Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Балобанов, Виталий Александрович

• Балобанов, Виталий Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Балобанов, Виталий Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Модели и подходы, используемые при изучении процесса сворачивания белков.

Сворачивание белков в растворе.

Конформационные переходы белка вблизи поверхности мембраны.

1.2 Конформационные состояния белков.

Нативное состояние.

Развёрнутое состояние.

Переходное состояние.

Промежуточные состояния.

1.3 Характеристика объекта исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Методы, применяемые в работе.

Биохимические методы.

Экспрессия генов.

Выделение и очистка белков.

Физические методы исследования.

Абсорбционная спектроскопия.

Флуоресцентная спектроскопия.

Круговой дихроизм (КД).

2.2 Материалы, применяемые в работе.

2.3 Приборы, параметры и условия измерений.

2.4 Экспериментальные процедуры.

Равновесное разворачивание апомиоглобина и его мутантных форм мочевиной.

Равновесное разворачивание апомиоглобина понижением рН.

Равновесная тепловая денатурация апомиоглобина.

Равновесное исследование взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидными везикулами.

Кинетическое исследование взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидными везикулами.

2. 5 Расчет термодинамических параметров.

Расчет термодинамических параметров из равновесного эксперимента.

Зависимость стабильности белка от температуры и концентрации денатуранта.

Расчёт параметра Ф для промежуточного состояния.

Вычисление видимых констант скоростей процесса взаимодействия апомиоглобина и его мутантных форм с фосфолипидными везикулами.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Экспрессия генов мутантных форм апомиоглобина.

Выделение и очистка белков.

3.2 Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина.

3.3 Исследование влияния точечных мутаций на стабильность нативного и промежуточного состояний при равновесном разворачивании мочевиной.

3.4 Исследование влияния фосфолипидной мембраны на стабильность апомиоглобина кашалота.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм»

Согласно современным представлениям для большинства белков характерно сворачивание не по принципу «все-или-ничего», при котором накапливаются лишь нативное (N) и развёрнутое (U) состояния, а сворачивание через образование промежуточных (I) состояний, которые проявляются в тех или иных условиях. В присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) белки чаще всего представляют собой практически полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи. Более мягкие денатурирующие условия (низкие рН или высокие концентрации некоторых солей) приводят только к частично денатурированным конформационным состояниям белковой молекулы [Ptitsyn, 1995; Bychkova and Ptitsyn 1993]. Физико-химические свойства таких состояний являются промежуточными между свойствами нативных и полностью развернутых белков. Образование таких промежуточных состояний является важным этапом на пути сворачивания белков. Кроме того, с образования таких состояний может начинаться агрегация белка и/или образование им амилоидных структур [Booth et al., 1997; Sharma et al 2010 ]. Можно сказать, что промежуточные состояния являются критическими в сети конформационных состояний белка, и поэтому их всестороннее изучение особенно важно.

Апомиоглобин кашалота является белком, для которого такое состояние наблюдается [Eliezer et al., 1998; Barrick and Baldwin, 1993]. Свойства этого белка достаточно хорошо изучены [Harrison and Blout, 1965; Griko and Privalov, 1994; Eliezer and Wright, 1996; Garcia et al., 2000; Cavagnero et al., 2001; Bertagna and Barrick, 2004]. На пути его сворачивания выделяют нативное, развёрнутое и стабильное промежуточное состояния. Накопление низкотемпературного промежуточного состояния апомиоглобина было показано при разворачивании белка мочевиной или понижением рН. Имеются также косвенные данные, что при температурной денатурации белка тоже накапливается некое промежуточное состояние [Griko et al., 1988; Griko and Privalov, 1994]. По данным литературы эти состояния обладают несколько различными свойствами. Однако до сих пор не решен вопрос: насколько сильны различия между формами промежуточного состояния, накапливающимися при различных способах денатурации, и являются ли эти формы вариантами одного и того же термодинамического состояния или нет? Для ответа на этот вопрос необходимо определить область условий, где промежуточное состояние стабильно, и проследить изменение его свойств в переходе от одной формы к другой. Другими словами, необходимо построить диаграмму термодинамических состояний апомиоглобина и выяснить, является ли область промежуточного состояния непрерывной. Построение такой фазовой диаграммы целесообразно в координатах «рН - концентрация мочевины -температура», так как изменение этих условий по отдельности наиболее значимо и часто используется для исследования сворачивания белков. Для апомиоглобина такой диаграммы до настоящего времени построено не было.

