Структурное и функциональное исследование бактериальных светочувствительных белков: родопсина из S. paucimobilis и модифицированной натриевой помпы из K. eikastus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Маляр Нина
- Специальность ВАК РФ03.01.02
- Количество страниц 135
Оглавление диссертации кандидат наук Маляр Нина
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Степень разработанности проблемы
Цели и задачи исследования
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость работы
Положения, выносимые на защиту
Вклад автора
Апробация работы
Публикации
Структура и объем работы
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Поиск новых микробных родопсинов в природе
1.1.1. Протонные помпы
1.1.1.1. Архейные протонные помпы (бактериородопсины)
1.1.1.2. Бактериальные протонные помпы
1.1.1.3. Эукариотические протонные помпы
1.1.1.4. Обратные протонные помпы (ксенородопсины)
1.1.2. Непротонные помпы
1.1.2.1. Катионные помпы
1.1.2.2. Архейные анионные помпы (галородопсины, ТБЛ родопсины)
1.1.2.3. Бактериальные анионные помпы (NTQ-родопсины)
1.1.3. Канальные родопсины
1.1.3.1. Катионные канальные родопсины из зеленых водорослей
1.1.3.2. Бактериородопсин-подобные катионные канальные родопсины
1.1.3.3. Анионные канальные родопсины
1.1.3.4. Десенсибилизированные анионные канальные родопсины типа MerMAID
1.1.3.5. Структуры канальных родопсинов
1.1.4. Сенсорные родопсины
1.1.4.1. Сенсорный родопсин ЛБЯ из ЛпаЬаепа (N08100) Бр. РСС7120
1.1.5. Энзимородопсины
1.1.6. Вирусные родопсины
1.1.7. Гелиородопсины
1.2. Рациональный дизайн микробных родопсинов
1.3. Методы изучения микробных родопсинов
1.3.1. Спектроскопия в УФ-видимой и инфракрасной области спектра
1.3.2. Метод рентгеноструктурного анализа
1.3.3. Серийная кристаллография временного разрешения с помощью рентгеновских лазеров на свободных электронах и синхротронных источников
1.3.4. Рамановская спектроскопия
1.3.5. Другие структурные методы
1.3.6. Электрофизиологические методы
1.3.6.1. Метод измерения светоиндуцированных токов через плоскую бислойную липидную мембрану (БЛМ)
1.3.6.2. Метод измерения светоиндуцированного трансмембранного потенциала на коллоидной пленке
1.3.6.3. Метод локальной фиксации потенциала
1.4. Обзор литературных данных об объектах исследования
1.4.1. Родопсин KR2 из Krokinobacter eikastus
1.4.2. Родопсин SpaR из Sphingomonas paucimobilis
ГЛАВА 2. МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Построение филогенетического древа и выравнивание последовательностей родопсинов
2.2.2. Дизайн генетических конструкций
2.2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.4. Получение генетических конструкций
2.2.5. Рестриктазно-лигазный метод клонирования
2.2.6. Сайт-направленный мутагенез
2.2.7. Трансформация клеток E. coli
2.2.8. Экспрессия белков в клетках E. coli
2.2.9. Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР)
2.2.10. Спектроскопия в УФ-видимом диапазоне
2.2.11. Метод импульсного фотолиза и анализ полученных данных
2.2.12. Приготовление липидных везикул
2.2.13. Метод регистрации светоиндуцированного изменения pH
2.2.14. Метод определения кинетики светоиндуцированных изменений мембранного AT в липидных везикулах
2.2.15. Метод регистрации протонного транспорта в липидных везикулах с помощью флуоресцентного красителя
2.2.16. Метод измерения светоиндуцированных токов через плоскую бислойную липидную мембрану (БЛМ)
2.2.17. Трансфекция клеток NG108-15
2.2.18. Регистрация активности SpaR в клетках млекопитающих методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp)
2.2.19. Кристаллизация микробных родопсинов
2.2.20. Получение и обработка дифракционных данных
2.2.21. Определение и улучшение структуры
2.2.22. Моделирование гипотетических структур мутантов KR2-N112A и KR2-N112G в О-состоянии
2.2.23. Конфокальная флуоресцентная микроскопия
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Общая и функциональная характеристика нового родопсина SpaR
3.1.1. Анализ аминокислотной последовательности SpaR
3.1.2. Спектр поглощения и фотоцикл SpaR
3.1.3. Кинетика светоиндуцированных изменений мембранного в одиночных липидных везикулах, содержащих SpaR
3.1.4. Помповая активность SpaR критически зависит от pH
3.1.5. Регистрация активности SpaR в клетках млекопитающих методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp)
3.1.6. pH-зависимость олигомерного состояния SpaR
3.1.7. Изучение олигомеризации SpaR методом малоуглового рентгеновского рассеяния
3.2. Кристаллические структуры SpaR и KR2-N112A
3.2.1. Анализ структуры SpaR
3.2.1.1. Получение кристаллов методом in meso
3.2.1.2. Ретиналь-связывающий «карман» SpaR
3.2.1.3. Цитоплазматическая часть SpaR
3.2.1.4. Внеклеточная часть SpaR
3.2.2. Анализ структуры мутанта KR2-N112A
3.2.2.1. Влияние мутации N112A на олигомерное состояние белка
3.2.2.2. Особенности кристаллической структуры мутанта N112A
3.2.2.3. Структурная организация области РШО в мутанта KR2-N112A
3.2.2.4. Роль N112 в ионной селективности KR2
3.3. Сайт-направленный мутагенез SpaR
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Светочувствительные белки - это эволюционно древние белки, которые встречаются во всех доменах жизни, обеспечивают рецепцию света живыми организмами, что позволяет им использовать энергию света в качестве топлива, для передачи сигналов и ориентирования в пространстве. Как правило, в состав таких белков входит хромофор, в котором происходят структурные перестройки при поглощении света, которые потом могут передаваться далее и распространяться, обеспечивая выполнение белком своей функции.
Наиболее распространенные фотоактивные белки - это микробные родопсины (МР). Гены опсинов встречаются в геномах микроскопических организмов всех доменов жизни, и даже в геномах вирусов. Мембранные части МР состоят из 7 трансмембранных спиралей и хромофора ретиналя, ковалентно связанного с остатком лизина через протонированное Шиффово основание. Поглощение фотона ретиналем приводит к его фотоизомеризации. Широкое распространение МР, их структурное и функциональное разнообразие, относительная простота гетерологической экспрессии и стабильность в искусственных миметиках мембраны делает их прекрасной модельной системой для фундаментальных исследований механизмов работы мембранных белков и обеспечивает множество биотехнологических применений. Большая часть МР - это ионные каналы, помпы или сенсоры.
В начале 21-го века был охарактеризован канальный родопсин 2 (СЬЯ2) из водоросли СЫатуйотопа8 теткаЫШ [1], который в 2005 г. лег в основу первой однокомпонентной оптогенетической системы[2], что привело к развитию оптогенетики, метода управления активностью клеток с помощью света. Быстрое дальнейшее развитие области открыло новую эру в изучении МР и привело к структурно-функциональным исследованиям ретинальных белков с целью получения новых оптогенетических инструментов [3-11].
Однако несмотря на успешное практическое применение этих белков, фундаментальные вопросы об их природе, эволюционном развитии, механизмах работы, лежащих в основе их крайне разнообразных функций, по-прежнему во многом открыты. Выявляемые в лабораторных условиях свойства родопсинов могут отличаться от таковых в живых организмах и не всегда говорят об их биологической роли. До сих пор нет четкого понимания, почему столь похожие родопсины имеют столь различные функции, а некоторые точечные мутации способны значительно изменить функцию родопсина. В попытках ответить на эти вопросы исследователи прибегают к метагеномному анализу для поиска новых родопсинов [12], строят и анализируют новые ветви филогенетического древа[13], разрабатывают новые методики определения функции МР[14,15], изучают структурные основы их функционирования [16]. Как правило, в
роли объектов структурных и функциональных исследований выступают либо новые белки с необычным природным мотивом консервативных аминокислотных остатков, либо известные родопсины с модифицированными ключевыми аминокислотными остатками. В случае МР мотив обычно определяют как триаду аминокислотных остатков, гомологичных остаткам Б85, Т89 и Б96 в наиболее изученной светочувствительной протонной помпе бактериородопсине (^БЯ) [17].
В настоящей работе исследовались структурные основы функционирования двух бактериальных родопсинов - не изученного ранее родопсина БраЯ из альфа-протеобактерии Sphingomonas paucmoЫlis NBRC 13935 и модифицированной светоуправляемой натриевой помпы из флавобактерии Krokinobacter eikastus. Представленная работа иллюстрирует два основных подхода к получению новых родопсинов (в перспективе, оптогенетических инструментов) с необычными свойствами: поиск потенциальных белков с новыми свойствами в природе и получение важных модификаций известных родопсинов методами белковой инженерии.
Родопсин БраЯ характеризуется не описанным ранее для родопсинов из протеобактерий мотивом БТБ. Анализ аминокислотной последовательности также выявил консервативный Н37 в положении, гомологичном Т46 бактериородопсина. Как выяснилось в ходе данной работы, БраЯ обладает активностью светоуправляемой протонной помпы, сильно зависящей от рН: он переносит протоны через мембрану вовне клетки при кислых рН, и практически прекращает помповую активность при рН 7.0 и выше. Только детальный анализ структурных данных высокого разрешения и сравнение с другими известными микробными родопсинами способны пролить свет на механизм переноса протона и причины рН-зависимости, поскольку предсказать точно структуру белка исходя из его аминокислотной последовательности практически невозможно[18]. В случае родопсина БраЯ предсказание структуры особенно затруднительно, так как он охарактеризован впервые и не обнаружено структур его близких гомологов.
Светоуправляемая натриевая помпа КЯ2 из флавобактерии K. eikastus с мотивом NDQ -одно из важных открытий последнего десятилетия в данной области [19]. На функционирование КЯ2, как и в случае БраЯ, значительно влияет рН: КЯ2 является натриевой помпой при физиологических условиях, а при рН меньше 6 он превращается в протонную помпу, выкачивающую протоны из клетки[20]. Известны примеры успешного рационального дизайна вариантов КК2[19,21-24]. В частности, замена ключевого с функциональной точки зрения[25,26] остатка N112 (участвующего в образовании мотива NDQ) на аланин превращает в
протонную помпу. При этом фотоцикл такой протонной помпы при рН 8.0 намного дольше, чем у нативного КЯ2 (составляет > 8 с, что сравнимо с длительностью фотоцикла БраЯ при этом рН)
и обладает рядом уникальных особенностей[22], в частности не включает ключевое для переноса натрия О-состояние[26]. Таким образом, мутант КЯ2-Ш12Л представляет собой сконструированную методами рационального дизайна протонную помпу с новым, неизвестным механизмом работы. Несмотря на то, что структура нативного КЯ2 известна, предсказать особенности строения мутантного белка, определяющие его свойства, трудно, поэтому, как и в случае БраЯ, требуется получение структуры атомарного разрешения.
