Новый механизм регуляции инициации трансляции малыми молекулами в Esсherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Виноградова Дарья Сергеевна

• Виноградова Дарья Сергеевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Виноградова Дарья Сергеевна

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Структура 70S бактериальной рибосомы

1.1.1 Цикл элонгации на бактериальной рибосоме

1.2 Основные участники процесса инициации трансляции

1.1.2 Инициаторная fMet-tRNAfMet

1.1.3 Инициаторный фактор 1 (IF1)

1.1.4 Инициаторный фактор 2 (IF2)

1.1.5 Инициаторный фактор (IF3)

1.1.6 Функциональные особенности матричной РНК прокариот

1.2 Механизм инициации трансляции в прокариотической системе

1.3 Ингибиторы инициации трансляции

1.4 Строгий ответ

1.5 Метод микротермофореза

1.6 Метод дифференциальной сканирующей флуориметрии

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Буферы и растворы

2.1.2 Электрофоретическое разделение белков и нуклеиновых кислот

2.2 Приборы и оборудование

2.3 Выделение рибосом Escherichia coli

2.3.1 Выделение 70S рибосом

2.3.2 Выделение 30S и 50S рибосомных субъединиц

2.4 Приготовление компетентных клеток E. coli и их трансформация плазмидной ДНК

2.4.1 Приготовление компетентных клеток E. coli для химической трансформации и их трансформация плазмидной ДНК методом теплового шока

2.4.2 Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli и их трансформация плазмидной ДНК методом электропорации

2.5 Выделение инициаторных факторов трансляции

2.5.1 Выделение инициаторного фактора 1 (IF1)

2.5.2 Выделение инициаторного фактора 2 (IF2)

2.5.3 Выделение инициаторного фактора 3 (IF3)

2.6 Выделение элонгационного фактора EF-Tu

2.7 Выделение элонгационного фактора EF-G

2.8 Выделение фенилаланиновой синтетазы (PheRS)

2.9 Получение аминоацилированной тРНК

2.9.1 Получение fMet-tRNAfMet

2.9.2 Получение BODIPY-Met-tRNAfMet

2.9.3 Получение Phe-tRNAPhe

2.9.4 Получение BODIPY-Phe-tRNAPhe

2.9.5 Получение [14C]Lys-tRNALys

2.10 Получение матричной РНК

2.10.1 Получение синтетической мРНК - mMF1 (mRNA 022)

2.10.2 Получение флуоресцентно меченной мРНК (mMF1 - Fluorescein)

2.10.3 Получение мРНК mCER с мутациями в 5'-UTR

2.10.4 Получение природных мРНК mTufA, mInfA, mRnr, mTktB и их измененных конструктов

2.11 Получение алармонов (p)ppGpp: ppGpp и pppGpp

2.12 Образование инициаторного комплекса

2.13 Образование претранслокационного комплекса и синтез дипептида

2.14 Схема проведения эксперимента методом микротермофореза

2.15 Схема проведения эксперимента методом дифференциальной сканирующей флуориметрии

2.16 Схема проведения эксперимента методом остановленного потока

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Новый механизм регуляции инициации трансляции в E. coli при строгом ответе

3.1.1 Ингибирующее действие молекулы ppGpp на процесс образования 30S инициаторного комплекса

3.1.2 Зависимость ингибирующего действия алармона ppGpp от мРНК

3.1.3 Влияние термодинамики взаимодействий внутри мРНК на устойчивость к ингибирующему действию алармона ppGpp

3.1.4 Структурированный усилитель инициации трансляции (SETI)

3.2 Анализ престационарной кинетики образования 70S инициаторного комплекса во время строгого ответа

3.2.1 Влияние алармонов (p)ppGpp на процесс образования 70S инициаторного комплекса

3.2.2 ppGpp-опосредованная регуляция образования 70S инициаторного комплекса

3.3 Ингибирование процесса инициации трансляции антибиотиками амикумацином А, касугамицином, эдеином

3.3.1 Влияние амикумацина А, касугамицина и эдеина на образование 30S инициаторного комплекса

3.3.2 Влияние амикумацина А, касугамицина и эдеина на образование 70S инициаторного

комплекса

3.3.3 Контролирующая роль IF3 в ингибирующем действии амикумацина А на этап образования инициаторного комплекса

3.3 Модельная система для анализа термодинамических параметров межмолекулярных взаимодействий в процессе образования 30S инициаторного комплекса

3.4.1 Лиганд-зависимое образование 30S инициаторного комплекса. Роль инициаторных факторов

3.4.2 Влияние функциональных участков мРНК на процесс образования 30S инициаторного комплекса

3.5 Трансляционные факторы - основные помощники в процессе биосинтеза белка

3.5.1 Термическая стабильность элонгационных факторов EF-Tu и EF-G и их нуклеотидных форм

3.5.2 Термическая стабильность IF2 и его нуклеотидных форм

3.6 Заключение

Основные выводы исследования

Список сокращений

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Список литературы

Благодарности

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новый механизм регуляции инициации трансляции малыми молекулами в Esсherichia coli»

Актуальность проблемы

Образование функционально активного инициаторного рибосомного комплекса является первым этапом трансляции - важнейшего процесса жизнедеятельности клетки, в результате которого происходит перевод генетической информации, закодированной в матричной РНК (мРНК), в аминокислотную последовательность белка при помощи рибосомы. Три белковых инициаторных фактора (Ш1, Ш2^ТР, ШЗ) участвуют в формировании инициаторного рибосомного комплекса с правильно расположенными в нем мРНК и инициаторной fMet-tRNAfMet. Кинетика образования такого комплекса определяется быстрым связыванием инициаторных факторов с малой 30S рибосомальной субъединицей, после которого следует длительный процесс распознавания кодона мРНК антикодоном инициаторной тРНК. Присоединением большой 50S субъединицы с последующим гидролизом GTP, высвобождением неорганического фосфата и инициаторных факторов завершается формирование функционально активного 70 S инициаторного комплекса, готового к началу синтеза полипептидной цепи. На протяжении всего процесса выделяют несколько контрольных этапов в отборе мРНК, включающих в себя первичный отбор, разворачивание вторичных структур и определение стартового кодона, а также контроль за связыванием с рибосомой через последовательность Шайна-Дальгарно. Вся эта многокомпонентная система находится в постоянной динамике, сопровождаемой различными конформационными изменениями, где от физико-химических свойств лигандов будет зависеть эффективность протекания всего процесса.

Несмотря на более, чем полувековую историю изучения биосинтеза белка, в рибосомологии все еще остается много загадок. Из-за своей высокой значимости этап трансляции является чувствительным процессом для действия различных малых молекул. Так в период неблагоприятных условий среды в клетке активируется механизм строгого ответа, опосредованный накоплением большого количества сигнальных молекул алармонов (p)ppGpp. В результате чего клетка снижает белковый синтез и выживает за счет экономии своих ресурсов. Однако, существующая концепция регулирования клеточной активности в условиях строгого ответа через этап транскрипции не могла объяснить возможность продолжения синтеза жизненно важных белков бактериальных клеток в неблагоприятных условиях среды. Трансляция остается одной из основных мишеней и таких ингибиторов, как антибиотики. Около половины известных на данный момент действуют на рибосому, вызывая различные нарушения. Механизм действия может быть различным и вызывать как полную блокировку какого-либо этапа трансляции, так и стимулировать возникновение ошибок в процессе синтеза белка.

Создание системы, моделирующей этап начала трансляции, с определением кинетических и термодинамических параметров ее компонентов, не только поможет ответить на многие открытые вопросы всего процесса трансляции, но и позволит изучить механизм действия малых молекул на эту стадию. Понимание молекулярных основ этапа бактериальной инициации трансляции и механизмов устойчивости к различным ингибирующим действиям малых молекул и антибиотиков также необходимо для эффективной борьбы с патогенными микроорганизмами.

Цель исследования:

Определение молекулярного механизма регуляции инициации трансляции в Escherichia coli (E. coli) в условиях строгого ответа.

Задачи исследования:

1. Создать модельную систему для изучения молекулярных механизмов строгого ответа на этапе инициации трансляции в E. coli.

2. Спектрофлуориметрическими методами микротермофореза и остановленного потока изучить влияние сигнальных молекул алармонов (p)ppGpp на процесс инициации трансляции.

3. Изучить влияние антибиотиков амикумацина А, касугамицина и эдеина на процесс инициации трансляции методами микротермофореза и остановленного потока.

4. Методом дифференциальной сканирующей флуориметрии определить конформационные особенности инициаторного фактора 2 (IF2) в зависимости от связанного нуклеотида.

Научная новизна и практическая значимость:

В ходе данной работы с использованием передовых методик флуоресцентной спектроскопии была создана высокочувствительная изолированная система in vitro для изучения физических основ процесса инициации трансляции в условиях строгого ответа в E. coli. Данная система содержала все компоненты белкового синтеза, необходимого для инициации трансляции в бактериальных клетках, включая рибосомы, мРНК, тРНК и инициаторные факторы. С помощью этой системы были смоделированы условия строгого ответа и проведен анализ эффективности процесса инициации трансляции, в результате чего был открыт новый уровень регуляции в бактериях. В условиях ингибирующего действия алармона ppGpp на этап инициации трансляции было определено, что термодинамика взаимодействий внутри мРНК, характеризующаяся сложной вторичной структурой в 5'-нетранслируемой области, и взаимодействия мРНК-рибосома определяют устойчивость инициаторной системы к ингибирующему действию алармона ppGpp. Кроме того, впервые было показано, что алармон pppGpp способен инициировать трансляцию.

При изучении влияния антибиотиков на процесс инициации трансляции был определен ингибирующий эффект амикумацина А. Кроме того, была определена ключевая роль инициаторного фактора 3 (IF3) в контроле формирования ошибочных инициаторных комплексов, образование которых способен стимулировать антибиотик.

Результаты данной работы значительно расширяют наше представление о молекулярном механизме таких важных и уязвимых процессов, как биосинтез белка и строгий ответ. Понимание молекулярных механизмов клеточной адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды открывает для нас новые пути в борьбе с патогенными микроорганизмами.