В литературе опубликовано много работ [Hughson et al., 1991; Barrick and Baldwin, 1993; Jennings and Wright, 1993; Eliezer et al., 1998; Jamin and Baldwin, 1998], посвященных исследованию структуры промежуточного состояния апомиоглобина. Однако вопрос о том, насколько сильны взаимодействия, удерживающие это состояние, до сих пор остаётся открытым. Для решения этого вопроса во второй части работы проведено исследование вклада ряда аминокислотных остатков в стабильность промежуточного и нативного состояний. Для этого, основываясь на равновесной денатурации мочевиной 12-ти мутантных форм апомиоглобина, были вычислены значения Ф-параметра для промежуточного состояния, характеризующего вклад боковых групп в стабильность этого состояния. Проведённый анализ показал относительную слабость взаимодействий боковых групп в промежуточном состоянии. Ранее такой анализ был проведён только для нестабильного переходного состояния на вершине энергетического барьера в переходе N-I, определяющего скорость сворачивания белка [Baryshnikova et al., 2005; Барышникова, 2005].

Переход белка в промежуточное состояние может вызывать и такой неклассический денатурирующий агент как фосфолипидная мембрана. Ранее в нашей лаборатории было показано [Басова и др., 2004], что свойства таких состояний сходны со свойствами промежуточного состояния, наблюдаемого при денатурации мочевиной или понижением рН. Кроме того, в литературе описана возможность инициации роста амилоидных структур на поверхности мембран []. Поэтому исследование взаимодействия глобулярного немембранного белка с фосфолипидной мембраной может помочь в понимании как процесса его сворачивания, так и процесса его амилоидной агрегации. Изучение влияния мембран на белки важно и с точки зрения медицины как важный компонент пищеварения и доставки лекарств в клетки [Уголев, 1967; Strollet al., 2000; Lennernas, 2007; Wawrezinieck et al., 2008]. В соответствии с этим исследование деталей процесса взаимодействия глобулярного водорастворимого белка с мембраной представляется достаточно интересным и необходимым. Согласно результатам, полученным нами в ходе этой работы, фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние белка, то есть может выступать как денатурирующий агент для его нативного состояния и как структурирующий для его развёрнутой формы. Взаимодействие апомиоглобина с мембраной происходит как минимум в две стадии, и скорость первой из них падает с увеличением стабильности нативной формы белка.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Балобанов, Виталий Александрович

выводы.

1. Впервые построена трехмерная фазовая диаграмма апомиоглобина в координатах «рН — температура - концентрация мочевины». Показано, что не наблюдается фазовых переходов между различными формами промежуточного состояния апомиоглобина и, следовательно, все эти формы принадлежат одному и тому же фазовому состоянию.

2. Показано, что взаимодействия боковых групп аминокислотных остатков в исследованных позициях в промежуточном состоянии не превышают 30% от взаимодействий в нативном состоянии. Однако измеренный вклад боковых цепей остатков А-, G- и Н-спиралей в стабильность промежуточного состояния выше, чем изученных остатков других спиралей, что подтверждает важность А-, G- и Н- спиралей в стабилизации промежуточного состояния.

3. Выяснено, что фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние белка, то есть выступает как денатурирующий агент для его нативного состояния и как структурирующий для его развёрнутой формы. Скорость взаимодействия с мембраной падает с ростом стабильности нативной формы белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Балобанов, Виталий Александрович, 2010 год

1. S Baryshnikova E.N., Melnik B.S., Finkelstein A.V., Semisotnov G.V., and Bychkova V.E. (2005) Three-state protein folding: experimental determination of free-energy profile. // Protein Sci., Vol. 14, P. 2658-2667

2. S Basova L.V., Tiktopulo E.I., Kutyshenko V.P., A. Grant Mauk A.G., Bychkova V.E. (2008) Phospholipid membranes affect tertiary structure of the soluble cytochrome b5 heme binding domain. // Biochim. Biophys. Acta., Vol. 1778, P. 1015-1026

3. S Baum J., Dobson C.M., Evans P.A., Hanly C. (1989) Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig a lactalbumin. // Biochemistry, Vol. 28, P. 7 - 13

4. S Bowen M., Brunger A.T. (2006) Conformation of the synaptobrevin transmembrane domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 103, P. 83788383

5. S Bryson E.A, Rankin S.E., Carey M., Watts A., Pinheiro T.J.T. (1999) Folding of apocytochrome с in lipid micelles: formation of alpha-helix precedes membrane insertion. // Biochemistry, Vol. 38, P. 9758-9767

6. S Cavagnero S., Dyson H.J., and Wright P.E. (1999) Effect of H helix destabilizing mutations on the kinetic and equilibrium folding of apomyoglobin. // J. Mol. Biol., Vol. 285, P. 269-282

7. S Cocco M.J., and Lecomte J.T. (1996) The native state of apomyoglobin described by proton NMR spectroscopy: the A-B-G-H interface of wild-type sperm whale apomyoglobin. // Proteins, Vol. 25(3), P. 267-285

8. S Davidson W.S., Jonas A., Clayton D.F., George J.M. (1998) Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes. // J. Biol. Chem., Vol. 273, P. 9443-9449.

