Структурно-функциональная организация гена аланин-богатого белка холодового шока капусты Brassica oleracea тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Баймиев, Андрей Ханифович

• Баймиев, Андрей Ханифович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Баймиев, Андрей Ханифович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Развитие неспецифической ответной реакции 9 растений на стрессовый фактор

1.2. Действие низких положительных и отрицательных 12 температур на растения

1.З.. Функции белков холодового шока

1.4. Регуляция экспрессии индуцируемых холодом генов 34 растений

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение и очистка ДНК растений

2.3. Выделение РНК растений

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.5. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной

ДНК

2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в 51 неденатурирующих условиях

2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в 53 неденатурирующих условиях

2.9. Полимеразная цепная реакция

2.10. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных

гелей

2.11. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные

фильтры (блоттинг)

2.12. Нозерн-блот и дот-блот анализ РНК

2.13. Радиоактивное мечение препаратов ДНК

2.14. Блот-гибридизация ДНК

2.15. Трансформация компетентных клеток Е.соИ 62 плазмидной ДНК

2.16. Секвенирование ДНК ферментативным методом

2.17. Электрофоретическое фракционирование ДНК в 65 денатурирующих условиях

2.18. Компьютерный анализ нуклеотидных 67 последовательностей

2.19. Реактивы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клонирование гена белка холодового шока капусты

3.2. Распространенность генов, подобных гену БХШ 79 капусты, в геномах растений различных семейств

3.3. Вариабельность генов БХШ растений семейства 80 крестоцветных

3.4. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при 84 различных условиях холодовой акклимации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аминокислоты: Ala (А) - аланин Arg (R) - аргинин Asn (N) - аспарагиновая кислота Asp (D) - аспарагин Cys (С) - цистеин His (H) - гистидин Ile (I) - изолейцин Gin (Q) - глутаминовая кислота Glu (Е) - глутамин Gly (G) - глицин Leu (L) - лейцин Lys (К) - лизин Met (M) - метионин Phe(F) - фенилаланин Pro (P) - пролин Ser (S) - серин Thr (Т) - треонин Trp (W) - триптофан Туг (Y) - тирозин Val (V) - валин

Нуклеотиды: дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ - дезоксигуанозинтрифосфат дТТФ - дезокситимидинтрифосфат дЦТФ - дезоксицитозинтрифосфат дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

ддАТФ - дидезоксиаденозинтрифосфат ддГТФ - дидезоксигуанозинтрифосфат ддТТФ - дидезокситимидинтрифосфат ддЦТФ - дидезоксицитозинтрифосфат ддНТФ - дидезоксинуклеотидтрифосфат

А.к.о. - аминокислотные остатки АБК - абсцизовая кислота ДТТ — дитиотрейтол пн - пара нуклеотидов тпн - тысяча пар нуклеотидов ПЭГ - полиэтиленгликоль ТАЕ - трис-ацетатный буфер ТЕ - трис-буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота 1РТО - изопропил-|3-В-галактозидаза ЬВ-среда - среда Лурия-Бертани БОБ - додецилсульфат натрия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация гена аланин-богатого белка холодового шока капусты Brassica oleracea»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Исследование механизмов реализации устойчивости ценных сельскохозяйственных культур к гипотермии является одной из важнейших проблем современной физиологии растений, поскольку известно, что резкое изменение погодных условий, в частности, понижение температуры, достаточно характерно для нашего региона. Многие виды растений приобретают способность переносить значительное понижение температуры окружающей среды, если они предварительно проходят период так называемого закаливания, во время которого в клетках растений наблюдаются различные биохимические изменения, вызванные, в свою очередь, индукцией определенных генов (Касперска-Палач, 1983). В последние годы большое внимание уделяется исследованиям, направленным на выяснение изменений в экспрессии генов, обусловленных воздействием холодового шока. Низкотемпературная индукция генов показана для многих растений, таких, как пшеница (Guo et al., 1992), ячмень (Cattivelli, Bartels, 1990), шпинат (Neven et al., 1993), люцерна (Laberge et al., 1993), арабидопсис (Kurkela, Frank, 1990; Nordin et al., 1991; Lin, Tomashow, 1992; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994), рапс (White et al., 1994) и ряда других. Экспрессия некоторых из этих генов носит специфический характер, поскольку вызывается только низкой температурой (Weretilnik, 1993). В то же время другие гены индуцируются, наряду с холодом, также и дегидратацией, солевым стрессом, обработкой абсцизовой кислотой (Kurkela, Frank, 1990; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994; Dunn et al, 1994; Leung et al., 1998). В формирование защитных реакций растений вовлекаются также и некоторые конститутивно экспрессирующиеся белки, синтез и количество которых увеличивается при гипотермии (Shen et al., 1993). К настоящему времени в литературе накопилось немало данных о возможных функциях белков холодового шока, которые отличаются большим разнообразием. Некоторые из этих белков представляют собой ферменты, участвующие в преобразовании физико-химических свойств плазматических мембран, а также в фосфорилировании митохондриальных белков. Другие повышают

стабильность мембран и цитоскелета. Обнаружены антифризные белки, влияющие также на устойчивость к фитопатогенам. Но самую большую группу регулируемых холодом белков составляют гидрофильные белки, имеющие альфа-спиральную структуру и выполняющие криопротекторные функции. Вода, связываемая в виде гидратных оболочек этими молекулами, не замерзает и не транспортируется, оставаясь в клетке. Таким образом клетки защищаются от внутриклеточного льда и чрезмерного обезвоживания. Однако, несмотря на значительное количество исследований, еще не вполне ясно, чем обусловлены различия в холодостойкости разных видов растений и как происходит усиление холодостойкости во время закаливания растения. Решение этих вопросов имеет не только определяющее фундаментальное значение для понимания механизмов управления холодоустойчивостью культурных растений, но и важное прикладное значение.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы заключалась в

исследовании структурно-функциональной организации гена белка холодового шока капусты Brassica oleracea и механизмов развития холодового закаливания у растений. В связи с этим, перед нами были поставлены следующие задачи:

1) Клонирование гена белка холодового шока (БХШ) капусты и определение его первичной структуры.

2) Сравнительный анализ генов, подобных гену БХШ капусты, у растений разных видов и семейств.

3) Изучение экспрессии гена БХШ при различных стрессовых условиях.

Научная новизна. Значительная индукция экспрессии клонированного нами гена аланин-богатого белка холодового шока капусты и других видов растений семейства крестоцветных наблюдается не только при гипотермии, но также и при дегидратации и обработке АБК, что позволяет предполагать вовлечение белка, кодируемого этим геном, в развитие универсальной неспецифической реакции на стресс.

Впервые показано, что данный тип генов белков холодового шока характерен только для растений семейства крестоцветных, которые, как известно, отличаются повышенной холодостойкостью. Полученные нами данные углубляют представления о структурно-функциональной организации генов БХШ высших растений и некоторых общих механизмах адаптации растений к неблагоприятным условиям среды.

Практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений может послужить основой для развития новых стратегий ' повышения устойчивости к низким температурам и увеличения продуктивности, а также расширения области возделывания сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции "Molecular biology of plants under environmental stress" (Познань, Польша, 1997); на научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета (БГУ, Уфа, 1997), на VI молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии" (Сыктывкар, 1999).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в пяти печатных работах, а также депонированы в международных банках данных The EMBL Nucleotide Sequence DataBase и GenBank.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 140 названий, в том числе 127 работ иностранных авторов. Работа изложена на 111 страницах и содержит 11 рисунков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Развитие неспецифической ответной реакции растений на стрессовые факторы

Воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды на растения существенным образом изменяет их метаболизм, вызывая тот или иной стрессовый ответ.

Концепция стресса была сформирована во второй половине 30-х годов канадским ученым Г. Селье . По Селье, стресс - это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любых сильных воздействий (стрессоров), включающих перестройку защитных сил организма, увеличивающих сопротивляемость к стрессовым факторам (цит. по Пахомовой, 1995).

В физиологии растений под стрессом подразумевается неспецифическая реакция клетки и организма в целом на экстремальные воздействия. В настоящее время убедительно показано, что у большинства растений под действием самых различных неблагоприятных факторов, как правило, развивается особое состояние - фитостресс. Чаще всего фитостресс проходит через фазы: фазу реакции, фазу адаптации и, наконец, в случае продолжительного губительного действия отрицательных воздействий - фазу гибели (истощение ресурсов надежности, повреждения), в течение которой наблюдаются необратимые деструктивные изменения (Генкель,1979; Урманцев, Гудсков, 1986; Урманцев, Пронина, 1986; Полевой, 1989; Веселова и др., 1990; Жадько, 1991; Пахомова, Пахомов, 1992).

К первичным неспецифическим процессам, происходящим в клетках растений при сильном и быстро нарастающем действии стрессора, относится целый комплекс в той или иной степени однотипных реакций, которые можно отнести к общебиологическим, а именно снижение активности синтетических процессов, деградация белоксинтезирующего аппарата, повышение проницаемости мембран, возрастание гидролитических процессов, активация и синтез стрессовых белков, увеличение синтеза этилена и абсцизовой кислоты, торможение деления и роста клеток и некоторые другие изменения (Блехман, Шеламова, 1992; Тарчевский, 1993; Пахомова, 1995; Глянько, 1996; Hughes, Dunn, 1996). Перечисленные реакции наблюдаются при действии любых стрессов. Если действие стресса не достигает пороговых значений, могут возникать обратимые процессы и формируется устойчивость организма к стрессу (фаза адаптации). После прекращения действия отрицательного фактора возможно восстановление функций организма (фаза реституции и восстановления). При усилении стрессового воздействия до летальных пределов наступает фаза повреждения и гибели. Характерно, что вся последовательность реакций сводится к одному - поддержанию гомеостаза растительного организма в экстремальных условиях. Он обеспечивается сложной и до конца еще не изученной системой механизмов адаптации, направленной на ослабление или устранение повреждающего действия стрессора на растение (Шматько, Григорюк, 1992). О переходе жизненных процессов растительного организма на новый уровень, связанный с выживанием в экстремальных условиях, свидетельствуют данные о синтезе так называемых белков теплового и холодового шока, полиморфизме ферментов, изменении их функциональной активности и свойств,

накоплении в клетках соединений, играющих адаптогенную и протекторную роль.

Факторы, способные вызвать стресс у растительных организмов, можно подразделить на три основные группы: а) физические - недостаточная или избыточная влажность, освещенность или температура, радиоактивные излучения, механические воздействия; б) химические - соли, газы, ксенобиотики; в) биологические - поражение возбудителями болезней или вредителями, конкуренция с другими растениями (Вартапетян, 1985; Полевой, 1989; Пахомова, 1993).

Растительные организмы, в отличие от животных, в большинстве случаев реагируют на стрессор не активацией обмена веществ, а, наоборот, снижением своей функциональной активности. Торможение биосинтетических процессов клеток происходит в результате действия ингибиторов и переключения энергетических ресурсов на преодоление неблагоприятных сдвигов. Механизмы ответной реакции растений на воздействие экологических стрессов разнообразны (Levitt, 1972; Sheel, 1988). Стресс в растительном организме вызывает в первую очередь неспецифические реакции устойчивости (изменения проницаемости мембран, структурированности цитоплазмы, смещение рН, падение мембранного потенциала), затем промежуточные (синтез стрессовых белков, торможение роста, фотосинтеза и др.) и специфические (гипоксия, засухо-, морозо- и солеустойчивость) (Саляев, Кефели, 1988). Ответные реакции растений на стресс включают изменения в росте, фотосинтезе, дыхании, гормональной активности и другие регулируемые на молекулярном уровне, включая генную экспрессию (Vaadia, 1985). Описанные изменения взаимосвязаны, протекают как каскадные саморазвивающиеся процессы и служат пусковым звеном

для включения целой цепи различных обменных реакций, первоначальное предназначение которых заключается в восстановлении исходного состояния клетки (Пахомова, 1995).

В фитофизиологии, так же как и в физиологии животных, различают повреждающий и физиологический (закаливающий) стрессы. При физиологическом стрессе в растениях наблюдаются явления суперкомпенсации: увеличение содержания ДНК и РНК, усиление трансляционной активности полисом, интенсификация синтеза белков, усиление обмена веществ, увеличение активности ряда ферментов, в том числе РНКазной активности, возрастание энергетического уровня и др. (Генкель, 1982; Киль и др., 1991).

Способность растений сопротивляться экстремальным условиям произрастания, приспосабливаться к ним и сохранять при этом свой жизненный потенциал является одним из определяющих условий существования растений и зависит от возможности реализовать защитно-приспособительные механизмы, т.е. адаптироваться к разнообразным стрессовым воздействиям.

1.2. Действие низких положительных и отрицательных температур на растения. Стрессовые белки растений

Температура среды - один из основных экологических факторов, отличающихся очень высокой мобильностью. Для нее характерны суточные, сезонные, годовые колебания. Растения, температура которых, как правило, соответствует температуре окружающей среды, вынуждены приспосабливаться к температурным перепадам, так как тепловой режим среды обитания оказывает существенное действие на их метаболизм, рост, развитие

и продуктивность (Pesci, 1987). Они проявляют различную степень устойчивости к повреждающему действию низких температур.

К морозостойким относятся растения, которые выживают после действия отрицательных температур и образования в них межклеточного льда. Морозостойкость связана с определенной подготовкой к восприятию холода (закаливание растений). Холодостойкие растения выносливы к любым низким положительным температурам, если при этом вода в них остается в переохлажденном состоянии. Теплолюбивые растения не устойчивы не только к отрицательным, но и даже к низким положительным температурам (Дроздов, 1984). Различают еще заморозкоустойчивость - способность выдерживать внезапное кратковременное воздействие отрицательных температур без существенного снижения продуктивности (Глянько, 1996).

Проблема холодоустойчивости остро стоит для теплолюбивых культурных растений, длительный рост которых при низкой положительной температуре невозможен. Например, это касается овощных культур (огурцы, томаты), зерновых (кукуруза), зернобобовых (соя).

По-видимому, основной причиной повреждающего действия низкой положительной температуры на теплолюбивые растения является нарушение функциональной активности мембран из-за перехода насыщенных жирных кислот, входящих в их состав, из жидкокристаллического состояния в состояние геля при низкой температуре (Wilson, Crawford, 1974). Это приводит к неблагоприятным сдвигам в обмене веществ и гибели растения. Так, у растений огурца, погибающего уже при 6°С, причиной необратимых повреждений клеток являются изменения в составе мембранных липидов (Карасев и др., 1995). Важное значение

фазовых переходов липидов при холодовом шоке показано и на другом модельном объекте (Drobnis et al., 1993).

Постепенное воздействие низких отрицательных температур на растения приводит к образованию льда в межклетниках (Pearce,1988; Guy, 1990). Лед в межклетниках образуется раньше, чем внутри клеток вследствие того, что межклеточная жидкость имеет более высокую точку замерзания, чем внутриклеточная жидкость. К тому же, это может отражать относительный уровень присутствия центров кристаллизации льда снаружи и внутри клеток; в отсутствии центров кристаллизации льда вода остается в переохлажденном состоянии до -38°С.

Накопление льда в межклеточном пространстве может привести к физическому разрушению клеток и тканей, вызываемое, в частности, из-за слипания межклеточного льда, клеточной стенки и мембраны (Levitt, 1980). Однако большинство повреждений происходит из-за дегидратации клеток во время замораживания (Levitt 1980; Steponkus, Webb, 1982). При температуре ниже нуля градусов химический потенциал льда меньше, чем химический потенциал жидкой воды. Поэтому при образовании межклеточного льда химический потенциал с внешней стороны становится меньше, чем внутри клетки, что в свою очередь приводит к перемещению жидкой воды по градиенту водного потенциала с внутренней стороны во внешнюю. Точка равновесия в этом процессе зависит как от начальной концентрации внутриклеточного раствора, так и от температуры, которая напрямую определяет химический потенциал воды (Thomashow, 1998).

Иссушающее действие льда, находящегося в межклеточниках, особенно при длительном действии низких температур, сходно с обезвоживанием, происходящим при засухе за счет испарения. При

температуре —10°С более чем 90% осмотически активной воды с внутриклеточной области переходит в межклеточную область. Индуцируемая холодом дегидратация может привести к различным последствиям, приводящим к разрушению клеток, таким как денатурация белков и их осаждение. Степень выживаемости клеток от высушивания, вызванного образованием внеклеточного льда, часто и определяет уровень морозоустойчивости растений (Uemura, Steponkus, 1989).

Таким образом, низкие и отрицательные температуры оказывают в основном повреждающее влияние на растительные клетки. При этом одним из первичных мест подобного воздействия является клеточная мембрана.