Методология и методы исследования. В работе были использованы следующие методы и технологии: при работе с клеточными культурами проводилась трансформация клеток плазмидными ДНК методами теплового шока и электропорации. Для выделения рибосом, белков, транскриптов мРНК применялось механическое или ультразвуковое разрушение клеток, ионообменная, гель-фильтрационная хроматографии, центрифугирование, в том числе ультрацентрифугирование. Для анализа эффективности образования дипептидов применялась обратнофазовая хроматография. Для анализа проб плазмид, РНК, белков использовались гель-электрофорезы. Анализ кинетики процессов проводили методом остановленного потока, аффинности взаимодействия - методом микротермофореза, термостабильности белков и коллоидных свойств раствора - методом дифференциальной сканирующей флуориметрии.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в получении препаратов 70S рибосом, белков, транскриптов мРНК, аминоацилировании тРНК, флуоресцентном мечении мРНК, а также в анализе литературных данных. Участвовал в дизайне и проведении экспериментов, анализе полученных результатов и в написании статей совместно с соавторами.

Апробация работы

Материалы работы докладывались на следующих конференциях: Open Science (Гатчина, Россия, 2016), VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Москва, Россия, 2017), «Зимняя школа ПИЯФ» (Рощино, Россия, 2017, 2018, 2019 и Репино, Россия, 2020), 21-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, Россия, 2017), «Ribosomes and Translation» (Петергоф, Россия, 2018), «43rd FEBS Congress» (Прага, Чехия, 2018), «Постгеном» (Казань, 2018), «RNA Meeting» (online, Ванкувер, Канада, 2020). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих международных рецензируемых журналах первого квартиля, входящих в список, утвержденный Высшей аттестационной комиссией.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Модель инициации трансляции в условиях строгого ответа позволила определить новый уровень регуляции в бактериях, где термодинамика взаимодействий внутри мРНК и между мРНК и рибосомой определяет устойчивость инициаторной системы к ингибирующему действию алармона ррОрр.

2. Анализ кинетических и термодинамических параметров образования инициаторного комплекса в присутствии амикумацина А определил ингибирующий механизм его действия, который зависит от наличия Ш3 в системе.

3. Тепловая денатурация Ш2 определила отличную от других нуклеотидных форм конформацию белка при связывании с алармоном ррОрр.

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Структура 70S бактериальной рибосомы

Бактериальная рибосома является рибонуклеопротеидным комплексом, состоящим из рибосомальной РНК (рРНК) и белков в соотношении 2:1 [1]. Для прокариотических, а также некоторых других организмов (сине-зеленых водорослей, архебактерий и других) характерна 70 S рибосома с соответствующим коэффициентом седиментации. Масса бактериальной 70S рибосомы составляет около 2,5106 Да, размер 20-25 нм [1]. Бактериальные рибосомы состоят из двух субъединиц: 30S - малой, которая ответственна за связывание матричной РНК (мРНК), и 50S - большой, осуществляющей катализ при удлинении полипептидной цепи. 30S субъединица состоит из одной молекулы 16S рРНК (1541 нуклеотид для E. coli) и 21 белка (S1-S21), 50S субъединица содержит две молекулы 5S и 23 S рРНК (120 и 2904 нуклеотидов для E. coli соответственно) и 34 белка (L1-L34). В каждой стадии белкового синтеза принимают участие белковые факторы, многим из которых необходима энергия в виде молекулы GTP. Они связываются с рибосомой, индуцируя различные конформационные изменения в процессе синтеза белка.

С самого начала считалось, что рибосомальные белки могут отвечать за функции рибосомы, а каркасом для их удержания на месте служит рРНК. Но и белки, и РНК вносят свой вклад в эффективность трансляции. Так первым показателем функциональной роли рРНК явилось открытие комплементарности между 3'-концом 16S рРНК и участком на мРНК, который располагается в области, предшествующей стартовому кодону. Эта комплементарность важна для правильной инициации трансляции [2]. Исследования влияния антибиотиков на трансляцию мРНК также показали специфические участки рРНК, с которыми взаимодействуют некоторые из них (например, стрептомицин, тетрациклин, спектиномицин и другие) [3], а мутация в гене, кодирующем рибосомальный белок S12 была первой отмеченной мутацией устойчивости к антибиотику стрептомицину [4;5].

Более сорока лет назад с помощью обычной электронной микроскопии были определены «голова», «платформа» и «тело» малой 30S субъединицы, а также центральный протуберанец в окружении двух стеблей большой 50S субъединицы. Матричная РНК, несущая закодированную генетическую информацию, располагается вокруг расщелины в малой субъединице (рис. 1.1), а растущий полипептид покидает рибосому через выходной туннель на 50S субъединице. 70S рибосома имеет три специализированных участка: Р, А и Е сайты, на которых связываются тРНК, несущие аминокислоты в процессе синтеза полипептидной цепи. Весь процесс синтеза

сопровождается конформационными перестройками и движениями рибосомы и участников процесса [6].

Рисунок 1.1 - Структура 70S рибосомы. А. Вид бактериальной 70S рибосомы, где большая 50S субъединица (коричневый) расположена сверху, а малая 30S субъединица (голубой) снизу. мРНК (темно-серый) располагается вокруг шеи 30S субъединицы, тРНК в А сайте (пурпурный), в Р сайте (зеленый), в Е сайте (желтый). Б. Декодирующий центр (ДЦ) на 30S субъединице, где происходит контроль кодон-антикодонового связывания во время отбора тРНК. В. Область связывания GTP-связывающих факторов, а также пептидил-трансферазный центр (ПТЦ), где катализируется образование пептидной связи на 50S субъединице [7;8] (адаптировано из [7])

1.1.1 Цикл элонгации на бактериальной рибосоме

Процесс трансляции можно разделить на три этапа: инициация, элонгация, терминация, после которой возможен рециклинг и новый синтез пептидной цепи [1;7—10]. Во время стадии инициации малая 30S субъединица рибосомы связывается с мРНК и специализированной инициаторной fMet-tRNAfMet в Р сайте рибосомы. Этот процесс осуществляется тремя белковыми факторами (IF1, IF2, IF3), где IF2 является GTP-связывающим белком. За стадией инициации следует стадия элонгации, которая состоит из трех важных этапов: декодирование, образование пептидной связи, транслокация. Во время декодирования правильная аминоацил-тРНК в составе тройного комплекса с фактором элонгации EF-Tu и GTP поступает в А сайт рибосомы. После успешного кодон-антикодонового узнавания между тРНК и мРНК в А сайте, гидролиза GTP и диссоциации EF-Tu с рибосомы, аминоацильный конец тРНК перемещается в пептидил-трансферазный центр (ПТЦ) на 50S субъединице, где происходит катализируемое рибосомой образование пептидной связи. В Р сайте остается деацилированная тРНК, а тРНК, находящаяся в А сайте, теперь содержит удлиненную пептидную цепь. З'-концы тРНК,

находящиеся в А и Р сайте начинают двигаться относительно 50Б субъединицы, образуя промежуточное или гибридное состояние рибосомы. После этого происходит движение мРНК и тРНК относительно 30Б субъединицы, катализируемое ГТФазным фактором элонгации ББ-О. В результате А сайт рибосомы, в котором экспонирован следующий кодон мРНК становится вакантным и готов принять следующую аминоацил-тРНК, в Р сайте располагается пептидил-тРНК, а в Е сайт переместилась деацилированная тРНК с последующей диссоциацией с рибосомы. Процесс происходит до тех пор, пока в А сайте не окажется терминирующий кодон. Белковые факторы терминации или ЯБ2 распознают стоп-кодон и катализируют отщепление полипептидной цепи от тРНК, находящейся в Р сайте (рис. 1.2).

Рисунок 1.2 - Схема основных этапов трансляции на 708 рибосоме: инициации, элонгации, терминации, рециклинга (адаптировано из [7])

Процесс трансляции сопровождается различными движениями частей рибосомы, конформационными переходами, а его направленность, по-видимому, обусловлена ГТФазными факторами элонгации ББ-Ти и ББ-О, которые связываются с одним и тем же участком на рибосоме [11]. Кроме того, каждый из этапов процесса трансляции протекает с определенными скоростями реакции, и понимание кинетических основ этого процесса дополняет знания о функционировании этой макромолекулярной машины [10-15].

1.2 Основные участники процесса инициации трансляции

С процесса инициации трансляции начинается процесс биосинтеза белка. 30S субъединица связывает мРНК через последовательность Шайна-Дальгарно (ШД, SD) с участком на 16S рРНК, называемом последовательностью антиШайна-Дальгарно (аШД, aSD). Специфическая инициаторная fMet-tRNAfMet связывается в Р сайте рибосомы со стартовым кодоном мРНК в открытой рамке считывания. Этот процесс управляется тремя инициаторными факторами IF1, IF2, IF3 [10;16;17].

1.1.2 Инициаторная fMet-tRNA^

Инициаторная fMet-tRNAfMet несет метионин, который всегда является первой аминокислотой в растущей полипептидной цепи. В бактериях, а также в хлоропластах и митохондриях метионин формилирован, что избирательно исключает fMet-tRNAfMet из фазы элонгации [18;19]. Роль инициаторной fMet-tRNAfMet заключается в правильной инициации трансляции в транслирующей области мРНК (Translation Initiation Region - TIR) [16]. Инициаторная fMet-tRNAfMet узнает стартовый кодон на мРНК, который, как правило, имеет последовательность AUG, но также будет узнавать последовательности GUG, UUG, AUU, AUA, когда они будут выступать в роли инициирующих кодонов. Метионил-тРНК синтетаза (MetRS) узнает CAU антикодон своего субстрата, который является идентичным для инициаторной и элонгаторной тРНК [20-22] и акцептирует метионин в качестве аминокислоты. Завершает процесс формирования инициаторной fMet-tRNAfMet фермент формилтрансфераза, которая способствует переносу формильной группы от формилтетрагидрофолата на аминогруппу остатка метионина. Такая модификация предотвращает взаимодействие с элонгационным фактором EF-Tu и вместо этого обеспечивает распознавание и связывание fMet-tRNAfMet с рибосомой с помощью инициаторного фактора IF2 [17]. Этими особенностями инициаторная тРНК обладает благодаря особым структурным характеристикам, многие из которых относятся к акцепторному концу и стеблю антикодоновой петли [23-25]. Одной из таких характеристик является наличие трех G:C пар подряд в антикодоновом стебле инициаторной тРНК, при этом элонгаторные тРНК содержат не более двух (рис. 1.3А). Эта важная особенность консервативна и обнаружена во всех инициаторных тРНК. Данные пары оснований придают особую жесткость антикодоновому стеблю, который влияет на структуру антикодоновой петли инициаторной тРНК, а также отвечает за его высокое сродство к Р сайту рибосомы. Две пары оснований 29:41 и 30:40 антикодонового стебля образуют контакты с консервативными нуклеотидами G1338 и A1339

16S рРНК на одной стороне Р сайта, тем самым образуя ворота, отделяющие Р сайт от Е сайта совместно с А790, располагающемся на другой стороне (рис. 1.3 Б-В) [26;27].