9. S Day P.J., Pinheiro T.J.T., Roberts L.M., Lord J.M. (2002) Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipids vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry, Vol. 41, P. 28362843

10. S De Jongh H.H.J., Killian J.A., de Kruijff B. 1992. A water-lipid interface induces a highly dynamic folded state in apo-cytochrome с and cytochrome c, which may represent a common folding intermediate. // Biochemistry, Vol. 31, P. 1636-1643

11. S Dill K.A. and Chan H.S. (1997) From Levinthal to pathways to funnels. // Nature Struct. Biol., Vol. 4, P. 10-19

12. Dobson C.M. and Karplus M. (1999) The fundamentals of protein folding: bringing together theory and experiment. // Curr. Opin. Struct. Biol., Vol. 9, P. 92-101

13. S Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu. and Ptitsyn O.B. (1981) a-lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? // FEBS Lett., Vol. 136, P. 311 -315

14. S Dolgikh D.A., Kolomiets A.P., Bolotina I.A. and Ptitsyn O.B. (1984) "Molten-globule" state accumulates in carbonic anhydrase folding. // FEBS Lett, Vol. 165, P. 88-92

15. S Dyson HJ. and Wright P.E. (2005) Intrinsically unstructured proteins and their functions // Nature reviews, Vol. 6, P. 197-208

16. Eftink MR (1994) The use fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. // Biophys J., Vol. 66, P. 482-501

17. Eisenberg M., Gesalfi Т., Riccio Т., McLaughlin S. (1979) Absorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids Biochemistry, Vol. 18, P. 5213-5223

18. Eliezer D, Yao J, Dyson H.J., Wright P.E. (1998) Structural and dynamic characterization of partially folded states of myoglobin and implications for protein folding. //Nature Struct. Biol., Vol. 5 P. 148-155

19. S Eliezer D. and Wright P.E. (1996) Is apomyoglobin a molten globule? Structural characterization by NMR. // J. Mol. Biol., Vol. 263, P. 531 538

20. S Endo Т., Eilers M., Schatz G. (1989). Binding of a tightly folded artificial mitochondrial precursor protein to the mitochondrial outer-membraneinvolves a lipid-mediated conformational change. // J. Biol. Chem., Vol. 264, P.2951-2956

21. S Fersht A.R. (1995) Optimization of rates of protein folding: the nucleation-condensation mechanism and its implications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, P. 10869-10873

22. Fersht A.R. (1997) Nucleation mechanisms in protein folding. // Curr. Opin. Struct. Biol., Vol. 7, P. 3-9

23. S Fersht A.R. and Daggett V. (2002) Protein folding and unfolding at atomic resolution. // Cell, Vol. 108, P. 573-582

24. S Fersht A.R., Matouschek A., and Serrano L. (1992) The folding of an enzyme. I. Theory of protein engineering analysis of stability and pathway of protein folding. // J. Mol. Biol., Vol. 224, P. 771-782

25. S Garcia C., Nishimura C., Cavagnero S., Dyson H.J. and Wright P.E. (2000) Changes in the apomyoglobin pathway caused by mutation in the distal histidine residue. // Biochemistry, Vol. 39, P. 11227-11237

26. S Goto Y, Fink AL (1990) Phase diagram for acidic conformational states of apomyoglobin. J. Mol. Biol., Vol. 20, P. 803-805

27. S Grantcharova V.P., Riddle D.S., Santiago J.V., Baker D. (1998) Important role of hydrogen bonds in the structurally polarized transition state for folding of the src SH3 domain. //Nature Struct. Biol., Vol. 5, P. 714-720

28. Griko Y.V. and Privalov P.L. (1994) Thermodynamic puzzle of apomyoglobin unfolding. // J. Mol. Biol., Vol. 235, P. 1318 1325

