Стимуляция секреции инсулина имидазолиновыми соединениями и инозитолгексафосфатом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Ефанов, Александр Михайлович

• Ефанов, Александр Михайлович
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ефанов, Александр Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Механизмы секреции инсулина (3-клетками поджелудочной 10 железы

1.1. Функции островков Лангерганса поджелудочной железы и 10 секретируемые ею гормоны

1.2. Метаболизм глюкозы

1.3. Электрическая активность (3-клетки " .; > л.

1.4. Роль увеличения [Са2+]1 в механизмах секреции инсулина

1.5. Фосфорилирование белков и секреция инсулина

1.6. Механизмы экзоцитоза содержащих инсулин секреторных 23 гранул

1.7. Возможные дефекты в регуляции секреции инсулина при 25 сахарном диабете

2. Имидазолиновые рецепторы и их роль в контроле секреции 26 инсулина

2.1. Характеризация имидазолиновых ¡1- и 12-рецепторов

2.2. Имидазолиновые рецепторы в (3-клетках поджелудочной 31 железы: эффекты имидазолиновых соединений на секрецию инсулина

3. Метаболизм и биологическая активность ИнФ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выделение островков Лангерганса и приготовление препаратов 42 ß-клеток

2. Культивирование секретирующих инсулин HIT Т15 клеток

3. Перфузия изолированной поджелудочной железы крысы

4. Измерение секреции инсулина в островках Лангерганса и HIT 44 Т15 клетках

5. Электрофизиология: измерение проводимости единичных 45 ионных каналов на плазматической мембране ß-клеток поджелудочной железы

6. Измерение концентрации ионов кальция внутри клетки при 47 помощи Са2+-чувствительных флуоресцентных зондов

7. Приготовление пермеабилизованных клеток и измерение 49 секреции инсулина в них

8. Фосфорилирование белков в препаратах HIT Т15 клеток

9. Измерение активности протеинкиназ в препаратах островков 51 Лангерганса или секретирующих инсулин HIT Т15 клетках

10. Аналитические методы иследования

10.1. Радиоиммунный анализ

10.2. Электрофорез в полиакриламидном геле и авторадиография

10.3 Определение белка

10.4. Статистическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование эффектов имидазолинового соединения RX871024 55 на секрецию гормонов поджелудочной железы: инсулина, глюкагона и соматостатина in situ

2. Стимулирование секреции инсулина имидазолиновым 59 соединением RX871024 in vitro

3. Исследование роли аг-адреноцепторов и Ij~, I2- имидазолиновых 62 рецепторов в инсулинотропной активности имидазолиновых соединений в (3-клетках поджелудочной железы

4. Влияние имидазолинового соединения RX871024 на 66 внутриклеточную концентрацию ионов кальция ([Ca2+]i)

5. Изучение влияния RX871024 на мембранный потенциал и 68 активность ионных каналов в (3-клетках поджелудочной железы

6. Исследование независимого от блокировки К+-каналов 75 влияния RX871024 на экзоцитоз инсулиновых гранул

7. Выяснение роли фосфорилирования в развитии эффектов 77 имидазолинов в (3-клетках поджелудочной железы

8. Взаимодействие между классическими антидиабетическим 86 препаратом, глибенкламидом, и имидазолиновым соединением, RX871024, в стимуляции секреции инсулина

9. Сравнение эффектов имидазолина RX871024 на секрецию 99 инсулина и [Ca2+]i в островках Лангерганса из нормальных и диабетических крыс

10. Изучение влияния ИнФбИ ИнФб на экзоцитоз инсулина. 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АДФ - аденозин-5~-дифосфат АТФ - аденозин-5~-трифосфат АТФаза - аденозинтрифосфатаза АЦ - аденилатциклаза

АиСса-суммарное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+

СЬиТ-2 - белок, переносчик глюкозы

О-белок - руанозин-5'-трифосфат-связывающий белок

ЦСН - додецилсульфат натрия

ЕС50 - концентрация соединения, при которой его эффект равен половине максимального

ИнФз - инозитол 1,4,5-трифосфат

КРБ - Кребс-Рингер бикарбонатный буффер

Км - константа Михаэлиса

Кэ - константа связывания

Катф - АТФ-зависмые калиевые каналы

КСа - Са2+-активируемые калиевые каналы

К3 - задерживаемые калиевые каналы

МАО - моноаминооксидаза

МАПК - митоген-активируемая протеинкиназа

МЭР - ]\Г-этилмалеимид-чувствительная АТФаза

О А - окадаевая кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ПКА - протеинкиназа А

