Формирование и рH-индуцированное разрушение слоя матриксного белка M1 вируса гриппа A тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Бревнов Владимир Владимирович

• Бревнов Владимир Владимирович
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Бревнов Владимир Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общее описание вируса гриппа

1.2. Структура вируса гриппа А

1.3. Жизненный цикл вируса гриппа А и роль в нем матриксного белка М1

1.4. Структура матриксного белка М1 вируса гриппа А

1.5. Взаимодействие матриксного белка М1 вируса гриппа А с липидным бислоем

1.6. Плазматическая мембрана

1.7. Плоские модельные системы биологических мембран

1.8. Адсорбция белков

1.8.1. Влияние природы белков на их адсорбцию

1.8.2. Влияние водного окружения на адсорбцию белков

1.8.3. Влияние свойств поверхности на адсорбцию белков

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Коммерческие реактивы

2.2. Выделение матриксного белка М1 из вирионов и его очистка

2.3. Идентификация белка М1

2.4. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса

2.4.1. Поверхностный плазмонный резонанс

2.4.2. Особенности измерений на ППР-спектрометре «Biosuplar 6» (Mivitec)

2.4.3. ППР-спектрометр Biacore T200 (GE Healthcare)

2.4.4. Оценка поверхностной концентрации белка

2.5. Формирование самособирающихся слоев

2.5.1. Создание монослоев тиолов на поверхности ППР-чипов

2.5.2. Создание липидных бислоев на поверхности L1 - чипа (Biacore)

2.5.2.1. Приготовление суспензии липосом

2.5.2.2. Иммобилизация липосом на поверхности сенсорного чипа

2.5.2.3. Регенерация поверхности чипа

Глава 3. Результаты и обсуждения

3.1. Взаимодействие матриксного белка М1 с гидрофильными чипами

3.1.1. Влияние рН на формирование слоя белка М1

3.1.2 Дезорганизация слоя белка М1 при уменьшении рН среды

3.2. Взаимодействие матриксного белка М1 с гидрофобными чипами

3.3. Взаимодействие матриксного белка М1 с липидным бислоем, состоящим из ДФФХ и ДФФС

3.3.1. Создание липидных бислоев на гидрофильной полимерной подложке

3.3.2. Оценка поверхностной плотности заряда липидной мембраны, состоящей из ДФФХ и ДФФС в различных мольных соотношениях

3.3.3. Формирование слоя белка М1 на липидном бислое при рН 4,7

3.3.4. Формирование слоя белка М1 на липидном бислое при рН 7,0

3.3.4.1. Влияние концентрации белка М1 на формирование слоя при рН 7,0

3.3.4.2. Влияние состава липидного бислоя на формирование слоя белка М1 при рН 7,0

3.3.5. Определение констант связывания белка М1 с липидными бислоями при рН 4,7 и рН 7,0

3.3.6. Определение эффективной константы М1-М1 взаимодействия

3.3.7. рН-индуцированное разрушение слоя матриксного белка М1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Вирус гриппа вызывает острые инфекционные заболевания дыхательных путей. Согласно данным ВОЗ, ежегодно в мире гриппом заболевает 5 - 10% взрослого населения и 20 - 30% детей, а умирает от 250 до 500 тыс. человек [1]. Для разработки вакцин и лекарственных средств против гриппа необходимо детальное понимание механизма инфицирования клетки и процесса сборки новых вирусных частиц.

Матриксный белок М1 вируса гриппа А (далее белок М1) играет огромную роль в его жизненном цикле, обеспечивая механическую прочность вириона, выход генетического материала вируса в цитоплазму клетки, сборку и отпочковывание дочерних вирусных частиц [2]. В нейтральной среде белок М1 формирует каркас вирусной частицы, связываясь с ее внешней липидной оболочкой и находящимся внутри рибонуклеопротеином (РНП), а в кислой среде, напротив, происходит частичная дезорганизация матриксного каркаса и разрушение связей с РНП, позволяющая генетическому материалу вируса выйти в цитоплазму клетки [3 - 6]. Матриксный белок М1, в отличие от трансмембранных белков вируса гриппа А, обладает консервативностью среди различных штаммов [7, 8]. Эта важная особенность белка М1 может быть использована для создания универсальных противовирусных средств, направленных на блокировку формирования или разрушения матриксного каркаса. Для решения таких задач необходимо понимание механизмов взаимодействия молекул М1 друг с другом и вирусной мембраной при физиологических значениях рН.

Матриксный белок М1 представляет собой молекулу массой 27,8 кДа, состоящую из 252 а.о. и образованную тремя доменами: N (2 - 67 а.о.), М (91-158 а.о.), и С (165 - 252 а.о.) [9,10]. Полученное экспериментально в случае более чем 10 штаммов вируса гриппа значение изоэлектрической точки матриксного белка составляет примерно 8,6 [11]. Это значение близко к величине, рассчитанной из первичной аминокислотной последовательности, р1 = 9,86.

На данный момент не удалось получить кристаллическую структуру белка М1, так как во всех случаях в процессе кристаллизации происходило отщепление С-концевого домена [9,10,12]. Согласно литературным данным, при рН 4.0 и рН 7.0 кристаллические структуры К-концевой части белка практически не отличаются [10,12]. Структура нативного полноразмерного белка М1 в растворе определена только при рН 4,7 [13]. Согласно полученным результатам, он представляет собой мономер с выраженной структурной анизотропией: компактный ММ-фрагмент диаметром 4 нм и вытянутый слабо упорядоченный С-концевой домен длиной от 2 до 9 нм (наиболее представленная длина 6-7 нм).

Взаимодействие матриксного белка М1 с липидным бислоем и влияние на него рН среды играют большую роль при инфицировании клетки вирусом. При исследовании образования вирусоподобных частиц и их отпочковывания было показано, что белок М1 является ключевым при баддинге и полимеризуется на поверхности липидной мембраны, способствуя ее выпячиванию во внеклеточное пространство [14]. Однако в другой работе была показана возможность осуществления таких процессов и без участия белка М1 за счет других вирусных белков [15]. При исследовании влияния кислотности среды на белок-липидную оболочку вируса гриппа была обнаружена частичная дезинтеграция матриксного каркаса при понижении рН.

Для понимания функций и свойств белка М1 проводились исследования и в более простых модельных системах, представляющих собой липосомы различного состава, бислойные липидные мембраны и др. [10,13,16-21]. Двойственная природа белка (наличие положительного заряда при физиологических значениях рН и большое число гидрофобных участков в его молекуле) обуславливает возможность реализации различных механизмов взаимодействия с липидным бислоем. В ранних работах, в основном, делался вывод о встраивании белка М1 в липидный бислой [9,16,17,22,23] и потенциальной важности для этого предварительных электростатических взаимодействий [18]. Однако в более поздних исследованиях вывод о существенном встраивании белка М1 не удалось подтвердить, хотя результаты

указывали на наличие электростатических и гидрофобных взаимодействий между белком и липидным бислоем [21,24,25]. Помимо указанных выше аспектов взаимодействия белка М1 с липидной мембраной, методами атомной силовой микроскопии т^йго изучали структуру сформированного белкового слоя в различных модельных системах, однако из-за различий в условиях проведения экспериментов и подходов к трактованию результатов эти работы не позволили получить однозначное представление о структуре сформированного слоя белка М1 и обратимости его адсорбции [13,21,25,26].

Исследование кинетики взаимодействия белка М1 с липидным бислоем важно для понимания как процессов формирования белкового слоя, так и происходящих при этом белок-липидных и межбелковых взаимодействий и, более того, для определения влияния большого многообразия внешних факторов. К сожалению, попытки проведения таких исследований были представлены всего в нескольких работах. В основном, все они были выполнены в лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ им. А.Н. Фрумкина РАН [18,24-29]. При этом использовались методы компенсации внутримембранного поля (КВП) [18,24-26] и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР) [24,25,30]. На основании полученных результатов делался вывод о важности электростатических взаимодействий при адсорбции белка М1 в нейтральной и кислой средах, однако кинетика и полученные величины адсорбции значительно различались. Нет и единого мнения о характере взаимодействия белка М1 с липидной мембраной. В одних работах говорилось о необратимости его адсорбции [24,25], а в других утверждалось, что он связывается обратимо [26].

Таким образом, на данный момент нет единого мнения о механизме самоорганизации белка М1 в вирусной оболочке, взаимодействии его с липидной мембраной и влиянии на них рН. До сих пор не определены кинетические параметры межбелкового и белок-липидного взаимодействий. Состав липидной мембраны, концентрация белка и его склонность к олигомеризации в нейтральной среде могут существенно влиять на все эти процессы, что требует комплексного подхода для их исследования.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы было исследовать кинетические закономерности формирования матриксным вирусным белком М1 слоя, ассоциированного с липидной мембраной, охарактеризовать его структуру и определить влияние на них природы поверхности и внешних факторов, в первую очередь кислотности среды, являющейся триггером распада белкового каркаса вируса гриппа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать различные системы, моделирующие липидную оболочку вируса гриппа с различной степенью детализации.

2. Методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса определить влияние природы поверхности, концентрации белка и рН среды на кинетику формирования слоя матриксного белка М1 и его характеристики.

3. Изучить процесс рН-индуцированной дезинтеграции слоя белка М1.

Научная новизна полученных результатов.

С помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса детально исследовано влияние рН среды на кинетику формирования слоя матриксного белка М1 вируса гриппа А на подложках, моделирующих вирусную липидную мембрану.

Впервые показано, что для матриксного вирусного белка М1 характерной чертой является значительное усиление с течением времени его аттракционных взаимодействий с различными модельными системами, приводящее к фактически необратимой адсорбции.

Обнаружено, что наличие отрицательно заряженных липидов в бислое способствует проявлению анизотропных свойств белка М1 в нейтральной среде, приводящих к формированию обратимых полислойных покрытий.

Впервые при рН 7,0 показана обратимость взаимодействия молекул матриксного белка М1 вируса гриппа А друг с другом и определена соответствующая эффективная константа связывания.

Обнаружено что с уменьшением рН среды связи между соседними цепями молекул формируемого слоя белка М1 ослабевают, и его конформация на поверхности подвергается все большим изменениям, сопровождаясь более сильным связыванием с подложкой.

Впервые определены кинетические константы взаимодействия матриксного белка М1 вируса гриппа А с липидными бислоями различного состава, при рН 7,0 и рН 4,7. Показано, что, несмотря на разрушение белкового каркаса вируса гриппа А при рН < 5,5, матриксный белок М1 при рН 4,7 связывается с липидными бислоями сильнее, чем при рН 7,0.

Исследована кинетика рН-индуцированного разрушения слоя матриксного белка М1 вируса гриппа А на липидных бислоях. На основании полученных результатов, сделан вывод, что различная структура белкового слоя, сформированного в кислой и нейтральной средах определяет его дезинтеграцию при понижении рН, подобную наблюдаемой в ходе вирусного инфицирования. Показано, что существенную роль в этом процессе играет усиление взаимного электростатического отталкивания молекул белка. Теоретическая и практическая значимость результатов

Проведенные исследования кинетики взаимодействия матриксного белка М1 вируса гриппа А с подложками, моделирующими липидную мембрану, позволили получить новую информацию о влиянии рН среды и природы поверхности на свойства белка, на структуру, формируемого им слоя.

Практическая значимость состоит в возможности использования полученных сведений о взаимодействии молекул матриксного белка М1 вируса гриппа А друг с другом и с липидными бислоями при разработке универсальных препаратов, направленных на блокировку формирования и/или разрушения матриксного каркаса вируса гриппа А. Подходы, реализованные в данной работе, могут быть использованы и в других биофизических исследованиях, связанных с

детальным изучением свойств белков и их взаимодействий с различными объектами.

Методология и методы исследования

Методология исследования основывается на системном, исследовательском и экспериментальном подходах. В качестве основного метода исследования использовался современный высокопроизводительный и высокоточный метод спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса, широко применяемый при изучении межмолекулярных взаимодействий. Научные результаты и положения, выносимые на защиту

1. Обнаружено, что с течением времени связывание матриксного белка М1 вируса гриппа А с широким кругом подложек усиливается, приводя к фактически необратимой адсорбции.

2. Впервые показано, что при рН 7,0 на бислое, содержащем отрицательно заряженные липиды, адсорбированный белок М1 проявляет анизотропные свойства, способствуя формированию его обратимых полислойных структур.

3. Установлено, что с ростом кислотности среды изменение конформации белка М1 при адсорбции усиливается, одновременно с усилением связывания с подложкой.

Степень достоверности результатов работы.

Достоверность полученных результатов определяется применением современных методик сбора и статистической обработки исходной информации; применением современного высокотехнологичного и высокоточного оборудования для исследования межмолекулярных взаимодействий, соответствующих поставленной цели и задачам; достаточным и репрезентативным объёмом выборок исследования; взаимной согласованностью полученных результатов, а также их соответствием текущему представлению об объекте исследования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование и рH-индуцированное разрушение слоя матриксного белка M1 вируса гриппа A»

Апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, индексируемых базой данных Scopus, 10 тезисов докладов на международных научных конференциях и 7 тезисов докладов на отечественных научных конференциях.

Основные результаты исследований, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на следующих международных и отечественных научных конференциях: 9-ом и 10-ом Международном Фрумкинском симпозиуме (г. Москва) в 2010 г. и 2016г., «XXI International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics» (Краков, Польша) в 2011 г.; XI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика» (г. Москва) в 2011 г.; III Международной конференции «Супрамолекулярные системы на поверхности раздела» (г. Туапсе, Россия) в 2013 г.; международной междисциплинарной конференции «Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные аспекты получения и применения» (г. Новый свет) в 2013 г., «6 th International conference NANOCON 2014» (Брно, чешская республика) в 2014 г.; 54, 55 и 57-ой международной научной конференции МФТИ» (г. Долгопрудный, Россия) в 2011, 2012 и 2014 гг.; конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН в 2010, 2011, 2012, 2014 гг. (г. Москва); конференции «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты» (г. Москва) в 2012 г., II Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва-Клязьма) в 2015 г., XXII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик) в 2015 г. Тезисы представленных докладов опубликованы в сборниках докладов и тезисов указанных конференций.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общее описание вируса гриппа

Вирус гриппа относится к семейству оболочечных РНК-вирусов ОгШошухоутёае (ортомиксовирусы), у которых помимо белкового каркаса есть дополнительная внешняя липидная оболочка. К таким вирусам помимо вируса гриппа относятся такие вирусы, как, например, ВИЧ, вирус стоматита, герпесвирусы и коронавирусы.

Вирус гриппа бывает трех типов: А, В и С [2]. Первые два типа имеют схожую структуру и сегментированный геном, состоящий из 8 частей, в то время как у вируса гриппа С-типа 7 геномных частей. Эпидемии, вызываемые А и В типами, происходят каждые 1-3 года, а происходящая примерно раз в 10-30 лет антигенная изменчивость вируса гриппа А обуславливает возникновение пандемий, при которых гриппом заболевает огромное число людей по всему миру [31-33]. Вирус гриппа С - типа не вызывает пандемий у человека. Вирус гриппа А поражает людей, свиней, птиц и других животных. Для каждого вида или группы видов вирусы свои, однако в силу высокой изменчивости, вирусы гриппа очень сильно и быстро эволюционируют, причем возможно их скрещивание друг с другом. Таким образом вирус гриппа может передаваться от одного вида другому.

Интенсивность эпидемии зависит, в основном, от иммунитета популяции к данной разновидности возбудителя. Однако в силу уже упомянутой выше высокой изменчивости вируса гриппа, инфицирование каким-то определенным штаммом вируса приводит к развитию иммунитета только к этому штамму. Таким образом, после эпидемии гриппа значительная часть популяции приобретает иммунитет, снижающий возможность повторения эпидемии, вызванной только вирусом гомологичного серотипа. Тем не менее, этот факт не означает, что такая эпидемия не повторится снова, так как, во-первых, не все представители вида подверглись инфекции, а во-вторых, приобретенный иммунитет постепенно утрачивается.

1.2. Структура вируса гриппа А

Размер вируса гриппа А составляет в среднем 80 - 120 нм [2,34,35]. На рисунке 1 приведена его фотография, полученная методом электронной микроскопии, а на рисунке 2 - его схематическое изображение. Внешнюю оболочку вирусной частицы (далее ВЧ) образует липидный бислой, сходный по составу с цитоплазматической мембраной клетки-хозяина [2]. В него встроены три типа трансмембранных белков: гемагглютинин (ГА), нейраминидаза (НА) и протонный канал М2.

Гемагглютинин является основным поверхностным белком (~ 80% от количества всех поверхностных белков) [35]. Согласно данным электронной микроскопии, молекулы гемагглютинина на поверхности вирусной оболочки формирует тримеры, которые также называют гемагглютининовыми «шипами» [36]. Функция гемагглютинина заключается в связывании с рецепторами клеточной мембраны и в способствовании слиянию вирусной и клеточной мембран [37]. В качестве рецепторов со стороны клетки выступают нейраминовые кислоты в олигосахаридах, входящих в состав белков клеточной мембраны [38,39]. На данный момент обнаружено восемнадцать подтипов ГА [40,41].

