Структурно-функциональный анализ факторов созревания рибосомы M (RimM) и P (RimP) патогенной бактерии Staphylococcus aureus по данным малоуглового рентгеновского рассеяния, спектроскопии ЯМР и ЭПР, и криогенной просвечивающей электронной микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гараева Наталия Сергеевна

• Гараева Наталия Сергеевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Гараева Наталия Сергеевна

1 Обзор литературы

1.1 Введение

1.2 Фактор созревания рибосомы M (RimM)

1.3 Фактор созревания рибосомы P (RimP)

2 Методы оценки стабильности белка

2.1 Методы дифференциальной сканирующей флуориметрии (NanoDSF)

2.2 Методы динамического (ДРС) и статического рассеяния света (СРС)

3 Методы структурно-динамических исследований биомолекул

3.1 Полипептидная цепь

3.2 Электронный парамагнитный резонанс

3.3 Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР)

3.4 Ядерный магнитный резонанс

3.5 Криоэлектронная микроскопия

4 Объекты исследования и параметры экспериментов

4.1 Объекты исследования

4.2 Подготовка образцов

4.2 Параметры экспериментов

5. Результаты исследований

5.1 Структурные исследования фактора созревания рибосомы M (RimM)

5.2 Структурные исследования фактора созревания рибосомы P (RimP)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ШИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Сокращения

CSI Chemical shift index

CTF ^ntest transfer function

CDR Сentral decoding region

COSY Correlated Spectroscopy

DEER Double electron-electron resonance

DLS Dynamic light scattering

ESE Electron spin echo

FEG Field Emission Gun

FSC Fourier Shell Correlation

GISA гликопептид-резистентный золотистый стафилококк

HSQS Heteronuclear Single Quantum Coherence

IF Initiation factor

LB Lysogeny broth

MTSL S-(1 -оксил-2,2,5,5 -тетраметил-2,5 -дигидро-1 H-пиррол-Э

ил)метил метантиосульфонат

MRSA мецитиллин-резистентный золотистый стафилококк

NOE Nuclear Overhauser Effect

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

NanoDSF Nano differential scanning fluorimetry

PELDOR Pulse Electron-Electron Double Resonance

RMSD Root Mean Square Deviation

RimM Ribosome maturation factor M

RimP Ribosome maturation factor P

SLS Static Dynamic Light Scattering

S. aureus Staphylococcus aureus

SAXS Small-angle X-ray scattering

VRSA ванкомицин-резистентный золотистый стафилококк

ГТФ Гуанозинтрифосфат

ДРС Динамическое рассеяние света

ДЦ Декодирующий центр

ИХС Индекс химического сдвига

ИПТГ изопропил-0-D-1 - тиогалактопиранозида

ИФ инициаторный фактор

Крио-ЭМ Криоэлектронная микроскопия

МУРР Малоугловое рентгеновское рассеяние

мРНК Матричная РНК

П.н. Пар нуклеотидов

ПААГ полиакриламидный гель

ПЭМ просвечивающая электронная микроскопии

р-белки Рибосомные белки

рРНК Рибосомная рибонуклеиновая кислота

СРС Статистическое рассеяние света

ССИ Спад свободной индукции

тРНК Транспортная РНК

ТЭМ Трансэмиссионный электронный микроскоп

SDSL Site-directed spin labeling

МФА Модель фиктивных атомов

DAM Dummy atom model

ЭПР Электронный парамагнитный резонанс

ЭСЭ Электронное спиновое эхо

ЯМР Ядерный магнитный резонанс

ЯЭО Ядерный эффект Оверхаузера

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональный анализ факторов созревания рибосомы M (RimM) и P (RimP) патогенной бактерии Staphylococcus aureus по данным малоуглового рентгеновского рассеяния, спектроскопии ЯМР и ЭПР, и криогенной просвечивающей электронной микроскопии»

Актуальность работы

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus, S. aureus) -грамположительная условно-патогенная бактерия, вызывающая многочисленные нозокомиальные инфекции мягких тканей. Благодаря своей способности вырабатывать факторы патогенности он быстро приобретает устойчивость к антибиотикам, что привело к появлению новых штаммов S. aureus с множественной устойчивостью (VRSA - ванкомицин-резистентный золотистый стафилококк, MRSA — мецитиллин-резистентный золотистый стафилококк, GISA - гликопептид-резистентный золотистый стафилококк). Эта способность подтверждает необходимость разработки новых антимикробных препаратов, которые замедлят или остановят синтез и высвобождение его факторов патогенности, то есть будут действовать против макромолекулярного комплекса, осуществляющего синтез белка в клетке -рибосомы.

Бактериальная (70S) рибосома состоит из двух субъединиц: малой (30S) и большой (50S). 30S субъединица, состоящая из 16S рРНК и 21 рибосомного белка (р-белков), связывающихся с рРНК в процессе созревания, играет критическую роль в декодировании мРНК и в точности трансляции [1,2]. Сборка 30S субъединицы рибосомы начинается на 16S рРНК параллельно в нескольких местах: сначала формируется тело 5' домена, затем центральная платформа и основные домены, и последним формируется 3' минорный домен с функционально важным участком- декодирующим центром рибосомы (ДЦ, в англоязычной литературе central decoding region или CDR) [3-6]. На поздних стадиях сборки, включая формирование ДЦ, в результате вырожденных взаимодействий часто возникают локальные минимумы энергии, которые соответствуют ошибочным конформациям рРНК [7]. Эти ошибки в конформации могут быть критичны для дальнейшего функционирования рибосомы [8-13]. Избегать появление этих кинетических ловушек и

обеспечить правильное созревание рибосомы, позволяют специальные белки, которые называются «факторы сборки рибосомы». Отсутствие этих белковых факторов может быть летальным для клетки. К таким факторам сборки относятся белки RimM и RimP.

Исследование структуры этих белков с использованием ключевых биофизических методов: спектроскопия ЯМР высокого разрешения, спектроскопия ЭПР, методы малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР, Small-angle X-ray scattering или SAXS), а также их комплексов с 30S субъединицей рибосомы методами просвечивающей криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ, cryogenic electron microscopy или cryo-EM) позволят понять их роль в созревании 30S субъединицы рибосомы, и разработать новые противомикробные агенты, приводящие к ошибкам в конформации 30S субъединицы рибосомы, что в свою очередь приведет к ошибкам в трансляции в клетках Staphylococcus aureus.

Цель работы:

Установление механизма созревания 30S субъединицы рибосомы из Staphylococcus aureus и определение роли белков RimM и RimP в этом механизме по данным спектроскопии ЯМР высокого разрешения, спектроскопии ЭПР, методом малоуглового рентгеновского рассеяния и просвечивающей криогенной электронной микроскопии.

Задачи работы:

1.Получение генетических конструкций с геном исследуемых белков: pETGB 1а:: rimM, pETGB 1 a::ntd_rimM, pETGB 1а:: rimP,

pACYC_Duet::rimP-us12

2.Оптимизация условий экспрессии и очистки белков: RimM, N-концевого домена RimM, RimP и гетеродимера RimP-uS12.

З.Исследование структуры и динамики факторов созревания рибосомы RimM и RimP из Staphylococcus aureus по данным спектроскопии ЯМР высокого разрешения, спектроскопии ЭПР, методом малоуглового

рентгеновского рассеяния и просвечивающей криогенной электронной микроскопии.

4.Установление деталей взаимодействия факторов созревания RimP и RimM с 30S субъединицей рибосомы с атомарным разрешением.