Актуальность диссертационной работы состоит в глубоком изучении механизмов работы рН зависимых светочувствительных протонных помп и их структурных особенностей, лежащих в основе селективности и типа транспорта (активный или пассивный), осуществляемого белком. Результаты настоящей работы расширяют современное понимание функциональных механизмов (функциональных трансформаций) МР, и вносят вклад в актуальную проблему рационального дизайна оптогенетических инструментов.
Степень разработанности проблемы
Микробные родопсины - это светочувствительные мембранные белки, содержащие молекулу ретиналя в качестве кофактора. У всех МР похожая третичная структура, состоящая из 7 трансмембранных а-спиралей, которые принято обозначать заглавными латинскими буквами от А до G[4]. Все спирали соединены между собой внеклеточными и цитоплазматическими петлями, часто свернутыми в Р-листы[10,11,27] или небольшие спирали [7,28-30]. Ретиналь ковалентно связан с высококонсервативным лизином на трансмембранной спирали G через протонированное ретинальное Шиффово основание (РШО). Первый МР, бактериородопсин из архей На1оЪа&егшт 8аИпагпт (HsBR), был открыт в 1971 [31]. НЬЯ - это светоуправляемая протонная помпа, обеспечивающая перенос протона из клетки вовне и таким образом создающая потенциал на мембране для синтеза АТФ [32]. В 1971-1999 г.г. были открыты и охарактеризованы множество архейных МР с разнообразными функциями (бактериородопсины[17,33,34], архейные светоуправляемые хлорные помпы (галородопсины) [35],сенсорные родопсины [36]), а с 2000 г. в результате развития метагеномного анализа гены, кодирующие МР были найдены во всех остальных доменах жизни и в вирусах [4]. Наиболее значительными открытиями с начала 21 -го века являются бактериальные протонные помпы (протеородопсины) [37], катионные и анионные канальные родопсины [1,38-41], бактериальные натриевые[19] и хлорные[42] помпы, природные обратные протонные помпы (ксенородопсины, шизородопсины) [3,13,43,44], гелиородопсины [7,45], родопсины из гигантских вирусов [5,28,30,46], энзимородопсины [47,48]. Недавно было показано, что МР улавливают большую часть солнечной энергии, получаемой мировым океаном [49]. Открытие новых МР, в частности, канальных родопсинов, привело ко все большему применению их в биотехнологиях и к
появлению нового направления оптогенетики - возможности контролировать светом живые ткани, например, нервную или мышечную [2,50]. На сегодняшний день обнаружено более 10 тысяч генов родопсинов[51] [52], многие из которых еще не охарактеризованы.
В результате поиска по открытым метагеномным базам данных нашей лабораторией был обнаружен один из объектов исследования этой работы - родопсин БраЯ из альфа-протеобактерии £. paucimobilis NBRC 13935, вызывающей оппортунистические инфекции у человека. Об этом белке ничего не было известно в литературе.
Также в результате метагеномного анализа была выделена группа непротонных катионных помп, имеющих мотив NDQ и способных к активному транспорту Li+ и №+ из клетки. В присутствии катионов большего размера эти родопсины превращаются в протонные помпы (переносящую протоны наружу клетки) [21]. Было показано, что при физиологических для морских микроорганизмов условиях (рН 8.0, ~500 мМ №С1) эти белки функционируют преимущественно как светоуправляемые натриевые помпы[35]. Наиболее охарактеризованный представитель этой группы - открытая в 2013 году светоуправляемая натриевая помпа из морской бактерии Krokinobacter eikastus (КЯ2)[19]. КЯ2 является натриевой помпой при физиологических условиях, а при рН меньше 6 он превращается в протонную помпу, выкачивающую протоны из клетки[20]. КЯ2 - единственный родопсин из группы бактериальных непротонных катионных помп, для которого были получены структуры высокого разрешения в основном и промежуточных состояниях[8,11,53]. В 2019 г. нашими коллегами была получена структура пентамерного в основном состоянии при физиологических условиях [7], а в 2020 году - предложен механизм связывания иона натрия внутри белка и раскрыта роль интермедиатов фотоцикла, в частности, О-состояния[26].
Параллельно в области изучения МР активно использовался метод сайт-направленного мутагенеза. Как правило, модификации подвергали ключевые аминокислотные остатки, формирующие мотив белка, прочие консервативные остатки, а также участки молекулы, которые было интересно изменить на основе анализа полученных структурных данных. Подробно литературные данные о результатах белковой инженерии описаны в Главе 1. Родопсин КЯ2 также подвергался точечному мутагенезу, в результате чего роль функционально значимых остатков N112, D116 и Q123 (образующих мотив NDQ) была частично раскрыта, а полученные мутанты иногда проявляли неожиданные свойства[8,11,19,21,22,26,53-55]. Тем не менее, в литературе мало данных о структурах высокого разрешения для этих мутантов, что затрудняет полное понимание механизмов функциональных перестроек светочувствительных натриевых помп и микробных родопсинов вообще. Например, с 2013 года о мутанте Ш12А было известно из литературы, что он является протонной помпой и характеризуется очень длинным фотоциклом
при pH 8.0, однако до сих пор не было данных о структуре высокого разрешения, следовательно, точный механизм протонного транспорта в нем неизвестен.
Цели и задачи исследования
Цель работы - структурная и функциональная характеристика двух родопсинов бактериального происхождения: не известного ранее SpaR из S. paucimobilis NBRC 13935 и мутанта N112A светоуправляемой натриевой помпы KR2 из K. eikastus. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи.
1) Создание генетических конструкций, оптимизированных для гетерологической экспрессии SpaR и KR2-N112A в E. coli; получение белковых препаратов SpaR и KR2-N112A высокой степени чистоты; характеристика физико-химических свойств полученных белковых препаратов.
2) Кристаллизация SpaR и KR2-N112A in meso; получение и обработка дифракционных данных; определение, улучшение и анализ структур SpaR и KR2-N112A атомарного разрешения.
3) Функциональная характеристика SpaR спектроскопическими и электрофизиологическими методами исследования, определение наличия и особенностей ионного транспорта, осуществляемого SpaR.
4) Рациональный дизайн и функциональная характеристика мутантов SpaR на основе полученной структуры высокого разрешения и анализа белковой последовательности, сравнение свойств различных мутантов и нативной формы SpaR.
Научная новизна
Впервые был охарактеризован родопсин SpaR из S. paucimobilis NBRC 13935: получена его пространственная структура с разрешением 2.8 Á, показана активность протонной помпы с необычной pH-зависимостью, при которой протонный транспорт почти полностью прекращается при pH 7.0 и выше, а фотоцикл при этих значениях pH сильно замедляется. Важно отметить, что ранее не были исследованы пространственная структура и функциональная характеристика нативных родопсинов из протеобактерий с мотивом DTS, характерным для SpaR.
Впервые расшифрована кристаллическая структура протонной помпы KR2-N112A при физиологических условиях с разрешением 2.4 Á. Впервые показаны такие особенности структуры мутанта KR2-N112A, как изгиб центральной части ключевой спирали С, и наличие альтернативных конформаций остатка L74 в этом мутантном белке. Также впервые показана сохранность в данном мутантном белке пентамерной организации и общей конформации, присущих нативному KR2.
Теоретическая и практическая значимость работы
Изученные структурные и функциональные особенности нового родопсина БраЯ могут позволить лучше понять молекулярные механизмы работы МР и быть использованы в инжиниринге рН-чувствительных оптогенетических инструментов на его основе. рН-зависимость активности протонной помпы у БраЯ необычна для протеородопсинов, так как прокачка протонов заметно снижается при нейтральном и щелочном рН окружающей среды. Наличие такой необычной протонной помпы у аэробных бактерий, живущих как раз при нейтральном и щелочном рН, интересно с точки зрения микробиологии и требует дальнейшего изучения. Полученная структура БраЯ интересна с фундаментальной точки зрения, так как позволяет предположить новый механизм транспорта протона.
Полученные данные о структуре мутанта КК2-Ш12А дают информацию о характере структурных перестроек светочувствительных натриевых помп при изменении характерного NDQ-мотива. Эти знания могут быть полезными при рациональном дизайне вариантов КЯ2 с измененной ионной селективностью.
В целом, работа иллюстрирует и развивает два наиболее современных пути к получению новых микробных родопсинов: 1) выбор объекта исследования среди природных белков с ранее не известными и предположительно новыми свойствами, полученных в результате биоинформатического поиска; 2) получение белков с новыми функциями путем рационального дизайна уже изученных микробных родопсинов. Развитие этих двух подходов нужно для расширения современных знаний о природных механизмах работы светочувствительных белков и усовершенствования методов белковой инженерии.
Положения, выносимые на защиту
1) Пространственная структура нового родопсина БраЯ из Sphingomonas paucmoЫlis, полученная с разрешением 2.8 А методом рентгеноструктурного анализа белков с использованием синхротронного излучения.
2) Рекомбинантно наработанный в E. шИ родопсин БраЯ, солюбилизированный в мицеллах детергента додецилмальтозида (ДДМ), имеющий максимум поглощения 541 нм при рН 7.5. Положение максимума поглощения белка в детергенте плавно зависит от рН в диапазоне от 2.5 до 12.0, а рКа акцептора протона составляет
3) Длительность фотоцикла SpaR в мицеллах детергента значительно зависит от рН, составляя около 90 мс при рН 5.2 - 6.4, около 1 с при рН 7.0 и достигая 3 с при рН 8.0. Удлинение фотоцикла происходит за счет увеличение продолжительности распада М2-состояния. Уменьшение рН с 7.5 до 5.5 приводит к ускорению стадий электрогенного переноса протонов, сопряженных с распадом М-состояния в 15-20 раз.
4) SpaR способен осуществлять активный транспорт протонов под действием света в направлении «вне клетки» в клетках E. coli и в плазматической мембране животных клеток линии NG108-15. Активность SpaR как светочувствительной протонной помпы снижается при защелачивании среды как в липосомах, так и в плазматической мембране NG108-15. В клетках NG108-15 SpaR реагирует снижением помповой активности на защелачивание внеклеточной среды.
5) Модель механизма транспорта протона родопсином SpaR, предложенная на основе анализа структуры SpaR и помповой активности 11 его мутантов, экспрессированных в E. coli. Согласно модели D73 является первичным акцептором протона, а Н37 является частью комплекса, участвующем в репротонировании Шиффова основания.
