«Регуляция трансляции путем стабилизации конформационных состояний рибосомы: роль деацилированной тРНК» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Сусоров Денис Сергеевич

• Сусоров Денис Сергеевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Сусоров Денис Сергеевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая важность работы

Глава1. Обзор литературы

1.1. Трансляция и структура рибосомы

1.2. Конформационная подвижность рибосомы

1.3. Конформационная подвижность рибосомы в ходе элонгации трансляции

1.4. Терминация и рециклинг

1.5. Деацилированная тРНК в Е-сайте

1.6. Заключение

Глава2. Материалы и методы

2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе

2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК

2.5. Трансформация E. coli плазмидной ДНК

2.6. Выделение плазмидной ДНК из E.coli

2.7. Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК при помощи автоматической системы Applied Biosystems ABI

2.8. АДФ -рибозилирование eEF2

2.9. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ

2.10. Электрофорез белков в нативном 10% ПААГ

2.11. Получение посттранлокационных комплексов рибосом

2.11.1. Получение мРНК

2.11.2. Выделение рибосом

2.11.3. Выделение факторов трансляции (нативных и рекомбинантных)

2.11.4. Аминоацилирование тРНК

2.11.5. Сборка ПОСТ комплекса

2.12. Проверка ПОСТ комплексов с помощью тоу-принт анализа

2.13. Тоу-принт анализ ПОСТ комплексов в присутствии различных лигандов

2.14. Анализ гидролиза пептидил-тРНК

2.15. Трансляция in vitro в лизате ретикулоцитов кролика

2.16. RelE анализ.............................................................................Ошибка! Закладка не определена.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Деацилированная тРНК стабилизирует эукариотические терминационные комплексы

3.2. Детерминанты, определяющие стабилизирующую активность деацилированной тРНК, расположены в её акцепторной ветви

3.3. Механизм стабилизации стабилизации eRF1 деацилированной тРНК и её роль в регуляции трансляции эукариот

3.4. Обратная транслокация эукариотических рибосом происходит в присутствии еЕБ2 и деацилированной тРНК

3.5. Условия, необходимые для обратной трналокации

3.6. АДФ-рибозилирование eEF2 ингибирует обратную транслокацию

3.7. Механизм обратной транслокации эукариот и её роль в понимании работы рибосомы

Заключение: роль конформационной подвижности рибосомы в регуляции трансляции эукариот

Выводы

Список цитируемой литературы

Список сокращений

ATP, АТФ аденозинтрифосфат

GTP, ГТФ гуанозинтрифосфат

гдф гуанозиндифосфат

СТР цитидинтрифосфат

dATP дезоксиаденозинтрифосфат

dGTP дезоксигуанозинтрифосфат

dTTP дезокситимидинтрифосфат

dCTP дезоксицитидинтрифосфат

SDS додецилсульфат натрия

IPTG изопропилтиогалактозид

DTT, ДТТ 1,4-дитио-DL-трейтол

MOPS 3-[N-Морфолино]пропансульфоновая кислота

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

TEMED N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин

ТХУ трихлоруксусная кислота

БСА бычий сывороточный альбумин

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК рибонуклеиновая кислота

мРНК матричная РНК

тРНК транспортная РНК

ПТЦ пептидилтрансферазный центр

RF факторы терминации

PABP поли-А-связывающий белок

ПЦР полимеразная цепная реакция

УФ ультрафиолет

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Регуляция трансляции путем стабилизации конформационных состояний рибосомы: роль деацилированной тРНК»»

Введение

Биосинтез белка или трансляция является одним из центральных процессов живой клетки - половину сухой массы любого организма составляют разнообразные белки, которые играют главную роль в определении физиологических и морфологических свойств организмов (Steitz and Moore, 2017). Биосинтез белка осуществляют особые субклеточные частицы - рибосомы. Каждая рибосома действует как полимераза, способная синтезировать полипептид практически любой последовательности; она состоит из двух неодинаковых субъединиц, состоящих из рибосомной РНК и белков; большая субъединица катализирует реакцию транспептидации (удлинения полипетидной цепи); на малой субъединице происходит взаимодействие кодонов мРНК и антикодонов тРНК (Steitz and Moore, 2017).

В ходе биосинтеза белка, рибосома двигается кодон-за-кодоном к 3'-концу матрицы, пропуская через себя тРНК и мРНК (Lin et al., 2015). В 1968 году было высказано предположение, согласно которому движение молекул тРНК в рибосоме можно разделить на две стадии: сначала они перемещаются относительно одной субъединицы, формируя гибридные состояния, потом - относительно другой (Bretscher, 1968; Spirin, 1968).

С помощью структурных методов удалось показать, что гибридные состояния тРНК сопровождаются крупномасштабными конформационными перестройками рибосомы (Agrawal et al., 1999; Korostelev and Noller, 2007; Ratje et al., 2010). Химические сшивки между большой и малой субъединицами, предотвращающие эти перестройки, блокировали перемещения тРНК и биосинтез белка (Horan and Noller, 2007). Дальнейшие структурные исследования различных стадий трансляции (Ramakrishnan, 2014) показали, что рибосома является динамичной структурой, конформация которой тесно связана с её функцией, и может регулироваться различными лигандами.

Данная работа посвящена именно этой связи рибосомной подвижности и её функции. В качестве объекта исследования мы использовали эукариотическую рибосому, так как она намного слабее изучена по сравнению с прокариотической и информации, касающейся особенностей ее функционирования, недостаточно.

В ходе работы нам удалось показать, что связывание с рибосомой белка-лиганда, фактора терминации трансляции человека eRF1, опосредовано стабилизируется отдаленным от него взаимодействием рибосомы с деацилированной тРНК через регуляцию конформации рибосомы. Также было обнаружено, что в присутствии фактора

элонгации трансляции эукариот 2 (eEF2), взаимодействие рибосомы с определенными деацилированными тРНК может сопровождаться обратным движением рибосомного комплекса вдоль мРНК (обратной транслокацией). Оба процесса не трудно объяснить с позиций конформационных изменений рибосомы. Выявленные механизмы опираются на консервативные свойства рибосомы, но тем не менее несут характерные для эукариот отличия.

Цели и задачи исследования

1. Исследовать влияние деацилированной тРНК на связывание фактора терминации трансляции человека eRF1 с терминирующей рибосомой.

2. Изучить влияние фактора элонгации трансляции эукариот eEF2 и деацилированной тРНК на направление движения элонгационных рибосомных комплексов.

Научная новизна и практическая значимость работы

При исследовании влияния деацилированных тРНК на эукариотические рибосомные комплексы, был обнаружен стабилизирующий эффект этих молекул на связывание фактора терминации трансляции человека eRF1 с рибосомами. Было продемонстрировано, что разные тРНК обладают различной эффективностью в этом процессе. В результате точечного мутагенеза, было обнаружено, что необходимой для стабилизирующей активности частью тРНК является её акцепторная ветвь. На примере двух тРНКВал, отличающихся только двумя парами оснований в акцепторном стебле и имеющих при этом разную способность к стабилизации eRF1, было показано, что биологическая роль таких изодекодерных тРНК в эукариотах может быть связана со стадией терминации трансляции. Используя мутантные факторы eRF1, а также антибиотик циклогексимид, удалось установить механизм стабилизирующего действия деацилированной тРНК, который оказался связан с межсубъединичной, а также внутренней подвижностью рибосомы.

Полученные данные углубляют понимание регуляции терминации у эукариот, что важно как с фундаментальной точки зрения, так и с практической, так как более 30% болезней человека связаны с образованием преждевременных стоп кодонов и нарушениями на стадии терминации трансляции (Brown et al., 2015).

В ходе дальнейшего исследования деацилированной тРНК удалось впервые показать обратную транслокацию у эукариотических рибосомных комплексов. Было продемонстрировано, что для осуществления этого процесса необходим фактор

элонгации трансляции эукариот еЕБ2, который катализирует прямую транслокацию в ходе элонгации трансляции, и комплиментарная кодону в Е сайте рибосомы деацилированная тРНК. Используя АДФ-рибозилирование остатка дифтамида в домене IV еЕБ2, а также антибиотик гигромицин Б, удалось установить механизм обратной транслокации. Было показано, что перемещение тРНК и мРНК в рибосоме требуют универсального промежуточного состояния, которое стабилизируется еЕБ2, а направление этих перемещений определяется концентрацией и типом лигандов, связанных с рибосомой.

Результаты, полученные при исследовании обратной транслокации важны для понимания рибосомы, как обратимой молекулярной машины. Они позволяют прояснить, каким образом достигается направленность и высокая скорость перемещения рибосом вдоль мРНК в живых клетках.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Трансляция и структура рибосомы

Трансляция состоит из четырех стадий - инициации, элонгации, терминации и рециклинга (Рис. 1). На стадии инициации, рибосомы связывают мРНК и находят стартовый кодон будущего белка. После распознавания старт-кодона происходит наращивание полипетидной цепи в соответствии с последовательностью кодонов мРНК - это стадия элонгации, в ходе которой рибосома движется к 3'-концу мРНК. В конце кодирующей последовательности мРНК рибосома встречает стоп-кодон и происходит терминация, в результате которой новый белок высвобождается в раствор. Рибосома остается связанной на мРНК, пока не диссоциирует в процессе рециклинга, что позволяет ей вновь вступить в стадию инициации. Процессы инициации, терминации и рециклинга сильно различаются у про- и эукариот, в то время как элонгация практически идентична (Рис. 1) (МеЫ^ et а!., 2012).