Многие растения регионов с умеренным климатом способны избежать или уменьшить воздействие низких температур. Они показывают повышенную морозоустойчивость после их экспозиции при низких положительных температурах. Этот процесс называется закаливанием. Во время закаливания происходят разнообразные биохимические , морфологические и физиологические изменения в растительных клетках (Касперска-Палач,1983; Singh, Laroche, 1988; Yelenovsky, Guy, 1989), подготавливающие их к преодолению низких положительных температур.

Рядом авторов показано, что холодовое закаливание растений сопровождается повышением или снижением активности ферментов, изменением их структурных и электрофоретических свойств, изозимного спектра (Алехина, Соколова, 1974; Krsnuk, 1975; Джанумова, Кузанян, 1987; Robertson, 1978; Huner et al., 1981; Angelopoulos, Gavalas, 1988; Петрова и др., 1985), фосфолипидного состава тканей и мембран различных растительных органелл, что ведет к повышению общего содержания фосфолипидов и

ненасыщенных жирных кислот (Касперска-Палач, 1983; Бочаров, Джанумова, 1986). Последнее определяет защитную реакцию клетки, обусловливающую снижение температуры фазовых переходов липидов мембран из жидкокристаллического состояния в твердое, что сказывается на проницаемости мембран для воды(Левитт, 1983).

Холодовое закаливание растений ведет к увеличению содержания ряда метаболитов, и в первую очередь Сахаров (Трунова, 1972), растворимых (в том числе водо-растворимых) белков (Chen, Li, 1982; Зверева, Трунова, 1985), свободных аминокислот (пролина, аргинина) (Thomas, James, 1993; Sakai, Larcher, 1987). Накопление некоторых из этих соединений, например, Сахаров, может быть связано с замедлением ростовых процессов, а растворимых белков - непосредственно с действием холода. У растений, не прошедших стадию закаливания, воздействие низких температур вызывает изменения процесса созревания рРНК: происходит накопление поздних предшественников в ущерб стабильным фракциям рРНК (Paldi et al., 1996).

При холодовом закаливании растений снижается оводненность тканей и увеличивается количество прочно связанных форм воды (Дроздов, Курец, Титов, 1984). По мнению Угарова, при низких температурах (4°С и ниже) вода в растительном организме переходит из "плотноупакованного" состояния в "льдоподобное", характеризующееся большим числом водородных связей (Угаров, 1988). При этом холодоустойчивые растения способны "усваивать" воду в "льдоподобном" состоянии, используя ее в процессах, связанных с выживанием, в отличие от теплолюбивых растений, которые не обладают этой способностью и погибают.

Биологические мембраны чрезвычайно чувствительны к действию факторов окружающей среды. Известна тесная зависимость состава мембран от температуры роста растений. Холодовая акклимация вызывает стабилизацию мембран. Так, у арабидопсиса, например, показано, что плазматические мембраны незакаленных растений подвергаются индуцированному лизису и формированию гексагональной II фазы липидов под действием холода, а мембраны закаленных растений - нет (Steponkus and Webb, 1992).

Исследования физического состояния плазмалеммы показали более высокую текучесть мембран клеток листьев закаленных растений морозоустойчивого сорта Мироновская 808 по сравнению с маломорозостойкой пшеницей сорта Пеньямо 62 (Vigh et al., 1979).

Стабилизация мембран против разрушений, вызываемых холодом, достигается, по- видимому, различными путями. Steponkus и др. (1992) показали, что увеличение холодостойкости мембран, происходящее во время холодовой акклимации, включает изменения в составе липидов мембраны, например, увеличение уровня ненасыщенных жирных кислот в мембранных фосфолипидах и изменения в уровне и типах мембранных стеролов и сереброзидов. Показано, что у люцерны холодоустойчивые растения характеризовались большим количеством моно- и дигалактозилдиацилглицерина, фосфатидилхолина,

фосфатидилэтаноламина, в то время как холодочувствительные имели больше фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и сульфолипида (Kuiper, 1970). Вероятно, стабилизации мембран во время холодовой аклимации способствует и накопление различных Сахаров (Anchordoguy et al., 1987).

Дегидратация, вызванная холодом, может вызвать различные формы мембранного лизиса. При относительно высокой замораживающей температуре между -2°С и -4°С преобладающим нарушением в мембранах неаклиматизированных растений, по-видимому, является лизис, который вызывается циклом осмотического сжатия-расширения, происходящего во время процесса замораживания-оттаивания. При низких температурах между -4°С и -10°С основной формой нарушения мембран в незакаленных растениях является индуцируемый холодом переход липидов из ламеллярной фазы в гексогональную II фазу (Steponkus et al. 1993). Утечка электролитов из клеток после цикла замораживания-оттаивания поддается измерению и является индикатором такого типа повреждений, более того, часто используется как показатель приобретения устойчивости к морозам у растений (Boothe et al., 1995).

В суспензионных культурах клеток винограда и яблони закаливание приводит к увеличению силы клеточных стенок и уменьшению пор в клеточной стенке. При закаливании некоторых вечнозеленых растений в тканях листьев увеличивается клеточное натяжение, способствующее большей устойчивости к изменению объема клеток при замерзании (Rajashekar, Laña, 1996). В то же время при воздействии низкими температурами для пшеницы показано увеличение активности синтеза актин-связывающего белка, участвующего в деполимеризации микротубул и актиновых филаментов, способствующее достижению большей текучести плазматической мембраны во время холодовой акклимации (Danyluk et al., 1996).

При действии стрессора на растительную клетку происходят определенные изменения в обменных процессах. Достаточно

эффективным способом регуляции метаболизма при холодовой акклимации является фосфорилирование белков (Каримова, Жуков, 1991). Вероятно, индуцируемые холодом фосфорилированные белки принимают участие в регуляции активности чувствительных к действию холода генов, взаимодействуя непосредственно с ДНК или другими белками, также участвующими в регуляции генов (Багокт, С1ша, 1992).

Ответной реакцией ряда видов растений на холодовое закаливание является увеличение содержания в тканях полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) (Апйкатеп М., РШакаэЫ Б. 1993), в связи с чем эти соединения расматриваются в качестве вероятных "аварийных" и протекторных веществ при экстремальных воздействиях (Шевякова, 1988).

У закаленных растений озимого рапса увеличивается содержание в тканях АТФ и повышается энергетический заряд (БоЬсгук, КасрегБка-Раксг, 1978).

Следствием первичных нарушений, вызванных воздействием неблагоприятных условий окружающей среды, является индукция синтеза стрессовых белков и отдельных присущих норме белков на фоне подавления тотального синтеза белка (Едрева, 1992; Блехман, Шеламова, 1992).

Холодовое закаливание индуцирует значительные изменения в составе растворимых белков листьев, стеблей и корней морозостойких сортов озимой пшеницы (7>. аеяНуит Ь. су. БгепсШсЬ и су Мо^аг) и неустойчивого к морозу сорта яровой пшеницы (су. С1еп1еа). По крайней мере 8 новых белков были выявлены в закаленных тканях. Белок с молекулярной массой 200 кД синтезировался во всех тканях. Два белка (с молекулярными массами 36 кД, р!5,5 и 5,7) специфически синтезировались в

листьях; три (с молекулярными массами 50, 45 и 44 кД) в стеблях и два ( с молекулярными массами 64 и 52 кД) в корнях (Perras, Sarhan, 1989; Quellet et al., 1993).

Рост при низкой температуре вызывал изменения в спектре клеточных белков Bromus inermis Leyss. (cv. Manchar). Синтез белков с молекулярными массами 25, 165, 190 и 200 кД увеличивался, ингибировался синтез белка с молекулярной массой 22 кД (Robertson et al., 1988).

Сравнение белковых спектров нескольких сортов кукурузы после температурного стресса показало, что холодовой шок вызывал синтез белков с молекулярными массами от 13 до 94 кД (Yacoob, Filion, 1986).

У люцерны (Medicago sativa cv. Saranac) холодовое закаливание приводило к появлению новых или усилению синтеза уже имеющихся белков с молекулярными массами 11, 27, 38, 60, 70, 80 и 90 кД (Mohapatra et al., 1987). У другого сорта люцерны (Apica) холодовое закаливание вызывало синтез белка с молекулярной массой 14,5 кД. При этом температура выживания половины растений (LT50) понижалась с -6°С до -16°С (Monroy et al., 1993).

Быстрые и стабильные изменения в синтезе белков происходили при переносе проростков шпината из нормальных условий (25°С) на холод (5°С). При этом синтезировались три шоковых белка с молекулярными массами около 160, 117 и 85 кД и значительно усиливался синтез белка с молекулярной массой 79 кД (Guy, Haskell, 1987; Neven et al., 1993).

При кратковременной холодовой обработке корневой меристемы лука Allium сера L. было обнаружено появление шести новых белков с молекулярными массами около 78, 75, 74, 70, 62, 35

кД, при длительной экспозиции на холоду синтезировался белок с молекулярной массой 31 кД (Moreno et al., 1994).

Относительное увеличение интенсивности синтеза по крайней мере 14 полипептидов установлено уже через 6 часов инкубации при 0°С проростков рапса {Brassica napus) (Meza-Basso et al., 1986).

Одним из наиболее интенсивно изучаемых растений является арабидопсис, характеризующийся чрезвычайно маленьким (для растений) размером генома. У него обнаружены различные белки, появляющиеся в ответ на холодовой и прочие стрессы (Kurkela and Franck, 1990; Nordin et al., 1991; Rouse et al., 1992; Nordin et al., 1993; Gilmour et al., 1992; Lang and Palva, 1992). Появление специфических мРНК во время закаливания показано также для люцерны (Wolfraime et al., 1993), шпината (Neven et al., 1993), ячменя (Cattivelli and Bartels, 1990), пшеницы (Houde et al., 1992) и рапса (Weretilnyk et al., 1993).

Таким образом, растения могут приобретать свойства морозостойкости, проходя несколько этапов закаливания, во время которых активизируется весь комплекс защитных средств растения. В мембранах возрастает содержание ненасыщенных жирных кислот, позволяющее поддерживать высокую проницаемость мембран при замораживании, повышается устойчивость плазматических мембран к разрывам, снижается точка замерзания цитоплазмы, отмечается некоторое уменьшение внутриклеточной воды, что тормозит образование внутриклеточного льда. При пониженных температурах останавливается рост, в клетках накапливаются соединения, выполняющие защитную функцию. К ним относятся прежде всего полимеры, способные связывать значительные количества воды: моно- и олигосахариды, некоторые аминокислоты, гидрофильные

белки. Чем выше их содержание, тем больше способность клетки к выживанию в условиях низких температур.

1.3. Функции белков холодового шока

Для многих индуцированных стрессом белков еще не определена функциональная роль. Возможное исключение составляют некоторые ферменты, участие которых в метаболических процессах уже исследовано (Guy et al., 1992). Например, при низких температурах усиливается синтез десатуразы насыщенных жирных кислот и предполагаемого белка- переносчика липидов, кодируемых, соответственно, геном FAD8 у арабидопсиса (Gibson et al., 1994) и геном- blt4 ячменя (Hughes, Dunn, 1996). Они изменяют состав липидов мембран, тем самым повышая холодостойкость клеток.

Кальций-зависимая протеин-киназа, митоген-активируемая протеин-киназа, синтез которых также регулируется холодом, могут способствовать усилению холодостойкости, контролируя экспрессию генов, участвующих в ответе растений на холод или регулируя активность белков, вовлеченных в развитие устойчивости к низким температурам (Hughes, Dunn, 1996; Jonak et al., 1996).

В настоящее время интенсивно ведутся работы по изучению генов, кодирующих белки, индуцируемые холодом, а также их регуляции. Большинство известных на сегодняшний день генов были выделены из библиотек кДНК, используя метод дифференциального скринирования, когда используются нормальная ростовая температура и низкая положительная температура для получения различных пулов мРНК. В этих условиях

увеличивается относительное содержание транскриптов генов, экспрессия которых индуцируется низкой температурой.

Выделение и анализ индуцированных холодом последовательностей является интересным подходом к изучению функции этих вновь индуцированных белков. У томата, например, индуцируемые транскрипты идентифицированы как имеющие высокую гомологию с тиоловыми протеазами (Schaffer, Fischer, 1988). По всей видимости, увеличение активности тиоловых протеаз, обеспеченное индукцией экспрессии протеазного гена, необходимо для деградации полипептидов, денатурированных низкими температурами.

Стрессовая реакция растений на действие экстремальных температур сопровождается синтезом также и белков теплового шока (БТШ), относящихся к классу шаперонов. Как известно, шапероны - эволюционно консервативные белки, необходимые для правильной сборки и агрегации полипептидов в олигомерные структуры, в состав которых они не входят (Ellis, 1987).

У проростков рапса при холодовом закаливании синтезировался БТШ hsp 90 (Krishna et al., 1995). Этот белок, вероятно, действует в комплексе с другими БТШ и участвует в переносе полипептидов, синтезированных во время холодового закаливания. Другой возможной функцией этих белков является обеспечение восстановления белков, денатурированных во время холодового стресса. Поддержанию клеточного гомеостаза у сои и шпината во время холодовой акклимации способствует синтез белков класса hsp70 (Cabane et al., 1993; Anderson et al., 1994; Li et al., 1999).

Выведенные аминокислотные последовательности некоторых белков показывают, что часть индуцируемых холодом генов

кодирует белки, сходные с белками, накапливаемыми во время водного стресса (Baker et al., 1988), а также во время воздействия абсцизовой кислотой (Skriver and Mundy, 1990; van Berkel et al., 1994). Это так называемые дегидрины - белки, синтезируемые в ответ на дегидратацию. Показано, что они обычно накапливаются у растений при низких незамораживающих температурах и других воздействиях внешней среды, которые имеют обезвоживающий компонент, включая засуху, засоление, высушивание созревающих семян и замораживание. Их конкретная роль неизвестна, но иммунолокализация и изучение очищенных дегидринов согласуется с предположением об участии этих белков в стабилизации различных коллоидов и макромолекул в цитоплазме и ядре. Вероятно, стабилизация происходит через механизм, включающий взаимодействие амфипатических альфа-спиральных областей дегидринов с поверхностью стабилизируемых молекул и взаимодействие гидрофильных областей с раствором (Close, 1996).

Дегидрины у многих видов растений - ячменя, кукурузы, арабидопсиса, имеют гомологичную структуру (Close et al., 1989; Rouse et al., 1992; Welin et al., 1995). Экспрессия дегидриновых генов у Bromis inermis и ржи в поле и в условиях гидропоники как при закаливании, так и при воздействии абсцизовой кислоты, приводит к увеличению морозостойкости (Robertson et al., 1994). А водный стресс (Siminovich and Cloutier, 1982), воздействие абсцизовой кислоты (Chen and Gusta, 1983) при незакаливающих температурах, также может индуцировать увеличение морозостойкости. Предполагается, что такие белки могут способствовать растениям переносить клеточное высушивание, которое опасно тем, что оно вызывает денатурацию белков и изменение ионной силы внутриклеточной жидкости. Высокая

гидрофильность белков холодового шока сближает их с белками, связанными с дегидратацией клеток не только при внешних воздействиях, как в случае дегидринов, так и во время нормального высушивания семян при созревании (белки Lea) (Dure et al., 1989). Предполагают, что помимо участия в развитии устойчивости к высушиванию, экспрессия генов Lea способствует повышению холодостойкости растений. По характеру внешнего воздействия, вызывающего их экспрессию, Ланг и соавт. (Lang et al., 1994) разделили эту группу генов, гомологичных Lea, на две подгруппы: "классические" lea гомологи, которые экспрессируются в основном в ответ на экзогенную АБК и высушивание и lti-гены, индуцируемые в основном при низкой температуре. Ранние исследования с "классическими" генами-гомологами lea показали, что они экспрессируются в больших количествах при холодовом воздействии, вероятно, по АБК-опосредованному механизму (Hahn, Walbot, 1989; Bray, 1991; Pan, 1990; Plant et al., 1991). У арабидопсиса низкотемпературная индукция экспрессии гена rabí8, принадлежащего к генам lea, была намного ниже, чем при воздействии высушиванием и экзогенной АБК. Эти различия, скорее всего коррелируют с различиями в уровне эндогенного содержания АБК. Известно, что если при холодовом воздействии уровень эндогенного содержания АБК увеличивается в 3-4 раза, то при высушивании происходит 40-50 кратное увеличение уровня гормона (Lang, Palva, 1992). Другая же подгруппа lea-гомологичных генов, а именно lti-гены, в основном экспрессируются при низких температурах (Guo et al., 1992; Wolfraim et al., 1993; Gilmour et al., 1992; Palva et al., 1993). В ответ на высушивание и воздействие экзогенной АБК экспрессия этих генов является низкой или отсутствует вообще. Работы с АБК-мутантами арабидопсиса

подтверждают предположение, что экспрессия lti-генов не зависит от экзогенной АБК (Palva et al., 1993). Таким образом, различные представители генов lea-гомологов экспрессируются преимущественно на воздействие низкой температуры и на воздействие водного стресса/АБК, и, соответственно, могут включаться в развитие устойчивости к низкой температуре, индуцируемого или низкой температурой, или высушиванием/АБК.

