Исследование взаимодействия токсина Hm-3 с потенциал-чувствительными доменами канала Nav1.4 человека методом спектроскопии ЯМР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Мышкин Михаил Юрьевич

• Мышкин Михаил Юрьевич
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Мышкин Михаил Юрьевич

Оглавление

Оглавление

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи работы

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Апробация результатов

Статьи в рецензируемых журналах

Тезисы конференций

Объем и структура диссертации

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Потенциал-зависимые натриевые каналы

1.1.1 Общие сведения

1.1.2 История исследования натриевых каналов

1.1.3 Генетическое разнообразие а-субъединиц

1.1.4 Топология и основные структурные элементы потенциал-зависимых натриевых каналов

1.1.5 Р-Субъединицы потенциал-зависимых натриевых каналов

1.1.6 Строение поры и ионная селективность

1.1.7 Активация и потенциал-чувствительные домены

1.1.8 Инактивация

1.1.9 Фармакологические мишени на поверхности каналов

1.1.9.1 Сайт

1.1.9.2 Сайт

1.1.9.3 Сайт

1.1.9.4 Сайт

1.1.9.5 Сайт

1.1.9.6 Сайт

1.1.9.7 Сайт

1.1.9.8 Сайт

1.1.10 Заболевания, связанные с мутациями в канале NaV1

1.2. Использование пептидных токсинов из ядов животных для создания лекарственных препаратов

1.2.1 Общие сведения

1.2.2 Структурный подход к разработке лекарственных препаратов

1.2.3 Фармакологические препараты на основе токсинов

2

1.2.4 Токсины из ядов пауков как прототипы для создания лекарственных препаратов

1.2.5 Структурные особенности паучьих пептидных токсинов

1.2.6 Новые подходы в поиске токсинов и изучении их свойств

1.2.7 Токсин ^-3 65 1.3. Применение методов спектроскопии ЯМР для исследования белковых молекул

1.3.1 Основы метода спектроскопии ЯМР 66 1.3.2. Особенности исследования мембранных белков методом ЯМР-спектроскопии

высокого разрешения

1.3.3 Изучение лиганд-рецепторных взаимодействий с помощью ЯМР

1.3.4 Отнесение ЯМР сигналов основной цепи белков с помощью комбинаторного селективного мечения

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Мембраномоделирующие среды

2.1.2 Потенциал-чувствительные домены ионных каналов

2.1.3 Пептидные токсины

2.2 Методы

2.2.1 ЯМР-спектроскопия

2.2.2 Расчет пространственной структуры токсина Hm-3

2.2.3 Исследование взаимодействия токсина Hm-3 с липидными везикулами и мембраномоделирующими средами

2.2.4 Очистка образцов ПЧД для ЯМР и ЭПР исследований

2.2.5 Встраивание ПЧД в мембраномоделирующие среды для подбора оптимального мембраномоделирующего окружения

2.2.6 Приготовление очищенных образцов для ЯМР исследований

2.2.7 Продукция и приготовление спин-меченых образцов

2.2.8 Расчет схем комбинаторного мечения с помощью программного пакета CombLabel

2.2.9 Отнесение сигналов ПЧД-П в мицеллах LPPG

2.2.10 Отнесение сигналов ПЧД-I-NaV1.4 и ПЧД-П-NaV1.4 в мицеллах DPC/LDAO

2.2.11 Исследование вторичной структуры и топологии ПЧД

2.2.12 Исследование динамических характеристик ПЧД

2.2.13 Оценка аффинности и энергии связывания Hm-3 с мицеллами и ПЧД

2.2.14 Молекулярное моделирование комплекса ПЧД-I/Hm-3 86 Глава 3. Результаты и дискуссия

3.1 Предпосылки работы

3.2. Исследование структуры и свойств токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei

3.2.1 Пространственная структура токсина Hm-3

3.2.2 Исследование мембранной активности токсина Hm-3

3.3 Исследование ПЧД-П-NaV1

3.3.1 Подбор мембраномоделирующего окружения для исследования ПЧД-П методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения

3.3.2 Вторичная структура ПЧД-П в мицеллах LPPG

3.3.3 Динамические характеристики основной цепи ПЧД-П в мицеллах LPPG

3.3.4 Гомологичное моделирование пространственной структуры ПЧД-П

3.3.5 Выводы о структуре ПЧД-П в мицеллах LPPG

3.4 Исследование структурного комплекса NaV1.4-ПЧД-I с токсином Нт-3

3.4.1 Подбор мембраномоделирующего окружения NaV1.4-ПЧД-I

3.4.2 Отнесение сигналов 15№меченого токсина Нт-3 и взаимодействие с мицеллами DPC/LDAO

3.4.3 CombLabel - программный комплекс для расчета схем комбинаторного мечения

3.4.4 Исследование ПЧД-I-NaV1.4 - отнесение ЯМР сигналов основной цепи

3.4.5 Картирование интерфейса взаимодействия ПЧД-I-NaV1.4 и токсина Нт-3 и построение структуры комплекса

3.4.6 Активность Нт-3 по отношению к каналам NaV1.4 с мутациями в ПЧД-1, приводящим к hypoPP

3.4.7 Выводы о взаимодействии Нт-3 с ПЧД-1

3.5 Исследование структурного комплекса NaV1.4-ПЧД-II с токсином Нт-3

3.5.1 Отнесение ЯМР-сигналов в NaV1.4-ПЧД-П в мицеллах DPC/LDAO

3.5.2 Картирование интерфейса взаимодействия ПЧД-П и токсина Нт-3

3.5.3 Построение модели комплекса взаимодействия ПЧД-ШНт-3

3.5.4 Сравнение вторичной структуры ПЧД-П в мицеллах LPPG и DPC/LDAO

3.5.5 Исследование третичной структуры изолированного ПЧД-П в

мембраномоделирующих средах с помощью ЭПР-спектроскопии

3.5.6 Ингибирование токсином Нт-3 токов утечки через мутантные варианты ПЧД-П

3.5.7 Выводы о взаимодействии Нт-3 с ПЧД-П

3.6 Исследование структурного комплекса NaV1.4-ПЧД-Ш с токсином Нт-3 146 Заключение 150 Выводы 152 Благодарности 153 Список сокращений 154 Список литературы 158 Приложения

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование взаимодействия токсина Hm-3 с потенциал-чувствительными доменами канала Nav1.4 человека методом спектроскопии ЯМР»

Актуальность темы исследования

Потенциал-зависимые ионные каналы отвечают за распространение потенциала действия по возбудимым тканям, и таким образом играют важнейшую роль в работе нервной, мышечной, сердечно-сосудистой и эндокринной систем. Мутации в генах, кодирующих ионные каналы у человека, приводят к различными наследственным заболеваниям, таким как эпилепсия, судорожные расстройства, аритмия, периодический паралич [Huang и др., 2017]. В частности некоторые мутации в гене SNC4A, кодирующем порообразующую альфа-субъединицу мышечного натриевого канала человека NaV1.4 приводят к развитию периодического паралича [Cannon, 2018]. Приступы паралича возможно предотвращать диетологическими методами и ограничениями в физической активности, однако болезнь имеет свойство ухудшаться с возрастом и в более тяжелых случаях приступы могут длиться по нескольку суток. Использование генной терапии для излечения данного заболеваний затруднено из-за большого размера гена SNC4A (~34 kb) и сложности доставки терапевтических вирусных частиц в мышечную ткань, составляющую около половины массы тела человека. Поэтому проблема поиска лекарственного препарата для предотвращения и остановки приступов паралича остается актуальной. Новейшие подходы в разработке классических фармакологических препаратов требуют знания о структуре мишени, либо о сайтах взаимодействия известных лигандов [Batool, Ahmad, Choi, 2019]. Известно, что ионные каналы являются мишенями природных пептидных токсинов из ядов пауков, скорпионов и змей, что значительно упрощает поиск высокоспецифичных лигандов [Bosmans, Swartz, 2010]. Метод ЯМР-спектроскопии высокого разрешения зарекомендовал себя в исследовании белок-белковых (и лиганд-рецепторных) взаимодействий, а также в исследовании структуры и динамики а-спиральных трансмембранных белков [Rule, Kevin Hitchens, 2006].

Таким образом актуальность данной диссертационной работы обуславливается проблемой поиска лекарственных препаратов для лечения периодического паралича. Данная работа посвящена изучению сайтов взаимодействия пептидного токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei с мышечным потенциал-зависимым натриевым каналом человека NaV1.4.

Степень разработанности темы исследования

Периодический паралич - группа болезней, вызываемых недостатком или избытком калия (т.н. гипо- и гиперкалиемия). Прогресс в лечении этих состояний различен: для гиперкалиемии есть препарат Keveyis™ (дихлофенамид), который снижает частоту приступов; тогда как для гипокалиемии есть только диетологические методы, которые не избавляют

полностью от приступов паралича. Одна из причин периодического паралича - мутации в гене SNC4A, кодирующем порообразующую а-субъединицу канала NaV1.4. Для других нейромышечных и сердечнососудистых заболеваний, в патофизиологии которых участвуют ионные каналы, разрабатываются лекарства на основе токсинов (подробнее в главе 1.2.3 литературного обзора). Часть таких лекарств уже успешно опробована для лечения пациентов [Pennington, Czerwinski, Norton, 2018]. Оптимальный путь для разработки таких лекарств -рациональный, через изучение структуры молекул и молекулярных комплексов [Batool, Ahmad, Choi, 2019].

В 2009 году у паука Heriaeus melloteei (вид инфраотряда аранеоморфных пауков -Araneomorphae) был найден токсин Hm-3, ингибирующий натриевые токи через канал NaV1.4 человека [Nikolsky и др., 2009]. Для определения структуры комплекса и структурных особенностей поверхности токсина в сайте связывания с ионным каналом необходимо определить пространственную структуру токсина, однако для Hm-3 она не была известна до начала данной работы. Кроме того, большинство пространственных структур получено для токсинов мигаломорфных пауков (Mygalomorphae) [Bosmans, Swartz, 2010], и до настоящего времени не было сравнения мембраноактивных токсинов мигаломорфных и аранеоморфных пауков. В том числе, не было известно, на какой из потенциал-чувствительных доменов (ПЧД) канала NaV1.4 воздействует токсин, и не был известен конкретный сайт связывания.

Сайт связывания токсина на поверхности канала NaV1.4 можно достоверно определить с помощью точечных мутаций и электрофизиологического исследования. Однако без примерной локализации на канале NaV1.4 размером ~2000 а.о. это очень затратный и трудоемкий процесс. Один из методов локализации связывания был предложен Босмансом и коллегами [Bosmans, Martin-Eauclaire, Swartz, 2008]: он заключается в пересаживании внеклеточных петель от каждого из четырех ПЧД канала NaV в гомотетрамерный канал KV2.1 и исследовании действия токсина на каждый из четырех химерных каналов методом электрофизиологии.

Ионные каналы - крупные многодоменные мембранные белки, поэтому исследование их структуры сопряжено со сложностями в их рекомбинантной экспрессии и фолдинге в модельных мембранах. К началу данной работы была известна структура бактериального канала NaVAB [Payandeh и др., 2011], позднее были также расшифрованы структуры каналов KV1.2/2.1 [Long и др., 2007], KcsA [Doyle и др., 1998], KVAP [Lee и др., 2005]. Пространственная структура канала NaV1.4 человека была опубликована только в 2018 году в работе [Pan и др., 2018] и не была известна на момент начала работы.