ID

CD

ET h- •

o

<

CD

pa

Is) O

s

o

O X

CD

S pa

a s

pa

pa

a

o

a a s

o\

pa «

H CD

Ci?

£ S o

H

O F

w

S

CD

a

CD

a

s

w

IF1, IF2:fMet-tRNA

Initiation (1-3)

2. Start codon selection downstream ot the SD

Large subunit

Large subunit

3. Subunit association and beginning of translation

IF1, IF2, IF3

1. mRNA binding via SD Interaction

%

IF3

7

\

Small subunit

7. Dissociation of tRNA and mRNA

%

mRNA

Shine-Dalgarno sequence (SD)

Start codon

RRF, EF-G

6.70S dissociation

RF1 or RF2, RF3

Recycling (6,7)

RRF, EF-G

Termination (5)

RF3

Initiation (0-3)

2. Start codon search by scanning

elF1,elFlA, elF3 elF2, elF4B, elF4E, elF4G, elF5, elF5B

\

* i

Elongation (4)

I

IF-P

EF-G

t

aa-tRNA:

EF-Tu

>

tRNA

aa-tRNA: eEF1A

4. Translation in polysomes

/v

RF1 or RF2 ABCE1

eRF1 :eRF3

5. Peptide release

0. mRNA circularizatlon

m48s

1. mRNA binding at the 5'-cap

43S

eiF4B, eiF4E, elF4G * PABP

.Cap

Start codon

Kozak ^ y Poly(A) tall

sequence~\(A)n3'

mRNA

*

elF2: Met-tRNA

elF1, elF1A, elF3, elF5

6. Dissociation of tRNA and mRNA

J L

5. Coupled peptide release and subunit dissociation

Termination and recycling (5,6)

Bacteria

Eukaryotes

Рибосома является очень консервативной частицей: она имеет характерное ядро, состоящее из рибосомной РНК (рРНК) и рибосомными белками, которое формирует основные функциональные центры рибосомы, такие как декодирующий центр, пептидил-трансферазный центр и тРНК-связывающие участки. Помимо этого ядра, прокариотическая и эукариотическая рибосомы имеют свои отличительные черты в виде специфичных белков, вставок и удлинений консервативных белков, и сегментов расширения рРНК (Melnikov et al., 2012).

Рибосома состоит из двух субъединиц - малой и большой, образованных соответственно малой и большой рРНК и соответствующими белками. Исследования прокариотических рибосом методом рентгено-структурного анализа (Ban et al., 2000; Wimberly et al., 2000; Yusupov et al., 2001), показали сложную архитектуру субъединиц, образованную в результате взаимного контакта рибосомных белков и рРНК. рРНК малой субъединицы образует 4 домена, которые вместе с рибосомальными белками придают субъединице характерную форму (Рис. 2А). Концевые 5'- и З'-домены (в частности, спираль h44) вместе с рибосомальными белками S4, 5, 12, 16, 17 и S20 формируют «тело» малой субчастицы и её «ногу» (или «шпору»), 3'-концевой домен, белки S2, 3, 7, 10, 13, 14 и S19 формируют «голову» малой субчастицы, а центральный домен вместе с белками S1, 6, 8, 11, 15 и S18 составляет её «платформу». На головном домене также различают «клюв», а вблизи него, на теле, располагается «плечо» малой субчастицы. рРНК большой субъединицы подразделяется на 7 доменов (включая 5S рРНК, как 7-ой домен), которые сложно переплетены друг с другом и с рибосомальными белками (Рис. 2Б). В её строении выделяют центральный вырост и подвижные боковые выросты L1 и L7/L12 (Wilson and Cate, 2012).

Интерфейс между двумя субъединицами образован в основном рРНК, относящейся к консервативному ядру рибосомы. мРНК связывается в щели между головой и телом малой субъединицы, где кодоны мРНК взаимодействуют с кодонами тРНК (Рис. 2В). В межсубъединичном интерфейсе находятся три тРНК-связывающих участка (сайта) рибосомы: А-сайт связывает входящую аминоацил-тРНК, Р-сайт содержит пептидил-тРНК и Е-сайт связывает деацилированную тРНК, которая поступает из Р-сайта после образования очередной пептидной связи. На большой субчастице, 3'-концы тРНК из А- и Р-сайтов находятся рядом в пептидил-трансферазном центре (ПТЦ) большой субчастицы, который катализирует удлинение цепи полипептида, в то время как деацилированный

конец тРНК Е-сайта отдален на расстояние порядка 50 ангстрем от ПТЦ (Schmeing and Ramakrishnan, 2009).

Рис. 2. Строение бактериальной рибосомы: (А) малой субъединицы, (Б) большой субъединицы, (В) полного рибосомного комплекса. (Г) Схема рибосомного комплекса. С изменениями по (Yamamoto et al., 2014) (А, Б) и (Voorhees and Ramakrishnan, 2013) (В).

Эукариотическая рибосома по своему строению похожа на прокариотическую (Ben-Shem et а1., 2010). Субъединицы имеют те же структурные части, что и у прокариотической рибосомы: малая субъединица также имеет тело, голову, платформу, клюв и плечо, а большая центральный вырост, и выросты L1 и L7/12, который в эукариотической рибосоме называется Ро/Р1-выростом. Интерфейс между субъединицами, как и у прокриотической рибосомы, относится к общему для них консервативному ядру. При этом, межсубъединичный интерфейс эукариотических рибосом имеет больше контактов типа рибоза-рибоза, связанных с взаимодействием ОН-групп, по сравнению с контактами, образованными фосфатами рРНК и М^2+-мостиками

(Khatter et al., 2015). В этом, вероятно, кроется причина меньшей зависимости эукариотических рибосом от Mg2+ по сравнению с прокариотическими (Khatter et al., 2014; Moore and Spremulli, 1985; Shenvi et al., 2005; Sperrazza et al., 1980).

Однако, эукариотическая рибосома намного больше прокариотической и более сложно устроена за счет дополнительных расширяющих сегментов рРНК (rRNA expansion segments, ES), и множества дополнительных рибосомальных белков (Wilson and Cate, 2012). Так, человеческая рибосома по сравнению с бактериальной имеет дополнительные 2650 нуклеотидов рРНК, 26 дополнительных рибосомных белков, а также удлинений общих с бактериями рибосомных белков на 2452 аминокислот (Anger et al., 2013). Эти дополнительные части, не затрагивая консервативные участки, локализуются в основном на сторонах субъединиц, обращенных к раствору (Рис. 3) и формируют переплетенный рРНК-белковый слой поверх консервативного ядра рибосомы (Anger et al., 2013). На малой субъединице, он необходим для гораздо более сложного чем у прокариот механизма инициации трансляции (Рис. 1), а на большой взаимодействует с шаперонами и эукариотическими регуляторами трансляции (Melnikov et al., 2012). Современные структурные данные показывают (Рис. 3), что при переходе от низших эукариот к многоклеточным животным происходит дальнейшее усложнение выростов рРНК, что приводит к формированию в рибосоме двух дополнительных рРНК оболочек - внутренней жесткой, скрепленной третичными РНК-контактами, и внешней рыхлой, образованной спиральными выростами рРНК (Anger et al., 2013).

Наличие РНК вставок в 5S рРНК центрального протуберанца 60S субъединицы приводит к увеличению расстояния между субъединицами в этом месте из-за стерических затруднений между малой субъединицей и дополнительной массой РНК большой (Svidritskiy et al., 2014). Также, рибосомы про- и эукариот отличаются по своим биохимическим свойствам, например, обладают различной чувствительностью ко многим антибиотикам (Budkevich et al., 2008; Garreau de Loubresse et al., 2014).

Рис. 3. Строение эукариотических рибосом. Серым показано общее для эукариот и бактерий ядро рибосомы, синим - дополнительные РНК и белковые элементы низших эукариот, красным и оранжевым - дополнительные РНК и белки рибосом млекопитающих. С изменениями по (Anger et al., 2013).

1.2.Конформационная подвижность рибосомы

В ходе трансляции рибосома претерпевает значительные конформационные изменения, которые необходимы для декодирования кодонов мРНК при инициации, перемещения тРНК-мРНК комплексов при элонгации, для терминации трансляции и рециклинга (Wilson and Cate, 2012). Крупномасштабные конформационные перестройки включают межсубъединичное вращение (Frank and Agrawal, 2000) (Рис. 4Б), изменение положения L1 и L7/12 выростов большой субъединицы (Yamamoto et al., 2014), а также внутридоменные перестройки малой субъединицы (Korostelev et al., 2008a). Сначала у эукариот (Рис. 4Г) (Behrmann et al., 2015; Budkevich et al., 2014; Khatter et al., 2015), а потом и у бактерий (Agirrezabala et al., 2017; J. Zhang et al., 2015) был открыт еще один тип подвижности - поворот (rolling) малой субъединицы относительно её длинной оси.