Рисунок 2. Схематическое изображение вириона гриппа [42]

Нейраминидаза является вторым, наиболее представленным поверхностным белком (-17%) [35]. Как и гемагглютинин, нейраминидаза является высокоизменчивым белком. На данный момент принято считать, что существует 11 подтипов НА [41]. Согласно кристаллической структуре [43], нейраминидаза представляет собой тетрамер, который 29 аминокислотными остатками N концевого домена частично погружен в липидную мембрану вируса. Функция данного белка состоит в удалении концевого остатка сиаловой кислоты от гликолипидов клеточной мембраны, что необходимо для плотной адсорбции вируса на ее поверхности. Нейраминидаза также предотвращает агрегацию вирусных частиц, благодаря чему каждый вирус является независимой инфицирующей частицей [44]. Кроме того, она играет важную роль в процессе выхода дочерних вирусных частиц из клетки-хозяина [45], разрывая связь вирусной частицы с рецепторами клетки-хозяина, что в свою очередь препятствует повторному связыванию вириона с этой клеткой. Благодаря такому действию нейраминидазы усиливается распространение вирусной инфекции в организме [46].

Протонный канал М2 является слабо представленным компонентом (~ 16 -20 молекул на вирион) [35]. Белок М2 представляет собой гомотетрамер, составленный из двух дисульфидно-связанных димеров, взаимодействующих посредством нековалентных связей [47-49]. Он играет важную роль на ранней стадии инфицирования, обеспечивая закисление среды внутри вириона, необходимое для распада белок-липидной оболочки вириона и выхода генетического материала вируса в цитоплазму клетки-хозяина.

Внутренняя часть липидной оболочки вируса ассоциирована с матриксным каркасом, образованным белком М1. Этот каркас представляет собой белковую сеть толщиной (по различным оценкам) от 4 до 6 нм [20,50-53]. Матриксный белок взаимодействует не только с липидным бислоем, но и с трансмембранными белками [19,45,54]. Внутри образуемого белком М1 каркаса располагается взаимодействующий с ним генетический материал вируса -рибонуклеопротеиновый комплекс (РНП), состоящий из нуклеопротеина и 8 отрицательно закрученных вирусных РНК (вРНК) [14,34]. Зачастую у РНК-содержащих вирусов каждый сегмент кодирует только один белок, в связи с чем уменьшается вероятность того, что какая-нибудь ошибка в одном из сегментов станет фатальной для вирусной частицы. На данный момент считается, что восемь сегментов генома вируса гриппа кодируют тринадцать белков. В таблице 1 представлены сведения о сегментах генома вирусов гриппа типа А 34 и соответствующих им белках на примере вируса гриппа штамма А/РК./8/34 [37,55,56].

Таблица 1. Сегменты генома вируса гриппа и кодируемые ими белки

Вирус гриппа A/PR/8/34

Сегмент генома Полипептид Число а.о. Молекулярная масса, кДа. Количество молекул на вирион

1 РВ2 759 85.7 30-60

2 РВ1 757 86.5 30-60

N40 718 - -

РВ1-Б2 87 10,483 -

Вирус гриппа А^/8/34

Сегмент генома Полипептид Число а.о. Молекулярная масса, кДа. Количество молекул на вирион

3 PA 716 84.2 30-60

PA-X 252 82,588 -

4 ИЛ 566 61.468 500

5 № 498 56.101 1000

6 454 50.087 100

7 М1 252 27.801 3000

М2 97 11.010 20-60

8 N81 230 26.815 -

Ш2ЖБР 121 14.216 130-200

1.3. Жизненный цикл вируса гриппа А и роль в нем матриксного белка М1

Жизненный цикл вируса гриппа А состоит из трех основных этапов: 1) проникновение в клетку, 2) синтез вирусных компонентов, 3) сборка и отпочковывание (баддинг) дочерних вирусных частиц (рисунок 3). На каждом из них большую роль играет матриксный белок М1. Вначале гемагглютинин связывается с гликопротеинами и гликолипидами, содержащими олигосахариды с концевыми сиаловыми кислотами [57]. Наиболее распространенный представитель последних - ^ацетилнейраминовая кислота. После этого вирусная частица попадает в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (рисунок 3, рисунок 4), причем образующаяся при этом эндосома может формироваться как с помощью клатрин-зависимого, так и клатрин-независимого механизмов [58,59]. Методами флуоресцентной микроскопии было установлено, что эндосома, содержащая вирусную частицу, двигаясь от клеточной мембраны сливается с лизосомой - везикулой, содержащей кислую среду и набор ферментов - для «переваривания» поглощенных клеткой объектов [60]. В ходе понижения рН среды внутри эндосомы, постепенно происходящем при движении вируса в

направлении клеточного ядра, начинает изменяться структура ГА, и при рН ~5.5-6.0 он приобретает активную для слияния конформацию, а именно, идет высвобождение и последующее встраивание его гидрофобного пептида в мембрану клетки-хозяина [3,35,53,61]. Вирусная и эндосомальная мембраны начинают сближаться, и постепенно формируется пора слияния (рисунок 4), что приводит к объединению мембран вириона и эндосомы [62-65]. Параллельно с этим протонный канал М2 перекачивает ионы Н+ из эндосомальной среды во внутреннюю часть вириона и при рН < 5-6 происходит дезорганизация матриксного каркаса и разрушение его связей с РНП от матриксного белка М1 [46,61,66,67], позволяющая генетическому материалу вирусной частицы выйти в цитоплазму клетки-мишени. В результате этого РНП вируса оказываются в околоядерной области, откуда через поры попадает в ядро клетки.

Внутри ядра происходят процессы обратной транскрипции и репликации генетического материала вируса гриппа. Триггером выхода новых комплексов вРНП является накапливание гемагглютинина в плазматической мембране [68]. Тем не менее, выход единичного РНП осуществляется только после последовательного связывания ряда белков. Согласно работе [69], вначале белок М1 связывается с вРНП, после чего белок ядерного экспорта NEP присоединяется к М1. Последний, в свою очередь, связывается с белком Сгт1, который облегчает выход вРНП через ядерные поры в цитоплазму клетки [70-72]. Образовавшийся комплекс Сгт1-ЫЕР-М1-РНП движется к месту сборки новой вирусной частицы. Считается, что М1 играет существенную роль в организации сборки вируса гриппа, связываясь как с РНП, так и с липидной оболочкой вируса и встроенными в нее белками [73].

Рисунок 3. Жизненный цикл вируса гриппа.

Рисунок 4. Модель слияния мембран вируса и клетки, вызванного ГЛ. При закислении среды происходят конформационные изменения молекулы ГЛ и его гидрофобный домен переходит в слиятельно-активную конформацию (1). Пептиды слияния тримера ГЛ встраиваются в мембрану клетки (2-3) и формируется «розетка» слияния. Дальнейшие конформационные изменения приводят к сближению мембран и формированию сталка (4-5), который переходит в пору слияния (6). Взято и адаптировано из [64]

Заключительной стадией жизненного цикла оболочечных вирусов является отпочковывание вновь сформированных вирусных частиц с поверхности клеточной мембраны (рисунок 3). В этом процессе важную роль играют трансмембранные белки ГА, НА, М2 и, главным образом, М1, который необходим для формирования полноценного жизнеспособного вириона. Исследования

показали, что ограничение количества белка М1 приводит к запаздыванию и снижению продукции вирусных частиц [74], а удаление или замена специфических аминокислотных последовательностей в его молекуле может приводить к прекращению продукции клеткой вирусных частиц [75].

Показано, что помимо связывания с РНП [76] и липидами, белок взаимодействует и с цитоплазматическими хвостами трансмембранных белков ГА и НА [77]. Установлено, что взаимодействие с цитоплазматическими хвостами ГА и НА способствует связыванию белка М1 с липидными рафтами в мембранах, что, по мнению авторов работы [14], вызывает изменение конформации белка М1 и приводит к его полимеризации в месте баддинга. Что касается взаимодействия матриксного белка с протонным каналом М2, то оно, по-видимому, влияет только на форму отпочковывающейся вирусной частицы [54,78,79].

На данный момент предполагается, что события при баддинге упрощенно происходят в следующем порядке (рисунок 5) [14]: сначала ГА и НА кластеризуются на липидных рафтах, давая тем самым начало формированию отпочковывающейся частицы. Затем М1 в комплексе с РНП подходит к мембране и связывается с цитоплазматическими концами НА и ГА. После этого М1 полимеризуется, приводя к выпячиванию бада во внеклеточное пространство, что характерно и для матриксных белков других оболочечных вирусов [80,81]. Однако показана возможность осуществления таких процессов и без участия белка М1 за счет других вирусных белков [15]. В заключение белок М2 подходит к основанию бада благодаря взаимодействию с М1 и/или ГА. Встраивание его амфифильных спиралей у границ липидных рафтов приводит к изгибу мембраны и отпочковыванию дочерней вирусной частицы.

Несмотря на то, что матриксный белок М1 играет столь важную роль как при инфицировании клетки, так и при формировании дочерних вирусных частиц, механизмы его взаимодействия с остальными компонентами вируса все еще до конца не выяснены.