ПКС - протеинкиназа С

CP - рецептор сульфанилмочевины

Ca2+]i - сутоплазматическая концентрация свободных ионов Са2+

СаМК II - кальций/кальмодулин зависимая протеинкиназа

CDS - эндогенный лиганд имидазолиновых рецепторов

ТРА - форболовый эфир

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ФИФ2 - фосфодитил-4,5-дифосфат

ФЛС - фософолипаза С

ФМА - форболмиристатацетат цАДФР - циклическая аденозин-3\5'-трифосфатрибоза цАМФ - циклический аденозин-3\5~-монофосфат цГМФ - циклический гуанозин-3\5"-монофосфат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ЭГТА - этиленбис-(оксиэтиленнитрило)тетраацетат ЭР - эндоплазматический ретикул

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стимуляция секреции инсулина имидазолиновыми соединениями и инозитолгексафосфатом»

Сахарный диабет характеризуется как состояние хронической гипергликемии (высокой концентрации глюкозы в крови) и затрагивает около 3% населения всего мира (King and Rewers, 1993). Дефекты в продукции инсулина, гормона, регулирующего уровень глюкозы в крови, и пониженная чувствительность к инсулину - две главные причины состояния гиперкликемии (Efendic et al, 1984). Инсулин производится и секретируется р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Механизмы секреции инсулина достаточно сложны и регулируются глюкозой, аминокислотами, различными гормонами и нейромодуляторами. Регуляция секреции инсулина, прежде всего глюкозой и нейромодуляторами, серьезно нарушена у больных сахарным диабетом. Несмотря на интенсивные исследования, механизмы регулирующие выделение инсулина, а также причины нарушенной секреции в состоянии диабета по-прежнему остаются во-многом непонятными.

Лечение диабета остается неразрешенной проблемой и мало изменилось с того времени, как в 1920-х годах впервые были использованы инъекции инсулина, а в 40-х - сулфанилмочевины. Создание препаратов способных восстанавливать секреторные функции (3-клеток и выявление механизмов их действия являются важнейшими подходами в лечение болезни.

Глюкоза, основной физиологический регулятор секреции инсулина, стимулирует секрецию путем активации двух механизмов: повышения внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]i) (Wollheim and Sharp, 1981) и непосредственного эффекта на движение на выделение содержимого инсулин содержащих гранул (Gembal et al, 1993). Препараты типа сулфанилмочевины увеличивают секрецию инсулина, моделируя эффект глюкозы на [Ca2+]j. Препараты, действующие на другие молекулярные механизмы, в частности, транспорт инсулин содержащих гранул, и модулирующие эффекты глюкозы, могли бы быть серьезной альтернативой для сулфанилмочевины при лечении диабета. К сожалению, механизмы непосредственного регулирования экзоцитоза инсулина, в отличие от механизмов регулирования [Ca2+]i плохо изучены. Вследствие вышесказанного, целью данной работы являлось выяснение механизмов регуляции секреции инсулина соединениями, непосредственно влияющими на экзоцитоз инсулина на примере двух групп соединений: имидазолиновых соединений и гексафосфата инозитола (ИнФб).

Несколько лет назад появились сообщения, что лиганды 0С2-адреноцепторов, содержащие имидазолиновое кольцо в их структуре, такие как клонидин, идазоксан и фентоламин, взаимодействуют со специфическими рецепторами отличными от аг-рецепторов. Эти рецепторы получили название Ii- и Ь-имидазолиновых рецепторов (Michel and Insel, 1989). Был охарактеризован эндогенный лиганд для этих рецепторов (Li et al, 1994) и описаны функции лигандов для различных типов клеток. Соединения с имидазолиновой структурой влияют на ионный транспорт, кровяное давление, секрецию различных гормонов, в том числе секрецию инсулина (Regunathan and Reis, 1996). Имидазолиновые соединения оказались мощными стимуляторами секреции инсулина (Schulz and Haselblat, 1989). К сожалению, имидазолиновые рецепторы недостаточно полно изучены вследствие отсутствия селективных лигандов для них. Практически ничего неизвестно о молекулярных механизмах, ответственных за биологические функции имидазолиновых соединений.

Соединения группы фосфатов инозитола с числом фосфатных групп более 5 (пентафосфаты инозитола (ИнФб) и ИнФб) представлены в клетках в относительно больших концентрациях (порядка несколько десятков мкМ) (МеппШ е! а1, 1993а). Однако в отличие от от 1,4,5-инозитолтрифосфата (ИнФз), функция которого в выделении ионов Са2+ детально исследована (Вегпс^е, 1993), роль ИнФ5 и ИнФб в клеточных механизмах не выяснена. Было предположено, что данные соединения могут регулировать везикулярный транспорт (Эе СагшШ е! а1, 1996).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Механизмы, секреции инсулина ß-клетками поджелудочной железы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Ефанов, Александр Михайлович

выводы

1. Имидазолиновое соединение ИХ871024 стимулирует секрецию инсулина и соматостатина и ингибирует секрецию глюкагона из поджелудочной железы крысы. Наличие двух последних эффектов установлено для имидазолиновых соединений впервые.

