Структурное разнообразие, биологическая активность и особенности биогенеза тритерпеновых гликозидов из 12 видов голотурий отрядов Dendrochirotida, Apodida и Elasipodida тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор наук Сильченко Александра Сергеевна

• Сильченко Александра Сергеевна
• доктор наук
• 2019

Оглавление диссертации доктор наук Сильченко Александра Сергеевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 16 СТРУКТУРЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ГОЛОТУРИЙ ОТРЯДОВ DENDROCHIROTIDA И ELASIPODIDA. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ, ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ БИОСИНТЕЗА ГЛИКОЗИДОВ

2.1. Введение

2.2. Структуры гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida

2.2.1. Гликозиды голотурий семейства Сисита1^ае

2.2.2. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae

2.2.3. Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae

2.2.4. Гликозиды голотурий семейства Psolidae

2.3. Структуры гликозидов голотурий отряда Elasipodida (семейства Elpidiidae)

2.4. Метаболомные масс-спектрометрические исследования гликозидов голотурий

2.5. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий. Закономерности взаимосвязи «структура - активность»

2.6. Биосинтез агликонов тритерпеновых гликозидов голотурий: что нам известно?

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Synaptidae отряда Apodida

3.1.1. Установление структур синаптозидов А и А1 из голотурии Synapta тасиШа

3.1.2. Структуры гликозидов и систематическое положение Synapta maculata

3.2. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Сиситаг^ае,

отряд Dendrochirotida

3.2.1. Установление структур гликозидов голотурии Cucumaria okhotensis

3.2.2. Тритерпеновые гликозиды Cucumaria okhotensis и систематика голотурий рода Cucumaria

3.2.3. Новый гликозид из голотурии Cucumaria japonica

3.2.4. Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Actinocucumis typica

3.2.5. Гликозиды из Actinocucumis typica как иллюстрация параллельной химической эволюции гликозидов в различных таксонах голотурий

3.2.6. Туркветозид А - гликозид с остатком 3-О-метилхиновозы из антарктической голотурии Staurocucumis turqueti

3.2.7. Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Pseudocolochirus violaceus

3.2.8. Структуры тритерпеновых гликозидов голотурии Pseudocolochirus violaceus

и ее таксономический статус

3.2.9. Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Colochirus robustus

3.2.10. Некоторые химические свойства агликона колохирозида Е,

имеющего 18(16)-лактон

3.2.11. Установление структур гликозидов из голотурии Cucumaria fallax 131 3.2.11.1. Биогенетическая взаимосвязь структур гликозидов голотурии C. fallax 145 3.2.11.2 Установление структур фаллаксозидов D3 и В1 - гликозидов с новыми типами полициклических систем из голотурии Cucumaria fallax

3.2.12. Возможные пути биосинтеза агликонов фаллаксозидов D3 и В1

3.2.13. Анализ структур гликозидов голотурии Cucumaria fallax и ее систематическая принадлежность

3.3. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae,

отряд Dendrochirotida

3.3.1. Установление структур гликозидов голотурии Eupentacta fraudatrix

3.3.2. Анализ структурного разнообразия, количественного содержания гликозидов и выполняемых ими функций в голотурии Eupentacta fraudatrix

3.3.3. Особенности биогенеза углеводных цепей гликозидов E. fraudatrix, как иллюстрация мозаичности их биосинтеза

3.3.4. Установление структур гликозидов голотурии Cladolabes schmeltzii

3.3.5. Анализ путей биогенеза агликонов и углеводных цепей гликозидов C. schmeltzii

3.4. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae, отряд Dendrochirotida

3.4.1. Установление структур гликозидов голотурииMassinium (=Neothyonidium) magnum

3.4.2. Биогенез агликонов голостанового и неголостанового типов в гликозидахM. magnum. Гликозидный состав Massinium (=Neothyonidium) magnum как пример внутривидового варьирования разнообразия гликозидов