Рисунок 1.3 - Структурные особенности инициаторной fMet-tRNAfMet. А. Значащие области инициаторной fMet-tRNAfMet. Желтым выделена формил-группа. Рамками выделены важные отличительные участки инициаторной тРНК. Б-В. Ворота между Р- и Е-сайтовыми тРНК, образованные головой и платформой 30S субъединицы. Взаимодействие нуклеотида А1339 16S рРНК и G29-С41 нуклеотидами Р-сайтовой тРНК (Б, верхняя панель). Взаимодействие нуклеотида G1338 16S рРНК и G30-С42 нуклеотидами Р-сайтовой тРНК (Б, нижняя панель). Ключевые нуклеотиды 16S рРНК, действующие подобно воротам, предотвращая транслокацию Р-сайтовой тРНК в Е сайт (если смотреть на Р-сайтовую тРНК со стороны 50S субъединицы). Такие ворота контролируются нуклеотидами 1338 и 1339 головы 30S субъединицы и 790 платформы (В) (адаптировано из [26])

Помимо антикодонового стебля, уникальными и важными структурными характеристиками обладает и акцепторный конец инициаторной тРНК, обеспечивая распознавание Met-tRNAfMet формилтрансферазой, а также устойчивость fMet-tRNAfMet к активности пептидил-тРНК-гидролазы [20, 27-29]. Основные структурные характеристики для распознавания формилтрансферазой располагаются в акцепторном стебле, что подтверждают эксперименты с химерной тРНК, состоящей из акцепторного стебля инициаторной tRNAfMet и антикодоновой петли элонгаторной tRNAMet. Такая тРНК полностью способна к формилированию [20, 30]. Основными особенностями акцепторного стебля tRNAfMet являются отсутствие связывания между нуклеотидами G1 и А72, что придает большую гибкость акцепторному концу, а также пара нуклеотидов А11:и24 в стволе дигидроуридина, являющаяся одной из основных детерминант формилирования [31, 32]. Конформация антикодоновой петли инициаторной tRNAfMet отличается в свободном и связанном в Р сайте состоянии. В результате этого факта существует предположение, что конформационное положение 37 нуклеотида (А37) играет роль в аккомодации fMet-tRNAfMet в Р сайт рибосомы, а также устойчивости к контролирующей функции Ш3 [17]. При этом быстрое формилирование инициаторной тРНК имеет огромное значение для связывания (а также предотвращения связывания элонгаторной тРНК) в Р сайт рибосомы [33].

Таким образом, первым аминокислотным остатком любой синтезируемой полипептидной цепи в прокариотической рибосоме всегда является формилметионин. В ходе элонгации формильный остаток, как правило, отщепляется формилазой. Метиониновый остаток часто (но не всегда) также отщепляется от растущей полипептидной цепи специальной аминопептидазой.

1.1.3 Инициаторный фактор 1 (№1)

Инициаторный фактор 1 (Ш1) является самым маленьким (71 аминокислотных остатков) из трех белковых факторов (ГРб) процесса инициации трансляции. Его структура была определена с помощью ЯМР спектроскопии [34] и представляет собой пятицепочечную в-бочку с очень гибкой петлей (рис. 1.4 А) [34, 35].

Рисунок 1.4 - Взаимодействие IF1 с 30S субъединицей. А. Пространственная структура IF1 из E. coli (pdb: 1ah9 [34]) с выделением значащих консервативных остатков аргинина. Б. Погружение нуклеотидов А1492 и А1493 на петле h44 малой 30S субъединицы (голубым) в белковые карманы, сформированные IF1 (пурпурный) и IFbS12 (пурпурный-золотистый). В. Сайт связывания IF1 в увеличении (слева) и положение IF1 по отношению к 30S (справа). IF1 (пурпурный), S12 (золотистый), 530 (зеленый) и h44 (голубой) (адаптировано из [35])

IF1 связывается на 30S субъединице рибосомы в районе А сайта, занимая положение в расщелине между спиралью h44, петлей 530 и белком S12 (рис. 1.4 В) [35]. По результатам экспериментов с сайт-направленным мутагенезом С-конец фактора (особенно Arg69) необходим для взаимодействия с 30S субъединицей [36]. Часть IF1, взаимодействующая с рибосомой, богата основными остатками аминокислот, в то время как большинство кислотных остатков

располагаются со стороны растворителя. Такое сильно асимметричное распределение заряда, вероятно, стабилизирует связывание с 30S субъединицей. Консервативные остатки в IF 1 образуют плотные электростатические и водородные связи с фосфатным остовом петли 530. При связывании IF1 функционально значимые основания A1492 и A1493 выпетливаются из спирали 44 16S рРНК. А1493 располагается в специальном кармане, образованном IF1, а А1492 располагается в кармане, образованном IF 1 вместе с S12 (рис. 1.4 Б). Консервативные остатки аргинина (Arg41, Arg46) стабилизируют это удаленное положение оснований. Известно, что антибиотик паромомицин наоборот, стимулирует их смыкание [37]. Такие конформационные движения очень схожи и в случае связывания аминоацил-тРНК с А сайтом рибосомы, но сама конформация А1492/А1493 отличается для комплексов с аминоацил-тРНК или с IF1.

При связывании IF 1 происходит небольшое по амплитуде движение платформы, плеча и головы 30S субъединицы в сторону А сайта в результате изгиба спирали h44 в сторону фактора. Происходит как бы конформационное схлопывание подобно тому, которое наблюдается при связывании антикодона тРНК с А сайтом [35, 38]. Существует мнение, что участие IF1 в процессе инициации трансляции необходимо для предотвращения связывания свободной аминоацил-тРНК с А сайтом рибосомы [39]. Блокируя положение А сайта, IF1 способствует увеличению сродства инициаторной тРНК к Р сайту в присутствии IF2 [40], стимулируя соответствующую конформацию доменов IF2 для правильного позиционирования инициаторной тРНК в Р сайте [42, 43]. При этом отличить инициаторную fMet-tRNAfMet от других тРНК сам по себе IF 1 не может. Тем не менее, в присутствии IF 1 аффинность 30S субъединицы к Met-tRNAfMet и Phe-tRNAPhe снижается в 5 раз [41].

В целом IF1 является «помощником» в работе IF2 и IF3. Он может содействовать высвобождению IF2 с 70S субъединицы [44], а также увеличивать скорость ассоциации и диссоциации рибосомальных субъединиц, при этом не сдвигая равновесие [45]. Особенно важно, что IF 1 увеличивает степень диссоциации субъединиц. Это является существенным in vivo, так как при анализе in vitro для полной диссоциации рибосом требуется примерно в 100 раз больше IF3 [46, 47]. Кроме того, присутствие в системе IF1 повышает селективность инициации в 60 раз

[41].

1.1.4 Инициаторный фактор 2 (IF2)

Инициаторный фактор 2 (Ш2) является самым большим ГТФазным трансляционным мультидоменным белком (молекулярная масса порядка 97 кДа), где каждый из доменов наделен своими структурными и функциональными свойствами [48]. Он напрямую взаимодействует с

ШеМККЛ^ [49], при этом отличая ШеМККЛ^ от МеМККЛШег, а также деацилированной 1ЯКЛШег [50]. Ш2 способствует связыванию МеМЯКЛ^ с 30Б субъединицей, не влияя на связывание других тРНК [41,51], при этом индуцируя определенную конформацию рибосомы [52].

К-концевая область 1Е2, представляющая собой два домена N1 и N2, способна с высокой эффективностью присоединять фактор к 30S рибосомальной субъединице [53, 54]. При этом в клетках встречается форма с отсутствующим N1 доменом [55]. Высококонсервативная центральная область состоит из трех доменов: G1, G2 и G3. Домен G2 способен с низкой аффинностью связываться с 50S субъединицей и содержит все структурные элементы, ответственные за связывание гуанозиновых нуклеотидов, а также за гидролиз GTP [48, 56]. С-концевая область состоит из двух доменов: С1 и С2 (рис. 1.5) [57].

Рисунок 1.5 - Кристаллическая структура IF2-GTP из Th. thermophilus (N-C1 домены) (pdb: 4B48, [60]) и ЯМР структура из G. stearothermophilus (C2 домен) (pdb: 1D1N). N-домен (синий), G-домен (зеленый лиловый: GTP-связывающий участок), C-домен (оранжевый). Молекула GTP представлена в виде объемной структуры

С1 домен в совокупности с С2 играет роль в структурных изменениях, происходящих в G2 домене. При этом C2 домен содержит все детерминанты для распознавания и связывания fMet-tRNAfMet [58, 59]. G2 домен является структурно гомологичным гуанин-связывающим доменом других трансляционных ГТФаз, например таких как EF-Tu, EF-G [56, 60]. Он содержит четыре элемента консервативных последовательностей, характерных для этих белков, а именно петлю G1/P и петли G2, G3 и G4 (рис. 1.5), причем последние две формируют стенки гидрофобного кармана, в котором находится гуаниновая часть GTP или GDP [56]. При

связывании гуанозинового нуклеотида P-петля G2 домена претерпевает сильные конформационные изменения, а остаток лизина (Lys 86) взаимодействует с His130 в присутствии GDP. При связывании IF2 с рибосомой происходит большое конформационное изменение С1 домена, в результате которого образуется стабильный контакт между концом линкера H8 и S12 белком, способствующий правильному позиционированию C1 и C2 для лучшего взаимодействия IF2^fMet-tRNAfMet на рибосоме [61, 64]. Домен С2 является очень гибким, и его структура схожа со структурой G3 домена [62]. Об этом свидетельствует тот факт, что как N-, так и С-концы, а также петли Р1-Р2 и Р4-Р5, в окрестности которых связывается fMet-tRNAfMet неупорядочены. С2 домен способен специфически распознавать и даже связывать fMet, fMet-AMP, fMet-ACC-5' и fMet-ACCAAC-5', а fMet связан в кармане, образованном консервативными остатками R654, Q655, F657, G667 и E713 [59]. Это характерное свойство отличает механизм, с помощью которого IF2 и EF-Tu связывают аминоацил-тРНК [58, 59, 63].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Виноградова Дарья Сергеевна, 2022 год

Список литературы

[1] Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка / А.С. Спирин.