Среди внутридоменных перестроек малой субъединицы различают сближение её головного и плечевого доменов малой субъединицы (Ogle et al., 2002) (Рис. 4А), а также закручивание головы малой субъединицы (head swivelling) относительно её тела (Ratje et al., 2010) (Рис. 4В).

Рис. 4. Конформационные перестройки малой субъединицы рибосомы. (А) Доменное смыкание при декодировании. (Б) Вращение малой субъединицы отсносительно большой. (В) Вращение головы малой субъединицы. (Г) Поворот малой субъединицы эукариотической рибосомы вокруг длинной оси. С изменениями по (Ogle et al., 2002) (А), (Zhou et al., 2013) (Б), (Yamamoto et al., 2014) (В) и (Budkevich et al., 2014) (Г).

Целостность рибосомы при конформационных изменениях поддерживается благодаря множеству лабильных связей внутри и между субъединицами, так называемым рибосомным мостам (bridges) (Рис. 5), набор которых динамично меняется для каждого типа движения.

А

Рис. 5. Межсубъединичные мосты прокариотической (А) и эукариотической (Б) рибосомы. С изменениями по (Dunkle et al., 2011) и (Ben-Shem et al., 2011).

Рассмотрим подробнее некоторые конформационные перестройки рибосомы. При вращении субъединиц друг относительно друга точкой поворота является мост В3 (Рис. 6А) (Dunkle et al., 2011). Он включает взаимодействие оснований A1418 и A1483 спирали h44 малой субъединицы с малой бороздкой спирали H71 большой. Вблизи оснований A1418 и A1483 находятся G-A пары рРНК, координирующие ион магния, они вносят вклад в ассоциацию субъединиц у всех организмов (Dunkle et al., 2011). Максимальному смещению при повороте субъединиц подвергаются рибосомные мосты, расположенные на периферии относительно оси вращения, например, B1a и B1b (Рис. 6). Эти мосты в основном образованы в результате электростатического взаимодействия заряженных аминокислот, и при изменении положения субъединиц, заряженные остатки находят себе новых партнеров для связывания. Такой тип контакта называется неограниченным и стабилизирует начальное и конечное состояния вращения, но дестабилизирует промежуточное, за счет взаимного отталкивания одноименных зарядов (Рис. 6А-В). Мутации в белках S13 и L5, составляющих мост B1b, или делеция S13 приводят к увеличению скорости транслокации и к уменьшению её точности. Тот же эффект дают

мутации в спирали H38, входящей в мост B1a, что подчеркивает важность данных рибосомных мостов для регуляции вращения рибосомных субъединиц (Cukras and Green, 2005; Frank et al., 2007). Другие периферические мосты, такие как B4, сохраняют партнеров по контакту на большой и малой субъединице и вносят вклад в стабильность ассоциации рибосомных субъединиц при их повороте (Bock et al., 2015; Dunkle et al., 2011). Такой тип контакта называется ограниченным (Рис. 6. А, Б, Г). В мосте B4 постоянный контакт поддерживается за счет изменения конформации спирали H38, которая следует за своим партнером по связи, белком S15, в ходе вращения рибосомных субъединиц (Рис. 6Г).

Рис. 6. Типы межсубъединичных контактов рибосомы. (А) Схема, показывающая ограниченные и неограниченные контакты. (Б) Карта рибосомных контактов по степени ограниченности. (В) Неограниченный контакт на примере рибосомного моста B1b. (Г) ограниченный контакт на примере моста B4. С изменениями по (Bock et al., 2015).

Мост B2a, образованный спиралью H69 большой субъединицы и h44 малой, вносит значительный вклад в ассоциацию рибосомных субъединиц, а также играет важную роль при декодировании кодонов мРНК, инициации трансляции и рециклинге рибосомных комплексов (Bock et al., 2015; Dunkle et al., 2011). В обычном и закрученном состоянии рибосомы, основание A1913 спирали H69 погружено в малую бороздку спирали h44, однако при вращении субъедииц вершина h44 смещается, что приводит к деформации и сжатию этой спирали (Рис. 7А). Антибиотики туберактиномицинового ряда, такие как виомицин и капреомицин, а также аминогликозиды, такие как неомицин и паромомицин, связываются вблизи моста B2a (Borovinskaya et al., 2007; Feldman et al., 2010; Stanley et al., 2010) и модулируют как силу связывания тРНК в А-сайте, так и способность рибосомы претерпевать межсубъединичное вращение.

Рис. 7. Структурные изменения важных частей большой рРНК при межсубъединичном повороте. (А) Сжатие спирали Н69. (Б) Сдвиг спирали Н68 к тРНК в Р-сайте. С изменениями по (Dunkle et al., 2011).

Структурные изменения при вращении рибосомных субъединиц также затрагивают спираль H68 большой субъединицы. При повороте малой субъединицы, эта спираль открепляется от основания A702, которое образует стекинг взаимодействие с А-А площадкой недалеко от вершины Н68, и движется в направлении акцепторного стебля тРНК, где взаимодействует с его малой бороздкой. Считается, что этот контакт стабилизирует Р/Е-состояние тРНК (Рис. 7Б) (Dunkle et al., 2011).

Поворот головы малой субъединицы происходит вокруг спирали h28 малой рибосомной РНК и связан с перестройкой рибосомных мостов B1a и B1b, в частности, взаимодействиями белков S13, L5 и спирали H38 (Dunkle et al., 2011).

Эукариотическая рибосома обладает дополнительными связями между субъединицами, в основном образованными между специфическими для эукариот

рибосомными белками и выростами рРНК на периферии субъединиц (например, мосты eB12, eB13, Рис. 5Б). Поразительным исключением является мост eB14, образованный белком L41e, который погружается в специальный карман 18S рРНК. Этот мост находится недалеко от точки межсубъединичного вращения рибосомы. Примечательно, что аналогичный карман в рРНК малой субъединицы есть и у прокариот, однако в нем не связывается никакой белок (Ben-Shem et al., 2011; Wilson and Cate, 2012).

Конформационные перестройки эукариотической рибосомы имеют свои особенности. Прежде всего, из-за дополнителной массы в районе центрального протуберанца большой субъединицы, малая субъединица отклоняется от большой, что приводит к изменению наклона оси межсубъединичного вращения и изменению положения спирали H69 по сравнению с прокариотической рибосомой (Svidritskiy et al., 2014) (Рис. 8А, Б). Большому смещению при повороте подвержены периферические мосты eB12 и eB13, образованные сегментом расширения es6E и белками eL19 и eL24, соответственно, однако они сохраняют места своих контактов за счет подвижных линкеров в белковых партнерах малой субъединицы (Behrmann et al., 2015). Центральный мост eB14 сохраняет свое положение при вращении субъединиц, и, вероятно, укрепляет точку поворота двух субъединиц (Behrmann et al., 2015).

Рис. 8. Структурные отличия эукариотической и прокариотической рибосом. (А) Малая субъединица рибосомы эукариот наклонена относительно большой (серым показано положение малой субъединицы в прокариотической рибосоме). (Б) Смещение в положениях спирали Н69 и Р/Е-тРНК по сравнению с прокариотическими (показано серым) (В) Ось межсубъединичного вращения отличается у про- и эукариот. По (Svidritskiy et al., 2014).

Следует отметить, что как в случае прокариотической, так и в случае эукариотической рибосомы, помимо рибосомных мостов, важную роль в ассоциации рибосомных субъединиц играет пептидил-тРНК, связанная в Р-сайте (Bock et al., 2015).

Для прокариотической рибосомы, наличие такой тРНК может компенсировать делеционные мутанты спирали Н69 и разрушение одного из главных межсубъединичных контактов - моста B2a (Ali et al., 2006). Для эукариотичесой рибосомы была показана стабилизаци спирали Н69 в присуствии тРНК в Р-сайте, что, предположительно, укрепляет контакт рибосомных субъединиц в ходе инициации трансляции (Khatter et al., 2015).

В настоящее время накопилось множество данных, показывающих, что помимо крупных межсубъединичных и междоменных смещений, сама внутренняя структура рибосомы динамична и подвержена аллостерической регуляции (Makarova and Bogdanov, 2017). Так, единственная делеция остатка Ser145 в белке L3 рибосомы Staphylococcus aureus обеспечивает устойчивость к антибиотику линезолиду, участок связывания которого отдален от точки мутации более чем на 20А (Petrov et al., 2004). Сокращение одной из петель белка ведет к смещению спирали H90 большой рРНК от пептидил-трансферазного центра, что приводит к перестройке площадки связывания антибиотика. В рибосоме дрожжей, мутации белка eL3, увеличивающие сродство тРНК к A- и P-сайтам, увеличивают химическую доступность оснований спирали H89 на расстоянии более 100 A(Belousoff et al., 2017).

1.3. Конформационная подвижность рибосомы в ходе элонгации

трансляции.