3.5. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Elpidiidae отряда Elasipodida

3.5.1. Установление структур гликозидов голотурии Kolga hyalina

3.5.2. Причины сходства в структурах гликозидов арктических и антарктических видов голотурий семейства Elpidiidae

3.6. Биосинтетические трансформации агликонов тритерпеновых гликозидов голотурий 312 3.6.1. Общие закономерности биосинтеза углеводных цепей гликозидов в голотуриях

3.7. Анализ взаимосвязи «структура-активность» новых тритерпеновых гликозидов

3.7.1. Зависимость цитотоксической активности от строения углеводной цепи

3.7.2. Влияние числа и положения сульфатных групп на цитотоксическую активность, проявляемую гликозидами

3.7.3. Зависимость цитотоксической активности гликозидов от структуры агликона

3.7.4. Влияние гидроксильной группы в боковой цепи агликона на цитотоксическую активность, проявляемую гликозидами

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурное разнообразие, биологическая активность и особенности биогенеза тритерпеновых гликозидов из 12 видов голотурий отрядов Dendrochirotida, Apodida и Elasipodida»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Голотурии (класс Holothuroidea, тип Echinodermata) -широко распространенные по всему Мировому океану от тропиков до Арктики и Антарктики морские беспозвоночные, являются преимущественно донными малоподвижными животными, хотя встречаются и свободно плавающие формы.

Голотурии содержат необычные вторичные метаболиты - тритерпеновые гликозиды, разнообразие структур которых и их важные физиологические и экологические функции делают эту обширную группу метаболитов прекрасными модельными соединениями для изучения закономерностей и особенностей биогенеза и молекулярной эволюции вторичных метаболитов.

В голотуриях тритерпеновые гликозиды регулируют размножение посредством синхронизации созревания ооцитов в популяциях и осуществляют защиту этих малоподвижных и утративших в ходе эволюции скелет беспозвоночных животных от хищников. Защитная роль гликозидов обеспечивается их мощным мембранолитическим действием, связанным с образованием комплексов между гликозидами и 5(6)-ненасыщенными стеринами мембран клеток-мишеней и последующим образованием пор в мембранах. Гликозиды являются также молекулярными компонентами сложной системы аллелопатических и иных малоизученных химических взаимодействий в морских донных сообществах.

Изначально интерес к изучению вторичных метаболитов голотурий определялся высокой ихтиотоксичностью экстрактов этих животных и их широким использованием в традиционной медицине азиатских стран и в качестве ценных видов морской пищи (sea food). К настоящему времени из различных представителей класса Holothuroidea выделены несколько сотен индивидуальных тритерпеновых гликозидов, для которых обнаружены цитотоксическая, гемолитическая, антигрибковая, противоопухолевая, радиопротекторная, иммуномодулирующая и другие виды биологической активности. Несмотря на длительную историю изучения этих соединений, интерес к ним остается на высоком уровне. Об этом свидетельствуют многочисленные и разноплановые исследования, проводимые в настоящее время учеными из разных стран мира. Работы по поиску и установлению структур новых гликозидов голотурий активно проводятся научными группами из нашей страны, Аргентины, Вьетнама и Китая. Молекулярные механизмы действия гликозидов, в том числе соединений, выделенных в нашей лаборатории, изучают в России (ТИБОХ ДВО РАН), США, Южной Корее, Китае и Германии. Активно ведутся исследования экологической роли гликозидов в природных сообществах, а именно механизмов передачи и восприятия химических сигналов в

морских биоценозах, чему посвящены новейшие работы ученых из США и Бельгии. Группой исследователей из Китая недавно был осуществлен полный синтез одного из гликозидов голотурий, эхинозида А, обладающего высокой противоопухолевой активностью.