5.Определение деталей молекулярного механизма созревания 30S рибосомы на последних этапах.

Объекты исследования

Объектами исследования в представленной работе стали:

□ генно- инженерные конструкции и вектора pETGB 1а и pACYCDuet для экспрессии в E. coli;

□ рекомбинантные белки RimP, RimM, N-концевой домен белка RimM с природным содержанием изотопов и обогащенных по изотопам 13C/ 15N;

□ образец белкового комплекса RimP-uS12;

□ 30S субъединица рибосомы из S. aureus RN 6390. Методы исследования

В представленной работе использовался комплексный подход на основе современных методов биофизики (спектроскопия ЯМР высокого разрешения, спектроскопия ЭПР, малоугловое рентгеновское рассеяние, криогенная просвечивающая электронная микроскопия) и молекулярной биологии (клонирование, экспрессия и очистка индивидуальных компонент клеток). Определение пространственной структуры белков было выполнено методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения на спектрометре Bruker Avance III HD 700 МГц, оснащенном трехканальным (1H,15N,13C) криодатчиком производства Bruker в лаборатории ЯМР I.G.B.M.C. (г. Страсбург, Франция), и спектрометре Bruker Avance III HD 700 МГц, оснащенном четырехканальным (1H,15N,13C, 31P) криодатчиком производства Bruker в научной лаборатории ЯМР кафедры медицинской физики Института физики КФУ (г. Казань, Россия). Анализ спектров ЯМР производили в программном

обеспечении CCPNMR, а расчет трехмерной структуры белка RimP производили в программном обеспечении ARIA2.1. Определение положения N-концевого домена белка RimP относительно рибосомного белка uS12 из S. aureus было выполнено методами спектроскопии ЭПР на спектрометре X-диапазона (9,6 ГГц) Elexsys 680 производства Bruker в научной лаборатории ЭПР кафедры квантовой электроники и радиоспектроскопии Института физики КФУ (г. Казань, Россия). Данные были обработаны в программном пакете DeerAnalysis2019. Модель комплекса RimP-uS12 была получена методами малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР, Small-angle X-ray scattering или SAXS), данные регистрировали с помощью системы Xeuss 3.0 SAXS/WAXS (ОИЯИ, г. Дубна, Россия), работающей в точечной геометрии, оснащенной микрофокусным генератором рентгеновского излучения GeniX3D с CuKa (X = 0,1541889 нм), с 1M 2D-детектором Eiger2 R (Dectris). Данные были обработаны в программном обеспечении ATSAS, модель комплекса построена методом имитационного отжига в программном обеспечении DAMMIN. Изображения комплекса 30S*RimM и 30S*RimP были получены методом криогенной просвечивающей электронной микроскопии (крио-ЭМ, cryogenic electron microscopy или cryo-EM) на микроскопе Glacios (NOVALIX, г. Страсбург, Франция). Крио-ЭМ карты были реконструированы в программном обеспечении CryoSPARC. Построение структуры комплекса 30S*RimP было выполнено в программном обеспечении Phenix с встроенным пакетом Coot. Полученные структуры анализировались в программе ChimeraX.

Научная новизна

Впервые определены положения элементов вторичной структуры N-концевого домена белка RimM и пространственная структура белка RimP из S. aureus в растворе методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения.

Определено положение доменов белка RimP относительно рибосомного белка uS12 методами спектроскопии ЭПР и малоуглового рентгеновского рассеяния.

Впервые методами криогенной просвечивающей электронной микроскопии определена структура комплекса 30S*RimP из S. aureus с разрешением 4,2 А.

Впервые выявлен механизм созревания 30S субъединицы рибосомы из S. aureus на последних этапах сборки и определена роль RimP в этом процессе.

Научная и практическая ценность

Информация о роли RimM и RimP в механизме созревания 30S субъединицы рибосомы из S. aureus могут быть использованы для создания новых противомикробных агентов, которые будут препятствовать созреванию 30S субъединицы рибосомы на этапах формирования центрального декодирующего центра, который играет ключевую роль в процессах трансляции: инициации и элонгации.

Обоснованность и достоверность результатов обеспечена применением широко апробированных подходов на основе современных методов спектроскопии ЯМР высокого разрешения, спектроскопии ЭПР, малоуглового рентгеновского рассеяния и криогенной просвечивающей электронной микроскопии, а также согласием с расчетными данными, выполненных в общепринятых пакетах программ.

Положения выносимые на защиту

1. Сравнительный анализ карт распределения электростатического потенциала, полученных методами просвечивающей криогенной электронной микроскопии показывает, что связывание белкового фактора RimM с 30S субъединицей рибосомы Staphylococcus aureus на поздних этапах созревания рибосомы предшествует связыванию белкового фактора RimP.

2. Белок RimP позволяет спирали h44 16S рРНК принять конформацию соответствующую созревшему состоянию малой субъединицы рибосомы Staphylococcus aureus благодаря двухэтапному связыванию спирали h44 с рибосомным белком uS12.

3. Различия в механизме созревания 30S субъединицы рибосомы в грамположительных бактериях Staphylococcus aureus и в грамотрицательных бактериях Escherichia coli обусловлены отличаем в положениях положительно заряженных аминокислотных остатков С-концевого домена RimP и подвижной петли uS12, которые стабилизируют положение спирали h44 16S рРНК путем взаимодействия с отрицательно заряженным сахарофосфатным остовом рРНК.

Личный вклад автора. Участие в определении целей и задач исследования. Получение генетических конструкций с геном исследуемых белков: pETGBla:: rimM, pETGBla:: ntdrimM, pETGB1a::rimP и pACYC_Duet::rimP-us12. Оптимизация условий экспрессии и очистки белков RimM, N-домена белка RimM, RimP и белкового комплекса RimP-uS12. Регистрация и отнесение сигналов в спектрах ЯМР, расчет и анализ структуры белков RimM и RimP методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Определение взаимной ориентации белков RimP и uS12 из S. aureus методами спектроскопии ЭПР и методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Оптимизация условий выделения и очистки 30S субъединицы рибосомы S. aureus для структурных исследований. In vitro реконструкция комплекса RimM и RimP c 30S субъединицей рибосомы S. aureus. Реконструкция крио-ЭМ карт распределения электростатического потенциала комплекса 30S*RimM и 30S*RimP из S. aureus. Получение структуры комплексов 30S*RimP из S. aureus.

Апробация работы

Работа выполнялась в лаборатории структурного анализа биомакромолекул Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр Российской академии наук», научно-исследовательской лаборатории «Структурная биология» Института фундаментальной медицины и биологии, а также научной лаборатории ЯМР кафедры медицинской физики Института физики Казанского (Приволжского) федерального университета. Основные результаты работы были апробированы на следующих российских и международных научных школах и конференциях: XX Зимняя молодежная школа ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 25 февраля -2 марта 2019 г.); Международная школа по криоэлектронной микроскопии RICCEM (Москва, 30 мая-2 июня 2021г.); XXII Зимняя молодежная школа ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 27 февраля - 4 марта 2023 г.); Итоговая научно-образовательная конференция КФУ (Казань, 2023); 4 Международная школа по криоэлектронной микроскопии RICCEM (Москва, 4-7 июня 2023г.); Международная школа по криоэлектронной микроскопии School of Advanced Science in Cryo-electron Microscopy 2023 (Бразилия, Сан-Паулу, 10-21 июля 2023).

