Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Ефремов, Руслан Геннадьевич

• Ефремов, Руслан Геннадьевич
• кандидат физико-математических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Ефремов, Руслан Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Ретиналь содержащие белки галофильных архебактерий.

1.1.1. Функции и биологическое место.

1.1.2. Общая характеристика и свойства ретиналевых белков Н. salinarum.

1.2. Бактериородопсин.

1.2.1. Исторический обзор и общая характеристика.

1.2.2. Фотоцикл бактериородопсина.

1.2.3. Стабилизация промежуточных состояний.

1.2.4. Кристаллографические структуры основного и промежуточных состояний BR

1.2.5. Модели транспорта протона.

1.3. Сенсорный родопсин II из Natronobacterium pharaonis.

1.3.1. Структура и фотоцикл SRII.

1.3.2. Взаимодействие с трансдьюсерным белком и передача сигнала.

1.4. Кристаллизация мембранных белков в липидной кубической фазе.

1.4.1. Особенности кристаллизации мембранных белков.

1.4.2. Липидная кубическая фаза.

1.4.3. Методика кристаллизации в липидной кубической фазе.

1.4.4. Механизм кристаллизации в кубической фазе.

1.5. Мероэдрическое двойниковапие белковых кристаллов.

1.6. Текущие проблемы и противоречия в исследовании BR и SRII.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах»

3.2. Изучение эволюции параметров липидной фазы в процессе кристаллизации с помощью дифракции нейтронов.59

3.2.1. Идентификация фазы.59

3.2.2. Медленная кинетика.60

3.2.3. Быстрая кинетика.62

3.3. Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения раствор/липид.63

3.4. Влияние моноглицерида: кристаллизация в МО, MB и MP.66

3.5. Влияние октилглюкозида.67

3.6. Влияние концентрации белка и рН.68

3.7. Обсуждение.68

3.8. Двойникование и скорость роста кристаллов.70

3.9. Расщепление двойниковых кристаллов на одиночные.71

3.10. Структура двойниковых кристаллов и модель возникновения двойникования . 74

3.11. Основные результаты и выводы.75

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА КРИСТАЛЛОВ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ФИКСАЦИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ В КРИСТАЛЛЕ ДЛЯ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА

4.1. Введение.78

4.2. Спектроскопия кристаллов BR.78

4.2.1. Характеристика основного состояния в кристалле.78

4.2.2. Характеристика фотоцикла BR в кристалле с помощью видимой и ИК-Фурье спектроскопии с разрешением по времени.80

4.3. Фиксация и характеристика промежуточных низкотемпературных состояний в кристаллах BR.85

4.3.1. К состояние.85

4.3.2. L и М состояния.86

4.3.3. N состояние.89

4.4. Обсуждение.91

4.5. Рентгеноструктурные данные основного и промежуточных состояний кристаллов BR.94

4.6. Спектроскопия кристаллов SRII в комплексе с Htrll.95

4.6.1. Спектр поглощения и фотоцикл.95

4.6.2. Фиксация и характеристика К состояния.97

4.6.3. Фиксация и характеристика М состояния.98

4.7. Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса SRII/Htrll.102

4.8. Основные результаты.104

4.9. Основные выводы.105

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ.107

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.109

ВВЕДЕНИЕ

Способность живых организмов эффективно преобразовывать энергию из одного вида в другой, является одним из условий, обеспечивающих сохранение и распространение жизни. Синтез наиболее распространенного переносчика энергии в живых системах - афденозин-трифосфата (АТФ) требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, синтезирующих АТФ. Градиент электрохимического потенциала создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных и фотохимических реакций [1]. Простейшим и наиболее исследованным ферментом, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал является бактериородопин (BR). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное пространство. BR благодаря ряду свойств: доступности в больших количествах, простоте очистки и стабильности; в течение последних 30 лет был одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков [2].

Гомологичный BR сенсорный родопсин II (SRII) является фоторецептором синего света, активирующим двухкомпонентный сигнальный каскад, который является одним из самых распространенных в природе. Данная сигнальная цепь регулирует работу флагеллярного мотора и позволяет археи избегать интенсивного синего и УФ освещения, вызывающего фотоокисление и разрушение организма [3]. Актуальность. Детальные механизмы транспорта протона BR и передачи сигнала SRII остаются непонятым до конца и противоречивыми [4;5]. Причиной этого является недостаточная точность и неполнота структурной информации, поскольку для понимания молекулярных механизмов функционирования белков необходимо знать какие структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, сопровождают рабочий цикл белков и приводят к направленному транспорту протона или передачи сигнала. Одно из возможных решений данной проблемы состоит в получении молекулярных структур основного и промежуточных состояний рабочего цикла BR и SRII, причем, структуры BR должны включать атомы водорода. Данная задача может быть решена с помощью рентгеновской кристаллографии при наличии высокоупорядочепных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и методов его фиксирования в промежуточных состояниях, с другой.

Цель работы заключалась в улучшении дифракционного качества белковых кристаллов, выращенных в липидной кубической фазе, исследовании влияния кристаллического окружения белков на их функциональность спектроскопическими методами и определении условий фиксирования промежуточных состояний белков в кристаллах при низких температурах.

Состояние исследуемых проблем. Кристаллы BR, позволившие определить структуру белка на молекулярном уровне, были получены в результате нового подхода, заключающегося в использовании липидной кубической фазы для кристаллизации мембранных белков. Свойства кубической фазы, определяющие успех кристаллизации, в настоящее время активно изучаются с целью определения механизма кристаллизации белков в этой системе и оценки потенциала данного подхода для кристаллизации мембранных белков [6].