Самым ярким примером взаимосвязи структуры и подвижности рибосомы с её функциями является стадия элонгации трансляции. Движение рибосомы вдоль мРНК в ходе удлинения полипептидной цепи - элонгации (Рис. 1), осуществляется посредством перемещения тРНК-мРНК комплексов внутри неё (Lin et al., 2015). Эта функция возможна благодаря двусубъединичному строению рибосомы и наличию у неё трех тРНК-связывающих участков, локализованных в интерфейсе субъединиц. Последовательное связывание концов тРНК с сайтами большой и малой субчастиц приводит к направленному продвижению рибосомы вдоль мРНК. В ходе этого процесса возникают так называемые гибридные состояния тРНК, при которых антикодоновый и акцепторный концы тРНК связаны с различными сайтами большой и малой субъединиц (Yamamoto et al., 2014).

Элонгация подразделяется на стадии декодирования, транспептидации и транслокации. Рибосома, готовая к декодированию очередного триплета мРНК, имеет вакантный А-сайт, Р-сайт, в котором находится пептидил-тРНК с прикрепленным

растущим белком, и Е-сайт, в котором находится деацилированная тРНК (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) (Рис. 9А). Рибосома в таком состоянии называется посттранслокационной (ПОСТ). В терминах положения антикодоновых и акцепторных концов относительно сайтов на малой и большой субъединице соответственно, тРНК в такой рибосоме имеют конформации А/А:Р/Р (для пептидил- и деацилированной тРНК, соотвественно).

В начале очередного цикла элонгации в вакантный А-сайт поступает аминоацил-тРНК. В декодирующем центре А-сайта располагаются особые консервативные основания рРНК малой субъединицы - это нуклеотиды A1492, A1493 и G530 (нумерация Escherichia coli). Эти основания способны внедряться (посредством А-минорных взаимодействий и связывания рибозофосфатного остова) в большой желобок РНК-дуплекса, образованного кодоном мРНК и антикодоном тРНК в случае их правильного спаривания, чего не происходит в случает связывания некомплиментарной тРНК (Рис. 9). Взаимодействие оснований рРНК с кодон-антикодоновым дуплексом обеспечивает более высокую начальную точность выбора тРНК, чем получаемую от разницы в количестве спаренных нуклеотидов (Ogle et al., 2001; Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Связывание комплиментарной тРНК приводит к закрытому состоянию декодирующего центра, характеризующемуся сближением головы малой субъединицы (а именно, её так называемого «клюва») и её тела (домена, называемого «плечом» малой субчастицы) (Рис. 4А). Считается, что такое «доменное смыкание» стабилизирует правильную кодон-антикодоновую пару в А-сайте (по сравнении с неправильной, геометрию которых нуклеотиды декодирующего центра не способны распознать) (Loveland et al., 2017; Schmeing and Ramakrishnan, 2009).

Также, в ходе декодирования с участием эукариотических рибосом, поворот малой субъединицы вдоль длинной оси (Budkevich et al., 2014), приводит к сужению межсубъединичного расстояния со стороны А-сайта и его увеличению со стороны Е-сайта (Рис. 4Г). У прокариот аналогичное конформационное изменение было обнаружено в рибосомах, остановленных SecM-пептидом (J. Zhang et al., 2015), а также в рибосомах, готовящихся к пропуску 50 нуклеотидов мРНК в гене 60 фага T4 (Agirrezabala et al., 2017). Однако связь поворота малой субъединицы с декодингом у прокариот пока не определена.

Рис. 9. Декодирование тРНК в А-сайте рибосомы. (А) Схема процесса. (Б) Распознавание кодона в А-сайте вызывает выпячивание нуклеотидов A1492-1493 из спирали h44 малой рРНК, которые мониторят геометрию кодон-антикодонового дуплекса (В). С изменениями по (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) (Б, В).

Таким образом, антикодоновый конец тРНК оказывается в А-сайте малой субъединицы. В это время акцепторный ССА-конец тРНК поступает в А-сайт большой субъединицы в ходе процесса, называемого аккомодацией тРНК. По завершении аккомодации ССА-конец тРНК закрепляется в пептидил-трансферазном центре (ПТЦ) рибосомы рядом с ССА-концом пептидил-тРНК из Р-сайта. ПТЦ образован консервативными участками рРНК и рибосомных белков. При участии оснований ПТЦ происходит реакция транспептидации, при этом пептидильный остаток переносится на аминоацильный, связанный с тРНК в А-сайте (Рис. 10А) (Schmeing and Ramakrishnan, 2009).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сусоров Денис Сергеевич, 2018 год

Список цитируемой литературы

Steitz TA, Moore PB. Perspectives on the ribosome. Philos Trans R Soc London B Biol Sci

2017;372.

Lin J, Gagnon MG, Bulkley D, Steitz TA. Conformational changes of elongation factor g on the ribosome during tRNA translocation. Cell 2015;160:219-27. doi:10.1016/j.cell.2014.11.049.

BRETSCHER MS. Translocation in Protein Synthesis: A Hybrid Structure Model. Nature 1968;218:675-7. doi:10.1038/218675a0.

Spirin AS. [On the mechanism of ribosome function. The hypothesis of locking-unlocking of subparticles]. Dokl Akad Nauk SSSR 1968;179:1467-70.

Agrawal RK, Heagle a B, Penczek P, Grassucci R a, Frank J. EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. Nat Struct Biol 1999;6:643-7. doi:10.1038/10695. Korostelev A, Noller HF. Analysis of Structural Dynamics in the Ribosome by TLS Crystallographic Refinement. J Mol Biol 2007;373:1058-70. doi:10.1016/j.jmb.2007.08.054. Ratje AH, Loerke J, Mikolajka A, Brünner M, Hildebrand PW, Starosta AL, et al. Head swivel on the ribosome facilitates translocation by means of intra-subunit tRNA hybrid sites. Nature 2010;468:713-6. doi:10.1038/nature09547.

Horan LH, Noller HF. Intersubunit movement is required for ribosomal translocation. Proc Natl Acad Sci 2007;104:4881-5. doi:10.1073/pnas.0700762104. Ramakrishnan V. The ribosome emerges from a black box. Cell 2014;159:979-84. doi:10.1016/j.cell.2014.10.052.

Brown A, Shao S, Murray J, Hegde RS, Ramakrishnan V. Structural basis for stop codon

recognition in eukaryotes. Nature 2015;524:493-6. doi:10.1038/nature14896.

Melnikov S, Ben-Shem A, Garreau de Loubresse N, Jenner L, Yusupova G, Yusupov M. One

core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat Struct Mol Biol 2012;19:560-7.

doi:10.1038/nsmb.2313.

Ban N, Nissen P, Hansen J, Moore PB, Steitz TA. The Complete Atomic Structure of the Large Ribosomal Subunit at 2.4 A Resolution. Science (80- ) 2000;289:905-20. doi:10.1126/science.289.5481.905.

Wimberly BT, Brodersen DE, Clemons WM, Morgan-Warren RJ, Carter AP, Vonrhein C, et al. Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 2000;407:327-39. doi:10.1038/35030006. Yusupov MM, Yusupova GZ, Baucom a, Lieberman K, Earnest TN, Cate JH, et al. Crystal

structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 2001;292:883-96. doi:10.1126/science.1060089.

Wilson DN, Cate JHD. The structure and function of the eukaryotic ribosome. Cold Spring Harb Perspect Biol 2012;4:5. doi:10.1101/cshperspect.a011536.

Schmeing TM, Ramakrishnan V. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 2009;461:1234-42. doi:10.1038/nature08403. Yamamoto H, Qin Y, Achenbach J, Li C, Kijek J, Spahn CMT, et al. EF-G and EF4: translocation and back-translocation on the bacterial ribosome. Nat Rev Microbiol 2014;12:89-100. doi:10.1038/nrmicro3176.

Voorhees RM, Ramakrishnan V. Structural basis of the translational elongation cycle. TL - 82. Annu Rev Biochem 2013;82 VN-r:203-36. doi:10.1146/annurev-biochem-113009-092313. Ben-Shem A, Jenner L, Yusupova G, Yusupov M. Crystal structure of the eukaryotic ribosome. Science 2010;330:1203-9. doi:10.1126/science.1194294.

Khatter H, Myasnikov AG, Natchiar SK, Klaholz BP. Structure of the human 80S ribosome. Nature 2015;520:640-5. doi:10.1038/nature14427.

Khatter H, Myasnikov AG, Mastio L, Billas IML, Birck C, Stella S, et al. Purification, characterization and crystallization of the human 80S ribosome. Nucleic Acids Res 2014;42. doi:10.1093/nar/gkt1404.

Moore MN, Spremulli LL. Effects of cations and cosolvents on eukaryotic ribosomal subunit

conformation. Biochemistry 1985;24:191-6. doi:10.1021/bi00322a027.

Shenvi CL, Dong KC, Friedman EM, Hanson JA, Cate JHD. Accessibility of 18S rRNA in

human 40S subunits and 80S ribosomes at physiological magnesium ion concentrations-

implications for the study of ribosome dynamics. RNA 2005;11:1898-908.

doi:10.1261/rna.2192805.

Sperrazza J, Russell D, Spremulli L. Reversible dissociation of wheat germ ribosomal subunits: cation-dependent equilibriums and {...}. Biochemistry 1980;19:1053-8. doi:10.1021/bi00547a001.

