Ультраструктурная и молекулярно-генетическая характеристика сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Хаят, Сабина Шаукатовна

• Хаят, Сабина Шаукатовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хаят, Сабина Шаукатовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Снижение активности сперматогенеза у мужчин

1.2 Ультраструктура жгутика сперматозоидов человека

1.3 Биохимические и ультраструктурные нарушения сперматозоидов при астенозооспермии

1.4 Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов

1.5 Общая характеристика митохондриального генома

1.5.1 Особенности митохондриальной ДНК человека

1.5.2 Использование митохондриальной ДНК в молекулярно-генетических Исследованиях(особенности митохондриальной генетики)

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Семиологический анализ

2.2 Метод количественного электронно-микроскопического анализа

сперматозоидов человека

2.2.1. Подготовка эякулята для электронно-микроскопического

Исследования

2.2.2 Проведение количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов

2.3. Количественный кариологический анализ соотношения незрелых половых клеток (НПК) разных стадий сперматогенеза из эякулята

2.4. Цитогенетическтий анализ лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией

2.5. Молекулярно-генетические методы исследования

2.5.1 Выделение геномной ДНК сперматозоидов из эякулята

2.5.2 Ампилификация ДНК методом полимеразной

цепной реакции (ПЦР)

2.5.3. Анализ полиморфизма длин рестрикционных

фрагментов (ПДРФ - анализ)

2.5.4. Электрофорез в агарозном геле

2.5.5 Детекция точковой мутации митохондриальной ДНК A3243G

2.5.6. Детекция протяженной делеции митохондриальной ДНК 4977

2.6. Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов

2.7. Статистическая обработка полученных результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Оценка вклада астенозооспермии в структуру патозооспермии

3.2. Ультраструктурное исследование сперматозоидов пациентов

с астенозооспермией

3.3. Исследование распространенных перестроек мтДНК: Делеции мтДНК 4977 и точковой замены A3243G в гене тРНК лейцина

3.4.Результаты молекулярно-генетического исследования нуклеотидной последовательности гена GAPDHS

3.5. Исследование уровня фрагментации ДНК на выборке 266 пациентов с нарушением фертильности

3.6. Модификация протокола комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией

3.7. Описание клинических случаев

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - аксонемный комплекс АТФ - аденозинтрифосфат АДФ - аденозиндифосфат

ГАФД - глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназа

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДФС - дисплазия фиброзного слоя жгутика

дНТФ дезоксинуклеозидтрифосфаты

дАТФ 2'-дезоксиаденозин - 5'- трифосфат

дЦТФ2'-дезоксицитозин - 5'- трифосфат

дТТФ 2'-дезокситимедин - 5!- трифосфат

дГТФ 2'-дезоксигуанин - 5'- трифосфат

мтДНК - митохондриальная ДНК

КДЦ - комплекс дыхательной цепи митохондрий

ПЦД - первичная цилиарная дискинезия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

НПК - незрелые половые клетки

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

РНК - рибонуклеиновая кислота

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ФС - фиброзный слой

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

СаМ - кальмодулин

вАРБШ - Г АДФ - глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназа ОТв-дифференциальное окрашивание хромосом НЬ - тяжелая цепь 1С - промежуточная цепь

LC - легкая цепь

MIM - Mendelian Inheritance of Man NADH-дегидрогеназный комплекс Taq-ДНК- полимеразы ТВЕ буфер - Tris-Borate-EDTA буфер TdT - terminal deoxynucleotidyl transferases TNDK нуклеозид дифосфат киназы

WD-повторы - дипептиды из триптофана и аспартата на С-конце белка LHON - Leber heredity optic neuropathy (синдромом Лебера) ISCN Международная система номенклатуры цитогенетики человека PGC - primordial germ cells - первичные половые клетки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ультраструктурная и молекулярно-генетическая характеристика сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией»

ВВЕДЕНИЕ

Мужское бесплодие — состояние, которое, как правило, является следствием совокупности патологических воздействий на репродуктивную систему мужчины. Доля мужского бесплодия составляет не менее половины причин бесплодия в браке (Matzuk, Lamb, 2002; Сегал, 2010; Щеплев, 2012).

Несмотря на совершенствование современных методов диагностики, доля идиопатического бесплодия, т.е. бесплодия с неустановленной причиной, остается стабильной и составляет около 1/3 случаев мужского бесплодия (Курило, 2002; Долгов и соавт., 2006; Diemer, Desjardins,1999).

Наряду с анатомическими, инфекционными, эндокринными, иммунологическими причинами специалисты уделяют все большее внимание изучению генетического фактора в развитии мужского бесплодия. Сперматогенез протекает под контролем специфических генов дифференцирующихся гамет и регулируется совокупностью гормонов, цитокинов и факторов роста (Cooke et al., 1998; de Kretser et al., 1998; Hecht, 1998; McLachlan et al., 1998; Okabe et al., 1998; Smith, Conti 1996, Божедомов, 2009; Сухих, Божедомов, 2009). Генетически обусловленными причинами бесплодия у мужчин могут являться хромосомные аномалии, микроструктурные перестройки и генные мутации, приводящие к нарушению фертильности (Черных, 2006; Курило и соавт., 2011; Kobayashi et al., 2012). Интенсивное внедрение методов молекулярной биологии в изучение генома человека позволило накопить определенную информацию о различных генетических дефектах, приводящих к нарушениям характеристик сперматогенеза. За последние несколько лет были не только картированы некоторые гены, продукты экспрессии которых влияют на развитие и функции гамет, гонад и других органов половой системы, но и описаны мутации этих генов. Это позволило в настоящее время четко идентифицировать генетическую причину некоторых форм нарушения центральных звеньев эндокринной регуляции и определить влияние этих мутаций на процессы стероидо- и гаметогенеза в гонадах, морфогенеза

органов половой системы (Черных, Курило, 2001 а, б; Wilson, Davies, 2007; Вартанян и соавт, 2010).

Причинами бесплодия у мужчин могут являться функциональная неполноценность сперматозоидов. Нарушение функциональных свойств сперматозоидов при традиционном светооптическом исследовании в ряде случаев выявить невозможно. Для определения различных структурных параметров сперматозоидов может быть применен метод их ультраструктурного анализа. Этот подход позволяет выявить особенности органоидов сперматозоидов - состояние акросомы, компактизации хроматина, строение жгутика и его компонентов, состояние и функционирование митохондрий, центриолей.

Ультраструктура жгутика является высоко консервативной и состоит из ряда элементов цитоскелета, необходимых для обеспечения движения сперматозоида. Структурной единицей, обеспечивающей двигательную активность жгутика, является аксонема и добавочные периаксонемные структуры. Характеристика ультраструктуры двигательного аппарата жгутика предоставляет возможность дальнейшего исследования его молекулярных компонентов, осуществления его функции и причин нарушения последней.

Известно, что подвижность сперматозоидов осуществляется за счет аэробных и анаэробных процессов. Аэробные процессы обеспечиваются энергией за счет митохондрий, анаэробные - за счет гликолиза (Mikai, Okuno, 2004; Williams, Ford, 2001). Одним из гликолитических ферментов является глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназа (ГАФД), которая катализирует окислительное фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата. Спермоспецифическая ГАФД тесно связана с периаксонемной структурой - фиброзным слоем, сниженная активность ГАФД приводит к снижению подвижности сперматозоидов (Элькина, 2007) Показано, что активность ГАФД снижена у пациентов с дисплазией фиброзного слоя, однако неизвестно, может ли ген ГАФД являться

кандидатным геном при этой форме астенозооспермии. Очевидно, что проблема патогенеза астенозооспермии изучена фрагментарно (Глинкина, 2003; Гоголевский, Гоголевская, 2005).

Гетерогенность форм астенозооспермии, разнообразие этиологии причин, приводящих к нарушению подвижности сперматозоидов, зависимость активности половых клеток от работы комплексов дыхательной цепи митохондрий и ферментов гликолиза обуславливает необходимость в комплексном подходе к изучению патогенеза астенозооспермии.

ШЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования - изучить ультраструктурные и молекулярно-генетические нарушения двигательной активности сперматозоидов на репрезентативной выборке пациентов (9215 мужчин) с астенозооспермией.

Для достижения поставленной цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Проанализировать вклад астенозооспермии в структуру патозооспермии на репрезентативной выборке пациентов.

2. Выявить особенности ультраструктуры жгутика сперматозоида и его компонентов у пациентов при астенозооспермии и бесплодии.

3. Исследовать возможные сочетания нарушений ультраструктур сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией и бесплодием.

4. Определить, имеется ли взаимосвязь между такими параметрами спермограммы, как подвижность сперматозоидов и наличие повреждений ДНК (одно- и двунитевые разрывы ДНК).

5. Провести исследование состава незрелых половых клеток из эякулята на разных стадиях их развития в группе мужчин с астенозооспермией и бесплодием.

6. Определить роль наиболее распространенных мутаций митохондриальной ДНК на репрезентативной выборке пациентов с астенозооспермией, провести сравнительный анализ частоты и спектра

мутаций мтДНК сперматозоидов во фракциях с различными параметрами подвижности сперматозоидов.

7. Изучить характер возможных перестроек гена САРОНБ, экспрессирующего спермоспецифичную изоформу глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, одного из ферментов гликолиза.

8. Расширить протокол комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией и бесплодием.

Новизна результатов исследования

Впервые на репрезентативной выборке российских пациентов установлено, что снижение подвижности сперматозоидов (астенозооспермия, астенотератозооспермия, олигоастенозооспермия,

олигоастенотератозооспермия) вносит ведущий вклад (93%) в структуру патозооспермии. Анализ результатов статистической обработки показал, что структура астенозооспермии неоднородна: в 71 % случаев она сочетана с тератозооспермией, олигоастенотератозооспермия составляет 26% , астенозооспермия встречается лишь у 3% обследованных.

Количественный кариологический анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их развития из эякулята впервые позволил выявить блок сперматогенеза на стадиях прелептотены-лептотены-зиготены у 80% пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией и повышенное количество незрелых половых клеток с признаками дегенерации, а также - нарушением анафазы 1 и 2 делений мейоза, т.е. выявлены неразошедшиеся в делениях мейоза сперматиды у половины исследуемых по незрелым половым клеткам случаев.

Выявлено отсутствие ассоциации астенозооспермии и нарушений структуры хроматина и целостности ДНК.

При исследовании ультраструктурных основ нарушения двигательной активности сперматозоидов показано, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты жгутиков сперматозоидов - аксонему

(центральные и периферические микротрубочки, динеиновые ручки), наружные плотные фибриллы, фиброзный слой.

У всех исследованных пациентов с дисплазией фиброзного слоя впервые обнаружен полиморфизм в гене САРИНБ - замена аденина на гуанин гб29381 (660-22 в>А) в гетерозиготном состоянии.

Практическая значимость

В работе расширена схема протокола комплексного медико-генетического обследования пациента с астенозооспермией неясного генеза. Полученные новые данные об особенностях нарушения ультрастуктуры сперматозоида у пациентов с астенозооспермией, проясняющие патогенез астенозооспермии, а также полученные данные о полиморфизме в гене ОАРИНБ у пациентов с астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя открывают возможности для дифференциальной диагностики синдромоной и функциональной (вызванной экзогенными факторами) форм астенозооспермии. Выявленное отсутствие ассоциации между количеством сперматозоидов с нарушением целостности ДНК и низкой подвижностью сперматозоидов расширяют современные представления о роли одно- и двунитевых разрывов ДНК сперматозоидов в этиологии астенозооспермии.

Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников ' (урологов-андрологов, акушеров-гинеколбгов, медицинских генетиков).

Личное участие автора

Основная часть экспериментов (создание коллекции ДНК, исследование мутаций и полиморфных вариантов митохондриальной ДНК и гена ОАРйН8, статистическая обработка данных выполнена автором самостоятельно. Проведение части семиологических исследований, анализ результатов, фиксация материала для электронно-микроскопического

исследования, подготовка срезов, сравнительный анализ ультраструктуры сперматозоидов выполнена при участии соискателя.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в работу лаборатории генетики нарушений репродукции Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический генетический научный центр» Российской академии медицинских наук. В практикеу лаборатории внедрен расширенный протокол комплексного медико-генетического обследования, включающий обязательное проведение электронно-микроскопического анализа ультраструктур сперматозоидов, цитогенетического исследования и молекулярно-генетического анализа гена GAPDHS для пациентов с анастенозооспермией неясного генеза.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены на Ежегодных российских научно-образовательных форумах "Мужское здоровье и долголетие" в 2009 и 2010 (г. Москва); 4th Utah-Florence Symposium on the Genetics of Male Infertility 2010 (Park City, USA); 16-th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis 2010 (Elba, Italy); VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 (г. Ростов-на-Дону); European Human Genetics Conference, 2010 (Gothenburg, Sweden); 26-м съезде European Society of human reproduction and embriology 2010 (Rome, Italy); 20th World Congress on Fertility and sterility 2010 (Munich, Germany) (5-м Международном конгрессе Всемирной ассоциации по репродуктивной медицине в 2010 (г. Москва); American Society of Human Genetics Annual Meeting 2010 (Washington, USA); Ежегодной конференции молодых ученых Медико-генетического научного центра РАМН в 2010 и 2011 (г. Москва). Основные результаты работы доложены на межлабораторном научном семинаре Медико-генетического научного центра РАМН (декабрь, 2011).

Публикации материалов исследования

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация построена по традиционному плану, состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы», «Список использованных источников». Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 30 иллюстраций и 10 таблиц. Список использованной литературы содержит 180 наименований (из них 32 в отечественных изданиях и 148 публикации в зарубежных изданиях)

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Астенозооспермия, одна из самых распространенных форм патозооспермии, имеет неоднородную структуру и в основном сочетана с тератозооспермией; астенозооспермия, несочетанная с другими формами патозооспермии встречается у 3% обследованных. Это свидетельствует о различных механизмах, приводящих к нарушению важной функции - нарушению двигательной активности сперматозоидов.

2. Количественный анализ структуры сперматозоидов показывает, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты -акросому, митохондрии, микротрубочки аксонемы, динеиновые ручки, наружные плотные фибриллы, фиброзный слой.

3. Распространенная делеция мтДНК 4977 не имеет клинической значимости для пациентов с астенозооспермией, данная протяженная делеция была обнаружена нами в образцах эякулята у обследованных пациентов с астенозооспермией и в контрольной группе примерно с равной частотой.

4. У пациентов с тотальной астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя в гене GAPDHS, кодирующего фермент ГАФДс, впервые обнаружили полиморфизм, rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Снижение активности сперматогенеза у мужчин

Репродуктивная функция человека - наиболее тонкая и наименее защищенная. Многочисленные исследования в ряде стран свидетельствуют о тотальном ухудшении качества эякулята за последние 50 лет. В частности, постепенно снижаются нормы показателей сперматогенеза в референсных значениях (WHO 1992, 1999, 2010).

Согласно 4-му изданию руководства ВОЗ, подвижность более 50% спермиев при относительном содержании морфологически нормальных форм более 30% трактуется как нормозооспермия (WHO, 1999). В последнем, 5-м издании Руководства ВОЗ (WHO, 2010) подвижность сперматозоидов считается нормальной, если их прогрессивная подвижность составляет не менее 32%. Как правило, три основных показателя состояния сперматогенной функции (концентрация спермиев в эякуляте, их подвижность и морфологические характеристики) меняются сочетанно (Multigner et al, 2002).

