Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Спиряхина, Татьяна Владиславовна

• Спиряхина, Татьяна Владиславовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Спиряхина, Татьяна Владиславовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Биология возбудителя.

1.2 .Распространенность возбудителя.

1.3. Факторы патогенности Y enterocolitica и их генетические детерминанты.

1.3.1. Факторы патогенности, кодируемые плазмидой вирулентности.

1.3.2. Факторы патогенности, кодируемые хромосомными генами.

1.3.3. Факторы токсигенности Y. enterocolitica.

1.3.4. Экзоферменты Y. enterocolitica как факторы патогенности.

1.4. Дифференциация патогенных и непатогенных иерсиний.:.

• 1.4.1. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации патогенных Y. enterocolitica.

1.4.2. Возможности плазмидного скрининга.

1.4.3. Применение метода ДНК-зондирования.

Экспериментальная часть.

Глава 2. Материал и методы.

2.1. Штаммы.

2.2. Питательные среды и сыворотки.

2.3. Определение биохимических свойств.,.

2.4. Определение маркеров вирулентности.

2.5.Плазмидный скрининг.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

Глава 3. Изучение биохимических свойств и определение биоваров Yersinia enterocolitica, изолированных от сельскохозяйственных животных.

Глава 4. Исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных генетическими методами.

4.1. Плазмидный скрининг.

4.2. Полимеразная цепная реакция.

4.3. Результаты ПЦР - анализа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения»

Актуальность темы

Работа посвящена изучению возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйствненных животных. Иерсиниоз — инфекционная болезнь человека и животных, вызываемая Y.enterocolitica, передающаяся алиментарным путем и характеризующаяся интоксикацией, преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта; при генерализованных формах — полиорганным поражением и склонностью к обострениям, рецидивам и хронизации процесса.

Иерсиниоз в соответствии с Международной статистической классификацией болезней (1995) регистрируется под символами: А046 — энтерит, вызванный Y.enterocolitica, или А28.2 — экстраинтестинальный иерсиниоз.

Заболевание широко распространено во многих странах мира. Наиболее часто эта инфекция встречается в странах Западной и Северной Европы, а также Америки: Великобритании, США, Канаде, Японии, России. В настоящее время наблюдается изменение структуры возбудителей ОКИ бактериальной природы, на первый план в некоторых странах (ФРГ, Дания, Финляндия) выдвигаются Campylobacter и Yersinia (Померанцев, Васильев, 1998; Куликовский, 1984).

В России первый случай кишечного иерсиниоза человека был зарегистрирован в 1968 году (Белова, Ющенко, 1968), официальный учет этой инфекции введен Минздравом в 1987 году. В настоящее время заболеваемость в некоторых регионах (Сибирь, Дальний Восток, Северо-Запад) составляет 3-5 случаев на 100 тыс. населения. Тридцатилетний период интенсивного изучения иерсиний позволил детально охарактеризовать свойства возбудителей кишечного иерсиниоза человека.

Y.enterocolitica - вид, представляющий собой разнородную группу микроорганизмов. По биохимическим свойствам различают 5 биовариантов первый биовар разделен на 1А и 1В), по антигенной структуре выделяют более 70 серовариантов. Далеко не все представители вида являются патогенными (Wauters et al., 1991). Эти микроорганизмы широко распространены в природе и часто выделяются из объектов внешней среды. Поэтому остается актуальным вопрос о подтверждении патогенности выделенной культуры." Помимо определения серогруппы и биоварианта рекомендуется исследовать факторы патогенности. Литературные данные свидетельствуют о полидетерминантной природе различных структур микроорганизма, обеспечивающих реализацию инфекционного процесса. Факторы патогенности Y.enterocolitica достаточно хорошо изучены, определены их генетические детерминанты. Описаны хромосомные гены и их продукты, участвующие в развитии инфекционного процесса. По современным данным литературы проявление патогенных свойств связано с присутствием в клетках Y.enterocolitica плазмиды pYV молекулярной массой 45-47 мДа и экспрессией кодируемых ею белков (Gemsky, Lazere, Casey, 1980; Portnoy, Moseley, Falkow, 1981; Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002; Смирнов, 2004). В Методических рекомендациях Министерства Здравоохранения РФ по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) для идентификации вирулентных иерсиний предлагается использовать фенотипические методы -определять маркеры вирулентности, агглютинационные тесты - постановку реакции агглютинации с сывороткой к вирулентным иерсиниям, а также молекулярно-генетические методы - полимеразную цепную реакцию. Имеются сообщения о возможности применения метода генетического зондирования (Кутырев и др., 1989, Попов и др., 1991).