Anger AM, Armache JP, Berninghausen O, Habeck M, Subklewe M, Wilson DN, et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature 2013;497:80-5. doi:10.1038/nature12104.

Svidritskiy E, Brilot AF, Koh CS, Grigorieff N, Korostelev AA. Structures of yeast 80S ribosome-tRNA complexes in the rotated and nonrotated conformations. Structure 2014;22:1210-8. doi:10.1016/j.str.2014.06.003.

Budkevich T V., El'skaya A V., Nierhaus KH. Features of 80S mammalian ribosome and its subunits. Nucleic Acids Res 2008;36:4736-44. doi:10.1093/nar/gkn424. Garreau de Loubresse N, Prokhorova I, Holtkamp W, Rodnina M V, Yusupova G, Yusupov M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature 2014;513:517-22. doi:nature13737 [pii]\r10.1038/nature13737 [doi].

Frank J, Agrawal RK. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature 2000;406:318-22. doi:10.1038/35018597.

Korostelev A, Ermolenko DN, Noller HF. Structural dynamics of the ribosome. Curr Opin

Chem Biol 2008a; 12:674-83. doi:10.1016/j.cbpa.2008.08.037.

Behrmann E, Loerke J, Budkevich T V., Yamamoto K, Schmidt A, Penczek PA, et al.

Structural snapshots of actively translating human ribosomes. Cell 2015;161:845-57.

doi:10.1016/j.cell.2015.03.052.

Budkevich T V., Giesebrecht J, Behrmann E, Loerke J, Ramrath DJF, Mielke T, et al. Regulation of the mammalian elongation cycle by subunit rolling: A eukaryotic-specific ribosome rearrangement. Cell 2014;158:121-31. doi:10.1016/j.cell.2014.04.044. Agirrezabala X, Samatova E, Klimova M, Zamora M, Gil-Carton D, Rodnina M V., et al. Ribosome rearrangements at the onset of translational bypassing. Sci Adv 2017;3:e1700147. doi:10.1126/sciadv.1700147.

Zhang J, Pan X, Yan K, Sun S, Gao N, Sui SF. Mechanisms of ribosome stalling by SecM at multiple elongation steps. Elife 2015;4. doi:10.7554/eLife.09684.

Ogle JM, Murphy IV F V., Tarry MJ, Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell 2002;111:721-32. doi:10.1016/S0092-8674(02)01086-3.

Zhou J, Lancaster L, Donohue JP, Noller HF. Crystal structures of EF-G-ribosome complexes trapped in intermediate states of translocation. Science 2013;340:1236086-1. doi:10.1126/science.1236086.

Dunkle JA, Wang L, Feldman MB, Pulk A, Chen VB, Kapral GJ, et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Sci (New York, NY) 2011;332:981-4. doi:10.1126/science.1202692.

Ben-Shem A, Garreau de Loubresse N, Melnikov S, Jenner L, Yusupova G, Yusupov M. SOM: The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Ä resolution. Science 2011;334:1524-9. doi:10.1126/science.1212642.

Cukras AR, Green R. Multiple Effects of S13 in Modulating the Strength of Intersubunit

Interactions in the Ribosome During Translation. J Mol Biol 2005;349:47-59. doi:10.1016/j.jmb.2005.03.075.

Frank J, Gao H, Sengupta J, Gao N, Taylor DJ. The process of mRNA-tRNA translocation. Proc Natl Acad Sci 2007;104:19671-8. doi:10.1073/pnas.0708517104. Bock L V., Blau C, Vaiana AC, Grubmüller H. Dynamic contact network between ribosomal subunits enables rapid large-scale rotation during spontaneous translocation. Nucleic Acids Res 2015;43:6747-60. doi:10.1093/nar/gkv649.

Borovinskaya MA, Pai RD, Zhang W, Schuwirth BS, Holton JM, Hirokawa G, et al. Structural basis for aminoglycoside inhibition of bacterial ribosome recycling. Nat Struct Mol Biol 2007;14:727-32. doi:10.1038/nsmb1271.

Feldman MB, Terry DS, Altman RB, Blanchard SC. Aminoglycoside activity observed on single pre-translocation ribosome complexes. Nat Chem Biol 2010;6:54-62. doi:10.1038/nchembio.274.

Stanley RE, Blaha G, Grodzicki RL, Strickler MD, Steitz TA. The structures of the antituberculosis antibiotics viomycin and capreomycin bound to the 70S ribosome. Nat Struct Mol Biol 2010;17:289-93. doi:10.1038/nsmb.1755.

Ali IK, Lancaster L, Feinberg J, Joseph S, Noller HF. Deletion of a Conserved, Central Ribosomal Intersubunit RNA Bridge. Mol Cell 2006;23:865-74. doi:10.1016/j.molcel.2006.08.011.

Makarova TM, Bogdanov AA. The ribosome as an allosterically regulated molecular machine. Biochem 2017;82:1557-71. doi:10.1134/S0006297917130016.

Petrov A, Meskauskas A, Dinman JJD. Ribosomal protein L3: influence on ribosome structure and function. RNA Biol 2004;22:629. doi:10.1016/j.bbi.2008.05.010. Belousoff MJ, Eyal Z, Radjainia M, Ahmed T, Bamert RS, Matzov D, et al. Structural Basis for Linezolid Binding Site Rearrangement in the Staphylococcus aureus Ribosome. MBio 2017;8:e00395-17. doi: 10.1128/mBio.00395-17.

Ogle JM, Brodersen DE, Clemons WM, Tarry MJ, Carter AP, Ramakrishnan V. Recognition of Cognate Transfer RNA by the 30S Ribosomal Subunit. Science (80- ) 2001;292:897-902. doi:10.1126/science.1060612.

Loveland AB, Demo G, Grigorieff N, Korostelev AA. Ensemble cryo-EM elucidates the mechanism of translation fidelity. Nature 2017;546:113-7. doi:10.1038/nature22397. Agirrezabala X, Liao HY, Schreiner E, Fu J, Ortiz-Meoz RF, Schulten K, et al. Structural characterization of mRNA-tRNA translocation intermediates. Proc Natl Acad Sci

2012;109:6094-9. doi: 10.1073/pnas.1201288109.

Budkevich T, Giesebrecht J, Altman RB, Munro JB, Mielke T, Nierhaus KH, et al. Structure and dynamics of the mammalian ribosomal pretranslocation complex. Mol Cell 2011;44:214-24. doi:10.1016/j.molcel.2011.07.040.

Semenkov YP, Rodnina M V, Wintermeyer W. The "allosteric three-site model" of elongation cannot be confirmed in a well-defined ribosome system from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:12183-8. doi:10.1073/pnas.93.22.12183.

Chen C, Stevens B, Kaur J, Smilansky Z, Cooperman BS, Goldman YE. Allosteric vs. spontaneous exit-site (E-site) tRNA dissociation early in protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:16980-5. doi:10.1073/pnas.1106999108.

Wilson DN, Nierhaus KH. The E-site story: The importance of maintaining two tRNAs on the ribosome during protein synthesis. Cell Mol Life Sci 2006;63:2725-37. doi:10.1007/s00018-006-6125-4.

Andersen CBF, Becker T, Blau M, Anand M, Halic M, Balar B, et al. Structure of eEF3 and the mechanism of transfer RNA release from the E-site. Nature 2006;443:663-8. doi:10.1038/nature05126.

Fischer N, Konevega AL, Wintermeyer W, Rodnina M V, Stark H. Ribosome dynamics and tRNA movement by time-resolved electron cryomicroscopy. Nature 2010;466:329-33. doi:10.1038/nature09206.

Schuwirth BS. Structures of the Bacterial Ribosome at 3.5 A Resolution. Science (80- ) 2005;310:827-34. doi: 10.1126/science.1117230.

Taylor DJ, Nilsson J, Merrill a R, Andersen GR, Nissen P, Frank J. Structures of modified eEF2 80S ribosome complexes reveal the role of GTP hydrolysis in translocation. EMBO J 2007;26:2421-31. doi:10.1038/sj.emboj.7601677.

Ramrath DJF, Lancaster L, Sprink T, Mielke T, Loerke J, Noller HF, et al. Visualization of

two transfer RNAs trapped in transit during elongation factor G-mediated translocation. Proc

Natl Acad Sci U S A 2013;110:20964-9. doi:10.1073/pnas.1320387110.

Mohan S, Donohue JP, Noller HF. Molecular mechanics of 30S subunit head rotation. Proc

Natl Acad Sci U S A 2014;111:13325-30. doi:10.1073/pnas.1413731111.

Gavrilova LP, Kostiashkina OE, Koteliansky VE, Rutkevitch NM, Spirin AS. Factor-free

("Non-enzymic") and factor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by

Escherichia coli ribosomes. J Mol Biol 1976;101:537-52. doi:10.1016/0022-2836(76)90243-6.

Atkinson GC. The evolutionary and functional diversity of classical and lesser-known

cytoplasmic and organellar translational GTPases across the tree of life. BMC Genomics 2015;16:78. doi:10.1186/s12864-015-1289-7.