Приведенные выше сведения об изменении величин количественных показателей состояния сперматогенной функции человека, принятых за норму, могут свидетельствовать либо о завышении первоначально принятых критериев, либо о действительно происходящем снижении некоторых показателей сперматогенеза.

В связи со второй гипотезой в литературе возникла дискуссия, которая заметно оживилась благодаря серии опубликованных сообщений о снижении показателей сперматогенеза у мужчин в различных странах, наблюдаемом в последние 40-50 лет (Быков, 2000; Cooper, Kavlock 1997; Irvine et al., 1996).

При рассмотрении современных тенденций изменения сперматогенной

функции человека особый интерес представляют результаты исследований, проведенных на репрезентативных выборках обследуемых в различных странах мира в течение последнего десятилетия, в сопоставлении с данными этих же центров за более ранние годы.

Так, в работе коллег из Индии (Adiga et al., 2008) описаны результаты исследования 7770 мужчин с бесплодием. Используя метод регрессионного анализа, они показали, что такие показатели как концентрация сперматозоидов, подвижность и доля морфологически нормальных форм снижались за 9 лет исследований. Сходные результаты - снижение доли подвижных сперматозоидов на 6,5% получила и другая группа исследователей из Индии (Marimuthu et al., 2003) при обследовании 1176 пациентов (средний возраст 31 год) в течение 11 лет наблюдений.

Так же в подтверждение гипотезы ухудшения качества спермы в популяции мужчин говорят исследования коллег из Великобритании, в их работе были описаны результаты исследования эякулята 577 молодых мужчин-доноров спермы за 10-12 лет снизились средняя концентрация и общее содержание спермиев (с 98 до 78 млн/мл и с 310 до 214 млн., соответственно), а также общее число подвижных спермиев (с 169 до 129 млн. - снижение на 24%).

Двенадцатилетние наблюдения исследователей из Туниса демонстрируют снижение таких показателей как количество сперматозоидов и, в особенности, количество морфологически нормальных форм, в своей работе они наблюдали 2940 молодых мужчин в возрасте 36±7 лет с бесплодием в браке (Feki et al., 2009)

Снижение данных показателей сперматогенеза происходило со скоростью примерно 2% в год (Irvine et al., 1996). Сходные результаты получены при обследовании 1351 донора спермы в Париже за 20-летний период: отмечено неуклонное снижение содержания спермиев в эякуляте со скоростью 2,1% в год - с 89 млн/мл в 1973 г. до 60 млн/мл в 1992 г. при

одновременном уменьшении доли подвижных и морфологически неизмененных спермиев (Auger et al., 1995; Sharpe, 1995).

Характерно, что различия в концентрации спермиев обнаружены между мужчинами, живущими не только в географически далеких, но и сравнительно близко расположенных регионах. Так, в группе скандинавских стран отмечена выраженная вариабельность этого показателя: самые низкие его значения отмечены в Дании, а наиболее высокие - в Финляндии (Jensen et al., 1996; Vierula et al., 1996). Более того, даже у мужчин, живущих в двух разных районах такой небольшой страны, как Дания, описаны различия в концентрации спермиев и доле морфологически нормальных форм в эякуляте (56,0 и 44,8 млн/мл, 42,5 и 39%, соответственно) (Jensen et al., 1997).

Исследование Клещева с соавтовами позволило установить более низкую концентрацию и долю подвижных сперматозоидов у мужчин г. Архангельска по сравнению с жителями соседних стран - Финляндии, Эстонии, Норвегии и Латвии (Клещев и соавт., 2011).

В окрестностях Лондона (Великобритания) в течение ряда лет наблюдали снижение общей концентрации спермиев и концентрации подвижных спермиев (со 105 до 76 млн/мл и с 61,7 до 48 млн/мл, соответственно), а в других оно отсутствовало (Ginsburg et al., 1994).Вместе с тем в некоторых исследованиях не выявлено существенных изменений показателей сперматогенеза у мужчин в ряде стран Европы и в США или получены противоречивые результаты. Так при обследовании 448 кандидатов в доноры спермы в Сиднее (Австралии) за период 1983-2001гг, не обнаружили достоверного снижения подвижности (Costello et al., 2002) При исследовании спермы бездетных мужчин в специализированной клинике в Швеции выявлено отсутствие ухудшения ее параметров в течение 10-летнего периода (с 1985 по 1995 г.) (Berling, Wolner-Hanssen, 1997). Между тем в двух сериях наблюдений, недавно проведенных в Финляндии с использованием гистологического анализа секционного материала, полученного от внезапно скончавшихся мужчин среднего возраста,

неожиданно выявлена картина существенных нарушений сперматогенеза (Pajarinen et al., 1996, 1997), что привлекло пристальное внимание специалистов и вызвало оживленную дискуссию (Joffe, 1997). В первой из указанных серий, состоявшей из двух групп мужчин общей численностью 271 человек, нормальный сперматогенез отмечен лишь у 21,2 и 42% (Pajarinen, 1996). Во второй серии наблюдений (528 мужчин) этот показатель выявлен у 41,7% обследованных, причем отмечено, что он снизился с 56,4% в 1981 г. до 26,9%) в 1991 г. За указанный период выявлено также достоверное уменьшение массы яичек, диаметра извитых семенных канальцев, нарастание объема соединительной ткани у обследованных пациентов (фиброз) (Oliva, 2001).

Рядом авторов высказаны сомнения в корректности выводов о снижении показателей активности сперматогенеза у человека в последние десятилетия. Как правило, полученные сдвиги относят за счет случайных причин, погрешности исследователей, анализирующих эякулят, а также хорошо известной изменчивости показателей сперматогенной функции мужчин (интра- и интериндивидуальной). Для человека характерен высокий уровень морфологической гетерогенности сперматозоидов, что затрудняет их оценку. Кроме того, использование различных методов приготовления, фиксации и окрашивания образцов эякулята, приводит к значительной вариабельности результатов исследования. Отмечается также возможная роль повторных пересмотров критериев оценки нормальных величин (Bromwich et al., 1994). Подвижность сперматозоидов зависит от времени года и суток. Имеются сообщения, что весной происходит снижение подвижности сперматозоидов (сезонные колебания). (Henkel et al., 2001) При наблюдении за количеством активно-подвижных сперматозоидов в течении суток было отмечено увеличение их числа во второй половине дня (суточные ритмы). Была также прослежена зависимость подвижности сперматозоидов от частоты эякуляции. У пациентов с олиго- астенозооспермией при эякуляции каждые 4-6 часов отмечалось относительное увеличение

количества активно-подвижных сперматозоидов. Поэтому одним из наиболее важных моментов лабораторных исследований является постоянный контроль качества полученных результатов.

Главными объектами критики служат различия в обследуемых контингентах мужчин (доноры спермы, кандидаты в доноры, представители общей популяции, мужчины с установленной плодовитостью, пациенты репродуктологических клиник, лица различного или только молодого возраста), отсутствие стандартизации в предварительной подготовке пациентов (например, в продолжительности воздержания перед получением проб спермы), приемов получения проб спермы и ее количественного и качественного анализа, а также неодинаковые или не полностью адекватные методы статистического анализа полученных данных (Farrow, 1994; Lerchl,1995; Lerchl, Nieschlag 1996). Однако детальный анализ приводимых авторами результатов не оставляет сомнения, что, несмотря на различия полученных данных, их неполную сопоставимость и имеющиеся противоречия, они описывают объективно протекающий общий процесс снижения сперматогенной функции человека, который может в неодинаковой степени проявляться в различных контингентах обследуемых, географических зонах и при действии тех или иных факторов внешней среды (Jouannet et al., 2001).

Для установления этиопатогенеза патоспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов применяют метод ультраструктурного анализа, позволяющий оценить структурную целостность и, следовательно, функциональную адекватность субклеточных структур, ответственных за осуществление клеточного движения, пенетрирующей и оплодотворяющей способности сперматозоидов.

1.2 Ультраструктура жгутика сперматозоида человека

Ультраструктура жгутика является высоко консервативной и состоит из ряда элементов цитоскелета, необходимых для обеспечения движения

сперматозоида. Структурной единицей, обеспечивающей двигательную активность жгутика является аксонема и добавочные периаксонемные структуры. В норме аксонемный комплекс (АК) представлен системой микротрубочек, протягивающихся от шейки сперматозоида до конца его жгутика. АК построен из 9 дуплетов (пар) микротрубочек, локализующихся по периферии аксонемы и пары центральных микротрубочек (рис.1). От каждого дуплета локализованных по периферии микротрубочек к соседнему дуплету отходят боковые структуры - «ручки», состоящие из белка динеина, обладающего АТФазной активностью (Fawcett, 1975).

Динеины являются «моторными» белками, расположенными на «ручках» внешних дуплетов микротрубочек и относятся к мультигенному семейству белков (Porter, Johnson, 1989; Holzbaur,Vallee, 1994; Milisav, 1998). Динеин может гидролизовать молекулы АТФ, преобразуя выделяющуюся при этом химическую энергию в механическую. Активация аксонемной динеин-АТФазы обеспечивает взаимное скольжение микротрубочек, входящих в состав аксонемы, что, в свою очередь, приводит к изгибу жгутика сперматозоида (Tash, Means, 1982). Аксонемные динеины — гетеродимеры или гетеротримеры, имеющие две или три моторные головки. Хотя динеины не родственны кинезинам, механизм их работы сходен. Движение головки динеина («эффективный удар») сопровождается распадом молекулы АТФ и высвобождением молекул АДФ и фосфата, при этом кольцевой домен поворачивается относительно «хвоста» тяжёлой цепи. Динеины — наиболее «быстрые» из молекулярных моторов. В эксперименте аксонемные динеины могут вызывать скольжение микротрубочек со скоростью 14 мкм/сек (Alberts et al., 2008).

Такие характеристики, как гибкость, плоскость движения жгутика и траектория его биения определяются строением фиброзного слоя жгутика, уникальной цитоскелетной структурой, выстилающей изнутри плазматическую мембрану и окружающей аксонему и добавочные

периаксонемные структуры. Фиброзный слой расположен в основном отделе, занимающем 3А длины жгутика сперматозоида и состоит из двух протяженных вдоль оси жгутика колонн, соединеных упорядоченными, полукруглыми поперечными ребрами, которые формируются от дистальной к проксимальной части жгутика на всех этапах сперматогенеза (Silva et al., 2012).

радиальная спица головка ножка

внутренняя динеиновая ручка

А и В микротрубочки

периферического

дуплета

внешняя динеиновая ручка

нексиновы и мостик

колонна фиброзного ц слоя

фиброзный слой

Рис. 1. Схематическое изображение аксонемы и фиброзного слоя жгутика сперматозоида (модификацированное по Ьагшгапёе, Gagnon, 2003)

Сперматозоиды являются высокодифференцированными клетками, в которых их определенные функции сопряжены со специальными клеточными структурами. Подвижность обеспечивается ультраструктурой жгутика, поэтому многие белки, напрямую вовлеченные в поддержание и регуляцию подвижности, сосредоточены в аксонемном комплексе и фиброзном слое жгутика сперматозоида. В частности, локализацию и прикрепление РКА-киназы к ее субстрату в фиброзном слое обеспечивают

якорные (прикрепляющие и поддерживающие) структурные белки АКАР. Это усиливает эффективность и специфичность фосфорилирования динеина. В работах Miki с соавторами (Miki et al. 2002) была продемонстрирована низкая подвижность сперматозоидов и инфертильность мышей, нокаутированных по гену Акар4. Определили, что недостаточность этого якорного белка (АКАР4) привела к деградации других белков фиброзного слоя жгутика. Т.о. было продемонстрировано, что якорные белки фиброзного слоя несут как функциональную, так и структурную функцию.

Реснички и жгутики, появившиеся на ранних этапах эволюции, служили одноклеточным организмам средством передвижения в водной среде. Позднейшая адаптация к жизни вне воды у растений привела практически к полной утрате этих органелл. В противоположность этому у многих сложно организованных многоклеточных животных реснички и жгутики были приспособлены для выполнения широкого спектра функций. Примечательно, что в ходе эволюционного процесса сохранилась высокая степень гомологичности протеинов, входящих в состав жгутиков простейших водорослей Chlamidomonas reinhardtii и ресничек млекопитающих (Ostrowski et al., 2002).

Каждый наружный дублет состоит из А- и В- микротрубочек; центральная пара микротрубочек, также структурно и биохимически асимметричная, расположена в центре кольца по всей длине аксонемы. Между собой микротрубочки связаны нексиновыми связками, радиальными спицами и наружными и внутренними динеиновыми ручками.

Динеиновые ручки распределены вдоль всей аксонемы с определенной периодичностью (каждые 24 нанометра - наружные и каждые 96 нанометров внутренние) и представляют собой мультипротеиновый комплекс, отходящий от А-микротрубочек каждого дублета. Наружные ручки обращены к границе аксонемы, а внутренние - к центральной паре микротрубочек.

Структура внешних динеиновых ручек была тщательно изучена в сперматозоидах многоклеточных. Она состоит из двух тяжелых цепей массой примерно 500 кДа, от 3 до 5 промежуточных (120 - 60 кДа) и шести легких цепей (30-8 кДа)

Тяжелые цепи динеина. Тяжелые динеиновые цепи - это белки с массой -500 кДа. Внешние динеиновые ручки состоят из двух тяжелых цепей - а и Р, которые филогенетически соответствуют у и а/(3 тяжелым цепям динеиновых ручек хламидомонады. Оказалось, что каждая тяжелая цепь выполняет определенную функцию в движении микротрубочек. Они содержат четыре Р-петли АТФ-связывающих субьединицы (Ogawa, 1991; Mocz et al., 1991). Исследования последних лет продемонстрировали, что тяжелые динеиновые цепи относятся к AAA суперсемействам и имеют шесть AAA доменов (Mocz, Gibbons, 2001; King et al., 2000). Считают, что каждая AAA субъединица формирует глобулярный субдомен. Между 4-й и 5-й AAA субъединицами существует биспиральный домен, который образует маленький ствол, необходимый для АТФ-чувствительного связывания прилегающего В-тубулина (King et al., 2000; Gee et al., 1997). Пространство между каждым AAA доменом необходимо для конформационных изменений в механохимических циклах (Inaba, Mohri, 1989; Inaba, 2000), которые, предположительно, оказывают влияние на движение (Burgess et al., 2003).

Промежуточные цепи динеина. Внешние динеиновые ручки хламидомонады содержат две промежуточные цепи, IC78 и IC69, чьи полные гомологи представлены в жгутике сперматозоида (Ogawa et al., 1995). Оба содержат WD-повторы, которые вовлечены в белок-белковое взаимодействие и, возможно, играют ключевую роль в сборке и связывании динеина на А-субъединице микротрубочки. Жгутик сперматозоида содержит уникальную промежуточную цепь с субъединицами триоредоксина и нуклеозид дифосфат киназы (TNDK-IC) (Ogawa et al., 1996; Padma et al., 2001). В жгутике сперматозоида морского ежа данная среднетяжелая цепь

имеет высокую молекулярную массу (-120 кДа), но размер TNDK-IC уменьшался в ходе эволюции (Padma et al., 2001).