- Москва «Высшая школа», 1986. - 303 с.

[2] Shine J., Dalgarno L. The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1974. - vol. 71. - p. 1342-1346

[3] Moazed D., Noller H. F. Interaction of antibiotics with functional sites in 16S ribosomal RNA // Nature - 1987. - vol. 327. - p. 389-394

[4] Ozaki M., Mizushima S., Nomura M. Identification and functional characterization of the protein controlled by the streptomycin-resistant locus in E. coli // Nature - 1969. - vol. 222. - p. 333-339

[5] Traub P., Nomura M. Streptomycin Resistance Mutation in Escherichia coli: Altered Ribosomal Protein // Science - 1968. - vol. 160. - p. 198-199

[6] Ramakrishnan V. The Ribosome Emerges from a Black Box // Cell - 2014. - vol. 159. - p. 979-984

[7] Schmeing T. M., Ramakrishnan V. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation // Nature - 2009. - vol. 461. - p. 1234-1242

[8] Ramakrishnan V. The Ribosome: Some Hard Facts About Its Structure and Hot Air About Its Evolution // Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology - 2009. - vol. 74. - p. 25-33

[9] Ramakrishnan V. Ribosome Structure and the Mechanism of Translation // Cell - 2002. - vol. 108.

- p. 557-572

[10] Rodnina M.V. Translation in Prokaryotes // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology - 2018. -vol. 10 (9). - a032664

[11] Opron, K., Zachary F. Burton. Ribosome Structure, Function, and Early Evolution // International Journal of Molecular Sciences - 2019. - vol. 20 (1). - p. 40

[12] Роднина М.В., Семенков П., Завельсберг А., Катунин В.И., Песке Ф., Вильден Б., Винтермайер В. Механизм транслокации тРНК на рибосоме // Молекулярная биология - 2001. - т. 35, №4. - 655-665 с.

[13] Milon P., Rodnina M. V. Kinetic control of translation initiation in bacteria // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology - 2012. - vol. 47. - p. 334-348

[14] Rodnina M.V., Fischer N., Maracci C. Ribosome dynamics during decoding // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci - 2017. - vol.372 (1716). - 20160182

[15] Ogle J., Ramakrishnan V., Structural insights into translational fidelity // Annu Rev Biochem -2005. - vol. 74. - p. 129-77

[16] Laursen B.S.; Sorensen H.P.; Mortensen K.K.; Sperling-Petersen H.U. Initiation of protein synthesis in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2005. - vol. 69. - p. 101-123

[17] Gualerzi C., Pon C. Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects // Cell. - 2015. - vol. 72. - p. 4341-4367

[18] Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes // Gene. - 1999. - vol. 234. - p. 187-208

[19] RajBhandary U. L. Initiator transfer RNAs // J. Bacteriol. - 1994. - vol. 176. - p. 547-552

[20] Lee C.P., Dyson M.R., Mandal N., Varshney U., Bahramian B., RajBhandary U.L. Striking effects of coupling mutations in the acceptor stem on recognition of tRNAs by Escherichia coli Met-tRNA synthetase and Met-tRNA transformylase // Proc Natl Acad Sci. - 1992. - vol. 89. - p. 9262-9266

[21] Mechulam Y., Schmitt E., Maveyraud L., Zelwer C., Nureki O., Yokoyama S., Konno M., Blanquet S. Crystal structure of E. coli methionyl-tRNA synthetase highlights: species-specific features // J Mol Biol. - 1999. - vol. 294. - p. 1287-1297

[22] Nakanishi K., Ogiso Y., Nakama T., Fukai S., Nureki O. Structural basis for anticodon recognition by methiony-tRNA synthetase // Nat Struct Mol Biol. - 2005. - vol. 12. - p. 931-932

[23] Rajbhandary U.L., Chow C.M. Initiator tRNAs and initiation of protein synthesis // ASM Press, Washington, DC. - 1995. - vol. 4. - p. 511-528

[24] Mangroo D., Wu X.Q., RajBhandary U.L. Escherichia coli initiator tRNA: structure-function relationships and interactions with the translational machinery // Biochem Cell Biol. - 1995. - vol. 73.

- p. 1023-1031

[25] Mayer C., Stortchevoi A., Kohrer C., Varshney U., Rajbhandary U.L. Initiator tRNA and its role in initiation of protein synthesis // Cold Spring Harb Symp Quant. - 2001. - vol. 66. - p.195-206

[26] Selmer M., Dunham C.M., Murphy F.V. 4th, Weixlbaumer A., Petty S., Kelley A.C., Weir J.R., Ramakrishnan V. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA // Science. - 2006.

- vol. 313. - p. 1935-1942

[26] Berk V., Zhang W., Pai R.D., Cate J.H. Structural basis for mRNA and tRNA positioning on the ribosome // Proc Natl Acad Sci. - 2006. - vol. 103. - p.:15830-15834

[27] Schmitt E., Panvert M., Blanquet S., Mechulam Y. Crystal structure of methionyl-tRNAfMet transformylase complexed with the initiator formyl-methionyl-tRNAfMet. // EMBO J. - 1998.

- vol. 17. - p. 6819-6826

[28] Schmitt E., Mechulam Y., Fromant M., Plateau P., Blanquet S. Crystal structure at 1.2A resolution and active site mapping of Escherichia coli peptidyl-tRNA hydrolase // EMBO J. - 1997. - vol. 16. - p. 4760-4769

[29] Dutka S., Meinnel T., Lazennec C., Mechulam Y., Blanquet S. Role of the 1-72 base pair in tRNAs for the activity of E. coli peptidyl-tRNA hydrolase // Nucleic Acids Res. - 1993. - vol. 21. - p. 4025-4030l

[30] Guillon J.M., Meinnel T., Mechulam Y., Lazennec C., Blanquet S., Fayat G. Nucleotides of tRNA governing the specificity of Escherichia coli methionyl-tRNA(fMet) formyltransferase // J Mol Biol. -1992. - vol. 224. - p. 359-367

[31] Takeuchi N., Vial L., Panvert M., Schmitt E., Watanabe K., MechulamY. and Blanquet S. Recognition of tRNAs by methionyl-tRNA transformylase from mammalian mitochondria // J. Biol. Chem. - 2001. - vol. 276. - p. 20064 -20068

[32] Mayer C., RajBhandary U.L. Conformational change of Escherichia coli initiator methionyl-tRNA(fMet) upon binding to methionyl-tRNA formyl transferase // Nucleic Acids Res. - 2002. - vol. 30. - p. 2844-2850

[33] Shah R., Varada R., Sah S., Shetty S., Lahry K., Singh S. and Varshney U. Rapid formylation of the cellular initiator tRNA population makes a crucial contribution to its exclusive participation at the step of initiation // Nucleic Acids Research. - 2019. - vol. 47. - № 4. - 1908-1919

[34] Sette M., van Tilborg P., Spurio R., Kaptain R., Paci M., Gualerzi C.O., Boelens R. The structure of the initiation factor IF1 from E. coli contains an oligomer-binding motif // EMBO J. - 1997. - vol. 16. - p. 1436-1443

[35] Carter A.P., Clemons W.M. Jr, Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Hartsch T., Wimberly B.T., Ramakrishnan V. Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit // Science.

- 2001. - vol. 291. - p. 498-501

[36] Gualerzi C.O., Spurio R., La Teana A., Calogero R., Celano B., Pon C.L. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli translation initiation factors. Identification of the amino acids involved in ribosomal binding and recycling of IF1 // Protein Eng. - 1989. - vol. 3. - p. 133-138

[37] Carter A. P., Clemons W. M., Brodersen D. E., Morgan-Warren R. J., Wimberly B. T., & Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics // Nature. - 2000. - vol. 07(6802). - p. 340-348

[38] Ogle J.M., Murphy F.V., Tarry, M.J., V. Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form // Cell. - 2002. - vol. 111(5). - p. 721-732

[39] Moazed D., Samaha R.R., Gualerzi C., Noller H. F. Specific protection of 16 S rRNA by translational initiation factors // J Mol Biol. - 1995. - vol. 248(2). - p. 207-210

[40] Brock S., Szkaradkiewicz K., Sprinzl M. Initiation factors of protein biosynthesis in bacteria and their structural relationship to elongation and termination factors // Mol Microbiol. - 1998. - vol. 29(2).

- p. 409-417

[41] Antoun A., Pavlov M.Y., Lovmar M., Ehrenberg M. How initiation factors maximize the accuracy of tRNA selection in initiation of bacterial protein synthesis // Mol Cell. - 2006. - vol. 23(2). - p. 183193

[42] Pon C.L., Gualerzi C. Mechanism of protein biosynthesis in prokaryotic cells. Effect of initiation factor IF1 on the initial rate of 30S initiation complex formation // FEBS Lett. -1984. - vol. 175(2). -p.203-207

[43] Wintermeyer W., Gualerzi C. Effect of Escherichia coli initiation factors on the kinetics of N-AcPhe-tRNAPhe binding to 30S ribosomal subunits. A fluorescence stopped-flow study // Biochemistry.