2. 13X871024 блокирует активность калиевых каналов клеточной мембраны Р-клеток: Кдтф, Кса и К3, что приводит к деполяризации мембраны, открытию потенциал-зависимых Са2+-каналов, потоку ионов Са2+ внутрь клетки и экзоцитозу инсулин содержащих гранул.

3. 11X871024 стимулирует выделение инсулина в условиях, при которых [Са2+]1 поддерживается постоянной. Этот эффект впервые был установлен для имидазолиновых соединений. Непосредственное стимулирование экзоцитоза имидазолином наблюдается исключительно при повышенных значениях [Са2+]1 и АТФ/АДФ внутри клетки и блокируется ингибиторами протеинкиназ А и С.

4. 11X871024 вызывает фосфорилирование белков р-клеток поджелудочной железы. Соединение не влияет непосредственно на активность ПКА, ПКС и СаМК И.

5. В сравнении с классическим антидиабетическим препаратом, глибенкламидом, селективно блокирующим активность КдтФ-каналов, имидазолин 13X871024 вызывает более высокий уровень секреции инсулина. В островках Лангерганса из диабетических крыс линии ОК, обладающих малой чувствительностью к глюкозе, КХ871024 восстанавливает эту чувствительность. Установленные эффекты имидазолинового соединения 11X871024 позволяют предложить данную группу соединений для потенциального использования в качестве основы для поиска антидиабетического лекарства нового типа.

6. Эндогенные инозитолфосфаты, ИнФв и ИнФб, стимулируют С а -независимый экзоцитоз инсулина и вызывают "прайминг", т.е. увеличивают число инсулин содержащих гранул готовых для слияния с плазматической мембраной и последующего Са2+-зависимого экзоцитоза. Модуляция секреции инсулина ИнФб осуществляется путем активации ПКС. Эффекты ИнФб на секрецию инсулина позволяют предположить, что данное соединение может быть одним из новых регуляторов секреции инсулина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой работе мы ставили задачу исследования эффектов двух различных групп соединений: имидазолиновых соединений и фосфатов инозитола (ИнФб и ИнФб), в островках Лангерганса поджелудочной железы и в секретирующих инсулин ß-клетках.

Данная задача представляет очевидный интерес с точки зрения понимания фундаментальных принципов регуляции выделения инсулина в ß-клетках, а также общих для многих типов клеток механизмов экзоцитоза. Обе группы соединений объединяет то свойство, что они способны стимулировать экзоцитоз инсулина независимо от изменений в [Ca2+]j. Если механизмы увеличения [Ca2+]i и посредством этого увеличения секреции инсулина в ß-клетках были достаточно хорошо изучены, то механизмы непосредственного регулирования экзоцитоза независимо от изменения [Ca2+]i остаются во многом не исследованы.

В тоже время, данные, полученные с животными, проявляющими признаки инсулин независимого диабета, позволяют предположить, что причины отсутствия инсулинотропной активности в состоянии диабета заключаются в дефекте на стадиях регулирования глюкозой экзоцитоза, а не [Ca2+]i (Zaitsev et al, 1997). Вследствие этого, создание лекарственных препаратов, стимулирющих экзоцитоз инсулина независимо от изменений в [Ca2+]i и корректирующих дефект глюкозы в состоянии диабета, представляет практический интерес.

Соединения с имидазолиновой структурой вызывают многочисленные эффекты в различных типах клеток (Regunathan and Reis, 1996), и эти эффекты опосредуются через специфические связывающие центры. В частности, данные соединения оказались мощными стимуляторами выделения инсулина (Schulz and Haselblat, 1989).

В качестве модельного соединения, на примере которого исследовались эффекты имидазолиновых соединений, нами использовался 13X871024 (Рис. 2). Данное соединение имеет имидазолиновое кольцо в своей структуре, и его эффекты, описанные нами, находятся в хорошем соответствии с эффектами других имидазолиновых соединений, описанных различными группами. Преимуществом данного соединения являлось то, что оно не обладало заметной ссг-активностью в отличие от большинства других имидазолиновых соединений, стимулирующих секрецию инсулина.

Общепризнанным фактом является утверждение, что имидазолиновые соединения стимулируют секрецию инсулина в ß-клетках поджелудочной железы через блокировку КдтФ-каналов (Plant and Henquin, 1990). Ингибирование активности КАтФ~каналов приводит к деполяризации клеточной мембраны, увеличению [Ca2+]i и стимуляции экзоцитоза инсулин содержащих гранул. Однако, наличие других механизмов, споособных приводить к увеличению секреции инсулина, для имидазолиновых соединений не обсуждалось.