6) Пространственная структура мутанта KR2-N112A, полученная с разрешением 2. 4 Ä методом рентгеноструктурного анализа белков с использованием синхротронного излучения. Мутантный белок KR2-N112A сохраняет пентамерную организацию и общую конформацию, присущие нативному KR2, но центральная часть ключевой спирали С имеет изгиб по сравнению с нативным KR2, а также в мутанте KR2-N112A увеличена полость возле Шиффова основания и существуют две альтернативные конформации остатка L74.
Вклад автора
Автор принимала непосредственное участие в создании генетических конструкций, экспрессии, очистке исследуемых белков, выполнении функциональных тестов и обработке их результатов, а также кристаллизации, получении дифракционных данных и анализе полученных пространственных структур. Автор оптимизировала используемые в работе протоколы, участвовала в разработке и проведении большинства экспериментов, обсуждении результатов и написании статей. Автор выражает благодарность соавторам опубликованных статей.
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК
Механизм обратного транспорта протона в ксенородопсинах2023 год, кандидат наук Цыбров Федор Михайлович
Родопсиновые протонные помпы и ионные каналы для оптогенетического контроля рН цитозоля и физиологии митохондрий2023 год, кандидат наук Власова Анастасия Дмитриевна
Фотохромные реакции ретинальсодержащих белков – зрительного родопсина и бактериородопсина – в фемто- и пикосекундном диапазоне времен2022 год, кандидат наук Смитиенко Ольга Александровна
Бионаногибридные структуры на основе фоточувствительных мембранных белков - аналогов родопсинов животных2017 год, кандидат наук Соловьева, Дарья Олеговна
Исследование механизма репротонирования основания Шиффа при фотоцикле мутантного бактериородопсина D96N1999 год, кандидат биологических наук Радионов, Алексей Николаевич
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурное и функциональное исследование бактериальных светочувствительных белков: родопсина из S. paucimobilis и модифицированной натриевой помпы из K. eikastus»
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях: 41st FEBS Congress (Эфес/Кушадасы, Турция, 2016), International Conference "Biomembranes 2016: Mechanisms of Aging and Age-related Diseases" (Долгопрудный, Россия, 2016), 43rd FEBS Congress (Прага, Чехия, 2018), International Conference "Biomembranes 2018" (Долгопрудный, Россия, 2018), II Всероссийская научная конференция с международным участием «Оптогенетика+ 2020» (Санкт-Петербург, Россия, 2020).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в высокорейтинговых научных журналах. Дополнительная статья принята в печать журналом «Доклады Российской академии наук. Науки о жизни» (индексируемом РИНЦ) 7 сентября 2020 г. и планируется к публикации в №6 2020г.
По результатам работы опубликовано 6 тезисов в сборниках трудов всероссийских и международных конференций, 3 из которых индексируются базами Scopus и Web of Science.
Структура и объем работы
Работа состоит из введения, 3 глав, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 135 страниц машинописного текста, включая 57 рисунков, 6 таблиц и 311 библиографических ссылок.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В данной главе будут рассмотрены основные функции природных микробных родопсинов, приведены результаты их структурных исследований, результаты инжиниринга новых оптогенетических инструментов и рационального дизайна природных родопсинов с целью лучшего понимания механизмов их функционирования. Рассмотрены примеры применения биофизических методов для исследования микробных родопсинов. Отдельное внимание будет уделено общим сведениям об объектах исследования данной диссертационной работы: приведен обзор структурно-функциональных работ, посвященных светочувствительной натриевой помпе КЯ2 и ее мутантных форм; дана информация об Sphingomonas paucmoЫlis, организме-хозяине нового родопсина БраЯ.
1.1. Поиск новых микробных родопсинов в природе
Микробные родопсины сейчас считаются наиболее распространенными светособирающими белками на Земле, делающими наибольший вклад в использовании морем солнечной энергии[49]. Они обладают крайне разнообразными биологическими функциями (Рисунок 1). Бурное развитие исследований микробных родопсинов привело к прорывным применениям, например, к разработке оптогенетических методов[56].
С момента открытия в 1971 году первого микробного родопсина - светоуправляемой протонной помпы бактериородопсина - и до 2000 года были известны лишь несколько родопсинов, функционирующих как протонные и хлорные помпы, а также как сенсоры. Примечательно, что все из них были архейными.
Рисунок 1. (а) Строение микробных родопсинов: показаны 7 спиралей и кофактор ретиналь; (б)основные известные функции микробных родопсинов.
В 2000 году была открыта первая светоуправляемая протонная помпа из бактерии[57]. Немногим позже охарактеризовали катионные канальные родопсины из зеленых водорослей [38]. Позже выяснилось, что существует множество генов родопсинов во всех доменах жизни, а также в вирусах. Развитие метагеномики и углубленный поиск новых инструментов для оптогенетики привели к обнаружению более 10000 генов новых микробных родопсинов [51] [52]. Так были выделены и охарактеризованы семейства натриевых помп [19], обратных протонных помп (ксенородопсинов[3] и шизородопсинов[44]), родопсинов из гигантских вирусов [46], светочувствительных ферментов [47] и еще несколько семейств микробных родопсинов, функция которых в настоящее время точно не известна. В частности, была открыта обширная группа гелиородопсинов с уникальным инвертированным расположением в мембране по сравнению с остальными известными родопсинами, встречающихся во всех доменах жизни, а также в гигантских вирусах [45].
Цитоплазма
Внеклеточн пространст
Мембрана
Г
Рисунок 2. Наложение известных пространственных структур микробных родопсинов: 10 архейных родопсинов, 8 родопсинов из бактерий, включая протонные и непротонные помпы и сенсорный родопсин Л8Я, эукариотические родопсины ЛЯ2 и химера канальных родопсинов
С1С2. Полный список использованных структур с РББ Юразмещен в таблице 2.1 [4]. Ретиналь изображен зеленым. Границы мембраны обозначены черными линиями. Структура канального родопсина С1С2 показана синим. Адаптировано из [4].
Микробные родопсины состоят из 7 трансмембранных альфа-спиралей (Л-О). К остатку лизина спирали О ковалентно через Шиффово основание присоединен кофактор ретиналь (Рисунок 2). Удивительно, что, будучи похожими структурно (Рисунок 2), родопсины тем не менее могут выполнять совершенно различные функции, и одна мутация в ключевых аминокислотных остатках может существенно повлиять на работу белка (множество примеров приведено в Таблице 1).
За последнее десятилетие получено много структурных данных о родопсинах благодаря развитию источников рентгеновского синхротронного излучения 3-го поколения и рентгеновских лазеров на свободных электронах, а также растущему количеству изучаемых родопсинов.
В этой главе архитектура белков будет описана в терминах «полостей» и «ворот», введенных в работе [6]. Считается, что родопсины выполняют свою функцию посредством организации внутренних и внешних гидрофильных полостей и констрикционных сайтов (ворот) между ними. В случае светоуправляемых транспортеров, полости обычно образуют цепочки для создания пути переноса субстрата. Предполагается, что все конформационные изменения в полостях и воротах изначально индуцируются изомеризацией ретиналя. Последовательность оптических трансформаций спектра поглощения микробного родопсина, вызванная поглощением фотона, называется фотоциклом (Рисунок 3).
Рисунок 3. Схема типичного фотоцикла микробного родопсина. В рамках показаны конформацииретиналя. Названия интермедиатов даны для бактериородопсина HsBR (в скобках - для ChR2). X- представляет собой противоион РШО (D85 в HsBR, E123 в ChR2). D85 в HsBR также служит акцептором протона от РШО. ЦЧи ВЧ- цитоплазматическая и внеклеточная часть, соответственно. В случае ионной помпы (например, HsBR) ЦЧ открыта, когда ВЧ закрыта (N-состояние). В случае ионного канала ВЧ открыта, когда открыта ЦЧ (P3-состояние). Адаптировано из [58].
Зачастую схема фотоцикла более сложная, чем приведенная на Рисунке 3, и включает в себя дополнительные состояния (например, L и О) и комформации ретиналя. В большинстве случаев наблюдается М-состояние, соответствующее депротонированному 13-cis хромофору, со сдвинутым в синюю область спектром поглощения. РШО затем репротонируется в N(P3)-состоянии. Для того, чтобы цитоплазматическая часть открылась, нужны конформационные перестройки спиралей, способствующие как переносу иона, так и передаче сигнала в сенсорных родопсинах. Для понимания механизмов функционирования родопсина очень информативно получение структур промежуточных состояний.
1.1.1. Протонные помпы 1.1.1.1. Архейные протонные помпы (бактериородопсины)
Светоуправляемые протонные помпы заняли особое место среди всех мембранных белков, так как первым открытым микробным родопсином была именно архейная протонная помпа бактериородопсин HsBR из Halobacterium salinarum[27]. Бактериородопсин стал первым мембранным белком, чью структуру получили с помощью электронной микроскопии [59]. Молекулярный механизм транспорта протона наружу клетки, осуществляемого HsBR, детально описан[60-62]. Другие известные архейные протонные помпы похожи на HsBR, поэтому их объединяют общим названием бактериородопсины.
Бактериородопсины способны прокачивать протон наружу клетки. В спектре поглощения HsBR есть один ретинальный пик (Xmax = 567 нм). Фотоцикл HsBR длится около 20 мс, слабо зависит от pH, буферного состава, но сильно зависит от температуры и липидного окружения [63]. При освещении HsBR проходит семь промежуточных состояний (I-, J-, K-, L-, M-, N- и O-состояния), при чем в М-состоянии происходит большой сдвиг спектра поглощения в синюю область (Xmax = 410 нм), что связано с депротонированием ретинального Шиффова основания. По данным рентгеноструктурного анализа как минимум в четырех промежуточных состояниях (K-, M- и N-состояния) происходят структурные перестройки. В темноте молекулы бактериородопсина находятся в стабильном «адаптированном к темноте» состоянии (Xmax = 560 нм) и при освещении частично переходят в «адаптированное к свету» состояние (Xmax = 567 нм).
В адаптированном к свету состоянии хромофор ретиналь находится в all-trans 15-syn конформации, а в адаптированном к темноте наблюдается смесь 1:1 состояний хромофора alltrans 15-syn и 13-c/s 15-syn[64]. Кристаллическая структура белка показывает ассиметричный паттерн гидратации внеклеточной и внутриклеточной частей белка, связанный с направленностью транспорта протона, опосредованным водородными связями.