Легкие цепи динеина. В жгутиках сперматозоидов многоклеточных и жгутиках хламидомонады существует 6 или 8 различных белков, определяемых как легкие цепи внешних динеиновых ручек, соответствуенно (Inaba et al., 1998, 1999; King, 2000). Две из этих молекул гомологичны t-комплексам белков ,экспрессирующихся в яичках(Тс!ех1 и Tctex2). Легкая динеиновая цепь белка Tctex2 фосфорилируется при активации движения сперматозоида в цАМФ-зависимой форме и может сыграть решающую роль в активации внешних динеиновых ручек (Inaba et al., 1999). Другие молекулы включают белки с лейцин-богатыми повторами и две изоформы, гомологичные высоконсервативным (8 кДа ) легким цепям хламидомонады.

Белок Tctexl легкой цепи отсутствует во внешней динеиновой ручке хламидомонады. Одну легкую цепь (LC5) еще предстоит определить. Небольшой белок, гомологичный белку roadblock Drosophila был так же найден и у хламидомонады (Harrison, 2002) и он может быть кандидатом для легкой цепи динеина LC5 в сперматозоиде. Несмотря на то, что внешние динеиновые ручки хламидомонады содержат Са2+-связанные легкие цепи, ни одного Са2+-связывающего белка не было найдено во «внешних» динеиновых ручках сперматозоидов у многоклеточных. Оказалось, что кальмодулин (СаМ) ассоциирован с внешними динеиновыми ручками у морского ежа и в жгутике сперматозоидов млекопитающих (Tash et al., 1988) В исследования последних лет во внешних динеинвых ручках Ciona выявлен белок весом 25 кДа со сходной последовательностью с В-субъединицей кальцинейрина.

Наружные динеиновые ручки состоят из трёх (а, ß, у) тяжелых (ЗНС), двух промежуточных (2IC : IC-69 и IC-78) и восьми лёгких (8LC) полипептидных цепей. Внутренние динеиновые ручки более вариабельны, до настоящего времени их точная структура не установлена; как правило, они состоят из одной или двух (а, ß) тяжелых (2 или 1 НС), трёх или другого

числа промежуточных (3IC: 1С-140, IC-138 и IC-97) и 3 или другого числа лёгких (3LC) динеиновых цепей.

Движение ресничек происходит вследствие скольжения дублетов друг относительно друга, которое обеспечивается АТФ - зависимой активностью динеиновых ручек. Частота биения ресничек в организме человека составляет 10-15 Hz(Afzelius, 1985).

Реснички и жгутики не только обеспечивают двигательную функцию, но и являются весьма динамичными в отношении их собственной структуры: каждые 6 ч в жгутике Chlamidomonas reinhardtii происходит обмен около 20% белков, участвующих в его функционировании. Этот процесс, протекающий с участием моторных белков - кинезинов, получил название внутрижгутикового транспорта и заключается в том, что структурные белки аксонемы переносятся из цитоплазмы к микротрубочкам жгутика, где включаются в процесс его структурной сборки (Geremek, Witt, 2004).

1.3 Биохимические и ультраструктурные нарушения сперматозоидов

при астенозооспермии

Сложная морфология жгутика сперматозоида подразумевает большое разнообразие структурных нарушений, способных оказывать влияние на её функцию.

В работе D.Cox и R.Talamo (1979) схематично представлены классические варианты этих нарушений при первичной цилиарной дискинезии - отсутствие динеиновых ручек, изменение числа, транслокации микротрубочек, отсутствие нексиновых связок и радиальных спиц.

Снижение подвижности сперматозоидов (астенозооспермия) наблюдается примерно у половины пациентов с нарушениями фертильности (Acacio, 2000) Астенозооспермия может быть обусловлена действием различных факторов: эндогенных, генетически обусловленных аномалий сперматозоидов и эффектом экзогенных факторов внешней среды, к которым

можно отнести экологические и инфекционные факторы (Потемина и соавт., 2006; Никитин, 2008)

Ультраструктурные нарушения в первую очередь касаются основной функциональной единицы реснички - аксонемы. Разнообразие вариантов аксонемных дефектов определяется множеством (>250) полипептидов, идентифицированных в составе аксонем и участвующих в их функционировании (Francavilla et al., 2006).

Дисплазия фиброзного слоя жгутика сперматозоида

Существуют многочисленные наследственные дефекты сперматозоидов, приводящие к астенозооспермии, которая затрудняет возможность естественного оплодотворения.

Одна из форм нарушения двигательного аппарата жгутика, выявляемая при электронно-микроскопическом исследовании, представляет собой дисплазию фиброзного слоя жгутика (ДФС). ДФС жгутика - генетически обусловленное заболевание, проявляющееся на ультраструктурном уровне хаотичным расположением колонн и ребер ФС в аксонеме жгутика сперматозоидов. Известно, что с фиброзным слоем жгутика сперматозоидов прочно связана сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДс), которая участвует в обеспечении энергией двигательной активности этих клеток, отвечает за прогрессивную подвижность сперматозоидов.

ДФС приводит к почти к полной неподвижности сперматозоида, но ядерная и акросомная структуры могут быть не повреждены (Chemes et al., 1998). ГАФДс встречается только в сперматозоидах и существенно отличается от глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы соматических клеток (ГАФД). В последовательности специфической формы ГАФДс есть полипролиновый участок, которого нет в ГАФД из соматических клеток, и нет участка, отвечающего за вывод ГАФД из ядра (Nuclear Export Signal, NES), присутствующего вГАФД клеток всех тканей человека. Известно, что

процесс формирования фиброзного слоя и встраивания в него ферментов строго регулируется. Нарушения регуляции формирования фиброзного слоя могут быть связаны с недостаточностью неизвестного белка, ответственного за связывание ГАФДс, что и приводит к снижению содержания ГАФДс в сперме пациентов с ДФС.

В работе Ю. Щуцкой с соавторами (ЗЬсЬ^Бкауа е! а1., 2008) показано, что в сперматозоидах с высокой подвижностью активность ГАФДс выше, чем в сперматозоидах с низкой подвижностью. Кроме того, при астенозооспермии, связанной с дисплазией фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов, значительно снижается содержание и активность ГАФДс по сравнению с нормальными показателями двигательной активности сперматозоидов.

Нарушение репродуктивной функции при первичной цилиарной дискинезии и синдроме Картагенера

Клинический полиморфизм ПЦД является следствием многообразия генетически детерминированных нарушений ультраструктуры ресничек мерцательного эпителия. Классической и самой распространенной формой ПЦД является синдром Картагенера, включающий обратное расположение внутренних органов, бронхоэктазы и синусит.

Одним из основных проявлений первичной цилиарной дискинезии (ПЦД) и синдрома Картагенера, помимо неподвижности ресничек эпителия дыхательных путей, является нарушение двигательной активности сперматозоидов (приводящее к мужскому бесплодию) или ворсин (фимбрий) воронки яйцевода, что нарушает перемещение овулировавшей яйцеклетки в маточную трубу и приводит к женскому бесплодию.

Ассоциацию между неподвижностью жгутиков сперматозоидов и ресничек эпителия дыхательных путей у пациента с синдромом Картагенера впервые описал В.А. А£геНш в 1976 г. Этим же автором впервые было выдвинуто предположение о роли динеиновых ручек в двигательной активности

аксонемы (АГгеНш, ЕНаББоп, 1979). Позднее было продемонстрировано, что нарушение структуры АК и его компонентов, вызванное действием экзогенных факторов (физических, химических и биологических) или генетически детерминированное, приводит к изменению двигательной активности ресничек эпителия дыхательных путей, фимбрий воронки фаллопиевых труб, жгутиков сперматозоидов.

Клетки, имеющие реснички или аналогичные структуры, обнаруживаются во многих системах организма. Реснички участвуют в мукоцилиарном клиренсе, движении гамет, перемещении спинномозговой жидкости, сенсорной рецепции, функционировании почечного эпителия, формировании лево-правосторонней асимметрии органов у млекопитающих (Шапег-ТаПоп & а1., 2003).

Примечательно, что однотипные клинические проявления нарушения подвижности ресничек, наблюдаемые, например, у пациентов с синдромом Картагенера, могут являться следствием различных ультраструктурных дефектов (потеря динеиновых ручек, изменение количества дублетов, синглетов, отсутствие радиальных спиц и др.) и вариантов генетической регуляции.

1.4 Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов

Проблема целостности генома мужских гамет актуальна для диагностики мужского бесплодия (ВеБЬау е1 а1., 2012), однако данные о том, влияет ли фрагментация ДНК на подвижность сперматозоидов противоречивы. В работе 2000 года ваисИт с соавторами установлено, что апоптотическая фрагментация ДНК ниже в группе мужчин с нормозооспермией в сравнении с группами мужчин с олигоастенотератозооспермией, различной андрологической патологией и тестикулярным раком. В другом исследовании (ВепсЬшЬ еЬ а1., 2003) не найдены ассоциации фрагментации ДНК с характеристиками спермограммы: концентрацией, подвижностью и процентом морфологически аномальных

сперматозоидов. Вместе с тем, одно- и двунитевые разрывы ДНК сперматозоидов могут быть связаны с генами ответственными за определенные звенья регуляции двигательной активности сперматозоидов. Фрагментацию ДНК сперматозоидов, характеризующуюся разрывом одной или двух нитей ДНК, интенсивно исследуют в последнее десятилетие (Sakkas et al., 1999; Carrell, 2003; Воробьева и соавт., 2005; Piomboni et al, 2006). Патофизиологические механизмы, ведущие к фрагментации ДНК, не вполне ясны, однако известно, что сперматозоиды человека часто имеют высокий уровень таких повреждений (Ahmadi, 1999). Предполагается, что их причиной могут быть нерепарированные повреждения ДНК, дефекты ремоделирования хроматина, возникающие в ходе сперматогенеза. Причинами фрагментации хроматина сперматозоидов в настоящее время также считаются апоптоз и окислительный стресс. Комплекс этих явлений в сперматозоидах стали детально исследовать лишь в последние годы и поэтому возникает еще много вопросов. Патофизиологические механизмы, ведущие к фрагментации ДНК, не вполне ясны, однако известно, что сперматозоиды человека часто имеют высокий уровень таких повреждений (Henkel, 2003)

Очевидно, что механизмы, которые приводят к фрагментации ДНК, взаимосвязаны, поскольку нарушения упаковки спермального хроматина приводит к дефектному замещению гистонов протаминами, что делает ДНК и сперматозоиды более чувствительными к неблагоприятным воздействиям, например, к влиянию высокореактивных молекул кислорода. Некоторые внешние условия и факторы связаны с повышением количества сперматозоидов в эякуляте с нарушенной ДНК, хотя механизмы, лежащие в основе этих нарушений, также не известны.

Методы для диагностики фрагментации ДНК спермы подразделяются на прямые и непрямые. С помощью прямых методов выявляются уже имеющиеся разрывы ДНК, в то время как непрямые методы позволяют оценить подверженность спермальной ДНК после внешнего

неблагоприятного воздействия, например, добавления кислоты. Наиболее широко применяемые прямые методы включают: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Nick End Labeling (TUNEL), Single Cell Gel Electrophoresis (COMET) and In-Situ Nick Translation (NT) assay. К наиболее известным непрямым методам относят: Flow cytometric acridine orange assay, Acridine Orange test (AO), DNA Break Detection-Fluorescence In Situ Hybridization (DBD-FISH) и Sperm Chromatin Dispertion test (SCD). Несмотря на различные методы оценки нарушений, все они направлены на то, чтобы попытаться определить общее число сперматозоидов с фрагментацией ДНК в независимости от участка генома, где это нарушение имело место.

Метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferases (TdT) dUTP end labeling) служит методом прямого мечения разрывов в ДНК. Интенсивность люминесценции пропорциональна числу встроенных dUTP, и, соответственно, числу разрывов в ДНК. В качестве флуорохрома обычно используют флюоресцеин. Используют расчет доли TUNEL-позитивных клеток. Применяют модификации метода, например, с использованием антифлюоресцеиновых антител. Метод требует малого числа сперматозоидов. Нормативные показатели по Carrell et al., 2003; Tesarik et al., 2004; Chohan et al., 2006; Smith et al., 2006 - 15%.

1.5 Общая характеристика митохондриального генома

Каждый сперматозоид содержит до сотни митохондрий, уложенных спиралью в средней части жгутика. Митохондрии - поставщики энергии в клетке, обеспечивающих двигательную активность жгутиков сперматозоидов. В них осуществляется ряд важных биохимических цепей реакций, из которых особенное значение для энергетического обмена клетки имеет окислительное фосфорилирование. В результате этого процесса образуются молекулы АТФ (аденозинтрифосфат) — основной источник энергии во многих биохимических превращениях.

1.5.1 Особенности митохондриальной ДНК человека

Совокупность мнтохондрнальных генов и любых реплицирующихся фрагментов митохондриальной ДНК (мтДНК) выделяют в отдельный генетический ресурс популяции - митохондриальный геном. Ценность исследований митохондриального генома для медико-генетических исследований складывается из комплекса особенностей мтДНК -материнского характера наследования, отсутствия рекомбинации, высокой скорости накопления мутаций.

Митохондриальная ДНК представляет собой геном клеточных органелл - митохондрий, у человека он составляет около 1% от общего содержания ДНК в клетке. Митохондриальный геном человека организован в суперспирализованную кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК (Даниленко, Давыденко, 2003) (рис.2) длиной 16569 пар нуклеотидов (рис. 2), которая ассоциирована с внутренней мембраной митохондрии.

МтДНК состоит из двух цепей - тяжелой (Н - heavy) и легкой (L -light). Они различаются по нуклеотидному составу, Н-цепь богата пуриновыми основаниями, L-цепь - пиримидиновыми.

МтДНК отличается от ядерной ДНК, главным образом, измененным генетическим кодом, большей компактностью, отсутствием интронов и связи с гистонами, а также низким содержанием некодирующих последовательностей - межгенные участки отсутствуют или крайне малы. Синтез ДНК в митохондриях проходит независимо от синтеза ядерной ДНК (Даниленко, Давыденко, 2003).

В структурной организации мтДНК выделяют контрольный (некодирующий) регион и кодирующий регион. Контрольный регион является единственной протяженной некодирующей структурой (порядка 1,1 тысячи пар нуклеотидов) и наиболее изменчивой частью митохондриального генома. Контрольный регион содержит последовательности, необходимые для инициации и регуляции процессов репликации и транскрипции мтДНК и

обеспечивает ассоциацию митохондриальной хромосомы с мембраной органеллы.

Контрольная область или с!-петля

12Б рРНК Цитохром Ь

'¡¡^^^^ Субъединицы

ЫАОН-дегидрогеназы

165 рРНК

(

'бъединицы -дегидроген.

22 тРНК-кодирующих гена 13 областей, кодирующих бел

Субъедин» NAD Н -д ег и д рог «и аз ы

Субъединицы ADH-дегидрогеназь

Субъ единицы цитохромоксидазы Субъединицы Субъединицы цитохромоксидазы АТФ-синтазы

Рис. 2 . Кольцевая молекула митохондриальной ДНК

Кодирующий регион включает 37 генов, кодирующих 2 рРНК (12S и 16S рРНК), 22 тРНК и 13 полипептидов (рис.2).

Одной из важнейших особенностей мтДНК является материнский характер ее наследования. При оплодотворении в момент проникновения в яйцеклетку сперматозоид утрачивает жгутик, содержащий митохондрии. Таким образом, организму достается мтДНК от матери. При этом небольшое число копий, не более 100 мтДНК на спермий, все же оказывается в цитоплазме яйцеклетки, которая содержит до 100 тыс. копий собственной мтДНК. Однако возможный вклад отцовской мтДНК в следующее поколение избирательно блокируется на молекулярном уровне и зигота приобретает

только один - материнский набор мтДНК (Cummins, 2000; Kaneda et al., 1995).