- 1983. - vol. 22(3). - p. 690-694

[44] Benne R., Naaktgeboren N., Gubbens J., Voorma H.O. Recycling of initiation factors IF-1, IF-2 and IF-3 // Eur. J. Biochem. - 1973. - vol. 32(2). - p. 372-380

[45] Grunberg-Manago M., Dessen P., Pantaloni, D., Godefroy-Colburn T., Wolfe A.D., Dondon J., Light-scattering studies showing the effect of initiation factors on the reversible dissociation of Escherichia coli ribosomes // J Mol Biol. - 1975. - vol. 94(3). - p. 461-478

[46] Gualerzi C., Pon C.L., Initiation of mRNA translation in prokaryotes // Biochemistry. - 1990. - vol. 29(25). - p. 5881-5889

[47] McCutcheon, Agrawal R.K., Philips S.M., Grassucci R.A., Gerchman S.E., Clemons W.M. Jr, Ramakrishnan V., Frank J., Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal subunit // J P Proc Natl Acad Sci. - 1999. - vol. 96(8). - p. 4301-4306

[48] Gualerzi C, Severini M., Spurio R., La Teana A., Pon C.L. Molecular dissection of translation initiation factor IF2: evidence for two structural and functional domains // J Biol Chem. - 1991. - vol. 266. - p. 16356-16362

[49] Sundari R.M., Stringer E.A., Schulman L.H. and Maitra U., Interaction of bacterial initiation factor 2 with initiator tRNA // J Biol Chem. - 1976. - vol. 251(11). - p. 3338-3345

[50] Hartz D., McPheeters D.S. and Gold L., Selection of the initiator tRNA by Escherichia coli initiation factors // Genes Dev. - 1989. - vol. 3(12A). - p. 1899-1912

[51] Antoun A., Pavlov M.Y., Lovmar M.and Ehrenberg M., How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria // Embo J. - 2006. - vol. 25(11). - p. 2539-2550

[52] Hershey JW, Merrick WC. Pathway and mechanism of initiation of protein synthesis. In Translational Control of Gene Expression // Cold Spring Harbor Laboratory. - 2000. - p. 33-88

[53] Gualerzi CO, Brandi L, Caserta E, Garofalo C, Lammi M, La Teana A, Petrelli D, Spurio R, Tomsic J, Pon CL. Initiation factors in the early events of mRNA translation in bacteria // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. - 2001. - vol. 66. - p. 363-376

[54] Caserta E, Tomsic J, Spurio R, La Teana A, Pon CL, Gualerzi CO. Ribosomal interaction of Bacillus stearothermophilus translation initiation factor IF2: characterization of the active sites // J Mol Biol. -2010. - vol. 396. - p. 118-129

[55] Nyengaard N.R., Mortensen K.K., Lassen S.F., Hershey J.W. and Sperling H.U. Petersen. Tandem translation of E. coli initiation factor IF2 beta: purification and characterization in vitro of two active forms // Biochem Biophys Res Commun. - 1991. - vol. 181(3). - p. 1572-1579

[56] Wienk H, Tishchenko E, Belardinelli R, Tomaselli S, Dongre R, Spurio R, Folkers GE, Gualerzi CO, Boelens R. Structural dynamics of bacterial translation initiation factor IF2 // J Biol Chem. - 2012. - vol. 287. - p. 10922-10932

[57] Misselwitz R, Welfle K, Kraft C, Gualerzi CO, Welfle H. Translational initiation factor IF2 from Bacillus stearothermophilus. A spectroscopic and microcalorimetric study of the C-domain // Biochemistry. - 1997. - vol. 36. - p. 3170-3178

[58] Spurio R, Brandi L, Caserta E, Pon CL, Gualerzi CO, Misselwitz R, Krafft C, Welfle K, Welfle H. The C-terminal sub-domain (IF2 C-2) contains the entire fMet-tRNA binding site of initiation factor IF2 // J Biol Chem. - 2000. - vol. 275. - p. 2447-2454

[59] Guenneugues M, Meunier S, Boelens R, Caserta E, Brandi L, Spurio R, Pon CL, Gualerzi CO. Mapping the fMet-tRNA binding site of initiation factor IF2 // EMBO J. - 2000. - vol. 19. - p. 52335249

[60] Simonetti A, Marzi S, Fabbretti A, Hazemann I, Jenner L, Urzhumtsev A, Gualerzi CO, Klaholz BP. Structure of the protein core of translation initiation factor 2 in apo, GTP-bound and GDP-bound forms // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. - 2013. - vol. 69. - p. 925-933

[61] Eiler D, Lin J, Simonetti A, Klaholz BP, Steitz TA. nitiation factor 2 crystal structure reveals a different domain organization from eukaryotic initiation factor 5B and mechanism among translational GTPases. // Proc Natl Acad Sci. - 2013. - vol. 110. - p. 15662-15667

[62] Wienk H, Tomaselli S, Bernard C, Spurio R, Picone D, Gualerzi CO, Boelens R. Solution structure of the Cl-subdomain of Bacillus stearothermophilus translation initiation factor IF2 // Protein Sci. -2005. - vol. 14. - p. 2461-2468

[63] Szkaradkiewicz K, Zuleeg T, Limmer S, Sprinzl M, Interaction of fMet-tRNAfMet and fMet-AMP with the C-terminal domain of Thermus thermophilus translation initiation factor 2 // Eur J Biochemro -2000. - vol. 267. - p. 4290-4299

[64] Simonetti A., Marzi S., Billas I., Tsai A., Fabbretti A., Myasnikov A.G., Roblin P., Vaiana A.C., Hazemann I., Eiler D., Steitz T.A., Puglisi J.D., Gualerzi C., Klaholz B. Involvement of protein IF2 N domain in ribosomal subunit joining revealed from architecture and function of the full-length initiation factor // Proc Natl Acad Sci. - 2013. - vol. 110(39). - p.15656-15661

[65] Brandi A., Piersimoni L., Feto N.A., Spurio R., Alix J., Schmidt F. and Gualerzi C. Translation initiation factor IF2 contributes to ribosome assembly and maturation during cold adaptation // Nucleic Acids Res. - 2019. - vol. 47(9). - p. 4652-4662

[66] Fabbretti A., Brandi L., Milon P., Spurio R., Pon C.L., Gualerzi C.O. Translation initiation without IF2-dependent GTP hydrolysis // Nucleic Acid Res. - 2012. - vol. 40. - p. 7946-7955

[67] Plumbridge J.A., Springer M. Organization of the Escherichia coli chromosome around the genes for translation initiation factor IF2 (infB) and a transcription termination factor (nusA) // J. Mol. Biol. - 1983. - vol. 167. - p. 227-243

[68] Nord S., Bylund G.O., Lovgren J.M., Wikstrom P.M. The RimP protein is important for maturation of the 30S ribosomal subunit // J. Mol. Biol. - 2009. - vol. 386. - p. 742-753

[69] Bunner A.E., Nord S., Wikstrom P.M., Williamson J.R. The effect of ribosome assembly cofactors on in vitro 30S subunit reconstitution // J. Mol. Biol. - 2010. - vol. 398. - p. 1-7

[70] Bubunenko M., Court D.L, Al Refaii A., Saxena S., Korepanov A., Friedman D.I., Gottesman M.E., Alix J.H. Nus transcription elongation factors and RNase III modulate small ribosome subunit biogenesis in Escherichia coli // Mol. Microbiol. - 2013. - vol. 87. -p. 382-393

[71] Rath D., Mangoli S.H., Mahjan S.K., Jawali N. A novel mutation spatially remote from the G-domain in IF2 affects the cold stress adaptation of Escherichia coli // Res. Microbiol. - 2009. - p. 576580

[72] Gibbs M.R., Fredrick K. Roles of elusive translational GTPases come to light and inform on the process of ribosome biogenesis in bacteria // Mol. Microbiol. - 2018. - vol. 107. - p. 445-454

[73] Lancaster L. and Noller H.F., Involvement of 16S rRNA nucleotides G1338 and A1339 in discrimination of initiator tRNA // Mol Cell. - 2005. - vol. 20(4). - p. 623-632

[74] Fabbretti A., Cynthia L., PonScott P., Walter H., Hill J., Lodmell S., Gualerzi C. The Real-Time Path of Translation Factor IF3 onto and off the Ribosome // Moll. Cell. - 2007. - vol. 25(2). - p. 285296

[75] Sharma I., Woodson S. RbfA and IF3 couple ribosome biogenesis and translation initiation to increase stress tolerance // Nucleic Acids Research. - 2020. - vol. 48. - p. 359-372

[76] Sharma H., Anand B. Ribosome assembly defects subvert initiation Factor3 mediated scrutiny of bona fide start signal // Nucleic Acids Research. - 2019. - vol. 47. - p. 11368-11386

[77] Giuliodori A., Brandi A., Giangrossi M., Gualerzi C. and Pon C. Cold-stress-induced de novo expression of infC and role of IF3 in cold-shock translational bias // RNA. - 2007. - vol. 13. - p.1355-1365

[78] Hussain T., Llacer J., Wimberly B., Kieft J., Ramakrishnan V. Large-Scale Movements of IF3 and tRNA during Bacterial Translation Initiation // Cell. - 2016. - vol. 167(1). - p. 133-144

[79] Maar D., Liveris D., Sussman J. K., Ringquist S., Moll I., Heredia N., Simons R. W. A Single Mutation in the IF3 N-Terminal Domain Perturbs the Fidelity of Translation Initiation at Three Levels // Journal of Molecular Biology. - 2008. - vol. 383(5). - p. 937-944

[80] Petrelli D, LaTeana A, Garofalo C, Spurio R, Pon CL, Gualerzi CO. Translation initiation factor IF3: two domains, five functions, one mechanism? // EMBO J. - 2001. - vol. 20. - p. 4560-4569

[81] ShreyaA., Dobriyal D., Varshney U. Contributions of the N- and C-Terminal Domains of Initiation Factor 3 to Its Functions in the Fidelity of Initiation and Antiassociation of the Ribosomal Subunits // J Bacteriol. - 2017. - vol. 199(11). - e00051-17

[82] Goyal A., Belardinelli R., Rodnina M.V. Non-canonical Binding Site for Bacterial Initiation Factor 3 on the Large Ribosomal // Cell Rep. - 2017. - vol. 20(13). - p. 3113-3122

[83] Milon P., Maracci C., Filonava L., Gualerzi C. O. & Rodnina M. V. Real-time assembly landscape of bacterial 30S translation initiation complex // Nature Structural & Molecular Biology. - 2012. - vol. 19(6). - p. 609-615

[84] Dreyfus M. What constitutes the signal for the initiation of protein synthesis on Escherichia coli mRNAs? // J Mol Biol. - 1988. - vol. 204. - p. 79-94