Кристаллизация в кубической фазе позволила получить структуру основного и промежуточных состояний BR с разрешением, достигающим 1.55 А. В результате были определены детали структурных изменений, сопровождающих фотоцикл, как, например, переориентация аминокислотных остатков и движение молекул воды [7]. Однако, структуры некоторых из промежуточных состояний, полученных разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмам переноса протона [8]. Причинами этого являются: недостаточно высокое разрешение дифракционных данных, мероэдрическое двойникование кристаллов, понижающее информативность дифракционных данных, и недостаточно полная характеристика промежуточных состояний при условиях сбора дифракционных данных с белковых кристаллов.

Структура SRII, а также его комплекса с трансдюсерным белком, были определены с помощью рентгеноструктурного анализа, однако, их структура в сигнальном состоянии остается неизвестной.

Научная новизна работы. В работе впервые применен метод дифракции нейтронов для изучения механизма кристаллизации в кубической фазе. Благодаря этому оказалось возможным исследование эволюции свойств липидной фазы в процессе кристаллизации и роста кристаллов на одних и тех же образцах.

В процессе оптимизации кристаллизационных условий было обнаружено, что концентрация детргента является важным кристаллизационным параметром, и ее оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное качество кристаллов и воспроизводимость кристаллизационных экспериментов.

В данной работе впервые продемонстрировано, что двойниковые кристаллы белка могут быть расщеплены на одиночные без нарушения кристаллической структуры. Предложенный подход позволил получить кристалл BR без двойпикования, с которого были собраны дифракционные данные с разрешением 1.35А.

В результате разработки нового экспериментального оборудования впервые удалось провести спектроскопические эксперименты с микросекундным временным разрешением в инфракрасном диапазоне на белковых микрокристаллах. Это дало возможность установить влияние кристаллического окружения и упаковки белков на их функциональность. В комбинации с низкотемпературной спектроскопией данный подход позволил наиболее детальную характеристику зафиксированных в кристалле промежуточных состояний.

Практическая ценность работы. Работа представляет общий интерес для белковой кристаллографии. В частности, результаты исследования механизма кристаллизации в кубической фазе представляются важными для кристаллизации и развития методики кристаллизации мембранных белков. Новые подходы к решению проблем двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения двойникования белковых кристаллов.

Развитые в работе методики характеристики белковых кристаллов спектроскопическими методами представляют интерес для кристаллографических исследований механизмов функционирования белков, поскольку позволяют сравнивать химические и структурные изменения, сопровождающие функционирование белков в кристалле, с изменениями, сопровождающими их функции в естественном окружении. Кроме того, данные результаты могут найти применение в видимой и инфракрасной микроспектроскопии, в частности, для исследования биологических тканей и отдельных клеток. Также микроспектроскопия в комбинации с проточной кюветой может найти применение в исследованиях нециклических биореакций.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав и заключения. Первая глава представляет литературный обзор, в котором показано, какое место исследуемые в работе белки, археродопсипы, занимают в биологическом пространстве. Детально рассмотрено современное представление о механизмах функционирования

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Ефремов, Руслан Геннадьевич

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

1. В результате исследования поведения липидной кубической фазы в процессе кристаллизации BR с помощью дифракции нейтронов показано: а) кубическая фаза сохраняет симметрию в течение всего процесса кристаллизации; б) структурные изменения липидной фазы, сопровождающие инициацию кристаллизации намного быстрее самого процесса кристаллизации.

2. Установлено, что концентрация детергента является важным кристаллизационным параметром. Ее оптимальный выбор позволил получить кристаллы BR, дающие дифракцию до разрешения 1.2 А.

3. В результате систематических исследований двойникования кристаллов BR, обнаружена корреляция фактора двойникования со скоростью роста кристаллов. Показано, что при замедлении роста, количество кристаллов без двойникования увеличивается.

4. Впервые показано, что двойниковые домены могут быть разделены без потери дифракционного качества, что позволило определить устройство двойниковых кристаллов и получить кристаллы BR без двойникования, дающие дифракцию до разрешения 1.35 А.

5. Развиты спектроскопические методики для характеристики кристаллов белков, позволяющие проведение экспериментов в видимом и ИК диапазонах с микросекундным временным разрешением на образцах с размером -100 мкм.

6. Исследование кристаллов BR и комплекса SRII с Htrll спектроскопическими методами в видимом и ИК диапазонах продемонстрировало: а. BR функционален в кристаллах, однако кристаллическое окружение существенно изменяет кинетику фотоцикла. При этом структурные изменения, сопровождающие промежуточные состояния, одинаковы в ПМ и кристалле. б. Кристаллическое окружение комплекса SRII/Htrll приводит к уменьшению амплитуды структурных изменений, сопровождающих формирование М состояния, однако не изменяет их характер.

7. Сформулированы процедуры фиксирования низкотемпературных промежуточных состояний фотоцикла BR и комплекса SRII/Htrll в кристаллах, которые были использованы для получения структуры К и М состояний комплекса, что впервые позволило получить структурную информацию о передаче сигнала между трансмембранными белками.