Долгое время все попытки получить рентгеновскую структуру #sBR высокого разрешения не были успешными. Необходимость решить эту сложную задачу привела к изобретению в 1996 году нового метода кристаллизации мембранных белков - кристаллизации в липидной кубической фазе (J. Rosenbush и E. Landau)[65]. В итоге структура была решена в 1997 году E. Pebay-Peyroula et al. [66,67]. Затем в течение нескольких лет были получены структуры промежуточных состояний[68-73]. Тем не менее, перед исследователями возникли новые вопросы. Во-первых, структурные данные и соответствующие заключения трёх исследовательских групп, занимавшихся молекулярными механизмами транспорта протона, были противоречивыми[60,62,74,75]. Во-вторых, радиационное повреждение #sBR наблюдалось даже при достаточно низком времени экспозиции [76]. Позже выявились и другие кристаллографические проблемы, связанные с двойникованием [77].
Путь переноса протона в #sBR проходит через три важных участка внутри белка (Рисунок
4):
1) области захвата протона
2) области Шиффова основания
3) области высвобождения протона
На сегодняшний день большинство исследователей согласны со следующей последовательностью переноса протона в #sBR.
Шаг 1. В основном состоянии ретинальное Шиффово основание (РШО) протонировано, и между РШО и молекулой воды W402 (также координирующей D85 и D212) существует водородная связь. В водной полости, содержащей W402 cavity, есть еще две молекулы воды. С одной стороны полость закрыта гидрофобным ретиналем, а с другой - боковой группой R82. При поглощении фотона ретиналь изомеризуется и переходит из all-trans в 13-c/s конформацию (Рисунок 5). В этом положении протонированное состояние РШО становится энергетически невыгодным, и протон переходит к первичному акцептору протона D85.
Шаг 2. Во время L- и М-состояний боковая группа R82 смещается в сторону, противоположную от РШО, открывая возможность перехода протона к D85.
Шаг 3. Протон, находившийся в сайте высвобождения протона, образованном двумя глутаматами E194 и E204, замещается протоном из области Шиффова основания, и выходит во внеклеточное пространство.
Шаг 4. Происходит репротонирование ретиналя за счет депротонирования D96 в сайте захвата протона. D96 затем репротонируется.
Шаг 5. Протон D85 переходит в область высвобождения протона, и цикл JШBR замыкается.
Рисунок 4. Структура бактериородопсина HsBR (PDB ID: 1C3W). Обозначения: 1 - область захвата протона, 2 - область Шиффова основания, 3 - область высвобождения протона. Внутренние полости показаны в виде розовых поверхностей. Молекулы воды, расположение которых определено из кристаллографических данных, изображены красными сферами. Адаптировано из [5].
Помимо HsBR, в литературе описано множество других архейных протонных помп, например, получены структуры атомарного разрешения для археородопсинов 1 и 2. Zhang et al. в 2013 году получили структуру дельтародопсина из Haloterrigena thermotolerans[78]. Максимальное количество родопсинов в одном организме обнаружено в архее Haloarcula marismortui - 6
цитоплазм.
f
родопсинов, 2 из которых являются протонными помпами [79]. Интересен родопсин из Haloquadratum walsbyi - в нем ретиналь находится в 11 -cis конформации, подобно ретиналю в зрительных родопсинах (в основном состоянии зрительные родопсины используют конфигурации 11 -cis/all-trans), а сам белок с точки зрения функции представляет собой нечто среднее между бактериородопсинами и сенсорными родопсинами[80]. В 2014 году Chan et al. получили структуру родопсина cruxrhodopsin-3 из Haloarcula vallismortis[81].
Рисунок 5. Фотоизомеризация ретиналя в HsBR и других микробных родопсинах. Адаптировано из [82].
Оказалось, что в оптогенетике HsBR слабо применим из-за низкого уровня гетерологической экспрессии в плазматической мембране нейронов. Тем не менее, среди бактериородопсинов есть перспективные инструменты для оптогенетики, например, археородопсин-3 (Arch) из Halorubrum sodomense, на 60% гомологичный HsBR, - считался одним из наиболее эффективных нейронных сайленсеров до открытия анионных канальных родопсинов[83]. Несмотря на то, что молекулярные механизмы Arch похожи на молекулярные механизмы HsBR, таргетированная экспрессия Arch в плазматической мембране осуществляется легко, причем белок сохраняет структурную и функциональную стабильность.
1.1.1.2. Бактериальные протонные помпы В 2000 году Beja et al. проанализировали метагеномные данные из образцов, взятых в заливе Монтерей (США) и обнаружили первый родопсин, принадлежащий домену Бактерии[84]. Они подтвердили, что этот родопсин представляет собой бактериальную светоуправляемую
протонную помпу - протеородопсин [57]. С тех пор протеородопсины прочно заняли положение наиболее распространенных [10,85,86] - гены бактериальных протонных помп находят не только в археях, но и в эукариотических микроорганизмах (вероятно, это результат горизонтального переноса генов [87]). Позже выяснилось, что свет стимулирует рост морских флавобактерий Dokdonia sp. Strain MED134 [88] и Vibrio strain AND4 в условиях нехватки питательных веществ в окружающей среде [89].
Протеородопсины делят на две группы в зависимости от их спектральных характеристик: поглощающие свет в зеленом диапазоне (GPR, максимум поглощения Xmax ~ 525 нм) и в синем (BPR, максимум поглощения Xmax ~ 490 нм), при чем последние обитают в более глубоких слоях океана, куда зеленый свет проникает меньше [90]. Разница в спектрах поглощения, по-видимому, обеспечивается остатками L105 в GPR и Q105 в BPR [91].
В отличие от бактериородопсинов, способных прокачивать протоны в широком диапазоне pH, у протеородопсинов обычно достаточно высокий pKa противоиона Шиффова основания (GPR D97 pKa = 7.1), что приводит к остановке транспорта протона при нейтральных и кислых pH[92] либо изменению его направленности [93]. Эта особенность фотохимии протеородопсинов связана с высококонсервативным гистидином на спирали В (в GPR это H75), который связан водородной связью с противоионом-аспартатом и подвержен воздействию водного окружения. В GPR имидазольная группа H75 переносит внешний протон на карбоксильную группу противоиона-аспартата (D97), что и вызывает бимодальное поведение. В щелочных pH фотоцикл длится 150 мс и проходит пять интермедиатов K, M1, M2, N и O-состояния[94]. В нейтральных и щелочных pH фотоцикл длится 25 мс и состоит из K, L и N-состояний, при этом нет М-состояния[95]. Несмотря на распространенность и важность для понимания эволюционной биологии, описанная pH-чувствительность лимитирует практическое использование протеородопсинов в нейробиологии.
Несмотря на большое количество находимых последовательностей протеородопсинов, структур высокого разрешения насчитывается мало. Среди них можно назвать кристаллические структуры протеородопсина из бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR)[10], двух протеородопсинов из Med12 и HOT75 (Med12BPR и HOT75BPR)[96], ксантрородопсина из эубактерии Salinbacter ruber (XR), родопсинов из цианобактерии Gloeobacter violaceus PCC 7421 (GR) и из термофильной бактерии Thermus thermophiles (TR). Первые атомарные структуры выявили необычные свойства, такие как характерный изгиб в середине спирали F (3ш- и п-спиралеподобные элементы), стабилизированное W154 и N224 в случае ESR, W141 и N212 в случае Med12BPD, W159 и N231 в случае HOT75BRP. Такого изгиба нет в бактериородопсинах и ксантрородопсинах. Еще одно свойство, как было уже замечено выше, - наличие
гистидинового остатка, взаимодействующего с акцептором протона от РШО через короткую водородную связь (2.4 Á), и таким образом увеличивающего его pKa. В случае пентамеров и гексамеров этот остаток гистидина участвует в интерфейсе олигомеризации. Также в протеородопсинах есть относительно большая полярная полость вблизи ШО и донора протона в цитоплазматической части белка. В случае #sBR похожая полость наблюдается в течение L-, M-и N-состояний, но в протеородопсинах она есть и в основном состоянии, хотя нет водородной связи РШО с донором протона.
Родопсин ESR из Exiguobacterium sibiricum сравнительно хорошо изучен. Ген, кодирующий этот белок, обнаружен в грамположительной психротрофной бактерии Exiguobacterium sibiricum, обитающей в почве районов вечной мерзлоты в Сибири и способной выживать при температурах в диапазоне от -5°C до 40°C (Rodrigues et al. 2008). Гетерологически экспрессированный в E. coli, белок функционирует как протонная помпа в широком диапазоне pH 4.5-8.5 [97-99].
Рисунок 6. Внутренние полости и ключевые аминокислотные остатки ESR (PDB Ю: 4HYJ). Адаптировано из [10].
В структуре ESR также есть типичный для протеородопсинов Ж7, повышающий pKa акцептора протона, но при этом в его структуре есть две уникальные черты (Рисунок 6). Во-первых, конфигурация остатков Н57 и R82 на внеклеточной стороне создает большую полость, соединяющую пару D85-H57 со внеклеточной средой, что напоминает архитектуру канального родопсина С1С2[100]. Таким образом, пара D85-H57 может отдавать протон непосредственно во внеклеточное пространство. Во-вторых, у ESR есть положительно заряженный остаток лизина К96 на цитоплазматической стороне (в положении, соответствующем D96 в ДЖК), вовлеченный в процесс репротонирования ШО во время фотоцикла (Рисунок 7). По сравнению с другими протонными помпами у ESR обратный порядок захвата и высвобождения протона[101], что возможно является механизмом адаптации к кислым значениям pH по сравнению с остальными протеородопсинами.
Рисунок 7. Сравнение ретиналь-связывающего кармана в ESR (слева, PDB ID: 4HYJ) и в HsBR (справа, PDB ID: 1C3W). Адаптировано из [10].
Необычную pH-зависимость также демонстрируют представители еще одной филогенетической группы родопсинов из бактерий с мотивом DTG, открытой Harris et al[102]. Авторы описали предположительно протонную помпу PspR из Pseudomonasputida, в которой на месте Asp96 бактериородопсина, являющегося карбоксильным донором протона для Шиффова
основания (ШО), размещен Gly84. Кроме того, Thr46 бактериородопсина, с которым Asp96 связан водородной связью, заменен гистидином, консервативным во всей филогенетической группе белков с мотивом DTG. Авторы показали способность PspR к активному транспорту протонов и предположили, что гистидин участвует в формировании комплекса, обеспечивающего репротонирование ШО. Позже Y. Sudo и S. Yoshizawa охарактеризовали еще три бактериальных родопсина с мотивом DTG и предположили, что они являются протонными помпами[103]. Тем не менее, не до конца ясный механизм репротонирования ШО и сильное замедление фотоцикла при повышении pH указывает на то, что функция этих родопсинов может не ограничиваться лишь прокачкой протона.
Можно привести еще несколько примеров родопсинов из бактерий, иллюстрирующих, насколько разнообразны по своим структурам и функциям представители этой группы. Ксантородопсин из Salinibacter ruber использует второй каротеноид, салиниксантин, как антенну, передающую свет к ретиналю и таким образом расширяющую диапазон длин улавливаемых волн [104]. Его ретиналь-связывающий карман изображен на Рисунке 8.