Из библиотеки ДНК закаленных проростков пшеницы был выделен клон Wcor 719, соответствующий актин-связывающему белку. Данный клон кодирует полипептид из 142 аминокислот с молекулярной массой 15,8 кД и pi 4,27. Полипептид имеет 2 домена, идентифицированные как актин- и фосфатидилинозит-4,5-бифосфат-связывающие сайты. Наблюдалось очень быстрое и сильное регулирование низкой температурой накопления транскрипта. Быстрота индукции транскрипта и значительность его гомологии с актин-связывающим белком из различных организмов свидетельствуют о возможном участии продукта этого гена в динамической реорганизации цитоскелета при закаливании (Danyluk et al., 1996).

При холодовой обработке рапса Brassica napus синтезировался пролин-богатый белок клеточной стенки, который, вероятно, также участвует в повышении холодоустойчивости клеток (Goodwin et al., 1996).

Интересным фактом стало обнаружение того, что растения, как и некоторые рыбы (Hew et al., 1985) и насекомые (Duman and Horwath, 1983), синтезируют так называемые "антифризные" белки (АФБ) в ответ на действие низких температур (Urrutia et al., 1992; Griffith et al., 1997). Эти протеины обладают активностью, вызывающей температурный гистерезис: протеины уменьшают

температуру, при котором образуется лед, но не влияют на точку плавления. Это вызвано тем, что "антифризные белки" связываются с поверхностью растущего кристалла льда и тормозят его дальнейший рост. Также "антифризные белки" влияют на форму кристаллов льда, которые образуются при снижении температуры ниже точки замерзания раствора и являются сильными ингибиторами рекристализации льда, т.е. тормозят объединение малых кристаллов в большие. Исследуя растения Solanum dulcamara L., Уррутиа и соавт. (Urrutia et al., 1992) показали, что вытяжка из стеблей паслена, собранных осенью, проявляла способность к ингибированию рекристаллизации, в то время как вытяжка из летних растений такую способность не имела. Наибольшие значения температурного гистерезиса определены для растений подорожника, мятлика, барбариса. Возможными функциями белков температурного гистерезиса авторы считают ингибирование рекристаллизации, уменьшение скорости роста кристаллов, защиту клеточных мембран за счет подавления образования кристаллов льда в межклеточном пространстве.

Температурный гистерезис был обнаружен в клеточном соке закаленных растений у более чем 20 видов, включая как однодольные, так и двудольные растения (Griffith et al., 1997). Гриффит и соавт. (Antikainen and Griffith, 1997; Griffith et al., 1997) показали, что злаки, включая озимую и яровую рожь, озимую и яровую пшеницу, озимый ячмень и яровой овес, накапливают "антифризные белки" в апопластической жидкости во время холодовой акклимации, но они не накапливаются в обработанных холодом кукурузе и табаке, которые являются теплолюбивыми растениями и не способны к холодовой акклимации. Более того, они накапливаются в детектируемом уровне не у всех растений,

способных к холодовой акклимации. В частности, антифризная активность не была выявлена в апопластической жидкости шпината и ярового рапса и была обнаружена в очень незначительном уровне у озимого рапса и капусты. Все эти растения относятся к двудольным и способны выжить при замораживании до -14°С после холодовой акклимации. Примечательно то, что капуста при холодовой акклимации синтезирует значительное количество "антифризных белков" (Antikainen and Griffith, 1997). Таким образом, вероятно, что в капусте и других двудольных растениях "антифризные белки" находятся непосредственно внутри клеток.

Шесть "антифризных белков" с молекулярной массой от 16 до 35 кД накапливаются в апопластической жидкости озимой ржи во время холодовой акклимации (Antikainen and Griffith, 1997; Griffith et al., 1997). Одновременно было определено, что наряду со способностью модифицировать рост кристаллов льда, эти белки проявляют глюканазную и хитиназную активность, а часть является тауматин-подобными белками. Это позволило авторам сделать заключение о двойственной роли антифризных белков ржи, участвующих как в обеспечении морозоустойчивости, так и в устойчивости к патогенезу. Один из АФБ был выделен и биохимически очищен, и было показано, что он имеет как эндохитиназную, так и антифризную активность. Этот протеин изменял форму кристаллов льда и проявлял относительно низкий уровень температурного гистерезиса. Для сравнения, очищенная эндохитиназа табака, теплолюбивого растения, как было показано, не обладает антифризной активностью. К тому же, эндохитиназа, глюконаза и тауматинподобные белки, присутствующие в клеточном экстракте неакклиматизированной ржи, также не обладают

антифризной активностью. Таким образом, антифризная активность не является неотъемлемым свойством этих белков.

В растениях арабидопсиса и рапса были обнаружены белки, обогащенные аланином или глицином, имеющие альфа-спиральную структуру (Kurkela and Franck, 1990; Gilmour et al., 1992; Orr et al., 1992). Эти белки имеют определенную гомологию с антифризными белками арктических рыб (Sccott et al., 1987). Конформационное соответствие данных молекул антифризных белков кристаллографической решетке льда позволяет им адсорбироваться на поверхности эмбриональных кристаллов вдоль оси их преимущественного роста путем конкурентного образования водородных связей. Наращиваемая поверхность кристаллов льда блокируется антифризными молекулами от доступа молекул воды не только непосредственно в местах водородного связывания антифризов; благодаря обилию гидрофобных метильных групп экранируются также центры кристаллизации, не принимающие участия в образовании водородных связей ( Аванов, 1990). Очевидно, такие небольшие аланин-богатые белки выполняют специализированную криопротекторную функцию. Уменьшая точку замерзания, они способствуют переохлаждению без образования кристаллов льда. Большинство подобных белков имеют альфа-спиральную структуру, высокую гидрофильность, остаются в растворе после кипячения (Hincha and Smitt, 1992; Boothe et al., 1997). Но прямых подтверждений участия продуктов индуцированных генов в качестве криопротекторов для увеличения морозостойкости растительных клеток долго не могли получить. Первые данные о растительных белках, непосредственно вовлеченных в защиту изолированных тилакоидов от повреждения при замораживании-оттаивании, были опубликованы более 20 лет

назад (Volger and Heber, 1975). Достаточно убедительное подтверждение участия индуцированного холодом белка было получено в работе немецких ученых (Sieg et al., 1996), которые выделили из листьев закаленных растений капусты белок с молекулярной массой 7 кД, защищающий тилакоиды листьев шпината от повреждений при замораживании-оттаивании.

Другая группа исследователей выделила и очистила белки corl5am -продукт гена сог15а, регулируемого холодом из A. thaliana (Gilmour et al., 1996). Зрелый белок с молекулярной массой 9,4 кД является очень гидрофильным, он остается растворимым после кипячения, более чем 60% состава аминокислот в нем приходится на Ala, Lys, Glu и Asp, и в нем 4 раза встречаются повторы, состоящие из 13 аминокислот (Thomashow, 1994).

С помощью конструирования трансгенных растений было выявлено, что хлоропласты, содержащие COR15am в трансгенных растениях, были на 1°С - 2°С устойчивее к холодовому воздействию, чем хлоропласты из растения дикого типа, не содержавшие COR 15 am. Холодовая акклимация увеличивает устойчивость хлоропластов примерно на 6°С. Более того, эффект COR15am не ограничивается только хлоропластами. Протопласты, выделенные из листьев неакклиматизированных трансгенных растений, которые продуцируют COR15am, были примерно на 1°С устойчивее при замораживании при температуре в границах от -4°С до -8°С, чем протопласты, изолированные из неакклиматизированных растений дикого типа.

В работе Артуса и сотр. (Artus et al., 1996) показано, что экспрессия COR15a увеличивала криостабильность плазматических мембран. Это заключение было сделано из опытов, где выживаемость протопластов вычислялась с помощью

прижизненного окрашивания флуоресцин диацетатом. Этот метод показывает характеристики полупроницаемости мембран протопластов. Было выявлено, что в отличие от холодовой акклимации, которая увеличивала выживаемость протопластов в границах температур от -2°С до -8°С, экспрессия COR15am увеличивала выживаемость только в границах температур от -4°С до -8°С. Возможно, объяснение этого факта может заключаться в том, что экспрессия COR15a может предотвратить некоторые виды мембранных разрушений, но не все. Как было отмечено выше, преобладающей формой мембранных разрушений в границах температур от -2°С до -4°С, вероятно, является лизис, вызванный растяжением, тогда как в границах температур от -4°С до -8°С происходит переход липидов из ламеллярной фазы в гексогональную II фазу, также вызывающий разрыв мембраны (Steponkus and Webb, 1992; Steponkus et al., 1993). Таким образом, возможно, что экспрессия COR15a ограничивает разрушение мембраны, вызванное формированием гексогональной II фазы липидов при низких температурах, но не способна предотвратить лизис мембраны вследствие растяжения. Однако сами механизмы, при помощи которых COR15a стабилизирует мембраны от индуцируемого холодом лизиса, еще не ясны. Вероятно, полипептид cor 15 am не функционирует как криопротектант, но может служить медиатором биохимических или физиологических изменений, т.е. видоизменять экспрессию гена, состав липидов и т.д., влияя на морозоустойчивость как на уровне органелл, так и на уровне клеток (Artus et al., 1996).

Репарация обратимых повреждений с последующим востановлением обмена веществ и роста начинается при возвращении растения в нормальные условия среды. При этом

темпы устранения структурных и физиолого-биохимических нарушений будут зависеть от степени повреждения растительного организма. При небольших повреждениях растения затрачивают на их устранение короткое время, что дает им возможность быстрее переключать программу наследственной информации на нормальный обмен веществ. При глубоких нарушениях процессы репарации займут значительную часть периода вегетации, что в сильной степени скажется на продуктивности растений.

На репарацию большое влияние оказывают условия внешней среды, в которых после действия неблагоприятного температурного фактора находится растительный организм. Так, сильная инсоляция после заморозка может привести к гибели растения вследствие нарушения согласованности между процессами транспирации, работой устьиц и сосудисто-проводящей системы стебля (Курец, 1975). Свет после действия низкой или высокой температуры ускоряет фотоокислительные реакции, оказывающие ингибирующий эффект на физиолого-биохимические процессы (Дроздов и др., 1984; Винтер, 1981; Петров и др., 1975). По некоторым данным, линейный рост пшеницы после заморозка быстрее восстанавливается в темноте, чем на свету. Есть также сведения о том, что глубокие повреждения, вызванные действием на растения высокой температуры, усиливаются в период репарации в световых условиях (Петров, 1975).

В последействии неблагоприятного фактора у растений наблюдаются на уровне жизненных процессов, как правило, следующие реакции: угнетение, стимуляция и вхождение в норму (Альтергот, 1985). В зависимости от напряженности стрессового фактора угнетение или стимуляция этих процессов имеют разную продолжительность. При неглубоком обратимом воздействии

неблагоприятным фактором краткосрочное угнетение сменяется активацией процессов жизнедеятельности. При глубоких нарушениях жизненных функций процессы репарации сопровождаются длительным угнетением с последующей краткосрочной стимуляцией обменных процессов или даже отсутствием последней.

В основе стимуляции и угнетения функциональной активности растительного организма лежат биохимические изменения. Ими могут быть накопление токсических соединений, оказывающих ингибирующее влияние, или же, наоборот, накопление соединений стимулирующего действия. Вопросы эти изучены недостаточно. Однако предполагают, что в основе этого лежат нарушения сопряженности физиологических и биохимических функций.

Таким образом, функции белков холодового шока весьма разнообразны. Часть их них представляет собой ферменты, участвующие в преобразовании физико-химических свойств плазматических мембран, а также в фосфорилировании митохондриальных белков. Часть белков повышает стабильность мембран и цитоскелета. Некоторые антифризные белки, определяющие морозоустойчивость, влияют также на устойчивость к фитопатогенам. Но самую большую группу регулируемых холодом белков составляют гидрофильные белки, имеющие альфа-спиральную структуру и выполняющие криопротекторную функцию. Вода, связываемая в виде гидратных оболочек этими молекулами, не замерзает и не транспортируется, оставаясь в клетке. Таким образом клетки защищаются от внутриклеточного льда и чрезмерного обезвоживания.

1.4. Регуляция экспрессии индуцируемых холодом генов растений

Исследование молекулярных механизмов развития и регуляции холодового закаливания необходимо для управления данным процессом. Действие низкой температуры вызывает в растительной клетке различные нарушения. Поэтому растению для выживания при низких температурах необходимо задействовать многочисленные механизмы, важнейшим из которых, вероятно, является синтез БХШ с весьма разнообразными функциями. Как показали исследования, разрушения, вызванные холодом, в основном являются следствием индуцируемой холодом дегидратации (Steponkus et al., 1993). Таким образом, устойчивость на воздействие холодом и дегидратацией могут иметь некоторые общие механизмы. Действительно, было показано, что некоторые растения повышают свою устойчивость к воздействию холода в ответ на дегидратацию (Guy et al., 1992; Siminovitch, Cloutier, 1983). Молекулярная основа перекрестной защиты еще не полностью ясна, но предполагают, что она включает экспрессию общих генов. Например, некоторые COR-гены (cold regulated) арабидопсиса, которые кодируют гидрофильные белки, такие как COR 15а и COR78, индуцируются во время холодовой акклимации. Этот процесс, посредством которого растения увеличивают свою устойчивость к воздействию низких положительных температур, также регулируется водным дефицитом (Thomashow, 1993). Предполагают, что экспрессия этих и других COR генов может способствовать растительной клетке противостоять разрушительному эффекту дегидратации, вызванному действием низких температур и высушиванием. На самом деле, недавние

исследования показали, что экспрессия гена COR15a, который кодирует белок, направленный на защиту хлоропластов, усиливает их устойчивость к низким температурам за счет воздействия на плазматическую мембрану (Artus et al., 1996).

Важная роль в регуляции реакции сопротивления растений к неблагоприятным условиям среды принадлежит фитогормону абсцизовой кислоте (АБК). Накопление в тканях АБК вызывают различные стрессовые воздействия, приводящие к проявлению защитного торможения метаболизма, такие как засуха (Imai et al., 1995), водный дефицит (Bray, 1988), засоление (Dunlap, Binzel, 1994), осмотический шок (Gomes et al., 1988), заражение фитопатогенными грибами (Шакирова и др., 1990). Увеличение уровня АБК ограничивает потерю воды путем транспирации за счет уменьшения раскрытия устьиц (Leung, Giraudat, 1998). Многие изменения генной экспрессии, которые происходят в ответ на действие низкой температуры и высушивание, также сопряжены с изменением уровня абсцизовой кислоты (Welin et al., 1994; Bray, 1993). Участие АБК в ответе растений на холодовое воздействие показано несколькими наблюдениями. Так, низкотемпературная обработка (4°С/2°С) растений арабидопсиса приводила к временному трехразовому увеличению уровня эндогенного АБК (Lang et al., 1994). Подобное изменение уровня АБК наблюдалось также у других видов (Lalk and Dorffling, 1985; Daie and Campbell, 1981; Chen et al., 1983; Guy and Haskell, 1988). Далее, применение АБК может индуцировать увеличение холодостойкости растения арабидопсиса, выращиваемого при комнатной температуре (22°С) (Mantyla et al., 1995). Показано также, что у растений арабидопсиса (aba-1), не способных к эндогенному синтезу АБК, холодовая акклимация с помощью низкотемпературной обработки ослаблена

(Mantyla et al., 1995;Heino et al., 1990), а воздействие АБК на АБК-нечувствительный мутант арабидопсиса (abil) не приводит к индукции холодовой акклимации (Mantyla et al., 1995). Некоторые белки, синтез которых регулируется низкой температурой, индуцируются и при воздействии эндогенной АБК (Cattavelli, Bartels, 1992; Palva, 1994). Однако не всегда обязательно присутствие АБК для синтеза белков холодового шока. Например, индуцируемый холодом и высушиванием белок арабидопсиса LTI78 в ответ на холодовое воздействие синтезируется в одинаковых количествах как в растении дикого типа, так и в АБК-мутантных растениях, что говорит об АБК-независимой холодовой индукции этого белка. Нужно также отметить, что LTI78 также накапливается в ответ на воздействие экзогенным АБК и высушивание, но в значительно меньшем количестве. Также интересно то, что при высушивании в АБК-мутантных растениях накопление LTI78 было намного меньше, чем в растении дикого типа, показывая тем самым, что частично индукция этого белка высушиванием может быть опосредована АБК (Nordin et al., 1991). Такое же поведение было отмечено для других индуцируемых холодом генов арабидопсиса: kinl, cor6.6/kin2, cor47/rdl7 (Kurkela, Borg-Franck, 1992; Horvath et al., 1993; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1993; Iwasaki et al., 1997).