Некоторые гликозиды из голотурий представляют интерес как потенциальные противораковые и иммуностимулирующие препараты. Биотехнологические способы получения достаточных количеств целевых природных соединений этого класса могут основываться на управлении их биосинтезом. Поэтому чрезвычайно актуально изучение генных кластеров, кодирующих ферменты их биосинтеза, и свойств самих ферментов. В этом аспекте голотурии, по сравнению с наземными растениями - другими известными продуцентами тритерпеновых гликозидов, имеющих медицинское значение - остаются практически неизученной группой организмов.

Для развития любого из вышеупомянутых направлений изучения гликозидов голотурий одним из необходимых условий является знание структур этих метаболитов, а анализ их структурного разнообразия позволяет реконструировать последовательность стадий их биосинтеза. Более того, при изучении гликозидного состава иногда удается обнаружить минорные соединения с необычными структурами, так называемые «горячие метаболиты», представляющие собой промежуточные соединения в цепи биосинтетических трансформаций гликозидов. Результатом изучения гликозидных профилей различных видов голотурий является построение метаболических сетей, позволяющих проследить биогенетические взаимосвязи в агликонах и углеводных частях их молекул и установить последовательность превращений, приводящих к образованию конечных продуктов, сделать выводы о направлениях молекулярной эволюции гликозидов и о степени варьирования их внутривидового и межвидового разнообразия.

Большое значение имеет изучение таксономического распределения тритерпеновых гликозидов в голотуриях и применение этих веществ в качестве хемотаксономических маркеров. Система класса Holothuroidea пересматривалась на протяжении многих десятков лет, в последние годы - с применением молекулярно-генетических методов. Последняя ее ревизия была произведена в 2017 г. По современным данным класс Holothuroidea включает 7 отрядов: Apodida, Elasipodia, Но1оШиг^а, РегасиМа, Molpadida, Synallactida и Dendrochirotida. При этом вместо отряда Aspidochirotida, описанного в распространенной системе Поусона и Фелла, был введён отряд Но1оШиг^а, а также два новых отряда - РегеюиМа и Synallactida. Кроме того, таксономический статус целого ряда видов, родов и даже семейств голотурий изменялся несколько раз и во многих случаях до сих пор требует уточнения или пересмотра. Отряд Dendrochirotida - самый

многочисленный в классе Holothuroidea, в его составе на данный момент выделяют 12 семейств, насчитывающих более 100 родов. Несмотря на то, что в последние годы гликозиды голотурий отряда Dendrochirotida чаще всего становятся предметами исследований, химический состав большинства видов этого отряда остается неизученным. Отряды Apodida, Elasipodida и Molpadida представляют собой наименее химически изученные группы голотурий. Так, единственный представитель отряда Apodida, структуры гликозидов которого установлены и описаны в данной работе - это голотурия Synapta maculatа. Кроме этого, с нашим участием выделены гликозиды из двух видов голотурий отряда Elasipodida - Rhipidothuria racovitzai (=Achlyonice violaecuspidata) и Kolga hyalina. Необходимо отметить, что данные о структурах тритерпеновых гликозидов из голотурий этих отрядов позволили сделать некоторые заключения, касающиеся особенностей биосинтеза тритерпеновых агликонов, а также послужили подтверждением теории общего эволюционного происхождения антарктических и арктических видов голотурий семейства Elpidiidae (отряд Elasipodida) и их распространения из одного центра биоразнообразия.

Таким образом, таксономическая специфичность гликозидов, наряду с огромным разнообразием их структур при сохранении общего плана строения, позволяет широко использовать их для уточнения систематического положения соответствующих таксонов голотурий. Поэтому изучение гликозидного состава разных видов голотурий остается актуальным для разрешения спорных вопросов систематики голотурий и химической эволюции гликозидов. Особенно эффективен комплексный подход, когда химические данные используются для подтверждения выводов, сделанных на основании молекулярно-генетических и морфологических методов.