Благодарности

В заключение мне бы хотелось поблагодарить моего научного руководителя Горделия Валентина Ивановича, за постановку научных задач и предоставленную свободу для их решения. Я искренне благодарен Георгу Бюлдту за предоставленную возможность выполнить работу в Институте структурной биологии Исследовательского центра г.Юлиха, за постоянную поддержку и продуктивные научные дискуссии. Также выражаю свою признательность Иохиму Хеберле за консультации и помощь в проведении спектроскопических экспериментов на белковых кристаллах. Мне приятно поблагодарить сотрудников Лаборатории нейтронной физики ОИЯИ: Ширяеву Гею Николаевну, Исламова Ахмеда Хусаиновича и Куклина Александра Ивановича, совместно с которыми были выполнены эксперименты по изучению механизма кристаллизации в кубической фазе. За техническую поддержку я благодарен Кристиану Бекену и Саше Неману. За неизменную поддержку в течение обучения в МФТИ хочется поблагодарить кафедру Молекулярной биологии и деканат ФМБФ. Выражаю признательность Льву Сергеевичу Ягужинскому, за ценные научные дискуссии и моральную поддержку. Я сердечно благодарен Diane Barrier за вдохновение, а также моим родителям.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Ефремов, Руслан Геннадьевич, 2005 год

1. Nelson,D.L. Сох,М.М. (2000) Lehninger Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York.

2. Lanyi,J.K. (2000) Bacteriorhodopsin Biochim Biophys Acta 1460,1-3.

3. Engelhard,M., Schmies,G. Wegener,A.A. (2003) Arhebacterial phototaxis (Batschauer,A., ed.), pp. 2-39. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK.

4. Lanyi,J.K. Schobert,B. (2004) Local-global conformational coupling in a heptahelical membrane protein: Transport mechanism from crystal structures of the nine states in the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 43,3-8.

5. Facciotti,M.T., Rouhani,S. Glaeser,R.M. (2004) Crystal structures of bR(D85S) favor a model of bacteriorhodopsin as a hydroxyl-ion pump FEBSLett. 564,301-306.

6. Caffrey,M. (2003) Membrane protein crystallization Journal of Structural Biology 142, 108-132.

7. Sass,H.J. et al. (2000) Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin Nature 406,649-653.

8. LanyijJ.K. (2004) What is the real crystallographic structure of the L photointermediate of bacteriorhodopsin? Biochim Biophys Acta 1658, 14-22.

9. Oesterhelt,D. Stoeckenius,W. (1971) Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium Nat New Biol 233, 149-152.

10. Falke,J.J. Hazelbauer,G.L. (2001) Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors Trends Biochem Set 26,257-265.

11. Spudich,J.L., Yang,C.S., Jung,K.H. Spudich,E.N. (2000) Retinyldene Proteins: Structure and function from Archea to Humans лим. Rev. CellDev. Biol. 16,365-392.

12. Beja,0. et al. (2000) Bacterial rhodopsin: evidence for a new type of phototrophy in the SQdi Science Ш% 1902-1906.

13. Bieszke,J.A., Spudich,E.N., Scott,K.L., Borkovich,K.A. Spudich,J.L. (1999) A eukaryotic protein, NOP-1, binds retinal to form an archaeal rhodopsin-like photochemically reactive pigment Biochemistry 38,14138-14145.

14. Venter, J.C. et al. (2004) Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea Science 304,66-74.

15. Brown,L.S. (2004) Fungal rhodopsins and opsin-related proteins: eukaryotic homologues of bacteriorhodopsin with unknown functions Photochem. Photobiol. Sci. 3, 555-565.

16. Waschuk,S.A., Bezerra,A.G., Jr., Shi,L. Brown,L.S. (2005) From the Cover: Leptosphaeria rhodopsin: Bacteriorhodopsin-like proton pump from a eukaryote Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 102,6879-6883.

17. Ihara,K. et al. (1999) Evolution of the archaeal rhodopsins: evolution rate changes by gene duplication and functional differentiation J M»/ Biol 285,163-174.

18. Luecke,H., Schobert,B., Richter,H-T., Cartailler,J.P. Lanyi,J.K. (1999) Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution J Mol Biol 291,899-911.

19. Hayashi,S. et al. (2001) Structural determinants of spectral tuning in retinal proteinsbacteriorhodopsin vs sensory rhodopsin II Journal of Physical Chemistry В 105,1012410131.

20. Henderson,R. (1975) The structure of the риф1е membrane from Halobacterium hallobium: analysis of the X-ray diffraction pattern J Mo/. Biol. 93,123-138.

21. Oesterhelt,D. Stoeckenius,W. (1973) Functions of a new photoreceptor membrane Proc Natl AcadSci USA 70,2853-2857.

22. Krebs,M.P. Isenbarger,T.A. (2000) Structural determinants of purple membrane assembly Вiochim Вiophys Acta 1460,15-26.

23. Birge,R.R. (1990) Nature of the primary photochemical events in rhodopsin and bacteriorhodopsin Biochim Biophys Acta 1016,293-327.

24. Hamm,?., Zurek,M., Roschinger,T., Patzelt,H., Oesterhelt,D.S. Zinth.W. (1997) Subpicosecond infrared spectroscopy on the photoisomerisation of the protonated Schiff base of all-trans retinal Chemical Physics Letters 268,180-186.

25. Dioumaev,A.K. Braiman,M.S. (1997) Two Bathointermediates of the Bacteriorhodopsin Photocycle, Distinguished by Nanosecond Time-Resolved FTIR Spectroscopy at Room Temperature J. Phys. Chem. В 101,1655-1662.

26. Balashov,S.P. Ebrey,T.G. (2001) Trapping and spectroscopic identification of the photointermediates of bacteriorhodopsin at low temperatures Photochem Photobiol 73, 453-462.

27. Chizhov,!., Chemavskii,D.S., Engelhard,M., Mueller,K.H., Zubov,B.V. Hess,B. (1996) Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle Biophys JlI, 2329-2345.

28. Zimanyi,L. LanyiJ.K. (1993) Deriving the intermediate spectra and photocycle kinetics from time- resolved difference spectra of bacteriorhodopsin. The simpler case of the recombinant D96N protein Biophys J 64,240-251.

29. Xie,A-H., NagleJ.F. Lozier,R.H. (1987) Flash spectroscopy of риф1е membrane Biophys J Sly 627-635.

30. Fitter,J., Verclas,S.A., Lechner,R.E., Seelert,H. Dencher,N.A. (1998) Function and picosecond dynamics of bacteriorhodopsin in purple membrane at different lipidation and hydration FEBSLett 433, 321-325.