С однородительским типом наследования мтДНК связывают и отсутствие рекомбинации (Даниленко, Давыденко, 2003). Очевидно, если в организм потомства попадают митохондрии только одного родителя, все молекулы в них идентичны, и выявить рекомбинацию невозможно. Таким образом, единственным источником изменчивости митохондриального генома являются последовательно накапливаемые мутации. Однородительский тип наследования и отсутствие рекомбинаций объясняет наследование мтДНК в виде одного локуса тесно сцепленных генов, или гаплотипа (Даниленко, Давыденко, 2003).

Для процесса репликации мтДНК характерны такие особенности, как разнонаправленность и асинхронность. Гены в митохондриях лишены интронов и транскрибируются с двух промоторов в виде полицистронных мРНК, что выражает большое сходство митохондриального генома с геномом прокариот (Anderson et al., 1981; Larsson, Clayton, 1995).

Еще одной уникальной особенностью мтДНК является высокая скорость замен нуклеотидов в процессе эволюции. Установлено, что время фиксации мутаций в митохондриальном геноме примерно в 10-20 раз выше, чем в аналогичных по размеру последовательностях ядерных генов (Brown et al., 1979), а вариабельность последовательностей в контрольном регионе в 34 раза выше, чем в кодирующем (Wallace, 1995). Считается, что в процессе эволюции в митохондриальной ДНК закрепляются только селективно-нейтральные мутационные изменения (Piomboni et al., 2012). Высокий уровень мутагенеза мтДНК объясняют, в основном, отсутствием эффективных систем репарации и измененным генетическим кодом (замены в третьем положении кодонов не приводят к изменению полиаминокислотной последовательности белка) (Даниленко, Давыденко, 2003).

В силу этих уникальных особенностей (материнской характер наследования, отсутствие рекомбинаций, высокая скорость накопления мутаций) митохондриальная ДНК представляет особую ценность для популяционно-генетических исследований.

1.5.2 Использование митохондриальной ДНК в молекулярно— генетических исследованиях (особенности митохондриальной генетики)

После расшифровки и опубликования в 1981 году Андерсоном с коллегами полной нуклеотидной последовательности мтДНК человека (Anderson et al., 1981) изучение мтДНК получило широкое распространение в медицине и биологии.

В 1988 году публикованы первые работы, в которых показана связь определенных митохондриальных ДНК-мутаций с рядом заболеваний у человека (Holt et al., 1988; Wallace et al., 1988). К настоящему моменту известно уже более 110 патогенных точечных мутаций и около 200 делеций, инсерций и других структурных реорганизаций мтДНК человека, для которых показаны ассоциации с различными клиническими фенотипами (Larsson, Clayton, 1995; Cottrell et al., 2000; Naviaux, 2000; Schon, 2000). Реорганизации митохондриального генома обнаружены также при старении организма (Michikawa et al., 1999; Cottrell et al.,2001; Lee, Wei, 2001; Wallace, 2001) и при злокачественном перерождении тканей (Fliss et al., 2000; Penta et al., 2001; Tan et al., 2002). Все эти проблемы, а также возможности прогнозирования и лечения заболеваний, связанных с аномалиями митохондриального генома, - предмет изучения "митохондриальной медицины". Сформировавшись как самостоятельное направление в конце XX столетия, сегодня она представляет наиболее интенсивно развивающуюся область исследования генетики клеточных органелл.

Дыхательная цепь митохондрий состоит из пяти мультиферментных комплексов, четыре из которых осуществляют непрсредственно транспорт электронов по дыхательной цепи, а пятый — катализирует синтез АТФ.

Комплексы дыхательной цепи митохондрий находятся под двойным генетическим контролем - их субъединицы кодируются как ядерными, так и митохондриальными генами. Все 13 полипептидных цепей, кодируемых мтДНК, участвуют в ферментативном комплексе окислительного фосфорилирования: 7 субъединиц NADH-дегидрогеназного комплекса, 3 субъединицы цитохром-С оксидазы, 2 субъединицы АТФ-азного комплекса и цитохром b (Anderson et al., 1981).

Митохондрии в клетках и в организме подчиняются законам популяционной генетики. При анализе этиологии и патогенеза митохондриальных заболеваний (Schon, 2000) необходимо учитывать материнское наследование, множественность органелл в клетке и мультикопийность митохондриальных геномов.

Новые мутации могут возникать в отдельных молекулах мтДНК, что создает феномен гетероплазмии, т.е. сосуществование в организме и даже в клетке двух или более митохондриальных генотипов. Если мутация патогенная, доля мутантных молекул в гетероплазматической популяции влияет на тяжесть биохимического нарушения, но наблюдаемая зависимость не всегда является линейной. Митохондриальная ДНК реплицируется и наследуется в ряду клеточных поколений по стохастическим законам, поэтому возможна митотическая сегрегация в пользу как мутантных, так и нормальных мтДНК.

Поскольку клетки разных органов и тканей характеризуются различным минимальным уровнем энергозатрат, локализация клеток с мутантными мтДНК, уровень гетероплазмии и динамика митотической сегрегации определяют уникальную генетическую гетерогенность проявляющихся форм патологии (DiMauro, 1987)

13 белков, 2рРНК и 22тРНК, кодируемых мтДНК, составляют лишь малую часть по сравнению с более чем 1000 белков ядерного кодирования, образующих различные компоненты митохондрий, а также участвующих в репликации, транскрипции, процессинге, трансляции мтДНК, импорте

биомолекул через мембраны митохондрий и т.д. Мутации всех этих ядерных генов так же могут вызывать разнообразные митохондриальные дисфункции.

Очевидно, что любые мутации, связанные с нарушением репликации либо экспрессии митохондриального генома, в мультикопийной генетической системе будут подвергаться негативному отбору и устраняться из популяции. Однако полная утрата какой-либо из митохондриальных тРНК или рРНК вызовет прекращение белкового синтеза в митохондриях; в гомозиготном состоянии такая мутация является летальной на ранних этапах эмбриогенеза (Larsson, Clayton, 1995).

Более "мягкие" мутации, вызывающие изменение стабильности тРНК с рибосомами или с аминокислотами, приводят к аномалиям в синтезе белков с митохондриальных РНК-матриц и вызывают функциональную недостаточность дыхательной цепи (Larsson, Clayton, 1995).

Проявление мутаций мтДНК тканеспецифично: сердце, мышцы и мозг являются органами наиболее зависимыми от аномалий процесса окислительного фосфорилирования, с этим связаны особенности большинства "митохондриальных" синдромов (Cottrell et al., 2000; Schon, 2000).

В митохондриальном геноме человека обнаружен ряд единичных делеций размером от 1 до 10 т.п.н. (Holt et al., 1988; Ballinger et al., 1992; Tang et al., 2000). Оказалось, что почти треть пациентов с делециями мтДНК утрачивают один и тот же участок митохондриального генома размером 4977 п.н., несут так называемую обычную ("common") делецию. Она фланкирована двумя прямыми повторами размером 13 п.н., что является одним из признаков "горячих точек" мтДНК, и расположена между генами atp8 и nad5. Все макроделеции, найденные в мтДНК человека, разделяются на две группы: 1) имеющие короткие прямые повторы в точках разрыва ДНК молекулы; 2) не имеющие таких повторов (Mita et al, 1990; Larsson, Clayton, 1995; Schon, 2000)

У пациентов, несущих делеции мтДНК с дупликациями, описана реорганизация генома, в результате которой объединяются интактная молекула мтДНК - 16,6 т.н.п. с молекулой, несущей делецию —11,6 т.п.н., при этом образуются кольцевые молекулы размером 28,2 т.п.н. (Schon, 2000). Аналогичные перестройки генома митохондрий, сочетающие делеции с дупликациями, показаны и в других исследованиях (Poulton, 1993; Cormier-Daire et al., 1994). Очевидно, в основе таких реорганизаций лежит процесс рекомбинации ДНК, хотя вероятность его в митохондриальном геноме млекопитающих остается дискуссионной (Holt et al., 1997; Awadalla et al., 1999; Tangetal. 2000).

Патогенность крупных делеций связывают прежде всего с утратой генов сразу нескольких тРНК, что приводит к нарушению трансляции практически всего митохондриального генома. Так, при упомянутой выше делеции 4977 п.н. утрачиваются гены тРНК, расположенные между генами atp8 и nad5. С данной делецией связано развитие сразу 3 синдромов:

• синдром Кернс-Сейра - фатальная мультисистемная патология;

• прогрессирующая наружная офтальмоплегия;

• синдром Пирсона - гипопластическая анемия, нарушение экзокринной функции поджелудочной железы.

Возникнув первоначально в результате мутации, единичная молекула мтДНК с делецией амплифицируется, проводя к появлению триллионов аномальных ДНК у больных с клиническими синдромами. Было показано, что более короткие молекулы мтДНК быстрее реплицируются, получая за счет этого преимущество перед молекулами дикого типа (Tang et al. 2000). Другим фактором, по мнению некоторых исследователей, являются пока неизвестные специальные "ретроградные" сигналы, направляемые в ядро из мутантных митохондрий, что приводит к более быстрой репликации органелл вместе с мутантными мтДНК (Schon et al., 2000). Кроме перечисленных синдромов, накопление крупных делеций в мтДНК отмечено

при старении (Pavicic, Richard, 2009; Mohamed et al., 2006), обнаружены также молекулы ДНК с протяженными дупликациями (Bodyak et al., 2001).

Учитывая определенную автономность половых клеток, связанную с их обособленностью от соматических клеток на ранних стадиях эмбриогенеза, можно объяснить причину наличия аномалий хромосом в половых клетках при отсутствии таковых в соматических.

Точечные мутации митохондриальных ДНК

13 белок-кодирующих митохондриальных генов занимают примерно 77% кодирующих последовательностей мтДНК; на долю двух генов рРНК приходится 14%, а 22 гена тРНК составляют 9% мтДНК человека. Однако из 110 патогенных точечных мутаций, 2/3 расположены в генах, участвующих в процессах трансляции, причем подавляющее большинство — в молекулах тРНК (Schon, 2000). При сканировании митохондриального генома 180 пациентов на наличие точечных мутаций также оказалось, что частота мутаций в генах тРНК в 2,4 раза выше, чем в белок-кодирующих генах (Wong et al., 2002). Следует подчеркнуть, что подавляющее большинство исследованных до сих пор мутаций митохондриальных генов тРНК является рецессивными: биохимическая дисфункция проявляется лишь тогда, когда уровень немутантных мтДНК падает ниже 30% (Cottrell et al., 2000).

Наиболее часто встречающаяся точечная мутация тРНК - транзиция в

лейциновой тРНК (UUR) с заменой аденина на гуанин в 3243-м нуклеотиде

(A3243G). Данная мутация изменяет высококонсервативный нуклеотид на

дигидроуридиновой петле молекулы тРНК, а также нарушает 30-членную

последовательность, терминирующую транскрипцию и находящуюся в гене tphkleu(uur) (chomyn et al? 2000).

Самый крупный из пяти комплексов цепи дыхания - окислительного фосфорилирования комплекс I состоит из 42 белковых субъединиц, семь из которых контролируются мтДНК. Известно уже 10 мутаций ND - генов, практически все они связаны с синдромом Лебера (LHON - Leber heredity optic neuropathy) - наследуемой по материнской линии потерей зрения. При

данном заболевании у людей 20-30 лет происходит подострая потеря центрального зрения из-за атрофии зрительных нервов и дегенерации ганглиозного слоя клеток ретины (Man et al., 2002).

LHON - наиболее распространенное митохондриальное генетическое заболевание из всех известных в настоящее время. Частота встречаемости его в британской популяции - 1 на 25000. Среди всех внесенных в регистр незрячих Австралии 2% составляют пациенты с LHON (Man et al., 2002).

Высокая мутабильность митохондриальной ДНК связана, с одной стороны, с особенностями ее организации: геном мтДНК не защищен гистоновыми белками, репарационные процессы не так многообразны, как в ядре - в частности, до сих пор не показана эксцизионная репарация нуклеотидов (Croteau et al., 1999). В то же время митохондрии являются «зоной повышенной опасности»: они поглощают более 90% кислорода, попадающего в клетку, и дыхательная цепь образует при функционировании большое количество ДНК-повреждающих свободных радикалов (Larsson, Clayton, 1995; Howell, 1999).

Аккумулируя точечные мутации почти в десять раз быстрее, чем ядерный геном (Cottrel et al., 2000), митохондриальная ДНК любого представителя незамкнутой популяции отличается от мтДНК другого человека в среднем на 25 нуклеотидных замен. Этот полиморфизм создает объективные трудности в выяснении истиной роли мтДНК в патогенезе заболевания, его следует учитывать при любом исследовании митохондриального генома. Кроме того, на проявления дефекта митохондриального генома, как было видно из многих приведенных примеров, оказывают влияние также генотип ядра и внешние условия.

На основе всех этих результатов можно заключить, что в онтогенезе в разных тканях возникают и увеличиваются клоны клеток с мутантными мтДНК, являющиеся своеобразными очагами дисфункции. Именно эти очаги индуцируют нарушения работы органа или системы органов. Наличие многих митохондриальных и ядерных генов, участвующих в регуляции

двигательной активности сперматозоидов усложняют задачу диагностики астенозооспермии.

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Хаят, Сабина Шаукатовна

выводы

1. Среди пациентов с бесплодием и патозооспермией (9215 человек) 93% составляют мужчины с разными формами астенозооспермии. Структура астенозооспермии неоднородна: в 70 % случаев она сочетана с тератозооспермией, группа пациентов с олигоастенотератозооспермией составляет 26% , с олигоастенозооспермией - 0,25%, астенозооспермия встречается у 4% обследованных. Это свидетельствует о различных механизмах, приводящих к нарушению двигательной активности сперматозоидов.

2. При электронно-микроскопическом исследовании в эякуляте пациентов с астенозооспермией (86 мужчин) повышенное содержание и /-ч сперматозоидов с прореагировавшей акросомои выявляется в 2 раза чаще, а с нарушенной структурой плотных фибрилл в 6 раз чаще, чем у пациентов с нормальной подвижностью сперматозоидов.

3. При электронно-микроскопическом исследовании в эякуляте пациентов с астенозооспермией (86 мужчин) обнаружены сочетания нарушений нескольких ультраструктур сперматозоидов. Изменение положения акросомы, выявленное у 64 пациентов, сочетается с наличием цитоплазматической капли на головке и нерегулярной укладкой митохондрий в 15.6 % случаев (10 мужчин). Нарушение строения пар периферических микротрубочек (12 мужчин) сопровождается изменением положения акросомы (91,7% случаев), нерегулярной укладкой митохондрий (83,3% случаев), сдвигом наружных плотных фибрилл аксонемы (67,7% случаев). При этом у 6 из 12 мужчин наблюдали четыре ультраструктурные аномалии сперматозоидов - нарушение строения пар периферических микротрубочек, изменение положения акросомы, нерегулярная укладка митохондрий, сдвиг наружных плотных фибрилл аксонемы.

4. При электронно-микроскопическом исследовании эякулята пациентов с астенозооспермией (86 мужчин) не обнаружено ассоциации астенозооспермии и повышенного содержания сперматозоидов с нарушением конденсации хроматина. При анализе фрагментации ДНК ассоциации между количеством сперматозоидов с нарушением целостности ДНК и низкой подвижностью сперматозоидов не выявлено.