На отдельных этапах работа была поддержана грантом РФФИ №20-3470021, стипендией им. М.В. Остроградского посольства Франции в России и государственным заданием ФИЦ «Казанский научный центр РАН».

Публикации. Список авторской литературы по теме диссертации включает 9 наименований. Из них 3 научные статьи в международных рецензируемых журналах, индексируемых базами данных РИНЦ, Web of Science и Scopus, и 6 публикаций в специальных выпусках журналов, опубликованных в рамках международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы из 128 наименований. Работа изложена на 166 страницах содержит 79 рисунков и 8 таблиц.

Во введении представлено обоснование актуальности диссертационной работы, сформулированы цели и задачи, приведены объекты и методы их исследования, отмечены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

В первой главе изложен обзор литературы по теме исследования. Представлена структура, механизм работы и роль 30S субъединицы рибосомы в процессе трансляции. А также приведено описание исследуемых в работе белков RimM и RimP, обусловливающее выбор данных объектов для представленной работы.

Во второй главе приведена краткая информация о физических методах, позволяющих оценить стабильность белка. Подробно описаны методы дифференциальной сканирующей флуориметрии (NanoDSF), а также статического (СРС) и динамического рассеяния света (ДРС).

В третьей главе представлены общие принципы для исследования структур макромолекул, использованные в диссертационной работе. А именно, методики электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), такие как сайт-направленное спиновое мечение и импульсная последовательность ДЭЭР (двойной электрон-электронный резонанс DEER или Double electron-electron resonance), позволяющая определить расстояние между двумя парамагнитными метками. Методы МУРР (малоуглового рентгеновского рассеяния, Small-angle X-ray scattering или SAXS), позволяющие вычислить радиус гирации макромолекулы, ее объем, а также рассчитать электронную плотность макромолекулы. Описаны методики спектроскопии ЯМР высокого разрешения для установления структуры макромолекулы, общие принципы многомерных ЯМР экспериментов и метод расчета структуры белков по данным спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Последним методом, представленным в третьей главе, является крио-электронная микроскопия и реконструкция трехмерной карты по данным крио-ЭМ.

В четвертой главе описываются объекты исследования, протоколы подготовки образцов для дальнейших структурных исследований, а также параметры экспериментов.

Пятая глава включает в себя два раздела, первый из которых посвящен исследованию структуры белка RimM методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения, а также анализу крио-ЭМ карты распределения электростатического потенциала комплекса 30S*RimM.

Второй подраздел пятой главы включает в себя структурные исследования белкового фактора созревания рибосомы P (RimP). В этом подразделе представлен анализ аминокислотной последовательности белка из разных организмов. Продемонстрированы структурные исследования белка RimP методами спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Методами спектроскопии ЭПР определено положение доменов белка RimP относительно рибосомного белка uS12. Проведен анализ электронной плотности белка RimP с рибосомным белком uS12 методами МУРР. А также получена крио-ЭМ структура комплекса 30S*RimP, на основе анализа которой выдвинута теория о роли RimP в созревании 30S субъединицы рибосомы S. aureus.

1 Обзор литературы

1.1 Введение

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus, S. aureus) -грамположительная условно-патогенная бактерия, вызывающая многочисленные нозокомиальные инфекции мягких тканей. Благодаря своей способности вырабатывать факторы патогенности она быстро приобретает устойчивость к антибиотикам. Эта способность привела к появлению новых штаммов S. aureus с множественной устойчивостью к антибиотикам (VRSA -ванкомицин-резистентный золотистый стафилококк, MRSA — мецитиллин-резистентный золотистый стафилококк, GISA - гликопептид-резистентный золотистый стафилококк). Одним из способов борьбы с патогеном является остановка синтеза и высвобождения его факторов патогенности. Согласно центральной догме молекулярной биологии процесс передачи информации в клетке осуществляется согласно схеме: ДНК^ РНК ^ БЕЛОК, и нарушение любого из этих этапов может привести к гибели клетки.

Процесс передачи (копирования) генетической информации из ДНК на РНК (мРНК) называется транскрипцией, а из РНК (мРНК) на белок-трансляцией (Рисунок 1.1).

Ферментом, катализирующим образование комплементарной ДНК молекулы мРНК, в процессе транскрипции, является РНК-полимераза (Рисунок 1.1). Согласно принципу комплементарности за счет образования водородных связей: аденин формирует парный комплекс с урацилом (в РНК), а гуанин с цитозином.

Транскрипция

полимераза

мрнк ммммммммммммиммшмммшмммм

Рисунок 1.1. Схема биосинтеза белка

Следующая стадия - трансляция (синтез белка на матричной РНК), включает в себя четыре основных этапа: инициация, элонгация, терминация и рециклинг.

Бактериальная 70S рибосома состоит из двух субъединиц: малой (30S) субъединицы и большой (50S) субъединицы, каждая из которых играет специфическую роль в трансляции белков.

Инициация

Ь,

9^1 \§ Щ1 50:

IF3 К РИнициаторнЯ

EF-G ГТФ

Рисунок 1.27. Схема биосинтеза белка в бактериях. Адаптировано из [14]

Инициация трансляции осуществляется с участием инициаторной тРНК (fMet-тРНК) (Рисунок 1.2). Большинство прокариотических мРНК содержат перед стартовым кодоном нетранслируемую область, называемую последовательностью Шайна-Дальгарно (AGGAGG), которая имеет комплементарную последовательность с З'-концом 16S рРНК 30S субъединицы рибосомы (CCUCCU) (Рисунок 1.3) [15-17]. Эта комплементарность используется для правильного позиционирования стартового кодона AUG в Р-сайте рибосомы во время инициации (Рисунок 1.3А). Затем с 30S субъединицей рибосомы связывается белок, который называется инициаторный фактор 1 (ИФ1, в англоязычной литературе Initiation Factor 1 или IF1). Он взаимодействует с 16S рРНК 30S субъединицы рибосомы в А сайте, посредством преимущественно электростатических взаимодействий (Рисунок 1.2, Рисунок 1.3) [18]. Это связывание приводит к

структурной перестройке спирали h44 малой субъединицы рибосомы, обеспечивая корректное связывание антикодона тРНК с кодоном мРНК [19]. Кроме того, в новом конформационном состоянии спираль h44 обеспечивает множество контактов с 50S субъединицей рибосомы. После этого в E-сайте с 30S субъединицей рибосомы связывается инициаторный фактор 3 (ИФ3, в англоязычной литературе Initiation Factor 3 или IF3) [20-22]. А инициаторный фактор 2 (ИФ2, в англоязычной литературе Initiation Factor 2 или IF2) образует комплекс с инициаторной тРНК и доставляет ее в Р- сайт 30S субъединицы [23, 24]. Инициаторные факторы ИФ2 и ИФ3 ускоряют связывание 30S субъединицы с 50S субъединицей рибосомы (Рисунок 1.4), после чего покидают образовавшуюся 70S рибосому, а процесс трансляции переходит к следующему этапу- элонгации.

Рисунок 1.3. Структура 30S субъединицы рибосомы из Пегтш ^егторЫ1ш (PDB: 1HR0). А) Положение А, Р и Е-сайта, а также иллюстрация последовательности Шайна-Дальгарно. Б) Положение инициаторного фактора 1, рибосомного белка uS12 и спирали h44 на 30S субъединице

рибосомы

Элонгация начинается с конформационного изменения в P-сайте вызванного формилметионин-тРНК (fMet-тРНК), это позволяет открыться А-сайту для связывания новой комплементарной кодону мРНК аминоацил-тРНК (аа-тРНК) (Рисунок 1.4). Связыванию способствует фактор элонгации Tu (EF-Tu).