Мы показали, что имидазолин RX871024 блокирует активность Катф-каналов и вызывают деполяризацию клеточной мембраны и увеличение в [Са2+]} (Рис. 32), что находится в полном согласии с описанными в литературе эффектами других имидазолиновых производных (Chan, 1993). Неизвестно, какой белок опосредует эффект имидазолинов: канал (Kir6.1) per se или белок, ассоциированный с этим каналом, как в случае другого класса ингибиторов

КХ871024

Рис. 32. Молекулярные механизмы, ответственные за КХ871024-вызываемую стимуляцию секреции инсулина в р-клетках поджелудочной железы.

Кдтф-каналов, сулфанилмочевины (Aguilar-Bryan et al, 1995).

Кроме активности КАтФ-каналов имидазолиновое соединение RX871024 ингибировало активность потенциал-зависимых калиевых каналов (Рис. 32). Механизмом блокировки данных каналов, по-видимому, является механическая блокировка поры канала соединением, как было предположено исходя из данных по кинетике ингибирования. Хотя данные каналы в отличие от КдтФ-каналов не является определяющими в контроле электрической активности р-клетки, ингибирование этих каналов приводит к замедлению реполяризации клеточной мембраны после пиков электрической активности. Данный эффект может приводить к небольшому увеличению [Са2+]ь в условиях когда клеточная мембрана деполяризована под воздействием глюкозы. Что в свою очередь может давать составляющую в общем эффекте имидазолинов на секрецию инсулина в присутствие высокой концентрации глюкозы.

Мы исследовали возможность того, что имидазолиновые соединения могут влиять на механизмы секреции инсулина, отличные от увеличения [Ca2+]j. И действительно, на примере имидазолинового соединения RX871024 нами впервые было показано, что имидазолиновые соединения стимулируют секрецию инсулина без соответствующего увеличения [Ca2+]i (Рис. 32). Для проявления данного эффекта необходимо достаточно высокие концентрации ионов Са2+ и АТФ внутри клетки. Ионы Са2+ действуют на одном из самых последних этапов в процессе экзоцитоза инсулин содержащих гранул (Sudhof, 1995). Необходимость наличия высокой концентрации Са2+ для эффекта имидазолина, по-видимому, объясняется тем, что соединение действует на этапе, предшествующем непосредственному Са2+-вызываемому процессу высвобождения содержимого гранулы. Таким этапом может быть движение гранул к месту их высвобождения или АТФ-зависимый "прайминг" по аналогии с показанными нами эффектами ИнФб.

Необходимость присутствия высокого отношения АТФ/АДФ для прямого эффекта 14X871024 на экоцитоз инсулин содержащих гранул можно объяснить тем, что белок, опосредующий этот эффект, либо имеет АТФ-связывающий центр по аналогии с сулфанилмочевиной (Agшlar-Bryan е1 а1, 1995), либо должен быть фосфорилирован для осуществления своих функций.

Важность фосфорилирования белков в эффекте 14X871024 на экзоцитоз инсулина, не связанном с изменениями в [Са2+]ь подтверждается следующими фактами: 1) Для этого эффекта необходимо высокое отношение АТФ/АДФ. 2) Ингибиторы протеинкиназ блокируют этот эффект. 3) Имидазолин 14X871024 вызывает фосфорилирование ряда белков в (3-клетках.

Механизм фосфорилирования белков, вызываемого 14X871024 пока неизвестен. Такие важные в процессах секреции инсулина протеинкиназы, как ПКА, ПКС и СаМК II не активируются имидазолином. Однако, существует связь между белком, ответственным за увеличение фосфорилирования вызываемого имидазолином и ПКА, так как ингибиторы ПКА подавляют фосфорилирование, вызываемое имидазолиновым соединением.

Непонятно, является ли наличие нескольких различных эффектов имидазолиновых соединений следствием взаимодействия с единственным связывающим центром, или в эти процессы вовлечены несколько различных независимых белков. Однако, мы можем утверждать, что описанные в литературе к настоящему времени имидазолиновые связывающие центры 1} и ¡2 типов не играют ни малейшей роли в процессах стимуляции секреции инсулина имидазолиновыми соединениями в (3-клетках.

Сравнение эффектов имидазолина 11X871024 с эффектами классического антидиабетического препарата - глибенкламида, селективно блокирующего активность КдтФ-каналов, показало, что имидазолин обладает более мощным эффектом на секрецию инсулина, чем глибенкламид, что также подчеркивает сложность механизмов стимуляции выделения инсулина имидазолиновыми соединениями. ИХ871024 был также весьма эффективен в стимуляции секреции инсулина в островках Лангерганса из диабетических крыс линии ОК, восстанавливая чувствительность данных островков к глюкозе. Всё это делает имидазолиновые соединения весьма перспективными антидиабетическими препаратами, более эффективными чем препараты класса сульфонил мочевины, используемые в терапии инсулин независимого диабета около 50 лет.