5. Количественный кариологический анализ соотношения незрелых половых клеток из эякулята на разных стадиях сперматогенеза впервые позволил выявить блок сперматогенеза на стадиях прелептотены-лептотены-зиготены и повышенное количество незрелых половых клеток с признаками дегенерации у 80% мужчин с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией. Неразошедшиеся в делениях мейоза сперматиды выявлены в 50% исследованных по незрелым половым клеткам случаев астенозооспермии.

6. Проведенный на репрезентативной выборке (240 пациентов с астенозооспермией) молекулярно-генетический анализ митохондриальной ДНК свидетельствует о неучастии делеции митохондриальной ДНК 4977 и точковой мутации митохондриальной ДНК АЗ243О в патогенезе астенозооспермии.

7. Проведенный молекулярно-генетический анализ гена САРОНГ, кодирующего один из ферментов гликолиза, спермоспецифическую глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназу, позволил впервые описать в этом гене полиморфизм гб29381 (660-22 С>А) в гетерозиготном состоянии у пациентов с тотальной астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя аксонемы жгутика.

8. Модифицирован протокол комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией с обязательным цитогенетическим (по лимфоцитам периферической крови), ультраструктурным анализом сперматозоидов и исследованием гена С АРИН Б.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выяснение механизмов нарушения репродуктивной функции и гаметопатии мужчин является одной из важнейших проблем андрологии, медицинской генетики, репродуктивной медицины. Исследование причин мужского бесплодия имеет не только биологическое, но и медико-социальное значение.

Гетерогенность механизмов, приводящих к астенозооспермии усложняет изучение ее патогенеза. В организме человека сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов связанных с клеточной пролиферацией и дифференцировкой.

Известно, что подвижность сперматозоидов осуществляется за счет аэробных и анаэробных процессов. Аэробные процессы обеспечиваются энергией за счет митохондрий, анаэробные - за счет гликолиза. В последнее время проводят активные работы по изучению влияния мутаций митохондриальной ДНК на двигательную способность сперматозоидов. В литературе обсуждается значимость протяженной делеции митохондриальной ДНК размером в 4977 п.н., при которой делетируется около трети молекулы мтДНК. Проведенные нами молекулярно-генетические исследования продемонстрировали, что распространенная делеция мтДНК 4977 не имеет клинической значимости для пациентов с астенозооспермией, данная протяженная делеция была обнаружена нами в образцах эякулята у обследованных пациентов с астенозооспермией и в контрольной группе примерно с равной частотой (70% и 71%», соответственно). Не было выявлено различий между фракциями с разной подвижностью сперматозоидов в одном и том же образце.

Другим механизмом, обеспечивающим сперматозоид энергией, необходимой для его подвижности является гликолиз. Одним из ферментов, участвующем в гликолизе является спермоспецифическая изоформа глицеральдегид—3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФДс), которая катализирует окислительное фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфата до 1,391 дифосфоглицерата. Этот фермент локализован в фиброзном слое жгутика. Ранее было показано, что у пациентов с дисплазией фиброзного слоя снижается активность ГАФДс. В рамках данной работы была исследована генетическая составляющая дисплазии фиброзного слоя, продемонстрирована ассоциация между сниженной активности фермента ГАФДС и наличием полимофризма А66(Ю у пациентов с астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя жгутика.

В рамках данного исследования было проведено комплексное медико-генетическое обследование пациентов со сниженными показателями подвижности сперматозоидов и бесплодием; проанализированы структура и патогенез различных случаев астенозооспермии; оценен вклад астенозооспермии в структуру патозооспермии на выборке 9215 пациентов, обследованных в лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ.

Одним из первых подходов к выявлению механизмов, вовлеченных в обеспечение подвижности сперматозоидов, было изучение ультраструктуры жгутика. Поэтому, несмотря на фрагментарность информации о сигнальных путях и молекулярных механизмах, которые контролируют сборку и функционирование жгутика сперматозоида, его ультраструктура охарактеризована относительно детально (МоЬЬег1еу, 2010; ВассеШ ег а1 2004).

В данной работе рассмотрены различные формы нарушений ультраструктурной организации сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией. Показано, что повышенное содержание сперматозоидов с измененным положением акросомы у пациентов с астенозооспермией обнаруживается в 1,5 раза чаще, чем у пациентов с нормальной подвижностью. Из 86 исследованных пациентов с астенозооспермией у 2 человек отсутствовала центральная пара микротрубочек аксонемы жгутика (9+0) , у 29 (34%) пациентов повышено содержание сперматозоидов с нарушением строения пар периферических микротрубочек (5+2, 7+2, 9+1 и т.д.), у 8 пациентов (9%) повышено содержание сперматозоидов с дезорганизацией строения пар микротрубочек. У 4 человек содержалось более 50% сперматозоидов с дисплазией фиброзного слоя, у 8 обратившихся повышено содержание сперматозоидов со сдвинутыми плотными фибриллами. Проведение количественного анализа морфологических аномалий аксонемы имеет прогностическое значение у пациентов с астенозооспермией - выявление генетических причин астенозооспермии важно при планировании ВРТ для пациентов с астенозооспермией и бесплодием, поскольку необходимо информировать пациента о риске передачи потомству генетической патологии от родителя.

Автор выражает глубокую признательность к.б.н Шилейко JI.B., к.б.н Сорокиной Т.М., сотрудникам лоборатории цитогенетики Кузиной Н.Ю., Магомедовой Х.Д., Барковой О.В. за помощь в проведении спермиологического и цитогенетического анализов. Коллективу и ведущим специалистам Лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН за ценные критические замечания и всестороннее обсуждение результатов исследования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хаят, Сабина Шаукатовна, 2012 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источников

1. Андрология. Клинические рекомендации. Под ред. П. А. Щеплева. М.: Медпрактика-М, 2012. - 155с.

2. Божедомов В.А. Актуальные вопросы оказания медицинской помощи парам с мужским фактором бесплодия // Материалы XIX международной конференции Российской ассоциации репродукции человека. (10-12 сентября 2009г., Иркутск). // Репродуктивные технологии сегодня и завтра. 2009. С. 20-21.

3. Бочарова E.H., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К. Количественное ультраструктурное исследование сперматозоидов человека при нарушении фертильности // Вестник новых медицинских технологий. -2007. - Т XIV, № 4. - С. 199-201.

4. Брагина Е.Е. Закономерности нарушений сперматогенеза человека при некоторых генетических и инфекционных заболеваниях. Автореф, дисс. докт. биол. наук, МГУ им М. В. Ломоносова, М., 2001. - 53с.

5. Брагина Е.Е., Замятина В.А., Бочарова E.H., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Гусак Ю.К., Поляков В.Ю. Повреждения ДНК сперматозоидов у мужчин с нарушениями фертильности // Материалы 11 международной медицинской выставки «Мужское здоровье и долголетие». (18-19 февраля , 2009 г., Москва), С. 20.

6. Брагина Е.Е., Курило Л.Ф., Абдумаликов P.A., Бочарова E.H., Михайлова Е.М., Гришина Е.М., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М. Множественные дефекты ультраструктурной организации жгутика сперматозоида у пациента с абсолютной астенотератозооспермией // Проблемы репродукции. 2004. №1. С. 66-69.

7. Брагина Е.Е., Шмальгаузен Е.В., Элькина Ю.Л., Черных В.Б., Курило Л.Ф. Нарушения морфологических и биохимических свойств жгутиков сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии // Материалы 6 международной медицинской выставки «Мужское здоровье и долголетие». (19-20 февраля , 2008 г., Москва), С. 28.

8. Быков В.Jl. Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2000. №1. С. 6-13.

9. Вартанян Э. В., Петрин А.Н., Курносова Т.Р. Генетические факторы мужского бесплодия // Проблемы репродукции. 2010. №2. С.74-78.

10. Вафин Р.Г., Радченко O.P., Сабирова Ф.М. Тенденции изменений качества эякулята жителей республики Татарстан // Проблемы реподукции. 2010. №2. С. 63-65.

П.Воробьева O.A., Воскресенская A.B., Одинцов A.A., Филатов М.В. Мужское бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов. Существует ли связь? // Проблемы репродукции. 2005. №6. С. 56-62.

12. Глинкина Ж.И. Медико-генетические аспекты обследования супружеских пар с бесплодием, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ: дисс. канд. биол. наук. М., 2003. 134 с.

13.Гоголевский П. А., Гоголевская И.К. Молекулярно-генетические основы мужского бесплодия // Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии. Под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова, Л.Н. Кузмичева. М.: МИА, 2005. С. 176189.

14.Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Минск: Технология, 2003. 494 с.

15.Долгов В.В., Луговская С.А., Фанченко Н.Д., Миронова И.И., Назарова Е.К., Ракова Н.Г., Раков С.С., Селиванов Т.О., Щелочков А. М. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Тверь.: Триада, 2006. 145с.

16.Клещев М.А., Осадчук A.B., Гуторова Н.В., Типисова Е.В., Осадчук Л.В. Анализ сперматогенной функции у мужского населения г. Архангельска // Андрология и генитальная хирургия. 2011. №2. С.56-60.

17.Кулешов Н.П. Современные методы в клинической цитогенетике: учебно-методическое пособие. М. 1991. - 128 с.

18.Курило Л. Ф. Генетическая регуляция развития мужской половой системы // Материалы 2 международной медицинской выставки «Мужское здоровье и долголетие». (17-19 февраля, 2004 г., Москва), С. 74-75.

19.Курило Л. Ф., Дубинская В. П., Остроумова Т. В., Шилейко Л. В., Мхитаров В.А., Литвиненко В. М. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам эякулята // Проблемы репродукции. 1995. №3. С. 3338.

20.Курило Л. Ф., Сорокина Т. М. Структура генетических заболеваний половой системы // Материалы I всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». (16-19 октября, 2002 г., Москва), С. 125-126.

21. Курило Л.Ф. Проблемы и задачи охраны и преконцепционной профилактики репродуктивного здоровья поколений // Андрология и генитальная хирургия. 2008. №2. С. 7-20.

22.Курило Л.Ф., Сорокина Т.М., Черных В.Б., Брагина Е.Е., Гордеева Е.Г., Шилейко Л.В., Мясников Д.А., Гончарова H.H., Марченко Л.А., Жахур H.A., Сонова М.М., Коломиец О.Л. Структура генетически обусловленных заболеваний органов половой системы человека // Андрология и генитальная хирургия. 2011. №3. С. 17-26.

23.Курило Л.Ф.,Остроумова Т.В., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Климова P.P., Чичев Е.В., Гаджтева З.С., Цибизов A.C., Бочарова E.H., Кущ A.A. Оценка состояния сперматогенеза по незрелым половым клеткам из эякулята пациентов с проблемами деторождения, сперматозоиды которых инфицированы вирусом простого герпеса // Материалы 11 международной медицинской выставки «Мужское здоровье и долголетие». (18-19 февраля , 2009 г., Москва), С. 47.

24.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: МИР, 1984. 479 с.

25.Никитин А.И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека (ответственность перед будущими поколениями). 2-е изд., доп. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. С. 22-59.

26.Потемина Т.Е., Шевантаева О.Н., Кузнецов C.B. Влияние внешних факторов на мужскую репродуктивную систему. Под ред. Д.И. Рыжакова. Нижний Новгород: НГМА, 2006. 28с.

27.Сегал A.C. Заболевания половой системы у мужчин. М.: ИКАР, 2010. 324 с.

28.Сухих Г.Т., Божедомов В.А. Мужское бесплодие. М.: Эксмо, 2009. 240 с.

29.Черных В.Б. Генетические факторы мужского бесплодия // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы». // Медицинская генетика. 2006. Прил 2. С. 8-14.

ЗО.Черных В.Б., Курило Л.Ф. Генетический контроль гормональной регуляции дифференцировки пола и развития половой системы у человека (обзор литературы) // Генетика. 2001. Т.37, №11. С. 1475-1485.

31.Черных В.Б., Курило Л.Ф. Генетический контроль дифференцировки пола у человека (обзор литературы) // Генетика. 2001. Т.37, №10. С.1317-1329.

32.Элькина Ю.Л. Роль глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в регуляции подвижности сперматозоидов // Материалы XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». (11-14 апреля 2007 г., Москва). С. 40.

33.Acacio B.D., Gottfried Т., Israel R., Sokol R. Z. Evaluation of a large cohort of men presenting for a screening semen analysis // Fértil. Steril. 2000. Vol. 73, №3. P. 595-597.

34.Adiga S.K., Jayaraman V., Kalthur G., Upadhya D., Kumar P. Declining semen quality among south Indian infertile men: A retrospective study // J. Hum. Reprod. Sei. 2008. Vol 1, №1. P. 15-18.

35.Afzelius B., Eliasson R. Flagellar mutants in man: on the heterogeneity of the immotile-cilia syndrome // J. Ultrastruct. Res. 1979. Vol 69, №1. P. 4352.

36.Afzelius B.A. A human syndrome caused by immotile cilia // Science. 1976. Vol. 193. P. 317-319.

37.Afzelius B.A. The immotile-cilia syndrome: a microtubule-associated defect. // Crit. Rev. Biochem. 1985. Vol.19, №1. P. 63-87.

38.Ahmadi A., Ng S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa // J Exp Zool. 1999. Vol. 284, №6. P. 696-704.

39.Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular biology of the cell. 5th edition. Garland Science. 2008. 1392 p.

40.Anderson S., Bankier A.T., Barreil B.G., Bruijn M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J., Staden R., Young I.G. Sequence and organization of the human mitochondrial genome //Nature. 1981 Vol. 290, № 5806. P. 457-465.

41.Auger J., Kunstmann J.M., Czyglik F., Jouannet P. Decline in semen quality among fertile men in Paris during the past 20 years // N. Engl. J. Med. 1995. Vol. 332. P. 281-285.

42.Awadalla P., Eyre-Walker A., Smith J.M. Linkage disequilibrium and recombination in hominid mitochondrial DNA // Science. 1999. Vol. 286. P. 2524-2525.

43.Baccetti B, Bruni E, Gambera L, Moretti E, Piomboni P. An ultrastructural and immunocytochemical study of a rare genetic sperm tail defect that causes infertility in humans // Fertil. Steril. 2004. Vol. 82, №2. P. 463-468.

44.Ballinger S.W., Shoffner J.M., Hedaya E.V., Trounce I., Polak M.A., Koontz D.A., Wallace D.C. Maternally transmitted diabetes and deafness

associated with a 10.4 kb mitochondrial DNA deletion // Nat. Genet. 1992. Vol. 1, № 1. P. 11-15.

45.Bartoov B., Eltes F., Pansky M., Langzam J., Reichart M., Soffer Y. Improved diagnosis of male fertility potential via a combination of quantitative ultramorphology and routine semen analyses // Hum. Reprod. 1994. Vol. 9, №11. P. 2069-2075.

46.Benchaib M., Braun V., Lornage J. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique // Hum Reprod. 2003. Vol. 18, №5. P. 1023-1028.

47.Berling S., Wolner-Hanssen P. No evidence of deteriorating semen quality among men in infertile relationships during the last decade: a study of males from Southern Sweden//Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 1002-1007.

48.Beshay V.E., Bukulmez O. Sperm DNA damage: how relevant is it clinically? // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2012. Vol. 24, №2. P. 44 - 48.

49.Bodyak N.D., Nekhaeva E., Wei J.Y., Khrapko K. Quantification and sequencing of somatic deleted mtDNA in single cells: evidence for partially duplicated mtDNA in aged human tissues // Hum. Mol. Genet. 2001 Vol. 10, №l.P. 17-24.