Рисунок 5. Модель отпочковывания дочерней вирусной частицы с поверхности клетки. А) Инициализация формирования частицы, вызванная кластеризацией молекул ГА (красный) и НА (оранжевый) на липидных рафтах. М1 (пурпурный) связывается с цитоплазматическими хвостами ГА и НА, прикрепляя тем самым вРНП (желтый). В) Вытягивание мембраны будущей вирусной частицы вследствие М1-М1 взаимодействия. Это приводит к перпендикулярной ориентации вРНП по отношению к мембране. С) М2 (синий) благодаря взаимодействию с М1 подходит основанию бада. Б) Общая картина отпочковывания вирионов. Показано распределение ГА и НА на липидных рафтах (желтый), формирование вытянутых вирусных частиц и М2 белки, встраивание которых приводит к отпочковыванию частицы. Взято и адаптировано из [14].

1.4. Структура матриксного белка М1 вируса гриппа А

Матриксный белок М1 представляет собой молекулу массой 27.8 кДа (252 аминокислотных остатка, а.о.), состоящую из трех доменов: N (2-67 а.о.), М (91-158 а.о.), и С (165-252 а.о.) [9,10]. Полученное экспериментально в случае более чем 10 штаммов вируса гриппа значение изоэлектрической точки матриксного белка составляет примерно 8.6 [11]. Оно близко к величине, рассчитанной из первичной аминокислотной последовательности, р1 = 9.86 [82].

Однако в работе [83] с помощью изоэлектрофокусирования в градиенте рН был сделан вывод, что предположительно нативный белок М1, изолированный из вирусных частиц по методу кислотной солюбилизации [84], имеет изоэлектрическую точку pI=5,0. В данном случае отсутствовала денатурирующая обработка белка (использовался неионный детергент NP-40) и, как предполагают авторы работы, возможно, М1-белок ренатурировал в водном растворе, приобретая нативную конформацию. В этой работе авторы не смогли объяснить такого сильного расхождения полученных результатов с теоретическим расчетом значения изоэлектрической точки, однако позднее было выдвинуто предположение, что агрегация белка М1 и, как следствие, экранировка ряда его заряженных участков, может приводить к сдвигу суммарной диссоциации заряженных групп в кислотную область [85].

В литературе описано несколько попыток закристаллизовать белок М1, однако его полная структура в целом до сих пор неизвестна, так как во всех случаях происходило отщепление С-концевого домена [9,12]. В 1997 г. Sha B. и Luo M. смогли при рН=4 закристаллизовать и определить структуру лишь N-концевой части белка (2-158 а.о.) с разрешением 2,08 А [9]. Согласно их данным, закристаллизованная N-концевая часть белка имеет форму правильной глобулы, а N и M -домены представлены четырьмя a-спиралями каждый: а1 - а4 и а6 - а9, соответственно. Короткая спираль a5 соединяет эти два домена. Пространственное расположение спиралей представлено на рисунке 6. Оказалось, что при кристаллизации N-концевая часть белка М1 формирует димеры, образованные сетью водородных связей и гидрофобными взаимодействиями между параллельными a6 -спиралями мономеров. Позднее, независимо друг от друга, две группы исследователей определили структуру N-концевой части белка при рН=7 [10,12]. Из данных следует, что структуры N- и M-доменов в кислой и нейтральной средах имеют лишь незначительные отличия (рисунок 7).

В связи с безуспешностью кристаллизации полноразмерного белка М1 рядом авторов были проведены попытки определения его структуры непосредственно в вирионе [86]. Для этого использовался метод тритиевой

планиграфии, при котором осуществлялось бомбардировка вируса А/АюЫ/2/68 «горячими» атомами трития. В результате была предложена модель ориентации белка в вирионе (рисунок 8). Позднее, используя эти данные и современные алгоритмы предсказания структуры, была предложена трехмерная структура М1 в вирионе [30]. Тем не менее, проведенные в этих работах исследования не смогли пролить свет на то, какова же структура С-домена белка М1.

Рисунок 6. Структура ^концевой части белка М1.Цветом обозначены отдельный молекулы белка М1, образующие димер.

Благодаря недавним исследованиям, проведенным методом малоуглового рентгеновского рассеяния, была определена структура нативного полноразмерного белка М1 в растворе при рН 4,7 [13]. Согласно полученным результатам, он представляет собой мономер с выраженной структурной анизотропией: компактный КМ-фрагмент диаметром 4 нм и вытянутый слабо упорядоченный С-концевой домен длиной от 2 до 9 нм (наиболее представленная длина составляла 6-7 нм) (рисунок 9). Авторы сделали вывод о том, что, помимо мономеров, в растворе присутствует минорная фракция белковых кластеров. Это согласуется с результатами более ранней работе Жирнова О.П. [67].

Рисунок 7. Справа - структура мономера М1 в нейтральной среде (синий), совмещенная со структурой мономера М1 в кислой среде (желтый). Взято и адаптировано из [12]. Спирали отмечены как Н1-Н9. Слева - скелет мономера М1 в нейтральной среде (зеленый), совмещенный со скелетом мономера М1 в кислой среде (синий). С-домен отсутствует. Стрелками указаны места различий в структуре. Взято и адаптировано из [10]

Рисунок 8. Схематическое расположение спиралей М1 белка в вирионе. Участки, отмеченные серым цветом, соответствуют областям с тритиевой меткой. Горизонтальная линия проведена для разделения меченных и немеченых участков и не отображает поверхность мембраны. Взято и адаптировано из [86].

Структура полноразмерного белка в нейтральной среде до сих пор неизвестна. На основании результатов исследования раствора белка М1 при рН 7,4 с помощью метода гель-фильтрации авторы работы [10] сделали вывод о том, что белок М1 в нейтральной среде представлен в виде мономера. Однако в более

позднем исследовании с помощью того же метода была показана

Рисунок 9. Структурная модель мономера М1 в кислой среде, созданная с помощью гибридного ab initio и rigid body моделирования структур (программы BUNCH и CORAL). Компактный фрагмент в верхней части структуры М1 белка представляет собой N-концевую часть, неупорядоченная нижняя часть - С-домен. Взято и адаптировано из [13]. концентрационно-зависимая олигомеризация рекомбинантного белка М1 [87].

Помимо поиска ответов на вопросы о пространственной структуре белка М1, многие ученые исследовали, каким образом матриксный белок взаимодействует с вРНП. В работах [88,89] посредством картирования моноклональными антителами было определено два сайта (80 - 109 а.о., и 129 -164 а.о.), ответственных за связывание белка М1 штамма A/WSN/33 с вРНК. Второй сайт содержит мотив «цинкового пальца», ответственный за связывание ДНК и РНК в случае ряда белков, в связи с чем, многие ученые полагали, что и в данном случае он играет немаловажную роль. Однако позднее, исследуя связывание меченой 32P 172-х нуклеотидной РНК с диким типом М1 и мутантными рекомбинантными белками М1, экспрессированными в E.coli, было показано, что за связывание с РНК ответственен участок между 91 и 111 аминокислотной позицией [90]. При исследовании кристаллической структуры М1 также был сделан вывод о малой вероятности участия «цинкового пальца» в связывании М1 с РНК, так как была показана значительная отдаленность элементов, формирующих палец [9]. При исследовании взаимодействия

рекомбинантного белка М1 и его доменов с РНП было сделано предположение, что за связывание с рибонуклеопротеином ответственен С-домен матриксного белка [91]. Тем не менее, на основании исследования влияния различных мутаций в области 101-105 а.о., соответствующей М-домену, на взаимодействие белка М1 с РНП и РНК авторы работы [75] сделали вывод об огромной роли участка ЯКЬКЯ этого домена при взаимодействии матриксного белка с РНП. Однако на данный момент принято считать, что только С-домен белка М1 связывается с вРНП.

1.5. Взаимодействие матриксного белка М1 вируса гриппа А с липидным

бислоем

Одной из первых работ, в которой удалось наблюдать матриксный белок внутри вирусной частицы, была выполнена Кш§гок '.Н. в 1988 [50]. В ней были сделаны электронные микрофотографии вируса гриппа АХ31 (Н3К2). В отличие от более ранних работ, в этой впервые удалось различить сегменты слоя матриксного белка в вирионе, размер которых составлял 4x4 нм. К сожалению, техника эксперимента не позволила судить о том, как расположен слой белка относительно липидной мембраны вируса. Двойственная природа белка (наличие положительного заряда при физиологических значениях рН и большое число гидрофобных участков в его молекуле) обуславливает возможность реализации различных механизмов взаимодействия с липидным бислоем. В ранних работах, в основном, предполагалось встраивание белка в липидный бислой. Впервые вывод о возможном встраивании был выдвинут на основании результатов исследования передачи энергии от вирусных белков на встроенный в липидный бислой зонд (12-(9-антроил)-стеариновая кислота) с помощью флуоресцентной спектрофлуориметрии [22]. Это было подтверждено при исследовании организации белка М1 на поверхности липосом с помощью криоэлектронной микроскопии [23]. А в работе [17], используя фоточувствительную гидрофобную метку, авторы сделали вывод о встраивании двух участков белка в вирусную мембрану. Позднее, на основании кристаллографической структуры К-концевой

части белка было сделано предположение, что при формировании новой вирусной частицы белок М1, подходя к клеточной мембране, претерпевает конформационные изменения, которые позволяют гидрофобным участкам N концевого домена открыться и встроиться в вирусную липидную мембрану (рисунок 10) [9]. Более того, в статье [86] на основании результатов бомбардировки атомами трития замороженных суспензий вируса A/Aichi/2/68 (ЮК2) был сделан вывод о возможном встраивании в липидный бислой гидрофобных участков нескольких доменов белка.