Часть механизмов, при помощи которых имидазолиновые соединения стимулируют секрецию инсулина: повышение фосфорилирования белков и стимуляция экзоцитоза независимо от изменений в [Са2+]ь совпадают с механизмами стимуляции секреции инсулина эндогенными соединениями, относящимися к группе инозитолфосфатов: ИнФб ИнФб. Концентрации этих соединений увеличиваются при стимуляции р-клеток глюкозой (Ьагзвоп е! а1, 1997). Увеличение концентрации данных соединений приводит к активации ПКС и фосфорилированию ряда белков, в том числе белков, играющих важную роль в процессе экзоцитоза (Рис. 33). Фосфорилирование, вызываемое ИнФ6, приводит к стимуляции "прайминга" инсулин-содержащих гранул, что, в конечном итоге, приводит к увеличению числа гранул, секретирующих свое содержимое наружу клетки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ефанов, Александр Михайлович, 1998 год

1. Allan D.R., Penner S.B. and Smith D.D. Renal imidazoline preferring sites andsolute excretion in the rat. Br. J. Pharmacol. 1993, 108, 870-875

2. Ammala C., Larsson O., Berggern P.O., Bokvist K., Juntti-Berggren L., Kindmark

3. H. and Rorsman P. Inositol triphosphate-dependent periodic activation of Ca2+activated K+ conductance in glucose-stimulated pancreatic -cells. Nature, 1991, 353,849.852

4. Arkhammar P., Nilsson T., Rorsman P. and Berggern P.O. Inhibition of ATP-regulated K+-channels precedes depolarization-induced increase in cytoplasmic free Ca2+ concentration in pancreatic (3-cells. J. Biol. Chem. 1987, 262, 5448-5454

5. Arkhammar P., Nilsson T., Welsh M., Welsh N. and Berggren P.O. Effects of protein kinase C activation on the regulation of stimulus-secreting coupling in pancreatic (3-cells. Biochem. J. 1989, 264, 207-215

6. Ashcroft F.M. and Rorsman P. Electrophysiology of the pancreatic (3-cell. Prog. Biophys. Mol. Biol. 1989, 54, 87-143

7. Ashcroft F.M., Kelly R.P. and Smith P.A. Two types of Ca channel in rat pancreatic (3-cells. Pflugers Arch. 1990, 415, 504-506

8. Ashcroft S.J.H. Protein phosphorylation and (3-cell function. Diabetologia 1994, 37, S21-S29

9. Atwater I., Rosario L. and Rojas E. Properties of Ca-activated K+ channel in pancreatic (3-cells. Cell Calcium 1983, 4, 451-461

10. Bartlett G.R. Isolation and assay of red-cell inositol polyphosphates. Anal. Biochem. 1982, 124, 425-431

11. Beck K.A. and Keen J.H. Self-associstion of the plasma membrane-associated assembly protein AP-2. J. Biol. Chem. 1991, 266, 4437-4441

12. Bennett W.M., Smith D.M. and Bloom S.R. Islet amylin polypeptide: does it play a patophysiological role in the development of diabetes? Diabetic. Med. 1994, 11, 825829

13. Berdeu D., Puech R., Ribes G., Loubatieres-Mariane M.M. and Bertrand G.Antazoline increases insulin secretion and improves glucose tolerance in rats and dogs. Eur. J. Pharmacol. 1997, 324, 233-239

14. Booyajian C., Joughlin S.E. and Leslie F.M. Anatomycal evidence for the a2-adrenoceptor heterogenety: differential autoradiographic distribution of 3Hrauwolscine and 3H-idazoxan in rat brain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1987, 241, 1079-1091

15. Boesquet P., Feldman J. and Schwartz J. Central cardiovascular effects of alpha-adrenergic drugs: differences between catecholamines and imidazolines. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1984, 230, 232-236

16. Brown C.C., Chan S.L.F., Stillings M.R., Smith S.A. and Morgan N.G. Antagonism of stimulatory effects of efaroxan and glibenclamide in rat pancreatic islets by the imidazoline, RX801080. Br. J. Pharmacol. 1993, 110, 1017-1022

17. Chan S.L.F. and Morgan N.G. Stimulation of insulin secretion by efaroxan may involve interaction with potassium channels. Eur. J. Pharmacol. 1990, 176,97-101

18. Chan S.L.F. Stillings M.R. and Morgan N.G. Mechanisms involved in stimulation of insulin secretion by the hypoglycaemic alph-adrenergic antagonist, DG-5128. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991a, 176, 1545-1551