Тритерпеновые гликозиды голотурий - перспективная группа природных соединений для создания на их основе лекарственных препаратов. Анализ взаимосвязи «структура -активность» позволяет установить функциональную значимость структурных частей молекул гликозидов для реализации их физиологического действия. Эти знания могут использоваться не только для прогнозирования активности новых веществ, но и для направленной модификации природных соединений с целью получения высокоактивных производных.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось всестороннее изучение гликозидов из 10 видов голотурий отряда Dendrochirotida и 2-х представителей малоизученных отрядов Apodida и Elasipodida, в том числе выделение и установление строения, а в некоторых случаях изучение химических свойств этих соединений, уточнение последовательностей биосинтетических трансформаций агликонов и

углеводных цепей гликозидов, уточнение систематического положения некоторых видов голотурий, изучение внутри- и межвидовой вариабельности гликозидного состава, установление зависимости проявляемой гликозидами цитотоксической активности от их структуры.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Оптимизировать схемы разделения сложных гликозидных сумм с использованием различных подходов, включающих колоночную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) на различных сорбентах;

2. Установить полные химические структуры выделенных соединений на основе комплексного анализа данных ЯМР и КД спектроскопии, масс-спектрометрии, а в ряде случаев - с использованием методов химических трансформаций изучаемых веществ;

3. Провести сравнительный структурный анализ гликозидов голотурий Cucumaria okhotensis, C. fallax и Pseudocolochirus violaceus для уточнения таксономического статуса данных видов;

4. Проанализировать гликозидный состав различных органов в голотурии Eupentacta fraudatrix для уточнения выполняемых гликозидами функций и причины внутривидовой вариабельности гликозидов на примере голотурии Massinium magnum;

5. Проанализировать особенности строения и биогенез углеводных цепей и агликонов выделенных нами гликозидов для реконструкции последовательностей их биосинтетических трансформаций;

6. Сравнить мембранолитическую (цитотоксическую) активность в отношении нескольких типов клеток, проявляемую новыми, найденными нами гликозидами для установления взаимосвязей «структура - активность».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гликозиды голотурии Synapta maculata - единственного химически изученного представителя отряда Apodida - имеют уникальные структурные фрагменты как в агликонах, так и в углеводных цепях, что подтверждает эволюционную обособленность отряда Apodida в составе класса Holothuroidea.

2. Изучены спиртовые экстракты 7 видов голотурий, относящихся к семейству Cucumariidae отряда Dendrochirotida. В их составе обнаружены 35 новых тритерпеновых гликозидов. Большинство из них имеют агликоны голостанового типа с 7(8)- или 9(11)-двойной связью, но встречаются исключения. Агликон колохирозида Е, выделенного из голотурии Colochirus robustus, относится к неголостановому типу и содержит 18(16)-лактон. На его примере доказано, что в условиях кислотного гидролиза в агликонах с 18(16)-лактоном не происходит миграции 7(8)-двойной связи в положение 8(9)- и 9(11)-, в

отличие от агликонов голостанового типа с 7(8)-двойной связью. Гликозиды голотурии Cucumaria fallax характеризуются уникальными неголостановыми агликонами с 8(9)-двойной связью и заместителями в положениях С-7 и/или С-11. Два гликозида имеют новые типы карбоциклических систем: с 18(16)-лактоном и дополнительным 16,23-пятичленным циклом; с двумя шести- и двумя пятичленными циклами и спироатомом, без двойной связи и боковой цепи. Предложены пути их образования в процессе биосинтеза.