Таким образом, в P-сайте рибосомы располагается тРНК, несущая на своем конце первый аминокислотный остаток синтезируемой полипептидной цепи, а в A-сайте находится тРНК, несущая на 3'-конце следующую аминокислоту, согласно генетическому коду (Рисунок 1.4). После образования ковалентной пептидной связи между аминокислотами происходит процесс, называемый транслокацией, во время которого мРНК в декодирующем центре сдвигается на три нуклеотида (кодон), тРНК, несущая пептид переносится из А- в Р-сайт, а деацилированная тРНК переносится из Р- в E-сайт (сайт выхода). Энергия для каждого смещения рибосомы передается факторами элонгации, которые гидролизуют ГТФ (Elongation Factor G, EF-G). Энергия ГТФ необходима как для связывания новой аминоацил-тРНК с А- сайтом, так и для ее транслокации в Р- сайт после образования пептидной связи (Рисунок 1.3).

Рисунок 1.4. Схема вторичной структуры тРНК в форме клеверного листа (слева) и таблица генетического кода (справа). Кругами, на структуре тРНК, отмечены нуклеотидные остатки; линиями обозначены пары оснований; точками - позиции, в которых могут быть дополнительные нуклеотиды. Инвариантные основания обозначены соответствующими знаками, где А — это аденин, Т — тимин, G — гуанин, С — цитидин, ¥ — псевдоуридин, «Ри» означает пуриновое основание, «Руг» — пиримидиновое основание.

Адаптировано из [25]

Транслокация прекращается при появлении стоп-кодона (UAA, UAG или UGA) в А-сайте, что провоцирует связывание факторов терминации (RF1 и RF2) (в англоязычной литературе Release Factor или RF), структурно гомологичных с тРНК и присоединяющих молекулы воды к карбоксильному концу аминокислоты. Что позволяет аминокислоте, прикрепленной к тРНК в Р-сайте отсоединиться от нее, а образовавшемуся белку, выйти из рибосомы через выходной туннель находящийся в 50S субъединице рибосомы (Рисунок

1.2) [26]. Малая и большая рибосомные субъединицы отсоединяются от мРНК и друг от друга и почти сразу же участвуют в следующем цикле трансляции.

Любые ошибки в трансляции могут привести к гибели клетки. Поскольку ключевую роль в этом процессе играют рибосомы, формирование функциональной пространственной структуры данных молекулярных комплексов, в частности, конформация декодирующего центра рибосомы, особенно спирали h44 и шеи 30S субъединицы, роль которых описана выше, принципиально важна для биосинтеза белка. Рассмотрим более детально процесс формирования или сборки (созревания, биогенеза) рибосомы.

Сборка 30S субъединицы рибосомы

Малая субъединица рибосомы состоит из 16S рРНК и 21 рибосомного белка (р-белков), связывающихся с 16S рРНК в процессе созревания [1,2]. В морфологии 30S субъединицы рибосомы принято выделять 4 части (4 домена 16S рРНК): голова (3'- мажорный домен), тело (3'-минорный домен, 5'-домен), платформа (центральный домен) и шея, соединяющая тело и голову (Рисунок 1.5) [15]. На рисунке 1.5 справа представлена передняя сторона 30S-субъединицы, участвующая в связывании с 50S-субъединицей.

спираль И44

Рисунок 1.5. Морфология 30S субъединицы рибосомы. Слева представлена структура 16S рРНК, справа- третичная структура созревшей 16S рРНК.

Цвета доменов на двух изображениях совпадают

Биогенез бактериальных рибосомных субъединиц начинается с транскрипции первичного транскрипта рРНК, который содержит предшественников 16S рРНК, 23S рРНК, 5S рРНК и некоторых тРНК [27,28] (Рисунок 1.6). Предшественники рРНК и тРНК сворачиваются до их вырезания из первичного транскрипта. Наличие непроцессированных 5'- и 3'-концов в предшественниках рРНК является критическим для получения нативной структуры рибосомных субъединиц. Поэтому процессинг рРНК происходит на заключительном этапе биогенеза рибосомы. В то время, как связывание рРНК и р-белков и их модификация специфическими ферментами происходят одновременно со сворачиванием рРНК. Связывание р-белков с рРНК происходит иерархически, что является очень важным для получения рибосомы с правильной конформацией [29].

На поздних этапах сборки, таких как формирование функциональных центров рибосомы, часто возникают кинетические ловушки -конформационные локальные минимумы энергии, которые соответствуют

ошибочным конформациям рРНК, возникающим в результате вырожденных локальных взаимодействий [30]. Для того чтобы избежать эти кинетические ловушки и обеспечить правильное созревание рибосомы существуют факторы сборки рибосомы.

Первичный транскрипт

пре- 16Б рРНК

Рисунок 1.6. Основные этапы созревания бактериальной ЗОБ субъединицы

рибосомы. Р-белки, представленные на карте сборки, обозначены буквами и -

универсальные (встречающиеся в бактериях и эукариотах), и Ь-

бактериальные 22

Факторы биогенеза рибосомы (факторы сборки рибосомы) — это широкий спектр белков, способствующих формированию функциональных центров рибосомы. Инактивация этих факторов приводит к образованию дефектных рибосом, вызывающих ошибки трансляции [31].

Сборка 30S-субъединицы начинается в нескольких местах 16S пре-рРНК по параллельным путям, где сначала формируется 5'-домен тела, затем центральная платформа и основной домен и, под конец, З'-минорный домен с функционально важным декодирующим центром (ДЦ, в англоязычной литературе central decoding region или CDR) (Рисунок 1.6) [27-29]. Декодирующий центр контролирует образование пар кодон-антикодон во время трансляции. Он располагается между телом и головой 30S субъединицы рибосомы и включает в себя: верхнюю часть спирали h44, спираль h45, спираль h27, часть спирали h28, находящуюся на шее 30S субъединицы, и центральный псевдоузел, находящийся между шеей, телом и платформой 30S субъединицы (Рисунок 1.6). Одним из критических участков ДЦ является спираль h44 16S рРНК, которая участвует в связывании с 50S субъединицей рибосомы и может приводить к ошибкам инициации и элонгации [5, 32-36].

В сборке декодирующего центра 30S субъединицы рибосомы учавствуют такие факторы сборки, как RimM (Рибосомный фактор созревания рибосомы М, в англоязычной литературе Ribosome maturation factor M) и RimP (Рибосомный фактор созревания рибосомы P, в англоязычной литературе Ribosome maturation factor P), делеция генов которых, является критической для функциональности рибосомы.

1.2 Фактор созревания рибосомы M (RimM)

RimM является одним из факторов созревания 30S субъединицы

участвующих на поздних этапах сборки рибосомы. RimM широко сохраняется

среди бактерий, а RimM-связанные белки обнаружены у четырех

эукариотических видов: паразитов малярии Plasmodium falciparum и

Plasmodium yoelii, малярийных москитов Anopheles gambiae и хлоропласт

23

растения Arabidopsis thaliana [37]. Примечательно, что белок RimM связывается со свободной, несозревшей 30S субъединицей, и не связывается с 30S-субъединицей, в составе ассоциированной 70S рибосомы [38].