19. Chan S.L.F., Dunne M.J., Stillings M.R. and Morgan N.G. The a2-adrenoceptor antagonist modulates Katp channels in insulin secreting cells. Eur. J. Pharmacol. 1991b, 204, 41-48

20. Chan S.L.F., Brown C.A., Scarpello K.E. and Morgan N.G. The imidazoline site involved in control of insulin secretion: characteristics that distinquish it from Ir and I2-sites. Br. J. Pharmacol. 1994, 112, 1065-1070

21. Chan S.L.F., Pallett A.N., Clews J., Ramsden C.A. and Morgan N.G. Evidence that the ability of imidazoline compounds to stimulate secretion is not due to interaction with o receptors. Eur. J. Pharmacol. 323, 241-244, 1997a

22. Chan S.L.F., Atlas D., James R.F.L. and Morgan N.G. The effect of putative endogenous imidazoline receptor ligand, clonidine-displacing substance, on insulin secretion from rat and human islets of Langergans. Br. J. Pharmacol. 1997b, 120, 926-932

23. Cheryan M. Phytic acid interaction in food systems. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1980, 13, 297-335

24. Cook D.L. and Hales C.N. Intracellular ATP directly blocks K+-channels in pancreatic (3-cells. Nature 1984, 311-271-273

25. Corey D.P. and Stevens C.F. Science and technology in patch-recording electrodes. Single channel recording. Ed. Sakmann B. and Neher E. pp. 53-68, Plenum Press, New York, 1983

26. Coupry I., Podevin R.A., Dausse J.P., Parini A. Evidence for imidazoline binding sites in basolateral membrane from rabbit kidney. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 147, 1055-1060

27. De Camilli P., Emr S.D., McPherson P.S. and Novick P. Phosphoinositides as regulators of membrane traffic. Science, 1996, 271, 1533-1539

28. Efendic S., Luft R. and Wajngot A. Acpects of the pathgenesis of type 2 diabetes. Endocr. Rev. 1984, 3, 395-410

29. Ernsberger P., Giuliano R., Willette R.N. and Reis D.J. Role of imidazole receptors in vasodepressor response to Clonidine analogs in the rostal ventrolateral medulla. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990, 253, 408-418

30. Evinger M.J., Ernsberger P., Regunathan S. and Reis D.J. Regulation of PNMT gene expression by imidazoline receptors in adrenal chromaffin cells. J. Neurochem. 1995, 65, 988-997

31. Fukuda M., Aruga J., Niinobe M., Aimoto S. and Mikoshiba K. Inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate binding to C2B domain of IP4BP/synaptotagmin II. J. Biol. Chem. 1994, 269, 29206-29211

32. Ganesan S., Calle R., Zawalich K., Smallwood J.L., Zawalich W.S. and Rasmussen H. Glucose-induced translocation of protein kinase C in rat pancreatic islets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 9893-9897

33. Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Belan P.V. and Petersen O.H. Inositol trisphosphate and cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca2+ from single isolated pancreatic zymogen granules. Cell. 1996, 84, 473-480

34. Gilon P., Shepherd R.M. and Henquin J.C. Oscillations of secretion driven by oscillations of cytoplasmic Ca2+ as evidences in single pancreatic islets. J. Biol. Chem. 1993, 268, 22265-22268

35. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B. and Sigworth F.J. Improved patch clamp techniques for high resolution current recording from cell and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 1981, 391, 85-100

36. Hashimoto Y. and Soderling T.S. Calcium calmodulin dependent protein kinase II and calcium phospholipid - dependent kinase activities in rat tissues assayed with a synthetic peptide. Arch. Biochem. Biophys. 1987, 252, 418-425

37. Hay J.C. and Martin T.F.J. Resolution of regulated secretion into sequential MgATP-dependent and calcium-dependent stages mediated by distinct cytosolic proteins. J. Cell. Biol. 1992, 119, 139-151

38. Hay J.C. and Martin T.F.J. Phosphatidylinositol transfer protein required for ATP-dependent priming of Ca2+-activated secretion. Nature 1993, 366, 572-575 Hedeskov C.J. Mechanism of glucose-inducd insulin secretion Physiol. Rev. 1980, 60, 442-509

39. Hellman B. The significance of calcium for glucose stimulation of insulin release. Endocrinology. 1975, 97, 392-398

40. Henquin J.C. and Meissner H.P. Significance of ionic fluxes and changes in membrane potential for stimulus-secretion coupling in pancreatic 3-cells. Experimentia 1984, 40, 1043-1052