3. В гликозидных фракциях голотурий видов Cucumaria okhotensis, Actinocucumis typica, Staurocucumis turqueti, Pseudocolochirus violaceus и Colochirus гоЬтШ, принадлежащих семейству Сишта1"Мае преобладают гликозиды с линейными тетрасахаридными углеводными цепями, которые различаются моносахаридным составом и количеством сульфатных групп. Колохирозид Е из голотурии C. robustus имеет необычную трисахаридную углеводную цепь, разветвленную по первому моносахаридному остатку, и редкое положение сульфатной группы. Голотурия Cucumaria fallax содержит моно-, ди- и трисульфатированные пентаозиды, с олигосахаридными цепями, разветвленными по С-2 остатка хиновозы - второго моносахаридного остатка в цепи, которые считаются хемотаксономическими маркерами голотурий рода Cucumaria. Анализ структур олигосахаридных цепей гликозидов из трех видов голотурий - C. okhotensis, Р. violaceus и С. fallax позволил уточнить их систематическое положение.

4. Изучен гликозидный состав 2 видов голотурий семейства Sclerodactylidae отряда Dendrochirotida - Е^еМи^о. fraudatrix и Cladolabes schmeltzii. Из голотурии Е. fraudatrix выделен 31 новый гликозид. Эти соединения принадлежат к 6 группам, различающимся строением углеводных цепей, большинство из которых, содержит терминальный остаток 3-О-метилксилозы, считающийся хемотаксономическим признаком рода Eupentоctо. Большая часть агликонов гликозидов Е. frоudоtrix относится к голостановому ряду, содержит 7(8)-двойную связь и 16^-ацетокси-группу и отличается друг от друга строением боковых цепей. В составе гликозидов данного вида обнаружено несколько необычных агликонов: 27-нор-голостановый агликон, голостановый агликон с 16(22)-эпокси-группой и неголостановые агликоны с 18,20-дигидрокси-фрагментом, которые являются «горячими метаболитами», т.е. промежуточными звеньями при биосинтезе агликонов голостанового типа. Анализ биогенеза углеводных цепей гликозидов Е. frоudоtrix показал, что они биосинтезируются путем последовательного присоединения моносахаридных остатков в различные положения растущей цепи, а сульфатирование может происходить на разных этапах синтеза олигосахаридной части гликозидов. Мозаичность биосинтеза гликозидов приводит к тому, что одинаковые углеводные цепи могут быть синтезированы различными путями.

5. Анализ количественного содержания гликозидов в отдельных органах голотурии E. fraudatrix, выполненный с помощью комбинированной методики с использованием ВЭЖХ и ESI масс-спектрометрии, показал повышенное содержание в гонадах гликозидов с агликонами, структурно сходными с половыми гормонами позвоночных животных, что подтвердило участие гликозидов в регуляции размножения голотурий.

6. Из голотурии Cladolabes schmeltzii выделены 40 новых гликозидов, в составе которых найдено 19 типов углеводных цепей (тетра-, пента- и гексасахаридные цепи), различающихся составом и положением моносахаридных остатков. В гликозидах данного вида голотурий впервые обнаружены сульфатированные гексасахаридные цепи (кладолозиды групп I, J, K и L), пентасахаридная цепь необычной архитектуры (кладолозид J1), углеводная цепь с тремя последовательно связанными остатками ксилозы (кладолозид N), цепи с двумя остатками хиновозы (кладолозиды групп F и Н), а также гексасахаридные цепи с неметилированными терминальными остатками (кладолозиды групп D, P, Q, R). Анализ биогенеза углеводных цепей гликозидов C. schmeltzii показал, что каждый тип цепи формируется в результате индивидуальной последовательности реакций гликозилирования, т.е. их биосинтез имеет строго направленный характер.

7. Структуры агликонов гликозидов C. schmeltzii значительно менее разнообразны, по сравнению с их углеводными цепями, и среди них преобладают голостановые агликоны с 9(11)-двойной связью и ацетокси-группами при С-16 и С-22. Путем проведения химических трансформаций и применения к полученным производным метода Мошера показано, что асимметрический центр С-22 в агликонах голостанового типа имеет абсолютную ^)-конфигурацию. Один из агликонов гликозидов C. schmeltzii (в кладолозиде С4) характеризуется уникальной структурой и представляет собой окта-нор-ланостановое производное с 16(17)-двойной связью. Предложена схема биосинтеза агликонов гликозидов C. schmeltzii.