Рисунок 1 0. Схематичное изображение относительного расположения матриксного белка, липидной мембраны, гемагглютинина, нейраминидазы и рибонуклеопротеина. С-домен обозначен как CD. Отрицательно заряженный участки вРНК показаны красными кружками. Конформация белка изменена так, чтобы обеспечить связывание №домена с мембраной. Взято и адаптировано из [9].

Исследуя адсорбцию белка М1 на бислойной липидной мембране (БЛМ) из азолектина и регистрируя изменения проводимости и разности поверхностных потенциалов на мембране, авторы работы [18] сделали выводы об электростатических взаимодействиях М1 с БЛМ и их важности для последующего встраивании белка.

В современных исследованиях выводы о встраивании белка в липидный бислой не удалось подтвердить и лишь предполагается наличие как электростатических, так и гидрофобных взаимодействий [24,92]. Более того, с помощью электронной микроскопии было показано, что в результате бромелаиновой обработки вируса А/РК/8/34 ширина пространства между М1-каркасом и липидной оболочкой менялась, и в некоторых случаях мембрана просто «счищалась» с матрикса (рисунок 11) [14]. В этой же работе в экспериментах т-уИтв с рекомбинантным М1 и искусственными отрицательно заряженными липосомами было продемонстрировано, что при высокой концентрации №С1 взаимодействие белка М1 с ними предотвращается, указывая на его электростатическую природу. Руководствуясь этими фактами, авторы сделали вывод о том, что белок, скорее всего, не встраивает свои участки в липидную оболочку вириона, и большая часть молекул М1 в вирусной частице связана с липидной мембраной при помощи электростатических взаимодействий.

Рисунок 11. Электронная микрофотография вируса А/РЯ/8/34 лишенного внеклеточных участков гликопротеинов посредством бромилаиновой обработки. Стрелкой указано место, в котором липидный бислой отошел от каркаса. Взято и адаптировано из [19].

В ряде работ проводилось исследование структуры формируемого слоя белка М1 в нейтральной среде (рН=7,0) на поверхности бислойных липидных мембран (БЛМ) с помощью атомной силовой микроскопии [24-26]. Так, в работе [25] было показано, что на поверхности БЛМ, содержащей диолеоилфосфатидилсерин (ДОФС) и долеоилфосфатидилхолин (ДОФХ) в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бревнов Владимир Владимирович, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. WHO | Influenza (Seasonal) [Electronic resource] // WHO. World Health Organization, 2017. URL: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (accessed: 09.04.2017).

2. Ruigrok R.W. Structure of Influenza A, B and C Viruses // Textbook of Influenza / ed. Nicholson K.G., Webster R.G., Hay A.J. Oxford: Blackwell Science, 1998. P. 29-42.

3. Lee K.K. Architecture of a nascent viral fusion pore. // EMBO J. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 29, № 7. P. 1299-1311.

4. Martin K., Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import // Cell. 1991. Vol. 67, № 1. P. 117-130.

5. Bui M., Whittaker G., Helenius a. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. // J. Virol. 1996. Vol. 70, № 12. P. 8391-8401.

6. Zhirnov O.P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses // Virology. 1990. Vol. 176, № 1. P. 274-279.

7. Heiny A.T. et al. Evolutionarily conserved protein sequences of influenza a viruses, avian and human, as vaccine targets // PLoS One. 2007. Vol. 2, № 11.

8. Gerhard W., Mozdzanowska K., Zharikova D. Prospects for universal influenza virus vaccine // Emerg. Infect. Dis. 2006. Vol. 12, № 4. P. 569-574.

9. Sha B., Luo M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein M1. // Nat. Struct. Biol. 1997. Vol. 4, № 3. P. 239244.

10. Arzt S. et al. Combined results from solution studies on intact influenza virus M1 protein and from a new crystal form of its N-terminal domain show that M1 is an elongated monomer. // Virology. 2001. Vol. 279, № 2. P. 439-446.

11. Leavitt J.C. et al. Human influenza a virus: Comparative analysis of the structural polypeptides by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis // Virology.

1979. Vol. 99, № 2. P. 340-348.

12. Harris A. et al. The crystal structure of the influenza matrix protein Ml at neutral pH: M1-M1 protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of M1. // Virology. 2001. Vol. 289, № 1. P. 34-44.

13. Shtykova E. V. et al. Structural analysis of influenza a virus matrix protein M1 and Its self-assemblies at low pH // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 12. P. 1-10.

14. Rossman J.S., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding // Virology. 2011. Vol. 411, № 2. P. 229-236.

15. Chen B.J. et al. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived viruslike particles. // J. Virol. 2007. Vol. 81, № 13. P. 7111-7123.

16. Gregoriades A. Interaction of influenza M protein with viral lipid and phosphatidylcholine vesicles. // J. Virol. 1980. Vol. 36, № 2. P. 470-479.

17. Gregoriades A., Frangione B. Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion. // J. Virol. 1981. Vol. 40, № 1. P. 323328.

18. El Karadaghi S. et al. Interaction of influenza virus proteins with planar bilayer lipid membranes I. Characterization of their adsorption and incorporation into lipid bilayers // BBA - Biomembr. 1984. Vol. 778, № 2. P. 269-275.

19. Ruigrok R.W. et al. Membrane interaction of influenza virus M1 protein. // Virology. 2000. Vol. 267, № 2. P. 289-298.

20. Fontana J., Steven A.C. At low pH, influenza virus matrix protein M1 undergoes a conformational change prior to dissociating from the membrane. // J. Virol. 2013. Vol. 87, № 10. P. 5621-5628.

21. Hilsch M. et al. Influenza a matrix protein m1 multimerizes upon binding to lipid membranes // Biophys. J. 2014. Vol. 107, № 4. P. 912-923.

22. Lenard J., Wong C.Y., Compans R.W. Association of the internal membrane protein with the lipid bilayer in influenza virus. A study with the fluorescent probe 12-(9-anthroyl)-stearic acid // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. Elsevier, 1974. Vol. 332, № 3. P. 341-349.

23. Bucher D.J. et al. Incorporation of influenza virus M-protein into liposomes. // J. Virol. 1980. Vol. 36, № 2. P. 586-590.

24. Knyazev D.G., Radyukhin V. a., Sokolov V.S. Intermolecular interactions of influenza M1 proteins on the model lipid membrane surface: A study using the inner field compensation method // Biochem. Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2009. Vol. 3, № 1. P. 81-89.

25. Князев Д.Г. Организация липид-белковых структур на примере вирусного белка М1: электрохимический подход: дисс. ... канд.ф.-м. наук: 02.00.05. M., 2008. 90 c.

26. Batishchev O.V. et al. pH-Dependent Formation and Disintegration of the Influenza A Virus Protein Scaffold to Provide Tension for Membrane Fusion. // J. Virol. 2015. Vol. 90, № 1. P. 575-585.

27. Brevnov V. V., Fedorova N. V., Indenbom a. V. Adsorption of viral matrix protein M1 in acidic medium // Biochem. Suppl. Ser. A Membr. Cell Biol. 2013. Vol. 7, № 3. P. 228-233.

28. Бревнов В.В., Федорова Н.В., Инденбом А.В. Влияние рН на характер адсорбции матриксного вирусного белка М1 // Биологические мембраны. 2015. Т. 32. № 2. С. 93-101.

29. Бревнов В.В., Федорова Н.В., Инденбом А.В. Формирование слоя матриксного белка М1 вируса гриппа А на липидных мембранах при рН 7.0 // Известия Академии наук. Серия химическая. 2016. Т. 11. С. 2737-2744..

30. Shishkov A. V et al. The in situ structural characterization of the influenza A virus matrix M1 protein within a virion // Protein Pept Lett. 2009. Vol. 16, № 11. P. 1407-1413.

31. Potter C.W. A history of influenza // J. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 91, № 4. P. 572-579.

32. Hill E.M., Tildesley M.J., House T. Evidence for history-dependence of influenza pandemic emergence // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 7, № August 2016. P. 43623.

33. Hsieh Y.-C. et al. Influenza Pandemics: Past, Present and Future // J. Formos.

Med. Assoc. Formosan Medical Association & Elsevier, 2006. Vol. 105, № 1. P. 1-6.