Родопсин из Gloeobacter violaceous аналогичным образом связывает каротеноид эхиненон [105]. Гены протеородопсинов обнаруживают в организмах-экстремофилах, например, живущих во льдах Антарктики [106], или напротив, в термофильных организмах. Так, найдены необычайно термостабильные протонные помпы из Thermus thermophilus [107] и Rubrobacter xylanophilus [108].
Рисунок 8. Ретиналь-связывающий карман ксантородопсина (PDB ID: 3DDL). Адаптировано из [10].
1.1.1.3. Эукариотические протонные помпы
Ретиналь-связывающие протонные помпы были выявлены в эукариотических организмах, например, грибах (Leptosphaeria [109,110]) и водорослях (Acetabularia [111]). Wada et al. в 2011 году получили структуру родопсина AR2 из Acetabularia с разрешением 3.2А [112].
1.1.1.4. Обратные протонные помпы (ксенородопсины)
Долгое время считалось, что направленность транспорта протона связана с градиентом протонов на клеточной мембране и всегда одинакова - из клетки наружу. Тем не менее в 2011 году показали, что мутант D217E сенсорного родопсина из Anabaena (ASR) проявляет свойства обратной протонной помпы, прокачивая протоны внутрь клетки[113]. Затем состоялось открытие новой ветви - ксенородопсинов (XeR)[114], филогенетически близкой к сенсорным родопсинам и функционирующих как природные обратные протонные помпы[3,43]. В их фотоцикле есть четыре разных промежуточных состояния: К, Ь, М1 и М2, при чем в М1 и М2-состояниях вероятнее всего происходят структурные перестройки во время переноса протона. Единственная на данный момент опубликованная структура природной светоуправляемой обратной протонной помпы NsXeR из Nanosalina была определена с разрешением 2.5 А [3] и представлена на Рисунке 9. NsXeR формирует тримеры, аналогично ЯsBR. NsXeR содержит остаток триптофана в положении, соответствующем R82 в #sBR. Считается, что этот консервативный триптофан -одна из важнейших черт ксенородопсинов [3]. Действительно, положительно заряженный аргинин играет важную роль в установлении однонаправленного транспорта иона: его замена на нейтральный глутамин превращает натриевую помпу в калиевый канал[24], а протонную помпу CsR из Coccomyxa - в светоактивируемый протонный канал[115].
Еще одна важная особенность - отсутствие заряженной аминокислоты в положении, соответствующем D96 ЯsBR. В NsXeR в этой области расположены Н48 на спирали В и D220 на спирали О, которые формируют солевой мостик, к тому же в основном состоянии Н48 расположен ближе к РШО, чем D96 в #sBR. Н48 также связан водородной связью с молекулой воды ^а1407). В #sBR аналогичная молекула воды ^а1502) участвует в формировании непрерывной цепочки водородных связей от РШО к D96 в Ь- и К-состояниях[73,116,117]. Таким образом, возможно, что в NsXeR при изомеризации ретиналя и изменении ориентации РШО аналогичная цепочка формируется от РШО до пары Н48-0220. В то время, как в ЯsBR протон с депротонированного РШО не переходит на D96, протонированном в Ь-состоянии, в ксенородопсинах возможно, что рКа пары Н48-0220 делает энергетически выгодным перенос протона от РШО к этой паре. При этом отсутствие аргинина на внеклеточной стороне делает возможным перенос протона для репротонирования ШО извне клетки. Больше информации могут дать структуры интермедиатов, которые пока не были опубликованы.
Показано, что ксенородопсин из Nanosalina способен вызывать потенциалы
действия в нейронах гиппокампа крыс при освещении на длине волны 532 нм с частотой как минимум 40 Гц[3]. Способность обратных протонных помп деполяризовать клеточную мембрану открывает новые возможности в нейробиологии, в том числе делает возможным полную блокаду ионного транспорта (например, транспорта кальция) через плазматическую мембрану.
Цитоплазматическая часть
часть
Рисунок 9. Структура и предполагаемый путь переноса протона в ксенородопсине NsXeR (PDB ID: 6EYU). Полости вычислены с помощью HOLLOW и показаны в виде поверхностей розового цвета. N-конец обозначен синим цветом.
1.1.2. Непротонные помпы 1.1.2.1. Катионные помпы
Долгое время считалось, что светоуправляемые катионные помпы невозможны из -за энергетически невыгодного стерического взаимодействия в районе РШО. Эта парадигма основана на имеющейся модели механизма функционирования бактериородопсинов.
Действительно, в непротонных помпах не может быть реализован механизм Гротгуса, лежащий в основе переноса протона в светоуправляемых протонных помпах[118]. Однако в 2013 году была открыта природная светоуправляемая натриевая помпа KR2 из Krokinobacter eikastus[19,119]. Этот родопсин не только прокачивает ионы натрия и лития, но также превращается в протонную помпу в присутствии ионов большего радиуса. Существует множество работ, посвященных структурно-функциональной характеристике KR2. Это единственный представитель семейства светочувствительных натриевых помп, для которого получены структуры высокого разрешения; получено множество его мутантных форм. Показана возможность использования KR2 для торможения нейронной активности.
Гены, кодирующие другие белки из этого семейства, находили в разнообразных организмах[23]. Некоторые белки охарактеризованы с функциональной точки зрения: подтверждена их способность к активному транспорту натрия [19,119,120]. Многие из изученных родопсинов этой группы являются гибридными Na+/H+ помпами и переносят натрий только если он присутствует в достаточном количестве в окружающей среде: KR2 из K. eikastus, GLR из G. limnaea и TRR1 из Truepera radiovictrix. Родопсины из Nonlabens marinus S1-08 и Dokdonia sp. PRO95 менее активны как протонные помпы в отсутствие натрия [119,121]. Все родопсины этого семейства характеризуются максимумом спектра поглощения 523 нм, положение пика слабо зависит от концентрации натрия[23].
Понимание механизма работы натриевых помп также необходимо для рационального дизайна других катионных помп, которых в природе пока не обнаружено.
Так как объектом данной работы является мутант KR2-N112A, особенности структуры и молекулярный механизм переноса натрия белком KR2, а также имеющиеся сведения о его модификациях будут рассмотрены в отдельном подразделе (подраздел 1.4.1).
Похожие диссертационные работы по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК
Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина2002 год, кандидат химических наук Миронова, Екатерина Валентиновна
Родопсины: структура и функции1985 год, доктор химических наук Абдулаев, Нажмутин Гаджимагомедович
Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах2005 год, кандидат физико-математических наук Ефремов, Руслан Геннадьевич
Моделирование механизмов первичных фотохимических реакций и фотоиндуцированной динамики ретиналь-содержащих белков2022 год, кандидат наук Кусочек Павел Александрович
Фотоиндуцированные процессы и их роль в функционировании бактериородопсина2014 год, кандидат наук Дегтярева, Ольга Васильевна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Маляр Нина, 2020 год
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nagel G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. Vol. 100, № 24. P. 13940-13945.
2. Boyden E.S. et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity // Nat. Neurosci. 2005.
3. Shevchenko V. et al. Inward H + pump xenorhodopsin: Mechanism and alternative optogenetic approach // Sci. Adv. 2017. Vol. 3, № 9. P. e1603187.
4. Gushchin I., Gordeliy V. Microbial rhodopsins // Subcellular Biochemistry. 2018. Vol. 87. P. 1956.
5. Bratanov D. et al. Unique structure and function of viral rhodopsins // Nat. Commun. Springer US, 2019. Vol. 10, № 1. P. 4939.
6. Volkov O. et al. Structural insights into ion conduction by channelrhodopsin 2 // Science (80-. ). 2017. Vol. 358, № 6366.
7. Kovalev K. et al. High-resolution structural insights into the heliorhodopsin family // Proc. Natl. Acad. Sci. 2020. Vol. 117, № 8. P. 4131-4141.
8. Kovalev K. et al. Structure and mechanisms of sodium-pumping KR2 rhodopsin. // Sci. Adv. 2019. Vol. 5, № 4. P. eaav2671.
9. Ishchenko A. et al. New Insights on Signal Propagation by Sensory Rhodopsin II/Transducer Complex // Sci. Rep. 2017. Vol. 7.
10. Gushchin I. et al. Structural insights into the proton pumping by unusual proteorhodopsin from nonmarine bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. Vol. 110, № 31. P. 12631-12636.
11. Gushchin I. et al. Crystal structure of a light-driven sodium pump // Nat. Struct. Mol. Biol. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 22, № 5. P. 390-396.
12. O'Malley M. a. Exploratory experimentation and scientific practice: metagenomics and the proteorhodopsin case. // Hist. Philos. Life Sci. 2007. Vol. 29, № 3. P. 337-360.
13. Bulzu P.A. et al. Casting light on Asgardarchaeota metabolism in a sunlit microoxic niche // Nat. Microbiol. Springer US, 2019. Vol. 4, № 7. P. 1129-1137.
14. Drachev L.A. et al. Fast Stages of Photoelectric Processes in Biological Membranes // Eur. J. Biochem. 2005. Vol. 117, № 3. P. 461-470.
15. Bamberg E., Hegemann P., Oesterhelt D. Reconstitution of the light-driven electrogenic ion pump halorhodopsin in black lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1984. Vol. 773, № 1. P. 53-60.
16. Ernst O.P. et al. Microbial and animal rhodopsins: Structures, functions, and molecular mechanisms // Chem. Rev. 2014. Vol. 114, № 1. P. 126-163.
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
Luecke H. et al. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 Âresolution // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 291, № 4. P. 899-911.
Li B. et al. Finding the needle in the haystack: towards solving the protein-folding problem
computationally // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2018.
Inoue K. et al. A light-driven sodium ion pump in marine bacteria // Nat. Commun. 2013. Vol. 4.
Kato Y., Inoue K., Kandori H. Kinetic Analysis of H + -Na + Selectivity in a Light-Driven Na +
-Pumping Rhodopsin // J. Phys. Chem. Lett. 2015. Vol. 6, № 24. P. 5111-5115.
Inoue K., Nomura Y., Kandori H. Asymmetric functional conversion of eubacterial light-driven
ion pumps // J. Biol. Chem. 2016. Vol. 291, № 19.
Inoue K. et al. The Role of the NDQ Motif in Sodium-Pumping Rhodopsins // Angew. Chemie Int. Ed. 2015. Vol. 54, № 39. P. 11536-11539.
Shevchenko V. et al. Sodium and Engineered Potassium Light-Driven Pumps // Optogenetics / ed. Appasani K. Cambridge: Cambridge University Press, 2017. P. 79-92. Vogt A. et al. Engineered Passive Potassium Conductance in the KR2 Sodium Pump // Biophys. J. 2019. Vol. 116, № 10. P. 1941-1951.