Для структурных исследований потенциал-зависимых ионных каналов методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения был успешно применен метод изучения пространственной структуры изолированных ПЧД каналов в мембранном окружении на

примере калиевых каналов KVAP [Lee и др., 2005], KCNQ1 [Law, Sanders, 2019]. ЯMР также зарекомендовал себя как метод поиска сайтов связывания лигандов, поскольку этот метод очень чувствительный к конформационным изменениям и к наличию химического обмена. ЯMР широко применяется для исследования белков, однако сложность его применения повышается с увеличением размера исследуемого объекта: наиболее крупные белки, структуру которых можно определить с помощью ЯЫР, не превышают 40 кДа [Lange и др., 2012; Nietlispach, Gautier, 2011]. Дополнительные проблемы возникают при применении ЯMР для исследования мембранных белков. Часть этих проблем могла бы быть решена при использовании комбинаторного мечения [Parker и др., 2004], но до начала данной работы не существовало удобной программы для автоматического расчета схемы мечения.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось исследование структуры комплексов и механизма взаимодействия токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei с отдельными ПЧД (сегменты S1-S4) мышечного потенциал-зависимого натриевого канала человека NaV1.4 с помощью ЯMР-спектроскопии высокого разрешения.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести исследование пространственной структуры и мембранной активности токсина Hm-3.

2. Разработать процедуру встраивания изолированных потенциал-чувствительных доменов канала NaV1.4 (ПЧД-I, ПЧД-II и ПЧД-III) в мембраноподобные среды.

3. Разработать программное обеспечение для расчета схем комбинаторного селективного мечения аминокислотных остатков стабильными изотопами 13C и 15N для ускорения процесса отнесения ЯMР-сигналов основной цепи белков.

4. Провести отнесение ЯЫР-сигналов основной цепи ПЧД-I и ПЧД-II, исследовать пространственную структуру и динамику ПЧД в мембраноподобном окружении.

5. Оценить соответствие структур ПЧД в модельной системе нативной структуре.

6. Определить аминокислотные остатки молекул, отвечающие за взаимодействие ПЧД-I и ПЧД-II с токсином Hm-3, и на основании этих данных построить молекулярные модели комплексов ПЧД-№т-3 и ПЧД-П/Нт-3.

7. Качественно охарактеризовать взаимодействие ПЧД-III с токсином Hm-3

Научная новизна работы

В данной работе на примере канала N^.4 человека впервые продемонстрирована возможность структурных исследований изолированных потенциал-чувствительных доменов натриевых каналов эукариот методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. В ходе работы определена пространственная структура токсина Нт-3 из яда паука Непаеш теЮее1, обладающего ингибирующей активностью по отношению к каналу №^.4, и показано сродство токсина к мембране. Впервые на основе экспериментальных данных получена модель структуры комплекса вольт-сенсорного токсина членистоногих с ПЧД потенциал-зависимого канала и напрямую показана важная роль окружающей мембраны в этом взаимодействии. Открыт новый сайт связывания токсинов паукообразных, находящийся на ПЧД-1 натриевых каналов и показано возможное взаимодействие токсинов с ПЧД-Ш. Впервые показано, что вольт-сенсорные токсины могут блокировать аберрантные ю-токи в мутантных ПЧД и предложены модели действия токсинов. В работе продемонстрирован оригинальный метод поиска и картирования сайтов взаимодействия вольт-сенсорных токсинов на ПЧД натриевых каналов человека.

Теоретическая и практическая значимость

В работе предложен оригинальный алгоритм и разработано новое программное обеспечение CombLabel, сделавшее применимым на практике метод комбинаторного селективного мечения белков. Комбинаторное селективное мечение позволяет значительно ускорить процесс отнесения ЯМР-сигналов основной цепи белков, что делает доступными для изучения препараты белков с ограниченной временной стабильностью. Методы и подходы по изучению структуры и динамики мембранных белков и лиганд-рецепторных взаимодействий, развитые в работе на примере токсина Нт-3 и ПЧД канала №а^.4, могут применяться как для фундаментальных молекулярно-биологических и биофизических исследований, так и для прикладных работ в области фармакологии, например при картировании сайтов связывания природных и синтетических лигандов на мембранных рецепторах.

Новые данные о пространственной структуре и мембранной активности пептидных токсинов из ядов пауков позволяют понять общие механизмы действия вольт-сенсорных токсинов на ионные каналы, а также отследить процессы конвергентной эволюции у паукообразных из инфраотрядов Araneomorphae и Mygalomorphae. Полученные структуры комплексов токсина Нт-3 с ПЧД-1 и ПЧД-П канала №^.4 позволяют продвинуться в понимании механизмов активации потенциал-зависимых каналов и механизмов патогенеза периодического паралича, а также указывают направление для дальнейшего поиска и

разработки лекарственных препаратов, облегчающих жизнь пациентов, страдающих периодическим параличом и другими каналопатиями.

Методология и методы исследования

Основным методом является ЯМР. Воздействие радиочастотными импульсами на образец в большом магнитном поле позволяет определять с высокой точностью резонансную частоту ядер атомов (в частности водород, углерод, азот), которая очень чувствительна к конформационным или химическим изменениям молекулы. Таким образом ЯМР позволяет определять пространственную структуру молекулы или детектировать наличие конформационных изменений в местах связывания лиганда. Для подтверждения того, что структуры ПЧД канала NaV1.4 в мембраномоделирующем окружении на основе мицелл детергентов имеют пространственную укладку, близкую к нативной, были использованы методы ЭПР-спектроскопии. Структуры комплексов токсина Hm-3 и ПЧД канала NaV1.4 были получены с помощью методов молекулярного моделирования (молекулярная динамика и белок-белковый докинг) на основе экспериментальных ограничений ЯМР

Положения, выносимые на защиту

1. Определена пространственная структура токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei в воде. Показано, что токсин принадлежит семейству токсинов, содержащих ингибиторный цистиновый узел (ICK мотив), имеет амфифильные свойства, и обладает высоким сродством к липидным мембранам.

2. Разработано программное обеспечение CombLabel для расчета схем комбинаторного селективного мечения аминокислотных остатков стабильными изотопами 13C и 15N для ускорения процесса отнесения ЯМР-сигналов основной цепи белков.

3. На примере ПЧД-II канала NaV1.4 продемонстрирована возможность изучения структурных и динамических особенностей изолированных ПЧД натриевых каналов человека в мембраномоделирующем окружении методом ЯМР-спектроскопии.

4. Определены ключевые аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии токсина Hm-3 c ПЧД-I и ПЧД-II канала NaV1.4 человека. На основе этих экспериментальных данных построены модели пространственной структуры комплексов Нт-3/ПЧД-1 и Hm-3/ПЧД-П.

5. Методом ЯМР-спектроскопии показано возможное взаимодействие токсина Hm-3 с ПЧД-III канала NaV1.4.

6. Предложена модель ингибирования токсином Hm-3 токов утечки через ПЧД-I и ПЧД-II канала NaV1.4 при наличии в них мутаций, приводящих к наследственному периодическому параличу.

Личный вклад автора

Автор лично осуществлял пробоподготовку для ЯМР- и ЭПР-исследований, получал и анализировал ЯМР-спектры, рассчитывал пространственную структуру токсина Hm-3, разрабатывал программное обеспечение CombLabel, рассчитывал схемы мечения с его использованием. Автор принимал участие в построении моделей комплексов токсина Hm-3 с ПЧД канала NaV1.4, анализе данных ЭПР-спектроскопии, а также подготовке и написании статей.

Автор выражает глубокую благодарность соавторам исследований, и особенно к.б.н. Д.С. Кульбацкому (Лаборатория биоинженерии нейромодуляторов и нейрорецепторов ИБХ РАН), который получал образцы ПЧД канала NaV1.4 в виде осадка бесклеточной системы, к.б.н. А.А. Беркут (Лаборатория молекулярных инструментов для нейробиологии ИБХ РАН), которая предоставила образцы рекомбинантного токсина Hm-3 и д.ф.-м.н. О.А. Крумкачевой (Международный томографический центр СО РАН, Новосибирск), которая провела ЭПР измерения.

Апробация результатов

Достоверность результатов диссертационной работы подтверждена использованием в ходе ее выполнения высокоточных приборов и современных методов проведения экспериментов и обработки экспериментальных данных. В частности, основные результаты работы были получены с помощью современных ЯМР-спектрометров Bruker Avance III с частотами по ядрам водорода 600 и 800 МГц, оснащенных криодатчиком, а также были использованы современные методы получения, обработки и анализа ЯМР-спектров. Чистота использованных в работе исходных образцов ПЧД и токсина Hm-3 достигалась с помощью ВЭЖХ и №2+-аффинной хроматографии и подтверждалась с помощью ПААГ электрофореза и ЯМР-спектроскопии. Нативность структур ПЧД в мембраномоделирующих средах на основе мицелл детергентов была подтверждена с помощью ЭПР-спектроскопии методом двойного электрон-электронного резонанса. Структурные модели комплексов токсина c ПЧД были получены на основе экспериментальных ограничений, полученных из данных ЯМР-спектроскопии. Участие ключевых аминокислотных остатков в комплексах подтверждалось с помощью сайт-направленного мутагенеза и экспериментов по электрофизиологии. Положения и выводы,

сформулированные в диссертации, получили квалифицированную апробацию на международных и российских научных конференциях и семинарах. Достоверность также подтверждается публикациями результатов исследования в рецензируемых научных изданиях.

Материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: XXI международная научная конференция студентов аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2014» (Россия, Москва, 2014); Biomembranes (Россия, Долгопрудный, 2014 и 2018); Euromar Congress (Чехия, Прага, 2015; Дания, Орхус, 2016); Phystech-Med 2015: Physics of Living Systems. Past, Present and Future (Россия, Долгопрудный, 2015); FEBS Congress (Израиль, Иерусалим, 2017); Международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Россия, Москва, 2017); XXVIIIICMRBS (Ирландия, Дублин, 2018); EuroISMAR (Германия, Берлин, 2019).

Статьи в рецензируемых журналах

1. Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Kulbatskii D.S., Surkova E.A., Berkut A.A., Vassilevski A.A., Lyukmanova E.N., Kirpichnikov M.P., Shenkarev Z.O. Voltage-Sensing Domain of the Third Repeat of Human Skeletal Muscle Nav1.4 Channel As a New Target for Spider Gating Modifier Toxins // Acta Naturae. 2021. Т. 13. №1. С. 134-139.

2. Myshkin M.Y., Männikkö R., Krumkacheva O.A., Kulbatskii D.S., Chugunov A.O., Berkut A.A., Paramonov A.S., Shulepko M.A., Fedin M.V., Hanna M.G., Kullmann D.M., Bagryanskaya E.G., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P., Lyukmanova E.N., Vassilevski A.A., Shenkarev Z.O. Cell-Free Expression of Sodium Channel Domains for Pharmacology Studies. Noncanonical Spider Toxin Binding Site in the Second Voltage-Sensing Domain of Human Nav1.4 Channel //Front Pharmacol. 2019. Т. 10 С. 953.