34. Noda T. Native morphology of influenza virions // Front. Microbiol. 2012. Vol. 2, № 269. P. 1-5.

35. Nayak D. et al. Structure, disassembly, assembly, and budding of influenza viruses // Textbook of Influenza. 2nd ed. / ed. Webster R.. et al. Oxford, UK: John Wiley & Sons, Ltd, 2013. P. 35-56.

36. Wharton S.A. et al. Structure, Function, and Antigenicity of the Hemagglutinin of Influenza Virus // The Influenza Viruses. Boston, MA: Springer US, 1989. P. 153-173.

37. Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication // Fields Virology / ed. Knipe D.M., Howley P.M., Fields B.N. Philadelphia: Lippincott-Raven Press, 2001. P. 1487-1531.

38. Weis W. et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. // Nature. 1988. Vol. 333, № 6172. P. 426-431.

39. Conn P.M. The receptors. Volume II. 1st ed. / ed. Conn P.M. Orlando: Academic Press, 1985. 436 p.

40. Gamblin S.J. et al. The structure and receptor binding properties of the 1918 influenza hemagglutinin. // Science. 2004. Vol. 303, № 5665. P. 1838-1842.

41. Types of Influenza Viruses| Seasonal Influenza (Flu) | CDC [Electronic resource]. URL: https://www.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm (accessed: 14.05.2017).

42. Karlsson Hedestam G.B. et al. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. // Nat. Rev. Microbiol. 2008. Vol. 6, № 2. P. 143-155.

43. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors. // Protein Sci. 1994. Vol. 3, № 10. P. 1687-1696.

44. Palese P. et al. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase // Virology. 1974. Vol. 61, № 2. P. 397-410.

45. Nayak D.P. et al. Influenza virus morphogenesis and budding // Virus Res. 2009. Vol. 143, № 2. P. 147-161.

46. Huang R.T.C. et al. The function of the neuraminidase in membrane fusion induced by myxoviruses // Virology. 1980. Vol. 107, № 2. P. 313-319.

47. Holsinger L.J. et al. Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-function analysis. // J. Virol. 1994. Vol. 68, № 3. P. 1551-1563.

48. Sugrue R.J., Hay A.J. Structural characteristics of the M2 protein of influenza a viruses: Evidence that it forms a tetrameric channe // Virology. 1991. Vol. 180, № 2. P. 617-624.

49. Schnell J.R., Chou J.J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. // Nature. 2008. Vol. 451, № 7178. P. 591-595.

50. Ruigrok R.W.H., Calder L.J., Wharton S.A. Electron microscopy of the influenza virus submembranal structure // Virology. 1989. Vol. 173, № 1. P. 311-316.

51. Fontana J. et al. Structural changes in Influenza virus at low pH characterized by cryo-electron tomography. // J. Virol. 2012. Vol. 86, № 6. P. 2919-2929.

52. Harris A. et al. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 50. P. 1912319127.

53. Calder L.J. et al. Structural organization of a filamentous influenza A virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. Vol. 107, № 23. P. 10685-10690.

54. Chen B.J. et al. The influenza virus M2 protein cytoplasmic tail interacts with the M1 protein and influences virus assembly at the site of virus budding // J Virol. 2008. Vol. 82, № 20. P. 10059-10070.

55. Krug R.M., Fodor E. The virus genome and its replication // Textbook of Influenza. Oxford, UK: John Wiley & Sons, Ltd, 2013. P. 57-66.

56. Schulze I.T. The structure of influenza virus // Virology. 1970. Vol. 42, № 4. P. 890-904.

57. Herrler G., Hausmann J., Klenk H.-D. Sialic Acid as Receptor Determinant of Ortho- and Paramyxoviruses // Biology of the Sialic Acids. Boston, MA: Springer US, 1995. P. 315-336.

58. Lakadamyali M., Rust M.J., Zhuang X. Endocytosis of influenza viruses Melike // Microbes Infect. 2004. Vol. 6, № 10. P. 929-936.

59. Rust M.J. et al. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, № 6. P. 567573.

60. Lakadamyali M. et al. Visualizing infection of individual influenza viruses. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 16. P. 9280-9285.

61. Li S. et al. PH-ontrolled two-step uncoating of influenza virus // Biophys. J. 2014. Vol. 106, № 7. P. 1447-1456.

62. Hamilton B.S., Whittaker G.R., Daniel S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion // Viruses. 2012. Vol. 4, № 7. P. 1144-1168.

63. Cross K. et al. Composition and Functions of the Influenza Fusion Peptide // Protein Pept. Lett. 2009. Vol. 16, № 7. P. 766-778.

64. Gruenke J.A. et al. New insights into the spring-loaded conformational change of influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 2002. Vol. 76, № 9. P. 4456-4466.

65. Чизмаджев Ю.А. Как вирус проникает в клетку // Природа. 2003. Vol. 4. С. 69-74.

66. Stauffer S. et al. Stepwise Priming by Acidic pH and a High K+ Concentration Is Required for Efficient Uncoating of Influenza A Virus Cores after Penetration // J. Virol. 2014. Vol. 88, № 22. P. 13029-13046.

67. Zhirnov O.P. Isolation of matrix protein M1 from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent // Virology. 1992. Vol. 186, № 1. P. 324-330.

68. Marjuki H. et al. Membrane accumulation of influenza A virus hemagglutinin triggers nuclear export of the viral genome via protein kinase Ca-mediated activation of ERK signaling // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 24. P. 1670716715.

69. Murti K.G., Webster R.G., Jones I.M. Localization of RNA polymerases on influenza viral ribonucleoproteins by immunogold labeling // Virology. 1988. Vol. 164, № 2. P. 562-566.

70. Akarsu H. et al. Crystal structure of the M1 protein-binding domain of the in

uenza A virus nuclear export protein ( NEP / NS2 ) // EMBO J. 2003. Vol. 22, № 18. P. 4646-4655.

71. Whittaker G.R., Digard P. Entry and Intracellular Transport of Influenza Virus. Caister Academic Press, U.K., 2006. P. 37-64.

72. Neumann G., Hughes M.T., Kawaoka Y. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRMl // EMBO J. 2000. Vol. 19, № 24. P. 6751-6758.

73. Gómez-Puertas P. et al. Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. // J. Virol. 2000. Vol. 74, № 24. P. 11538-11547.

74. Bourmakina S. V, García-sastre A., Garci A. The Morphology and Composition of Influenza A Virus Particles Are Not Affected by Low Levels of M1 and M2 Proteins in Infected Cells The Morphology and Composition of Influenza A Virus Particles Are Not Affected by Low Levels of M1 and M2 Proteins in Infe. 2005. Vol. 79, № 12. P. 7926-7932.

75. Liu T., Ye Z. Restriction of Viral Replication by Mutation of the Influenza Virus Matrix Protein. 2002. Vol. 76, № 24. P. 13055-13061.

76. Noton S.L. et al. Identification of the domains of the influenza A virus M1 matrix protein required for NP binding, oligomerization and incorporation into virions // J. Gen. Virol. 2007. Vol. 88, № 8. P. 2280-2290.

77. Ali A. et al. Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of M1 protein. // J. Virol. 2000. Vol. 74, № 18. P. 8709-8719.

78. Rossman J.S. et al. Influenza Virus M2 Ion Channel Protein Is Necessary for Filamentous Virion Formation // J. Virol. 2010. Vol. 84, № 10. P. 5078-5088.

79. Roberts P.C., Lamb R.A., Compans R.W. The M1 and M2 Proteins of Influenza A Virus Are Important Determinants in Filamentous Particle Formation // Virology. 1998. Vol. 240, № 1. P. 127-137.

80. Solon J. et al. Membrane deformations induced by the matrix protein of vesicular stomatitis virus in a minimal system // J. Gen. Virol. 2005. Vol. 86, № 12. P. 3357-3363.

81. Antonny B. Membrane deformation by protein coats // Curr. Opin. Cell Biol. 2006. Vol. 18, № 4. P. 386-394.

82. Influenza Research Database - A/Puerto Rico/8/1934 - Ml Matrix protein 1, M2 Matrix protein 2, M42 protein - NC_002016 [Electronic resource]. URL: https://www.fludb.org/brc/fluSegmentDetails.spg?ncbiGenomicAccession=NC_0 02016&context=1448314501029 (accessed: 20.06.2017).

83. Zhirnov O.P. [The anomalous isoelectric properties of influenza virus matrix protein M1]. // Vopr. Virusol. Vol. 36, № 3. P. 191-194.

84. Zhirnov O.P. [Influenza virus proteins: preparation of a soluble M1 polypeptide by means of a stepwise deproteination of virions]. // Mol. Biol. (Mosk). Vol. 25, № 2. P. 375-380.

85. Тимофеева Т.А. Структурно-функциональные домены матриксного белка М1 вируса гриппа: дисс. ... канд. Биол. наук: 03.00.03. М., 2001. 157 с.

86. Shishkov A.V. et al. The in situ spatial arrangement of the influenza A virus matrix protein M1 assessed by tritium bombardment. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. Vol. 96, № 14. P. 7827-7830.