Abe-Yoshizumi R. et al. Role of Asn112 in a Light-Driven Sodium Ion-Pumping Rhodopsin // Biochemistry. 2016. Vol. 55, № 41. P. 5790-5797.
Kovalev K. et al. Molecular mechanism of light-driven sodium pumping // Nat. Commun. 2020. Vol. 11, № 1. P. 2137.
Luecke H. et al. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 Â resolution // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 291, № 4. P. 899-911.
Zabelskii D. et al. Viral channelrhodopsins: calcium-dependent Na+/K+ selective light-gated channels // bioRxiv. 2020.
Shihoya W. et al. Crystal structure of heliorhodopsin // Nature. 2019.
Needham D.M. et al. A distinct lineage of giant viruses brings a rhodopsin photosystem to unicellular marine predators // Proc. Natl. Acad. Sci. 2019. Vol. 116, № 41. P. 20574-20583. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium // Nat. New Biol. 1971. Vol. 233, № 39. P. 149-152. Matsuno-Yagi A., Mukohata Y. ATP synthesis linked to light-dependent proton uptake in a red mutant strain of Halobacterium lacking bacteriorhodopsin // Arch. Biochem. Biophys. 1980. Kouyama T. et al. Structure of archaerhodopsin-2 at 1.8Â resolution // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2014.
Luecke H. et al. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008.
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
Schobert B., Lanyi J.K. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, № 17. P. 10306-10313.
Bogomolni R.A., Spudich J.L. The photochemical reactions of bacterial sensory rhodopsin-I. Flash photolysis study in the one microsecond to eight second time window // Biophys. J. 1987. Vol. 52, № 6. P. 1071-1075.
Béja O. et al. Proteorhodopsin phototrophy in the ocean // Nature. 2001.
Nagel G. et al. Channelrhodopsin-1: A light-gated proton channel in green algae // Science (80-. ). 2002. Vol. 296, № 5577. P. 2395-2398.
Govorunova E.G., Sineshchekov O.A., Spudich J.L. Structurally Distinct Cation Channelrhodopsins from Cryptophyte Algae // Biophys. J. 2016. Vol. 110, № 11. Oppermann J. et al. MerMAIDs: a family of metagenomically discovered marine anion-conducting and intensely desensitizing channelrhodopsins // Nat. Commun. 2019. Govorunova E.G. et al. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics // Science (80-. ). 2015.
Kim K. et al. Crystal structure and functional characterization of a light-driven chloride pump having an NTQ motif // Nat. Commun. 2016. Vol. 7, № 1. P. 12677.
Inoue K. et al. A natural light-driven inward proton pump // Nat. Commun. 2016. Vol. 7, № 1. P. 13415.
Inoue K. et al. Schizorhodopsins: A family of rhodopsins from Asgard archaea that function as light-driven inward H + pumps // Sci. Adv. 2020. Vol. 6, № 15. P. eaaz2441. Pushkarev A. et al. A distinct abundant group of microbial rhodopsins discovered // Nature. 2018. Yutin N., Koonin E. V. Proteorhodopsin genes in giant viruses // Biol. Direct. Biology Direct, 2012. Vol. 7, № 1. P. 1.
Luck M. et al. A photochromic histidine kinase rhodopsin (HKR1) that is bimodally switched by ultraviolet and blue light // J. Biol. Chem. 2012.
Yoshida K. et al. A unique choanoflagellate enzyme rhodopsin exhibits lightdependent cyclic nucleotide phosphodiesterase activity // J. Biol. Chem. 2017.
Gomez-Consarnau L. et al. Microbial rhodopsins are major contributors to the solar energy captured in the sea // Sci. Adv. 2019. Vol. 5, № 8.
Deisseroth K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience // Nature Neuroscience. 2015.
Gomez-Consarnau L. et al. Microbial rhodopsins are major contributors to the solar energy captured in the sea // Sci. Adv. 2019.
Zhang F. et al. Circuit-breakers: Optical technologies for probing neural signals and systems //
Nature Reviews Neuroscience. 2007.
53. Kato H.E. et al. Structural basis for Na + transport mechanism by a light-driven Na + pump // Nature. 2015. Vol. 521, № 7550. P. 48-53.
54. Nishimura N. et al. Distortion and a Strong Hydrogen Bond in the Retinal Chromophore Enable Sodium-Ion Transport by the Sodium-Ion Pump KR2 // J. Phys. Chem. B. 2019.
55. Tomida S. et al. Hydrogen-bonding network at the cytoplasmic region of a light-driven sodium pump rhodopsin KR2 // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 2018.
56. Zhang F. et al. The microbial opsin family of optogenetic tools // Cell. 2011.
57. Beja O. et al. Bacterial rhodopsin: Evidence for a new type of phototrophy in the sea // Science (80-. ). 2000. Vol. 289, № 5486. P. 1902-1906.
58. Kandori H. Retinal Proteins: Photochemistry and Optogenetics // Bull. Chem. Soc. Jpn. 2020. Vol. 93, № 1. P. 76-85.
59. Henderson R., Unwin P.N.T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy // Nature. 1975. Vol. 257, № 5521. P. 28-32.
60. Wickstrand C. et al. Bacteriorhodopsin: Would the real structural intermediates please stand up? // Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 2015.
61. Wickstrand C. et al. Bacteriorhodopsin: Structural Insights Revealed Using X-Ray Lasers and Synchrotron Radiation // Annu. Rev. Biochem. 2019.
62. Lanyi J.K. Bacteriorhodopsin // Annu. Rev. Physiol. 2004. Vol. 66, № 1. P. 665-688.
63. Chizhov I. et al. Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle // Biophys. J. Elsevier, 1996. Vol. 71, № 5. P. 2329-2345.
64. Hofrichter J., Henry E.R., Lozier R.H. Photocycles of bacteriorhodopsin in light- and dark-adapted purple membrane studied by time-resolved absorption spectroscopy // Biophys. J. 1989.
65. Landau E.M., Rosenbusch J.P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. Vol. 93, № 25. P. 14532-14535.
66. Pebay-Peyroula E. et al. X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases // Science (80-. ). 1997.
67. Luecke H., Richter H.T., Lanyi J.K. Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution // Science (80-. ). 1998.
68. Neutze R. et al. Bacteriorhodopsin: A high-resolution structural view of vectorial proton transport // Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 2002.
69. Royant A. et al. Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in the photocycle of bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406, № 6796. P. 645-648.
70. Schobert B. et al. Crystallographic structure of the K intermediate of bacteriorhodopsin:
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
Conservation of free energy after photoisomerization of the retinal // J. Mol. Biol. 2002. Luecke H. et al. Structural changes in bacteriorhodopsin during ion transport at 2 angstrom resolution // Science (80-. ). 1999.
Efremov R. et al. Time-resolved microspectroscopy on a single crystal of bacteriorhodopsin reveals lattice-induced differences in the photocycle kinetics // Biophys. J. 2006. Vol. 91, № 4. P. 1441-1451.
Kouyama T. et al. Crystal Structure of the L Intermediate of Bacteriorhodopsin: Evidence for Vertical Translocation of a Water Molecule during the Proton Pumping Cycle // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 335, № 2. P. 531-546.
Edmonds B.W., Luecke H. Atomic resolution structures and the mechanism of ion pumping in bacteriorhodopsin // Front Biosci. 2004. Vol. 9. P. 1556-1566.
Nango E. et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin // Science (80-. ). 2016. Vol. 354, № 6319. P. 1552-1557.
Borshchevskiy V. et al. Low-dose X-ray radiation induces structural alterations in proteins // Acta
Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2014. Vol. 70, № 10. P. 2675-2685.
Borshchevskiy V., Gordeliy V. Crystallization of Membrane Proteins: Merohedral Twinning of
Crystals // Modern Aspects of Bulk Crystal and Thin Film Preparation. 2012.
Zhang J. et al. Crystal structure of deltarhodopsin-3 from Haloterrigena thermotolerans // Proteins
Struct. Funct. Bioinforma. 2013. Vol. 81, № 9. P. 1585-1592.
Fu H.Y. et al. Insight into a single halobacterium using a dual-bacteriorhodopsin system with different functionally optimized pH ranges to cope with periplasmic pH changes associated with continuous light illumination // Mol. Microbiol. 2013.
Sudo Y. et al. A Microbial rhodopsin with a unique retinal composition shows both sensory
rhodopsin II and bacteriorhodopsin-like properties // J. Biol. Chem. 2011.
Chan S.K. et al. Crystal structure of cruxrhodopsin-3 from haloarcula vallismortis // PLoS One.
2014.
Vlasov A. V. et al. Raman scattering: From structural biology to medical applications // Crystals. 2020.
Chow B.Y. et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps // Nature. 2010.
Beja O. et al. Bacterial rhodopsin: Evidence for a new type of phototrophy in the sea // Science (80-. ). 2000.
Martinez-Garcia M. et al. High-throughput single-cell sequencing identifies photoheterotrophs and chemoautotrophs in freshwater bacterioplankton // ISME J. 2012.
86. Venter J.C. et al. Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea // Science (80. ). 2004.
87. Slamovits C.H., Keeling P.J. Contributions of Oxyrrhis marina to molecular biology, genomics and organelle evolution of dinoflagellates // J. Plankton Res. 2011.
88. Gomez-Consarnau L. et al. Light stimulates growth of proteorhodopsin-containing marine Flavobacteria // Nature. 2007.
89. Gomez-Consarnau L. et al. Proteorhodopsin phototrophy promotes survival of marine bacteria during starvation // PLoS Biol. 2010.
90. Man D. et al. Diversification and spectral tuning in marine proteorhodopsins // EMBO J. 2003.
91. Ozaki Y. et al. A color-determining amino acid residue of proteorhodopsin // Biochemistry. 2014.
92. Dioumaev A.K. et al. Proton transfers in the photochemical reaction cycle of proteorhodopsin // Biochemistry. 2002.
93. Lorinczi É. et al. Voltage- and pH-Dependent Changes in Vectoriality of Photocurrents Mediated by Wild-type and Mutant Proteorhodopsins upon Expression in Xenopus Oocytes // J. Mol. Biol. 2009.
94. Vârô G. et al. Characterization of the photochemical reaction cycle of proteorhodopsin // Biophys. J. 2003.
95. Lakatos M. et al. The photochemical reaction cycle of proteorhodopsin at low pH // Biophys. J. 2003.
96. Ran T. et al. Cross-protomer interaction with the photoactive site in oligomeric proteorhodopsin complexes // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013.
97. Petrovskaya L.E. et al. ESR — A retinal protein with unusual properties from Exiguobacterium sibiricum // Biochem. 2015. Vol. 80, № 6. P. 688-700.