8. Изучен гликозидный состав голотурии Massinium (=Neothyonidium) magnum, представителя семейства Phyllophoridae, отряда Dendrochirotida. Выделены 12 новых гликозидов, которые содержат агликоны неголостанового типа с 18(16)-лактоном и неукороченной боковой цепью. Агликон магнумозида А1 характеризуется наличием необычного 20(24)-эпокси-фрагмента. Проанализированы биогенетические взаимосвязи агликонов голостанового и неголостанового типов. Установлено, что внутривидовая вариабельность гликозидного состава голотурий обусловлена экологической и защитной ролью этих соединений, что приводит к изменениям качественного и количественного состава гликозидов в зависимости от местообитания животных.

9. Два новых гликозида выделены из голотурии Kolga hyalinа, представителя отряда Elasipodidа. Структурное сходство тритерпеновых гликозидов двух изученных видов голотурий отряда Elasipodidа: Kolga hyalina, обитающего в Арктике, и Rhipidothuria racovitzai, обитающего в Антарктике, свидетельствует об общем эволюционном прошлом этих видов.

10. Описаны ключевые стадии формирования агликонов различного типа и основные закономерности биосинтеза углеводных цепей гликозидов голотурий. Начальные стадии биосинтеза агликонов связаны с перегруппировками карбокатионов, ферментативно синтезируемых 2,3-оксидосквален циклазами. Результатом активности данных ферментов является образование нескольких биосинтетических предшественников (тритерпеновых спиртов) с различным положением двойной связи в ядре.

11. Анализ взаимосвязи «структура-активность», выполненный на основании данных по мембранолитической активности новых гликозидов, позволил выявить структурные фрагменты в составе углеводных цепей и агликонов, необходимые для проявления гликозидами биоактивности. Биологическая активность гликозидов зависит не только от структур гликозидов, но и от особенностей строения клеточных мембран, на которые они действуют.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из экстрактов 10 видов голотурий отряда Dendrochirotida выделены 118 ранее неизвестных тритерпеновых гликозидов, еще 2 новых необычных гликозида получены из экстракта голотурии Synapta maculata (отряд Apodida) и 2 новых соединения - из голотурии Kolga hyalina (отряд Elasipodida). Установлено строение всех 122 выделенных природных соединений. Обнаружено 37 новых вариантов строения агликонов и 25 новых углеводных цепей гликозидов.

Впервые найдены гликозиды с двумя новыми типами полициклических систем: агликон с 18(16)-лактоном и дополнительным 16,23-пятичленным циклом; агликон без двойной связи в ядре, без лактона и боковой цепи, с двумя шести- и двумя пятичленными циклами и спироатомом. Предложены пути их образования. Кроме того, найдены многочисленные агликоны, являющиеся «горячими метаболитами», т.е. промежуточными звеньями в биосинтезе этих частей молекул гликозидов, в том числе не имеющие 18(20)-лактонного цикла, но содержащие 18,20-дигидрокси-фрагмент в ланостановом ядре. Впервые обнаружены: 27-нор-голостановый агликон; агликоны, содержащие 8(9)-двойную связь и функциональные группы при С-7 и/или С-11; агликоны с 16,22- или 20,24-эпокси фрагментами, а также октанорланостановый агликон с 16(17)-двойной связью.

Обнаружены ранее неизвестные углеводные цепи с остатком 3-О-метилглюкуроновой кислоты. Выделена целая серия гликозидов с новыми типами углеводных цепей

необычной архитектуры, в частности линейные и разветвленные трисахаридные цепи, гексасахаридные цепи, содержащие три последовательно связанных остатка ксилозы (в качестве первого, второго, и третьего сахара) или два остатка хиновозы (в качестве второго и пятого сахара), а также сульфатированные гексасахаридные цепи. Ряд новых олигосахаридных цепей характеризуется наличием неметилированных терминальных остатков.