29. S Griko Y.V., Privalov P.L., Veniaminov V.P. and Kutyshenko V.P. (1988) Thermodynamic study of the apomyoglobin structure. // J. Mol. Biol., Vol. 202, P. 127-138

30. Harrison S.C., Blout E.R. (1965) Reversible conformational changes of myoglobin and apomyoglobin. // J. Biol. Chem., Vol. 240, P. 299-303

31. S Jackson S.E., Fersht A.R. (1991) Folding of chymotrypsin inhibitor 2. Evidence for a two-state transition. // Biochemistry, Vol. 30, P. 10428 -10435

32. S Jaenicke L.A (1974) Rapid micromethod for the determination of nitrogen and phosphate in biological material. // Anal. Biochem., Vol. 61, P. 623-627

33. S Jamin, M. and Baldwin, R.L. (1998) Two forms of the pH 4 folding intermediate of apomyoglobin. // J. Mol. Biol., Vol. 292, P. 731-740

34. S Jennings P.A. and Wright P.E. (1993) Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. // Science., Vol. 262, P. 292

35. S Jennings P. A., Stone M.J., Wright P.E. (1995) Overexpression of myoglobin and assignment of the amid, Ca and CP resonances.// J. Biomol. NMR, Vol. 6, P. 271-276

36. S Kamagata K., Kuwajima K. (2006) Surprisingly high correlation between early and late stages in non-two-state protein folding. // J. Mol. Biol., Vol. 357(5), P. 1647-1654

37. S Kamatari Y.O., Ohji S., Konno Т., Seki Y., Soda K., Kataoka M., Akasaka K. (1999) The compact and expanded denatured conformations of apomyoglobin in the methanol-water solvent. // Protein Sci., Vol. 8, P. 873882

38. S Kay M.S. and Baldwin R.L. (1996) Packing interactions in apomyoglobin folding intermediate. //Nature Struct. Biol., Vol. 3, P. 439-445

39. S Kolb V.A. Makeev E.V. and Spirin A.S. (1994) Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. // EMBO J., Vol. 13, P. 3631-3637

40. Lennernas H. (2007) Modelling gastrointestinal drug absorption requires more in vivo biopharmaceutical data: experience from in vivo dissolution and permeability studies in humans. // Curr. Drug Metab., Vol. 8, P. 645-657

41. S Martinez J.C., Serrano L. (1999) The folding transition state between SH3 domains is conformationally restricted and evolutionarily conserved. // Nature Struct. Biol., Vol. 6, P. 1010-1016

42. S Massey S., Banerjee Т., Pande A.H., Taylor M., Tatulian S.A., Teter K. (2009) Stabilization of the tertiary structure of the Cholera toxin Al subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. // J. Mol. Biol., Vol. 393, P. 1083-1096

43. S Matouschek A., Kellis J.T., Jr., Serrano L., and Fersht A.R. (1989) Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering. // Nature, Vol. 340, P. 122-126

44. S Merrill A.R., Cohen F.S., Cramer W.A. (1990) On the nature of the structural change of the colicin-El channel peptide necessary for its translocation competent state. // Biochemistry, Vol. 29, P. 5829-5836

45. S Nishimura C., Dyson H.J., and Wright P.E. (2002) The apomyoglobin folding pathway revisited: structural heterogeneity in the kinetic burst phase intermediate. // J. Mol. Biol., Vol. 322, P. 483-489

46. S Oxender D.L., Fox C.F. (1987) Protein engineering (Tutorials in molecular and cell biology). // Alan R. Liss, inc., New York

47. S Pace C.N. (1986) Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. // Methods Enzymol., Vol. 131, P. 266280

48. S Parker M.J. and Marqusee S. (1999) The cooperativity of burst phase reactions explored. // J. Mol. Biol., Vol. 293, P. 1195-1210

49. S Parker M.W., Tucker A.D., Tsernoglou D., Pattus F. (1990) Insights into membrane insertion based on studies of colicins. // Trends Biochem. Sci., Vol. 15, P. 126-129

50. S Patel J., Behrens-Kneip S., Hoist O., Kleinschmidt J.H. (2009) The periplasmic chaperone Skp facilitates targeting, insertion, and folding of OmpA into lipid membranes with negative membrane surface potential. // Biochemistry, Vol. 48, P. 10235-10245

51. S Ptitsyn O.B. (1995) Molten globule and protein folding. // Adv. Protein Chem., Vol. 47, P. 83-229

52. Rankin S.E., Watts A., Roder H., Pinheiro T.J.T. (1999) Folding of apocytochrome С induced by interaction with negatively charged lipid micelles proceeds via collapsed intermediate state. // Protein Sci., Vol. 8, P. 381-393