31. Dracheva,S., Bose,S. Hendler,R.W. (1996) Chemical and functional studies on the importance of риф1е membrane lipids in bacteriorhodopsin photocycle behavior £"55 le//382,209-212.

32. Zscherp.C, Schlesinger,R., TittorJ., Oesterhelt,D. HeberleJ. (1999) In situ determination of transient pKa changes of internal amino acids of bacteriorhodopsin by using time-resolved attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy Proc Natl Acad Sci USA 96, 5498-5503.

33. Souvignier,G. Gerwert,K. (1992) Proton uptake mechanism of bacteriorhodopsin as determined by time-resolved stroboscopic-FTIR -spectroscopy: Proton Uptake Mechanism of Bacteriorhodopsin 5/о/7/гу5. J. 63,1393-1405.

34. Aton,B., Doukas,A.G., Callender,R.H., Becher,B. Ebrey,T.G. (1977) Resonance Raman studies of the purple membrane Biochemistry 16,2995-2999.

35. Barth,A. Zscherp,C. (2002) What vibrations tell us about proteins Q. Rev Biophys 35, 369-430.

36. Maeda,A. et al. (1992) Structures of aspartic acid-96 in the L and N intermediates of bacteriorhodopsin: analysis by Fourier transform infrared spectroscopy Biochemistry 31,4684-4690.

37. Lewis,A., SpoonhowerJ., Bogomolni,R.A., Lozier,R.H. Stoeckenius,W. (1974) Tunable laser resonance raman spectroscopy of bacteriorhodopsin Proc Natl Acad Sci U S A 11,4462-4466.

38. Braiman,M.S., Mogi,T., Marti,T., Stem,L.J., Khorana,H.G. Rothschild,K.J. (1988) Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212 Biochemistry 27, 8516-8520.

39. Maeda,A. (1995) Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin Isr. J. Chem. 35,387-400.

40. Heberle,J. Dencher,N.A. (1992) Surface-bound optical probes monitor proton translocation and surface potential changes during the bacteriorhodopsin photocycle Proc Natl Acad Sci USAS% 5996-6000.

41. Xiao,Y., Hutson,M.S., Belenky,M., Herzfeld,J. Braiman,M.S. (2004) Role of arginine-82 in fast proton release during the bacteriorhodopsin photocycle: a timeresolved FT-IR study of purple membranes containing 15N-labeled arginine Biochemistry 43,12809-12818.

42. Garczarek,F., Wang, J., El Sayed,M.A. Gerwert,K. (2004) The assignment of the different infrared continuum absorbance changes observed in the 3000-1800-cm(-l) region during the bacteriorhodopsin photocycle Biophys J 87,2676-2682.

43. Garczarek,F., Brown,L.S., Lanyi,J.K. Gerwert,K. (2005) Proton binding within a membrane protein by a protonated water cluster Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 3633-3638.

44. Pfefferle,J.M., Maeda,A., Sasaki,J. Yoshizawa,T. (1991) Fourier transform infrared study of the N intermediate of bacteriorhodopsin Biochemistry 30, 6548-6556.

45. Vonck,J. (1996) A three-dimensional difference map of the N intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle: part of the F helix tilts in the M to N transition Biochemistry 35,5870-5878.

46. Sass,H.J. et al. (1997) The tertiary structural changes in bacteriorhodopsin occur between M states: X-ray diffraction and Fourier transform infrared spectroscopy EMBO 716,1484-1491.

47. Zscherp,C. Heberle,J. (1997) Infrared difference spectra of the intermediates L, M, N, and О of the bacteriorhodopsin photoreaction obtained by time-resolved attenuated total reflection spectroscopy У P/?;; Chem В 101,10542-10547.

48. HeberieJ., Fitter,!., Sass,H.J. Buldt,G. (2000) Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved Biophys Chem 85,229-248.

49. Zscherp,C., Schlesinger,R. Heberle,J. (2001) Time-Resolved FT-IR Spectroscopic Investigation of the pH-Dependent Proton Transfer Reactions in the E194Q Mutant of Bacteriorhodopsin Biochem Biophys Res Commun 283, 57-63.

50. Balashov,S.P. Litvin,F.F. (1976) Primary photochemical reactions of bacteriorhodopsin in the purple membrane of Halobacteria at AYiBioorg. Khim. 2, 565566.

51. Sasaki,J., Shichida,Y., Lanyi,J.K. Maeda,A. (1992) Protein changes associated with reprotonation of the Schiffbase in the photocycle of Asp96>Asn bacteriorhodopsin. The MN intermediate with unprotonated Schiffbase but N-like protein structure J Biol Chem 267,20782-20786.

52. Chen,W.G. Braiman,M.S. (1991) Kinetic-Analysis of Time-Resolved Infrared Difference Spectra of the L-Intermediates and M-lntermediates of Bacteriorhodopsin Photochemistry and Photohiology 54,905-910.

53. Balashov,S.P. (2005) Photoreactions of the photointermediates of bacteriorhodopsin Isr. У.С/гет. 35,415-428.

54. Pebay-Peyroula,E., Rummel,G., Rosenbusch,J.P. Landau,E.M. (1997) X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases Science 111, 1676-1681.

55. Grudinin,S., Buldt,G., Gordeliy,V. Baumgaertner,A. (2005) Water molecules and hydrogen-bonded networks in bacteriorhodopsin-molecular dynamics simulations of the ground state and the m-intermediate Biophys J 8S, 3252-3261.

56. Edman,K. et al. (1999) High-resolution X-ray structure of an early intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle Nature 401, 822-826.