Voorhees RM, Schmeing TM, Kelley AC, Ramakrishnan V. The mechanism for activation of GTP hydrolysis on the ribosome. Science 2010;330:835-8. doi:10.1126/science.1194460. Andersen GR, Nissen P, Nyborg J. Elongation factors in protein biosynthesis. Trends Biochem Sci 2003;28:434-41. doi:10.1016/S0968-0004(03)00162-2.

Kjeldgaard M, Nissen P, Thirup S, Nyborg J. The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure 1993;1:35-50. doi:10.1016/0969-2126(93)90007-4.

Maracci C, Peske F, Dannies E, Pohl C, Rodnina M V. Ribosome-induced tuning of GTP hydrolysis by a translational GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A 2014;111:14418-23. doi:10.1073/pnas. 1412676111.

Gromadski KB, Schümmer T, Stramgaard A, Knudsen CR, Kinzy TG, Rodnina M V. Kinetics of the interactions between yeast elongation factors 1A and 1Ba, guanine nucleotides, and aminoacyl-tRNA. J Biol Chem 2007;282:35629-37. doi:10.1074/jbc.M707245200. Chen Y, Feng S, Kumar V, Ero R, Gao Y-G. Structure of EF-G-ribosome complex in a pretranslocation state. Nat Struct Mol Biol 2013;20:1077-84. doi:10.1038/nsmb.2645. Li W, Liu Z, Koripella RK, Langlois R, Sanyal S, Frank J. Activation of GTP hydrolysis in mRNA-tRNA translocation by elongation factor G. Sci Adv 2015;1:e1500169. doi:10.1126/sciadv.1500169.

Pulk A, Cate JHD. Control of ribosomal subunit rotation by elongation factor G. Science 2013;340:1235970. doi:10.1126/science.1235970.

AEvarsson A, Brazhnikov E, Garber M, Zheltonosova J, Chirgadze Y, Al-Karadaghi S, et al. Three-dimensional structure of the ribosomal translocase: elongation factor G from Thermus thermophilus. EMBO J 1994;13:3669-77.

Brilot AF, Korostelev A a, Ermolenko DN, Grigorieff N. Structure of the ribosome with elongation factor G trapped in the pretranslocation state. Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110:20994-9. doi:10.1073/pnas.1311423110.

Czworkowski J, Wang J, Steitz TA, Moore PB. The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7 A resolution. EMBO J 1994;13:3661-8. doi:10.1016. Tourigny DS, Fernández IS, Kelley AC, Ramakrishnan V. Elongation factor G bound to the ribosome in an intermediate state of translocation. Science 2013;340:1235490. doi:10.1126/science.1235490.

Peske F, Matassova NB, Savelsbergh a, Rodnina M V, Wintermeyer W. Conformationally restricted elongation factor G retains GTPase activity but is inactive in translocation on the ribosome. Mol Cell 2000;6:501-5. doi:10.1016/S1097-2765(00)00049-6. Liu G, Song G, Zhang D, Zhang D, Li Z, Lyu Z, et al. EF-G catalyzes tRNA translocation by disrupting interactions between decoding center and codon-anticodon duplex. Nat Struct Mol Biol 2014;21:1-10. doi:10.1038/nsmb.2869.

Abeyrathne PD, Koh CS, Grant T, Grigorieff N, Korostelev AA. Ensemble cryo-EM uncovers inchworm-like translocation of a viral IRES through the ribosome. Elife 2016;5. doi:10.7554/eLife.14874.

Zhou J, Lancaster L, Donohue JP, Noller HF. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science 2014;345:1188-91. doi:10.1126/science.1255030.

Savelsbergh a, Matassova NB, Rodnina M V, Wintermeyer W. Role of domains 4 and 5 in elongation factor G functions on the ribosome. J Mol Biol 2000;300:951-61. doi:10.1006/jmbi.2000.3886.

Su X, Lin Z, Lin H. The biosynthesis and biological function of diphthamide. Crit Rev

Biochem Mol Biol 2013;48:515-21. doi:10.3109/10409238.2013.831023.

Morimoto H, Bonavida B. Diphtheria toxin- and Pseudomonas A toxin-mediated apoptosis.

ADP ribosylation of elongation factor-2 is required for DNA fragmentation and cell lysis and

synergy with tumor necrosis factor-alpha. J Immunol 1992;149:2089-94.

J0rgensen R, Purdy AE, Fieldhouse RJ, Kimber MS, Bartlett DH, Merrill AR. Cholix toxin, a

novel ADP-ribosylating factor from Vibrio cholerae. J Biol Chem 2008;283:10671-8.

doi:10.1074/jbc.M710008200.

Mateyak MK, Kinzy TG. ADP-ribosylation of translation elongation factor 2 by diphtheria toxin in yeast inhibits translation and cell separation. J Biol Chem 2013;288:24647-55. doi:10.1074/jbc.M113.488783.

Davydova EK, Ovchinnikov LP. ADP-ribosylated elongation factor 2 (ADP-ribosyl-EF-2) is unable to promote translocation within the ribosome. FEBS Lett 1990;261:350-2. doi:10.1016/0014-5793(90)80589-B.

Zhang D, Yan K, Liu G, Song G, Luo J, Shi Y, et al. EF4 disengages the peptidyl-tRNA CCA end and facilitates back-translocation on the 70S ribosome. Nat Struct Mol Biol 2016;23:125-31. doi:10.1038/nsmb.3160.

Shoji S, Walker SE, Fredrick K. Reverse Translocation of tRNA in the Ribosome. Mol Cell

2006;24:931-42. doi:10.1016/j.molcel.2006.11.025.

Konevega AL, Fischer N, Semenkov YP, Stark H, Wintermeyer W, Rodnina M V. Spontaneous reverse movement of mRNA-bound tRNA through the ribosome. Nat Struct Mol Biol 2007;14:318-24. doi:10.1038/nsmb1221.

Liu H, Pan D, Pech M, Cooperman BS. Interrupted catalysis: The EF4 (LepA) effect on back-

translocation. J Mol Biol 2010;396:1043-52. doi:10.1016/j.jmb.2009.12.043.

Evans RN, Blaha G, Bailey S, Steitz TA. The structure of LepA, the ribosomal back

translocase. Proc Natl Acad Sci 2008;105:4673-8. doi:10.1073/pnas.0801308105.

Gagnon MG, Lin J, Steitz TA. Elongation factor 4 remodels the A-site tRNA on the ribosome.

Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113:4994-9. doi:10.1073/pnas. 1522932113.

Gagnon MG, Lin J, Bulkley D, Steitz TA. Crystal structure of elongation factor 4 bound to a

clockwise ratcheted ribosome. Sci (New York, NY) 2014;345:684-7.

doi:10.1126/science.1253525.

Margus T, Remm M, Tenson T. Phylogenetic distribution of translational GTPases in bacteria. BMC Genomics 2007;8:15. doi:10.1186/1471-2164-8-15.

Heller JLE, Kamalampeta R, Wieden H-J. Taking a step back from back-translocation: An integrative view of LepA/EF4's cellular function. Mol Cell Biol 2017:MCB.00653-16. doi:10.1128/MCB.00653-16.

Liu H, Chen C, Zhang H, Kaur J, Goldman YE, Cooperman BS. The conserved protein EF4 (LepA) modulates the elongation cycle of protein synthesis. Proc Natl Acad Sci 2011;108:16223-8. doi:10.1073/pnas.1103820108.

Balakrishnan R, Oman K, Shoji S, Bundschuh R, Fredrick K. The conserved GTPase LepA contributes mainly to translation initiation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 2014;42:13370-83. doi:10.1093/nar/gku1098.

Gibbs MR, Moon K-M, Chen M, Balakrishnan R, Foster LJ, Fredrick K. Conserved GTPase

LepA (Elongation Factor 4) functions in biogenesis of the 30S subunit of the 70S ribosome.

Proc Natl Acad Sci 2017;114:980-5. doi: 10.1073/pnas.1613665114.

Pech M, Karim Z, Yamamoto H, Kitakawa M, Qin Y, Nierhaus KH. Elongation factor 4

(EF4/LepA) accelerates protein synthesis at increased Mg2+ concentrations. Proc Natl Acad

Sci U S A 2011;108:3199-203. doi:10.1073/pnas.1012994108.

Bijlsma JJ, Lie-A-Ling M, Nootenboom IC, Vandenbroucke-Grauls CM, Kusters JG.

Identification of loci essential for the growth of Helicobacter pylori under acidic conditions. J

Infect Dis 2000;182:1566-9. doi: 10.1086/315855.

Caron F, Meyer E. Does Paramecium primaurelia use a different genetic code in its macronucleus? Nature 1985;314:185-188. doi:10.1038/314185a0.

MEYER F, SCHMIDT HJ, PLUMPER E, HASILIK A, MERSMANN G, MEYER HE, et al. UGA IS TRANSLATED AS CYSTEINE IN PHEROMONE-3 OF EUPLOTES-OCTOCARINATUS. Proc Natl Acad Sci U S A 1991;88:3758-61. doi:10.1073/pnas.88.9.3758.

Preer Jr. JR, Preer LB, Rudman BM, Barnett AJ. Deviation from the universal code shown by the gene for surface protein 51A in Paramecium. Nature 1985;314:188-90. doi:10.1038/314188a0.