87. Zhang K. et al. Dissection of influenza A virus M1 protein: PH-dependent oligomerization of N-terminal domain and dimerization of C-terminal domain // PLoS One. 2012. Vol. 7, № 5. P. 1-12.

88. Ye Z.P. et al. Functional and antigenic domains of the matrix (M1) protein of influenza A virus. // J. Virol. 1987. Vol. 61, № 2. P. 239-246.

89. Ye Z.P., Baylor N.W., Wagner R.R. Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotypic antibodies and synthetic peptides. // J. Virol. 1989. Vol. 63, № 9. P. 3586-3594.

90. Watanabe K. et al. Mechanism for inhibition of influenza virus RNA polymerase activity by matrix protein // J Virol. 1996. Vol. 70, № 1. P. 241-247.

91. Baudin F. et al. In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus M1 protein. // Virology. 2001. Vol. 281, № 1. P. 102-108.

92. Kretzschmar E., Bui M., Rose J.K. Membrane association of influenza virus matrix protein does not require specific hydrophobic domains or the viral

glycoproteins. // Virology. 1996. Vol. 220, № 1. P. 37-45.

93. Chizmadzhev Y.A. Bioelectrochemistry of Membranes / ed. Walz D., Teissie J., Milazzo G. Springer Basel AG, 2004. 240 p.

94. Ермаков Ю.А. Биоэлектрохимия бислойных липидных мембран // Рос. хим. ж. 2005. Т. XLIX, № 5. С. 114-120.

95. McLaughlin S. Electrostatic Potentials at Membrane-Solution Interfaces // Curr. Top. Membr. Transp. 1977. Vol. 9, № C. P. 71-144.

96. Kretschmann E., Raether H. Radiative decay of non-radiative surface plasmons excited by light // Z. Naturforsch. 1968. Vol. 23, № November 1968. P. 21352136.

97. Cardona M. Fresnel Reflection and Surface Plasmons // Am. J. Phys. 1971. Vol. 39, № 10. P. 1277-1277.

98. Mol N., Fischer M. Surface Plasmon Resonance. 2010. Vol. 627. 286 p.

99. Либенсон М. Поверхностные электромагнитные волны оптического диапазона // Соросовский образовательный журнал. 1996. Т. 10. С. 92-98.

100. Karlsson R. Surface Plasmon Resonance in Binding Site, Kinetic, and Concentration Analyses // The Immunoassay Handbook. Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. 4th ed. / ed. Wild D. Elsevier, 2013. P. 209-221.

101. Karp G. The Structure and Function of the Plasma Membrane // Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments. 7th ed. / ed. Karp G. 2013. P. 120-177.

102. Геннис Р. Биомембраны Молекулярная структура и функции. Москва: МИР, 1997. 622 с.

103. Mueller P. et al. Reconstitution of Cell Membrane Structure in vitro and its Transformation into an Excitable System // Nature. 1962. Vol. 194, № 4832. P. 979-980.

104. Montal M., Mueller P. Formation of Bimolecular Membranes from Lipid Monolayers and a Study of Their Electrical Properties // Proc. Natl. Acad. Sci. 1972. Vol. 69, № 12. P. 3561-3566.

105. Chanturia A., Scientific E. A Comparative Study of Planar Lipid Membranes formed by Montal-Mueller and Mueller-Rudin Techniques // Biol. Membr. 1996. Vol. 13. P. 235-240.

106. Khan M.S., Dosoky N.S., Williams J.D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies // Int. J. Mol. Sci. 2013. Vol. 14, № 11. P. 21561-21597.

107. Gennis R.B., Jo A. Protein-Lipid Interactions // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1977. Vol. 6. P. 195-238.

108. Petty M. Langmuir-Blodgett Films: An Introduction. Cambridge University Press, 1996. 234 p.

109. Jass J., Tjärnhage T., Puu G. From Liposomes to Supported, Planar Bilayer Structures on Hydrophilic and Hydrophobic Surfaces: An Atomic Force Microscopy Study // Biophys. J. 2000. Vol. 79, № 6. P. 3153-3163.

110. Kalb E., Frey S., Tamm L.K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers // BBA - Biomembr. 1992. Vol. 1103, № 2. P. 307-316.

111. Nollert P., Kiefer H., Jähnig F. Lipid vesicle adsorption versus formation of planar bilayers on solid surfaces // Biophys. J. 1995. Vol. 69, № 4. P. 1447-1455.

112. Reimhult E., Höök F., Kasemo B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure // Langmuir. 2003. Vol. 19, № 5. P. 1681-1691.

113. Stelzle M., Weissmuller G., Sackmann E. On the Application of Supported Bilayers as Receptive Layers for Biosensors with Electrical Detection // J. Phys. Chem. 1993. Vol. 97, № 12. P. 2974-2981.

114. Fabre R.M., Okeyo G.O., Talham D.R. Supported lipid bilayers at skeletonized surfaces for the study of transmembrane proteins // Langmuir. 2012. Vol. 28, № 5. P. 2835-2841.

115. Gritsch S. et al. Impedance spectroscopy of porin and gramicidin pores reconstituted into supported lipid bilayers on indium-tin-oxide electrodes // Langmuir. 1998. Vol. 7463, № 97. P. 3118-3125.

116. Berquand A. et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization // Langmuir. 2003. Vol. 19, № 5. P. 1700-1707.

117. Kühner M., Tampe R., Sackmann E. Lipid mono- and bilayer supported on polymer films: composite polymer-lipid films on solid substrates // Biophys. J. 1994. Vol. 67, № 1. P. 217-226.

118. Tanaka M., Sackmann E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface // Nature. 2005. Vol. 437, № 7059. P. 656-663.

119. Awad M., Khalid A. Membrane Electrochemistry: Electrochemical Processes in Bilayer Lipid Membrane // InTech. 2013. P. 71-92.

120. Castellana E.T., Cremer P.S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design // Surf. Sci. Rep. 2006. Vol. 61, № 10. P. 429-444.

121. Nakanishi K., Sakiyama T., Imamura K. On the adsorption of proteins on solid surfaces, a common but very complicted phenomenon // Biosci. Bioeng. 2001. Vol. 91, № 3. P. 233-244.

122. Norde W. Driving forces for protein adsorption at solid surfaces // Macromol. Symp. 1996. Vol. 103, № 1. P. 5-18.

123. Andrade J.D., Hlady V. Protein adsorption and materials biocompatibility: A tutorial review and suggested hypotheses // Advances in Polymer Science. Springer, Berlin, Heidelberg, 1986. P. 1-63.

124. Demaneche S. et al. Dissimilar pH-dependent adsorption features of bovine serum albumin and a-chymotrypsin on mica probed by AFM // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2009. Vol. 70, № 2. P. 226-231.

125. Malmsten M. Formation of Adsorbed Protein Layers. 1998. Vol. 199. P. 186-199.

126. Haynes C. a, Norde W. Globular proteins at solid / liquid interfaces // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 1994. Vol. 2. P. 517-566.

127. Koutsoukos P.. G., Norde W., Lyklema J. Protein Adsorption on Hematite (a-Fe203) Surfaces // J. Colloid Interface Sci. 1983. Vol. 95, № 2. P. 385-397.

128. Norde W. My voyage of discovery to proteins in flatland ...and beyond // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2008. Vol. 61, № 1. P. 1-9.

129. Norde W., Favier J.P. Structure of adsorbed and desorbed proteins // Colloids and Surfaces. 1992. Vol. 64, № 1. P. 87-93.

130. Haynes C. a, Norde W. Structures and Stabilities of Adsorbed Proteins // Journal of Colloid and Interface Science. 1995. Vol. 169, № 2. P. 313-328.

131. Norde W., Zoungrana T. Activity and structural stability of adsorbed enzymes // Prog. Biotechnol. 1998. Vol. 15, № C. P. 495-504.

132. Morrissey B.W. The adsorption and conformation of plasma proteins: a physical approach // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1977. Vol. 283. P. 50-64.

133. Sevastianov V.I., Belomestnaia Z.M., Zimin N.K. In Vitro Assessment of the Hemocompatible Properties of Polymers // Artif. Organs. 1983. Vol. 7, № 1. P. 126-133.

134. Baujard-Lamotte L. et al. Kinetics of conformational changes of fibronectin adsorbed onto model surfaces // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2008. Vol. 63, № 1. P. 129-137.

135. Wei Y. et al. Adsorption-induced changes in ribonuclease A structure and enzymatic activity on solid surfaces // Langmuir. 2014. Vol. 30, № 49. P. 1484914858.

136. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

137. Welford K. Surface plasmon-polariton and their uses // Opt. Quantum Electron. 1991. Vol. 23. P. 1-27.

138. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook. 2008. 8-10 p.

139. Jung L.S. et al. Quantitative Interpretation of the Response of Surface Plasmon Resonance Sensors to Adsorbed Films // Langmuir. 1998. Vol. 14, № 19. P. 5636-5648.