3. Myshkin M.Y., Dubinnyi M.A., Kulbatskii D.S., Lyukmanova E.N., Kirpichnikov M.P., Shenkarev Z.O. CombLabel: rational design of optimized sequence-specific combinatorial labeling schemes. Application to backbone assignment ofmembrane proteins with low stability //J Biomol NMR. 2019. T. 73. №10-11. С. 531-544.

4. Männikkö R., Shenkarev Z.O., Thor M.G., Berkut A.A., Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Kulbatskii D.S., Kuzmin D.A., Sampedro Castañeda M., King L., Wilson E.R., Lyukmanova E.N., Kirpichnikov M.P., Schorge S., Bosmans F., Hanna M.G., Kullmann D.M., Vassilevski A.A. Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis // Proc Natl Acad Sci USA. 2018. № 201720185.

5. Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Kulbatskii D.S., Lyukmanova E.N., Kirpichnikov M.P., Shenkarev Z.O. "Divide and conquer" approach to the structural studies of multidomain ion

channels by the example of isolated voltage sensing domains of human Kv2.1 and Nav1.4 channels //Rus J of Bioorg Chem. 2017. № 43. С. 608-619.

6. Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Myshkin M.Y., Shulepko M.A., Kulbatskii D.S., Petrosian N.S., Chugunov A O., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S., Shenkarev Z.O. NMR investigation of the isolated second voltage-sensing domain of human Nav1.4 channel // Biochim Biophys Acta. 2017. Т. 1859. № 3. С. 493-506.

7. Berkut A.A., Peigneur S., Myshkin M.Y., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Arseniev A.S., Grishin E.V., Tytgat J., Shenkarev Z.O., Vassilevski A.A. Structure of Membrane-Active Toxin from Crab Spider Heriaeus melloteei Suggests Parallel Evolution of Sodium Channel Gating Modifiers in Araneomorphae and Mygalomorphae // J Biol Chem. 2015. Т. 290. № 1. С. 492-504.

Тезисы конференций

1. M.Y. Myshkin, M.A. Dubinnyi, D.S. Kulbatskii, A.S. Paramonov, A.A. Berkut, A.A. Vassilevski, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev. Combinatorial Selective Labeling Facilitates Mapping of Binding Interfaces in Complex of Spider Toxin with Human Voltage-Gated Sodium Channel Abstract book. EurolSMAR, 2019, Берлин, Германия.

2. M.Y. Myshkin, M.A. Dubinnyi, D.S. Kulbatskii, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev. Facilitation of NMR Assignment of Membrane Proteins with Limited Stability by Combinatorial Selective Labeling. Biomembranes, 2018, Долгопрудный, Россия.

3. M.Y. Myshkin, A.S. Paramonov, A.A. Berkut, D.S. Kulbatskii, E.N. Lyukmanova, A.A. Vassilevski, Z.O. Shenkarev. NMR Spectroscopy Identifies Binding Interfaces in the Complex of Gating Modifier Toxin Hm-3 with First Voltage-Sensing Domain of Nav1.4 Sodium Channel. Biomembranes, 2018, Долгопрудный, Россия.

4. M.Y. Myshkin, M.A. Dubinnyi, D.S. Kulbatskii, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev. Design of Optimal Combinatorial Selective Labeling Schemes for Fast NMR Assignment of Proteins. XXVIIIICMRBS, 2018, Дублин, Ирландия.

5. М.Ю. Мышкин, М.А. Дубинный, Д.С, Кульбацкий, Е.Н. Люкманова, З.О. Шенкарев. Оптимальные схемы изотопного мечения для быстрого ЯМР-анализа мембранных белков с низкой стабильностью. Применение к потенциал-чувствительным доменам K + и Na + каналов. Международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова», 2017, Москва, Россия.

6. M.Y. Myshkin, A.S. Paramonov, A.A. Berkut, D.S. Kulbatskii, A.A. Vassilevski, E.N.

Lyukmanova, Z.O. Shenkarev. 'Divide and conquer' approach for structural NMR studies of

voltage-gated sodium channels. Mapping of binding interface with gating-modifier toxin. 42nd

12

FEBS Congress, 2017, Иерусалим, Израиль.

7. M.Y. Myshkin, E.I. Rumynskiy, E.N. Lyukmanova, A.S. Paramonov, D.S. Kulbatskii, A.S. Arseniev, Z.O. Shenkarev. «Screening of membrane mimetics and NMR backbone assignment of isolated VSD of human Kv2.1 channel». EuroMAR, 2016, Орхус, Дания.

8. M.Y. Myshkin, E.N. Lyukmanova, A.S. Paramonov, D.S. Kulbatskii, M.A. Shulepko, A.A. Berkut, A.A. Vasilevski, D.A. Dolgikh, A.S. Arseniev, Z.O. Shenkarev. Isolated voltage-sensing domain of human Nav1.4 channel: topology in membrane mimicking environment and interaction with spider toxin Hm-3. EuroMAR, 2015, Прага, Чехия.

9. M.Y. Myshkin, E.N. Lyukmanova, A.S. Paramonov, D.S. Kulbatskii, M.A. Shulepko, A.S. Arseniev, Z.O. Shenkarev. 'Divide and conquer' approach to structural NMR studies of voltage-gated sodium channels. Biomembranes, 2014, Долгопрудный, Россия.

10. М.Ю. Мышкин, Е.Н. Люкманова, З.О. Шенкарев, М.А. Шулепко, А.С. Парамонов, А.С. Арсеньев, Д.А. Долгих, М.П. Кирпичников. Исследование пространственной структуры потенциалочувствительного домена из 2-й псевдосубъединицы канала Nav 1.4 человека. XXVI зимняя молодёжная научная школа "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ", 2014, Москва, Россия.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, который включает 282 источника. Работа изложена на 179 страницах и содержит 57 рисунков и 5 таблиц.

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Потенциал-зависимые натриевые каналы 1.1.1 Общие сведения

K+, Na+ и Ca2+ потенциал-зависимые (ПЗ) ионные каналы (KV, №уи CaV) являются структурно сходными интегральными мембранными белками (ИМБ), принадлежащими к суперсемейству потенциал-зависимых ионных каналов (VGIC, или P-loop белки). Эти каналы играют важную роль в большом количестве физиологических явлений, таких как возбудимость нервных и мышечных клеток (в том числе, клеток сердечной мышцы), проведение электрических сигналов по нейронам, секреция гормонов и нейромедиаторов [Hille, 2001].

На данный момент известно более 1000 мутаций [Huang и др., 2017], приводящих к нарушению работы NaV каналов и, соответственно, к развитию наследственных заболеваний, таких как эпилепсия, хронический болевой синдром, невосприимчивость к боли [Cox и др., 2006], судорожные расстройства, аритмия. Из них около 70 мутаций в гене канала NaV1.4 приводят к таким заболеваниям как миотония, парамиотония, гипо- и гиперкалемический периодический паралич, миастения и врожденная миопатия [Cannon, 2018].

Существует огромное количество природных соединений, разнообразным образом влияющих на работу ионных каналов, которые можно найти в ядах различных организмов — пауков, скорпионов, змей, моллюсков, кишечнополостных и рыб [Gilchrist, Olivera, Bosmans, 2014]. Современный рациональный подход к разработке лекарственных препаратов подразумевает наличие белка-мишени, который либо напрямую, либо косвенно участвует в некотором процессе и к которому можно подобрать соединение, способное связываться с белком-мишенью и модулировать его работу таким образом, что происходит компенсация патологии [Batool, Ahmad, Choi, 2019]. С этой точки зрения ионные каналы являются идеальными кандидатами белков-мишеней, поскольку патологии напрямую с ними связаны, а также известно множество молекул, действующих на эти белки.

Исследование пространственной структуры ионных каналов NaV важно как для фундаментального знания о механизме работы этих каналов, так и для практической разработки лекарственных препаратов. Особый практический интерес представляет изучение пространственной структуры комплексов ионных каналов с их лигандами [Shen и др., 2019].

1.1.2 История исследования натриевых каналов

Натриевый ток впервые был открыт Аланом Ходжкином и Эндрю Хаксли с помощью метода фиксации напряжения и описан в четырех основополагающих работах в журнале Journal of Physiology в 1952 году [Hodgkin, Huxley, 1952a; Hodgkin, Huxley, 1952b; Hodgkin, Huxley, 1952c; Hodgkin, Huxley, 1952d]. Они описали селективность по натрию, потенциал-зависимую активацию и быструю инактивацию, а также разработали математическую модель возникновения потенциала действия. За эти исследования в 1963 году они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине "За открытия, касающиеся ионных механизмов возбуждения и торможения в периферических и центральных участках нервных клеток". В работах было продемонстрировано, что электрические сигналы в нервных клетках инициируются потенциал-зависимой активацией натриевых токов, которые переносят ионы натрия внутрь клетки. Затем натриевый ток инактивируется в течение 1-2 мс, и сигнал обрывается за счет активации потенциал-зависимого калиевого тока, который переносит ионы калия наружу и восстанавливает изначальный баланс электрических зарядов (Рис. 1).

Рисунок 1. Потенциал действия. Деполяризующий стимул выше порога активации заставляет открыться натриевые каналы (1). Через них в клетку начинает течь натриевый ток, вызывающий еще большую деполяризацию (2), приводящую к активации калиевых каналов. Через 1-2 мс после активации, натриевые каналы инактивируются, и ток калия из клетки реполяризует (3) мембрану. Когда мембрана гиперполяризуется из-за калиевого тока (4), калиевые каналы закрываются, и клетка возвращается в состояние покоя (5).

Метод фиксации потенциала был значительно усовершенствован, когда Эрвин Неер и Берт Закман попробовали измерить ток с малой площади мембраны живой клетки (или "патча")

15

с помощью тонкой пипетки. В 1976 году им впервые удалось зафиксировать ток единичного канала — ацетилхолинового рецептора никотинового типа [Neher, Sakmann, 1976] — метод был назван patch-clamp и сейчас является одним из эталонов измерения электрофизиологической активности мембран. Позднее удалось модифицировать метод для получения большой стабильности контакта, улучшенный метод назвали gigaseal (из-за того, что получался контакт с высоким электрическим сопротивлением в десятки гигаом) [Hamill и др., 1981]. За разработку этого метода они удостоились в 1991 году Нобелевской премии по физиологии и медицине "За открытия, касающиеся функций одиночных ионных каналов в клетках".