57. Schobert,B., Cupp-Vickery,J., Homak,V., Smith,S. Lanyi,J. (2002) Crystallographic structure of the К intermediate of bacteriorhodopsin: conservation of free energy after photoisomerization of the retinal У. Mol. Biol. 321,715-726.

58. Royant,A., Edman,K., Ursby,T., PebayPeyroula,E., Landau,E.M. Neutze,R. (2000) Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in the photocycle of bacteriorhodopsin Nature 406,645-648.

59. Edman,K. et al. (2004) Deformation of helix С in the low temperature L-intermediate of bacteriorhodopsin Journal of Biological Chemistry 279,2147-2158.

60. Lanyi,J.K. Schobert,B. (2003) Mechanism of proton transport in bacteriorhodopsin from crystallographic structures of the K, L, M-1, M-2, and M-2 intermediates of the photocycle J Mo/ Biol 328,439-450.

61. Lanyi,J. Schobert,B. (2002) Crystallographic structure of the retinal and the protein after deprotonation of the schiff base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle У Mol Biol 321,727-737.

62. Facciotti,M.T. et al. (2001) Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocycle Biophys J 81,3442-3455.

63. Luecke,H., Schobert,B., Richter,HT., CartaillerJ.P. &Lanyi,J.K. (1999) Structural Changes in Bacteriorhodopsin During Ion Transport at 2 Angstrom Resolution Science 286,255-261.

64. Schobert,B., Brown,L.S. Lanyi,J.K. (2003) Crystallographic structures of the M and N intermediates of bacteriorhodopsin: assembly of a hydrogen-bonded chain of water molecules between Asp-96 and the retinal Schiff base У Л/о/ Biol 330,553-570.

65. Rouhani,S. et al. (2001) Crystal Structure of the D85S Mutant of Bacteriorhodopsin: Model of an 0-like Photocycle Intermediate У Mo/5/o/313,615-628.

66. Haupts,U., Tittor,J., Bamberg,E. Oesterhelt,D. (1997) General concept for ion translocation by halobacterial retinal proteins: the isomerization/switch/transfer (1ST) model Biochemistry 36,2-7.

67. Brown,LS., Dioumaev,A.K., Needleman,R. LanyiJ.K. (1998) Local-access model for proton transfer in bacteriorhodopsin Biochemistry 37, 3982-3993.

68. Facciotti,M.T., Rouhani-Manshadi,S. Glaeser,R.M. (2004) Energy transduction in transmembrane ion pumps Trends Biochem. Sci. 29,445-451.

69. Herzfeld,J. Lansing,J.C. (2002) Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycXtAnnu. Rev. Biophys Biomol. Struct. 31,73-95.

70. HohenfeldJ.P., Wegener,A-A. Engelhard,M. (1999) Purification of histidine tagged bacteriorhodopsin, pharaonis halorhodopsin and pharaonis sensory rhodopsin II functionally expressed in Escherichia coli FEBSLett 442,198-202.

71. Luecke,H., Schobert,B., LanyiJ.K., Spudich,E.N. Spudich,J.L. (2001) Crystal Structure of Sensory Rhodopsin И at 2.4 A: Insights into Color Tuning and Transducer Interaction Science 293, 1499-1503.

72. Royant,A. et al. (2001) X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1 -A resolution Proc Natl Acad Sci t 5 A 98:10131-6

73. ChizhovJ., Schmies,G., Seidel,R., Sydor,J.R., Luttenberg,B. Engelhard,M. (1998) The photophobic receptor from Natronobacterium pharaonis: temperature and pH dependencies of the photocycle of sensory rhodopsin II BiophysJlS, 999-1009.

74. Imamoto,Y., Shichida,Y., HirayamaJ., Tomioka,H., Kamo,N. Yoshizawa,T. (1992) Nanosecond laser photolysis of phoborhodopsin: from Natronobacterium pharaonis appearance of KL and L intermediates in the photocycle at room temperature Potochem. Photobiol. 56,1129-1134.

75. HirayamaJ., Imamoto,Y., Shichida,Y., Kamo,N., Tomioka,H. Yoshizawa,T. (1992) Photocycle of phoborhodopsin from haloalkaliphilic bacterium (Natronobacterium pharaonis) studied by low-temperature spectrophotometry Biochemistry 31,2093-2098.

76. Kandori,H., Shimono,K., Sudo,Y., Iwamoto,M., Shichida.Y. Kamo,N. (2001) Structural Changes of pharaonis Phoborhodopsin upon Photoisomerization of the Retinal Chromophore: Infrared Spectral Comparison with Bacteriorhodopsin Biochemistry 40,9238-9246.

77. Engelhard.M., Scharf,B. Siebert,F. (1996) Protonation changes during the photocycle of sensory rhodopsin II from Natronobacterium pharaonis FEBSLett 395,195-198.

78. Hein,M., Wegener,A.A., Engelhard,M. Siebert,F. (2003) Time-Resolved FTIR Studies of Sensory Rhodopsin II (NpSRIl) from Natronobacterium pharaonis: Implications for Proton Transport and Receptor Activation BiophysJ. 84,1208-1217.

79. Furutani,Y., Iwamoto,M., Shimono,K., Kamo,N. Kandori,H. (2002) FTIR Spectroscopy of the M Photointermediate in pharaonis Phoborhodopsin BiophysJ. 83, 3482-3489.

80. Balashov.S.P., Sumi,M. Kamo,N. (2000) The M Intermediate of Pharaonis Phoborhodopsin Is Photoactive Biophys J 78,3150-3159.

81. Furutani,Y. et al. (2004) FTIR Spectroscopy of the О Photointermediate in pharaonis Phoborhodopsin Biochemistry 43, 5204-5212.