50.Bromwich P., Cohen J., Stewart I., Walker A. Decline in sperm counts: an artefact of changed reference range of "normal"? // Brit. Med. J. 1994. Vol. 309. P. 19-22.

51.Brown W.M., George M.J., Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. Vol. 76. P. 19671971.

52.Burgess S.A., Walker M.L., Sakakibara H., Knight P.J., Oiwa K. Dynein structure and power stroke //Nature. 2003. Vol. 421, №6924. P. 715-718.

53.Carrell D.T., Liu L., Peterson C.M., Jones K.P., Hatasaka H.H., Erickson L., Campbell B. Sperm DNA fragmentation is increased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss // Arch. Androl. 2003. Vol. 49, №1. P. 49-55.

54.Chemes E.H., Rawe Y.V. Sperm pathology: a step beyond descriptive morphology. Origin, characterization and fertility potential of abnormal sperm phenotypes in infertile men // Hum. Reprod. Update. 2003. Vol. 9, №5. P. 405-428.

55.Chemes H.E, Alvarez S.C. Tales of the tail and sperm head aches: changing concepts on the prognostic significance of sperm pathologies affecting the head, neck and tail // Asian J Androl. 2012. Vol. 14, № 1. P. 14-23.

56.Chemes H.E. Phenotypes of sperm pathology: genetic and acquired forms in infertile men // J. Androl. 2000. Vol. 21, №6. P. 799-808.

57.Chemes H.E., Brugo S., Zanchetti F., Carrere C., Lavieri J.C. Dysplasia of the fibrous sheath: an ultrastructural defect of human spermatozoa associated with sperm immotility and primary sterility. Fertil. Steril. 1987. Vol. 48, №4. P. 664-669.

58.Chemes H.E., Olmedo S.B., Carrere C., Oses R., Carizza C., Leisner M., Blaquier J. Ultrastructural pathology of the sperm flagellum: association between flagellar pathology and fertility prognosis in severely asthenozoospermic men// Hum. Reprod. 1998. Vol. 13, №9. P. 2521-2526.

59.Chemes H.E., Rawe V.Y. The making of abnormal spermatozoa: cellular and molecular mechanisms underlying pathological spermiogenesis // Cell Tissue Res. 2010. Vol. 341, №3. P. 349-357.

60.Chia S.E., Lim T. A., Tay S. K., Lim S. T. Factors associated with male infertility: a case-control study of 218 infertile and 240 fertile men // British Journal of Obstetrics and and Gynaecology. 2000. Vol. 107, № l.P. 55-61.

61.Chohan K.R., Griffin J.T., Lafromboise M., De Jonge C.J., Carrell D.T. Comparison of chromatin assays for DNA fragmentation evaluation in human sperm // J. Androl. 2006 Vol. 27, №1. P. 53-59.

62.Chomyn A., Enriquez J.A., Micol V., Fernandez-Silva P., Attardi G. The mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episode syndrome-associated human mitochondrial tRNALeu(UUR) mutation causes aminoacylation deficiency and concomitant reduced

association of mRNA with ribosomes // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, №25. P. 19198-19209.

63.Cooke HJ., Hargreave T., Elliott D.J. Understanding the genes involved in spermatogenesis: a progress report // Fértil. Steril. 1998. Vol. 69, №6. P. 989-995.

64.Cooper R.I., Kavlock R.J. Endocrine disruptors and reproductive development: a weight-of-evidence overview // J. Endocrinol. 1997. Vol. 152. P. 159-166.

65.Cormier-Daire V., Bonnefont J.P., Rustin P., Maurage C., Ogler H., Schmitz J., Ricour C., Saudubray J.M., Munnich A., Rötig A. Mitochondrial DNA rearrangements with onset as chronic diarrhea with villous atrophy // J. Pediatr. 1994. Vol. 124, №1. P. 63-70.

66.Costello M.F., Sjoblom P., Haddad Y., Steigrad S.J., Bosch E.G. No decline in semen quality among potential sperm donors in Sydney, Australia, between 1983 and 2001 // J. Assist. Reprod. Genet. 2002. Vol. 19, №6. P. 284-290.

67.Cottrel D.A., Blakely E.L., Borthwick G.M. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2000. Vol. 908. P. 199-207.

68.Cottrell D.A., Blakely E.L., Johnson M.A., Borthwick G.M., Ince P.I., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA mutations in disease and ageing // Novartis Found Symp. 2001. P. 243-246.

69.Courtade M., Lagorce C., Bujan L., Caratero C., Mieusset R. Clinical characteristics and light and transmission electron microscopic sperm defects of infertile men with persistent unexplained asthenozoospermia // Fértil. Steril. 1998. Vol. 70, №2. P. 297-304.

70.Cox D.W., Talamo R.C. Genetic aspects of pediatric lung disease // Pediatr Clin. North Am. 1979. Vol. 26, №3. P. 467-80.

71.Croteau D.L., Stierum R.H., Bohr V.A. Mitochondrial DNA repair pathways // Mutat. Res. 1999.Vol. 434, №3. P. 137-148.

72.Cummins J. M. Fertilization and elimination of the paternal mitochondrial genome // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15, Suppl. 2. P. 92-101.

73.De Kretser D.M., Huidobro C., Southwick G.J., Temple-Smith P.D. The role of the epididymis in human infertility // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1998. Vol. 53. P. 271-275.

74.Dhillon V.S., Shahid M., Husain S.A. Associations of MTHFR DNMT3b 4977 bp deletion in mtDNA and GSTM1 deletion, and aberrant CpG island hypermethylation of GSTM1 in non-obstructive infertility in Indian men // Mol. Hum. Reprod. 2007. Vol. 13, №4. P. 213-222.

75.Diemer T., Desjardins C. Developmental and genetic disorders in spermatogenesis // Hum. Reprod. Update. 1999. Vol. 5, №2. P. 120-140.

76.DiMauro S., Servidei S., Zeviani M., DiRocco M., DeVivo D.C., DiDonato S., Uziel G., Berry K., Hoganson G., Johnsen S.D. Cytochrome C oxidase deficiency in Leigh syndrome // Ann. Neurol. 1987. Vol. 22, №4. P. 498506.

77.Evans V.J., Bryant J.C., Kerr H.A., Schilling E.L. Chemically defined media for cultivation of long-term cell strains from four mammalian species // Exp. Cell. Res. 1964. Vol. 36. P. 439-474.

78.Farrow S. Falling sperm quality: fact or fiction? // Brit. Med. J. 1994. Vol. 309. P. 1-2.

79.Fawcett D.W. The mammalian spermatozoon // Dev. Biol. 1975. Vol. 44. P. 394-436.

80.Feki N.C., Abid N., Rebai A., Sellami A., Ayed B.B., Guermazi M., Bahloul A., Rebai T., Ammar L.K. Semen quality decline among men in infertile relationships: experience over 12 years in the South of Tunisia // J. Androl. 2009. Vol. 30, №5. P. 541-547.

81.Fliss M.S., Usadel H., Caballero O.L. Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids // Science. 2000. Vol. 287. P. 2017-2019.

82.Francavilla S., Pelliccione F., Cordeschi G., Necozione S., Santucci R., Bocchio M., Mihalca R., Ciociola F., Francavilla F. Utrastructural analysis of asthenozoospermic ejaculates in the era of assisted procreation // Fertil. Steril. 2006. Vol. 85, №4. P. 940-946.

83. Gandini L., Lombardo F., Paoli D. Study of apoptotic DNA fragmentation in human spermatozoa // Hum. Reprod. 2000. Vol. 15, №4. P. 830-839.

84.Gee C.C., Zimmer-Faust R.K. The effects of walls, paternity and ageing on sperm motility // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200, №24. P. 3185-3192.

85.Geremek M., Witt M. Primary ciliary dyskinesia: genes, candidate genes and chromosomal regions. J. Appl. Genet. 2004 ; Vol. 45, №3. 347-361.

86.Gianaroli L, Magli MC, Collodel G, Moretti E, Ferraretti AP, Baccetti B. Sperm head's birefringence: a new criterion for sperm selection. Fertil Steril. 2008. Vol. 90, №1. P. 104-112.

87.Ginsburg J., Okolo S., Prelevic G., Hardman P. Residence in the London area and sperm density // Lancet. 1994. Vol. 343. P. 230.

88.Goto, Y., Nonaka, I., Horai, S. A mutation in the tRNALeu(UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalopathies // Nature. 1990. Vol. 348, №6302. P. 651-653.

89.Harrison A., Sakato M., Tedford H.W., Benashski S.E., Patel-King R.S., King S.M. Redox-based control of the gamma heavy chain ATPase from Chlamydomonas outer arm dynein // Cell Motil. Cytoskeleton. 2002. Vol. 52, №3. P. 131-143.

90.Hecht N.B. Molecular mechanisms of male germ cell differentiation // Bioessays. 1998. Vol. 20, №7. P. 555-561.

91.Henkel R., Hajimohammad M., Stalf T. Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy // Fertil .Steril. 2004. Vol. 81. P. 965972.

92.Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M., Stalf T., Hoogendijk C., Mehnert C., Menkveld R., Schill W.B., Kruger T.F. DNA fragmentation of

spermatozoa and assisted reproduction technology // Reprod. Biomed. Online. 2003. Vol. 7, №4. P. 477-484.

93.Henkel R., Menkveld R., Kleinhappl M., Schill W.B. Seasonal changes in human sperm chromatin condensation // J. Assist. Reprod. Genet. 2001. Vol. 18, №7. P. 371-377.

94.Henkel R.R. Leukocytes and oxidative stress: dilemma for sperm function and male fertility // Asian. J. Androl. 2011 Vol. 13, №1. P. 43-52.

95.Holt I.J., Dunbar D.R., Jacobs H.T. Behaviour of a population of partially duplicated mitochondrial DNA molecules in cell culture: segregation, maintenance and recombination dependent upon nuclear background // Hum Mol Genet. 1997. Vol. 6, №8. P. 1251-1260.

96.Holt I.J., Harding A.E., Morgan-Hughes J.A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies // Nature. 1988. Vol. 331. P. 717-719.

97.Holzbaur E.L, Vallee R.B. Dyneins: molecular structure and cellular function // Ann. Rev. Cell Biol. 1994. Vol. 10. P. 339-372.

98.Hungerford D.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KC1 // Stain. Technol. 1965. Vol. 40, №6. P. 333-338.

99.Ibanez-Tallon I., Heintz N., Omran H.To beat or not to beat: roles of cilia in development and disease //Hum. Mol. Genet. 2003. Vol. 1, №12. P. 27-35.

100. Ieremiadou F., Rodakis G.C. Correlation of the 4977 bp mitochondrial DNA deletion with human sperm dysfunction // BMC Res. Notes. 2009. Vol. 4, №2. P. 18.

101. Inaba K., Kagami O., Ogawa K. Tctex2-related outer arm dynein light chain is phosphorylated at activation of sperm motility // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 256, №1. P. 177-183.

102. Inaba K., Mohri H. Two states of the conformation of 21S outer arm dynein coupled with ATP hydrolysis // J Biochem. 1989. Vol. 106, №2. P. 349-354.

103. Inaba K.Conformational changes of dynein: mapping and sequence analysis of ATP-Vanadate-dependent trypsin-sensitive sites on the outer arm dynein b heavy chain from sea urchin sperm flagella // J. Biochem. 2000. Vol. 127, №6. P. 1115-1120.

104. Irvine S., Cawood E., Richardson D. Evidence of deteriorating semen quality in the United Kingdom: birth cohort study in Scotland over 11 years //Brit. Med. J. 1996. Vol. 312. P. 467-470.

105. Jensen T.K., Andersson A.M., Hjollund N.H. Inhibin B as a serum marker of spermatogenesis: correlation to differences in sperm concentration and follicle-stimulating hormone levels. A study of 349 Danish men // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997. Vol. 82. P. 4059-4063.

106. Jensen T.K., Giwermann A., Carlsen E., Scheike T., Skakkeback N.E. Semen quality among mem-bers of organic food associations in Zealand, Denmark//Lancet. 1996. Vol. 347. P. 1844.

107. Joffe M. Disorders of spermatogenesis in Finland. Is this a period effect, and if so, why? // Brit. Med. J. 1997. Vol. 314. P. 1042-1043.

108. Jouannet P., Wang C., Eustache F., Kold-Jensen T., Auger J. Semen quality and male reproductive health: the controversy about human sperm concentration decline // APMIS. 2001. Vol. 109, №5. P. 333-344.

109. Kaneda Hayashi J., Takahama S., Taya C., Lindahl K. F., Yonekawa H. Elimination of paternal mitochondrial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis // Proc Natl Acad Sei USA. 1995. V. 92 P. 4542-4546.

110. Kao S., Chao H.T., Wei Y.H. Mitochondrial deoxyribonucleic acid 4977-bp deletion is associated with diminished fertility and motility of human sperm // Biol Reprod. 1995. Vol. 52, №4. P. 729-736

111. Kierszenbaum A.L., Tres L.L. The acrosome-acroplaxome-manchette complex and the shaping of the spermatid head // Arch. Histol. Cytol. 2004. Vol. 67, №4. P. 271-284.

112. King L.M., Holsberger D.R. Donoghue A.M. Correlation of CASA velocity and linearity parameters with sperm mobility phenotype in turkeys // J. Androl. 2000. Vol. 21, №1. P. 65-71.

113. Kobayashi H, Nagao K, Nakajima K. Focus issue on male infertility // Adv. Urol. 2012. Vol. 2012, P. 823.

114. Lamirande E, Gagnon C. Redox control of changes in protein sulfhydryl

levels during human sperm capacitation // Free Radic Biol Med. 2003. Vol. 35,

№10. P. 1271-1285.

115. Larsson N.G., Clayton D.A. Molecular genetic aspects of human mitochondrial disorders // Ann. Rev. Genet. 1995. Vol. 29. P.151-178.

116. Lee H.C., Wei Y.H. Mitochondrial alterations, cellular response to oxidative stress and defective degradation of proteins in aging // Biogerontology. 2001. Vol. 2. P. 231-244.

117. Lenaz G., Genova M.L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject // Antioxid Redox Signal. 2010. Vol. 12. P. 961-1008.

118. Lerchl A. Evidence for decreasing quality of sperm. Presentation of data on sperm concentration was flawed // BMJ. 1995. Vol. 311, №7004. P. 569-570.

119. Lerchl A., Nieschlag E. Decreasing sperm counts? A critical review. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 1996. Vol. 104, №4. P. 301-307.

120. Man P.Y., Griffiths P.G., Brown D.T., Howell N., Turnbull D.M., Chinnery P.F. The epidemiology of Leber hereditary optic neuropathy in the North East of England // Am. J. Hum. Genet. 2003. Vol. 72, №2. P. 333339.

121. Marimuthu P., Kapilashrami M.C., Misro M.M., Singh G. Evaluation of trend in semen analysis for 11 years in subjects attending a fertility clinic in India // Asian J. Androl. 2003. Vol. 5, №3. P. 221-225.

122. Matzuk M.M, Lamb D.J. Genetic dissection of mammalian fertility pathways //Nat. Cell Biol. 2002. Vol 4, Suppl 1. P. 41-49.

123. Matzuk M.M, Lamb D.J. The biology of infertility: research advances and clinical challenges // Nat Med. 2008. Vol. 14, №11. P.1197-1213.

124. McLachlan R.I., Mallidis C., Ma K., Bhasin S., de Kretser D.M. Genetic disorders and spermatogenesis // Reprod. Fertil. Dev. 1998. Vol. 10, №1. P. 97-104.