Использование селективных блокаторов калиевых и натриевых каналов, таких как тетродотоксин (TTX) [Narahashi, Moore, Scott, 1964], сакситоксин (STX) [Narahashi, Haas, Therrien, 1967], и тетраэтиламмоний (TEA) [Hagiwara, Saito, 1959], позволило решить целый ряд задач. Во-первых, было определено, что натриевый и калиевый ток проводятся каждый отдельно специальными каналами, имеющими трансмембранную пору и ворота на внутриклеточной стороне, в противовес мембранным транспортерам типа валиномицина, лишенных как ворот, так и поры (Рис. 2) [Armstrong, 1966; Armstrong, 1969; Armstrong, 1971; Armstrong, Binstock, 1965]. Армстронг в своих экспериментах определил, что TEA действовал на калиевые каналы только изнутри клетки, после их открытия, при этом TEA выбивался из предполагаемой поры при положительном потенциале и избытке калия снаружи такое возможно было только при наличии пронизывающей поры с внутриклеточными воротами и водной полостью. Также ток, соответствующий 600 ионам в миллисекунду, возможен только для поры, а не переносчиков. Во-вторых, удалось оценить количество одиночных натриевых каналов на мембранах нейронов (100-400 каналов на/мкм2) [Ritchie, Rogart, Strichartz, 1976] с помощью вытеснения радиоактивно-меченым 3H-STX немеченого TTX. С помощью тетродотоксина Хартшорн и Каттеролл выделили натриевые каналы из мозга и обнаружили, что он состоит из а-субъединицы с нековалентно ассоциированной р1-субъединицей и связанной дисульфидной связью р2-субъединицей [Hartshorne, Catterall, 1981; Hartshorne, Catterall, 1984]. После очистки этот комплекс был полностью функционален: в нем была одна пора и он демонстрировал зависимость активации от потенциала с теми же фармакологическими характеристиками.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мышкин Михаил Юрьевич, 2024 год

Список литературы

1. Abramson J. u gp. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3 // Nature. 2024. T. 630. № 8016. C. 493-500.

2. Ahuja S. u gp. Structural basis of Nav1.7 inhibition by an isoform-selective small-molecule antagonist// Science. 2015. T. 350. № 6267. C. aac5464.

3. Alabi A. A. u gp. Portability of paddle motif function and pharmacology in voltage sensors // Nature. 2007. T. 450. № 7168. C. 370-375.

4. Anangi R. u gp. EXPRESSION OF SNAKE VENOM TOXINS INPICHIA PASTORIS // Toxin Reviews. 2007. T. 26. № 2. C. 169-187.

5. Armstrong C. M. Time course of TEA(+)-induced anomalous rectification in squid giant axons // J. Gen. Physiol. 1966. T. 50. № 2. C. 491-503.

6. Armstrong C. M. Inactivation of the potassium conductance and related phenomena caused by quaternary ammonium ion injection in squid axons // J. Gen. Physiol. 1969. T. 54. № 5. C. 553-575.

7. Armstrong C. M. Interaction of tetraethylammonium ion derivatives with the potassium channels of giant axons // J. Gen. Physiol. 1971. T. 58. № 4. C. 413-437.

8. Armstrong C. M. Sodium channels and gating currents // Physiol. Rev. 1981. T. 61. № 3. C. 644-683.

9. Armstrong C. M., Bezanilla F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels //Nature. 1973. T. 242. № 5398. C. 459-461.

10. Armstrong C. M., Bezanilla F. Charge movement associated with the opening and closing of the activation gates of the Na channels // J. Gen. Physiol. 1974. T. 63. № 5. C. 533-552.

11. Armstrong C. M., Bezanilla F. Inactivation of the sodium channel. II. Gating current experiments // J. Gen. Physiol. 1977. T. 70. № 5. C. 567-590.

12. Armstrong C. M., Bezanilla F., Rojas E. Destruction of sodium conductance inactivation in squid axons perfused with pronase // J. Gen. Physiol. 1973. T. 62. № 4. C. 375-391.

13. Armstrong C. M., Binstock L. ANOMALOUS RECTIFICATION IN THE SQUID GIANT AXON INJECTED WITH TETRAETHYLAMMONIUM CHLORIDE // J. Gen. Physiol. 1965. T. 48. № 5. C. 859-872.

14. Arseniev A. S. u gp. 1 H-NMR study of gramicidin A transmembrane ion channel // FEBS Letters. 1985. T. 186. №2. C. 168-174.

15. Babb P. L. u gp. The Nephila clavipes genome highlights the diversity of spider silk genes and their complex expression // Nat. Genet. 2017. T. 49. № 6. C. 895-903.

16. Banham J. E. u gp. Distance measurements in the borderline region of applicability of CW EPR and DEER: A model study on a homologous series of spin-labelled peptides // Journal of Magnetic Resonance. 2008. T. 191. № 2. C. 202-218.

17. Batool M., Ahmad B., Choi S. A Structure-Based Drug Discovery Paradigm // Int. J. Mol. Sci.

2019. T. 20. № 11.

18. Battiste J. L., Wagner G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data//Biochemistry. 2000. T. 39. № 18. C. 5355-5365.

19. Baxter N. J., Williamson M. P. Temperature dependence of 1H chemical shifts in proteins // J. Biomol. NMR. 1997. T. 9. № 4. C. 359-369.

20. Bayrhuber M. u gp. Conkunitzin-S1 is the first member of a new Kunitz-type neurotoxin family. Structural and functional characterization // J. Biol. Chem. 2005. T. 280. № 25. C. 23766-23770.

21. Bemmelen M. X. van u gp. Cardiac voltage-gated sodium channel Nav1.5 is regulated by Nedd4-2 mediated ubiquitination // Circ. Res. 2004. T. 95. № 3. C. 284-291.

22. Bennett V., Chen L. Ankyrins and cellular targeting of diverse membrane proteins to physiological sites // Curr. Opin. Cell Biol. 2001. T. 13. № 1. C. 61-67.

23. Berjanskii M. V., Wishart D. S. A Simple Method To Predict Protein Flexibility Using Secondary Chemical Shifts // Journal of the American Chemical Society. 2005. T. 127. № 43. C. 14970-14971.

24. Berkut A. A. u gp. Structure of membrane-active toxin from crab spider Heriaeus melloteei suggests parallel evolution of sodium channel gating modifiers in Araneomorphae and Mygalomorphae // J. Biol. Chem. 2015. T. 290. № 1. C. 492-504.

25. Billen B. u gp. Unique bell-shaped voltage-dependent modulation of Na+ channel gating by novel insect-selective toxins from the spider Agelena orientalis // J. Biol. Chem. 2010. T. 285. № 24. C. 18545-18554.

26. Bollag G. u gp. Vemurafenib: the first drug approved for BRAF-mutant cancer // Nat. Rev. Drug Discov. 2012. T. 11. № 11. C. 873-886.

27. Bosmans F., Martin-Eauclaire M.-F., Swartz K. J. Deconstructing voltage sensor function and pharmacology in sodium channels //Nature. 2008. T. 456. № 7219. C. 202-208.

28. Bosmans F., Swartz K. J. Targeting voltage sensors in sodium channels with spider toxins // Trends Pharmacol. Sci. 2010. T. 31. № 4. C. 175-182.

29. Brackenbury W. J. u gp. Voltage-Gated Na Channel 1 Subunit-Mediated Neurite Outgrowth Requires Fyn Kinase and Contributes to Postnatal CNS Development In Vivo // Journal of Neuroscience. 2008. T. 28. № 12. C. 3246-3256.

30. Brackenbury W. J., Isom L. L. Na Channel P Subunits: Overachievers of the Ion Channel Family // Front. Pharmacol. 2011. T. 2. C. 53.

31. Brust A. u gp. x-Conopeptide Pharmacophore Development: Toward a Novel Class of Norepinephrine Transporter Inhibitor (Xen2174) for Pain // Journal of Medicinal Chemistry. 2009. T. 52. №22. C. 6991-7002.

32. Buffington S. A., Rasband M. N. Na+ channel-dependent recruitment of NavP4 to axon initial segments and nodes of Ranvier // J. Neurosci. 2013. T. 33. № 14. C. 6191-6202.

33. Butterwick J. A., MacKinnon R. Solution structure and phospholipid interactions of the isolated voltage-sensor domain from KvAP // J. Mol. Biol. 2010. T. 403. № 4. C. 591-606.

34. Calderon R. O., Attema B., DeVries G. H. Lipid Composition of Neuronal Cell Bodies and Neurites from Cultured Dorsal Root Ganglia // Journal of Neurochemistry. 2002. T. 64. № 1. C. 424-429.

35. Calhoun J. D., Isom L. L. The role of non-pore-forming P subunits in physiology and pathophysiology of voltage-gated sodium channels //Handb. Exp. Pharmacol. 2014. T. 221. C. 51-89.

36. Cannon S. C. When all is lost.. .a severe myopathy with hypotonia from sodium channel mutations // Brain. 2016. T. 139. № Pt 3. C. 642-644.

37. Cannon S. C. Sodium Channelopathies of Skeletal Muscle // Handb. Exp. Pharmacol. 2018. T. 246. C.309-330.

38. Cannon S. C., Brown R. H. Jr, Corey D. P. Theoretical reconstruction of myotonia and paralysis caused by incomplete inactivation of sodium channels //Biophys. J. 1993. T. 65. № 1. C. 270-288.

39. Capes D. L. u gp. Gating transitions in the selectivity filter region of a sodium channel are coupled to the domain IV voltage sensor // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012. T. 109. № 7. C. 2648-2653.

40. Catterall W. A. Voltage-dependent gating of sodium channels: correlating structure and function // Trends in Neurosciences. 1986. T. 9. C. 7-10.

41. Catterall W. A. u gp. Structure and biosynthesis of neuronal sodium channels // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1986. T. 479. C. 186-203.

42. Catterall W. A. Voltage-gated sodium channels at 60: structure, function and pathophysiology // J. Physiol. 2012. T. 590. № 11. C. 2577-2589.

43. Cavanagh J. u gp. Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice. : Elsevier, 2010. 912 c.

44. Chahine M. u gp. Regulation of Nav channels in sensory neurons // Trends in Pharmacological Sciences. 2005. T. 26. № 10. C. 496-502.

45. Chandler W. K., Meves H. Voltage clamp experiments on internally perfused giant axons // J. Physiol. 1965. T. 180. № 4. C. 788-820.

46. Chen C. u gp. Reduced sodium channel density, altered voltage dependence of inactivation, and increased susceptibility to seizures in mice lacking sodium channel p2-subunits // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002. T. 99. № 26. C. 17072-17077.

47. Chill J. H. u gp. Measurement of 15N relaxation in the detergent-solubilized tetrameric KcsA potassium channel // J. Biomol. NMR. 2006. T. 36. № 2. C. 123-136.

48. Chugunov A. O. u gp. Temperature-sensitive gating of TRPV1 channel as probed by atomistic simulations of its trans- and juxtamembrane domains // Sci. Rep. 2016. T. 6. C. 33112.

49. Clairfeuille T. u gp. Structural basis of a-scorpion toxin action on Na channels // Science. 2019. T. 363. №6433.

50. Clark R. J. u gp. The engineering of an orally active conotoxin for the treatment of neuropathic pain // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2010. T. 49. № 37. C. 6545-6548.

51. Cole R., Loria J. P. FAST-Modelfree: a program for rapid automated analysis of solution NMR spin-relaxation data// J. Biomol. NMR. 2003. T. 26. № 3. C. 203-213.

52. Coon J. J. h gp. Tandem Mass Spectrometry for Peptide and Protein Sequence Analysis // BioTechniques. 2005. T. 38. № 4. C. 519-523.

53. Cox J. J. h gp. An SCN9A channelopathy causes congenital inability to experience pain //Nature. 2006. T. 444. № 7121. C. 894-898.

54. Craik D. J., Adams D. J. Chemical modification of conotoxins to improve stability and activity // ACS Chem. Biol. 2007. T. 2. № 7. C. 457-468.

55. Cushman D. W. h gp. Design of potent competitive inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Carboxyalkanoyl and mercaptoalkanoyl amino acids // Biochemistry. 1977. T. 16. № 25. C. 5484-5491.

