппа. Автор, свид-во СССР № 833260 от 1978.

15. Полежаев Ф.И. Живая рекомбинантная вакцина против гриппа. Диссертация на соискание уч.степени докт.мед.наук. 1983, НИИЭМ АН СССР: Ленинград.

16. Полежаев Ф.И., Александрова Г.И., Будиловский Г.Н., Гармашова Л.М., Гендон Ю.З., Грунис A.M., и др. Штамм вируса гриппа 17/42/3 (H3N2), используемый для производства живой гриппозной вакцины. Автор, свид-во СССР № 1003539 от 28.05.1981.

17. Киселева И.В., Григорьева Е.П., Найхин А.Н., Иванова В.В., Ларионова Н.В., Донина С.А., и др. Температурочувствительность эпидемических вирусов гриппа А как возможный маркер иммуногенности реассортантных вакцинных штаммов. Вопросы вирусологии. 2003. 48 (4): 26-29.

18. Гущина М.И., Получение холодоадаптированных рекомбинантных штаммов для живой гриппозной вакцины типа А для детей. Диссертация на соискание уч.степени канд.биол.наук. НИИЭМ АМН СССР. 1989: Ленинград.

19. Гущина М.И., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., и др. Штамм 47/ С вируса гриппа A(H3N2) используемый для получения живой интраназалыюй вакцины для детей. Авторское свид-во СССР № 1655985 от 15.12.91.

20. Романова Ю.Р., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Ларионова Н.В. Штамм

А/17/Иоганесбург/94/1 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых. Патент РФ № 2110277 Дата приоритета 30.05.1996.

21. Александрова Г.И., Романова Ю.Р., Руденко Л.Г. Штамм А/47/ Иоганесбург/94/1 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для детей. Патент РФ № 2110278 Дата приоритета 30.05.1996.

22. Романова Ю.Р., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., и др. Штамм А/17/Шангдонг/93/3/5 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых. Патент РФ № 2077582 Дата приоритета 29.12.1994.

23. Романова Ю.Р., Чудин А.Б., Климов А.И., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм А/17/ Пекин/92/4 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых. Патент РФ № 2078818 Дата приоритета 30.09.1994.

24. Романова Ю.Р., Лисовская К.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм А/47/Пек1ш/92/3 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ № 2078820 Дата приоритета 30.09.1994.

25. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа А/17/Внсконсин/05/84 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ №2340671 от 13.06.07,- Опубл. БИ 10.12.2008.-№34. 2008.

26. Гармашова JI.M., Александрова Г.И., Буднловский Г.И., Полежаев Ф.И., Гсидон Ю.З., Климов А.И., и др. Штамм вируса гриппа 47/7/2 (H3N2), используемый для получения живой интраназальнои вакцины для детей. Автор, свид-во СССР № 1036739 от 04.08.1981.

27. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Перт/95/29 (Н1N1) для производства живой гриппозной интраназальнои вакцины. Патент РФ № 2144955 Дата приоритета 30.04.1998 Опубл. БИ 2000,- №3. 2000.

28. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/47/Иоганнесбург/96/7/7 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальнои вакцины для детей. Патент РФ № 2151185 Дата приоритета 10.12.1998. Опубл. БИ 2000,- №17.

29. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Науменко З.С., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Пекин/95/25 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальнои вакцины для взрослых. Патент РФ № 2159811 Дата приоритета 20.05.1999 Опубл. БИ 2000.-№33.

30. Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Науменко З.С., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/47/Пекин/95/35 (H1N1) для производства живой гриппозной инт-раназальной вакцины для детей. Патент РФ № 2159810 Дата приоритета 25.05.1999 Опубл. БИ 2000.- №33.

31. Киселева PI.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов A.PI. Штамм вируса гриппа A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых. Патент РФ № 2183672 Дата приоритета 08.12.2000 Опубл. БИ 2002,-№17.