125. Menkveld R., Huwe P., Ludwig M., Weidner W. Morphological sperm alterations in different types of prostatitis // Andrologia. 2003. Vol.35. P. 288-293.

126. Michikawa Y., Mazzucchelli F., Bresolin N. Aging-dependent large accumulation of point mutations in the human mtDNA control region for replication// Science. 1999. Vol. 286. P. 774-779.

127. Mikai C., Okuno M. Glycolysis plays a major role for adenosine triphosphate supplementation in mouse sperm flagellar movement // Biol. Reprod. 2004 Vol. 71, №2. P. 540-547.

128. Miki K., Willis W., Brown P., Goulding E., Fulcher K., Eddy E. Targeted disruption of the AKAP4 gene causes defects in sperm flagellum and motility // Dev. Biol. 2002. Vol. 248. P. 331-342.

129. Milisav I. Dynein and dynein-related genes // Cell Motil Cytoskeleton. 1998. Vol. 39. P. 261-272.

130. Mita S., Rizzuto R., Moraes C.T., Shanske S., Arnaudo E., Fabrizi G.M., Koga Y., DiMauro S., Schon E.A. Recombination via flanking direct repeats is a major cause of large-scale deletions of human mitochondrial DNA // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18, №3. P. 561-567.

131. Mobberley M.A. Electron microscopy in the investigation of asthenozoospermia //Br. J. Biomed. Sci. 2010. Vol. 67, №2. P. 92-100.

132. Mocz G., Farias J., Gibbons I.R.. Proteolytic analysis of domain structure in the beta heavy chain of dynein from sea urchin sperm flagella // Biochemistry. 1991. Vol. 30, №29. P. 7225-7231.

133. Mocz G., Gibbons I.R. Model for the motor component of dynein heavy chain based on homology to the AAA family of oligomeric ATPases // Structure. 2001. Vol. 9, №2. P. 93-103.

134. Mohamed S.A., Hanke T., Erasmi A.W., Bechtel M.J., Scharfschwerdt M., Meissner C., Sievers H.H., Gosslau A. Mitochondrial DNA deletions and the aging heart // Exp. Gerontol. 2006. Vol. 41, №5. P. 508-517

135. Multigner L, Oliva A. Secular variations in sperm quality: fact or science fiction? // Cad Saude Publica.. 2002. Vol. 18, №2. P. 403-412.

136. Naviaux R.K. Mitochondrial DNA disorders // Eur. J. Pediatr. 2000. Vol. 159, Suppl. 3. P. 219-226.

137. Ogawa K. Four ATP-binding sites in the midregion of the beta heavy chain of dynein// Nature. 1991. Vol. 352, №6336. P. 643-645.

138. Ogawa K., Kamiya R., Wilkerson C.G., Witman G.B. Interspecies conservation of outer arm dynein intermediate chain sequences defines two intermediate chain subclasses // Mol Biol Cell. 1995. Vol. 6, №6. P. 685896.

139. Ogawa K., Takai H., Ogiwara A., Yokota E., Shimizu T., Inaba K., Mohri H. Is outer arm dynein intermediate chain 1 multifunctional? // Mol. Biol. Cell. 1996. Vol. 7, №12. P. 1895-1907.

140. Okabe M., Ikawa M., Ashkenas J. Male infertility and the genetics of spermatogenesis //Am. J. Hum. Genet. 1998. Vol. 62, №6. P. 1274-1281.

141. Oliva A., Spira A., Multigner L. Contribution of environmental factors to the risk of male infertility // Hum Reprod. 2001 Vol. 16, №8. P. 17681776.

142. Ostrowski L.E., Blackburn K., Radde K.M., Moyer M.B., Schlatzer D.M., Moseley A., Boucher R.C. A proteomic analysis of human cilia: identification of novel components // Mol Cell Proteomics. 2002. Vol. 1, №6. P. 451-465.

143. Padma P., Hozumi A., Ogawa K., Inaba K. Molecular cloning and characterization of a thioredoxin-nucleoside diphosphate kinase related dynein intermediate chain from the ascidian, Ciona intestinalis. // Gene. 2001. Vol. 275, №1. P. 177-183.

144. Pajarinen J., Karhunen P.J., Savolainen V. Moderate alcohol consumption and disorders of human spermatogenesis // Alcohol Clin. Exper. Res. 1996. Vol. 20. P. 332-337.

145. Pajarinen J., Laippala P., Penttila A., Karhunen P.J. Incidence of disorders of spermatogenesis in middle aged Finnish men, 1981-1991: two necropsy series //Brit. Med. J. 1997. Vol. 314. P. 13-18.

146. Pavicic W.H., Richard S.M. Correlation analysis between mtDNA 4977-bp deletion and ageing // Mutat. Res. 2009 Vol. 670, №1. P. 99-102.

147. Penta J.S., Johnson F.M., Wachsman J.T., Copeland W.C. Mitochondrial DNA and human malignancy // Mutat. Res. 2001. Vol. 488, №2. P. 119-133.

148. Piomboni P., Bruni E., Capitani S., Gambera L., Moretti E., La Marca A., De Leo V., Baccetti B. Ultrastructural and DNA fragmentation analyses in swim-up selected human sperm // Arch. Androl. 2006. Vol. 52, №1. P. 51-59.

149. Piomboni P., Focarelli R., Stendardi A., Ferramosca A., Zara V. The role of mitochondria in energy production for human sperm motility // Int. J. Androl. 2012. Vol. 35, №2. P. 109-24.

150. Porter M.E., Johnson K.E. Dynein structure and function // Ann. Rev. Cell Biol. 1989. Vol. 5. P. 119-151.

151. Poulton J. Mitochondrial DNA and genetic disease // Dev. Med. Child. Neurol. 1993. Vol. 35, №9. P. 833-840.

152. Ricci G., Perticarari S., Fragonas E., Giolo E., Canova S., Pozzobon C., Guaschino S., Presani G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes // Hum. Reprod. 2002. Poulton Vol. 17, №10. P.2665-2672.

153. Ryder T.A., Mobberley M.A., Hughes L., Hendry W.F. A survey of the ultrastructural defects associated with absent or impaired human sperm motility // Fertil. Steril. 1990. Vol. 53, №3. P.556-560.

154. Sakkas D., Urner F., Bizzaro D., Manicardi G., Bianchi P.G., Shoukir Y., Campana A. Sperm nuclear DNA damage and altered chromatin structure: effect on fertilization and embryo development // Hum. Reprod. 1998. Vol. 13, Suppl 4. P. 11-19.

155. Schon E.A. Mitochondrial genetics and disease // Trends in Biol. Sci. 2000. Vol. 25. P. 555-560.

156. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes // Lancet. 1971. Vol. 2. №7731. P. 971-972.

157. Sharpe R.M. On the importance of being earnest. Decline in semen quality among fertile men in Paris during the past 20 years // Hum. Experim. Toxicol. 1995. Vol. 14. P. 463-464.

158. Shchutskaya, Yu. Yu.; Elkina, Yu. L.; Kuravsky, M. L.; Bragina, E. E.; Schmalhausen, E.V. Investigation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from human sperms // Biochemistry. 2008. Vol. 73. P. 185191.

159. Silva L.F., Oliveira J.B., Petersen C.G., Mauri A.L., Massaro F.C., Cavagna

M., Baruffi R.L., Franco J.G. The effects of male age on sperm analysis by

motile sperm organelle morphology examination // J. Reprod Biol Endocrinol.

2012. Vol. 19, №l.P. 19-27.

160. Smith E.P., Conti M. Growth factors and testicular function: relevance to disorders of spermatogenesis in humans. // Semin Reprod Endocrinol. 1996. Vol. 14, №3. P. 209-217.

161. Smith R., Kaune H., Parodi D., Madariaga M., Rios R., Morales I., Castro A. Increased sperm DNA damage in patients with varicocele: relationship with seminal oxidative stress // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21, №4. P. 986-993.

162. Tan D.J.Bai R.K., Wong L.J. Comprehensive scanning of somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer // Cancer Res. 2002. Vol. 62, №4. P. 972-976.

163. Tang Y., Manfredi G., Hirano M., Schon E. Maintenance of human rearranged mitochondrial DNAs in long-term cultured transmitochondrial cell lines // Mol Biol Cell. 2000. Vol. 11, №7. P. 2349-2358.

164. Tash J.S., Krinks M, Patel J., Means R.L., Klee C.B., Means A.R. Identification, characterization, and functional correlation of calmodulin-dependent protein phosphatase in sperm // J Cell Biol. 1988 Vol. 106, №5. P. 1625-1633.

165. Tash J.S., Means A.R. Regulation of protein phosphorylation and motility of sperm by cyclic adenosine monophosphate and calcium // Biol. Reprod. 1982. Vol. 26, №4. P. 745-63.

166. Tesarik J., Greco E., Mendoza C. Late, but not early, paternal effect on human embryo development is related to sperm DNA fragmentation // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19, №3. P. 611-705.

167. Vierula M., Niemi M., Keiski A. Saaranen M. Saarikoski S., Suominen J. High and unchanged sperm counts of Finnish men // Int. J. Androl. 1996. Vol. 19. P. 11-17.

168. Vogt N., Koch I., Schwarz H., Schnorrer F., Nusslein-Volhard C. The gammaTuRC components Grip75 and Grip 128 have an essential microtubule-anchoring function in the Drosophila germline // Development. 2006. Vol. 133, №20. P. 3963-3972.

169. Wallace D. C. Mitochondrial DNA variation in human evolution, degenerative disease and aging // Am. J. Hum. Genet. 1995. V. 57. P. 201223.

170. Wallace D.C. A mitochondrial paradigm for degenerative diseases and aging // Novartis Found. Symp. 2001. Vol. 235. P. 247-263.

171. Wallace D.C. Mitochondrial DNA variation in human evolution, degenerative disease, and aging // Am. J. Hum. Genet. 1995 Vol. 57, №2. P. 201-23.

172. Wallace D.C., Singh G., Lott M.T., Hodge J.A., Schurr T.G., Lezza A.M., Elsas L.J., Nikoskelainen E.K. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy // Science. 1988. Vol. 242, №4884. P. 1427-1430.

173. Williams A.C., Ford W.C. The role of glucose in supporting motility and capacitation in human spermatozoa // J. Androl. 2001. Vol. 22, №4. P. 680-95.

174. Williamson R.A., Koehler J.K., Smith W.D., Stenchever M.A. Ultrastructural sperm tail defects associated with sperm immotility // Fertil. Steril. 1984. Vol. 41, №1. P. 103-107.

175. Wilson C. A., Davies D. C. The control of sexual differentiation of the reproductive system and brain // Reproduction. 2007. Vol. 133, №2. P. 331-359.

176. Wilton L.J., Teichtahl H., Temple-Smith P.D., de Kretser D.M. Structural heterogeneity of the axonemes of respiratory cilia and sperm flagella in normal men // J. Clin. Invest. 1985 Vol. 75, №3. P. 825-831.

177. Wong L.J., Liang M.H., Kwon H., Park J., Bai R.K., Tan D.J. Comprehensive scanning of the entire mitochondrial genome for mutations // Clin Chem. 2002 .Vol. 48, №11. P. 1901-1912.

178. World Health Organisation. Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen, 5th ed. Geneva: World Health Organization, 2010.

179. World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1992.

180. World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1999.

Таблица 6 Результаты количественного кариологического анализа состава незрелых половых клеток (НПК) эякулята пациентов с полизооспермией. качестве нормативных значений предлагаем данные исследования НПК у доноров спермы (условный контроль) из сообщения Л.Ф.Курило и др. (Курило Ф. и соавт, 1995)

номера генетических карт пациентов МГНЦ РАМН % НПК % В прелептотен е-зиготене % В пахитене % В диплотене % В диакинезе, М1, МП % Сперматоциты II + сперматиды % Неразошедшиеся сперматиды % Неидентифиц. половые клетки % лейкоциты Объем эякулята, мл Количество млн. в 1 мл

Нормативные Значения*

2-4 0,66+\-0,16 0,45+\-0,10 1,11+\-0,26 0,04+\-0,02 91,99+\-0,89 22,98+\-2,65 5,85+\-0,85 - >2 >20 млн.

22988 9,5 1,8 - - - 86,5 38 11,7 11,4 2,5 360

20180 7,4 1,4 - - - 90,8 10,8 7,8 4,4 3,6 269

24452 4,8 5 - - - 72,5 24,2 22,5 2,2 3 238

20794 5,6 - - - - 95 12 5 12 3 244

21238 7,4 5 - - - 78,8 38,1 16,2 2,3 6 174

22567 1,5 - - - - 95 12 5 22 2,5 210

21649 4,1 3,8 0,4 - - 60 27 35,8 14 3,5 220

26677 11,6 2,3 - 0,6 - 78,8 36,7 18,3 2,9 3 197

20749 7 1,6 - 0,65 - 84,6 23 13,15 10 10,5 172

21934 4,2 - - - - 92,6 13 7,4 2 2,5 229

24580 6 5 1,4 0,7 - 8,4 26 8,4 25 3 173

20101 6,7 1,9 0,38 - - 83,7 38,2 14,2 7,4 4 164

19062 8,2 3 - - - 84,9 19,3 12,1 3,4 3 163

18161 8,5 5,4 - 0,9 - 84,2 32,2 9,5 5,3 2,3 168

23735 5,6 1 - - - 86,3 26,9 12,7 28 4 156

20106 9,2 4,5 - - - 86,4 30 9,1 5,7 2 159

24773 9,6 6,1 - 1,8 - 73 44,4 19,1 7 4,5 158

20114 8,2 3 - - - 83,6 24,4 13,4 8,4 3 192

20599 5,3 - - - - 97,3 12 2,7 21 3 182

17898 4,5 2,8 1 - - 93 13,4 3,2 13 4,6 176

Повтор через 4 мес. 4 4,7 0,9 0,9 - 89,7 16 3,8 20 3,5 211

21849 4,8 6,3 - - - 60,8 25 32,9 3,2 0,8 156

21777 2,4 5,4 3,6 2 - 78 4,6 11 36 1 235

23079 6,2 1,4 - - - 81,6 15,9 17 1,9 1,5 171

блица 9. Результаты электронно-микроскопического исследования сперматозоидов у 86 пациентов с астенозооспермией

1°Г?/п Акросома Хроматин Цитоплазматич, иалли Митохондрии Жгутик

положение форма прореаг. зрелый незрел. на головке на шейке укладка матрикс ахсонема нар. пл. фибр. фиброзн.слой

норм. | изменен, норм. изменен. нормал. нерегул. нормал. эл./плот. 9+2 9+0 | (5+2, 7+2 и т.д.] дезорг. норм. сдвин. норм. диспла;