Таким образом, в регуляции экспрессии индуцируемых холодом генов АБК имеет очень важное значение, но не является строго обязательным компонентом, что указывает на сложный характер регуляции и наличие более чем одного пути передачи стрессового сигнала.

Исследования, направленные на выяснение принципов регуляции экспрессии генов при низких температурах, базируются на способности промоторных конструкций обеспечивать

низкотемпературную экспрессию репортерного гена или в трансгенных растениях, или в пробах транзиентной экспрессии (Schneider et al., 1997).

С этой целью у озимого рапса Brassica napus был выделен и секвенирован соответствующий клон этого растения bnll5 (White et al., 1994). Изучали промоторный участок данного гена, получая делеционные мутанты по этому участку и трансформируя ими растения ярового рапса. В результате данного исследования был выяснен основной элемент низкотемпературной регуляции (LTR), который представляет собой прямой повтор из 8 пар оснований: TGGCCGAC. Этот участок, обнаруженный и в промоторе гена холодового шока А. thaliana cor 15а, подобен повторяющейся последовательности G/TA/GCCGACA/TT/A-A/T, присутствующей в промоторных участках трех индуцируемых низкими температурами генов из А. thaliana: rabí8 (Lang and Palva, 1992), Ш78 и Ш65 (Nordin et al., 1993).

В работе других авторов (Yamagushi-Shinozaki and Shinozaki, 1994) показано, что в промоторной последовательности гена rd29A, выделенного из арабидопсиса и также индуцируемого холодом, есть коровая последовательность из 9 пар оснований TACCGACAT внутри повтора в 20 пар оснований. Таким образом, присутствие идентичных или сходных участков в промоторах генов, регулируемых низкими температурами, из двух видов растений А. thaliana и В. napus еще раз указывает на вовлеченность элемента из 8 пар оснований GGCCGA в низкотемпературную экспрессию данного гена.

Одной из основных целей исследований, проводимых в настоящее время, является определение того, как растение распознает действие низкой температуры и водного дефицита и

каким образом это влияет на изменение генной экспрессии. Важное значение для приближения к решению этой проблемы имело обнаружение в промоторах генов cor 15а и сог78 так называемого С-повтора/DRE (dehydration responsive element), участвующего в активации сог-генов в ответ на воздействие низкой температуры, засухи и абсцизовой кислоты (Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994;Baker et al., 1994; Jiang et al., 1996; Shinwaki et al., 1998).

В дальнейшем был выделен и охарактеризован клон кДНК А. thaliana, который кодирует С-повтор-связывающий фактор CBF1. Этот белок активирует транскрипцию С-повтор-содержащих генов-репортеров у дрожжей. Кроме того, транскрипты CBF1 накапливаются в ответ на низкие температуры у A. thaliana. Эти результаты свидетельствуют о том, что CBF1 является транскрипционным фактором, участвующим в контроле уровня экспрессии генов COR, что, в свою очередь, обеспечивает устойчивость растений к морозу (Thomashow, 1996; Jaglo-Ottosen et al., 1998). CBFl-белок имеет ДНК-связывающий мотив, обнаруженный также в EREBP1 (etylene responsive element) табака (Ohme-Takagi, Shinshi, 1995), участвующем в экспрессии генов в ответ на воздействие этиленом, и в APETALA2 арабидопсиса - АР2, участвующем в морфогенезе цветов (Jofuku et al., 1995). Транскрипционный фактор, участвующий в низкотемпературной регуляции активности cor-гена, обнаружен и у кукурузы (Kusano et al., 1995).

Недавно идентифицированы еще два гена, имеющие высокий уровень гомологии с геном CBF1, названные CBF2 и CBF3, соответственно (Medina et al., 1999). Эти два гена, также, как и CBF1, связывающийся с вовлеченным в низкотемпературную

регуляцию промоторным элементом CCGAC, кодируют белки, содержащие последовательности, связывающиеся с ДНК APETALA2, участвующей при морфогенезе цветка. Гены CBF2 и CBF3 связаны с CBF1, образуя кластер на хромосоме 4. Высокий уровень гомологии между ними, их тандемное расположение и тот факт, что все они имеют одинаковую транскрипционную ориентацию, дает основание говорить об их общем происхождении. Они индуцируются очень быстро низкими температурами, но в отличие от большинства охарактеризованных регулируемых холодом растительных генов, они не индуцируются абсцизовой кислотой и высушиванием.

У арабидопсиса охарактеризованы еще два взаимосвязанных клона кДНК (RCI2A и RCI2B), соответствующие генам, экспрессия которых транзиентно индуцируется низкими, незамораживающими температурами (Capel et al., 1997). RCI2A и RCI2B кодируют маленькие (54 аминокислоты) высокогидрофильные белки. Они показывают сходство с белками, кодируемыми генами ячменя и пырея {Lophophyrum elongatum), регулируемыми различными стрессовыми условиями. Как и у большинства охарактеризованных индуцируемых холодом генов растений, экспрессия RCI2A и RCI2B также вызывается абсцизовой кислотой и денатурацией, но не является общим ответом на стрессы, т.к. не индуцируется солевым стрессом и анаэробными условиями. Более того, низкие температуры способны индуцировать экспрессию RCI2A и RCI2B в АБК-дефицитном и АБК-нечувствительном генетическом фоне, показывая, что существует как АБК-зависимый, так и АБК-независимый пути регуляции низкотемпературного ответа этих двух генов.

Для большинства генов, индуцируемых АБК, было показано также наличие в промоторной области консервативного участка, PyAGCTGGC, действующего как АБК-чувствительный элемент и названного ABRE ( ABA responsive element) (Marcotte et al., 1989; Mundy et al., 1990; Broy, 1991). Была клонирована кДНК, кодирующая ДНК-связывающий белок, специфически связывающийся с этим консервативным участком и было показано, что данный белок содержит основной домен/лейцин-замковую структуру (Guiltinan et al., 1990; Oeda et al., 1991).

Более полно цис-, транс-активные элементы регуляции были изучены для гена RD29a арабидопсиса. Из растений арабидопсиса после воздействия на них холодом и высушиванием была получена библиотека кДНК, из которой в дальнейшем были выделены два клона (DREB1 и DREB2) (Qiang Liu et al., 1998), кодирующие белки, специфически взаимодействующие с DRE-последовательностью в промоторной области гена RD29a. В трансгенных растениях сверхэкспрессия как DREBla, так и DREB2a вызывает активацию экспрессии гена RD29a в условиях отсутствия стрессового воздействия и такие растения проявляют устойчивость к морозу и высушиванию. В свою очередь, индукция DREBla вызывается исключительно низкой температурой, a DREB2a - высушиванием и солевым воздействием, и ни один из них не индуцируется АБК. Авторы предположили, что белки DREBla и DREB2a участвуют как транс-активирующие элементы в двух различающихся путях регуляции экспрессии гена RD29a, вызываемых низкой температурой с одной стороны и высушиванием и воздействием высоких концентраций солей с другой.

Таким образом, активность работы генов БХШ, соответственно, синтез этих БХШ, зависит от ряда факторов. Несомненная роль в регуляции экспрессии генов БХШ принадлежит АБК , хотя обнаружены

ЮССИ&СКА*

государственна,

гены, не чувствительные к изменениям в концентрации этого фитогормона. Транскрипционный контроль экспрессии генов БХШ осуществляется рядом цис- и транс-активных элементов. К цис-регулирующим факторам можно отнести последовательность АССОАС, встречающуюся во многих промоторах сог-генов, а к транс-регулирующим факторам, соответственно, СВБ1 и СВР2.

* * *

Суммируя данные, приведенные в данной главе, можно сказать, что проявление устойчивости растений к стрессовым воздействиям зависит от сочетания неспецифического ответа со специфическим и в этом заложена возможность адекватного реагирования живых систем на изменения в окружающей среде и развитие этой способности в эволюции. Знание ключевых звеньев неспецифической устойчивости крайне необходимо для осуществления целенаправленного практического повышения устойчивости растений к неблагоприятным воздействиям, которым растения подвергаются в естественных условиях произрастания. Одним из таких неблагоприятных факторов среды, вызывающих значительные изменения в метаболизме растительных клеток, являются низкие температуры. По всей видимости, устойчивость растений к низким температурам представляет собой генетически закрепленный признак, проявляющийся при экстремальных температурных условиях (Глянько, 1996). Воздействие высокими или низкими температурами, сила которого не превышает компенсаторных возможностей растения, сопровождается изменениями в структурно-функциональной организации клеток, тканей, органов, направленными на выживание растительного организма в экстремальных условиях. Исследование

механизмов устойчивости растений к низким положительным и отрицательным температурам предполагает выяснение молекулярно-генетических закономерностей, определяющих природу термоустойчивости отдельных видов растений, выявление физиолого-биохимических особенностей действия физиологически активных соединений в процессе воздействия экстремального фактора, раскрытие механизмов переноса сигнала и путей регуляции процесса закаливания. За последние годы получены интересные данные о работе промоторов, активность которых зависит от действия низких температур, о пост-транскрипционном контроле и о передаче сигнала. Однако еще нет ясного объяснения на биохимическом и молекулярном уровнях, как развивается процесс холодового закаливания. Очень мало накоплено данных о функциях генов, регулируемых холодом. Исследования в этих направлениях представляются крайне важными и интересными для понимания механизмов устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

Для исследований были взяты следующие виды растений: сем. крестоцветные {Brassicaceae):

капуста огородная {Brassica oleracea) репа {Brassica г ара) рапс {Brassica napus) горчица белая {Sinapis alba) дайкон {Raphanus sativus, subsp. acanthiformis) редис посевной {Raphanus sativus, subsp. sativus,convar. radicula)

редька {Raphanus sativus, subsp. sativus, convar. niger) хрен деревенский {Armoracia rusticana) рыжик посевной {Camelina sativa)

пастушья сумка обыкновенная {Capsella bursa-pastoris) сем. пасленовые {Solanaceae)\

томат {Lycopersicon esculentum) сем. зонтичные (.Apiaceae):

морковь обыкновенная {Daucus carota) сем. сложноцветные {Asteraceae):

мать-и-мачеха обыкновенная {Tussilago farfara) сем. лютиковые (Ranunculaceae):

ветренница лесная {Апетопа sylvestris) сем. маковые (Papaveraceae):

чистотел большой {Chelidonium majus) сем. бобовые (Fabaceae):

клевер посевной {Trifolium pratense)

сем. злаки (Роасеае barnhart)

рожь посевная {Seeale cereale)

Объектом исследования в опытах по экспрессии гена БХШ была капуста посевная Brassica oleracea L. сорта Амагер 611. Все образцы были взяты из листьев контрольных и опытных растений на стадии появления 4-го листа.

2.2 Выделение и очистка ДНК растений

ДНК из 2-х суточных проростков, выращенных в лабораторном термостате при 24±2°С, выделяли фенольно-детергентным методом (Graham, 1978). Семена перед проращиванием предварительно обрабатывали 70%-ным этанолом для удаления экзогенной микрофлоры. Растительный материал растирали в ступке с жидким азотом до порошкообразного состояния. Затем его переносили в колбу, добавляли 5-10 объемов (по отношению к исходной навеске растительного материала) экстрагента, содержащего 100 мМ трис-HCl (pH 8,0), 20 мМ ЭДТА, 1%-ный ДДС натрия и прогревали на водяной бане при 60°С в течение 10 мин. Охладив суспензию до комнатной температуры, к ней добавляли 5 М NaC104 до конечной концентрации 1 М. Экстракцию ДНК с ее одновременной депротеинизацией осуществляли, встряхивая гомогенат с равным объемом (по отношению ко всему объему гомогената) смеси 80%-ного свежеперегнанного фенола (доведенного до рН8,0 с помощью многократных насыщающих встряхиваний с трис-HCl, рН8,0), хлороформа и изоамилового спирта, взятых в соотношении 25:24:1, в течение 40 - 60 мин на встряхивателе типа 358S (Elpan, Польша).

Смесь расслаивали центрифугированием при 2500 об/мин в течение 20 мин в препаративной центрифуге К-70Э ГДР). Верхний

водно-солевой слой, содержащий нуклеиновые кислоты, отбирали пипеткой с широким оплавленным кончиком и повторно депротеинизировали в течение 20 мин. Затем смесь центрифугировали и ДНК осаждали, перенося водно-солевую фазу в колбу с двумя объемами охлажденного 96%-ного этанола. Спиртовой осадок ДНК собирали центрифугированием, промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола, подсушивали и растворяли в минимальном объеме 1 х ТЕ буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1 (рН8,0) и 1 мМ ЭДТА.

Примеси высокомолекулярной рРНК удаляли переосаждением ЫаС1. Для этого, препараты ДНК растворяли в небольшом объеме дистиллированной воды и добавляли 1/3 объема 5 М ЫаС1. После 4 -6 часов на холоде формировался осадок рРНК, который удаляли в скоростной центрифуге К-24 (МЬ\¥, ГДР) при 12000 об/мин в течение 20 мин. Надосадок, содержащий ДНК и низкомолекулярную РНК, осаждали двумя объемами этанола. Остаточное количество соли удаляли промывкой осадка 70%-ным этанолом. При необходимости, когда требовалась высокая чистота препарата, низкомолекулярную РНК разрушали обработкой РНКазой. Для этого прогретую в течение 10 мин при 90°С на водяной бане (для денатурации примесей ДНКаз) РНКазу А добавляли к раствору ДНК до конечной концентрации 10 мкг/мл. После 1 часа инкубации при 37°С РНКазу удаляли депротеинизацией с равным объемом свежеперегнанного фенола (рН8,0) и смесь расслаивали в центрифуге К-23 ГДР) при 2500 об/мин в течение 15 мин.

ДНК осаждали 2 объемами этанола.

Концентрацию ДНК в образце определяли по оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, СССР) или по флуоресценции с красителем Hoechst 33258 с помощью ДНК-минифлуориметра (Hoefer Scientific Instruments, США).

2.3. Выделение РНК

Тотальную РНК выделяли, используя гуанидинтиоцианатный буфер (Boothe et al., 1995). Листья растирали в жидком азоте и переносили в буфер, содержащий 4М гуанидинтиоцианат, 2%-ный саркозил, 50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 1%-ный р-меркаптоэтанол. Затем добавляли 0,2 объема 10%-ного ДДС-натрия, 0,1 объема 2М ацетата натрия (рН 4,0). После депротеинизации смесью фенола и хлороформа РНК осаждали изопропанолом. Осадок РНК растворяли в воде, предварительно автоклавированной с добавлением диэтилпирокарбоната (0,05%), и переосаждали 6М хлоридом лития. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, СССР).

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК

Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с некоторыми модификациями. Колонией E.coli, несущей какую-либо плазмиду (список использованных в работе штаммов E.coli, плазмидных и фагмидных векторов, а также рекомбинантных конструкций дан в разделе 2.19 "Реактивы и материалы", засевали 100 мл среды Лурия-Бертани (LB) (1%-ный бакто-триптон, 0,5%-ный дрожжевой экстракт и 1%-ный NaCl), содержащей 100 мкг/мл ампициллина или другие необходимые

антибиотики (и 12,5 мкг/мл тетрациклина для штамма XL 1-Blue) и выращивали при 37°С без встряхивания в течение ночи. Часть полученной ночной культуры переносили, обеспечив ее 100 -кратное разбавление, в колбу со свежеприготовленной средой LB, содержащей необходимые антибиотики. Наращивание продолжали до достижения оптической плотности, соответствующей

о

концентрации 2 - 3 х 10 клеток/мл (обычно 14-16 час).

Затем клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге К-23 (Германия). Осадок суспендировали в 8 мл 10%-ной сахарозы. После добавления 2 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (10мг/мл в 0,25 М трис-НС1, рН7.8) выдерживали 10 мин при 0°С и добавляли 2 мл 0,5 М ЭДТА. Лизис проводили с помощью смеси детергентов бридж 58 -дезоксихолат натрия (конечные концентрации 1% и 0,4%, соответственно). Осторожно перемешивали в течение 5 мин пока раствор не становился вязким и прозрачным. Полученный лизат осветляли в ультрацентрифуге Ж-62 (СССР) в бакет-роторе РБЗО в течение 45 мин при 29000 об/мин. Осторожно сливали супернатант, не допуская перетекания вместе с ним иногда образующегося вязкого придонного слоя, содержащего хромосомную ДНК, и добавляли к нему 1/5 объема 5 М NaCl и 1/4 объема 50%-го полиэтиленгликоля 6000 (Humphreys et al., 1975). При 0°С в холодильнике в течение нескольких часов формировался осадок плазмидной ДНК, содержащий загрязняющее количество РНК, белка, полисахаров.