32. Киселева PI.B., Александрова Г.Р1., Руденко Л.Г., Климов А.И. Штамм вируса гриппа A/47/Новая Каледония/99/156 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для детей. Патент РФ № 2185437 Дата приоритета 08.12.2000 Опубл. БИ 2002.- №20.

33. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/07/28 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей. Патент РФ №2416641 от 30.12.10.- Опубл. БИ 2011.-№11. 2011.

34. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.Р1., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа A/17/Соломоновы острова/06/9 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназалыюй вакцины для взрослых и детей. Патент РФ №2422518 от 11.01.2010.- Опубл. БИ 2011.-№18.

35. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ №2413765от 16.09.09- Опубл. БР1 2011.-№7.

36. Полежаев Ф.И., Александрова Г.Р1., Гармашова Л.М., Грунис A.M., Богомолова Л.И., Момот О.Ф., и др. Вакцинный штамм H/32/5 (Н INI). Автор, свид-во СССР № 833260 от 27.08.1979.

37. Гущина M.PI., Александрова Г.И., Медведева Т.Е., Лонская H.PI., Климов А.И., Коваль Т.А., и др. Штамм A/47/Чл вируса гриппа A(PIINI) используемый для получения интраназалыюй вакцины для детей. Авторское свид-во СССР № 1446925 от 22.08.88.

38. Гущина М.И., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., и др. Штамм 47/Т вируса гриппа A(H1N1) используемый для получения живой интраназальной вакцины для детей. Авторское свид-во СССР № 1632040 от 01.11.90.

39. Романова Ю.Р., Чудин А.Б., Климов А.И., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм A/17/Тсхас/ 91/ 1/ 3 (HIN 1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ № 2084524 Дата приоритета 30.09.1994.

40. Гущина М.И., Александрова Г.И., Хайдер A.A., Руденко Л.Г. Штамм А/47/ Техас/91/2/6 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для детей. Патент РФ № 2077581 Дата приоритета 30.09.1994.

41. Полежаев Ф.И., Александрова Г.И., Будиловский Г.Н., Гармашова Л.М., Гендон Ю.З., Климов А.И., и др. Штамм вируса гриппа 47/25/1 (H1N1), используемый для получения живой интраназальной вакцины для детей. Автор, свид-во СССР № 1036742 от 04.08.1981.

42. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм В/ 60/ Петербург/ 95/ 20 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2128224 Дата приоритета 07.05.1997.

43. Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Дешева Ю.А., Ларионова Н.В., Климов А.И. Штамм вируса гриппа В/60/Иоханнесбург/99/50 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2215786 Дата приоритета 19.03.2002 Опубл. БИ, 2003 -№31.

44. Киселева И.В., Александрова Г.П., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа В/60/Гонконг/01/22 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2266329 от 15.03.2004 г.

45. Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Ларионова Н.В., Климов А.И. Штамм вируса гриппа В/60/Джшшн/03/1 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2307161 от 09.07.2007 г.

46. Ларионова П.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа В/60/Флорида/04/181 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2422519 от 11.01.2010.- Опубл. БИ 2011.-№18.

47. Ларионова И.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа В/60/Малайзия/04/898 для производства живой гриппрозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2416639 от 30.12.10 - Опубл. БИ 2011.-№11.

48. Ларионова И.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа В/60/Брисбен/08/83 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей и донор аттенуации В/СССР/60/525/69 для его получения. Патент №2422517 28.01.2010.-Опубл. БИ 2011.-№18.

49. Ермаченко Т.А., Лисовская К.В., Григорьева Е.П., Руденко Л.Г. и др. Штамм В/60/32/Р вируса гриппа В, используемый для получения живой интраназальной вакцины для взрослых и детей. Авторское свид-во СССР № 1731811 от 10.07.90.

50. Егоров А.Ю., Лукашок И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм В/Панама/90 (4)Е вируса гриппа, используемый для получения живой интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и детей. Патент РФ № 2078819 Дата приоритета 30.09.1994.