98. Balashov S.P. et al. Aspartate-histidine interaction in the retinal schiff base counterion of the light-driven proton pump of Exiguobacterium sibiricum // Biochemistry. 2012. Vol. 51, № 29. P. 5748-5762.
99. Petrovskaya L.E. et al. Predicted bacteriorhodopsin from Exiguobacterium sibiricum is a functional proton pump // FEBS Lett. 2010.
100. Kato H.E. et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel // Nature. 2012. Vol. 482, № 7385. P. 369-374.
101. Dioumaev A.K. et al. Photocycle of exiguobacterium sibiricum rhodopsin characterized by low-temperature trapping in the IR and time-resolved studies in the visible // J. Phys. Chem. B. 2013. Vol. 117, № 24. P. 7235-7253.
102. Harris A. et al. A new group of eubacterial light-driven retinal-binding proton pumps with an
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
unusual cytoplasmic proton donor // Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. Elsevier B.V., 2015. Vol. 1847, № 12. P. 1518-1529.
Sudo Y., Yoshizawa S. Functional and Photochemical Characterization of a Light-Driven Proton Pump from the Gammaproteobacterium Pantoea vagans // Photochem. Photobiol. 2016. Vol. 92, № 3. P. 420-427.
Balashov S.P. et al. Xanthorhodopsin: a proton pump with a light-harvesting carotenoid antenna. // Science. American Association for the Advancement of Science, 2005. Vol. 309, № 5743. P. 2061-2064.
Balashov S.P. et al. Reconstitution of gloeobacter rhodopsin with echinenone: Role of the 4-Keto group // Biochemistry. 2010.
Koh E.Y. et al. Proteorhodopsin-bearing bacteria in Antarctic sea ice // Appl. Environ. Microbiol. 2010.
Tsukamoto T. et al. Thermal and Spectroscopic Characterization of a Proton Pumping Rhodopsin from an Extreme Thermophile // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 30. P. 21581-21592. Kanehara K. et al. A phylogenetically distinctive and extremely heat stable light-driven proton pump from the eubacterium Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 T // Sci. Rep. 2017. Brown L.S. Fungal rhodopsins and opsin-related proteins: eukaryotic homologues of bacteriorhodopsin with unknown functions // Photochem. Photobiol. Sci. 2004. Vol. 3, № 6. P. 555.
Waschuk S.A. et al. Leptosphaeria rhodopsin: Bacteriorhodopsin-like proton pump from a eukaryote // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. Vol. 102, № 19. P. 6879-6883.
Tsunoda S.P. et al. H+-Pumping Rhodopsin from the Marine Alga Acetabularia // Biophys. J. 2006. Vol. 91, № 4. P. 1471-1479.
Wada T. et al. Crystal structure of the eukaryotic light-driven proton-pumping rhodopsin, Acetabularia rhodopsin II, from marine alga // J. Mol. Biol. 2011.
Kawanabe A. et al. An inward proton transport using anabaena sensory rhodopsin // Journal of Microbiology. 2011.
Ugalde J.A. et al. Xenorhodopsins, an enigmatic new class of microbial rhodopsins horizontally transferred between archaea and bacteria // Biol. Direct. 2011.
Fudim R. et al. Design of a light-gated proton channel based on the crystal structure of Coccomyxa rhodopsin // Sci. Signal. 2019. Vol. 12, № 573. P. eaav4203.
Weinert T. et al. Proton uptake mechanism in bacteriorhodopsin captured by serial synchrotron crystallography // Science (80-. ). 2019.
Nango E. et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin // Science
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
(80-. ). 2016.
Gerwert K., Freier E., Wolf S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins // Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 2014. Vol. 1837, № 5.
Yoshizawa S. et al. Functional characterization of flavobacteria rhodopsins reveals a unique class of light-driven chloride pump in bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. 2014. Vol. 111, № 18. P. 67326737.
Balashov S.P. et al. Light-driven Na+pump from Gillisia limnaea: A high-affinity Na+binding site is formed transiently in the photocycle // Biochemistry. 2014.
Bertsova Y. V, Bogachev A. V, Skulachev V.P. Proteorhodopsin from Dokdonia sp. PRO95 is a light-driven Na+-pump // Biochem. 2015. Vol. 80, № 4. P. 449-454.
Sasaki J. et al. Conversion of bacteriorhodopsin into a chloride ion pump // Science (80-. ). 1995. Kolbe M. Structure of the Light-Driven Chloride Pump Halorhodopsin at 1.8 Å Resolution // Science (80-. ). 2000. Vol. 288, № 5470. P. 1390-1396.
Kouyama T. et al. Crystal Structures of the L 1 , L 2 , N, and O States of pharaonis Halorhodopsin // Biophys. J. 2015. Vol. 108, № 11. P. 2680-2690.
Song Y., Gunner M.R. Halorhodopsin pumps Cl- and bacteriorhodopsin pumps protons by a common mechanism that uses conserved electrostatic interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014.
Muroda K. et al. Protein-bound water as the determinant of asymmetric functional conversion between light-driven proton and chloride pumps // Biochemistry. 2012.
Gmelin W. et al. The Crystal Structure of the L1 Intermediate of Halorhodopsin at 1.9 Â Resolution! // Photochem. Photobiol. 2007. Vol. 83, № 2. P. 369-377.
Lanyi J.K., Vodyanoy V. Flash Spectroscopic Studies of the Kinetics of the Halorhodopsin Photocycle // Biochemistry. 1986.
Chizhov I., Engelhard M. Temperature and halide dependence of the photocycle of halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis // Biophys. J. 2001. Vol. 81, № 3. P. 1600-1612. Hasemi T. et al. Characterization of a cyanobacterial chloride-pumping rhodopsin and its conversion into a proton pump // J. Biol. Chem. 2016. Vol. 291, № 1.
Niho A. et al. Demonstration of a Light-Driven SO42- Transporter and Its Spectroscopic Characteristics // J. Am. Chem. Soc. 2017.
Inoue K. et al. Spectroscopic study of a light-driven chloride ion pump from marine bacteria // J. Phys. Chem. B. 2014.
Yun J.H. et al. Non-cryogenic structure of a chloride pump provides crucial clues to temperature-
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
dependent channel transport efficiency // J. Biol. Chem. 2019.
Harz H., Hegemann P. Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas // Nature. 1991. Ehlenbeck S. et al. Evidence for a light-induced H+ conductance in the eye of the green alga Chlamydomonas reinhardtii // Biophys. J. 2002.
Bohm M. et al. Channelrhodopsin-1 phosphorylation changes with phototactic behavior and responds to physiological stimuli in chlamydomonas // Plant Cell. 2019.
Boyden E.S. et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity // Nat. Neurosci. 2005.
Zhang F. et al. Red-shifted optogenetic excitation: A tool for fast neural control derived from Volvox carteri // Nat. Neurosci. 2008.
Klapoetke N.C. et al. Independent optical excitation of distinct neural populations // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 3. P. 338-346.
Yizhar O. et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction // Nature. 2011. Vol. 477, № 7363. P. 171-178.
Lin J.Y. et al. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics // Biophys. J. 2009. Vol. 96, № 5. P. 1803-1814.
Marshel J.H. et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception // Science (80. ). 2019. Vol. 365, № 6453. P. eaaw5202.
Sineshchekov O.A. et al. Rhodopsin-mediated photoreception in cryptophyte flagellates // Biophys. J. 2005.
Govorunova E.G. et al. The Expanding Family of Natural Anion Channelrhodopsins Reveals Large Variations in Kinetics, Conductance, and Spectral Sensitivity // Sci. Rep. 2017. Eisenhauer K. et al. In channelrhodopsin-2 Glu-90 is crucial for ion selectivity and is deprotonated during the photocycle // J. Biol. Chem. 2012.
Wietek J. et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel // Science (80. ). 2014. Vol. 344, № 6182. P. 409-412.
Kim Y.S. et al. Crystal structure of the natural anion-conducting channelrhodopsin GtACR1 // Nature. 2018. Vol. 561, № 7723.
Li H. et al. Crystal structure of a natural light-gated anion channelrhodopsin // Elife. 2019. Vol. 8.
Sineshchekov O.A. et al. Photochemical reaction cycle transitions during anion channelrhodopsin gating // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016.
Sineshchekov O.A. et al. Gating mechanisms of a natural anion channelrhodopsin // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015.
151. Kuhne J. et al. Unifying photocycle model for light adaptation and temporal evolution of cation conductance in channelrhodopsin-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019.
152. Bork P. et al. Tara Oceans studies plankton at Planetary scale // Science. 2015.
153. Gregory A.C. et al. Marine DNA Viral Macro- and Microdiversity from Pole to Pole // Cell. 2019.
154. Nack M. et al. The DC gate in channelrhodopsin-2: Crucial hydrogen bonding interaction between C128 and D156 // Photochem. Photobiol. Sci. 2010.
155. Kato H.E. et al. Structural mechanisms of selectivity and gating in anion channelrhodopsins // Nature. 2018.
156. Oda K. et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 3949.
157. Parkinson J.S., Hazelbauer G.L., Falke J.J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update // Trends in Microbiology. 2015.
158. Gordeliy V.I. et al. Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex // Nature. 2002. Vol. 419, № 6906. P. 484-487.
159. Sasaki J., Spudich J.L. Signal transfer in haloarchaeal sensory rhodopsin-transducer complexes // Photochemistry and Photobiology. 2008.
160. Bogomolni R.A. et al. Removal of transducer HtrI allows electrogenic proton translocation by sensory rhodopsin I // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994.
161. Iwamoto M. et al. Light-induced proton uptake and release of pharaonis phoborhodopsin detected by a photoelectrochemical cell // J. Phys. Chem. B. 1999.
162. Sasaki J., Spudich J.L. Proton circulation during the photocycle of sensory rhodopsin II // Biophys. J. 1999.
163. Schmies G. et al. Sensory rhodopsin II from the haloalkaliphilic Natronobacterium pharaonis: Light-activated proton transfer reactions // Biophys. J. 2000. Vol. 78, № 2. P. 967-976.
164. Schmies G. et al. Electrophysiological characterization of specific interactions between bacterial sensory rhodopsins and their transducers // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001.
165. Sudo Y., Spudich J.L. Three strategically placed hydrogen-bonding residues convert a proton pump into a sensory receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006.
166. Luecke H. et al. Crystal structure of sensory rhodopsin II at 2.4 angstroms: Insights into color tuning and transducer interaction // Science (80-. ). 2001.
167. Royant A. et al. X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1-Â resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001.
168. Edman K. et al. Early structural rearrangements in the photocycle of an integral membrane sensory receptor // Structure. 2002.