Предыдущие исследования показали, что белок RimM участвует в созревании определенной области, состоящей из спиралей h31 и h33b 16S рРНК, а также р-белков uS13 и uS19, находящихся в головном домене 30S субъединицы рибосомы [37]. Снижение уровня глутатион- S- трансферазы также доказало, что белок RimM связывается с р-белком uS19. Кроме того, на основе карты связывания р-белков, где р-белки классифицируются как ранние, средние, среднепоздние и поздние, белки uS2, uS13 и uS19 относятся к числу поздних р-белков, участвующих в сборке головы 30S субъединицы (Рисунок 1.6) [29, 39-41]. Связывание р-белка uS19 со спиралью h33b 16S рРНК вызывает конформационные изменения в 3'-концевом домене 16S рРНК [42].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гараева Наталия Сергеевна, 2024 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Wimberly,B.T. Structure of the 30S ribosomal subunit/ Wimberly,B.T., Brodersen,D.E., Clemons,W.M.Jr, Morgan-Warren,R.J., Carter,A.P., Vonrhein,C., Hartsch,T. and Ramakrishnan,V.// Nature.- 200.- V.407.-P.327-339.

2. Culver,G.M. Assembly of the 30S ribosomal subunit / Culver G.M// Biopolymers.- 2003.- V. 68.-P. 234-249.

3. Talkington, M.W. An assembly landscape for the 30S ribosomal subunit/ Talkington,M.W., Siuzdak,G. and Williamson,J.R. //Nature - 2005.-V. 438, P.628-632.

4. Adilakshmi,T. Concurrent nucleation of 16S folding and induced fit in 30S ribosome assembly/ Adilakshmi,T., Bellur,D.L. and Woodson,S.A.// Nature.-2008- P.455.-V. 1268-1272.

5. Mulder,A.M. Visualizing ribosome biogenesis: parallel assembly pathways for the 30S subunit/ Mulder,A.M., Yoshioka,C., Beck,A.H., Bunner,A.E., Milligan,R.A., Potter,C.S., Carragher,B. and Williamson,J.R.// Science.-2010.- V.330.- P.673-677.

6. Dutca, L. M. Assembly of the 5' and 3' minor domains of 16S ribosomal RNA as monitored by tethered probing fromribosomal protein S20/ Dutca, L. M. and Culver, G. M.// J. Mol. Biol.-2008.- V.376.- P.92-108.

7. Yusupova, G.Z.The path of messenger RNA through the ribosome/ Yusupova,G.Z., Yusupov,M.M., Cate,J.H.D., Noller,H.F.// Cell.-2001.- V.106 (2)- P.233-241.

8. Schuwirth,B.S. Structures of the Bacterial Ribosome at 3.5 Â Resolution/ Schuwirth,B.S., Borovinskaya,M.A., Hau,C.W., Zhang,W., Vila-Sanjurjo,A., Holton,J.M., et al.// Science.-2005.- V.310 (5749).- P.827-834.

9. Selmer, M. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA/ Selmer M., Dunham C.M., Murphy F.V., Weixlbaumer A., Petry S., Kelley A. C.// Science.- 2006.- V.313 (5795).- P.1935-1942.

10. Demeshkina, N. A new understanding of the decoding principle on the ribosome/ Demeshkina N., Jenner L., Westhof E., Yusupov M. and Yusupova G.// Nature.- 2012.-V.484.- P.256-259.

11. Rozov,A. Structural insights into the translational infidelity mechanism/ Rozov A., Demeshkina N., Westhof E., Yusupov M. and Yusupova G.// Nat. Commun.-2015.- V.6.- P.7251-7259.

12. Rozov, A. Novel base-pairing interactions at the tRNA wobble position crucial for accurate reading of the genetic code/ Rozov A., Demeshkina N., Khusainov I., Westhof E., Yusupov M. and Yusupova G.// Nat. Commun.-2016.- V.7.- P.10457-10510.

13. Rozov,A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction/ Rozov A., Khusainov I., El Omari K., Duman R., Mykhaylyk V., Yusupov M.// Nat. Commun.-2019.- V.10.- P.2519.

14. Schmeing, M. T. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation/ Schmeing, M. T. and Ramakrishnan V.//Nature.-2009.- V.461(7268).- P.1234-1242.

15. Laursen, B.S. Initiation of protein synthesis in bacteria/ Laursen BS, Sorensen HP, Mortensen KK, Sperling-Petersen HU// Microbiol. Mol. Biol. Rev.-2005.- V.69.-P.101-123.

16. Shine, J. The 3' terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding site/ Shine J. and Dalgarno L.// Proc Natl Acad Sci USA.-1974.-V. 71(4).-P.1342-1346.

17. Steitz, J. A. How ribosomes select initiator regions in mRNA: base pair formation between the 3' terminus of 16S rRNA and the mRNA during

initiation of protein synthesis in Escherichia coli/ Steitz J. A. and Jakes K.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1975.- V.72(12). - P.4734-4738,.

18. Dahlquist, K. D. Interaction of translation initiation factor IF1 with the E. coli ribosomal A site/ Dahlquist K. D. and Puglisi J. D.// Journal of Molecular Biology.-2000.- V.299(1).- P.1-15.

19. Carter, A. P. Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit/ Carter A. P., Clemons W. M. J., Brodersen D. E., MorganWarren R. J., Hartsch, T., Wimberly, B. T., and Ramakrishnan, V.// Science.-2001.- V.291.-P.498-501.

20. Allen, G. S. The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli/ Allen G. S., Zavialov A., Gursky R., Ehrenberg M., and Frank J.// Cell.-2005.- V.121(5).-P.703-712.

21. Pioletti, M. Crystal structures of complexes of the small and ribosomal subunit with tetracycline, edeine and IF3/ Pioletti M., Schlünzen F., Harms J., Zarivach R., Glühmann M., Avila H., Bashan A., Bartels H., Auerbach T., Jacobi C., Hartsch T., Thomas A., and Franceschi F.// The EMBO Journal.-2001.- V.20(8). - P.1829-1839.

22. Kaempfer, R. Initiation factor IF-3: a specific inhibitor of ribosomal subunit association/ Pioletti M., Schlünzen F., Harms J., Zarivach R., Glühmann M., Avila H., Bashan A., Bartels H., Auerbach T., Jacobi C., Hartsch T., Thomas A., Franceschi F.// J Mol Biol.-1972.- V.71(3).-P.583-598.

23. Gualerzi, C. O. Molecular dissection of translation initiation factor IF2. evidence for two structural and functional domains/ Gualerzi C. O., Severini M., Spurio R., La Teana A., Pon C. L.// J Biol Chem.-1991.- V.266(25).-P.16356-16362.

24. Simonetti, A. Structure of the 30S translation initiation complex/ Simonetti A., Marzi S., Myasnikov A. G., Fabbretti A., Yusupov M., Gualerzi C. O., Klaholz B. P// Nature.-2008.- V.455(7211).-P.416-420.

25. tRNA [Электронный ресурс]/ Режим доступа: https://de.wikipedia.org/wiki/TRNA (Дата обращения: 26.09.23)

26. Mitra, K. Structure of the E. coli protein-conducting channel bound to at translating ribosome/K. Mitra, Christiane Schaffitzel, Tanvir Shaikh, Florence Tama, Simon Jenni, Charles L Brooks, Nenad Ban, Joachim Frank// Nature.-2005.-V.438.- p.318.

27. Woodson, S.A. RNA folding and ribosome assembly/ Sarah A. Woodson, T.C. Jenkins, Johns Hopkins//Curr. Opin. Chem. Biol.- 2008.-V.12.-P.667-673.