56. Das S. h gp. Binary architecture of the Nav1.2-P2 signaling complex // eLife. 2016. T. 5.

57. Delaglio F., Wu Z., Bax A. Measurement of homonuclear proton couplings from regular 2D COSY spectra// J. Magn. Reson. 2001. T. 149. № 2. C. 276-281.

58. Deschênes I. h gp. Isoform-Specific Modulation of Voltage-Gated Na Channels by Calmodulin // Circulation Research. 2002. T. 90. № 4.

59. Dominguez C., Boelens R., Bonvin A. M. J. HADDOCK: A Protein-Protein Docking Approach Based on Biochemical or Biophysical Information // Journal of the American Chemical Society. 2003. T. 125. №7. C. 1731-1737.

60. Doyle D. A. h gp. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity // Science. 1998. T. 280. № 5360. C. 69-77.

61. Du Y. h gp. Identification of new batrachotoxin-sensing residues in segment IIIS6 of the sodium channel//J. Biol. Chem. 2011. T. 286. № 15. C. 13151-13160.

62. Efremov R. G. h gp. Molecular lipophilicity in protein modeling and drug design // Curr. Med. Chem. 2007. T. 14. № 4. C. 393-415.

63. Egbertson M. S. h gp. Non-peptide fibrinogen receptor antagonists. 2. Optimization of a tyrosine template as a mimic for Arg-Gly-Asp // J. Med. Chem. 1994. T. 37. № 16. C. 2537-2551.

64. Englander J. h gp. Selective labeling of a membrane peptide with15N-amino acids using cells grown in rich medium // Biopolymers. 2006. T. 84. № 5. C. 508-518.

65. England S., Groot M. J. de. Subtype-selective targeting of voltage-gated sodium channels // Br. J. Pharmacol. 2009. T. 158. № 6. C. 1413-1425.

66. Erlanson D. A. h gp. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery //Nat. Rev. Drug Discov. 2016. T. 15. № 9. C. 605-619.

67. Escoubas P. h gp. Multidimensional peptide fingerprinting by high performance liquid chromatography, capillary zone electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the identification of tarantula venom samples // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 1998. T. 12. № 16. C. 1075-1084.

68. Escoubas P., Quinton L., Nicholson G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry // Journal of Mass Spectrometry. 2008. T. 43. № 3. C. 279-295.

69. Escoubas P., Rash L. Tarantulas: eight-legged pharmacists and combinatorial chemists // Toxicon.

161

2004. T. 43. № 5. C. 555-574.

70. Flinspach M. u gp. Insensitivity to pain induced by a potent selective closed-state Nav1.7 inhibitor // Sci. Rep. 2017. T. 7. C. 39662.

71. Fu S. u gp. Erratum to: First-in-human phase I study of SOR-C13, a TRPV6 calcium channel inhibitor, in patients with advanced solid tumors // Invest. New Drugs. 2017. T. 35. № 3. C. 397.

72. Gilchrist J. u gp. Crystallographic insights into sodium-channel modulation by the P4 subunit // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. T. 110. № 51. C. E5016-24.

73. Gilchrist J., Olivera B. M., Bosmans F. Animal toxins influence voltage-gated sodium channel function//Handb. Exp. Pharmacol. 2014. T. 221. C. 203-229.

74. Goldin A. L. u gp. Messenger RNA coding for only the alpha subunit of the rat brain Na channel is sufficient for expression of functional channels in Xenopus oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. T. 83. № 19. C. 7503-7507.

75. Goldin A. L. Resurgence of sodium channel research // Annu. Rev. Physiol. 2001. T. 63. C. 871-894.

76. Gossert A. D., Jahnke W. NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2016. T. 97. C. 82-125.

77. Gui J. u gp. A Tarantula-Venom Peptide Antagonizes the TRPA1 Nociceptor Ion Channel by Binding to the S1-S4 Gating Domain // Current Biology. 2014. T. 24. № 5. C. 473-483.

78. Guntert P. Automated NMR structure calculation with CYANA // Methods Mol. Biol. 2004. T. 278. C. 353-378.

79. Hagiwara S., Saito N. Voltage-current relations in nerve cell membrane of Onchidium verruculatum//J. Physiol. 1959. T. 148. № 1. C. 161-179.

80. Hajduk P. J., Meadows R. P., Fesik S. W. NMR-based screening in drug discovery // Q. Rev. Biophys. 1999. T. 32. № 3. C. 211-240.

81. Hamill O. P. u gp. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches //Pflugers Arch. 1981. T. 391. № 2. C. 85-100.

82. Haney R. A. u gp. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics // BMC Genomics. 2014. T. 15. № 1. C. 366.

83. Harner M. J., Frank A. O., Fesik S. W. Fragment-based drug discovery using NMR spectroscopy // Journal of BiomolecularNMR. 2013. T. 56. № 2. C. 65-75.

84. Hartshorne R. P., Catterall W. A. Purification of the saxitoxin receptor of the sodium channel from rat brain // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981. T. 78. № 7. C. 4620-4624.

85. Hartshorne R. P., Catterall W. A. The sodium channel from rat brain. Purification and subunit composition//J. Biol. Chem. 1984. T. 259. № 3. C. 1667-1675.

86. Hefke F. u gp. Optimization of amino acid type-specific 13C and 15N labeling for the backbone assignment of membrane proteins by solution- and solid-state NMR with the UPLABEL algorithm // J. Biomol. NMR. 2011. T. 49. № 2. C. 75-84.

87. Hein C. h gp. Acceleration of protein backbone NMR assignment by combinatorial labeling: Application to a small molecule binding study // Biopolymers. 2017. T. 107. № 5.

88. Henrion U. h gp. Tracking a complete voltage-sensor cycle with metal-ion bridges // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. T. 109. № 22. C. 8552-8557.

89. Hille B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve // J. Gen. Physiol. 1971. T. 58. № 6. C. 599-619.

90. Hille B. The permeability of the sodium channel to metal cations in myelinated nerve // J. Gen. Physiol. 1972. T. 59. № 6. C. 637-658.

91. Hille B. Ionic selectivity, saturation, and block in sodium channels. A four-barrier model // J. Gen. Physiol. 1975. T. 66. № 5. C. 535-560.

92. Hille B. Ionic Basis of Resting and Action Potentials // Comprehensive Physiology. 1977. C. 99-136.

93. Hille B. Ion Channels of Excitable Membranes. : Sinauer Associates Incorporated, 2001. 814 c.

94. Hodgkin A. L., Huxley A. F. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo // The Journal of Physiology. 1952a. T. 116. № 4. C. 449-472.

95. Hodgkin A. L., Huxley A. F. The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo // The Journal of Physiology. 1952b. T. 116. № 4. C. 497-506.

96. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve // The Journal of Physiology. 1952c. T. 117. № 4. C. 500-544.

97. Hodgkin A. L., Huxley A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo//J. Physiol. 1952d. T. 116. № 4. C. 473-496.

98. Horga A. h gp. Prevalence study of genetically defined skeletal muscle channelopathies in England //Neurology. 2013. T. 80. № 16. C. 1472-1475.

99. Huang W. h gp. Structure-based assessment of disease-related mutations in human voltage-gated sodium channels // Protein Cell. 2017. T. 8. № 6. C. 401-438.

100. Isom L. L. h gp. Primary structure and functional expression of the beta 1 subunit of the rat brain sodium channel // Science. 1992. T. 256. № 5058. C. 839-842.

101. Isom L. L. h gp. Structure and function of the beta 2 subunit of brain sodium channels, a transmembrane glycoprotein with a CAM motif// Cell. 1995. T. 83. № 3. C. 433-442.

102. Isom L. L., Catterall W. A. Na+ channel subunits and Ig domains //Nature. 1996. T. 383. № 6598. C.307-308.

103. Jensen M. 0. h gp. Mechanism of voltage gating in potassium channels // Science. 2012. T. 336. №6078. C. 229-233.

104. Jiang D. h gp. Structural basis for gating pore current in periodic paralysis //Nature. 2018. T. 557. № 7706. C. 590-594.

105. Jiang D. h gp. Structure of the Cardiac Sodium Channel // Cell. 2020. T. 180. № 1. C. 122-134.e10.

106. Jiang Y. u gp. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel //Nature. 2003. T. 423. № 6935. C. 33-41.

107. Jung H. J. u gp. Solution structure and lipid membrane partitioning of VSTx1, an inhibitor of the KvAP potassium channel //Biochemistry. 2005. T. 44. № 16. C. 6015-6023.

108. Jurkat-Rott K. u gp. Sodium channelopathies of skeletal muscle result from gain or loss of function // Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 2010. T. 460. № 2. C. 239-248.

109. Kainosho M., Tsuji T. Assignment of the three methionyl carbonyl carbon resonances in Streptomyces subtilisin inhibitor by a carbon-13 and nitrogen-15 double-labeling technique. A new strategy for structural studies of proteins in solution // Biochemistry. 1982. T. 21. № 24. C. 6273-6279.

110. Kasai T. u gp. Stable isotope labeling strategy based on coding theory // J. Biomol. NMR. 2015. T. 63. №2. C. 213-221.

111. Kaser A. u gp. The AVIT protein family. Secreted cysteine-rich vertebrate proteins with diverse functions //EMBO Rep. 2003. T. 4. № 5. C. 469-473.

112. Kazen-Gillespie K. A. u gp. Cloning, Localization, and Functional Expression of Sodium Channel P1A Subunits // Journal of Biological Chemistry. 2000. T. 275. № 2. C. 1079-1088.

113. Kazimierczuk K., Orekhov V. Y. Accelerated NMR spectroscopy by using compressed sensing // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2011. T. 50. № 24. C. 5556-5559.

114. Kim D. Y. u gp. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity // Nat. Cell Biol. 2007. T. 9. № 7. C. 755-764.

115. King G. F., Hardy M. C. Spider-venom peptides: structure, pharmacology, and potential for control of insect pests // Annu. Rev. Entomol. 2013. T. 58. C. 475-496.

116. Kiyatkin N. I. u gp. Cloning and structure of cDNA encoding alpha-latrotoxin from black widow spider venom //FEBS Lett. 1990. T. 270. № 1-2. C. 127-131.

117. Klammt C. u gp. Facile backbone structure determination of human membrane proteins by NMR spectroscopy //Nat. Methods. 2012. T. 9. № 8. C. 834-839.

118. Kneller J. M., Lu M., Bracken C. An Effective Method for the Discrimination of Motional Anisotropy and Chemical Exchange // Journal of the American Chemical Society. 2002. T. 124. № 9. C. 1852-1853.

119. Koh C. Y., Kini R. M. From snake venom toxins to therapeutics--cardiovascular examples // Toxicon. 2012. T. 59. № 4. C. 497-506.

120. Koishi R. u gp. A superfamily of voltage-gated sodium channels in bacteria // J. Biol. Chem. 2004. T. 279. № 10. C. 9532-9538.

121. Korzhnev D. M. u gp. NMR studies of Brownian tumbling and internal motions in proteins // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 2001. T. 38. № 3. C. 197-266.

122. Kot E. F. u gp. Phase Transitions in Small Isotropic Bicelles //Langmuir. 2018. T. 34. № 11. C. 3426-3437.

123. Kovacs H., Moskau D., Spraul M. Cryogenically cooled probes—a leap in NMR technology // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 2005. T. 46. № 2-3. C. 131-155.