41. Johnston D.G. and Alberti K.M.M. Clinics in Endocrinology and Metabolism. Vol. 11(2), W.B. Saunders, 1982

42. Kashiwagi A., Harono Y., Suzuki M., Kojima H., Harada M., Nishio Y., Shigeta Y.

43. New alpha 2-adrenergic blocker (DG-5128) improves insulin secretion and in vivoglucose disposal in NIDDM patients. Diabetes 1986, 35, 1085-1089

44. Kawazu S., Suzuki M., Negishi K., Watanabe T., Ishii J. Studies of midaglizole (DG5128): a new type of oral hypoglycemic drug in healthy subject. Diabetes 1987, 36,216.220

45. King H. and Rewers M. Global estimates for prevalence of diabetes mellitus andimpaired glucose tolerance in adults. Diabetes Care 1993, 16, 157-177

46. Knight D.E. and Scrutton M.C. Gaining access to the cytosol: the techique and someapplications of eletropermeabilization. Biochem. J. 1986, 234, 497-506

47. Kohen E., Kohen C., Thorell B., Mintz D. and Rabinovich A. Intracellularcommunication in pancreatic islets monolayer cultures: a microfluorometric study.

48. C., Ullrich B., Zhang J.Z., Anderson R.G., Brose. N. and Sudhof T.C. Ca2+-dependent and -independent activities of neural and non-neural synaptotagmins. Nature, 1995, 375, 594-599

49. Martin T.F.J. Identification of proteins required for Ca2+-activated secretion. Ann. NY. Acad. Sci. 1994, 710, 328-332

50. McPherson P.S. and Campbell K.P. The ryanodine/Ca2+ release channel. J. Biol. Chem. 1993, 268, 13765-13768

51. Meely M.P., Ernsberger P.R., Granata A.R. and Reis D.J. An endogenous clonidine-displacing substance from bovine brain: receptor binding and hypotensive actions in the ventrolateral medulla. Life Sci. 1986, 38, 287-293

52. Meglasson M.D., Burch P.T., Berner D.K., Najafi H., Wogin A.P. and Matchinsky F.M. Chromotografic resolution and kinetic characterisation of glucokinase from islets of Langenhans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80, 5-9

53. Meglasson M.D., Burch P.T., Berner D.K., Najafi H. and Matchinsky F.M. Identification of glucokinase as an alloxan-sensitive sensor of pancreatic beta-cell. Diabetes 1986, 35, 1163-1173

54. Michel M.C. and Insel P.A. Are there multiple imidazoline binding sites? Trends Pharmacol. Sci. 1989, 342-344

55. Newgard C. Regulatory role of glucose transport and phosphorylation in pancreatic islet (3-cells. Diabetes Reviews 1996, 4, 191-206

56. Norris F.A., Ungewickell E. and Majerus P.W. Inositol hexakisphosphate binds to clathrin assembly protein 3 (AP-3/AP180) and inhibits clathrin cage assembly in vitro. J. Biol. Chem. 1995, 270, 214-217

57. Olmos G., Kulkarni R.N., Hague M. and MacDermot J. Imidazolines stimulate release of insulin from RIN-5AH cells independently from imidazoline Ir and h-receptors. Eur. J. Pharmacol. 1994, 262, 41-48

58. Olmos G., Ribera J. and Garcia-Sevilla J. A. Imidazoli(di)ne compounds interact with phencyclidine site of NMDA receptors in the rat brain. Eur. J. Parmacol. 1996,310, 273-275

59. Ozanne S.E., Guest P.C., Hutton J.C. and Hales C.N. Intracellular localization and molecular heterogenety of the sulphonylurea receptor in insulin-secreting cells. Diabetologia 1995, 38, 277-282

60. Parini A., Moudanos G., Pizzinat N. and Lanier S. The elusive family of imidazoline binding sites. Trends Pharmacol. Sci. 1996, 17, 13-16

61. Persaud S.J., Jones P.M. and Howell S.L. Glucose-stimulated insulin secretion is not dependent on activation of protein kinase A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 173, 833-839

62. Persaud S.J., Jones P.M., Wheeler-Jones C.P.D. and Howell S.L. Tyrosine kinasesand the regulation of insulin secretion. Diabetologia 1993, 36, All

63. Plant T.D. Properties of calcium-dependent inactivation of calcium channels incultured mouse pancreatic B-cells. J. Physiol. 1988, 404, 731-747

64. Plant T.D. and Henquin J.C. Phentolanmine and yohimbine inhibit ATP-sensitive

65. K+-channels in mouse pancreatic (3-cells. Br. J. Pharmacol. 1990, 101, 115-120

66. Regunathan S. and Reis D.J. Imidazoline receptors and their endogenous ligands. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996, 36, 511-544

67. Reis D.J. and Regunathan S. Endogenous ligands for imidazoline receptors: classic and immunoreactive clonidine-displacing substance. Ann. New York Acad. Sci. 1995, 763, 511-544