1 48 21 48 21 7 78 5 7 6 3 9 28 2 4 4 11 5 19

2 2 8 2 8 50 58 5 2 1 5 6 3 28 15 13 26

3 28 33+86 63 6 18 73 9 6 2 27 18 11 3 27 1 12 21 5 7 39

4 7 14+12В 27 6 28 47 1 21 6 2 21 19 4 31 3 7 32 3 32 2

5 5 18+28в 21 28 5 30 21 36 4 18 11 12 17 27 2 1 3 29 1 27 1

6 25 54+14в 75 18 23 94 19 29 4 9 14 22 1 9 26 17 20 42 10 42 32

7 26 45+18в 80: 0 19 79 23 26 14 28 15 38 5 44 6 3 2 50 3 46 1

3 15 7 7 15 31 63 2 2 10 3 13 31 8 8 14 21

9 22 37+бв 63 2 21 72 7 21 11 19 6 24 1 21 1 2 б 21 3 27 3

10 22 52+11 в 76 9 . э 64 13 40 6 19 12 29 2 44 1 0 0 44 1 33 1

11 42 17 29 30 41 91 15 4 20 13 5 39 4 12 10 28 5 36

12 57 21 35 42 31 62 46 а 11 18 3 21 49 9 6 44 7 43

13 63 18 47 34 17 75 23 14 15 20 3 23 52 11 8 45 5 54

14 55 18 27 46 53 112 35 1 2 24 9 33 58 1 23 14 25 4 51 2

15 78 10 49 39 31 76 49 4 4 17 5 22 43 и 7 32 6 54 11

16 35 7 23 19 37 38 40 3 2 3 4 13 40 12 7 21 6 31

17 33 21 7 47 36 47 49 20 4 11 15 26 57 3 15 12 39 12 52 14

18 25 17 17 25 18 35 28 7 2 9 3 12 28 8 2 10 1 16

19 108 13 54 57 10 110 20 11 23 21 11 32 61 6 3 54 5 66

20 77 14 60 31 4 93 2 7 10 21 3 24 60 4 5 56 4 54

21 81 14 53 42 20 72 42 3 26 18 2 20 63 25 2 50 8 73

22 57 10 38 39 23 73 25 и 24 22 9 31 63 8 2 55 4 78

23 56 27 33 50 22 80 17 6 13 14 4 18 аз 14 1 56 7 72 2

24 111 19 55 75 14 140 5 6 18 29 4 33 73 3 12 5 69 10 82

25 75 18 54 39 3 90 4 9 9 21 4 25 73 17 3 51 5 74

26 57 13+170 83 4 13 72 20 27 16 19 6 22 0 47 4 1 X 50 2 40 2

27 12 18 6 21 33 44 27 15 10 15 12 18 9 15

28 21 17 10 28 52 26 61 7 17 20 6 23 3 53 6 32 10 34 16 52 13

29 51 15 Ср см 37 47 4 10 16 35 4 39 67 2 16 5 51 10 75 2

30 70 26 57 39 28 97 24 12 9 27 5

зп/п Акросома Хроматин Цитоплазматич. капли Митохондрии Жгутик

положение форма прореаг. зрелый незрел. на головке на шейке у клади а матрикс аксонема нар, пл. фибр. фиброзн.слой

норм. идаенен. НОРМ. изменен. нормл, нерегул. нормал, эл./плот. 9+2 9+0 (5+2, 7+2 и т.д.) дезорг. норм. сдеин. норм. дисплаз

31 66 21 36 51 15 93 9 21 22 25 4 29 86 6 12 3 75 7 93

32 68 22 47 43 10 79 17 6 15 26 26 77 1 11 83 5 92 2

33 70 20 37 53 15 81 24 7 9 20 7 24 3 51 2 12 5 53 6 76 4

34 80 17 48 49 9 93 11 12 29 11 40 77 2 14 9 66 9 90 6

35 60 33 29 64 9 , 96 5 4 26 22 7 29 75 11 61 9 83

36 79 58 21 26 103 4 16 29 7 36 113 22 86 6 73

37 25 8 13 20 45 28 44 8 13 19 9 28 29 2 21 13 51 12 65

38 34 37 19 52 37 76 30 16: 9 18 17 35 75 13 12 63 8 67

39 10 11 8 13 51 58 14 6 6 16 4 20 25 8 48 25 63 34 53 6

40 16 16+2В 33 1 12п+4в 36 13 17 6 9 0 9 0 14 1 2 4 17 0 25 1

41 48 15 31 32 24 62 25 4 15 20 9 29 51 2 10 4 64 4 54 2

42 34 16 16 34 41 70 23 7 15 13 10 23 53 3 .30 7 56 16 70

43 70 12 51 31 16 88 10 8 11 29 2 31 84 15 5 76 5 63 1

44 42 19 29 32 34 82 12 2 8 20 4 24 26 9 6 36 3 44

45 38 31 13 56 41 100 10 7 7 21 6 27 91 20 4 64 8 93

46 13 27 5 35 64 57 47 18 10 11 14 25 24 4 50 39 82 27 53 3

47 41 30 26 45 32 76 27 15 6 26 3 27 2 70 9 12 4 86 о 61

48 23 21 4 40 54 79 19 2 8 27 4 27 4 73 4 16 75 6 95

49 54 18 31 41 30 86 13 3 4 33 11 44 63 18 8 74 8 81

50 47 31 23 55 16 39 55 16 8 31 18 49 43 4 12 23 59 11 78

51 18 15 6 25 56 35 49 21 10 10 10 17 3 38 1 18 4 53 7 43 1

52 7 4 1 10 21 14 14 11 4 3 6 9 21 1 у 7 34 6 25 1

53 91 3 83 11 9 100 3 16 37 10 47 90 13 4 101 5 110

54 47 16 28 35 37 87 11 5 10 22 1 22 1 71 22 5 95 8 89

55 60 30 22 68 17 93 14 9 12 30 14 39 5 80 16 4 94 6 80

56 41 20 16 45 86 97 49 3 12 28 6 33 1 94 19 102 9 95

57 35 19 22 32 42 74 21 7 13 35 2 35 2 74 27 4 63 9 96

58 42 32 23 51 44 76 40 21 11 13 р 24 3 17 44 21 65 26 62 1

59 24 5 14 15 10 38 1 3 8 10 10 26 7 1 30 4 17

60 40 22 19 43 37 68 30 11 6 17 6 23 46 18 1 54 7 57 1

2П/П Акросома Хроматин Цитоплазматич. капли Митохондрии Жгутик

положение форма прореаг. зрелый незрел. на головне на шейке укладка мат рикс аксонема нар. пл. фибр. фиброзн.слой

норм. изменен. норм, изменен. нормал. нерегул. нормал. эл./плот. 9+2 9+0 {5+2, 7+2 и т.д.) дезорг. норм. сдвин. норм. дисплаз

61 62 14 44 32 45 49 72 7 21 35 7 42 47 7 9 7 66 9 78

62 3 2 ^ 2 82 56 30 1 17 4 21 52 1 16 5 58 11 70

63 57 20 35 42 34 64 47 4 19 36 10 46 66 2 18 2 60 10 58

64 75 4 41 38 34 51 57 6 21 29 5 34 56 2 11 70 5 57 1

65 08 10 49 49 13 99 10 3 7 44 9 51 2 73 1 18 6 89 10 97

66 58 30 31 57 ' 9 69 26 10 26 25 10 31 4 56 23 1 59 11

67 27 8 21 14 44 65 16 7 6 21 5 26 43 1 17 3 60 8 52

68 28 11 8 31 46 31 51 11 14 20 8 28 55 26 19 103 7 61

69 40 21 13 со 38 44 57 26 29 31 13 44 73 29 2 63 9 64

70 54 18 24 48 30 68 33 15 23 36 16 51 1 78 21 9 86 11 80

71 77 13 51 39 18 97 Т1 6 12 21 5 26 66 15 2 71 10 91

72 25 15 10 30 54 73 21 6 10 21 5 26 71 32 25 77 15 68

73 23 7 5 25 70 76 24 2 10 23 15 32 6 96 12 6 93 9 96

74 23 12 14 21 36 56 13 5 6 13 2 15 31 14 3 44 7 30

75 40 14 21 33 56 69 38 4 10 38 8 45 1 80 22 6 73 9 94

76 36 15 12 39 46 85 11 3 11 22 8 2.8 65 3 14 9 61 9 62

77 29 21 6 44 46 28 69 6 5 14 11 25 58 45 23 88 32 62

78 47 12 23 38 42 61 42 4 14 32 4 33 3 72 1 11 11 82 7 80

79 19 17 7 29 61 57 41 3 11 17 8 25 75 4 29 8 73 12 76 2

30 63 18 47 34 46 109 17 12 13 32 12 39 5 83 17 5 85 5 99

81 60 16 33 43 45 51 74 33 17 13 16 27 2 41 9 23 3 74 8 19 24

82 68 7 34 41 21 72 22 6 14 34 7 41 78 9 1 65 4 97

83 48 14 35 27 31 59 30 13 13 17 4 21 61 21 5 59 8 74

84 46 17 29 34 32 62 32 13 20 18 6 24 68 14 1 78 9 77

85 63 14 27 50 26 90 13 10 6 26 11 35 2 69 3 15 4 83 9 89

86 10 2 3 9 31 20 21 4 6 7 2 8 1 5 2 7 20 2

блица 10 Результаты электронно-микроскопического исследования сперматозоидов у 62 пациентов группы условного контроля (инфертильные мужчины юрмальной подвижностью сперматозоидов)

|9п/п Акросома Хроматин Цитоплазматич. капли Митохондрии Жгутик

положение фо эма прореаг. зрелый незрел. на головке на шейке укладка мат эикс аксонема нар. пл. фибр. фиброзн.слой

норм. изменен. норм. изменен. нормал. нерегул. нормал. эл./плот. 9+2 9+0 (5+2, 7+2 и т.д.) дезорг. норм. сдвин. норм. дисплаз

1 89 6 41 54 5 81 19 4 11 27 11 38 100 6 88 5 108

2 74 18 31 61 7 79 21 10 10 14 10 22 95 10 2 94 6 108

3 90 8 65 33 2 93 7 2 26 5 29 2 99 7 1 89 4 114

4 80 11 41 50 9 95 3 1 6 24 7 29 2 95 12 3 104 6 108

5 14 11 8 17 6 14 18 7 1 3 1 4 28 2 9 2 37 4 19

б 35 11 20 26 81 54 78 9 7 13 3 16 40 13 31 16 70 34 45

7 75 10 42 43 6 73 14 2 3 10 10 41 3 1 45 2 40

8 83 9 24 68 8 87 9 1 б 24 5 28 1 124 8 1 131 4 149

9 90 14 44 60 12 77 36 12 20 33 4 29 8 99 7 2 89 5 89

10 69 7 37 39 24 74 23 7 14 18 8 26 100 11 103 9 87 1

11 12 3 7 8 7 19 3 3 3 б 1 7 13

12 62 26 27 61 11 86 13 8 15 19 7 25 1 80 9 2 87 7 67

13 99 22 62 59 24 79 66 10 30 21 11 32 80 18 4 94 7 88

14 82 10 49 43 8 78 22 2 17 29 5 34 88 6 3 93 6 97

15 87 11 41 57 2 94 б 3 8 16 7 23 127 9 3 107 6 106

16 52 17 20 49 28 80 19 3 8 12 5 17 18 2 7 2 28 3 60 1

17 72 17 30 59 10 82 17 13 16 20 8 25 3 117 3 9 3 99 6 114

18 55 10 21 44 35 68 31 7 23 26 9 33 2 96 11 5 99 8 120

19 5 4 1 8 23 29 2 7 3 2 1 3 15 4 1 19 1 И

20 63 19 20 62 5 53 46 14 15 28 12 38 2 73 3 9 4 76 5 156

21 71 14 32 53 10 42 54 14 7 17 8 21 4 90 17 97 10 102 1

22 69 11 35 45 19 77 16 4 10 20 1 21 81 1 8 2 97 7 95 2

23 85 27 29 83 23 111 23 32 30 13 19 31 1 55 9 2 62 7 73

24 66 33 34 65 1 94 5 11 13 27 б 33 112 5 1 115 4 98

25 36 37 7 66 25 63 33 26 17 9 10 19 44 18 12 65 5 62

26 19 24 4 39 18 40 17 4 13 9 8 15 2 31 3 4 2 40 2 44

27 31 16 16 31 13 47 9 1 7 5 6 9 2 49 1 15 1 65 5 33

28 71 15 40 46 13 71 26 6 5 21 6 27 113 7 3 91 8 113

29 58 24 28 54 16 56 40 24 20 17 6 17 6 88 6 2 89 6 101

30 82 9 59 32 9 95 4 3 1 23 7 30 84 1 11 8 85 6 97

Мзп/п Акросома Хроматин. Цитоплазматич. капли Митохондрии Жгутик

положение форма прореаг. зрелый незрел. на головке на шейке укладка мат »икс аксонема нар, пл. фибр. фиброзн.слой

норм. изменен. норм. изменен. нормал. нерегул. поймал. эл./плот. 9+2 9+0 (5+2, 7+2 и т.д.) дезорг. норм. СД8ИН. норм. ддаплаз.

31 63 31 35 59 6 36 58 8 18 21 9 30 99 11 89 6 84

32 24 22 9 37 45 79 13 3 11 6 7 9 4 29 1 9 15 44 10 35

33 70 22 39 53 8 100 2 3 25 1 26 98 8 ~п 1 102 2 129

34 84 14 46 52 2 93 7 4 22 27 12 39 98 7 97 4 101

35 54 24 17 61 22 69 29 13 10 35 12 44 3 89 2 13 5 98 4 95

36 63 15 34 44 22 84 15 6 14 19 6 19 6 84 11 2 98 7 72 3

37 51 35 27 59 14 63 33 8 18 18 7 20 5 61 12 7 72 5 84 1

38 75 20 37 58 6 94 3 7 8 32 3 34 1 92 2 6 2 87 5 109

39 75 10 4.5 40 15 35 61 5 19 32 8 39 1 96 11 4 86 б 97 2

40 23 20 8 35 41 66 16 10 5 8 8 14 2 41 2 11 2 55 5 37 1

41 60 25 11 74 15 87 13 9 15 25 9 29 5 73 1 16 11 92 4 99

42 38 28 13 53 16 50 34 28 23 7 19 23 3 26 2 20 4 51 3 48

43 84 10 58 36 6 80 19 2 12 18 3 21 92 7 100 3 82

44 92 6 61 37 2 97 2 3 3 25 6 31 88 7 2 87 4 90

45 53 27 23 57 17 54 46 11 13 18 4 22 90 2 11 88 3 94

46 30 44 8 66 27 36 69 12 19 19 6 13 4 65 8 3 74 3 54

47 52 22 20 54 26 66 34 1 8 28 8 36 89 9 2 96 4 107

48 50 31 14 67 19 57 41 7 13 21 5 26 85 11 87 5 75

49 20 3 10 13 5 14 13 4 6 6 11 1 16 16

50 40 12 24 28 48 62 33 2 20 25 8 30 3 92 15 6 95 9 110

51 63 28 33 58 8 51 49 15 16 21 10 31 80 14 4 93 8 ' 100

52 60 11 18 53 29 84 8 14 14 17 31 102 18 5 95 7 104

53 61 14 24 51 22 87 8 6 7 18 7 25 79 3 11 9 94 8 87

54 71 17 27 61 12 86 14 12 3 24 2 23 3 99 6 1 97 2 113

55 79 13 43 49 6 47 53 6 6 21 2 23 71 11 2 80 4 73

56 38 14 21 31 48 74 26 7 13 4 15 19 58 3 11 3 72 6 28 13

57 86 6 61 31 8 83 14 2 21 23 8 31 91 18 4 107 7 91

со 1-П 57 31 32 56 10 66 28 8 15 17 9 25 1 94 14 7 99 5 96

59 74 15 48 41 11 77 20 5 22 17 16 33 84 6 2 91 4 98

60 88 8 53 43 4 88 12 6 3 22 10 31 1 93 7 2 91 6 108

61 68 10 47 31 19 85 15 9 5 19 11 30 86 11 10 98 6 94

62 57 27 28 56 16 77 21 5 10 22 9 28 3 45 6 31 7 77 4 92 2