124. Kozlov S. u gp. A novel strategy for the identification of toxinlike structures in spider venom // Proteins. 2005. T. 59. № 1. C. 131-140.

125. Kuhn-Nentwig L., Stocklin R., Nentwig W. Venom Composition and Strategies in Spiders // Spider Physiology and Behaviour - Physiology. 2011. C. 1-86.

126. Langenegger N., Nentwig W., Kuhn-Nentwig L. Spider Venom: Components, Modes of Action, and Novel Strategies in Transcriptomic and Proteomic Analyses // Toxins . 2019. T. 11. № 10.

127. Lange O. F. u gp. Determination of solution structures of proteins up to 40 kDa using CS-Rosetta with sparse NMR data from deuterated samples // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. T. 109. № 27. C.10873-10878.

128. Lau C. H. Y., King G. F., Mobli M. Molecular basis of the interaction between gating modifier spider toxins and the voltage sensor of voltage-gated ion channels // Scientific Reports. 2016. T. 6. № 1.

129. Lavecchia A., Cerchia C. In silico methods to address polypharmacology: current status, applications and future perspectives // Drug Discov. Today. 2016. T. 21. № 2. C. 288-298.

130. Lavecchia A., Di Giovanni C. Virtual screening strategies in drug discovery: a critical review // Curr. Med. Chem. 2013. T. 20. № 23. C. 2839-2860.

131. Law C. L., Sanders C. R. NMR resonance assignments and secondary structure of a mutant form of the human KCNE1 channel accessory protein that exhibits KCNE3-like function // Biomol. NMR Assign. 2019. T. 13. № 1.

132. Lee C.-H., MacKinnon R. Voltage Sensor Movements during Hyperpolarization in the HCN Channel // Cell. 2019. T. 179. № 7. C. 1582-1589.e7.

133. Lee H.-K. u gp. A marine analgesic peptide, Contulakin-G, and neurotensin are distinct agonists for neurotensin receptors: uncovering structural determinants of desensitization properties // Front. Pharmacol. 2015. T. 6. C. 11.

134. Lee S.-Y. u gp. Structure of the KvAP voltage-dependent K+ channel and its dependence on the lipid membrane //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. T. 102. № 43. C. 15441-15446.

135. Lee S.-Y., MacKinnon R. A membrane-access mechanism of ion channel inhibition by voltage sensor toxins from spider venom // Nature. 2004. T. 430. № 6996. C. 232-235.

136. Leipold E. u gp. Molecular interaction of S-conotoxins with voltage-gated sodium channels // FEBS Letters. 2005. T. 579. № 18. C. 3881-3884.

137. LiontaE. u gp. Structure-based virtual screening for drug discovery: principles, applications and recent advances // Curr. Top. Med. Chem. 2014. T. 14. № 16. C. 1923-1938.

138. Lipfert J. u gp. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering // J. Phys. Chem. B. 2007. T. 111. № 43. C. 12427-12438.

139. Lipkind G. M., Fozzard H. A. KcsA crystal structure as framework for a molecular model of the Na(+) channel pore //Biochemistry. 2000. T. 39. № 28. C. 8161-8170.

140. Li Q. u gp. Structural Mechanism of Voltage-Dependent Gating in an Isolated Voltage-Sensing Domain //Biophysical Journal. 2013. T. 104. № 2. C. 196a.

141. Lohr F. u gp. Combinatorial triple-selective labeling as a tool to assist membrane protein backbone resonance assignment // J. Biomol. NMR. 2012. T. 52. № 3. C. 197-210.

142. Lohr F. u gp. Time-shared experiments for efficient assignment of triple-selectively labeled proteins // J. Magn. Reson. 2014. T. 248. C. 81-95.

143. Lohr F. u gp. An extended combinatorial 15N, 13Ca, and 13C' labeling approach to protein backbone resonance assignment // J. Biomol. NMR. 2015. T. 62. № 3. C. 263-279.

144. Long S. B. u gp. Atomic structure of a voltage-dependent K channel in a lipid membrane-like environment//Nature. 2007. T. 450. № 7168. C. 376-382.

145. Long S. B., Campbell E. B., Mackinnon R. Voltage sensor of Kv1.2: structural basis of electromechanical coupling // Science. 2005. T. 309. № 5736. C. 903-908.

146. Lopez-Santiago L. F. u gp. Sodium channel Scn1b null mice exhibit prolonged QT and RR intervals // J. Mol. Cell. Cardiol. 2007. T. 43. № 5. C. 636-647.

147. Lyukmanova E. N. u gp. Structural Insight into Specificity of Interactions between Nonconventional Three-finger Weak Toxin from Naja kaouthia (WTX) and Muscarinic Acetylcholine Receptors // J. Biol. Chem. 2015. T. 290. № 39. C. 23616-23630.

148. MacKinnon R. u gp. Structural conservation in prokaryotic and eukaryotic potassium channels // Science. 1998. T. 280. № 5360. C. 106-109.

149. Malhotra J. D. u gp. Structural Requirements for Interaction of Sodium Channel P1 Subunits with Ankyrin // Journal of Biological Chemistry. 2002. T. 277. № 29. C. 26681-26688.

150. Malmberg A. B. u gp. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T // Pain. 2003. T. 101. № 1-2. C. 109-116.

151. Mannikko R. u gp. Spider toxin inhibits gating pore currents underlying periodic paralysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018. T. 115. № 17. C. 4495-4500.

152. Marti-Renom M. A. u gp. Comparative protein structure modeling of genes and genomes // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000. T. 29. C. 291-325.

153. Maslennikov I. u gp. Membrane domain structures of three classes of histidine kinase receptors by cell-free expression and rapid NMR analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. T. 107. № 24. C.10902-10907.

154. Mayor A. Greek Fire, Poison Arrows, and Scorpion Bombs: Unconventional Warfare in the Ancient World. : Princeton University Press, 2022. 432 c.

155. McCormick K. A. u gp. Molecular determinants of Na+ channel function in the extracellular domain ofthebeta1 subunit//J. Biol. Chem. 1998. T. 273. № 7. C. 3954-3962.

156. McEwen D. P. u gp. Sodium channel beta1 subunit-mediated modulation of Nav1.2 currents and cell surface density is dependent on interactions with contactin and ankyrin // J. Biol. Chem. 2004. T. 279. № 16. C. 16044-16049.

157. Messner D. J., Catterall W. A. The sodium channel from rat brain. Separation and characterization of subunits//J. Biol. Chem. 1985. T. 260. № 19. C. 10597-10604.

158. Milescu M. u gp. Tarantula toxins interact with voltage sensors within lipid membranes // J. Gen. Physiol. 2007. T. 130. № 5. C. 497-511.

159. Milescu M. u gp. Interactions between lipids and voltage sensor paddles detected with tarantula toxins//Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. T. 16. № 10. C. 1080-1085.

160. Miljanich G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain // Curr. Med. Chem. 2004. T. 11. № 23. C. 3029-3040.

161. Miller J. A., Agnew W. S., Levinson S. R. Principal glycopeptide of the tetrodotoxin/saxitoxin binding protein from Electrophorus electricus: isolation and partial chemical and physical characterization //Biochemistry. 1983. T. 22. № 2. C. 462-470.

162. Minor D. L. Jr u gp. Transmembrane structure of an inwardly rectifying potassium channel // Cell. 1999. T. 96. № 6. C. 879-891.

163. Moreau A., Gosselin-Badaroudine P., Chahine M. Molecular biology and biophysical properties of ion channel gating pores // Q. Rev. Biophys. 2014. T. 47. № 4. C. 364-388.

164. Morgan K. u gp. beta 3: an additional auxiliary subunit of the voltage-sensitive sodium channel that modulates channel gating with distinct kinetics // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. T. 97. № 5. C. 2308-2313.

165. Mori M. u gp. Novel interaction of the voltage-dependent sodium channel (VDSC) with calmodulin: does VDSC acquire calmodulin-mediated Ca2+-sensitivity? // Biochemistry. 2000. T. 39. №6. C. 1316-1323.

166. Murray J. K. u gp. Single Residue Substitutions That Confer Voltage-Gated Sodium Ion Channel Subtype Selectivity in the NaV1.7 Inhibitory Peptide GpTx-1 // J. Med. Chem. 2016. T. 59. № 6. C. 2704-2717.

167. Myshkin M. Y. u gp. Cell-Free Expression of Sodium Channel Domains for Pharmacology Studies. Noncanonical Spider Toxin Binding Site in the Second Voltage-Sensing Domain of Human Na1.4 Channel //Front. Pharmacol. 2019. T. 10. C. 953.

168. Namadurai S. u gp. Crystal structure and molecular imaging of the Nav channel P3 subunit indicates a trimeric assembly // J. Biol. Chem. 2014. T. 289. № 15. C. 10797-10811.

169. Narahashi T., Haas H. G., Therrien E. F. Saxitoxin and tetrodotoxin: comparison of nerve blocking mechanism // Science. 1967. T. 157. № 3795. C. 1441-1442.

170. Narahashi T., Moore J. W., Scott W. R. TETRODOTOXIN BLOCKAGE OF SODIUM CONDUCTANCE INCREASE IN LOBSTER GIANT AXONS // J. Gen. Physiol. 1964. T. 47. № 5. C. 965-974.

171. Nardi A. u gp. Advances in targeting voltage-gated sodium channels with small molecules // ChemMedChem. 2012. T. 7. № 10. C. 1712-1740.

172. Neher E., Sakmann B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres //Nature. 1976. T. 260. № 5554. C. 799-802.

173. Ng H. Q. u gp. Purification and structural characterization of the voltage-sensor domain of the hERG potassium channel // Protein Expr. Purif. 2012. T. 86. № 2. C. 98-104.

174. Nicholson G. M., Graudins A. Spiders of medical importance in the Asia-Pacific: Atracotoxin, latrotoxin and related spider neurotoxins // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 2002. T. 29. № 9. C. 785-794.

175. Nietlispach D., Gautier A. Solution NMR studies of polytopic a-helical membrane proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2011. T. 21. № 4. C. 497-508.

176. Nikolsky A. S. u gp. Voltage-gated sodium channels are targets for toxins from the venom of the spider Heriaeus melloteei // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2009. T. 3. № 3. C. 245-253.

177. Noda M. u gp. Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence//Nature. 1984. T. 312. № 5990. C. 121-127.

178. Noda M. u gp. Expression of functional sodium channels from cloned cDNA //Nature. 1986. T. 322. № 6082. C. 826-828.

179. Norton R. S. Peptide Toxin Structure and Function by NMR // Modern Magnetic Resonance. 2018. C.2081-2097.

180. O'Malley H. A., Isom L. L. Sodium channel P subunits: emerging targets in channelopathies // Annu. Rev. Physiol. 2015. T. 77. C. 481-504.

181. Ozawa S.-I. u gp. Structural basis for the inhibition of voltage-dependent K channel by gating modifier toxin// Scientific Reports. 2015. T. 5. № 1.

182. Pan X. u gp. Structure of the human voltage-gated sodium channel Na v 1.4 in complex with P1 // Science. 2018. T. 362. № 6412.

183. Paramonov A. S. u gp. NMR investigation of the isolated second voltage-sensing domain of human Nav1.4 channel //Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 2017. T. 1859. № 3. C. 493-506.

184. Parker M. J. u gp. A combinatorial selective labeling method for the assignment of backbone amide NMR resonances//J. Am. Chem. Soc. 2004. T. 126. № 16. C. 5020-5021.