[85] Gualerzi CO, Brandi L, Caserta E, Garofalo C, Lammi M, La Teana A, Petrelli D, Spurio R, Tomsic J, Pon CL. Initiation factors in the early events of mRNA translation in bacteria // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. - 2001. - vol. 66. - p. 363-376

[86] Jin H, Zhao Q, Gonzalez de Valdivia EI, Ardell DH, Stenström M, Isaksson LA. Influences on gene expression in vivo by a Shine-Dalgarno sequence // Mol Microbiol. - 2006. - vol. 60. - p. 480-492

[87] Osterman I., Evfratov S., Sergiev P.V., Dontsova O.A., Comparison of mRNA features affecting translation initiation and reinitiation // Nucleic Acids Research. - 2013. - vol. 41. -p. 474-486

[88] Boni IV, Isaeva DM, Musychenko ML, Tzareva NV. Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein S1 // Nucleic Acids Res. - 1991. - vol. 19. - p. 155-162

[89] Osterman I., Chervontseva Z.S., Evfratov S.A., Sorokina A., Rodin V.A., Rubtsov M.P., Komarova E.S., Zatsepin T.S., Kabilov M.R., Bogdanov A.A. Translation at first sight: the influence of leading codons // Nucleic Acids Research. - 2020. - vol. 48. - p. 6931-6942

[90] Milon P, Konevega AL, Gualerzi CO, Rodnina MV. Kinetic checkpoint at a late step in translation initiation // Mol Cell. - 2008. - vol. 30. - p.712-720

[91] Komarova AV, Tchufistova LS, Supina EV, Boni IV. Protein S1 counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation // RNA. - 2002. - vol. 8. - p. 1137-1147

[92] Grill S, Moll I, Giuliodori AM, Gualerzi CO, Bläsi U. Temperature dependent translation of leaderless and canonical mRNAs in Escherichia coli // FEMS Microbiol Lett. - 2002. - vol. 211. -p.161-167

[93] Moll I, Grill S, Gualerzi CO, Bläsi U. Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control // Mol Microbiol. - 2001. - vol. 43. - p. 239-246

[94] Grill S, Moll I, Hasenöhrl D, Gualerzi CO, Bläsi U. Modulation of ribosomal recruitment to 5' terminal start codons by translation initiation factors IF2 and IF3 // FEBS Lett. - 2001. - vol. 495. - p. 167-171

[95] Brock J.E., Pourshahian S., Giliberti J., Limbach P.A., Janssen G.R. Ribosomes bind leaderless mRNA in Escherichia coli through recognition of their 5'-terminal AUG // RNA. - 2008. - vol. 14. - p. 2159-2169

[96] Giliberti J., O'Donnell S., Etten W.J., Janssen G.R. A 5'-terminal phosphate is required for stable ternary complex formation and translation of leaderless mRNA in Escherichia coli // RNA. - 2012. -vol. 18. - p. 508-518

[97] Tedin K., Moll I., Resch A., Grill S., Graschopf A., Gualerzi C.O., Bläsi U. Translation initiation factor 3 antagonizes authentic start codon selection on leaderless mRNAs // Mol Microbiol. - 1999. -vol. 31. - p. 67-78

[98] O'Donnell S.M., Janssen G.R. Leaderless mRNAs bind 70S ribosomes more strongly than 30S ribosomal subunits in Escherichia coli // J Bacteriol. - 2002. - vol. 184. - p. 6730-6733

[99] Moll I., Hirokawa G., Kiel M.C., Kaji A., Bläsi U.Translation initiation with 70S ribosomes: an alternative pathway for leaderless mRNAs // Nucleic Acids Res. - 2004. - vol. 32. - p. 3354-3363

[100] Sussman J.K., Simons E.L., Simons R.W. Escherichia coli translation initiation factor 3 discriminates the initiation codon in vivo // Mol Microbiol. - 1996. - vol. 21. - p. 347-360

[101] Komarova E.S., Chervontseva Z.S., Osterman I.A., Evfratov S.A., Rubtsova M.P., Zatsepin T.S., Semashko T.A., Kostryukova E.S., Bogdanov A.A., Gelfand M.S., Dontsov O.A., Sergiev P.V. Influence of the spacer region between the Shine-Dalgarno box and the start codon for fine-tuning of the translation efficiency in Escherichia coli // Microb Biotechnol. - 2020. - vol. 13(4). - p. 1254-1261

[102] Komarov A.V., Tchufistova L.S., Supina E.V., Boni I.V. Protein S1 counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation // RNA. - 2002. -vol. 8(9). - p. 11371147

[103] Kohler R., Mooney R.A., Mills D.J., Landick R., Cramer P. Architecture of a transcribing-translating expressome // Science. - 2017. - vol. 356. - p. 194-197

[104] Kennell D. and Riezman H. Transcription and translation initiation frequencies of the Escherichia coli lac operon // J. Mol. Biol. - 1977. - vol. 114. - p. 1-21

[105] Kennell, D., and H. Riezman. Transcription and translation initiation frequencies of the Escherichia coli lac operon. // J. Mol. Biol. - 1977. - vol. 114. - p. 1-21

[106] Landick R., Carey J., Yanofsky C. Translation activates the paused transcription complex and restores transcription of the trp operon leader region // Proc Natl Acad Sci. - 1985. - vol. 82. - p. 46634667

[107] Proshkin S., Rahmouni A.R., Mironov A., Nudler E. Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation // Science. - 2010. - vol. 328. - p. 504-508

[108] Milon P., Carotti M., Konevega A.L., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Gualerzi C.O. The ribosome-bound initiation factor 2 recruits initiator tRNA to the 30S initiation complex // EMBO Rep.

- 2010. - vol. 11. - p. 312-316

[109] Studer S.M., Joseph S. Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex // Mol Cell. - 2006. - vol. 22. - p. 105-115

[110] Goyal A., Belardinelli R., Maracci C., Milon P., Rodnina M.V. Directional transition from initiation to elongation in bacterial translation // Nucleic Acids Res. - 2015. - vol. 43. - p. 10700-10712

[111] Duval M., Korepanov A., Fuchsbauer O., Fechter P., Haller A., Fabbretti A., Choulier L., Micura R., Klaholz B.P., Romby P., et al. Escherichia coli ribosomal protein S1 unfolds structured mRNAs onto the ribosome for active translation initiation // PLoS Biol. - 2013. - vol. 11. - e1001731

[112] Byrgazov K., Grishkovskaya I., Arenz S., Coudevylle N., Temmel H., Wilson D.N., Djinovic-Carugo K., Moll I. Structural basis for the interaction of protein S1 with the Escherichia coli ribosome // Nucleic Acids Res. - 2015. - vol. 43. - p. 661-673

[113] Cornish P.V., Ermolenko D.N., Noller H.F., Ha T. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes // Mol Cell. - 2008. - vol. 30. - p. 578-588

[114] Guo Z., Noller H.F. Rotation of the head of the 30S ribosomal subunit during mRNA translocation // Proc Natl Acad Sci. - 2012. - vol. 109. - p. 20391-20394

[115] Myasnikov A.G., Marzi S., Simonetti A., Giuliodori A.M., Gualerzi C., Yusupova G., Yusupov M., Klaholz B.P. Conformational transition of initiation factor 2 from the GTP- to GDP-state visualized on the ribosome // Nat Struct Mol Biol. - 2005. - vol. 12. - p. 1145-1149

[116] Allen G.S., Zavialov A., Gursky R., Ehrenberg M., Frank J. The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli // Cell. - 2005. - vol. 121. - p. 703-712

[117] Simonetti A., Marzi S., Myasnikov A.G., Fabbretti A., Yusupov M., Gualerzi C., Klaholz B.P. Structure of the 30S translation initiation complex // Nature. - 2008. - vol. 455(7211). - p. 416-420

[118] Julián P., Milon P., Agirrezabala X., Lasso G., Gil D., Rodnina M.V., Valle M. The Cryo-EM Structure of a Complete 30S Translation Initiation Complex from Escherichia coli // PLoS Biol. - 2011.

- vol. 9(7). - e1001095

[119] Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janell D., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution // Cell. - 2000. - vol. 102. - p. 615-623

[120] Qin D., Liu Q., Devaraj A., Fredrick K. Role of helix 44 of 16S rRNA in the fidelity of translation initiation // RNA. - 2012. - vol. 18. - p. 485-495

[121] Yusupova G., Jenner L., Rees B., Moras D., Yusupov M. Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome // Nature. - 2006. - vol. 444. - p. 391-394

[122] Korostelev A., Trakhanov S., Asahara H., Laurberg M., Lancaster L., Noller H.F. Interactions and dynamics of the Shine-Dalgarno helix in the 70S ribosome // Proc Natl Acad Sci. - 2007. - vol. 104. -p.16840-16843

[123] La Teana A., Brandi A., O'Connor M., Freddi S., Pon C.L. Translation during cold adaptation does not involve mRNA-rRNA base pairing through the downstream box // RNA. - 2000. - vol. 6. - p. 1393-1402

[124] Yusupova G.Z., Yusupov M.M., Cate J.H., Noller H.F. The path of messenger RNA through the ribosome // Cell. - 2001. - vol. 106. - p. 233-241

[125] Qu X., Lancaster L., Noller H.F., Bustamante C., Tinoco I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps // Proc Natl Acad Sci. - 2012. - vol. 109. - p. 14458-14463

[126] Brandi L., Fabbretti A., Pon C.L., Dahlberg A.E., Gualerzi C.O. Initiation of protein synthesis: a target for antimicrobials // Expert Opinion on Therapeutic Targets. - 2008. - vol.. 12. - № 5. - p. 519534

[127] Wilson D.N. Ribosome-targeting antibiotics and bacterial resistance mechanisms // Nat. Rev. Microbiol. - 2014. - vol. 12. - p. 35-48

[128] Arenz S., Wilson D.N. Bacterial Protein Synthesis as a Target for Antibiotic Inhibition // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2016. - vol. 6(9). - a025361

[129] Arenz S. & Wilson D. N. Blast from the Past: Reassessing Forgotten Translation Inhibitors, Antibiotic Selectivity, and Resistance Mechanisms to Aid Drug Development // Molecular Cell. - 2016.