Сформировавшийся осадок собирали в центрифуге К-23 при 3000 об/мин в течение 10 мин. После растворения осадка в 1 х ТЕ перед этапом депротеинизации проводили удаление остаточного полиэтиленгликоля встряхиванием с хлороформом и расслаиванием

в центрифуге К-23 при 2500 об/мин в течение 5 мин. Депротеинизацию проводили встряхиванием с равным объемом смеси хлороформа и 80 %-ого свежеперегнанного фенола (доведенного до рН8,0 5М NaOH), взятых в соотношении 1:1 в течение 10 мин (здесь и далее при упоминании хлороформа имеется ввиду его смесь с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1). Затем проводили центрифугирование в центрифуге К-23 при 2500 об/мин в течение 20 мин. Верхний водно-солевой слой, содержащий ДНК, отсасывали и подвергали повторной депротеинизации по той же схеме. Эту процедуру повторяли до тех пор пока не исчезала интерфаза, состоящая из денатурированного белка. Затем супернатант встряхивали с равным объемом хлороформа с последующим центрифугированием и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Спиртовой осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола и хлороформа и растворяли в соответствующем объеме 1 х ТЕ.

При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Birnboim, Doly, 1979; Kondo et al., 1991). Для этого тефлоновыми палочками переносили бактериальные колонии в микроцентрифужные пробирки и тщательно суспендировали в 100 мкл раствора I, содержащего 50 мМ трис-НС1 (рН7,8) и 20 мМ ЭДТА. После суспендирования добавляли 200 мкл раствора II, содержащего 1%-ный раствор ДДС натрия и 0,2 М NaOH. После осторожного перемешивания через 5 мин добавляли 150 мкл 5 М ацетата калия. Затем, тщательно перемешав, центрифугировали в течение 5 мин. Осторожно отбирали осветленную жидкость, не захватывая осадок и липидный слой, и осаждали ДНК двумя объемами этанола при -70°С. После

растворения в минимальном объеме препарат был готов для его анализа агарозным гель-электрофорезом.

2.5. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК

Клетки E.coli штамма XL 1-Blue, несущие фагмиды, наращивали в течение 1 час в 10 мл TYP среды с ампициллином (100 мкг/мл) и тетрациклином (12,5 мкг/мл) при 37°С при интенсивном перемешивании. После этого проводили суперинфекцию хелперными фагами М13К07 или R408 (затем в случае с фагом М13К07 наращивали в течение 1 час и добавляли канамицин (100 мкг/мл)) и оставляли встряхиваться в течение ночи при тех же условиях. Клетки E.coli удаляли центрифугированием в центрифуге К-24 в течение 15 мин при 12000 об/мин. Отбирали супернатант, содержащий фаговые частицы хелперного фага и фагмиды и проводили с ним повторное аналогичное центрифугирование для максимального удаления клеток E.coli. К заключительному супернатанту добавляли 1/4 объема фаг-осаждающего раствора (3,75 М ацетат аммония, 20%-ный ПЭГ 6000). После тщательного перемешивания выдерживали при 0°С в течение 1-3 час для формирования осадка. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием в течение 15 мин при 12000 об/мин в центрифуге К-24. Осадок ресуспендировали в 400 мкл 1 х ТЕ буфера и проводили удаление остаточного полиэтиленгликоля встряхиванием с хлороформом и расслаиванием в центрифуге К-23 при 2500 об/мин в течение 5 мин. Белки удаляли многократной депротеинизацией смесью фенол-хлороформ до полного исчезновения интерфазы. Одноцепочечную ДНК, содержащуюся в верхней водно-солевой фазе осаждали двумя

объемами этилового спирта в присутствии ацетата аммония (конечная концентрация до 1 М). Избыточную соль в осадке удаляли обработкой 70%-ным этанолом. Растворяли осадок в 10 - 20 мкл дистиллированной и деионизованной воды. После вышеописанной обработки одноцепочечная ДНК была готова к проведению секвенирующих реакций. В отдельных случаях контроль качества и количества выделенных препаратов осуществляли аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле как описано ниже в разделе 2.6.

2. б.Расщепление ДНКрестрикционными эндонуклеазами

Перечень использованных рестрикционных эндонуклеаз приведен в разделе 2.19 "Реактивы и материалы". Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками, также указанными в этом же разделе. Время рестрикции варьировало от 1 час до 1 суток в зависимости от цели эксперимента и количества препарата ДНК. Для каждого конкретного фермента применялась наиболее оптимальная для него температура инкубации (4°С, 30°С, 37°С, 50°С и 65°С). Для предотвращения испарения расщепление ДНК при повышенных температурах (50°С и 65 °С) проводили под слоем вазелинового масла. При комбинированном расщеплении двумя или более рестрикционными эндонуклеазами или выбирали буферные растворы наиболее оптимально соответствующие особенностям действия всех используемых ферментов или проводили последовательную инкубацию расщепляемой ДНК с разными ферментами, начиная с требующего более низкую ионную силу.

При препаративном расщеплении полноту рестрикции проверяли аналитическим электрофорезом соответствующих аликвот реакционной смеси в 0,8% - 2,0%-ных агарозных гелях.

В экспериментах по молекулярному клонированию рестрикционные эндонуклеазы инактивировали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ с последующей обработкой смесью фенола и хлороформа для термостабильных рестрикционных эндонуклеаз, или же прогревом 15 мин при 65°С. По завершению рестрикции к препаратам гидролизованной ДНК добавляли буфер для нанесения, содержащий 6-ти кратный ТАЕ-(для агарозных гелей) или ТВЕ-буфер (для полиакриламидных гелей), 50%-ный глицерин и маркерные красители ксиленоловый синий и бромфеноловый синий, и фракционировали их в агарозных или полиакриламидных гелях.

2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 0,4 -2,0%-ные агарозные гели или же 4 - 12%-ные полиакриламидные гели. Источниками питания служили приборы фирмы Bio-Rad (США) модели 250/2.5 или модели ЕС-103 (Е-С Apparatus Corporation, США). Отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот двигались от анода к катоду.

Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах подводного типа GNA-200 (Pharmacia, Швеция) или аналогичных приборах с различными размерами гелевых пластин (стандартная,

14 х 14 см; мини, 8x9 см; широкая мини, 12 х 9 см), изготовленных из оргстекла в инструментальной мастерской Уфимского научного центра РАН. Толщина гелей варьировала незначительно от 2 до 4 мм. Гребенки для формирования колодцев имели толщину 1,5 мм и отличались шириной зубчиков (от 3 мм до 8 мм). В качестве буферной системы использовали ТАЕ-буфер, содержащий 40 мМ трис-ацетата (рН7,6) и 2 мМ ЭДТА. При разделении фрагментов ДНК крупного размера (от 50 - 70 тпн до 2 тпн) электрофорез проводили в 0,4 - 1,0%-ных гелях агарозы, соответственно, при напряжении 2 - 3V на см длины геля в течение 12-18 час. При разделении мелких фрагментов ДНК (от 200 пн до 1 тпн) использовали 1 - 2%-ные гели агарозы с градиентом напряжения 8 -10V на см длины геля. В последнем случае повышенный градиент напряжения способствовал сокращению времени электрофореза и уменьшению диффузии (Sealey, Southern, 1982).

Полиакриламидный гель-электрофорез проводили в вертикальных приборах, изготовленных в инструментальной мастерской. В качестве электрофоретического буфера использовали трис-боратный буфер (рН8,3), содержащий 90 мМ трис-основание (гидроксиметиламинометан), 9 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА. Толщину используемых гелей определяли специальные спейсеры, изготовленные из тефлона (1,5 мм) или майлара (0,5 мм). Размер зубчиков гребенки, формирующих ячейки для нанесения препаратов, варьировал от 3 до 8 мм.

В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК фага лямбда после расщепления рестрикционными эндонуклеазами Есо911 (или ее изошизомером рестриктазой BstEll), Hindlll и Pstl. Маркерные фрагменты ДНК маленького размера получали

расщеплением плазмиды рВЮ22 рестрикционными эндонуклеазами А1и\, М?/Л, а также использовали 123 пн маркерную лестницу.

После окончания электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (5 мкг/мл) в течение 20 мин. Одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК фагмид окрашивали акридиновым оранжевым (30 мкг/мл) в течение 30 мин и затем отмывали водопроводной водой в течение 1 час. Флуоресценцию нуклеиновых кислот наблюдали в ультрафиолетовом свете при длине волны 302 нм в трансиллюминаторе ТМ-36. Одно- и двуцепочечные нуклеиновые кислоты, окрашенные бромидом этидия, светились оранжево-красным светом, тогда как при окрашивании акридиновым оранжевым двуцепочечные молекулы имели зеленый цвет, а одноцепочечные - оранжево-красный. Гели фотографировали фотоаппаратом "Зенит-11" на пленку "Микрат 300" через оранжевый светофильтр ОС-12 (для бромистого этидия) и желто-зеленый светофильтр ЖЗС-5 (для акридинового оранжевого).

2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

Препаративный гель-электрофорез использовали для разделения различных форм плазмидной и фагмидной ДНК, рестрикционных фрагментов ДНК после их расщепления рестрикционными эндонуклеазами с целью их последующей элюции и очистки. Основными отличиями препаративного электрофореза от аналитического являлись толщина гелевой пластины и размер колодцев для нанесения препарата ДНК. В зависимости от количества разделяемого препарата толщина геля могла достигать 3

мм (для полиакриламидных гелей) или 1 см (для агарозных гелей) при ширине ячейки или колодца до 12 см.

2.9. Полимеразная цепная реакция

Фрагмент ДНК, содержащий ген БХШ капусты, был получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (МсРЬегвоп е1 а1., 1995) на амплификаторе производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы ТегтиБ aquaticus фирмы "Биомастер". При этом были использованы следующие праймеры: 5'-ААТСТСАОАОАССААСААОАА-3' и

5'-ТТСООСТСАААТТГСООА-31. Реакция была выполнена в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1, 16,6 мМ (№14)2804, 1,5 мМ М§С12, 0,01% Т\уееп-20, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 1 единицу ДНК-полимеразы. ПЦР проводили по схеме: начальная денатурация (94°С, 4 мин); 30 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация - 94С, 45 сек; 2) отжиг -50°С, 1 мин; 3) синтез - 72°С, 1 мин. Затем проводили инкубацию при 72°С в течение 7 мин.

Амплификацию фрагментов гена БХШ различных видов растений, относящихся к семейству крестоцветных, проводили с использованием праймеров следующего состава:

5 '-СвАС ААвОСС А АОвАТОСТОС-З' и

5'-ОССООТСТТСТССТТСАСО-З'. Состав реакционной смеси не отличался от вышеописанного. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация (94°С, 4 мин); 30 циклов амплификации: 1) денатурация - 94°С, 45 сек; 2) отжиг - 53°С, 1 мин; 3) синтез - 72°С, 1 мин; элонгация - 72°С в течение 4 мин.

Результаты амплификации оценивались путем проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле. В качестве маркера размера фрагментов использовали ДНК фага X, расщепленную рестрикционной эндонуклеазой Вб1Е II.

2.10. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей

Элюцию фрагментов ДНК из агарозного геля после препаративного электрофореза проводили с помощью легкоплавкой агарозы ("Ше81апс1ег 1979). Просматривая окрашенный бромистым этидием агарозный гель в ультрафиолетовом трансиллюминаторе с длиной волны 302 нм, перед искомым фрагментом ДНК в геле вырезали соответствующую лунку. В образовавшееся пространство заливали 1,5%-ную легкоплавкую агарозу (тип VII), содержащую бромистый этидий и повышенную (1,2 х кратную) концентрацию ТАЕ-буфера, необходимую для торможения движущихся фрагментов ДНК при входе в зону легкоплавкой агарозы и за счет этого концентрирования молекул ДНК, приходящихся на единицу объема геля. После застывания легкоплавкой агарозы и превращения ее в гель продолжали электрофорез в том же направлении, периодически контролируя процесс перехода фрагмента ДНК из обычной агарозы в легкоплавкую с помощью трансиллюминатора. По завершению этого процесса кусочек легкоплавкой агарозы, содержащий требуемый фрагмент ДНК, вырезали и помещали в пробирку, соответствующую объему вырезанного кусочка геля. К расплавленной на водяной бане при 65°С легкоплавкой агарозе добавляли равный объем дистиллированной воды и раствор 7,5 М ацетата аммония до конечной концентрации 0,5 М, встряхивали с фенолом и

расслаивали в центрифуге К-24 (либо в микроцентрифуге MPW-50 (Польша)) при 12000 об/мин в течение 5 мин. Фенол удаляли встряхиванием с равным количеством хлороформа и последующим центрифугированием. Водно-солевой слой, содержащий ДНК, осаждали 2 объемами этанола при температуре -70°С. Сформировавшийся осадок собирали центрифугированием, растворяли в соответствующем объеме воды и качество и количество препарата проверяли аналитическим электрофорезом в 0,8% - 2%-ных агарозных гелях в зависимости от размера элюируемых фрагментов ДНК.

Электроэлюцию фрагментов ДНК из препаративного агарозного геля проводили в специально изготовленной камере из оргстекла с платиновыми электродами, расположенными на близком расстоянии друг от друга. Вырезанный кусочек агарозного геля, содержащий требуемый фрагмент ДНК, помещали в диализную трубку Visking, наполняли ее 0,5 х кратным трис-ацетатным буфером, герметизировали специальными зажимами для диализных трубок фирмы Pierce (США). Подготовленную таким образом диализную трубку располагали между платиновыми электродами и подавали напряжение (20 В/см). Во избежании образования нежелательного градиента рН буфер в элюционной камере постоянно перемешивался с помощью двух магнитных мешалок и двух магнитиков, покрытых тефлоновой оболочкой. Процесс элюции контролировали, периодически просматривая диализную трубку в ультрафиолетовом трансиллюминаторе ТМ-36. Для продолжения электроэлюции диализную трубку с гелем возвращали в камеру, строго следя за ее правильной ориентацией (т.е. прежней ориентацией) относительно электродов. По завершению элюции на короткое время (15 сек) менялась полярность электродов, что было

необходимо для выведения обратно в буфер ДНК, сорбировавшейся в процессе элюции на внутренней поверхности диализной трубки со стороны катода.

Элюцию ДНК из препаративного полиакриламидного геля проводили путем растирания с помощью листа тефлона и плоского тефлонового пестика вырезанного кусочка геля, содержащего искомый фрагмент ДНК. Полученную кашицеобразную массу переносили в соответствующую пробирку, добавляли 5 объемов экстрагента (0,5 М ацетат аммония и 0,1%-ный ДДС натрия) и равный объем щелочного фенола (рН8,0) и встряхивали в течение ночи. После расслоения в центрифуге (или микроцентрифуге) ДНК из водно-солевого слоя осаждали 3 объемами этанола. Для формирования осадка его выдерживали при температуре -70°С в течение 2-6 час.

2.11. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры (блоттинг)

Перенос фрагментов ДНК из гелей на нитроцеллюлозные фильтры проводили по методу Саузерна (Southern, 1975) с некоторыми модификациями (Meinkoth, Wahl, 1979). Гель для денатурации ДНК выдерживали в растворе, содержащим 0,3 М NaOH и 1,5 М NaCl в течение 30 мин при слабом встряхивании. Затем гель помещали в нейтрализующий раствор (1 М трис-HCl, (pH 7,5) и 1,5 М NaCl) на 30 мин и переносили в ванночку со специальной подставкой, покрытой фильтровальной бумагой Whatman ЗММ. На гель накладывали точно вырезанный по размеру геля и предварительно смоченный в 2 х SSC (0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия) нитроцеллюлозный фильтр ВА85 с диаметром пор

0,45 мкм фирмы Schleicher und Schuel, не допуская неплотного контакта фильтра с гелем и образования пузырьков воздуха в этих местах. Затем мембранный фильтр сверху накрывали слоем бумаги ЗММ, стопкой обыкновенной фильтровальной бумаги и придавливали небольшим грузом (0,5 - 1,0 кг в зависимости от площади блоттируемого геля). В ванночку наливали раствор, содержащий 6 - 10 х SSC и оставляли на 4 - 12 час. Перенос ДНК из геля на нитроцеллюлозный фильтр в такой системе происходил за счет капиллярных сил с током жидкости от смоченного листа фильтровальной бумаги к сухим. После завершения переноса ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах фиксировали в течение 2 час при 80°С в вакуумном сушильном шкафу.

Процедура переноса ДНК на нейлоновые фильтры Hybond N практически не отличалась от приведенной выше, за исключением способа фиксации ДНК на фильтре, которую в этом случае проводили, или облучая фильтр ультрафиолетовым светом в течение 3-5 мин или подвергая воздействию микроволнами в микроволновой печи Плутон (Goldstar - Россия) при мощности 800Вт в течение 2 мин.