Kisselev L, Ehrenberg M, Frolova L. Termination of translation: Interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J 2003;22:175-82. doi:10.1093/emboj/cdg017. Nakamura Y, Ito K. Making sense of mimic in translation termination. Trends Biochem Sci 2003;28:99-105. doi:10.1016/S0968-0004(03)00006-9.

Kisselev LL. Class-1 translation termination factors are functional analogs of aminoacyl-tRNAs. Mol Biol 2003;37:791-802. doi: 10.1023/B:MBIL.0000008346.19430.11. Frolova LY, Tsivkovskii RY, Sivolobova GF, Oparina NY, Serpinsky OI, Blinov VM, et al. Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide release factors abolish ability of human eRF1 to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis. RNA 1999;5:1014-20. doi:10.1017/S135583829999043X.

Laurberg M, Asahara H, Korostelev A, Zhu J, Trakhanov S, Noller HF. Structural basis for translation termination on the 70S ribosome. Nature 2008;454:852-7. doi:10.1038/nature07115.

Petry S, Brodersen DE, Murphy IV F V., Dunham CM, Selmer M, Tarry MJ, et al. Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 2005;123:1255-66. doi:10.1016/j.cell.2005.09.039.

Song H, Mugnier P, Das AK, Webb HM, Evans DR, Tuite MF, et al. The Crystal Structure of Human Eukaryotic Release Factor eRF1—Mechanism of Stop Codon Recognition and Peptidyl-tRNA Hydrolysis. Cell 2000;100:311-21. doi:10.1016/S0092-8674(00)80667-4. Mora L, Zavialov A, Ehrenberg M, Buckingham RH. Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RF1 and RF2 from Escherichia coli. Mol Microbiol 2003;50:1467-76. doi:10.1046/j.1365-2958.2003.03799.x. Seit-Nebi A, Frolova L, Justesen J, Kisselev L. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for

stop codon recognition. Nucleic Acids Res 2001;29:3982-7.

Shaw JJ, Green R. Two Distinct Components of Release Factor Function Uncovered by Nucleophile Partitioning Analysis. Mol Cell 2007;28:458-67. doi:10.1016/j.molcel.2007.09.007.

Zavialov A V., Mora L, Buckingham RH, Ehrenberg M. Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell 2002;10:789-98. doi:10.1016/S1097-2765(02)00691-3.

Zhou J, Korostelev A, Lancaster L, Noller HF. Crystal structures of 70S ribosomes bound to release factors RF1, RF2 and RF3. Curr Opin Struct Biol 2012;22:733-42. doi:10.1016/j.sbi.2012.08.004.

Korostelev A, Asahara H, Lancaster L, Laurberg M, Hirschi A, Zhu J, et al. Crystal structure of a translation termination complex formed with release factor RF2. Proc Natl Acad Sci U S A 2008b;105:19684-9. doi:10.1073/pnas.0810953105.

Zhou J, Lancaster L, Trakhanov S, Noller HF. Crystal structure of release factor RF3 trapped in the GTP state on a rotated conformation of the ribosome. Rna 2012;18:230-40. doi:10.1261/rna.031187.111.

Klaholz BP, Pape T, Zavialov A V, Myasnikov AG, Orlova E V, Vestergaard B, et al. Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 2003;421:90-4. doi:10.1038/nature01225.

Korostelev A, Zhu J, Asahara H, Noller HF. Recognition of the amber UAG stop codon by release factor RF1. EMBO J 2010;29:2577-85. doi:10.1038/emboj.2010.139. Weixlbaumer A, Jin H, Neubauer C, Voorhees RM, Petry S, Kelley AC, et al. Insights into Translational Termination from the Structure of RF2 Bound to the Ribosome. Science (80- ) 2008;322:953-6. doi:10.1126/science.1164840.

Freistroffer D V., Pavlov MY, MacDougall J, Buckingham RH, Ehrenberg M. Release factor RF3 in E. coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J 1997;16:4126-33. doi:10.1093/emboj/16.13.4126. Grentzmann G, Kelly PJ, Laalami S, Shuda M, Firpo MA, Cenatiempo Y, et al. Release factor RF-3 GTPase activity acts in disassembly of the ribosome termination complex. RNA 1998;4:973-83. doi:10.1017/S1355838298971576.

Jin H, Kelley AC, Ramakrishnan V. Crystal structure of the hybrid state of ribosome in complex with the guanosine triphosphatase release factor 3. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:15798-803. doi:10.1073/pnas. 1112185108.

Weixlbaumer A, Petry S, Dunham CM, Selmer M, Kelley AC, Ramakrishnan V. Crystal structure of the ribosome recycling factor bound to the ribosome. Nat Struct Mol Biol 2007;14:733-7. doi:10.1038/nsmb1282.

Zhang D, Yan K, Zhang Y, Liu G, Cao X, Song G, et al. New insights into the enzymatic role of EF-G in ribosome recycling. Nucleic Acids Res 2015;43:10525-33. doi:10.1093/nar/gkv995.

Seit-Nebi A, Frolova L, Kisselev L. Conversion of omnipotent translation termination factor eRF1 into ciliate-like UGA-only unipotent eRF1. EMBO Rep 2002;3:881-6. doi:10.1093/embo-reports/kvf178.

Kononenko A V., Mitkevich VA, Dubovaya VI, Kolosov PM, Makarov AA, Kisselev LL. Role of the individual domains of translation termination factor eRF 1 in GTP binding to eRF3. Proteins Struct Funct Genet 2008;70:388-93. doi:10.1002/prot.21544.

Preis A, Heuer A, Barrio-Garcia C, Hauser A, Eyler DE, Berninghausen O, et al. Cryoelectron

microscopic structures of eukaryotic translation termination complexes containing eRF1-eRF3

or eRF1-ABCE1. Cell Rep 2014;8:59-65. doi:10.1016/j.celrep.2014.04.058.

Eyler DE, Wehner KA, Green R. Eukaryotic release factor 3 is required for multiple turnovers

of peptide release catalysis by eukaryotic release factor 1. J Biol Chem 2013;288:29530-8.

doi:10.1074/jbc.M113.487090.

Alkalaeva EZ, Pisarev A V., Frolova LY, Kisselev LL, Pestova T V. In Vitro Reconstitution of Eukaryotic Translation Reveals Cooperativity between Release Factors eRF1 and eRF3. Cell 2006;125:1125-36. doi:10.1016/j.cell.2006.04.035.

Taylor D, Unbehaun A, Li W, Das S, Lei J, Liao HY, et al. Cryo-EM structure of the mammalian eukaryotic release factor eRF1-eRF3-associated termination complex. Proc Natl Acad Sci 2012;109:18413-8. doi:10.1073/pnas.1216730109.

Becker T, Armache J-P, Jarasch A, Anger AM, Villa E, Sieber H, et al. Structure of the no-go mRNA decay complex Dom34-Hbs1 bound to a stalled 80S ribosome. Nat Struct Mol Biol 2011;18:715-20. doi:10.1038/nsmb.2057.

Matheisl S, Berninghausen O, Becker T, Beckmann R. Structure of a human translation termination complex. Nucleic Acids Res 2015;43:8615-26. doi:10.1093/nar/gkv909. Brown CM, Stockwell PA, Trotman CNA, Tate WP. Sequence analysis suggests that tetra-nucleotides signal the termination of protein synthesis in eukaryotes. Nucleic Acids Res 1990;18:6339-45. doi:10.1093/nar/18.21.6339.

Shirokikh NE, Alkalaeva EZ, Vassilenko KS, Afonina ZA, Alekhina OM, Kisselev LL, et al.

Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res 2009;38. doi:10.1093/nar/gkp1025.

Feng T, Yamamoto A, Wilkins SE, Sokolova E, Yates LA, Münzel M, et al. Optimal Translational Termination Requires C4 Lysyl Hydroxylation of eRF1. Mol Cell 2014;53:645-54. doi:10.1016/j.molcel.2013.12.028.

Skabkin M, Skabkina O, Hellen CT, Pestova T. Reinitiation and other unconventional posttermination events during eukaryotic translation. Mol Cell 2013;51:249-64. doi:10.1016/j.molcel.2013.05.026.

Pisarev A V., Skabkin MA, Pisareva VP, Skabkina O V., Rakotondrafara AM, Hentze MW, et al. The Role of ABCE1 in Eukaryotic Posttermination Ribosomal Recycling. Mol Cell 2010;37:196-210. doi: 10.1016/j.molcel.2009.12.034.

Noll H. Chain initiation and control of protein synthesis. Science 1966;151:1241-5. WETTSTEIN FO, NOLL H. BINDING OF TRANSFER RIBONUCLEIC ACID TO RIBOSOMES ENGAGED IN PROTEIN SYNTHESIS: NUMBER AND PROPERTIES OF RIBOSOMAL BINDING SITES. J Mol Biol 1965;11:35-53.

Rheinberger HJ, Sternbach H, Nierhaus KH. Three tRNA binding sites on Escherichia coli ribosomes. Proc Natl Acad Sci 1981;78:5310.