28. Woodson, S.A. RNA folding pathways and the self-assembly of ribosomes/ Sarah A. Woodson, T. C. Jenkins, Johns Hopkins// Chem. Res. -2011.- V.44.-P.1312-1319.

29. Held, W.A. Assembly mapping of 30 S ribosomal proteins from Escherichia coli./ W.A. Held, B. Ballou, S. Mizushima, M. Nomura// J. Biol. Chem. -1974. - V.249 - P.3103-3111.

30. Woodson, S.A. Recent insights on RNA folding mechanisms from catalytic RNA// Cell. Mol.Life Sci..- 2000.-V.57.-P. 796-808.

31. Connolly,K. Deconstructing ribosome construction/ Connolly,K., Culver, G.// Trends Biochem. Sci.-2009.- V.34.- P.256-263.

32. Schluenzen, F. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution/ Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann, M. Janell D., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F.// Cell- 2000.- V.102.-P.615-623.

33. Gabashvili, I.S. Solution structure of the E. coli70S ribosome at 11.5 A resolution/ Gabashvili I.S., Agrawal R.K., Spahn C.M., Grassucci R.A., Svergun D.I., Frank J., Penczek P.// Cell- 2000.- V.100.- P.537-549.

34. Yusupov, M.M. Crystal structure of the ribosome at 5.5 Ä resolution/ Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H.D., Noller N.F.// Science- 2001.- V.292- P.883-896.

35. Bylund, G.O. RimM and RbfA are essential for efficient processing of 16S rRNA in Escherichia coli/ Wipemo L.C., Lundberg L.A., Wikström P.M./ J. Bacteriol. -1998.- V.180.- P.73-82.

36. Goto, S. RsgA releases RbfA from 30S ribosome during a late stage of ribosome biosynthesis/ Goto S., Kato S., Kimura T., Muto A., Himeno H.// EMBO J. -2011.- V.30.- P.104-114.

37. Lövgren, J.M. The PRC-barrel domain of the ribosome maturation protein RimM mediates binding to ribosomal protein S19 in the 30S ribosomal subunits/ J.M. Lövgren, G.O. Bylund, M.K. Srivastava, L.A. Lundberg, O. P. Persson, G. Wingsle, P.M. Wikström//RNA. - 2004. - V.10 - P.1798-1812.

38. Bylund, G.O. A novel ribosome-associated protein is important for efficient translation inEscherichia coli. [Text]/ G. O. Bylund, B. C. Persson, L.A. Lundberg, P.M. Wikström//J. Bacteriol. - 1997. - V.179 - P.4567-4574.

39. Grondek, J.F. Assembly of the 30S ribosomal subunit: positioning ribosomal protein S13 in the S7 assembly branch/J.F.Grondek, G.M. Culver// RNA. -1997. -V.10 - P.1861-1866.

40. Mizushima, S. Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from E.coli./ S. Mizushima, M. Nomura// Nature. - 1970.- V.226 - P.1214- 1218.

41. Powers, T. Dynamics ofin vitroassembly of 16 S rRNA into 30 S ribosomal subunits/ T. Powers, G. Daubresse, H.F. Noller//J. Mol. Biol. - 1993. - V.232 - P.362-374.

42. Holmes, K.L. 2004. Mapping structural differences between 30S ribosomal subunit assembly intermediates / K.L. Holmes, and G.M. Culver//Nat. Struct. Mol. Biol.- 2004. - V.11 - P.179-186.

43. Leong, V. Escherichia coli rimM and yjeQ null strains accumulate immature 30S subunits of similar structure and protein complement/ Leong V., Kent M., Jomaa A., Ortega J.// RNA.- 2013.- V.19- P.789-802.

44. Guo, Q. Dissecting the in vivo assembly of the 30S ribosomal subunit reveals the role of RimM and general features of the assembly process/ Guo Q., Goto S., Chen Y., Feng B., Xu Y., Muto A., Himeno H., Deng H., Lei J., Gao N.// Nucleic Acids Res.- 2013.- V.41.- P.2609-2620

45. Bunner, A.E. The effect of ribosome assembly cofactors on in vitro 30S subunit reconstitution/ Bunner A.E., Nord S., Wikström P.M., Williamson J.R.// J. Mol. Biol.- 2010.- V.398.- P.1-7.

46. Suzuki, S. Structural Characterization of the Ribosome Maturation Protein, RimM/ Sakura Suzuki, Ayako Tatsuguchi, Eiko Matsumoto, Masahito Kawazoe, Tatsuya Kaminishi, Mikako Shirouzu, Yutaka Muto, Chie Takemoto, Shigeyuki Yokoyama// JOURNAL OF BACTERIOLOGY. -2007. - V.189 - P.6397-6406.

47. Nord, S. The RimP protein is important for maturation of the 30S ribosomal subunit/ Nord S., Bylund G.O., Lövgren J.M., Wikström P.M.// J. Mol. Biol. -2009.- V.386.- P.742-753.

48. Chang, J. Identification of novel attenuated Salmonella enteritidis mutants/ Chang J., Pang E., He H., Kwang J.// FEMS Immunol.Med. Microbiol.-2008.- V.53.- P.26-34.

49. Poonam, Ribosomal maturation factor (RimP) is essential for survival of non-tuberculous mycobacteria Mycobacterium fortuitum under in vitro acidic stress conditions/ Poonam, Yennamalli, R.M., Bisht G.S., Shrivastava R.// 3 Biotech.- 2019.- V.9.- p.127.

50. Traub,P. Structure and function of E. coli ribosomes. VI. Mechanism of assembly of 30S ribosomes studied in vitro/ Traub,P. and Nomura,M.// J Mol Biol.- 1969.-V.40.-P.391-413.

51. Sashital,D.G. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30S subunit assembly in E. coli/ Sashital

D.G., Greeman C.A., Lyumkis D., Potter C.S., Carragher B. and Williamson J.R.// Elife.-2014.- V.3.-P.1-26.

52. Maksimova,E. Protein Assistants of Small Ribosomal Subunit Biogenesis in Bacteria/ Maksimova E., Kravchenko O., Korepanov A. and Stolboushkina

E.// Microorganisms.-2022.- V.10.- p.747.

53. Schedlbauer,A. A conserved rRNA switch is central to decoding site maturation on the small ribosomal subunit/ Schedlbauer A., Iturrioz I., Ochoa-Lizarralde B., Diercks T., Lopez-Alonso J.D., Lavin J.L., Kaminishi T., Çapuni R., Dhimole N., de Astigarraga E.// Sci. Adv.-2021.- V.7.-P.603-608.

54. Yu, L.Solution structure and function of a conserved protein SP14.3 encoded by an essential Streptococcus pneumoniae gene/ Yu L., Gunasekera A.H., Mack J., Olejniczak E.T., Chovan L.E., Ruan X., Towne D.L., Lerner C.G., Fesik S.W.// J. Mol. Biol. -2001.- V.311.-P. 593-604.

55. Chu, T. The ribosomal maturation factor P from Mycobacterium smegmatis facilitates the ribosomal biogenesis by binding to the small ribosomal protein S12/ Chu T., Weng X., Law C.O.K., Kong H.K., Lau, J., Li S., Pham H.Q., Wang R., Zhang L., Kao R.Y.T.// J. Biol. Chem.- 2019.- V.294.- P.372-378.