2.12. Нозерн-блот и дот-блот анализ

Для нозерн-блот анализа РНК фракционировали в 1%-ном агарозном геле, содержащем формальдегид в концентрации 2,2 М (Sambrook et al., 1989). Затем РНК переносили на нитроцеллюлозный фильтр 0,22 мкм ("Schleicher & Schuell", ФРГ) и гибридизировали с меченной Р-пробой, содержащей ген белка холодового шока капусты.

При изучении интенсивности специфической генной экспрессии в тканях или культурах клеток была разработана процедура гибридизации в точках на нитроцеллюлозных фильтрах большого количества образцов РНК в специальном приборе (НПО "Вектор", Новосибирск) с возможностью последующей количественной оценки сканирующей денситометрией.

Для этого нитроцеллюлозный фильтр нужного размера (величина пор 0,22 или 0,45 микрон) промокали в воде, затем вымачивали в 20 х SSC 1 час при комнатной температуре. 2 листа фильтровальной бумаги Whatman ЗММ, смоченные в 20 х SSC, помещали на поверхность прибора, где создается вакуум. Влажный нитроцеллюлозный фильтр помещали поверх фильтровальных листов, удаляя воздушные пузырьки под фильтром, затем накрывали верхнюю плату прибора с лунками. В лунки прибора наливали 10 х SSC и пропускали через нитроцеллюлозный фильтр. Образцы РНК перед нанесением на нитроцеллюлозный фильтр инкубировали 15 мин при 68°С в растворе, содержащем формамид, формальдегид и SSC. Затем, разбавив обработанные образцы РНК двумя объемами 20 х SSC, пропускали через нитроцеллюлозный фильтр. Связанную на фильтре РНК фиксировали, прогревая 2 часа при 80°С в вакуумном шкафу. Гибридизировали фильтр с меченным зондом как описано в разделе 2.13.

2.13. Радиоактивное мечение препаратов ДНК

Радиоактивное мечение препаратов ДНК осуществляли в системе in vitro с помощью различных ферментов в зависимости от преследуемых при этом целей. Так, концевое мечение фрагментов ДНК по 5'-концу проводили используя у-[32Р] АТФ и

полинуклеотидкиназу фага Т4 (Maxam, Gilbert, 1977). Для повышения эффективности мечения предварительно удаляли 5'-концевой остаток фосфорной кислоты обработкой щелочной фосфатазой. Дефосфорилирование проводили в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (рН9,0), 10 мМ MgCl2, 10 мМ спермидина и 1 мМ ZnCb при 37°С в течение 30 мин в присутствии 0,1 единиц фермента. Щелочную фосфатазу удаляли двукратной фенольной обработкой. Затем препарат ДНК осаждали этанолом и центрифугировали в настольной микроцентрифуге модели 320а (ПНР) 5 мин при 12000 об/мин. Осадок, отмытый от фенола 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в требуемом объеме бидистиллированной воды. Затем добавляли киназный буфер (50 мМ трис-HCl (рН7,6), 10 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотрейтола, 1 мМ спермидина), 1 - 2 МБк у-[32Р] АТФ и 2 единицы полинуклеотидкиназы фага Т4. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ и фермент удаляли фенольной обработкой. Затем препарат осаждали этанолом, а невключившуюся метку удаляли или переосаждением этанолом или гель-фильтрацией на сефадексе G-25.

Мечение 3'-концов препаратов ДНК осуществляли, используя Кленовский фрагмент ДНК полимеразы I и соответствующий [ос-32Р] дНТФ (Sambrook et al., 1989). Этот метод применялся для заполнения комплементарными нуклеотидами выступающих 5'-концов фрагментов ДНК, образующихся после ее обработки определенными рестриктазами. Реакцию проводили в буфере ТМ (10 мМ трис-HCl (рН 8,0), ЮмМ MgCl2), используя для мечения 1 -3 МБк радиоактивного дезоксинуклеотидтрифосфата и 2 единицы фермента, при температуре 37°С в течение 20 - 30 мин. Препарат

осаждали этанолом и непрореагировавший изотоп удаляли как описано выше.

Для проведения блот-гибридизации эффективное мечение зондов осуществляли методом случайного праймирования. С этой целью рекомбинантную плазмиду предварительно расщепляли по уникальному сайту подходящей рестрикционной эндонуклеазы (например, Ряй), находящемуся в векторной последовательности, затем денатурировали полученную линейную конструкцию и после отжига случайных гексануклеотидных праймеров метили дАТФ[сс-32Р] с помощью Кленовского фрагмента ДНК полимеразы I. Невключившуюся радиоактивную метку удаляли переосаждением этанолом.

2.14. Блот-гибридизация ДНК

Гибридизацию фильтров с иммобилизованной на них ДНК с радиоактивно мечеными зондами проводили при 65°С в течение 18 -24 час в гибридизационном буфере, содержащем 6 х 88С, 5 х раствор Денхардта (0,02% бычьего сывороточного альбумина, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% фиколла), 0,1% ДДС натрия (ОепЬаг^ Б. Т., 1966). Для снижения уровня неспецифической гибридизации проводили предгибридизацию в течение 4-6 час при тех же условиях с добавлением предварительно обработанной ультразвуком денатурированной одноцепочечной ДНК из спермы лосося, (в концентрации 100 мкг/мл гибридизационной жидкости). Если в качестве зонда использовали ДНК пробы, то их предварительно денатурировали кипячением в течение 5 мин.

Фильтры высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку РМ-В в течение 1-7 суток. Все манипуляции с

рентгеновской пленкой проводили или в полной темноте или при освещении красным светом.

2.15. Трансформация компетентных клеток E.coli

плазмидной ДНК

Трансформацию компетентных клеток E.coli рекомбинантной ДНК проводили по методу Коэн (Cohen S. N., 1972). К 0,2 мл суспензии клеток добавляли 10 мкл лигазной смеси и инкубировали 1 час на льду. Подвергнув клетки тепловому шоку при 42°С в течение 2 мин инкубировали их еще 1 час при 37°С, предварительно разбавив в 10 раз свежей средой LB. Затем по 0,5 мл суспензии равномерно распределяли на поверхности 1,5%-ного агара, приготовленного на среде LB и разлитого в чашки Петри. После подсушивания агара потоком стерильного воздуха в ламинарном боксе чашки выдерживали в перевернутом положении при 37°С в течение 18-24 час.

Для трансформации к 200 мкл только что размороженной на льду суспензии компетентных клеток добавляли 20 мкл лигазной смеси (25 мМ трис-HCl (рН7,8), 10 мМ MgCl2,4 мМ ДТТ, 1 мМ АТР) и инкубировали при 0°С в течение 30 мин. Затем проводили тепловой шок при 42°С на водяной бане в течение 2 мин, затем суспензию разбавляли LB-средой и инкубировали при 37°С при слабом покачивании в течение 1 час. После инкубации суспензию клеток кратковременно осаждали в микроцентрифуге и осадок суспендировали в 100 мкл среды LB. Затем эту суспензию равномерно распределяли стерильным стеклянным шпателем по поверхности 1,5%-го агара, приготовленного на LB-среде с ампициллином (100 мкг/мл) и тетрациклином (15 мг/мл), разлитого

в чашки Петри. Жидкости давали возможность впитаться и чашки Петри затем помещали в перевернутом виде в термостат (37°С) на 18 час. При использовании в качестве селективного маркера гена р-галактозидазы (колонии, содержащие ненарушенный ген имеют голубой цвет, а при инсерции вставки в ген |3-галактозидазы колонии приобретают белый цвет) по поверхности агаризованной среды предварительно растирали 50 мкл X-gal (20 мг/ мл в диметилформамиде) и 80 мкл раствора изопропил-Р-тио-D-галактозидазы (IPTG, 24 мг/ мл). Колонии, выросшие после трансформации (в последнем случае - белого цвета), стерильной платиновой петлей переносили на другие чашки Петри с той же средой для подращивания с целью последующего выделения плазмидной ДНК для анализа.

2.16. Секвенирование ДНК ферментативным методом

Секвенирование проводили ферментативным дидезокси методом Сэнгера (Sanger et al., 1977) с помощью наборов для секвенирования секвеназой и Т7 ДНК полимеразой фирм United States Biochemicals и Pharmacia, соответственно. Реакционные терминирующие смеси (по 100 мкМ всех дезоксинуклеотид трифосфатов (дНТФ) и по 5 мкМ каждого дидезоксинуклеотид трифосфатов (ддНТФ)) для построения второй цепи ДНК готовили также отдельно из ультрачистых дезокси- и дидезоксинуклеотид трифосфатов фирмы Pharmacia.

На первом этапе проводили отжиг одноцепочечной матрицы со специальным "универсальным" праймером для секвенирования (+)-цепи фагмид. Для этого в полипропиленовой реакционной пробирке смешивали 2 мкл 5-ти кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН7,5;

100 мМ М§С12; 250 мМ ЫаС1), 1 мкл праймера (0,5 пкмоль/мкл), 3 мкл дистиллированной воды и 4 мкл одноцепочечной фагмидной матрицы. Данную смесь выдерживали в течение 2 мин при температуре 65°С и затем позволяли остывать в течение получаса до температуры приблизительно 30°С.

Второй этап состоял в мечении, заключавшемся в построении короткого участка второй цепи в неоптимальных условиях работы фермента в течение 3-5 мин. Неоптимальные условия представляли собой комнатную температуру вместо 37°С и пониженную концентрацию трех нерадиоактивных дезоксинуклеотид трифосфатов (по 1,5 мкМ дГТФ, дТТФ, дЦТФ) и полное отсутствие "холодного" дАТФ, вместо которого было добавлено необходимое

л л

количество (10 мкКи) радиоактивного а-[ Р] дАТФ ("Изотоп", Санкт-Петербург).

Третий этап - продолжение построения второй цепи ДНК в условиях специфического терминирования с помощью ддНТФ, прерывающих дальнейшее присоединение нуклеотидов. Для этого четыре равные части содержимого реакционной пробирки переносили в заранее подготовленные и обозначенные символами в, А, Т, и С пробирки с 2,5 мкл соответствующих терминирующих смесей в каждой. В микроцентрифужной пробирке, обозначенной "А" находилась реакционная смесь "А" (0,05 мМ дТТФ; 0,05 мМ дГТФ; 0,005 мМ дАТФ; 0,2мМ ддАТФ), в пробирку "О" 2 мкл смеси "С' (0,05 мМ дТТФ; 0,005 ММ дГТФ; 0,05 ММ дАТФ; 0,1 ММ ддГТФ), в пробирку "С" 2 мкл смеси "С" (0,05 ММ дТТФ; 0,05 ММ дГТФ; 0,05 ММ дАТФ; 0,005 ММ ддЦТФ), в пробирку "Т" 2 мкл смеси "Т" (0,005 ММ дТТФ; 0,05 ММ дГТФ; 0,05 ММ дАТФ; 0,3 ММ ддТТФ). Смеси выдерживали в течение 15-20 мин при температуре 37°С. По завершению реакции добавляли в каждую

пробирку 4 мкл стоп-раствора (95%-ный формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05%-ный бромфеноловый синий и 0,05%-ный ксиленоловый синий FF). Для денатурации цепей (исходной и вновь построенной) пробирки прогревали при 80 - 85 °С в течение 2 мин непосредственно перед нанесением препаратов на секвенирующий гель.

2.17. Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях

Электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций проводили в 6%-ном полиакриламидном геле (акриламид:метилен бисакриламид - 19:1) в TBE буфере с 7 М мочевиной (служащей для предотвращения образования возможной вторичной структуры одноцепочечных ДНК) в приборе вертикального типа Макрофор (Pharmacia - LKB, Швеция) при 55°С и мощности 60 Вт. Перед заливкой геля стекла готовились соответствующим образом - стекло с вырезом обрабатывалось раствором у-метакрилоксипропилтриметоксисилана, а другое -(специальная термоплата, позволяющая поддерживать одинаковую температуру во время электрофореза по всему гелю и исключающая эффект "улыбки") раствором 1%-го диметилдихлорсилана в изо-пропаноле. За счет этих обработок достигались полимеризация геля к акриловым группам на стекле с вырезом и недопущение за счет этого его растрескивания при сушке и уменьшения адгезии к термоплате, соответственно. За счет клиновидной формы геля происходило равномерное изменение по длине геля силы тока и тем самым достигалось постоянное замедление движения более мелких

фрагментов, что приводило к увеличению разрешающей способности как метода, так и прибора.

Гели готовили по следующей схеме. К рассчитанному объему акриламида добавляли кристаллическую мочевину до конечной концентрации 7М и 0,1 объема 10 х кратного трис-боратного буфера. Полученный раствор затем фильтровали, дегазировали, добавляли необходимое количество персульфата аммония и TEMED, перемешивали и заливали между стеклами, входящими в комплект прибора Macrophor (LKB, Швеция). Термоплату предварительно обрабатывали раствором диметилдихлорсилана, обеспечивающего хорошее отделение геля после завершения электрофореза. Полированные стекла обрабатывали раствором

у-метакрилоксипропилтриметоксисилана в изо-пропаноле, обеспечивающего приклеивание геля к стеклу во время полимеризации полиакриламида.

Перед нанесением образцов лунки тщательно промывали буфером и проводили преэлектрофорез в течение 30 мин при напряжении около 1000V. Термостатированную плату подключали к ультратермостату и прогревали до 55°С, что обеспечивало равномерный нагрев геля и исключало искривление полос при электрофорезе. После этого лунки вновь промывали буфером и с помощью тонкого капилляра наносили пробы в объеме 1 мкл на дорожку. Электрофорез проводили при напряжении 1500 - 2000V. После завершения электрофореза стекло с приклеенным гелем отделяли от термоплаты с помощью специально изготовленного клина из оргстекла. Мочевину из геля вымывали 10%-ной уксусной кислотой в течение 1 час. Затем его сушили в термостате при 80°С и радиоавтографировали на пленку РМ-В или Hyperfilm f3-max. Пленку экспонировали в течение 1-7 суток при комнатной

температуре. Пленку обрабатывали в проявителе "Рентген 2", фиксировали в стандартном закрепителе БКФ-2, промывали водопроводной и дистиллированной водой и сушили.

2.18. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерной программы DNASIS (Hitachi Software Engineering Со, Япония), а также с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc." (США) с использованием персонального компьютера Пентиум И. Нуклеотидные последовательности рДНК растений, а также векторные последовательности для анализа были взяты из опубликованных статей, получены по электронной почте из Европейского банка нуклеотидных последовательностей (EMBL European Bioinformatic Institute, Гинкстон, Великобритания), из EMBL Nucleotide Sequence Database, Release 41, декабрь 1994 (EMBL European Bioinformatic Institute), а также из базы данных " DNA Data", датированной январем 1998 г. фирмы "DNASTAR, Inc." или посредством Интернета в обновляемых версиях "GenBank".

2.19. Реактивы и материалы

лл ___

Радиоактивные изотопы [а- Р] дАТФ, [а- Р] дЦТФ, ("Изотоп" С. Петербург)

Дезокси АТФ, дезокси ЦТФ, дезокси ГТФ, дезокси ТТФ (Pharmacia, Швеция)

Дидезокси АТФ, дидезокси ЦТФ, дидезокси ГТФ, дидезокси ТТФ (Pharmacia, Швеция)

ДНК-лигаза фага Т4 (Pharmacia, Швеция)

Кленовский фрагмент ДНК полимеразы1 E.coli (NEN, США)

Рестрикционные эндонуклеазы -ВатШ (GVGATCC) MBI Fermentas, Литва Eco9\l (GVGTNACC) MBI Fermentas, Литва EcoKl (GVAATTC) MBI Fermentas, Литва ZscoRII (VCCWGG) Bethesda Research Laboratories, США Hindlll (AVAGCTT) MBI Fermentas, Литва Hpall (CVCGG) Сибэнзим, Новосибирск Mspl (CVCGG) MBI Fermentas, Литва Mval (CCVWGG) MBI Fermentas, Литва Pstl (CTGCAVG) MBI Fermentas, Литва Smal (CCCVGGG) MBI Fermentas, Литва АТФ (Serva, ФРГ) Кальций хлористый Merck, ФРГ Магний хлористый Serva, ФРГ Цинк хлористый Aldrich, США

Трис (гидроксиэтиламинометан) "тризма" или "Sigma 7-9" (Sigma, США)

ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль) (Serva, ФРГ)

Ампициллин, тетрациклин, канамицин моносульфат (Serva, ФРГ) Лизоцим (Serva, ФРГ)

Дрожжевой экстракт, Бакто-пептон, Бакто-агар, Бакто-триптон (Difco, США)

Дезоксихолат натрия (Serva или Merck, ФРГ)

Бридж 58 (Serva, ФРГ)

Полиэтиленгликоль 6000 (Fluka, Швейцария или Merck, ФРГ)

Агароза, тип II (Sigma, США)

Агароза для электрофореза ДНК (Bio-Rad, США)

Агароза для электрофореза ДНК (Serva, ФРГ)

Агароза легкоплавкая (Bio-Rad, США)

Акриламид, метиленбисакриламид (Serva, ФРГ)

TEMED (тетраэтилметилендиамин) Fluka, Швейцария

Бромфеноловый синий Serva, ФРГ

DTT (дитиотреитол) Serva, ФРГ

Диэтиламиноэтилцеллюлоза DE 52, хроматографическая бумага ЗММ Whatmann, Англия

Нитроцеллюлозные фильтры (ВА83 и ВА85 Schleicher & Shuell, ФРГ)

Спермидина гидрохлорид Calbiochem, США Фиколл 400 (Pharmacia, Швеция) Этидиум бромид (Fluka, Швейцария)

X-gal (5 бромо 4 хлоро 3 индолил J D галактозид Boehringer Manheim, ФРГ

IPTG (изопропил ¡ тиогалактопиранозид) Boehringer Manheim, ФРГ

SDS (додецилсульфат натрия) Serva, ФРГ

Ткань Miracloth (Calbiochem, США)

Рентгеновская пленка РМ-В (Тасма, Казань)

Рентгеновская пленка РА-1 (ГосНИИ "Химфотопроект", Казань)

Остальные реактивы отечественного производства "Реахим"

Бактериальные штаммы. При проведении экспериментов по субклонированию, выделению плазмидной и однонитевой ДНК использовали штаммы E.coli НВ101, JM109, XL 1-Blue, NM522.