Saruyama H, Nierhaus KH. Evidence that the three-site model for the ribosomal elongation cycle is also valid in the archaebacterium Halobacterium halobium. MGG Mol Gen Genet 1986;204:221-8. doi:10.1007/BF00425502.

Triana-Alonso FJ, Chakraburtty K, Nierhaus KH. The elongation factor 3 unique in higher fungi and essential for protein biosynthesis is an E site factor. J Biol Chem 1995;270:20473-8. doi:10.1074/jbc.270.35.20473.

Feng S, Chen Y, Gao YG. Crystal Structure of 70S Ribosome with Both Cognate tRNAs in the E and P Sites Representing an Authentic Elongation Complex. PLoS One 2013;8. doi:10.1371/journal.pone.0058829.

Korostelev A, Trakhanov S, Laurberg M, Noller HF. Crystal Structure of a 70S Ribosome-tRNA Complex Reveals Functional Interactions and Rearrangements. Cell 2006;126:1065-77. doi:10.1016/j.cell.2006.08.032.

Márquez V, Wilson DN, Tate WP, Triana-Alonso F, Nierhaus KH. Maintaining the ribosomal reading frame: The influence of the E site during translational regulation of release factor 2. Cell 2004;118:45-55. doi:10.1016/j.cell.2004.06.012.

Lill R, Wintermeyer W. Destabilization of codon-anticodon interaction in the ribosomal exit

site. J Mol Biol 1987;196:137-48. doi:10.1016/0022-2836(87)90516-X.

Jenner L, Rees B, Yusupov M, Yusupova G. Messenger RNA conformations in the ribosomal

E site revealed by X-ray crystallography. EMBO Rep 2007;8:846-50.

doi:10.103 8/sj.embor.7401044.

Jenner LB, Demeshkina N, Yusupova G, Yusupov M. Structural aspects of messenger RNA reading frame maintenance by the ribosome. Nat Struct Mol Biol 2010;17:555-60. doi:10.1038/nsmb.1790.

Trabuco LG, Schreiner E, Eargle J, Cornish P, Ha T, Luthey-Schulten Z, et al. The Role of L1 Stalk-tRNA Interaction in the Ribosome Elongation Cycle. J Mol Biol 2010;402:741-60. doi:10.1016/j.jmb.2010.07.056.

Petrov AS, Bernier CR, Gulen B, Waterbury CC, Hershkovits E, Hsiao C, et al. Secondary structures of rRNAs from all three domains of life. PLoS One 2014;9. doi:10.1371/journal.pone.0088222.

Feinberg JS, Joseph S. Identification of molecular interactions between P-site tRNA and the ribosome essential for translocation. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:11120-5. doi:10.1073/pnas.211184098.

Lill R, Lepier A, Schwägele F, Sprinzl M, Vogt H, Wintermeyer W. Specific recognition of the 3'-terminal adenosine of tRNAPhe in the exit site of Escherichia coli ribosomes. J Mol Biol 1988;203:699-705. doi:10.1016/0022-2836(88)90203-3.

Schmeing TM, Moore PB, Steitz T a. Structures of deacylated tRNA mimics bound to the E

site of the large ribosomal subunit. RNA 2003;9:1345-52. doi:10.1261/rna.5120503.

Lill R, Robertson JM, Wintermeyer W. Binding of the 3' terminus of tRNA to 23S rRNA in

the ribosomal exit site actively promotes translocation. EMBO J 1989;8:3933-8.

Devaraj A, Shoji S, Holbrook ED, Fredrick K. A role for the 30S subunit E site in maintenance

of the translational reading frame. RNA 2009;15:255-65. doi:10.1261/rna.1320109.

Nierhaus KH. Decoding errors and the involvement of the E-site. Biochimie 2006;88:1013-9.

doi:10.1016/j.biochi.2006.02.009.

Nierhaus KH, Pech M. Problems with the Analyses of the Ribosomal Allosteric Three-site Model. J Biol Chem 2012;287:27049. doi:10.1074/jbc.L112.381848.

Choi J, Puglisi JD. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proc Natl Acad Sci 2017:201719592. doi:10.1073/pnas.1719592115.

Katoh T, Wohlgemuth I, Nagano M, Rodnina M V., Suga H. Essential structural elements in tRNA(Pro) for EF-P-mediated alleviation of translation stalling. Nat Commun 2016;7:11657.

doi:10.1038/ncomms11657.

Schmidt C, Becker T, Heuer A, Braunger K, Shanmuganathan V, Pech M, et al. Structure of the hypusinylated eukaryotic translation factor eIF-5A bound to the ribosome. Nucleic Acids Res 2015;44:1944-51. doi:10.1093/nar/gkv1517.

Chen B, Boel G, Hashem Y, Ning W, Fei J, Wang C, et al. EttA regulates translation by binding the ribosomal E site and restricting ribosome-tRNA dynamics. Nat Struct Biol 2014;21:152-9. doi:10.1038/nsmb.2741.

Dmitriev SE, Bykova N V, Andreev DE, Terenin IM. Adequate system for investigation of translation initiation of the human retrotransposon L1 mRNA in vitro. Mol Biol (Mosk) 2006;40:25-30. doi:10.1134/S0026893306010043.

Andreev D, Hauryliuk V, Terenin I, Dmitriev S, Ehrenberg M, Shatsky I. The bacterial toxin RelE induces specific mRNA cleavage in the A site of the eukaryote ribosome. RNA 2008;14:233-9. doi:10.1261/rna.693208.

Dmitriev SE, Pisarev A V., Rubtsova MP, Dunaevsky YE, Shatsky IN. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett 2003;533:99-104. doi:10.1016/S0014-5793(02)03776-6. Robertson JM, Wintermeyer W. Mechanism of ribosomal translocation. tRNA binds transiently to an exit site before leaving the ribosome during translocation. J Mol Biol 1987;196:525-40. doi:10.1016/0022-2836(87)90030-1.

Parisien M, Wang X, Pan T. Diversity of human tRNA genes from the 1000-genomes project. RNA Biol 2013;10:1853-67. doi:10.4161/rna.27361.

Schmutzler C, Gross HJ. Genes, variant genes, and pseudogenes of the human tRNA(Val) gene family are differentially expressed in HeLa cells and in human placenta. Nucleic Acids Res 1990;18:5001-8.

Thomann HU, Schmutzler C, Hüdepohl U, Blow M, Gross HJ. Genes, variant genes and pseudogenes of the human tRNA(Val) gene family. Expression and pre-tRNA maturation in vitro. J Mol Biol 1989;209:505-23.

Goodenbour JM, Pan T. Diversity of tRNA genes in eukaryotes. Nucleic Acids Res 2006;34:6137-46. doi:10.1093/nar/gkl725.

Li W, Frank J. Transfer RNA in the hybrid P/E state: Correlating molecular dynamics simulations with cryo-EM data. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;9:9. doi:10.1073/pnas.0708094104.

Valle M, Zavialov A, Li W, Stagg SM, Sengupta J, Nielsen RC, et al. Incorporation of

aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy. Nat Struct Biol 2003a;10:899-906. doi:10.1038/nsb1003.

Valle M, Zavialov A, Sengupta J, Rawat U, Ehrenberg M, Frank J. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell 2003b;114:123-34. doi:10.1016/S0092-8674(03)00476-8. Le Quesne JPC, Spriggs KA, Bushell M, Willis AE. Dysregulation of protein synthesis and disease. J Pathol 2010;220:140-51. doi:10.1002/path.2627.

Youngman EM, Green R. Ribosomal Translocation: LepA Does It Backwards. Curr Biol 2007;17. doi:10.1016/j.cub.2006.12.029.

Davies J, Gorini L, Davis BD. Misreading of RNA codewords induced by aminoglycoside antibiotics. Mol Pharmacol 1965;1:93-106.

Jesús Cabañas M, Vázquez D, Modolell J. Inhibition of ribosomal translocation by aminoglycoside antibiotics. Biochem Biophys Res Commun 1978;83:991-7. doi:10.1016/0006-291X(78)91493-6.

Borovinskaya MA, Shoji S, Fredrick K, Cate JHD. Structural basis for hygromycin B inhibition of protein biosynthesis. RNA 2008;14:1590-9. doi:10.1261/rna.1076908. Rheinberger HJ, Nierhaus KH. The ribosomal E site at low Mg2+: coordinate inactivation of ribosomal functions at Mg2+ concentrations below 10 mM and its prevention by polyamines. J Biomol Struct Dyn 1987;5:435-46. doi:10.1080/07391102.1987.10506403. Chen J, Petrov A, Tsai A, O'Leary SE, Puglisi JD. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nat Struct Mol Biol 2013;20:718-27. doi:10.1038/nsmb.2567.

Spiegel PC, Ermolenko DN, Noller HF. Elongation factor G stabilizes the hybrid-state conformation of the 70S ribosome. Rna 2007;13:1473-82. doi:10.1261/rna.601507. Wasserman MR, Alejo JL, Altman RB, Blanchard SC. Multiperspective smFRET reveals rate-determining late intermediates of ribosomal translocation. Nat Struct Mol Biol 2016;23:333-41. doi:10.1038/nsmb.3177.