68. Remaury A. and Paris H. The insulin secreting line, RINm5F, expresses an alpha-2D adrenoceptor and nonadrenergic idazoxan binding sites. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992, 260, 417-426

69. Roe M.W., Lancaster M.E., Mertz R.J., Worley J.F. Ill and Dukes I.D. Voltage-dependent intracellular calcium release from mouse islets stimulated by glucose. J. Biol. Chem. 1993, 268, 9953-9956

70. Rorsman P. and Trube G. Glucose-dependent K+-channels in pancreatic (3-cells areregulated by intracellular ATP. Pflugers Arch. 1985, 405, 305-309

71. Rorsman P. and Trube G. Calcium and delayed potassium channels in pancreatic 3cells under voltage-clamped conditions. J. Physiol. 1986, 374, 531-550

72. Rorsman P., Ashcroft F.M. and Trube G. Single calcium channel currents in mousepancreatic (3-cells. Pflugers Arch. 1988, 412, 597-603

73. Sasakawa N., Nakaki T., Kakinuma E and Kato R. Increase in inositol tris-, pentakis- and hexakisphosphates by high K+ stimulation in cultured cerebellar granule cells. Brain Res. 1993, 623, 155-160

74. Sastre M. and Garsia-Sevilla J.A. Opposite age-dependent changes of alpha 2-adrenoceptors and nonadrenoceptor 3H-idazoxan binding sites (^-imidazoline sites) in human brain: strong correlation of h with monoaminoxidase. J. Neurochem. 1993, 61, 881-889

75. Schulz A. and Haselblat A. An insulin releasing property of imidazoline derivatives is not limited to compounds that block alpha-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1989, 340, 321-327

76. Smith P.A., Sakura H., Coles B., Gummerson N. Proks P. and Aschroft F.M. Electrogenic arginine transport mediate stimulus-secreting coupling in mouse pancreatic (3-cells. J. Physiol. 1997, 499, 625-635

77. Sugden M.C., Ashcroft S.J.H. and Sugden P.H. Protein kinase activities in rat pancreatic islets of Langerhans. Biochem J. 1979, 180, 219-229

78. Sugden M.C., Christie M.R. and Ashcroft S.J.H. Presence and possible role of calcium-dependent regulatorn (calmodulin) in rat islets of Langenhans. FEBS Lett. 1979, 105,95-100

79. Sutton R., Peters M., McShane P., Gray D.W.R. and Morris P.J. 1986 Isolation of ratpancreatic islets by ductal injection of collagenase. Transplantation, 42, 689-691.

80. Synetos D., Mynolopoulos V.G., Atlas D., and Pipili-Synetos E. Human plasmaderived material with with clonidine-displacing substance-like properties contractsthe isolated rat aorta. J. Autonom. Pharmacol. 1991, 11, 343-351

81. Tal M., Wu Y.J., Leister M., Sukana M., Lodish H.F., Fleischer N. and Efrat S.

82. Vall2.HRAS downregulates GLUT-2 in (3-cells of transgenic mice without affectingglucose homeostatis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5744-5748

83. Tesson F., Limon-Boulez I., Urban P., Puype M., Vandekerckhove J., Coupry I.,

84. Pompon D. and Parini A. Localization of ^-imidazoline binding sites on monoamineoxidases. J. Biol. Chem. 1995, 270, 9856-9861

85. Thams P., Capita K. Hedeskov C.J. and Koford H. Phorbol ester-induced down-regulation of protein kinase C in mouse pancreatic islets. Potentiation of phase 1 and inhibition og phase 2 of gluocse-induced insulin secretion. Biochem. J. 1990, 265, 777-787

86. Thorens B., Wu Y.J., Leahy J.L. and Weir G.C. The loss of GLUT2 expression by glucose-unresponsive ß-cells of db/db mice is reversible and is induced by the diabetic enviroment. J. Clin. Invest. 1992, 90, 77-85

87. Tibirica E., Feldman J., Mermet C., Gonon F. and Bousquet P. An imidazoline-specific mechanism for the hypotensive effect of Clonidine: a study with yohimbine and idazoxan. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991, 256, 606-613

88. Wenham R.M., Landt M., Walters S.M., Hidaka H. and Easom R.A. Inhibition of insulin secretion by KN-62, a specific inhibitor of the multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, 189, 128-131

89. Wollheim C.B. and Sharp G.W. Regulation of insulin release by calcium. Physiol. Rev. 1981, 61, 1185-1248

90. Yalow R.S. The limitations of radioimmunoassay. Trends Analyt. Chem. 1982, 1,128.131

91. Zaitsev S., Efanova I., Ostenson C.G., Efendic S. and Berggren PO. Delayed Ca2+ response to glucose in diabetic GK rat. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 239,129.133