Векторы и использованные конструкции.

рВЯ322, рВЮ27, рОЕМ32^+),рОЕМЗгГ(-), рОЕМ5гГ(+), рОЕМ5гГ(-)

Субклонирование фрагментов вставки осуществляли в плазмиде рОЕМЗг£(+) ("Рготе§а").

Составы использованных стандартных растворов

1 х8БС 1 х раствор Денхардта

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Баймиев, Андрей Ханифович

выводы

1. Клонированный ген белка холодового шока капусты состоит из 600 п.н. В структуре гена имеются 3 экзона (первый в 56 п.н., второй в 68 п.н., третий в 73 п.н.), разделенные двумя интронами размером 283 п.н. и 120 п.н. Экзоны являются ОС - богатыми (содержание таких пар достигает 70%), интроны - АТ - богатыми (доля таких повторов составляет около 70%).

2. Методом ПЦР показана специфичность данного гена для геномов растений семейства крестоцветных.

3. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов генов БХШ растений семейства крестоцветных выявлена значительная консервативность их структуры и гомология в пределах данного семейства.

4. Показано, что экспрессия гена БХШ капусты индуцируется низкими температурами, а также высушиванием и обработкой АБК. Наиболее сильная индукция экспрессии генов БХШ капусты происходит при воздействии на растения кратковременной отрицательной температуры (30 мин) с дальнейшей экспозицией (до 2-х недель) при низкой положительной температуре.

5. Аминокислотный состав БХШ капусты, выведенный на основе нуклеотидной последовательности, характеризуется высоким содержанием аланина (около 20%), лизина (около 13%) и глицина (около 11%), распределенных неравномерно по длине белка и концентрированных в трех аланин-глицин -богатых участках. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности показал общую гидрофильность белка, при наличии трех относительно гидрофобных участка, совпадающих с аланин-глицин-богатыми фрагментами белка.

На основании полученных результатов можно предположить, что высокая степень гидрофильности белкового продукта изученного нами гена БХШ является важной составляющей в его криопротекторной функции при формировании холодоустойчивости крестоцветных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Низкотемпературное воздействие вызывает значительные изменения в метаболизме растений, в том числе синтез стрессовых белков, который показан также и при других неблагоприятных воздействиях. Функции большинства из них точно не установлены. Среди них есть ферменты, переносчики липидов, актин-подобные белки, способствующие стабилизации мембран (Schaffer, Fischer, 1988; Gibson et al., 1994; Hughes, Dunn, 1996; Danyluk et al., 1996). Некоторые антифризные белки, определяющие морозоустойчивость, влияют также на устойчивость к фитопатогенам. Большую группу БХШ составляют гидрофильные белки, имеющие альфа-спиральную структуру и выполняющие криопротекторную функцию (Kurkela, Franck, 1990; Gilmour et al., 1992; Orr et al., 1992). К таким белкам относится и белок холодового шока капусты, ген которого изучен в нашей работе. Как и многие другие подобные гены, ген БХШ капусты csp 5 индуцируется холодом, высушиванием и экзогенным воздействием АБК. Но в отличие от большинства изученных генов БХШ арабидопсиса, индукция csp 5 в ответ на холодовое воздействие происходит значительно быстрее. По всей видимости, функции этого гена связаны с быстрым ответом на низкотемпературный стресс. Одной из первичных неспецифических реакций растительного организма на стресс является накопление АБК (Chen et al., 1983; Lang et al., 1994). Низкотемпературный стресс также вызывает увеличение эндогенного содержания АБК (Daie, Campbell, 1981; Chen et al., 1983). В свою очередь быстрое накопление АБК стимулирует развитие такого защитного механизма растений к стрессам, как синтез стрессовых белков. Наши опыты также демонстрируют безусловное участие АБК в стрессовом ответе растений на низкотемпературное воздействие. Очевидно, АБК способствует предадаптации растений к стрессовым воздействиям за счет мобилизации АБК-индуцированных защитных механизмов. Тот факт, что уровни индукции мРНК сэр 5 как при воздействии экзогенной АБК, так и при высушивании являются примерно равными и несколько меньше, чем при холодовом воздействии, в сочетании с данными о значительных различиях в изменении эндогенного содержания АБК у растений при высушивании и холодовом стрессе, позволяет говорить о различном характере участия АБК в механизмах индукции при этих стрессах. Синтезируемые при холодовой акклимации многих растений белки холодового шока, выполняя различные функции, отличаются как по молекулярной массе, так и по аминокислотному составу, а БХШ со сходными функциями имеют гомологию в своей структуре. Это показано нами при изучении распространенности последовательностей, гомологичных гену БХШ капусты, в геномах растений из различных таксономических групп, а также растений семейства крестоцветных, к которому принадлежит капуста. Возникновение устойчивости к холоду является очень сложным процессом и, вероятно, существует множество путей, прямых и непрямых, по которым БХШ могут влиять на его развитие. Полученные нами данные позволяют выяснить определенные аспекты механизма развития устойчивости к низкотемпературному стрессу.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Баймиев, Андрей Ханифович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Аванов А.Я. Биологические антифризы и механизм их активности // Молекулярная биология. - 1990. - Т. 24, №3. - С. 581597.

Алехина Н.Д., Соколова С.А. Изменение изозимного состава глутаматдегидрогеназы в связи с температурой выращивания растений // Докл. АН СССР. - 1974. - Т. 216. №3. - С. 682-685.

Альтергот В.Ф. Действие повышенной температуры на растения в эксперименте и в природе. М. Наука. 1981. 56 с.

Буколова Т.П., Воловик Н.В., Кравцова Л.И. Изменение жирнокислотного состава фосфолипидов узлов кущения озимых злаков в процессе закаливания // Физиология и биохимия культурных растений. - 1992. - Т.24. №1. - С. 69-73.

Глянько А.К. Температурный стресс: механизмы термоустойчивости, рост, развитие и продуктивность растений // Сельскохозяйственная биология. - 1996. - №3. - С. 3-19.

Джанумов Д.А., Кузанян P.C. Элекрофоретический спектр белков мембран хлоропластов контрастных по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы // Физиология растений. - 1987. - Т. 34. №2. -С. 365-372.

Дроздов С.Н., Курец В.К., Титов А.Ф. Терморезистентность активно вегетирующих растений // Л., 1984.

Дроздов С.Н. Влияние температуры внешней среды на холодо-и теплоустойчивость активно вегетирующих растений // Терморезистентность и продуктивность сельскохозяйственных растений. Петрозаводск, - 1984. - С.З.

Карасев Г.С., Астахова Н.В., Райхман Л.А., Трунова Т.И. Действие низкой положительной температуры на содержание белков

и ультраструктуру клеток огурца и томата // Физиология растений. -1995. - Т. 42. №6. - С. 855-861.

Каримова Ф.Г., Жуков С.Н. Влияние цАМФ на фосфорилирование белков листьев гороха при низкой положительной температуре // Доклады Академии наук. - 1991. Т. 316. №5. - С. 12771279.

Касперска-Палач А. Механизмы закаливания травянистых растений. // В сб.: Холодостойкость растений .М., - 1983. - С. 112-123.

Курец В.К. Воспроизведение заморозков в искусственных условиях. В сб.: Заморозки и урожай. М., - 1975, 4(48). - С. 10-26.

Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. - Т. 37. №1/2. - С. 66-91.

Петрова О.В., Угаров Г.С. Эколого-физиологические аспекты адаптации организмов к низким положительным температурам. // Якутск, 1988.

Шакирова Ф.М., Хайруллин P.M.. Ямалеев A.M. Сравнительный анализ содержания лектина и абсцизовой кислоты в проростках пшеницы, инфицированной корневыми гнилями. Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений. Применение в физилогии растений и экологии // Уфа, - 1990. - С. 38-41.

Anderson J.V., Li Q.B., Guy C.L. Structural organization of the spinach endoplasmic reticulum-luminal 70-kilodalton heat-shock cognate gene and expression of 70-kilodalton heat-shock genes during cold acclimation // Plant Physiol. - 1994. - V. 104, N4. - P. 1359-1370.

Artus N.N., Uemura M., Steponkus P.I., Gilmour S.J., Thomashow M.F. Constitutive expression of cold-regulated Arabidopsis thaliana corl5a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93. - P. 13404-13409.

Asghar R., Fenton R.D., De Mason D.A., Close T.J. Nuclear and Cytoplasmic Localization of Maize Embryo and Aleurone Dehydrin // Protoplasma. 1994. - V.177. - P.87-94.

Baker J., Steele C., Dure I. Sequence and characterization of 6 lea proteins and their genes from cotton // Plant Mol. Biol. 1988. - V. 11. - P. 277-291.

Baker S.S., Wilhelm K.S., Thomashow M.F. The 5-region of Arabidopsis thaliana corl5a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression // Plant Mol. Biol. - 1994. -V 24. - P. 701-713.

Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic. Acids Res. - 1979. - V. 7. -P. 1513.

Boothe J.G., de Bens M.D., Johnson-Flanagan A.M. Expression of a low-temperature-induced protein in Brassica napus // Plant Physiol. -1995. -V. 108. - P. 795-803.

Boothe J.G., de Beus M.D., Johnson-Flanagan A.M. Expression of a Low-Temperature-Induced Protein in Brassica napus // Plant Physiol. -1995. -V. 108. -P.795-803.

Bray E.A. Drought- and ABA-induced changes in polypeptide and mRNA accumulated in tomato leaves // Plant Physiol. - 1988. - V.88, N4. - P.1210-1214.

Bray E. A. Regulation of gene expression by endogenous ABA during stress // In: Physiology and Biochemistry. (Davies W. J., Jones H. G., Eds) Abscisic Acid: BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK. - 1991. -P. 81-98.

Brush R.A., Griffith M., Mlynarz A. Characterization and quantification of intrinsic ice nucleators in winter rye (Secale cereale) Leaves // Plant Physiol. - 1994. - V.104. - P.725-735.

Boothe J.G., Sonnichsen F.D., de Beus M.D., Johson-Flanagan A.M. Purification, characterization and structural analysis of a plant low-temperature-induced protein // Plant Physiol. - 1997. - V. 113, N2. - P. 367-376.

Cabane M., Calvet P., Yincens P., Boudet A.M. Characterization of chilling-acclimation-related proteins in soybean and identification of one as a member of the heat shock protein (HSP 70) family // Planta. - 1993. -V. 190, N3.-P. 346-353.

Capel J., Jarillo J.A., Martinez-Zapater J.M. Two homologous low-temperature-inducible genes from Arabidopsis encode highly hydrophobic proteins // Plant physiol. - 1997. - V. 115, N 2. - P. 569-576.

Cattivelli L., Bartels D. Molecular Cloning and characterization of cold-regulated genes in barley // Plant Physiol. - 1990. - V.93. - P. 15041510.

Cattavelli L., Bartels D. Biochemistry and molecular biology of cold-inducible enzymes and proteins in higher plants // University Press, Cambridge,UK. - 1992. - V. 49. - P. 267-288.

Chen THH, Gusta L.V., Abscisic acid-induced freezing tolerance in cultured plants cells // Plant Physiol. - 1983. - V. 73. - P. 71-75.

Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. Involvment of abscisic acid in potato cold acclimation // Plant Physiol. - 1983. - V.71, N2. - P. 362-365.

Clewell D.B., Helinsky D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in E.coli purification and induced convertion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1969. - 62, N4. - P. 1159-1162.

Close J. Dehydrins: Testing the link between DHN genes and freezing tolerance in barley timothy // Plant Physiol. - 1996. - V. Ill, No. 2. Suppl. - P. 28.

Close T. J., Kortt A.A., Chandler P. M. A cDNA-based comparison of dehydration-induced proteins (dehydrins) in barley and corn // Plant Mol. Biol. - 1989. - V. 13. - P. 95-108.

Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. - V.69, N8. - P.2110-2114.

Danyluk J., Carpentier E., Sarhan F. Identification and characterization of a low temperature regulated gene encoding an actin-binding protein from wheat. // FEBS Lett. - 1996. - V. 389. N. 3. - P. 324327.

Daie J., Campbell W.F., Response of tomato plants to stressfull temperatures // Plant Physiol. - 1981. - V. 67. - P. 26-29.

Denhardt D.T. A membrane-filter technique for detection of complementary DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1966. - V.23, N5. - P. 641-652.

Drobnis E.Z., Crowe L.M., Berger T., Anchordoguy T.J., Overstreet J.W., Crowe J.H. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model // J. Exp. Zool. -1993. - V.265, N4. - P. 432-437.

Duman J., Horwath K. The role of hemolymph proteins in the cold tolerance of insects // Annu. Rev. Physiol. - 1983. - V. 45. - P. 261-270.

Dure L., Crouch M., Harada J., Ho D.T.-H., Mundy J., Quatrano R., Thomas T., Sung Z.R. Common amino acid sequence domains among the Lea proteins of higher plants // Plant Mol. Biol. - 1989. - V. 12. - P. 475486.

Dunlap J.R., Binzel M.A. Is indole-3-acetic acid part of the signal mechanism regulating salinity stress in tomato // Plant Physiol. - 1994. -V.105, N1. - P.24.

Dunn M.A., Goddard N.J., Zhang L., Pearce R.S., Hughes M.A. Low-temperature-responsive barley genes have different control mechanisms // Plant Mol. Biol. - 1994. - V.245. - P.879-888.

Dure L., Crouch M., Harada J., Ho D.T.-H., Mundy J., Quatrano R., Thomas S., Sung Z.R. Common amino acid sequence domains among the lea proteins of higher plants // Plant Mol.Biol. - 1989. - V.12. - P.475-486.

Ellis R.J. Proteins as molecular chaperones // Nature. - 1987. - 328, No.l.-P. 228-232.

Gibson S., Arondel V., Iba K., Somerville C. Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3-desaturase from Arabidopsis // Plant Physiol. - 1994. - V. 106. - P. 1615-1621.

Gilmour S.J., Artus N.N., Thomashow M.F. cDNA Sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 18. - P. 13-21.

Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance // Science. - 1998. - V. 280. N 5360. - P. 104-106.

Gilmour S.L., Thomashow M.F. Cold acclimation and cold-regulated gene expression in ABA mutants Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. - 1991, N17, - P. 1233-40.

Gomez J., sanches-Martinez D., Stiefel V. et al. A gene induced by the plant hormone abscisic acid in response to water stress encodes a glycine-rich protein //Nature. - 1988. - V. 334, N6179. - P. 262-264.

Goodwin W., Pallas J.A., Jenkins G.I. Transcripts of a gene encoding a putative cell wall-plasma membrane linker protein are specifically cold-induced in Brassica napus // Plant Mol. Biol. - 1996. - V. 31. N. 4.-P. 771-781.

Guo W., Ward R.W., Thomashow M.F. Characterization of a cold-regulated wheat gene related to Arabidopsis cor47 // Plant Physiol. - 1992.

- V.100. -P.915-922.

Guy C.L. Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1990. -V. 41. - P. 187-223.

Guy C.L., Haskell D. Induction of freezing tolerance in spinach is associated with the synthesis of cold acclimation induced proteins // Plant Physiol. - 1987. - V. 84. - P. 872-878.