185. Park J. H. u gp. Studies examining the relationship between the chemical structure of protoxin II and its activity on voltage gated sodium channels // J. Med. Chem. 2014. T. 57. № 15. C. 6623-6631.

186. Payandeh J. u gp. The crystal structure of a voltage-gated sodium channel //Nature. 2011. T. 475. №7356. C. 353-358.

187. Payandeh J. Progress in understanding slow inactivation speeds up // J. Gen. Physiol. 2018. T. 150. №9. C. 1235-1238.

188. Pellecchia M., Sem D. S., Wuthrich K. NMR in drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. T. 1. №3. C. 211-219.

189. Peng D. u gp. Purification and Structural Study of the Voltage-Sensor Domain of the Human KCNQ1 Potassium Ion Channel //Biochemistry. 2014. T. 53. № 12. C. 2032-2042.

190. Pennington M. W., Czerwinski A., Norton R. S. Peptide therapeutics from venom: Current status and potential // Bioorg. Med. Chem. 2018. T. 26. № 10. C. 2738-2758.

191. Pervushin K. u gp. Attenuated T2 relaxation by mutual cancellation of dipole-dipole coupling and chemical shift anisotropy indicates an avenue to NMR structures of very large biological

macromolecules in solution//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. T. 94. № 23. C. 12366-12371.

192. Phillips L. R. u gp. Voltage-sensor activation with a tarantula toxin as cargo // Nature. 2005. T. 436. № 7052. C. 857-860.

193. Pineda S. S. u gp. Spider venomics: implications for drug discovery //Future Med. Chem. 2014. T. 6. № 15. C. 1699-1714.

194. Plummer N. W., Meisler M. H. Evolution and diversity of mammalian sodium channel genes // Genomics. 1999. T. 57. № 2. C. 323-331.

195. Poget S. F., Cahill S. M., Girvin M. E. Isotropic bicelles stabilize the functional form of a small multidrug-resistance pump for NMR structural studies // J. Am. Chem. Soc. 2007. T. 129. № 9. C. 2432-2433.

196. Popot J.-L. Folding membrane proteins in vitro: A table and some comments // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2014. T. 564. C. 314-326.

197. Prevarskaya N., Skryma R., Shuba Y. Ion channels and the hallmarks of cancer // Trends in Molecular Medicine. 2010. T. 16. № 3. C. 107-121.

198. Priest B. T. u gp. ProTx-I and ProTx-II: gating modifiers of voltage-gated sodium channels // Toxicon. 2007. T. 49. № 2. C. 194-201.

199. Qu X. u gp. Accelerated NMR spectroscopy with low-rank reconstruction // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2015. T. 54. № 3. C. 852-854.

200. Reckel S. u gp. Solution NMR structure of proteorhodopsin // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2011. T. 50. № 50. C. 11942-11946.

201. Redaelli E. u gp. Target promiscuity and heterogeneous effects of tarantula venom peptides affecting Na and K ion channels // Journal of Biological Chemistry. 2010. T. 285. № 17. C. 13314.

202. Reginsson G. W., Schiemann O. Pulsed electron-electron double resonance: beyond nanometre distance measurements on biomacromolecules //Biochemical Journal. 2011. T. 434. № 3. C. 353-363.

203. Ren D. u gp. A prokaryotic voltage-gated sodium channel // Science. 2001. T. 294. № 5550. C. 2372-2375.

204. Richmond J. E. u gp. Slow Inactivation in Human Cardiac Sodium Channels // Biophysical Journal. 1998. T. 74. № 6. C. 2945-2952.

205. Riek R. u gp. Solution NMR techniques for large molecular and supramolecular structures // J. Am. Chem. Soc. 2002. T. 124. № 41. C. 12144-12153.

206. Ritchie J. M., Rogart R. B., Strichartz G. R. A new method for labelling saxitoxin and its binding to non-myelinated fibres of the rabbit vagus, lobster walking leg, and garfish olfactory nerves // The Journal of Physiology. 1976. T. 261. № 2. C. 477-494.

207. Rudel R., Lehmann-Horn F. Membrane changes in cells from myotonia patients // Physiol. Rev. 1985. T. 65. №2. C. 310-356.

208. Rule G. S., Kevin Hitchens T. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy. : Springer Science & Business Media, 2006. 532 c.

209. Sanders C. R., Sonnichsen F. Solution NMR of membrane proteins: practice and challenges // Magn. Reson. Chem. 2006. T. 44 Spec No. C. S24-40.

210. Sanggaard K. W. u gp. Spider genomes provide insight into composition and evolution of venom and silk//Nat. Commun. 2014. T. 5. C. 3765.

211. Sastry M., Bewley C. A., Kwong P. D. Mammalian expression of isotopically labeled proteins for NMR spectroscopy // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. T. 992. C. 197-211.

212. Scarborough R. M. u gp. Design of potent and specific integrin antagonists. Peptide antagonists with high specificity for glycoprotein IIb-IIIa // J. Biol. Chem. 1993. T. 268. № 2. C. 1066-1073.

213. Schanda P., Van Melckebeke H., Brutscher B. Speeding up three-dimensional protein NMR experiments to a few minutes // J. Am. Chem. Soc. 2006. T. 128. № 28. C. 9042-9043.

214. Schneider M. F., Chandler W. K. Voltage Dependent Charge Movement in Skeletal Muscle: a Possible Step in Excitation-Contraction Coupling //Nature. 1973. T. 242. № 5395. C. 244-246.

215. Schultz J. u gp. Specific interactions between the syntrophin PDZ domain and voltage-gated sodium channels //Nat. Struct. Biol. 1998. T. 5. № 1. C. 19-24.

216. Schwager E. E. u gp. The house spider genome reveals an ancient whole-genome duplication during arachnid evolution // BMC Biol. 2017. T. 15. № 1. C. 62.

217. Schwalbe H. Editorial: New 1.2 GHz NMR Spectrometers- New Horizons? // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2017. T. 56. № 35. C. 10252-10253.

218. Shen H. u gp. Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution // Science. 2017. T. 355. № 6328.

219. Shen H. u gp. Structures of human Na v 1.7 channel in complex with auxiliary subunits and animal toxins // Science. 2019. T. 363. № 6433. C. 1303-1308.

220. Shenkarev Z. O. u gp. Lipid-protein nanodiscs as reference medium in detergent screening for high-resolution NMR studies of integral membrane proteins // J. Am. Chem. Soc. 2010. T. 132. № 16. C.5628-5629.

221. Shenkarev Z. O. u gp. Molecular mechanism of action of P-hairpin antimicrobial peptide arenicin: oligomeric structure in dodecylphosphocholine micelles and pore formation in planar lipid bilayers // Biochemistry. 2011. T. 50. № 28. C. 6255-6265.

222. Shenkarev Z. O. u gp. Lipid-protein nanodiscs promote in vitro folding of transmembrane domains of multi-helical and multimeric membrane proteins //Biochim. Biophys. Acta. 2013. T. 1828. № 2. C. 776-784.

223. Shen Y. u gp. TALOS : a hybrid method for predicting protein backbone torsion angles from NMR chemical shifts // Journal of Biomolecular NMR. 2009. T. 44. № 4. C. 213-223.

224. Shen Y., Bax A. Protein backbone and sidechain torsion angles predicted from NMR chemical shifts using artificial neural networks // J. Biomol. NMR. 2013. T. 56. № 3. C. 227-241.

225. Sheumack D. D. u gp. Complete amino acid sequence of a new type of lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spiderAtrax robustus // FEBS Letters. 1985. T. 181. № 1. C. 154-156.

226. Shi J. h gp. Protein signal assignments using specific labeling and cell-free synthesis // J. Biomol.

170

NMR. 2004. T. 28. № 3. C. 235-247.

227. Shuker S. B. u gp. Discovering high-affinity ligands for proteins: SARby NMR// Science. 1996. T. 274. № 5292. C. 1531-1534.

228. Siegenbeek van Heukelom J. Role of the anomalous rectifier in determining membrane potentials of mouse muscle fibres at low extracellular K+ // J. Physiol. 1991. T. 434. C. 549-560.

229. Skerratt S. E., West C. W. Ion channel therapeutics for pain // Channels . 2015. T. 9. № 6. C. 344-351.

230. Skinner W. S. u gp. Purification and Characterization of Two Classes of Neurotoxins from the Funnel Web Spider, Agelenopsis aperta// Journal of Biological Chemistry. 1989. T. 264. № 4. C. 2150-2155.

231. Smith J. J., Undheim E. A. B. True Lies: Using Proteomics to Assess the Accuracy of Transcriptome-Based Venomics in Centipedes Uncovers False Positives and Reveals Startling Intraspecific Variation in Scolopendra Subspinipes // Toxins . 2018. T. 10. № 3.

232. Sobhanifar S. u gp. Cell-free expression and stable isotope labelling strategies for membrane proteins // J. Biomol. NMR. 2010. T. 46. № 1. C. 33-43.

233. Sokolov S., Scheuer T., Catterall W. A. Depolarization-activated gating pore current conducted by mutant sodium channels in potassium-sensitive normokalemic periodic paralysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. T. 105. № 50. C. 19980-19985.

234. Song C. M., Lim S. J., Tong J. C. Recent advances in computer-aided drug design // Briefings in Bioinformatics. 2009. T. 10. № 5. C. 579-591.

235. Staunton D. u gp. Cell-free expression and selective isotope labelling in protein NMR // Magn. Reson. Chem. 2006. T. 44 Spec No. C. S2-9.

236. Stevens M., Peigneur S., Tytgat J. Neurotoxins and their binding areas on voltage-gated sodium channels //Front. Pharmacol. 2011. T. 2. C. 71.

237. Strong M., Chandy K. G., Gutman G. A. Molecular evolution of voltage-sensitive ion channel genes: on the origins of electrical excitability // Mol. Biol. Evol. 1993. T. 10. № 1. C. 221-242.

238. Struyk A. F., Cannon S. C. Paradoxical depolarization of BA2 - treated muscle exposed to low extracellular K : Insights into resting potential abnormalities in hypokalemic paralysis // Muscle & Nerve. 2008. T. 37. № 3. C. 326-337.

239. Sunagar K. u gp. Evolution stings: the origin and diversification of scorpion toxin peptide scaffolds // Toxins . 2013. T. 5. № 12. C. 2456-2487.

240. Swartz K. J., MacKinnon R. Mapping the receptor site for hanatoxin, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels //Neuron. 1997. T. 18. № 4. C. 675-682.

241. Swinney D. C., Anthony J. How were new medicines discovered? // Nat. Rev. Drug Discov. 2011. T. 10. №7. C. 507-519.

242. Takeshita K. u gp. X-ray crystal structure of voltage-gated proton channel // Nature Structural & Molecular Biology. 2014. T. 21. № 4. C. 352-357.

243. Tao X. u gp. A gating charge transfer center in voltage sensors // Science. 2010. T. 328. № 5974.

171

C. 67-73.

244. Tonelli M. u gp. Hydrogen exchange during cell-free incorporation of deuterated amino acids and an approach to its inhibition // Journal of Biomolecular NMR. 2011. T. 51. № 4. C. 467-476.

245. Trachsel C. u gp. Multicomponent venom of the spider Cupiennius salei: a bioanalytical investigation applying different strategies // FEBS Journal. 2012. T. 279. № 15. C. 2683-2694.