- vol. 61(1). - p. 3-14

[130] Osterman I.A., Wieland M., Maviza T.P., Lashkevich K.A., Lukianov D.A., Komarova E.S., Zakalyukina Y.V., Buschauer R., Shiriaev D.I., Leyn S.A., Zlamal J.E., Biryukov M.V., Skvortsov D.A., Tashlitsky V.N., Polshakov V.I., Cheng J., Polikanov Y.S., Bogdanov A.A., Osterman A.L., Dmitriev S.E., Beckmann R., Dontsova O.A., Wilson D.N., Sergiev P.V. Tetracenomycin X inhibits translation by binding within the ribosomal exit tunnel // Nat Chem Biol. - 2020. - vol. 16(10). - p. 1071-1077

[131] Vila-Sanjurjo A., Squires C.L., Dahlberg A.E. Isolation of kasugamycin resistant mutants in the 16S ribosomal RNA of Escherichia coli // J Mol Biol. - 1999. - vol. 293. - № 1. - p. 1-8

[132] Schuwirth B.S., Day J.M., Hau C.W., Janssen G.R., Dahlberg A.E., Cate J.H., Vila-Sanjurjo A. Structural analysis of kasugamycin inhibition of translation // Nat Struct Mol Biol. - 2006. - vol. 13. -№ 10. - p. 879-886

[133] Dinos G.; Wilson D.N.; Teraoka Y.; Szaflarski W.; Fucini P.; Kalpaxis D.; Nierhaus K.H. Dissecting the Ribosomal Inhibition Mechanisms of Edeine and Pactamycin: the Universally Conserved Residues G693 and C795 Regulate P-Site RNA Binding // Molecular Cell. - 2004. - vol. 13. - p. 113124

[134] Giuliodori A., Spurio R., Milon P., Fabbretti A. Antibiotics Targeting the 30S Ribosomal Subunit: A Lesson from Nature to Find and Develop New Drugs // Curr Top Med Chem. - 2018. - vol. 18(24).

- p. 2080-2096

[135] Potrykus K. & Cashel M. (p)ppGpp: still magical? // Annu. Rev. Microbiol. - 2008. - vol. 62. -p.35-51

[136] Hauryliuk V., Atkinson G.C., Murakami K.S., Tenson T. and Gerdes K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology // Nat Rev Microbiol. - 2015. - vol. 13. - p. 298- 309

[137] Atkinson G.C., Tenson T. and Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life // PloS One. - 2011. - vol. 6. - e23479

[138] Steinchen W., Bange G. The magic dance of the alarmones (p)ppGpp // Mol Microbiol. - 2016. -vol. 101(4). - p. 531-44

[139] Gaca A.O., Kudrin P., Colomer-Winter C., Beljantseva J., Liu K., Anderson B., et al. From (p)ppGpp to (pp)pGpp: characterization of regulatory effects of pGpp synthesized by the small alarmone synthetase of Enterococcusfaecalis // J Bacteriol. - 2015. - vol. 197. - p. 2908- 2919

[140] Rowen L. and Kornberg A. Primase, the dnaG protein of Escherichia coli An enzyme which starts DNA chains // J Biol Chem. - 1978. - vol. 253. - p. 758- 764

[141] Kitani T., Yoda K., Ogawa T. and Okazaki T. Evidence that discontinuous DNA replication in Escherichia coli is primed by approximately 10 to 12 residues of RNA starting with a purine // J Mol Biol. - 1985. - vol. 184. - p. 45- 52

[142] Maciag-Dorszynska M., Szalewska-Palasz A. and Wegrzyn G. Different effects of ppGpp on Escherichia coli DNA replication in vivo and in vitro // FEBS Open Bio. - 2013. - vol. 3. - p. 161- 164

[143] Rymer R. U. et al. Binding mechanism of metalNTP substrates and stringent-response alarmones to bacterial DnaG-type primases // Structure. - 2012. - vol. 20. - p. 1478-1489

[144] Wang J. D., Sanders G. M. & Grossman A. D. Nutritional control of elongation of DNA replication by (p)ppGpp // Cell. - 2007. - vol. 128. - p. 865-875

[145] Maciag M., Kochanowska M., Lyzen R., Wegrzyn G. & Szalewska-Palasz A. ppGpp inhibits the activity of Escherichia coli DnaG primase // Plasmid. - 2010. - vol. 63. - p. 61-67

[146] Gaca A. O., Abranches J., Kajfasz J. K. & Lemos J. A. Global transcriptional analysis of the stringent response in Enterococcus faecalis // Microbiology. - 2012. - vol. 158. - p. 1994-2004

[147] Corrigan R. M., Bowman L., Willis A. R., Kaever V. & Grundling A. Cross-talk between two nucleotide signaling pathways in Staphylococcus aureus // J. Biol. Chem. - 2015. - vol. 290. - p. 58265839

[148] Samarrai W. et al. Differential responses of Bacillus subtilis rRNA promoters to nutritional stress // J. Bacteriol. - 2011. - vol. 193. - p. 723-733

[149] Irving S. E., Choudhury N. R. & Corrigan R. M. The stringent response and physiological roles of (p)ppGpp in bacteria // Nature Reviews Microbiology. - 2020. - p. 256-271

[150] Schreibe G., Ron E. Z. & Glaser G. ppGpp-mediated regulation of DNA replication and cell division in Escherichia coli // Curr. Microbiol. - 1995. - vol. 30. - p. 27-32

[151] Ferullo D.J. & Lovett S.T. The stringent response and cell cycle arrest in Escherichia coli // PLoS Genet. - 2008. - vol. 4(12). - e1000300

[152] Kanjee U., Ogata K. and Houry W.A. Direct binding targets of the stringent response alarmone (p)ppGpp // Mol Microbiol. - 2012. - vol. 85. - p. 1029- 1043

[153] Vinogradova D.S., Zegarra V., Maksimova E., Nakamoto J.A., Kasatsky P., Paleskava A., Konevega A.L., Milon P. How the initiating ribosome copes with ppGpp to translate mRNAs // PLoS Biol. - 2020. - vol. 18(1). - e3000593

[154] Zhang Y., Zbornikova E., Rejman D. & Gerdes K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli // mBio. - 2018. - vol. 9(2). - e02188-17

[155] Rojas A. M., Ehrenberg M., Andersson S. G. & Kurland C. G. ppGpp inhibition of elongation factors Tu, G and Ts during polypeptide synthesis // Mol. Gen. Genet. - 1984. - vol. 197. - p. 36-45

[156] Sinha A. K., Winther K. S., Roghanian M. & Gerdes K. Fatty acid starvation activates RelA by depleting lysine precursor pyruvate // Mol. Microbiol. - 2019. - vol. 112. - p. 1339-1349

[157] Jerabek-Willemsen M., Wienken C.J., Braun D., Baaske P., Duhr S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis // Assay Drug Dev Technol. - 2011. -vol. 9(4). - p. 342-53

[158] Voit A., Krekhov A., Enge W., Kramer L., Köhler W. Thermal patterning of a critical polymer blend // Phys Rev Lett. - 2005. - vol. 94(21). - 214501

[159] Duhr S., Braun D. Thermophoretic depletion follows Boltzmann distribution // Phys Rev Lett. -2006. - vol. 96(16). - 168301

[160] Dhont J., Wiegand S., Duhr S., Braun D. Thermodiffusion of charged colloids: single-particle diffusion // Langmuir. - 2007. - vol. 23(4). - p. 1674-1683

[161] Seidel S., Dijkman P., Lea W., Bogaart G., Jerabek-Willemsen M., Lazic A., Joseph J., Srinivasan P., Baaske P., Simeonov A., Katritch I., Melo F., Ladbury J., Schreiber G., Watts A., Braun D., Duhr S. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions // Methods. - 2013. - vol. 59(3). - p. 301-315

[162] Duhr S, Braun D. Why molecules move along a temperature gradient // Proc Natl Acad Sci. -2006. - vol. 103. - p. 19678-19682

[163] Ross D, Gaitan M, Locascio LE. Temperature Measurement in Microfluidic Systems Using a Temperature-Dependent Fluorescent Dye // Anal Chem. - 2001. - vol. 73. - p. 4117-4123

[164] Royer C.A. Probing protein folding and conformational transitions with fluorescence // Chem Rev. - 2006. - vol. 106. - p. 1769-1784

[165] Zelent B., Troxler T., Vanderkooi J. Temperature dependence for fluorescence of beta-NADH in glycerol/water solution and in trehalose/sucrose glass // J Fluoresc. - 2007. -vol. 17(1). - p. 37-42

[166] Buschmann V., Weston K., Sauer M. Spectroscopic study and evaluation of red-absorbing fluorescent dyes // Bioconjug Chem. - 2003. - vol. 14(1). - p. 195-204

[167] Grimsley G.R., et al. Determining the conformational stability of a protein from urea and thermal unfolding curves // Curr Protoc Protein Sci. - 2013. - vol. 28. - unit 28.4

[168] Real-Hohn A., Groznica M., Löffler N., Blaas D., Kowalski H. nanoDSF: In vitro Label-Free Method to Monitor Picornavirus Uncoating and Test Compounds Affecting Particle Stability // Front Microbiol. - 2020. - vol. 11. - p. 1442

[169] Magnusson A., Szekrenyi A., Joosten H., Finnigan J., Charnock S., Fessner W. nanoDSF as screening tool for enzyme libraries and biotechnology development // FEBS J. - 2019. - vol. 286(1). -p. 184-204

[170] Baaske P., Breitsprecher D., Derix J., Duhr S. System and method for the optical measurement of stability and aggregation of particles. - Patent № CA3000059A1

[171] Rodnina M.V., Wintermeyer W. GTP consumption of elongation factor Tu during translation of heteropolymeric mRNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1995. -vol. 92. - № 6. - p. 1945-1949

[172] Milon P., Konevega A.L., Peske F., Fabbretti A., Gualerzi C.O., Rodnina M.V. Transient kinetics, fluorescence, and FRET in studies of initiation of translation in bacteria // Methods Enzymol. - 2007. -vol. 430. - p. 1-30

[173] Daviter T., Wieden H.-J. & Rodnina M. V. Essential Role of Histidine 84 in Elongation Factor Tu for the Chemical Step of GTP Hydrolysis on the Ribosome // Journal of Molecular Biology. - 2003. -vol. 332(3). - p. 689-699

[174] Gite et al., Ultrasensitive Fluorescence-Based Detection of Nascent Proteins in Gels //Analytical Biochemistry. - 2000. - vol. 279(2). - p. 218-225

[175] Schmidt A., Kochanowski K., Vedelaar S., Ahrne E., Volkmer B., Callipo L., Knoops K., Bauer M., Aebersold R., Heinemann M. The quantitative and condition-dependent Escherichia coli proteome // Nat Biotechnol. - 2016. - vol. 34(1). - p. 104-110

[176] Mechold U., Murphy H., Brown L., & Cashel M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis // J Bacteriol. - 2002. - vol. 184. - p. 2878-2888

[177] Maracci C., Rodnina M.V. Review: Translational GTPases // Biopolymers. - 2016. -vol. 105(8).