Guy C.L., Haskell D. Detection of polypeptides associated with the cold acclimation process in spinach // Electrophoresis. - 1988. - V. 9. - P. 787-796.

Guy C.L., Huber J.I.A., Huber S.C. Sucrose phosphate synthase and sucrose accumulation at low temperature // Plant Physiol. - 1992. - V. 100. -P. 502-508.

. Guy C.L., Niemi K.J., Brambl R. Altered gene expression during cold acclimation of spinach // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1985. - V. 82, N11. -P. 3673-3677.

Hahn M. And Walbot V. Effects of cold-treatment on protein synthesis and mRNA levels in rice leaves // Plant Physiology. - 1989. - V. 91.-P. 930-938.

Heino P., Sandman G., Lang V., Nordin K., Palva E.T. Abscisic acid deficiency prevents development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana // Theoretical and applied genetics. - V. 79, - P. 801-816.

Hew C. I., Joshi S., Wang N-C., Kao M-H. and Ananthanarayanan. Structures of shorthorn seulpin antifreeze polypeptides // Eur. J. Biochem.

- 1985. -V. 151. - P. 167-172.

Hincha D.K., Smitt J.M. Cryoprotective leaf proteins: assay methods and heat stability // J. Plant Physiol. - 1992. - V. 140, N2. - P. 236-240.

Hon W.-C., Griffith M., Chong P., Yang D.S.C. Extraction and Isolation of Antifreeze Proteins from Winter Rye (Secale cereale) Leaves // Plant Physiol. - 1994. - V.104. - P.971-980.

Houde M., Danyluk J., Laliberte J. F., Rassart E., Dhindsa R. S., Sarhan F. Cloning, characterization and expression of a cDNA encoding a 50—kilodalton protein specifically induced by colds acclimation in wheat //Plant Physiol. - 1992. -V. 99. - P.1381-1387.

Hughes M.A., Dunn M.A. The molecular biology of plant acclimation to low temperature // J. Exp. Bot. - 1996. - V. 47. - P. 291305.

Hughes M.A., Dunn M.A., Pierce R.S., White A.J., Zhang L. An abscisic-acid-responsive, low temperature barley gene has homology with a maize phospholipid transfer protein // Plant Cell Environ. - 1992. - V. 15. - P.861-865.

Humphreys G.O., Weston A., Brown M.G.M., Saunders J.R. Plasmid transformation of Escherichia coli // In: Transformation. Proc. Jaglo-Ottosen. 1975.

Jarillo J.A., Leyva A., Salinas J., Martinez-Zapater J.M. Low temperature induces the accumulation of alcohol dehidrogenase mRNA in Arabidopsis thaliana, a chilling-tolerant plant // Plant Physiol. - 1993. - V. 101,-P. 833-837.

Jonak C., Kiegerl S., Ligterink W., Barker P.J., Huskisson N.S., Hirt H. Stress signalling in plants: a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93, N20. - P. 11274-11279.

Kazuoka T., Oeda K. Purification and Characterization of Cor85-Oligomeric Complex from Cold-Acclimated Spinach // Plant Cell Physiol. - 1994.-V.35.-P.601-611.

Kondo T., Mukai M., Kondo Y. Rapid isolation of plasmid DNA by LiCl-EtBr treatment and gel filtration // Anal. Biochem. - 1991. - V. 198, N1.- P.30-35.

Krasnuk M., Jung J.A., Witham F.H. Electrophoretic studies of the relationship of peroxidases, polyphenol oxidase and oxidase to cold tolerance of alfaalfa // Cryobiology. - 1975, - V. 12, N1. - P. 62-80.

Krishna P., Sacco M., Cherutti J.F., Hill S. Cold-induced accumulation of hsp 90 transcripts in Brassica napus // Plant Physiol. -1995. -V. 107. - P. 915-923.

Kuiper P.J.C. Lipids in alfalfa in relations to cold hardiness // Plant Physiol. - 1970. - V. 45, N. 6. - P. 684-686.

Kurkela S., Franck M. Cloning and charactrerisation of a cold- and ABA-inducible Arabidopsis gene // Plant Mol. Biol. - 1990. - V. 15. - P. 137-144.

Kusano T., Berberich T., Harada M., Suzuki N., Sugawara K. A maize DNA-binding factor with a bZIP motif is induced by low temperature // Mol. Gen. Genet. - 1995. - V. 248, N5. - P. 507-517.

Laberge S., Castonguay Y., Vezina L.-P. New Cold- and Drought-Regulated Gene from Medicago sativa // Plant Physiol. - 1993. - V.101. -P.1411-1412.

Lalk I., Dorffing K., Hardening, abscisic acid, proline and freezing resistance in two winter wheat varieties // Plant Physiol. - 1985. - V. 63. -P. 287-292.

Lang V., Mantyla E., Welin B., Sundberg B., Palva E.T. Alteration in water status, endogenous abscisic acid content and expression of rab 18 gene during the development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana // Plant Physiology, - 1994. - V. 104, - P. 1341-1349.

Lang V., Palva E. T. The expression of a rab-reguiated gene, rab 18, is induced by abscisic acid during the cold acclimation process of

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 20. - P. 951-962.

Leung J., Giraudat J. Abscisic acid signal transduction // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. - V.49. - P. 199-222.

Li Q.B., Haskell D.W., Guy C.L. Coordinate and non-coordinate expression of the stress 70 family and other molecular chaperones at high and low temperature in spinach and tomato // Plant Mol. Biol. - 1999. - V. 39,N1. - P. 21-34.

Lin C., Thomashow M.F. DNA Sequence Analysis of a Complementary DNA for Cold-Regulated Arabidopsis Gene Corl5 and Characterization of the COR15 Polypeptide // Plant Physiol. - 1992. -V.99. - P.519-525.

Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K. and Shinozaki K. Two transcriptional factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis // The Plant Cell. - 1998. -V. 10.-P. 1391-1406.

Mantyla E., Lang V., Palva E.T. Role of abscisic acid in drought-induced freezing tolerance cold acclimation and accumulation of LTI 78 and RAB 18 proteins in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. - 1995. - V. 107,-P. 141-148.

Maxam A., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977,- V. 74, N 2. - P. 560-564.

Medina J., Bargues M., Terol J., Perez-Alonso M., Salinas J. The Arabidopsis CBF Gene Family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing protein whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration // Plant Physiol. -1999. -V. 119. - P. 463-470.

Meinkoth J. And Wahl G. Hybrization of nucleic acids immobilized on solid supports // Anal. Biochem. - V. 138. - P. 267.

Meza-Basso L., Alberdi M., Raynal M., Ferrero-Cadinanos M.-L., Delseny M. Changes in protein synthesis in rapeseed (Brassica napus) seedlings during a low temperature treatment // Plant Physiol. - 1986. - V. 82. - P. 733-738.

Mohapatra S.S., Poole R.J., Dhindsa R.S. Cold acclimation, freezing resistance and protein synthesis in alfalfa (Medicago sativa L. cv. Saranac) // J. Experimental Botany. - 1987. - V. 38, N 195. - P. 16971703.

Mohapatra S. S., Wolfraim L., Pools R. S., Dhindsa R. S. Molecular cloning and relationship of freezing tolerance of cold acclimation specific genes of alfalfa // Plant Physiol. - 1989. - V.89. - P. 375-380.

Monroy A.F., Castonguay Y., Laberge S., Sarhan F., Vezina L.P., Dhindsa R.S. A new cold-induced alfalfa gene is associated with enhanced hardening at subzero temperature // Plant Physiol. - 1993. - V. 102, N3. -P. 873-879.

Moreno M.L., Ferrero M.L., Torre C.D. The pattern of polypeptides in proliferating cells of Allium cepa L. roots during cold and heat conditions // J. Plant Physiol. - 1994. - V. 143.- P. 759-762.

Neven L.G., Haskell D.W., Hofig A., Li Q-B., Guy C.L. Characterization of a Spinach Gene Responsive to Low Temperature and Water Stress // Plant Mol.Biol. - 1993. - V.21. - P.291-305.

Nordin K., Heino P., Palva E.T. Separate Signal Pathways Regulate the Expression of a Low Temperature-Induced Gene in Arabidopsis thaliana//Plant Mol. Biol. - 1991. - V. 16. - P. 1061-1071.

Nordin K.„ Vohale T., Palya E. T. Differential expression of two related, low temperature-induced genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Mol. Biol. - 1993. - V. 21. - P. 641-653.

Orr W., Iu B., White T. C., Robert L. S., Singh J. Complementary sequence of a low temperature induced B-napus gene with homology to the Arabidopsis thaliana kin 1 gene // Plant Physiol. - 1992. - V. 98. - P. 1532-1534.

Ouellet F., Houde M., Sarhan F. Purification, characterization and cDNA cloning of the 200 kDa protein induced by cold acclimation in wheat // Plant Cell Physiol. - 1993. - V. 34, N1. - P. 59-65.

Paldi E., Racz I., Lasztity D. Effect of low temperature on the rRNA processing in wheat (Triticum aestivum L.) // J. Plant Physiol.- 1996.- V. 1489. N3-4. - P.374-377.

Palva E.T. Gene expression under low temperature stress // Harwood Academic, New York. - 1994. - P. 103-130.

Pan R-C. The role of abscisic acid in chilling resistance // In RP Pharis, SB Rood, eds, Plant Growth Substances 1988. Springer-Verlag, Berlin.-P. 391-399.

PCR 2. A Practical Approach / Ed. McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R. New York: Oxford University Press, 1995. 332 p.

Pearce R.S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: a low temperature scanning-electron-microscopy study // Planta. -1988.-V. 175.-P. 313-324.

Perras M., Sarhan F. Synthesis of freezing tolerance proteins in leaves, crown, and roots during cold acclimation of wheat // Plant Physiol.- 1989. - V. 89. - P. 577-585.

Plant A. L., Cohen A., Moses M. S. and Bray E.A. Nucleotide sequence and spatal expression pattern of a drought- and abscisic acid-induced gene in tomato // Plant Physiology. - 1991. - V. 97. - P. 900-906.

Rajashekar C.B., Lafta A. Cell-wall changes and cell tension in response to cold acclimation and exogenous abscisic acid in leaves and cell cultures // Plant Physiol. - 1996. - V. 111. - P. 605-612.

Robertson A.J., Gusta L.V., Reaney M.J.T., Ishikawa M. Identification of proteins correlated with increased freezing tolerance in bromegrass (Bromus inermis Leyss. Cv. Manchar) cell cultures // Plant Physiol. - 1988. - V. 86. - P. 344-347.

Robertson A. J., Weninger A., Wilen R. W., Fu P., Gusta L. V. Comparison of dehydrin gene expression and freezing tolerance in Bromus inermis and Secale cereale grown in controlled environments, hydroponics and the field // Plant Physiol. - 1994. - V. 106. - P. 12131216.

Rouse D., Gehring C. A., Parish R. W. Structure and sequence of a dehydrin-1 ike gene in Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 19.-P. 531-532.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989. 1626

P-

Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977. - V.74. -P.5463-5467.

Sarokin P.L., Chua N.H.Binding sites for two novel phosphoproteins, 3Af5 and 3Af3, are required for rbc-3A expression // Plant Cell. - 1992. - V. 4, No2. - P. 473-483.

Schaffer M.A., Fischer R.L. Analysis of mRNAs that accumulate in response to low temperature identifies a thiol protease gene in tomato // Plant Physiol. - 1988. - V. 87. - P. 431-436.

Schneider A., Salamini F., Gebhardt C. Expression patterns and promoter activity of the cold-regulated gene ci21A of potato // Plant. Physiol. - 1997.-V. 113, N2. -P. 335-345.

Scott G.K., Davies P.L., Shears M.A., Fletcher G.L. Structural variations in the alanine-rich antifreeze proteins of the pleuronectinae // Eur. J. Biochem. - 1987.- V. 168., N3. - P. 629-633.

Shen Q., Uknes S.J., Ho T.-H.D. Hormone response complex in a novel abscisic acid and cycloheximide-inducible barley gene // J. Biol. Chem. - 1993. - V.268, N31. - P.23652-23660.

Shinwari Z.K., Nakashima K., Miura S., Kasuga M., Seki M., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. An Arabidopsis gene family encoding DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene expression // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. -V. 250, N1.-p. 161-170.

Sieg F., Schroder W., Schmitt J.M., Hincha D.K. Purification and characterization of a cryoprotective protein (cryoprotectin) from leaves of cold-acclimated cabbage //Plant Physiol. - 1996. - V. 111. - P. 215-221.

Siminovich D., Cloutier Y. Twenty-four-hour induction of freezing and drought tolerance in plumules of winter rye seedlings by desication stress at room temperature in the dark // Plant Physiol. - 1982. - V. 69. - P. 250-255.

Siminovitch D., and Cloutier Y. Drought and freezing tolerance and adaptation in plants: some evidence of near equivalences // Cryobiology. -1983.-V. 20.-P. 487-503.

Skriver K., Mundy J. Gene response to ABAs and osmotic stress // Plant Cell. - 1990. - V. 2. - P. 503-5012.

Singh J., Laroche A. Freesung tolerance in plants: a biochemical overview // Biochem. Cell Biol. 1988. - V. 66. - P. 650-657.

Southern E. Detection of specific sequens among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P. 503.

Stockinger E., Gilmour S., and Thomoshow M. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional

activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1997. - V. 94. - P. 1035-1040.

Takahashi R., Joshee N., Kitagawa Y. Induction of chilling resistance by water stress, and cDNA sequence analysis and expression of water stress-regulated genes in rice // Plant Mol. Biol. - 1994. - V. 26, N1. -P. 339-352.

Thomashow M.F. Function and regulation of Arabidopsis thaliana COR(cold-regulated) genes // Plant Physiol. - 1996. - V. 111, N2. Suppl. -P. 29.

Tomashow M. F. Molecular genetics of cold acclimation in higher plants // Adv. Genet. - 1990. - V. 28. - P. 99-131.

Uemura M., Steponkus P.L. Effect of cold acclimation on the incidence of two forms of freezing injury in protoplasts isolated from winter rye leaves//Plant Physiol. - 1989. - V. 91. - P. 1131-1137.

Urrutia M. E., Duman J. G., Knight Ch. A, Plant thermal hysteresis proteins // Biochem Biophys. Acta. - 1992. - V. 1121. - P. 199-206.

Van Berkel J., Salamini F., Gebhardt C. Transcripts accumulating during cold storage of potato (Solanum tuberosum L.) tubers are sequence related to stress-responsive genes // Plant Physiol. - 1994. - V. 104, N2. -P. 445-452.

Vigh L., Horvath I., Horvath L.I. et al. Protoplast plasmalemma fluidity of hardened wheats correlates with frost resistance // FEBS Lett. -1979. - V. 107, N2. - P. 291-294.

Volger H.G., Heber U. Cryoprotective leaf proteins // Biochim. Biophys. Acta. - 1975. - V. 412. - P. 335-349.

Welin B.Y., Olson A., Palva E.T. Structure and organization of two closely related low-temperature-induced dhn/lea/rab-like genes in

Arabidopsis thaliana L., Heynn // Plant Mol. Biol. - 1995. - V.29, N2. - P. 391-395.

Weretilnik E., Orr W., White T.C., Iu B., Singh J. Characterization of three related low-temperature-regulated cDNAs from winter Brassica napus//Plant Physiol. - 1993. - V. 101. - P. 171-177.

Wieslander L. A simple method to recover intact high molecular weight RNA and DNA after electrophoretic separation in low gelling temperature agarose gels // Anal. Biochem. - 1979. - V. 98. - P. 305.

White T.C., Simmond D., Donaldson P., Singh J. Regulation of BN115, Low-temperature-responsive gene from winter Brassica napus // Plant Physiol - 1994. - V.106. - P.917-928.

Wolfraim L. A., Langis R., Tyson H., Dhindsa R. S. cDNA sequence, expression and transcript stability of a cold acclimation specific gene, cas 18. of alfalfa (Medicago falcata) cells // Plant. Physiol. - 1993. -V. 101. - P. 1275-1282.

Xiong L., Ishitani M., and Zhu J-K. Interaction of osmotic stress, temperature, and Abscisic acid in the regulation of gene expression in Arabidopsis // Plant Physiol. - 1999. - V. 119. - P. 205-211.

Yacoob R.K., Filion W.G. Temperature-stress response in maize: a comparison of several cultivars // Can. J. Genet. Cytol. - 1986. - V. 28. -P. 1125-1131.

Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. A Novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress // Plant Cell. - 1994. - V.6. - P. 251-264.

Yelenosky G.,Guy C.L. Freezing tolerance of citrus, spinach and petunia leaf tissue: osmotic adjusment and sensitivity to freeze induced cellutar dehydration // Plant Physiol. - 1989. - V. 89. - P. 444-451.