82. Wegener,A.A., Chizhov,!., Engelhard,M. Steinhoff,H.J. (2000) Time-resolved detection of transient movement of helix F in spin-labelled pharaonis sensory rhodopsin IIУ Mo/5/0/301,881-891.

83. Sudo,Y., Iwamoto,M., Shimono,K., Sumi,M. Kamo,N. (2001) Photo-induced proton transport of pharaonis phoborhodopsin (sensory rhodopsin II) is ceased by association with the transducer Biophys J 80, 916-922.

84. Furutani,Y., Sudo,Y., Kamo,N. Kandori,H. (2003) FTIR spectroscopy of the complex between pharaonis phoborhodopsin and its transducer protein Biochemistry 42,48374842.

85. Furutani,Y., Kamada,K., Sudo,Y., Shimono,K., Kamo,N. Kandori,H. (2005) Structural changes of the complex between pharaonis phoborhodopsin and its cognate transducer upon formation of the M photointermediate Biochemistry 44,2909-2915.

86. Hippler-Mreyen,S. et al. (2003) Probing the sensory rhodopsin II binding domain of its cognate transducer by calorimetry and electrophysiology J M Biol 330, 1203-1213.

87. Gordeliy,V.I. et al. (2002) Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin Il-transducer complex Nature 419,484-487. 88. McPherson,A. (1998) Crystallization of Biological Macromolecules. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

88. Michel,H. (1991) Crystallization of Membrane Proteins. CRC Press, Boca Raton.

89. Faham,S. Bowie,J.U. (2002) Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure У Mo/5/o/ 316,1-6.

90. Takeda,K. et al. (1998) A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained by successive fusion of the vesicular assemblies J Mol Biol 283, А6ЪА1А.

91. Lindblom,G. Rilfors,L. (1989) Cubic Phases and Isotropic Structures Formed by Membrane-Lipids Possible Biological Relevance Biochimica et Biophysica Acta 988, 221-256.

92. Engblom,J., Miezis,Y., Nylander,T., Razumas,V. Larsson,K. (2000) On the swelling ofmonoolein liquid-crystalline aqueous phases in the presence of distearoylphosphatidylglycerol. Progr. Colloid Polym. Sci. 2000, 116, 9-15

93. Anderson,S. (1988) Minimal surfaces and structures Chem. Rew. 88,221-242.

94. Schwarz,U.S. Gompper,G. (1999) Systematic approach to bicontinuous cubic phases in ternary amphiphilic systems Phys. Rev. E Stat. Phys. Plasmas. Fluids Relat Interdiscip. Topics. 59, 5528-5541.

95. Qiu,H. Caffrey,M. (2000) The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects Biomaterials 21,223-234.

96. Misquitta,Y. et al. (2004) Rational design of lipid for membrane protein crystallization J. Struct. Biol. 148,169-175.

97. Misquitta,Y. Caffrey,M. (2003) Detergents destabilize the cubic phase ofmonoolein: implications for membrane protein crystallization Biophys. J. 85,3084-3096.

98. Landau,E.M. Rosenbusch,J.P. (1996) Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins Proc Natl Acad Sci USA 93,14532-14535.

99. Caffrey,M. (2003) Membrane protein crystallization Journal of Structural Biology 142, 108-132.

100. Nollert,P., Qiu,H., Caffrey,M., Rosenbusch,J.P. Landau,E.M. (2001) Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases FEBS Z,e//504, 179-186.

101. Grabe,M., Neu,J., Oster,G. Nollert,P. (2003) Protein interactions and membrane geometry Biophys. J. 84, 854-868.

102. Qutub,Y., Reviakine,!., Maxwell,C., Navarro,J., Landau,E.M. Vekilov,P.G. (2004) Crystallization of transmembrane proteins in cubo: mechanisms of crystal growth and defect formation УМ?/. Biol. 343,1243-1254.

103. Parsons,S. (2003) Introduction to twinning Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59, 1995-2003.

104. Dauter,Z. (2003) Twinned crystals and anomalous phasing Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59,2004-2016.

105. Terwisscha van Scheltinga,A.C., Valegard,K., Hajdu,J. Andersson,!. (2003) MIR phasing using merohedrally twinned crystals Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59, 2017-2022.

106. Yeates,T.O. (1997) Detecting and overcoming crystal twinning Methods Enzymol. 276, 344-358.

107. Luecke,H., Richter,H.T. Lanyi,J.K. (1998) Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution Science 280,1934-1937.

108. Qiu,H. Caffrey,M. (1998) Lyotropic and thermotropic phase behavior of hydrated monoacylglycerols: Structure characterization of monowaccenin Journal of Physical Chemistry В 102,4819-4829.

109. Lorber,B., Bishop,J.B. DeLucas,L.J. (1990) Purification of octyl beta-Dglucopyranoside and re-estimation of its micellar size Biochim Biophys Acta 1023,254265.

110. Oesterhelt,D. 8L Stoeckenius,W. (1974) Isolation of the cell membrane of Halobacterium halobium and its fractionation into red and purple membrane Methods Enzymol 31, 667-678.

111. Rehorek,M. Heyn,M.P. (1979) Binding of all-trans-retinal to the риф1е membrane. Evidence for cooperativity and determination of the extinction coefficient Biochemistry 18,4977-4983.

112. Dencher,N.A. Heyn,M.P. (1978) Formation and properties of bacteriorhodopsin monomers in the non-ionic detergents octyl-beta-D-glucoside and Triton X-100 FEBS Lett 96,322-326.

113. Tatulian,S-A. (2003) Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy: a method of choice for studying membrane proteins and lipids Biochemistry 42,11898-11907.