246. Trbovic N. u gp. Efficient strategy for the rapid backbone assignment of membrane proteins // J. Am. Chem. Soc. 2005. T. 127. № 39. C. 13504-13505.

247. Trott O., Olson A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading // J. Comput. Chem. 2010. T. 31. № 2. C. 455-461.

248. Tsujino A. u gp. Myasthenic syndrome caused by mutation of the SCN4A sodium channel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. T. 100. № 12. C. 7377-7382.

249. Turner A. u gp. Potential Threats Posed by New or Emerging Marine Biotoxins in UK Waters and Examination of Detection Methodology Used in Their Control: Brevetoxins // Marine Drugs. 2015. T. 13. №3. C. 1224-1254.

250. Undheim E. A. B. u gp. A proteomics and transcriptomics investigation of the venom from the barychelid spider Trittame loki (brush-foot trapdoor) // Toxins . 2013. T. 5. № 12. C. 2488-2503.

251. Undheim E. A. B. u gp. Weaponization of a Hormone: Convergent Recruitment of Hyperglycemic Hormone into the Venom of Arthropod Predators // Structure. 2015. T. 23. № 7. C. 1283-1292.

252. Ushkaryov Y. Alpha-latrotoxin: from structure to some functions // Toxicon. 2002. T. 40. № 1. C. 1-5.

253. Varga K. u gp. Clinical studies with captopril treatment of hypertensive patients // Acta Physiol. Hung. 1988. T. 72 Suppl. C. 67-78.

254. Veiseh M. u gp. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci // Cancer Res. 2007. T. 67. № 14. C. 6882-6888.

255. Verardi R. u gp. Isotope labeling for solution and solid-state NMR spectroscopy of membrane proteins // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. T. 992. C. 35-62.

256. Wang X. u gp. Discovery and characterization of a family of insecticidal neurotoxins with a rare vicinal disulfide bridge//Nat. Struct. Biol. 2000. T. 7. № 6. C. 505-513.

257. Watanabe E. u gp. Nav2/NaG channel is involved in control of salt-intake behavior in the CNS // J. Neurosci. 2000. T. 20. № 20. C. 7743-7751.

258. West J. W. u gp. A cluster of hydrophobic amino acid residues required for fast Na(+)-channel inactivation //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992. T. 89. № 22. C. 10910-10914.

259. Williamson M. P. Corrigendum to "Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding" [Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 73C (2013) 1-16 // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 2014. T. 80. C. 64.

260. Wisedchaisri G. u gp. Resting-State Structure and Gating Mechanism of a Voltage-Gated Sodium

172

Channel // Cell. 2019. T. 178. № 4. C. 993-1003.e12.

261. WishartD. S. u gp. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR // J. Biomol. NMR. 1995. T. 6. № 2. C. 135-140.

262. Wishart D. S., Sykes B. D. Chemical shifts as a tool for structure determination // Methods Enzymol. 1994. T. 239. C. 363-392.

263. Wong H.-K. u gp. beta Subunits of voltage-gated sodium channels are novel substrates of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme (BACE1) and gamma-secretase // J. Biol. Chem. 2005. T. 280. № 24. C. 23009-23017.

264. Wu F. u gp. Mice with an NaV1.4 sodium channel null allele have latent myasthenia, without susceptibility to periodic paralysis // Brain. 2016a. T. 139. № Pt 6. C. 1688-1699.

265. Wu J. u gp. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Á resolution // Nature. 2016b. T. 537. № 7619. C. 191-196.

266. Wu P. S. C. u gp. Amino-acid Type Identification in 15N-HSQC Spectra by Combinatorial Selective 15N-labelling//Journal of Biomolecular NMR. 2006. T. 34. № 1. C. 13-21.

267. Xiao Y. u gp. Jingzhaotoxin-III, a novel spider toxin inhibiting activation of voltage-gated sodium channel in rat cardiac myocytes // J. Biol. Chem. 2004. T. 279. № 25. C. 26220-26226.

268. Xiao Y. u gp. Tarantula huwentoxin-IV inhibits neuronal sodium channels by binding to receptor site 4 and trapping the domain ii voltage sensor in the closed configuration // J. Biol. Chem. 2008. T. 283. №40. C. 27300-27313.

269. Xiao Y., Blumenthal K., Cummins T. R. Gating-pore currents demonstrate selective and specific modulation of individual sodium channel voltage-sensors by biological toxins //Mol. Pharmacol. 2014. T. 86. №2. C. 159-167.

270. Xu H. u gp. Structural Basis of Nav1.7 Inhibition by a Gating-Modifier Spider Toxin // Cell. 2019a. T. 176. № 5. C. 1238-1239.

271. Xu L. u gp. Voltage-gated sodium channels: structures, functions, and molecular modeling // Drug Discov. Today. 2019b. T. 24. № 7. C. 1389-1397.

272. Yabuki T. u gp. Dual amino acid-selective and site-directed stable-isotope labeling of the human c-Ha-Ras protein by cell-free synthesis // J. Biomol. NMR. 1998. T. 11. № 3. C. 295-306.

273. Yan Z. u gp. Structure of the Na1.4-P1 Complex from Electric Eel // Cell. 2017. T. 170. № 3. C. 470-482.e11.

274. Yu F. H. u gp. Sodium channel beta4, a new disulfide-linked auxiliary subunit with similarity to beta2 // J. Neurosci. 2003. T. 23. № 20. C. 7577-7585.

275. Yu F. H., Catterall W. A. The VGL-chanome: a protein superfamily specialized for electrical signaling and ionic homeostasis // Sci. STKE. 2004. T. 2004. № 253. C. re15.

276. Zaharieva I. u gp. Recessive loss-of-function SCN4A mutations associated with a novel phenotype of congenital myopathy //Neuromuscular Disorders. 2015. T. 25. C. S275-S276.

277. Zhang F. u gp. Shellfish toxins targeting voltage-gated sodium channels // Mar. Drugs. 2013. T. 11. № 12. C. 4698-4723.

278. Zhang J. u gp. Simulating the ion permeation and ion selection for a eukaryotic voltage-gated sodium channel NaVPaS //Protein & Cell. 2018. T. 9. № 6. C. 580-585.

279. Zhang X. u gp. Crystal structure of an orthologue of the NaChBac voltage-gated sodium channel //Nature. 2012. T. 486. № 7401. C. 130-134.

280. Zoonens M., Popot J.-L. Amphipols for Each Season // The Journal of Membrane Biology. 2014. T. 247. № 9-10. C. 759-796.

281. Zundert G. C. P. van u gp. The HADDOCK2.2 Web Server: User-Friendly Integrative Modeling of Biomolecular Complexes // J. Mol. Biol. 2016. T. 428. № 4. C. 720-725.

282. Molecular Orbital Theory in Drug Research // Medicinal Chemistry. 1971.

Приложения

Приложение 1. Статистика расчета пространственной структуры токсина Нт-3.

Ограничения на расстояния и углы

Всего контактов NOE 263

внутри остатков 115

между остатков 148

последовательные (|Н|=1) 92

средние контакты (1<|Н|<4) 20

дальние контакты Ш-Ц>4) 36

Ограничения на водородные связи (13 связей, верхние/нижние) 26/26

Ограничения на S-S связи (3 связи, верхние/нижние) 9/9

Ограничения на торсионные углы 46

Угол ф 29

Угол х1 17

Всего ограничений/на остаток: 379/10,8

Статистика рассчитанных структур

Структур рассчитано/выбрано 200/20

Штрафная функция CYANA (А2) 1,05 ± 0,04

Нарушения ограничений

Расстояния (>0,2 А) 2

Расстояния (>0,4 А) 0

Двугранные углы (>1°) 0

Двугранные углы (>5°) 0

Общее среднеквадратичное отклонение (RMSD, А, Gly1-Val35)

Основная цепь 0,22 ± 0,07

Тяжелые атомы 0,62 ±0,14

Анализ карты Рамачандрана

Остатков в предпочтительных областях (%) 71,0%

Остатков в разрешенных областях (%) 29,0%

Остатков в запрещенных областях (%) 0,0%

Приложение 2. Электрофоретический анализ образцов ПЧД каналов №-у1.4, полученных методом бесклеточного синтеза. Дорожки: 1 - маркер молекулярных масс. Дорожки 2-5 - очистка препарата ПЧД-1 на №2+-аффинной смоле; 2 - осадок ТС, солюбилизированный в буфере А, содержащем 10% DPC; 3 - промывка колонки десятью объемами буфера А, содержащего 0,5% DPC; 4 - дополнительная промывка колонки одним объемом буфера А, содержащего 0,5% DPC; 5 - элюция буфером А, содержащим 0,5% DPC и 250 мМ имидазол. Дорожки 6-9 - очистка препаратов ПЧД-П на №2+-аффинной смоле, порядок дорожек такой же, как и для ПЧД-1. Дорожки 10-13 - инкапсуляция ПЧД-1 в бицеллы DMPC/DHPC: 10 - осадок ТС, солюбилизированный в 2% LS (20 мМ Трис-НС1; рН 7,0; 0,5 мМ ЭДТА) с добавлением 1% липида DMPC до диализа; 11 - препарат белка в липосомах DMPC после диализа; 12 - осадок препарата ПЧД-1 в DMPC после добавления DHPC до молярного соотношения DMPC/DHPC 1:4; стрелкой указаны агрегаты ПЧД. 13 - супернатант препарата ПЧД-1 в DMPC после добавления DHPC.

ПЧД-1-Мау1.4 ПЧД-И-Мау1.4 ПЧД-1-Мау1.4

116 66 45 35

<

ПЧЦ-Ыач1А

123456789 10 11 12 13

Г- -- -

\

Агрегаты

Приложение 3. Данные релаксации ядер N для ПЧД-П в мицеллах LPPG (800 МГц, 45

A A A A C G G G H I L L M P P S T T T V

L R S S Y L L L I L E Y E H R E H R Y A

A G N P S N U Y S E U S T E O R R P R L

X + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

N + — + + — + + + — + + + + + — + + + + +

C + — — + — — + + — + + — + + + + — + + +

D — — — — — + — — — + — — — — — — — — — —

Приложение 5. (А) Вольт-амперная характеристика мутантных химерных каналов ку2.1/пдч-1 в отсутствии (цветные кружки) и присутствии 1 мкМ (Д) или 10 мкМ (о) Hm-3. (Б) Процент ингибирования тока при добавлении 1 мкМ (слева) и 10 мкМ (справа) Hm-3 при -20 мВ. *P < 0,01 (дисперсионный анализ ANOVA и посттест Даннетта для множественного сравнения). Дикий тип (WT, wild-type), n = 14 при 1 мкМ и n = 4 при 10 мкМ (18 контрольных измерений). При 1 мкМ Hm-3 n = 6 для p.D211H и n = 9 для E208A. При 10 мкМ Hm-3 n = 4 для p.D211H и n = 3 для E208A.

А А А А С G G G Н I L L м Р Р S Т Т Т V

L R S S Y L L L I L Е Y Е Н R Е Н R Y А

А G N Р S N и Y S Е и S Т Е О R R Р R L

X + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

N + — + + — + + + — + + + — + — + + + + +

С + + — + — — + + — + + + + + + + — + + +

D — — — — — + — — — + — — — — — — — — — —