По современным воззрениям, источником инфекции при кишечном иерсиниозе являются больные сельскохозяйственные, домашние, дикие животные и грызуны, а факторами передачи - продукты животноводства и корма. Поэтому роль Y.enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных и свойства возбудителя требуют всестороннего изучения.

Регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных в РФ введена с 1996 году (Иерсиниозы, СП, ВП, 1996). Эпизоотологические исследования свидетельствуют о возрастающей роли Y enterocolitica в желудочно-кишечной патологии сельскохозяйственных животных. Иерсиниоз основных видов животных описан в различных регионах РФ: Дальневосточном регионе, Нижегородской, Ульяновской, Вологодской, Ленинградской и других областях (Кирьянов, Савчук, 1987; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002; Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003). Из сельскохозяйственных животных наиболее важную роль играют свиньи и КРС, меньшую - МРС, лошади. Описаны случаи кишечного иерсиниоза среди собак, кошек и других домашних животных (Platt-Samoraj, Szweda, Siwicki, 2000; Vokoun, 1985; Hayashidani et al., 1995; Корчагин, Васильев, 2002). Имеются наблюдения о заражении от диких животных (кабанов) (Shayegani, Stone, DeForge, 1986; Nattermann, Dedek, Loepelmann, 1986), a также от грызунов, которые часто инфицируют своими экскрементами корма и пищевые продукты (Калошина, Ющенко, Шестопалов, 1989; Singh, Sharma, Singh, 1994; Hayashidani, Kitahara, Ogawa, 1994). Значительное количество работ посвящено изучению кишечного иерсиниоза у свиней (Кирьянов, Савчук, 1989; Родионова, Муравьев, Малофеева, 1999; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002, Прунтова и др., 2000; Nattermann, Horsch, Seeger, 1985; Markic, 1986; Mickova, Konecny, 1987; Hugenberg J., 1999, Okoroafor, Adesiyun, Agbonlahor, 1988). Почти на всех территориях от свиней изолируют Y.enterocolitica серогрупп ОЗ, 09, 05,27, 08, 06,30, 05, 07, ОН, 012, 017, 019, 04,32. Доказано, что свиньи являются основным источником иерсиниоза. От крупного рогатого скота выделяют иерсинии серогрупп 012, 013, 018, 07,8, 04, 05,27, ОЗ, 08.

К сожалению, количество отечественных работ по изучению спектра биоваров «ветеринарных» штаммов Y.enterocolitica, а также по исследованию их генетическими методами, невелико. Отсутствует нормативно-техническая документация по кишечному иерсиниозу сельскохозяйственных животных, нет диагностических препаратов, утвержденных Министерством сельского хозяйства РФ. Единственные «Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах», выпущенные Министерством сельского хозяйства, официально утверждены лишь в октябре этого года, и только начинают действовать. Все перечисленные обстоятельства делают необходимым глубокое и всестороннее изучение ветеринарного аспекта проблемы кишечного иерсиниоза в нашей стране, особенно генетических особенностей Y. enterocolitica в связи с вопросами эпизоотологии и эпидемиологии. Кишечный иерсиниоз по-прежнему остается инфекцией, мало известной работникам животноводства, данные о заболеваемости среди сельскохозяйственных животных неполны и отрывочны.

В Саратовской области существование кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных было доказано Зыкиным Л.Ф. и сотр. в 1997 году (Зыкин Л.Ф. и др., 1997). С этого времени на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Саратовского ГАУ им Н.И.Вавилова ведется планомерная работа по изучению кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных. С 1997 по 2005 год были обследованы животные нескольких районов Саратовской области: Саратовского, Советского, Базарно-Карабулакского, Энгельского, Марксовского, Ново-Бурасского, Красноармейского, Калининского и Петровского. При иммунологическом обследовании свиней и КРС в высоком проценте случаев выявлены антитела, а затем бактериологическим методом были выделены культуры Y. enterocolitica от поросят, КРС, из молока коров, а также из мяса и мясопродуктов (Хапцев, 2000; Гвинджилия, Зыкин, 2002; Гвинджилия, 2002; Осипчук, 2003; Киселева, Зыкин, 2004; Киселева, 2005). Большая часть культур выделена в Петровском районе Саратовской области, что согласуется с данными Областного Центра санэпиднадзора за 2001 год, по которым в этом же районе были выявлены лица (6 человек) с диагностическими титрами антител к Y.enterocolitica 03 серогруппы. Это еще раз подтверждает, что при заболевании людей основным источником инфекции являются сельскохозяйственные животные, а фактором передачи -продукты животноводства.

После выявления кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области и выделения культур Y.enterocolitica, выяснения роли молока и мяса в передаче возбудителя (Зыкин и др., 1997; Хапцев, 2000; Осипчук, 2003; Киселева, 2005), возникла необходимость подробно изучить свойства штаммов Y.enterocolitica, изолированных из разных источников, и определить их генетические особенности.