114. Goormaghtigh,E., Raussens,V. Ruysschaert,J.M. (1999) Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes Biochim Biophys cto 1422,105-185. 116. daCosta,C.J. BaenzigerJ.E. (2003) A rapid method for assessing lipid:protein and detergent:protein ratios in membrane-protein crystallization Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 59,77-83.

115. СвергунД.И., Фейгин,Л.A. (1986) Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. "Наука", Москва.

116. Липсон,Г-, Стипл,Г- (1972) Интерпретация порошковых рентгенограмм. "МИР", Москва.

117. Исламов, А. X. (2003) Сравнительное исследование структуры и свойств липидных мембран с помощью рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей. Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова.

118. Wilson, А. J.C. (1949) The Probability Distribution of X-ray Intensities Acta Cryst. 2, 318-321.

119. Britton,D. (1972) Estimation of twinning parameter for twins with exactly superimposed reciprocal lattices Acta Cryst. A 28,296-297.

120. Fisher,R.G. Sweet,R.M. (1980) Treatment of diffraction data from protein crystals twinned by merohedry Acta Cryst. A 36, 755-760.

121. Yeates,T.O. (1988) Simple Statistics for Intensity Data from Twinned Specimens Acta Crystallographica Section A 44, 142-144.

122. Stanley,E. (1972) Identification of Twins from Intensity Statistics Journal of Applied Crystallography 5,191

123. Stanley,E. (1972) Identification of Twins from Intensity Statistics Journal of Applied Crystallography S 191-&.

124. Collaborative Computational Project,No.4. (1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography c/a Crystallogr D SQ, 1вО-1ЬЪ.

125. Efremov,R., Moukhametzianov,R., Buldt,G. Gordeliy,V. (2004) Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals of bacteriorhodopsin 5/орЛу5. J. 87, 36083613.

126. Griffiths,?.R. de Haseth,J.A. (1986) Fourier transforme infrared spectrometry. John Wiley Sons Inc., New York.

127. Hehn, D. Untersuchung der Struktur und Dynamik von BacteriorhodopsinIntermediaten mit hochaufloesenden Methoden. 2

129. Bolwien, С Zeitauflosende Schwingungsspektroskopie an Bacteriorhodopsin und Halorhodopsin. 2

130. Institut fiir biologische Informationsverarbeitung 2, FZ-Jiilich.

131. Malinowski,E.R. Howery,D.G. (1989) Factor analysis in chemistry. Robert E. Krieger Publishing Co., Inc., Malabar, Florida.

132. Ruckebusch,C., DuponcheI,L., Sombret,B., Huvenne,J.P. Saurina,J. (2003) Timeresolved step-scan FT-IR spectroscopy: focus on multivariate curve resolution J. Chem. Inf Comput. Sci. 43,1966-1973. 133. HeBling,B., Souvignier,G. Gerwert,K. (1993) A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsins intramolecular reactions to photocycle intermediates Л/ор/2у5 У 65,1929-1941.

133. Nagle,J.F. (1991) Solving complex photocycle kinetics. Theory and direct method BiophysJ5%Aie-A.

134. Onsager,L. (1931) Reciprocal relations in irreversible processes Phys. Rev. 37,405-426.

135. Lozier,R.H., Xie,A., Hofrichter,J. Clore,G.M. (1992) Reversible steps in the bacteriorhodopsin photocycle Proc Natl Acad Sci USA 89,3610-3614.

136. Zimanyi,L., Varo,G., Chang,M., Ni,B., Needleman,R. Lanyi,J.K. (1992) Pathways of proton release in the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 31, 8535-8543.

137. Varo,G. Lanyi,J.K. (1991) Thermodynamics and energy coupling in the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 30, 5016-5022.

138. Nagle,J.F., Zimanyi,L. Lanyi,J.K. (1995) Testing BR photocycle kinetics Biophys J 68,1490-1499.

139. Mueller,K.H. Plesser,T. (1991) Variance reduction by simultaneous multiexponential analysis of data sets from different experiments Eur. Biophys. J. 19,231240.

140. Kuntsevich, A. Kappel,F. (1997) SolvOpt: The Solver for Local Nonlinear Optimization Problems, http://www.unigraz.at/imawww/kuntsevich/solvopt/index.html.

141. Misquitta,Y. Caffrey,M. (2003) Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization Biophys J S5,3084-3096.

142. Landau,E.M. (2003) In Cubo Crystallization of Membrane Proteins In: Membrane Protein Purification and Crystallization (Hunte,C., von Jagow,G. Schaegger,H., eds.), pp. 285-

144. Gmelin, V. Strukturelle und functionelle Untersuchungen an der lichtgetribenen Anionenpumpe Halorhodopsin aus Halobacterium salinarum. 2

145. Fakultat ftir Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universitaet, Muenchen.

146. Nollert,P., Qiu,H., Caffrey,M., Rosenbusch,J.P. Landau,E.M. (2001) Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases FEBS Lett. 504, 179-186.

147. Caffrey,M. (2000) A lipids eye view of membrane protein crystallization in mesophases Curr Opin Struct Biol 10,486-497.

148. Mozzarelli,A. Rossi,G.L. (1996) Protein function in the crystal Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25,343-365.

149. Fischer,U. Oesterhelt,D. (1979) Chromophore equilibria in bacteriorhodopsin Biophys. J. 2%,2\\-2Ъ0.

150. Metz,G., Siebert,F. Engelhard,M. (1992) Asp85 is the only internal aspartic acid that gets protonated in the M intermediate and the purple-to-blue transition of bacteriorhodopsin. A solid-state 13C CP-MAS NMR investigation FEBS Lett 303,237241.

151. Hildebrandt,P. Stockburger,M. (1984) Role of water in bacteriorhodopsins chromophore: resonance Raman study Biochemistry 23,5548.