Доказана невозможность миграции 7(8)-двойной связи в агликонах с 18(16)-лактоном, в условиях кислотного гидролиза, в отличие от агликонов голостанового типа с 7(8)-двойной связью.

Показаны достоверные отличия в гликозидном составе голотурий Cucumоriо okhotensis и Cucumariо ^ротш, доказывающие видовую самостоятельность Cucumariо okhotensis. На основе анализа структур тритерпеновых гликозидов исключена принадлежность голотурии Pseudocolochirus violоceus к роду Cucumоriо, а голотурия Cucumariо fоllоx однозначно отнесена к роду Cucumariо, а не к роду Pseudocnus.

Показано, что качественный и количественный состав гликозидных фракций голотурий изменяется в зависимости от фазы жизненного цикла животных и зависит от их местообитания. Получены данные, подтверждающие участие гликозидов в процессах размножения голотурий, а именно: повышенное содержание в гонадах голотурии Е^епШсШ frоudоtrix ряда минорных компонентов гликозидной суммы, имеющих агликоны, структурно подобные половым гормонам позвоночных, по сравнению с их содержанием в остальных органах. Таким образом, за выполнение различных функций в голотуриях, вероятно, отвечают гликозиды с различными структурами, поэтому в гликозидной фракции в разные периоды жизненного цикла голотурий накапливаются определенные компоненты, необходимые в данный период жизни организма-продуцента.

Показано, что биосинтез углеводных цепей происходит путем последовательного присоединения моносахаридных остатков в определенные положения растущей цепи. При этом в разных видах голотурий биосинтез углеводных цепей может иметь разную степень мозаичности.

Установлены биогенетические взаимосвязи между различными типами агликонов гликозидов. Анализ строения полициклических систем позволил заключить, что регуляция их биосинтеза оксидосквален циклазами осуществляется таким образом, что из протостероидных катионов при катализе одной оксидосквален циклазой могут образовываться несколько продуктов (тритерпеновых спиртов - предшественников гликозидов с различным положением двойной связи в ядре), либо в организме голотурий могут функционировать несколько оксидосквален циклаз, синтезирующих тритерпеновые предшественники агликонов с различным положением двойной связи. Указанные тритерпеноиды проходят через ряд ключевых стадий на пути к формированию агликонов голостанового и неголостанового типов.

Впервые обнаружено сходство в структурах тритерпеновых гликозидов голотурий отряда Elasipodida, обитающих в Арктике и Антарктике, указывающее на происхождение этих видов от общих глубоководных психрофильных предковых форм голотурий.

Для большинства выделенных гликозидов изучены гемолитическая и цитотоксическая активности, что позволило обнаружить ряд ранее неизвестных особенностей зависимости мембранолитического действия гликозидов от их строения. Полученные результаты демонстрируют, насколько велик потенциал структурного разнообразия тритерпеновых гликозидов голотурий. Различная биологическая активность, проявляемая гликозидами, может быть перспективна для лечения ряда заболеваний, в том числе опухолевой природы. Знания зависимости «структура - активность» наряду с изучением особенностей биосинтеза данных соединений в будущем позволит получать достаточные количества целевых биоактивных веществ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных и российских конференциях: "Phytochemistry & Application of Plant Saponins" (Пулавы, Польша, 2004), II международной конференции «Химия, Структура и Функция Биомолекул» (Минск, 2006), Российской конференции по иглокожим (Москва, 2011), 2-nd International Symposium on Life Sciences (Владивосток, 2013), 2-ой всероссийской конференции по иглокожим (Москва, 2015), 24-th Conference on Isoprenoids (Белосток, Польша, 2018), 3-rd International Symposium on Life Sciences (Владивосток, 2018).