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
Gushchin I. et al. Active state of sensory rhodopsin II: Structural determinants for signal transfer and proton pumping // J. Mol. Biol. 2011. Vol. 412, № 4. P. 591-600.
Moukhametzianov R. et al. Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer // Nature. 2006. Vol. 440, № 7080. P. 115-119.
Wegener A.A. et al. Time-resolved detection of transient movement of helix F in spin-labelled pharaonis sensory rhodopsin II // J. Mol. Biol. 2000.
Parkinson J.S. Signaling Mechanisms of HAMP domains in chemoreceptors and sensor kinases // Annual Review of Microbiology. 2010.
Bordignon E. et al. Structural analysis of a HAMP domain: The linker region of the
phototransducer in complex with sensory rhodopsin II // J. Biol. Chem. 2005.
Doebber M. et al. Salt-driven equilibrium between two conformations in the HAMP domain from
Natronomonas pharaonis: The language of signal transfer? // J. Biol. Chem. 2008.
Hayashi K. et al. Structural analysis of the phototactic transducer protein HtrII linker region from
Natronomonas pharaonis // Biochemistry. 2007.
Gushchin I. et al. Mechanism of transmembrane signaling by sensor histidine kinases // Science (80-. ). 2017. Vol. 356, № 6342. P. eaah6345.
Jung K.-H., Trivedi V.D., Spudich J.L. Demonstration of a sensory rhodopsin in eubacteria // Mol. Microbiol. 2003. Vol. 47, № 6. P. 1513-1522.
Vogeley L. et al. Anabaena sensory rhodopsin: A photochromic color sensor at 2.0 Ä // Science (80-. ). 2004.
Dong B., Sanchez-Magraner L., Luecke H. Structure of an Inward Proton-Transporting Anabaena Sensory Rhodopsin Mutant: Mechanistic Insights // Biophys. J. 2016.
Irieda H. et al. Photo-induced regulation of the chromatic adaptive gene expression by Anabaena sensory rhodopsin // J. Biol. Chem. 2012.
Vogeley L. et al. Crystal Structure of the Anabaena Sensory Rhodopsin Transducer // J. Mol. Biol. 2007.
Kondoh M. et al. Transient dissociation of the transducer protein from anabaena sensory rhodopsin concomitant with formation of the m state produced upon photoactivation // J. Am. Chem. Soc. 2011.
Wang S. et al. A eukaryotic-like interaction of soluble cyanobacterial sensory rhodopsin transducer with dna // J. Mol. Biol. 2011.
Kim S.Y. et al. A role of Anabaena sensory rhodopsin transducer (ASRT) in photosensory transduction // Mol. Microbiol. 2014.
Kateriya S. et al. 'Vision' in single-celled algae // News in Physiological Sciences. 2004.
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
Kateriya S. 'Vision' in Single-Celled Algae // News Physiol. Sci. 2004. Vol. 19, № 3. P. 133137.
Dunin-Horkawicz S., Lupas A.N. Comprehensive analysis of HAMP domains: Implications for transmembrane signal transduction // J. Mol. Biol. 2010.
Lamarche L.B. et al. Purification and Characterization of RhoPDE, a Retinylidene/Phosphodiesterase Fusion Protein and Potential Optogenetic Tool from the Choanoflagellate Salpingoeca rosetta // Biochemistry. 2017.
Pandit J. et al. Mechanism for the allosteric regulation of phosphodiesterase 2A deduced from the X-ray structure of a near full-length construct // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Avelar G.M. et al. A Rhodopsin-Guanylyl cyclase gene fusion functions in visual perception in a fungus // Curr. Biol. Elsevier, 2014. Vol. 24, № 11. P. 1234-1240.
Rauch A. et al. Crystal structure of the guanylyl cyclase Cya2 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008.
Scheib U. et al. The rhodopsin-guanylyl cyclase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii enables fast optical control of cGMP signaling // Sci. Signal. 2015.
Lopez J.L. et al. Microbial and viral-like rhodopsins present in coastal marine sediments from four polar and subpolar regions // FEMS Microbiol. Ecol. 2017.
Philosof A., Beja O. Bacterial, archaeal and viral-like rhodopsins from the Red Sea // Environ. Microbiol. Rep. 2013.
Feldbauer K. et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. Vol. 106, № 30. P. 12317-12322.
Lu Y. et al. Crystal structure of heliorhodopsin 48C12 // Cell Res. 2020. Vol. 30, № 1. P. 88-90. Shibukawa A. et al. Photochemical Characterization of a New Heliorhodopsin from the GramNegative Eubacterium Bellilinea caldifistulae (BcHeR) and Comparison with Heliorhodopsin-48C12 // Biochemistry. 2019.
Singh M. et al. Anion binding to mutants of the Schiff base counterion in heliorhodopsin 48C12 // Phys. Chem. Chem. Phys. 2019.
Ray L.B. Silencing neurons using optogenetics // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science (AAAS), 2015. Vol. 349, № 6248. P. 598-598. Barnett S.C. et al. Optogenetic stimulation: Understanding memory and treating deficits // Hippocampus. 2018. Vol. 28, № 7. P. 457-470.
Ostrovsky M.A., Kirpichnikov M.P. Prospects of Optogenetic Prosthesis of the Degenerative Retina of the Eye // Biochemistry (Moscow). Pleiades Publishing, 2019. Vol. 84, № 5. P. 479490.
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
Chang R.B. Optogenetic Control of the Peripheral Nervous System // Cold Spring Harb. Perspect. Med. Cold Spring Harbor Laboratory, 2019. Vol. 9, № 12. P. a034397.
Boyle P.M., Karathanos T. V., Trayanova N.A. Cardiac Optogenetics 2018 // JACC: Clinical Electrophysiology. Elsevier Inc, 2018. Vol. 4, № 2. P. 155-167.
Johnson H.E., Toettcher J.E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics // Current Opinion in Biotechnology. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 52. P. 42-48. Deiters A. Special Issue on Optochemical and Optogenetic Control of Cellular Processes // ChemBioChem. 2018. Vol. 19, № 12. P. 1198-1200.
Inoue K. et al. Converting a Light-Driven Proton Pump into a Light-Gated Proton Channel // J. Am. Chem. Soc. American Chemical Society, 2015. Vol. 137, № 9. P. 3291-3299. Vogt A. et al. Conversion of a light-driven proton pump into a light-gated ion channel // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5. P. 1-13.
Gradinaru V. et al. Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics // Cell. 2010.
Berndt A. et al. Bi-stable neural state switches // Nat. Neurosci. 2009. Vol. 12, № 2. P. 229-234. Gunaydin L A. et al. Ultrafast optogenetic control // Nat. Neurosci. 2010. Vol. 13, № 3. P. 387392.
Kleinlogel S. et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh // Nat. Neurosci. 2011. Vol. 14, № 4. P. 513-518. Berndt A. et al. Structure-guided transformation of channelrhodopsin into a light-activated chloride channel // Science (80-. ). 2014. Vol. 344, № 6182. P. 420-424.
Berndt A. et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016.
Lin J.Y. et al. ReaChR: A red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation // Nat. Neurosci. 2013. Vol. 16, № 10. P. 1499-1508. Sineshchekov O.A. et al. Bacteriorhodopsin-like channelrhodopsins: Alternative mechanism for control of cation conductance // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2017.
Scheib U. et al. Rhodopsin-cyclases for photocontrol of cGMP/cAMP and 2.3 Âstructure of the adenylyl cyclase domain // Nat. Commun. 2018.
Mukherjee S., Hegemann P., Broser M. Enzymerhodopsins: novel photoregulated catalysts for optogenetics // Current Opinion in Structural Biology. 2019.
Grimm C. et al. Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the
engineered light-driven sodium pump eKR2 // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 9316.
Racker E., Stoeckenius W. Reconstitution of purple membrane vesicles catalyzing light driven
proton uptake and adenosine triphosphate formation // J. Biol. Chem. 1974.
220. Henderson R. et al. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy // J. Mol. Biol. 1990.
221. Lozier R.H., Bogomolni R.A., Stoeckenius W. Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium // Biophys. J. 1975.
222. Dencher N., Wilms M. Flash photometric experiments on the photochemical cycle of bacteriorhodopsin // Biophys. Struct. Mech. 1975.
223. Bagley K. et al. Fourier transform infrared difference spectroscopy of bacteriorhodopsin and its photoproducts. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1982.
224. Kandori H. Hydration switch model for the proton transfer in the Schiff base region of bacteriorhodopsin // Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 2004.
225. Faham S., Bowie J.U. Bicelle crystallization: A new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure // J. Mol. Biol. 2002.
226. Takeda K. et al. A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained by successive fusion of the vesicular assemblies // J. Mol. Biol. 1998.
227. Cherezov V. et al. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2004.
228. Cherezov V., Caffrey M. Membrane protein crystallization in lipidic mesophases. A mechanism study using X-ray microdiffraction // Faraday Discuss. 2007.
229. Cherezov V. et al. High-resolution crystal structure of an engineered human p2-adrenergic G protein-coupled receptor // Science (80-. ). 2007.
230. Lee S.C. et al. Steroid-based facial amphiphiles for stabilization and crystallization of membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013.
231. Polovinkin V. et al. High-Resolution Structure of a Membrane Protein Transferred from Amphipol to a Lipidic Mesophase // J. Membr. Biol. 2014.
232. Nikolaev M. et al. Integral Membrane Proteins Can Be Crystallized Directly from Nanodiscs // Cryst. Growth Des. 2017.
233. Broecker J., Eger B.T., Ernst O.P. Crystallogenesis of Membrane Proteins Mediated by Polymer-Bounded Lipid Nanodiscs // Structure. 2017.
234. Nogly P. et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser // Science (80-. ). 2018. Vol. 361, № 6398.
235. Nass Kovacs G. et al. Three-dimensional view of ultrafast dynamics in photoexcited bacteriorhodopsin // Nat. Commun. 2019.
236. KASHIMA T., WATARI T., MIKUBO H. [Raman spectra and structure of molecular addition
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
compound of aminopyrine and barbital in aqueous solution]. // Eisei Shikenjo Hokoku. 1961. Vol. 79. P. 59-63.
Tobin M.C. Raman spectra of crystalline lysozyme, pepsin, and alpha chymotrypsin // Science (80-. ). 1968. Vol. 161, № 3836. P. 68-69.
Lord R.C., Yu N.T. Laser-excited Raman spectroscopy of biomolecules. II. Native ribonuclease and a-chymotrypsin // J. Mol. Biol. 1970. Vol. 51, № 2. P. 203-213.
Rimai L., Kilponen R.G., Gill D. Resonance-enhanced raman spectra of visual pigments in intact bovine retinas at low temperatures // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. Vol. 41, № 2. P. 492-497.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.