53. S Roder H., and Colon W. (1997) Kinetic role of early intermediate in protein folding // Curr. Opin. Struct. Biol., Vol. 7, P. 15 28

54. S Samatova E.N., Katina N.S., Balobanov V.A., Melnik B.S., Dolgikh D.A., Bychkova V.E., Finkelstein A.V. (2009) How strong are side chain interactions in the folding intermediate? // Protein Sci., Vol. 18(10), P. 21522159

55. S Sanger F, Tuppy H. (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. I. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. // Biochem. J., Vol. 49(4), P. 463-481

56. S Santoro M.M. and Bolen D.W. (1998) Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method. // Biochemistry, Vol. 27, P. 8063-8068

57. S Sosnick T.R., Shtilerman M.D., Mayne L., Englander S.W. (1997) Ultrafast signals in protein folding and the polypeptide contracted state. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, P. 8545-8550

58. S Steensma E. and van Mierlo C.P.M. (1998) Structural characterization of apoflavodoxin shows that the location of the stable nucleus differs among proteins with a flavodoxin-like topology. // J. Mol. Biol., Vol. 282, P. 653666

59. S Stroll B.R., Leipold H.R., Milstein S., Edwards D.A. (2000) A mechanistic analysis of carrier-mediated oral delivery of protein therapeutics. // J. Control. Release., Vol. 64, P. 217-228.

60. У Tanford C. (1968) Protein denaturation. // Adv. Protein Chem., Vol. 23, P. 121

61. S Ternstrom Т., Mayor U., Akke M. and Oliveberg M. (1999) From snapshot to movie: ф analysis of protein folding transition states taken one step further. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, P. 14854-14859

62. S Tsong T.Y., Baldwin R.L. and McPhie P. (1972) A sequential model of nucleation dependent protein folding kinetic studies of ribonuclease A. // J. Mol. Biol., Vol. 63, P. 453-469

63. S Tsui V., Garcia C., Cavagnero S., Siuzdak G., Dyson H. J., and Wright P. E. (1999) Quench-flow experiments combined with mass spectrometry show apomyoglobin folds through an obligatory intermediate. // Protein Sci., Vol. 8, P. 45-49

64. S Uversky V.N., Ptitsyn O.B. (1996) Further evidence on the equilibrium "pre-molten-globule state": four-state guanidinium chloride induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. // J. Mol. Biol., Vol. 255, P. 215-228

65. S van der Goot F.G., Gonzales-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. (1991) A molten-globule membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin-A. //Nature, Vol. 354, P. 408^110

66. S van der Goot F.G., Lakey J.H., Pattus F. (1992) The molten globule intermediate for protein insertion or translocation through membranes. // Trends Cell Biol., Vol. 2, P. 343-348

67. S Vecsey-Semjen В., Moellby R., Van der Goot F.G. (1996) Partial C-terminal unfolding is required for channel formation by Staphylococcal a-toxin. // J. Biol. Chem., Vol. 271, P. 8655-8660

68. S Viguera A.R., Serrano L. and Wilmanns M. (1996) Different folding transition states may result in the same native structure. // Nature Struct. Biol., Vol. 3, P. 874-880

69. S Villegas V., Martinez J.C., Aviles F.X., and Serrano L. (1998) Structure of the transition state in the folding process of human procarboxypeptidase A2activation domain. // J. Mol. Biol., Vol. 83, P. 1027-1036i

70. У Wawrezinieck A., Pean J.M., Wuethrich P., Benoit J.P. (2008) Oral bioavailability and drug/carrier particulate systems. // Med. Sci. (Paris), Vol. 24, P. 659-664

71. У Yao J., Chung J., Eliezer D., Wright P.E., Dyson H.J. (2001) NMR structural and dynamic characterization of the acid-unfolded state of apomyoglobin provides insights into the early events in protein folding. // Biochemistry, Vol. 27, P. 3561-3571

72. S Zhao J.M., London E. (1988) Conformation and model membrane interactions of Diphtheria toxin fragment A. // J. Biol. Chem., Vol. 263, P. 15369-15377

73. S Барышникова Е.Н. (2005) Исследование ядра сворачивания апомиоглобина. диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук // Пущино ИБ РАН

74. S Птицын О.Б. (1973) Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. // Докл. Акад. Наук СССР, Т. 210, С. 1213 1215

75. S Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. (2002) Физика белка: курс лекций. // М.: Книжный дом «Университет»469.477