56. Schedlbauer, A. Backbone and sidechain NMR assignments for the ribosome maturation factor RimP from Escherichia coli/ Schedlbauer A., Ochoa-Lizarralde B., Iturrioz I., Çapuni R., Diercks T., de Astigarraga E., Fucini P., Connell S.R.// Biomol. NMR Assign.- 2020.- V.14.-P.189-193.

57. Schumacher, M.A. Structures of the pleiotropic translational regulator Hfq and an Hfq-RNA complex: A bacterial Sm-like protein/ Schumacher M.A., Pearson R.F., Moller T., Valentin-Hansen P., Brennan R.G.// EMBO J.-2022.-V.21.- P.3546-3556.

58. Kajitani, M. Regulation of the Escherichia coli hfq gene encoding the host factor for phage Q beta/ Kajitani M., Kato A., Wada A., Inokuchi Y., Ishihama A.// J. Bacteriol.-1994.- V.176.- P.531-534.

59. Käufl, F. Protein Stability Measurement Instrument / Käufl F, Rapp F.// Genetic Engineering & Biotechnology News. -2015.-V.35 (4).

60. Joseph R. Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy/ Joseph R. Lakowicz// 2006.-V.16.-P.1-673.

61. Walker., M.S. Exciplex formation in the excited state/ Walker M.S., Bednar T.W., Lumry R.// J Chem Phys.- 1966.-V.45.- P.3455-3456.- p.31.

62. Hershberger., M.V. The 3-methylindole/nbutanol exciplex: evidence for two exciplex sites in indole compounds/ Hershberger M.V., Lumry R., Verral R.// Photochem Photobiol.- 1981.-V.33.-P.609-617.

63. Strickland, E.H. Near-ultraviolet absorption bands of tryptophan: studies using indole and 3-methylindole as models/ Strickland E.H., Horwitz J., Billups C.// Biochemistry. - 1970.-V.9(25).-P.4914-4920.

64. Lasser, N. Exciplex formation between indole derivatives and polar solutes/ Lasser N, Feitelson J, Lumry R.// Isr J Chem.-1977.- V.16, P.330-334.

65. Sun, M. Solvent effects on the fluorescent states of indole derivatives-dipole moments/ Sun M., Song P.S.//Photochem Photobiol.-1977.- V.25.-P.3-9.

66. Lami, H. Indole's solvatochromism revisited/ Lami H., Glasser N.// J Chem Phys.-1986.- V.84(2).-P.597-604

67. Pierce, D.W. Stark effect spectroscopy of tryptophan/ Pierce D.W., Boxer S.G.// Biophys.-1995.- V. 68, P.1583-1591

68. Debye, P. Molecular-weight determination by light scattering/ Debye P.// J. Phys. Colloid Chem. -1947.- V.51 (1).-P.18-22.

69. Zimm, B.H. The scattering of light and the radial distribution function of high polymer solutions/ Zimm B.H. // J. Chem. Phys.-1948.- V.16 (12).- P.1093-1099.

70. Chu, B. Laser light scattering/ Chu B. // Academic Press, New York.- 1974.

71. Pecora, R. Dynamic light scattering. Applications of photon correlation spectroscopy/ Pecora R.// Plenum Press New York.- 1985.

72. Schmitz, K.S. An introduction to Dynamic light scattering by macromolecules/ Schmitz K.S. // Academic Press New York.- 1990.

73. Oberthuer, D. Monitoring and scoring counter-diffusion protein crystallization experiments in capillaries by in situ dynamic light scattering/ D. Oberthuer, E. Melero-Garcia, K. Dierks, A. Meyer, C. Betzel, A. GarciaCaballero, J.A. Gavira J.// PlosOne.-2012.-V. 7 .

74. Hutchings, J. Fine details in complex environments: the power of cryo-electron tomography/ J. Hutchings and Giulia Zanetti // Biochemical Society Transactions.- 2018.- V. 46(4). - P.807-816.

75. Evans, R.(2023). Illuminating intrinsically disordered proteins with integrative structural biology/ Evans R., Ramisetty S., Kulkarni P. and Weninger K.// Biomolecules.-V.13 (1)7- P.124.

76. Nadeau, OW. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine/ Ganten D, Ruckpaul K// Springer Berlin.- 2006.

77. Smith, D. Simple Alkanethiol Groups for Temporary Blocking of Sulfhydryl Groups of Enzymes/ Smith D, Maggio E., Kenyon G// Biochem.-1975.-V.14.-P.766-761.

78. Likhtenshtein, G. Nitroxides: Applications in Chemistry, Biomedicine, and Material Science/ Likhtenshtein G., Yamauchi J., Nakatsuji S.I., Smirnov A.I. and Tamura R.//Angewandte Chemie International Edition. -2008.- V.47, P.9579-9590.

79. Kokorin, A.I. Nitroxides-theory, experiment and applications/ Kokorin A.I.// IntechOpen, Cold Spring Harbor.-2012

80. Kuzhelev,A.A. Room-Temperature Distance Measurements Using RIDME and the Orthogonal Spin Labels Trityl/Nitroxide/ Kuzhelev A.A.,

Krumkacheva O.A., Shevelev G.Y., Yulikov M., Fedin M.V. and Bagryanskaya E.G.// Phys. Chem. Chem. Phys..-2018.-V. 20 (15).- P.10224-10230.

81. Berliner, L.J. A Novel Reversible Thiol Specific Spin Label: Papain Active Site Labeling and Inhibition/ Berliner LJ, Grunwald J, Hankovszky HO, Hideg K// Anal. Biochemistry.-1982.- V.119.-P.450-455.

82. Fedin, M., Multiple-Photon Transitions in EPR Spectroscopy/ Fedin M., Kalin M., Gromov I., Schweiger A.// J. Chem. Phys.-2004.- V.120.- P.1361.

83. Hubbell, W.L. Identifying Conformational Changes With Site-Directed Spin Labeling/ Hubbell WL, Cafiso DS, Altenbach C// Nature structural biology.-2000.- V.7.-P.735-739.

84. Debye, P. Scattering by an inhomogeneous solid/ P. Debye and A. M. Bueche// J. Appl. Phys.- 1949.-V.20.-P.518-525.

85. Debye, P. Scattering by an inhomogeneous solid the correlation function and its application/ P. Debye, H. R. J. Anderson, H. Brumberger// Journal of Applied Physics. - 1957.- V.28.- P.679-683.

86. Porod, G. Die Röntgenkleinwinkelstreuung von dichtgepackten kolloiden/ Porod G., Kolloid Z.// Systemen. -1951.- V.124.- p.83

87. Svergun., D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing/ D. I. Svergun// Biophys J. -1999.-P.879-2886.

88. Hongtao, Yu. Extending the size limit of protein nuclear magnetic resonance//Proc Natl Acad Sci U S A.- 1999.-V.96(2).- P.332-334.

89. Gordon, S. R. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy/ Gordon S. Rule, T. Kevin Hitchens// Springer Science & Business Media.- 2006 . - p.532

90. Keeler J. Understanding NMR Spectroscopy [Text]/ J. Keeler - Wiley, 2010. - 511 p.

91. Kay L. E., Torchia D. A., Bax A. Backbone dynamics of proteins as studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease // Biochemistry. - 1989. - V.28(23). - P. 8972-8979.

92. Lesovoy, D. M. NMR relaxation parameters of methyl groups as a tool to map the interfaces of helix-helix interactions in membrane proteins / D. M. Lesovoy, K. S. Mineev, P. E. Bragin et al. // Journal of Biomolecular NMR. -2017. - V.69 (3). -P. 165-179.