Публикация результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в международных и российских научных журналах: Journal of Natural Products (Lloydia), Tetrahedron, Carbohydrate Research, Molecules, Marine Drugs, Natural Product Research, Biochemical Systematics and Ecology, Natural Product Communications, Биоорганическая химия. Некоторые части работы были опубликованы в отдельных главах научных сборников.

Всего автором опубликовано 70 научных статей, 4 главы в книгах и 1 патент, в том числе 39 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, по теме диссертации.

Личный вклад автора. Работа выполнена в Лаборатории химии морских природных соединений ФГБУН Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН. Основные результаты были получены лично автором, либо при его непосредственном участии. Автором выбирались методы, планировались и проводились эксперименты, устанавливалось химическое строение веществ на основе полученных спектроскопических данных, проводился анализ данных о структурах и активности гликозидов с целью их использования для уточнения таксономического положения ряда видов, построения схем биогенеза и биосинтеза агликонов и углеводных цепей, выявления зависимости «структура - активность». Регистрацию ЯМР спектров, выделенных автором соединений, проводил д.х.н. Калиновский А.И. (в.н.с. лаб. физико-химических методов исследований (ЛФХМИ) ТИБОХ ДВО РАН), масс-спектров - к.х.н. Дмитренок П.С. (зав.

ЛФХМИ) и к.х.н. Попов Р.С. (н.с. ЛФХМИ), КД спектров - Бердышев Д.В. (н.с. ЛФХМИ). Изучение биологической активности гликозидов проводилось сотрудниками лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ ТИБОХ ДВО РАН (зав. лаб. - д.б.н. Амининым Д.Л., н.с., к.б.н. Юрченко Е.А, н.с., к.б.н. Чингизовой Е.А.). Автор осуществлял подготовку публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация построена традиционно и состоит из 7 глав. Литературный обзор, следующий после Введения, включает обзор структур тритерпеновых гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida, данные о метаболомных исследованиях некоторых видов голотурий, а также данные об особенностях биосинтеза тритерпеновых гликозидов, известные к моменту написания диссертации. В главе «Обсуждение результатов» приведены результаты структурного изучения тритерпеновых гликозидов голотурий, сделан ряд выводов о таксономической принадлежности некоторых видов голотурий, обсуждена последовательность и специфика биосинтетических превращений агликонов и углеводных цепей гликозидов, проанализирована взаимосвязь биологической активности гликозидов и их химического строения. В экспериментальной части описаны приборы, биологический материал, использованный в работе, а также основные методики и эксперименты. Диссертация содержит Заключение, Выводы и Список цитируемой литературы.

Работа изложена на 399 страницах, содержит 107 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 225 цитируемых работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту академику РАН Валентину Ароновичу Стонику. Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Калинину В.И, д.х.н. Авилову С.А., за конструктивные советы и ценные рекомендации, д.х.н. Калиновскому А.И. за получение и помощь в анализе спектральных данных. Автор благодарит сотрудников ТИБОХ ДВО РАН: д.б.н. Аминина Д.Л., к.б.н. Чингизову Е.А, к.б.н. Юрченко Е.А., д.х.н. Федорова С.Н. - за проведение исследований биологической активности гликозидов, к.х.н. Дмитренка П.С., к.х.н. Попова Р.С и Бердышева Д.В. - за получение спектральных данных, к.х.н. Антонова А.С. - за помощь в выделении гликозидов, д.х.н. Макарьеву Т.Н. и к.х.н. Ляхову Е.Г. - за ряд ценных советов. Автор также выражает благодарность к.б.н. Смирнову А.В. (Зоологический институт РАН, г. Санкт-Петербург), д.б.н. Долматову И.Ю., к.б.н. С.Ш. Даутову (Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН), к.б.н. В.Г. Степанову (Камчатский филиал Тихоокеанского института географии (ТИГ) ДВО РАН, Петропавловск-Камчатский) - за предоставление некоторых видов голотурий и определение их видовой принадлежности.