152. Schenkl,S. et al. (2003) Compositional heterogeneity reflects partial dehydration in three-dimensional crystals of bacteriorhodopsin J. Mol. Biol. 329, 711-719.

153. Royant,A., Edman,K., Ursby,T., Pebay-Peyroula,E., Landau,E.M. Neutze,R. (2001) Spectroscopic characterization of bacteriorhodopsins L-intermediate in 3D crystals cooled to 170 К Photochem Photobiol 74, 794-804.

154. Scherrer,P., Mathew,M.K., Sperling,W. Stoeckenius,W. (1989) Retinal isomer ratio in dark-adapted purple membrane and bacteriorhodopsin monomers Biochemistry 28, 829-834.

155. Mogi,T., Stern,L.J., Marti,T., Chao,B.H. Khorana,H.G. (1988) Aspartic acid substitutions affect proton translocation by bacteriorhodopsin Proc Natl Acad Sci USA 85,4148-4152.

156. Tittor,J., Paula,S., Subramaniam,S., Heberle.J., Henderson,R. Oesterhelt,D. (2002) Proton translocation by bacteriorhodopsin in the absence of substantial conformational changes JM?/. Biol. 319, 555-565.

157. Bagley,K., Dollinger,G., Eisenstein,L., Singh,A.K. Zimanyi,L. (1982) Fourier transform infrared difference spectroscopy of bacteriorhodopsin and its photoproducts Proc Natl Acad Sci USA79,4972-4976.

158. HeberleJ., Buldt,G., Koglin,E., RosenbuschJ.P. Landau,E.M. (1998) Assessing the functionality of a membrane protein in a three-dimensional crystalJ Mol Biol 281, 587592.

159. HofrichterJ., Henry,E.R. Lozier,R.H. (1989) Photocycles of bacteriorhodopsin in light- and dark-adapted риф1е membrane studied by time-resolved absoфtion spectroscopy Biophys J 56,693-706.

161. Rothschild,K.J. (1991) Protein dynamics in the bacteriorhodopsin photocycle: submilHsecond Fourier transform infrared spectra of the L, M, and N photointermediates Proc Natl Acad Sci US ASS, 2388-2392.

162. Gerwert,K., Hess,B., SoppaJ. Oesterhelt,D. (1989) Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin Proc Natl Acad Sci USA 86,4943-4947.

163. Sasaki,J., Lanyi,J.K., Needleman,R., Yoshizawa,T. Maeda,A. (1994) Complete identification of С О stretching vibrational bands of protonated aspartic acid residues in the difference infrared spectra of M and N intermediates versus bacteriorhodopsin Biochemistry 33,3178-3184.

164. Takei,H., Gat,Y., Rothman,Z., Lewis,A. Sheves,M. (1994) Active site lysine backbone undergoes conformational changes in the bacteriorhodopsin photocycle Journal, of Biological Chemistry. 269, 7387-7389.

165. Xie,A.H. (1990) Quantum efficiencies of bacteriorhodopsin photochemical reactions Biophys J 58,1127-1132.

166. Smith,S.O., Lugtenburg,J. Mathies,R.A. (1985) Determination of retinal chromophore structure in bacteriorhodopsin with resonance Raman spectroscopy J Membr Biol S5,95-109.

167. Rothschild,K.J., Roepe,P., Lugtenburg,J. Pardoen,J.A. (1984) Fourier transform infrared evidence for Schiff base alteration in the first step of the bacteriorhodopsin photocycle Biochemistry 23,6103-6109.

168. Balashov,S.P., Imasheva,E.S., Litvin,F.F. Lozier,R.H. (1990) The N intermediate of bacteriorhodopsin at low temperatures: stabilization and photoconversion FEBS Lett 271, 93-96.

169. Mitsuoka,K. et al. (1999) The Structure of Bacteriorhodopsin at 3.0 Resolution Based on Electron Crystallography: Implication of the Charge Distribution У M?/5/o/286, 861-882.

170. Subramaniam,S. Henderson,R. (2000) Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin Nature 406,653-657.

171. Balashov, S. P., Lu, M., Imasheva, E. S., Govindjee, R., Ebrey, T. G., Othersen, В., Chen, Y. M., Crouch, R. K., and Menick, D. R. (1999) The proton release group of bacteriorhodopsin controls the rate of the final step of its photocycle at low pH. Biochemistry Usa 38, 2026-2039.

172. Braiman,M.S., Ahl,P.L. Rothschild,K.J. (1987) Millisecond Fourier-transform infrared difference spectra of bacteriorhodopsins M412 photoproduct Proc Natl Acad Sci US AS4, 5221-5225.

173. Hildebrandt,V., FendIer,K., Heberie,J., Hoffmann,A., Bamberg,E. BuIdt,G. (1993) Bacteriorhodopsin expressed in Schizosaccharomyces pombe pumps protons through the plasma membrane Proc Natl Acad Sci USA 90,3578-3582.

174. Belrhali,H. et al. (1999) Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: a molecular view of the риф1е membrane at 1.9 A resolution Structure Fold Des 1,909-9X1.

175. Zaccai,G. (1987) Structure and hydration of purple membranes in different conditions J Mol Biol 194,569-512.

176. Edman,K. et al. (2002) Early structural rearrangements in the photocycle of an integral membrane sensory receptor Structure 10,473-482.

177. FurutanijY., Sudo,Y., Kamo,N. Kandori,H. (2003) FTIR spectroscopy of the complex between pharaonis phoborhodopsin and its transducer protein Biochemistry 42,48374842.

178. Kriminski,S., Kazmierczak,M. Thome,R.E. (2003) Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating Acta Crystallogr D Biol Сгу5? 59,697-708.