93. Reimer, L. & Hohl, H. Transmission Electron Microscopy - Physics of Image Formation//Springer.-2008.-606p.

94. Williams, D. B. Transmission Electron Microscopy/ Williams D. B., Carter C. B.// Springer. - 2009.-741p.

95. Hanszen, KJ. New knowledge on resolution and contrast in the electron microscope image// Naturwissenschaften.- 1967.-V.54.-P.125-133.

96. Hanszen, K.J. Die Phasenkontrast- und Amplitudenkontrast- Übertragung des elektronenmikroskopischen/ Hanszen, K.J., Morgenstern B.//Objectivs. Z. angew. Physik.-1965.- V.21.-p. 215.

97. van Heel, M. There is no corresponding record for this reference/van Heel M., Schatz M. J. //Struct. Biol.- 2005.- V.151.- p.250

98. Rohou, A. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs/ A. Rohou and N. Grigorieff // Journal of Structural Biology.-2015.-V.192(2). - P.216-221.

99. Penczek, P A. Fundamentals of three-dimensional reconstruction from projections// Methods Enzymol.-2010.- V.482.- P.1-33.

100. Rosenthal, P. B. There is no corresponding record for this reference/ Rosenthal P. B., Henderson R. J.// Mol. Biol.- 2003.- V.333.- p.721.

101. Grishin, N. V. KH domain: one motif, two folds// Nucleic Acids Res.- 2001.-V.29.-P. 638.

102. Wyatt, Strutz. Exploring protein stability by nanodsf// Biophysical Journal.-2016.- V.110(3).

103. Kotov,V., In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with MoltenProt./ Kotov V., Mlynek G., Vesper O., Pletzer M., Wald J., Teixeira-Duarte C.M., Celia H., Garcia-Alai M., Nussberger S., Buchanan S.K., Morais-Cabral J.H., Loew C., Djinovic-Carugo K. and Marlovits,T.C.// Protein Sci..-2021.- V.30.- P.201-217.

104. Stoll, S. EasySpin, a comprehensive software package for spectral simulation and analysis in EPR/ Stoll S. and Schweiger A.// Journal of magnetic resonance.-2006.- V.178(1).- P.42-55.

105. Russell, H. DEER Data Analysis Software: A Comparative Guide/ Russell H., Cura R., Lovett J. E. // Frontiers in Molecular Biosciences.-2022.- V.9 : 915167

106. Vranken,W.F. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline/ Vranken W.F., Boucher W., Stevens T.J., Fogh R.H., Pajon A., Llinas M., Ulrich E.L., Markley J.L., Ionides J., Laue E.D.// Proteins.-2005.- V.59- P.687-696.

107. Berjanskii., M. V. A simple method to predict protein flexibility using secondary chemical shifts/M. V. Berjanskii, D. S. Wishart, J. Am.//. Chem. Soc.- 2015.- V.127.- P.14970.

108. Asakura, T. The relationship between amide proton chemical shifts and secondary structure in proteins/T. Asakura, K. Taoka, M. Demura, M. P. Williamson, J.//Biomol. NMR.- 1995.- V.6.- P.227.

109. Daragan, V. A. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy / V. A. Daragan, K. H. Mayo// Progr. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc..- 1997.-V.31.-p. 63.

110. Kay, L. E. Backbone dynamics of proteins as studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease/L. E. Kay, D. A. Torchia, A. Bax// Biochemistry.- 1989.- V.28.-P. 8972.

163

111. Sattler, M. Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients/ Sattler M., Schleucher J. and Griesinger C// Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc..-1999.- V.34.- P.93-158.

112. Sattler, M. Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients/ Sattler M., Schleucher J. and Griesinger C// Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc..-1999.- V.34.- P.93-158.

113. Cornilescu,G. Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology/ Cornilescu G., Delaglio F., Bax A.// J Biomol NMR.-1999.- V.13.- P.289-302.

114. Bardiaux,B. ARIA for solution and solid-state NMR/ Bardiaux B., Malliavin T. and Nilges M// Methods Mol. Biol.-2012.- V.831.- P.453-483.

115. Williams,C.J. MolProbity: more and better reference data for improved allatom structure validation/ Williams C.J., Headd J.J., Moriarty N.W., Prisant M.G., Videau L.L., Deis L.N., Verma V., Keedy D.A., Hintze B.J., Chen V.B.// Protein Sci..-2018.- V.27.- P.293-315.

116. Laskowski,R.A. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR/ Laskowski R.A., Rullmannn J.A., MacArthur M.W., Kaptein R. and Thornton J.M.// J Biomol NMR.-1996.- V.8.- P.477-486.

117. Punjani,A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination/ Punjani A., Rubinstein J.L., Fleet D.J. and Brubaker M.A.// Nature Methods.-2017.- V.14.- P.290-296.

118. Kajitani,M. Regulation of the Escherichia coli hfq gene encoding the host factor for phage Q beta/ Kajitani M., Kato A., Wada A., Inokuchi Y. and Ishihama A.//J. Bacteriol.-1994.- V.176.- P.531-534.

119. Grzegorz, M. Cech. The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator/ Grzegorz M. Cech, Agnieszka Szalewska-

164

Palasz, Krzysztof Kubiak, Antoine Malabirade, Wilfried Grange, Veronique Arluison, and Grzegorz W^grzyn //Front Mol Biosci.- 2016.- V.3.- p.36.

120. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold// Nature.-2021.- V.596.- P.583-589.

121. Varadi, M. AlphaFold Protein Structure Database: massively expanding the structural coverage of protein-sequence space with high-accuracy models//Nucleic Acids Research.-2021.- V.50.- P.439-444.

122. Berliner, L. J. Distance Measurements in Biological Systems by EPR/ L. J. Berliner, S. S. Eaton, G. R. Eaton//Springer Science Business Media, New York, NY.- 2006.- Vol. 19

123. Belinite,M. Stabilization of Ribosomal RNA of the Small Subunit by Spermidine in Staphylococcus aureus/ Belinite M., Khusainov I., Soufari H., Marzi S., Romby P., Yusupov M. and Hashem Y.// Front. Mol. Biosci.-2021.- V.8. -P.738-752.

124. Afonine,P.V. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography/ Afonine P.V., Poon B.K., Read R.J., Sobolev O.V., Terwilliger T.C., Urzhumtsev A. and Adams P.D.// Acta Crystallogr. Sect. D. Struct. Biol.-2018.- V.74.- P.531-544.

125. Pettersen, E.F. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers/ Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Meng E.C., Couch G.S., Croll T.I., Morris J.H., Ferrin T.E.// Protein Sci.-2021.-V.30.-P. 70-82.

126. Emsley,P. Coot: model-building tools for molecular graphics/ Emsley P. and Cowtan K.// Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr.- 2004.- V.60.-P.2126-2132.

127. Ioannis, Amarantos. The identification of spermine binding sites in 16S rRNA allows interpretation of the spermine effect on ribosomal 30S subunit functions/ Ioannis Amarantos, Ioannis K. Zarkadis, Dimitrios L. Kalpaxis// Nucleic Acids Research.-2002.- V.30.- P.2832-2843.

165

128. Kazuei, Igarashi Effect of spermidine on N-formylmethionyl-tRNA binding to 30S ribosomal subunits and on N-formylmethionyl-tRNA dependent polypeptide synthesis/Kazuei Igarashi, Yasuhiro Watanabe, Kazunori Nakamura, Masaharu Kojima, Yoko Fujiki, Seiyu Hirose// BBRC.-1978.-V.83.-P.806-813.