140. Breault-Turcot J., Chaurand P., Masson J.F. Unravelling nonspecific adsorption of complex protein mixture on surfaces with SPR and MS // Anal. Chem. 2014. Vol. 86, № 19. P. 9612-9619.

141. Sigma-Aldrich. Preparing Self-Assembled Monolayers (SAMs) A Step-by-Step Guide for Solution-Based Self-Assembly [Electronic resource]. URL:

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Aldrich/Instructions/1/al-266.pdf (accessed: 18.06.2017).

142. Wong J.Y. et al. Polymer-Cushioned Bilayers. I. A Structural Study of Various Preparation Methods Using Neutron Reflectometry // Biophys. J. Elsevier, 1999. Vol. 77, № 3. P. 1445-1457.

143. Wong J.Y. et al. Polymer-Cushioned Bilayers. II. An Investigation of Interaction Forces and Fusion Using the Surface Forces Apparatus // Biophys. J. Elsevier, 1999. Vol. 77, № 3. P. 1458-1468.

144. Cooper M.A. Advances in membrane receptor screening and analysis // J. Mol. Recognit. 2004. Vol. 17, № 4. P. 286-315.

145. Marsh D. Handbook of Lipid Bilayers. 2nd ed. CRC Press, 2013. 1113 p.

146. Abdiche Y.N., Myszka D.G. Probing the mechanism of drug/lipid membrane interactions using Biacore // Anal. Biochem. 2004. Vol. 328, № 2. P. 233-243.

147. MacDonald R.C. et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1991. Vol. 1061, № 2. P. 297-303.

148. Valcarcel C.A. et al. Effects of Lipid Composition on Membrane Permeabilization by Sticholysin I and II, Two Cytolysins of the Sea Anemone Stichodactyla helianthus // Biophys. J. Elsevier, 2001. Vol. 80, № 6. P. 2761-2774.

149. Hodnik V., Anderluh G. Capture of Intact Liposomes on Biacore Sensor Chips for Protein? Membrane Interaction Studies // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. Vol. 627. P. 201-211.

150. Erb E.M. et al. Characterization of the surfaces generated by liposome binding to the modified dextran matrix of a surface plasmon resonance sensor chip. // Anal. Biochem. 2000. Vol. 280, № 1. P. 29-35.

151. Севастьянов И., Васин С.Л., Перова Н.В. Методы исследования биоматериалов и медицинских изделий // Биосовместимость / ed. Севастьянов И. Москва, 1999. P. 47-87.

152. Vörös J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers // Biophys. J. 2004. Vol. 87, № 1. P. 553-561.

153. Rabe M., Verdes D., Seeger S. Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces // Adv. Colloid Interface Sci. Elsevier B.V., 2011. Vol. 162, № 1-2. P. 87-106.

154. Latour R. Biomaterials: protein-surface interactions // The encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. 2005. P. 1-15.

155. Ramsden J.J. Puzzles and paradoxes in protein adsorption // Chem. Soc. Rev. 1995. Vol. 24. P. 73.

156. van der Vegte E.W., Hadziioannou G. Acid-Base Properties and the Chemical Imaging of Surface-Bound Functional Groups Studied with Scanning Force Microscopy // The journal of physical chemistry B. 1997. Vol. 101, № 46. P. 9563-9569.

157. Protein Calculator [Electronic resource]. URL: http://protcalc.sourceforge.net/ (accessed: 24.06.2017).

158. Shishkov A. et al. Spatial structure peculiarities of influenza A virus matrix M1 protein in an acidic solution that simulates the internal lysosomal medium // FEBS J. 2011. Vol. 278, № 24. P. 4905-4916.

159. Anderluh G. et al. Properties of nonfused liposomes immobilized on an L1 Biacore chip and their permeabilization by a eukaryotic pore-forming toxin // Anal. Biochem. 2005. Vol. 344, № 1. P. 43-52.

160. Cooper M.A. et al. A Vesicle Capture Sensor Chip for Kinetic Analysis of Interactions with Membrane-Bound Receptors // Anal. Biochem. 2000. Vol. 277, № 2. P. 196-205.

161. Baird C.L., Courtenay E.S., Myszka D.G. Surface plasmon resonance characterization of drug/liposome interactions // Anal. Biochem. 2002. Vol. 310, № 1. P. 93-99.

162. Olaru A. et al. Quality assessment of SPR sensor chips; case study on L1 chips // Biosens. Bioelectron. Elsevier, 2013. Vol. 45, № 1. P. 77-81.

163. Hodnik V., Anderluh G. Surface Plasmon Resonance for Measuring Interactions of Proteins with Lipid Membranes // Methods In Molecular Biology / ed. Kleinschmidt J.H. Humana Press, 2013. P. 23-36.

164. Richter R., Mukhopadhyay A., Brisson A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study // Biophys. J. Elsevier, 2003. Vol. 85, № 5. P. 3035-3047.

165. Ekeroth J., Konradsson P., Höök F. Bivalent-ion-mediated vesicle adsorption and controlled supported phospholipid bilayer formation on molecular phosphate and sulfate layers on gold // Langmuir. 2002. Vol. 18, № 21. P. 7923-7929.

166. Kleinschmidt J.H. Lipid-protein interactions : methods and protocols. Humana Press, 2013. 464 p.

167. Gouy M. Sur la constitution de la charge électrique à la surface d'un électrolyte // J. Phys. Théorique Appliquée. 1910. Vol. 9, № 1. P. 457-468.

168. Chapman D.L. LI. A contribution to the theory of electrocapillarity // Philos. Mag. Ser. 6. 1913. Vol. 25, № 148. P. 475-481.

169. Grahame D.C. The Electrical Double Layer and the Theory of Electrocapillarity. // Chem. Rev. 1947. Vol. 41, № 3. P. 441-501.

170. Stern O. Zur theorie der elektrolytischen doppelschicht // Zeitschrift fur Elektrochemie. 1924. Vol. 30. P. 508-516.

171. Ермаков Ю.А. Равновесие ионов вблизи липидных мембран - эмпирический анализ простейшей модели // Коллоидный журнал. 2000. Vol. 6. С. 437-449.

172. McLaughlin S. The Electrostatic Properties Of Membranes // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1989. Vol. 18, № 1. P. 113-136.

173. Eisenberg M. et al. Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids // Biochemistry. 1979. Vol. 18, № 23. P. 52135223.

174. Ermakov Y.A. et al. Lipid and cell membranes in the presence of gadolinium and other ions with high affinity to lipids. 2. A dipole component of the boundary potential on membranes with different surface charge // Membr. Cell Biol. 1998. Vol. 12, № 3. P. 411-426.

175. Ermakov Y.A. The determination of binding site density and assocition constants for monovalent cation adsorption onto liposomes made from mixtures of zwitterionic and charged lipids // BBA - Biomembranes. 1990. Vol. 1023, № 1. P.

91-97.

176. Yasmann A., Sukharev S. Properties of diphytanoyl phospholipids at the air-water interface // Langmuir. 2015. Vol. 31, № 1. P. 350-357.

177. Ревин В. et al. Ревин В / ed. Рубин А. Саранск: Издательство Мордовского университета, 2002. 156 p.

178. Gerl M.J. et al. Quantitative analysis of the lipidomes of the influenza virus envelope and MDCK cell apical membrane // J. Cell Biol. 2012. Vol. 196, № 2. P. 213-221.

179. Zou Q., Habermann-Rottinghaus S.M., Murphy K.P. Urea effects on protein stability: Hydrogen bonding and the hydrophobic effect. 1998. Vol. 31, № November 1997. P. 107.

180. Zangi R., Zhou R., Berne B.J. Urea ' s Action on Hydrophobic Interactions Urea ' s Action on Hydrophobic Interactions. 2009. Vol. 131, № January. P. 1535-1541.

181. Hinterwirth H. et al. Quantifying Thiol Ligand Density of Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles by Inductively Coupled Plasma A Mass Spectrometry. 2013. № 2. P. 1129-1136.

182. Ritzefeld M., Sewald N. Real-Time Analysis of Specific Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance // J. Amino Acids. 2012. Vol. 2012. P. 1-19.

183. Цыбалова Л.М., Киселев О.И. Разработки , перспективы использования // Вопросы вирусологии. 2012. Vol. 57, № 1. P. 9-14.

184. Webster R.G. et al. Textbook of influenza. Second / ed. Webster R.G. et al. Wiley Blackwell, 2013. 522 p.

185. Phizicky Fields, Stanley E. et al. Protein-protein interactions: Methods for detection and analysis // Microbiol Rev. 1995. Vol. 59, № 1. P. 94-123.

186. Nikolovska-Coleska Z. Studying Protein-Protein Interactions Using Surface Plasmon Resonance. 2015. P. 109-138.

187. Ксенофонтов А.Л. et al. Неупорядоченные области в структуре С домена белка М1 вируса гриппа // Молекулярная биология. 2011. Vol. 45, № 4. С. 689-696.