- p. 463-475

[178] Gomez-Hens A. & Perez-Bendito D. The stopped-flow technique in analytical chemistry // Analytica Chimica Acta. - 1991. - vol. 242. - p. 147-177

[179] Antoun A., Pavlov M.Y., Tenson T. and Ehrenberg M. Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering // Biol. Proced. - 2004. - vol. 6(1). - p. 35-54

[180] Antoun A, Pavlov MY, Andersson K, Tenson T, Ehrenberg M. The roles of initiation factor 2 and guanosine triphosphate in initiation of protein synthesis // Embo J. - 2003. - vol. 22. - p. 5593-5601

[181] Wishnia A, Boussert A, Graffe M, Dessen PH, GrunbergManago M. Kinetics of the reversible association of ribosomal subunits: stopped-flow studies of the rate law and of the effect of Mg2+. // J Mol Biol. - 1975. - vol. 93. - p. 499-415

[182] Mitkevich V.A., Ermakov A., Kulikova A.A., Tankov S., Shyp V., Soosaar A. et al. Thermodynamic characterization of ppGpp binding to EF-G or IF2 and of initiator tRNA binding to free IF2 in the presence of GDP, GTP, or ppGpp // J Mol Biol. - 2010. - vol. 402. - p. 838-846

[183] Milon P, Tischenko E, Tomsic J, Caserta E, Folkers G, Teana A, et al. The nucleotide-binding site of bacterial translation initiation factor 2 (IF2) as a metabolic sensor // Proc Natl Acad Sci. - 2006. -vol. 103. - p. 13962-13967

[184] Hauryliuk V, Mitkevich VA, Draycheva A, Tankov S, Shyp V, Ermakov A, et al. Thermodynamics of GTP and GDP Binding to Bacterial Initiation Factor 2 Suggests Two Types of Structural Transitions // J Mol Biol. - 2009. - vol. 394. - p. 621-626

[185] Caserta E, Tomsic J, Spurio R, Teana A, Pon CL, Gualerzi CO. Translation initiation factor IF2 interacts with the 30S ribosomal subunit via two separate binding sites // J Mol Biol. - 2006. - vol. 362.

- p. 787-799

[186] Caban K, Pavlov M, Ehrenberg M, Gonzalez RL. A conformational switch in initiation factor 2 controls the fidelity of translation initiation in bacteria // Nat Commun. - 2017. - vol. 8(1). - p. 1475

[187] Burkhardt D.H., Rouskin S., Zhang Y., Li G.W., Weissman J.S., Gross C A. Operon mRNAs are organized into ORF-centric structures that predict translation efficiency // Elife. - 2017. - vol. 6. -e22037

[188] Sanchez-Vazquez P., Dewey C.N., Kitten N., Ross W., Gourse R.L. Genome-wide effects on Escherichia coli transcription from ppGpp binding to its two sites on RNA polymerase // Proc Natl Acad Sci. - 2019. - vol. 116 (17). - p. 8310-8319

[189] Varik V., Oliveira S., Hauryliuk V., Tenson T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp // Sci Rep. - 2017. - vol. 7(1). - 11022

[190] Zbornikova E., Knejzlik Z., Hauryliuk V., Krasny L., Rejman D. Analysis of nucleotide pools in bacteria using HPLC-MS in HILIC mode // Talanta. - 2019. - vol.205. - 120161

[191] Kriel A., Bittner A.N., Kim S., Liu K., Tehranchi A.K., Zou W.Y., et al. Direct regulation of GTP homeostasis by (p)ppGpp: a critical component of viability and stress resistance // Mol Cell. - 2012. -vol. 48. - p. 231-241

[192] Polikanov Y.S., Osterman I.A., Szal T., Tashlitsky V.N., Serebryakova M.V., Kusochek P., et al. Amicoumacin A inhibits translation by stabilizing RNA interaction with the ribosome // Mol. Cell. -2014. - vol. 56. - p. 531-540

[193] Prokhorova I.V., Akulich K.A., Makeeva D.S., Osterman I. A., Skvortsov D. A., Sergiev P. V., et al. Amicoumacin A induces cancer cell death by targeting the eukaryotic ribosome // Sci. Rep. - 2016.

- vol. 6. - 27720

[194] Maksimova E., Vinogradova D.S., Osterman I.A., Kasatsky P.S., Nikonov O., Milon P., Dontsova O.A., Sergiev P.V., Paleskava A., Konevega A.L. Multifaceted Mechanism of Amicoumacin A Inhibition of Bacterial Translation // Front Microbiol. - 2021. - vol. 12. - 618857

[195] Chin K., Shean C. S., Gottesman M. E. Resistance of lambda cI translation to antibiotics that inhibit translation initiation // J Bacteriol. - 1993. - vol. 175. - p. 7471-7473

[196] Vazquez-Laslop N., Mankin A. S. Context-specific action of ribosomal antibiotics // Annu. Rev. Microbiol. - 2018. - vol. 72. - p. 185-207

[197] Schluenzen F., Takemoto C., Wilson D. N., Kaminishi T., Harms J. M., Hanawa-Suetsugu K., et al. The antibiotic kasugamycin mimics mRNA nucleotides to destabilize tRNA binding and inhibit canonical translation initiation // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2006. - vol. 13. - p. 871-878

[198] Rodnina M.V., Stark H., Savelsbergh A., Wieden H.J., Mohr D., Matassova N.B., Peske F., Daviter T., Gualerzi C.O., Wintermeyer W. GTPases mechanisms and functions of translation factors on the ribosome // Biol Chem. - 2000. - vol. 381(5-6). - p. 377-387

[199] Wittinghofer A., Vetter I.R. Structure-function relationships of the G domain, a canonical switch motif // Annu Rev Biochem. - 2011. - vol. 80. - p. 943-971

[200] Vetter I.R., Wittinghofer A. The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions // Science.

- 2001. - vol. 294(5545). - p. 1299-1304

[201] Gromadski K.B., Wieden H., Rodnina M.V. Kinetic mechanism of elongation factor Ts-catalyzed nucleotide exchange in elongation factor Tu // Biochemistry. - 2002. -vol. 41(1). - p.162-169

[202] Hansson S., Singh R., Gudkov A.T., Liljas A., Logan D.T. Crystal structure of a mutant elongation factor G trapped with a GTP analogue // FEBS Lett. - 2005. - vol. 579(20). - p. 4492-4497

[203] Salsi E., Farah E., Netter Z., Dann J., Ermolenko D.N. Movement of elongation factor G between compact and extended conformations // J Mol Biol. - 2015. - vol. 427(2). - p. 454-467

[204] Savelsbergh A., Katunin V.I., Mohr D., Peske F., Rodnina M.V., Wintermeyer W. An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation // Mol Cell. - 2003. -vol. 11(6). - p. 1517-1523

[205] Pan D., Kirillov S.V., Cooperman B. Kinetically competent intermediates in the translocation step of protein synthesis // Mol Cell. - 2007. - vol. 25(4). - p. 519-529

[206] Tomsic J., Vitali L.A., Daviter T., Savelsbergh A., Spurio R., Striebeck P., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Gualerzi C.O. Late events of translation initiation in bacteria: a kinetic analysis // EMBO J. - 2000. - vol. 19(9). - p. 2127-2136

[207] Sprink T., Ramrath D., Yamamoto H., Yamamoto K., Loerke J., Ismer J., Hildebrand P.W., Scheerer P., Bürger J., Mielke T., Spahn C. Structures of ribosome-bound initiation factor 2 reveal the mechanism of subunit association // Sci Adv. - 2016. - vol. 2(3). - e1501502

[208] Potrykus K., Murphy H., Philippe N., Cashel M. ppGpp is the major source of growth rate control in E. coli // Environ Microbiol. - 2011. - vol. 13. - p. 563-575

[209] Dai X., Zhu M., Warren M., Balakrishnan R., Patsalo V., Okano H., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth // Nat Microbiol. -2016. - vol. 2. - 16231

[210] Hobbs J.K. & Boraston A.B. (p)ppGpp and the Stringent Response: An Emerging Threat to Antibiotic Therapy // ACS Infectious Diseases. - 2019. - vol. 5(9). - p. 1505-1517

Благодарности

Выражаю благодарность своему мужу за непоколебимую веру в успех, родителям, брату за бесконечную поддержку.

Особую благодарность я выражаю своему научному руководителю Коневеге Андрею Леонидовичу за организацию исследований по теме диссертации, за поддержку, участие, внимание и все те возможности, которые он для меня открыл.

Глубокую благодарность выражаю Полу Милону за идею исследования, постоянное участие и поддержку.

Благодарю Петра Вардегу за тот опыт и те знания, которые я получила в области технологий микротермофореза и дифференциальной сканирующей флуориметрии, а также компанию Нанотемпер Технолоджис Рус (NanoTemper Technologies Rus) за предоставленные для проведения научно-исследовательской работы приборы Monolith NT.115 и Prometheus NT.48.

Особую признательность я выражаю Елене Максимовой за бесконечную поддержку, веру и участие.

Я выражаю глубокую благодарность Яне Забродской и Алексею Мишину за неоценимую помощь в подготовке данной диссертации к защите, а также всем коллегам, принимающим участие в этом процессе.

Глубокую признательность я выражаю Соболевой Наталие Георгиевне и Катунину Владимиру Ивановичу за начало моего научного пути, всестороннюю поддержку и участие.

Благодарю Павла Касацкого и всех сотрудников лаборатории биосинтеза белка ОМРБ ПИЯФ НИЦ КИ за помощь, поддержку, участие и атмосферу научной семьи.

Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда и Российского Фонда Фундаментальных Исследований.