Цель работы - выяснение генетических особенностей (наличия плазмиды pYV и хромосомного гена inv) штаммов Y. enterocolitica, выделенных от больных и павших поросят, а также из молока КРС, и биотипирование этих штаммов.

Задачи исследования:

1. Определить биоварианты штаммов Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

2. Провести плазмидный скрининг культур различного происхождения.

3. Исследовать культуры Y.enterocolitica методом ПЦР, применяя две коммерческие тест-системы: для выявления хромосомного гена inv и ДНК плазмиды pYV.

Научная новизна

1. Впервые определен спектр биовариантов Y.enterocolitica, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных Саратовской области. От свиней и крупного рогатого скота выделяются Y.enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Установлено, что хромосомный ген inv одинаково распространен среди Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

3. Доказано, что плазмида вирулентности pYV присутствует лишь в клетках Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят. Культуры, выделенные из молока КРС, являются бесплазмидными.

4. Показано, что для определения плазмидного профиля можно использовать плазмидный скрининг, а для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV ПЦР-анализ с тест-системой «ДиаГен- Yersinia».

Практическая значимость

По результатам исследований подготовлены методические рекомендации «Идентификация патогенных штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами для оценки их эпидемиологической и эпизоотологической значимости», утвержденные МК ФВМ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 5 от 16 ноября 2005 г).

Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсам «Ветеринарная микробиология и иммунология» и «Клиническая микробиология».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди сельскохозяйственных животных Саратовской области . циркулируют Y.enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Хромосомный ген inv, кодирующий синтез белка инвазина, встречается как у Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят, так и у культур кишечно-иерсиниозного микроба, выделенных из молока коров.

3. Культуры Y.enterocolitica , изолированные от больных и павших поросят, являются носителями плазмиды вирулентности pYV, которая была обнаружена у семи из шестнадцати культур. Ни у одного из двадцати девяти «молочных» штаммов эта плазмида не выявлена. Для подтверждения патогенности с целью решения вопроса об эпизоотической и эпидемической значимости выделенной культуры Y.enterocolitica в комплексе с определением принадлежности к био- и серогруппе и наличия маркеров вирулентности рекомендуется выявлять присутствие в клетке плазмиды вирулентности pYV.

4. Плазмидный анализ и ПЦР с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды pYV в равной степени могут использоваться для выявления присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV, так как их результаты одинаковы.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского Федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов, 2003), на научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и инфекционной патологии животных» (Омск, 2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2004 год (СГАУ им. Н.И. Вавилова, Саратов, 2005).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР кафедры микробиологии и ветсанэкспертизы ИВМиБ за 2003-2005 годы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы, включающего 137 наименований, в том числе 86 иностранных, и приложения. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Спиряхина, Татьяна Владиславовна

Выводы

1. Изучено 45 штаммов Y.enterocolitica, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи (шестнадцать культур) и из молока коров (двадцать девять штаммов) в 2000-2003 годах в Саратовской области. Все культуры обладали типичными для вида свойствами. Большинство из них (двадцать семь культур) относились к серогруппам ОЗ и 09.

2. Биотипирование позволило отнести Y.enterocolitica к первому (А и В), второму, третьему и четвертому биоварам; преобладают биоварианты 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

3. С помощью плазмидного скрининга автономный репликон молекулярной массой 45-47 мДа (плазмида вирулентности pYV) был обнаружен только у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших и больных поросят - в семи случаях из шестнадцати. Ни у одного из двадцати девяти штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, плазмида вирулентности pYV не найдена. Наличие маркеров вирулентности (кальцийзависимости, пигментсорбции, способности агглютинироваться сывороткой СВИ, температурозависимости колоний и аутоагглютйнации) не всегда совпадает с присутствием в клетках плазмиды pYV.

4. Результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды вирулентности иерсиний совпадают с результатами плазмидного скрининга. Они положительны только у культур, выделенных от поросят (шесть случаев из шестнадцати), и отрицательны у «молочных» штаммов.

5. ПЦР-анализ с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-270», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv, показал, что этот ген равномерно распространен среди Y.enterocolitica, выделенных от разных групп животных, и, скорее всего, не связан с проявлением патогенных свойств микроба.

6. Плазмидный скрининг и ПЦР-анализ с тест-системой для выявления ДНК плазмиды pYV можно рекомендовать в качестве дополнительного теста при идентификации патогенных иерсиний

Заключение

Yersinia enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза, заболевания, которое широко распространено в мире, в том числе и в России. По данным ВОЗ эта болезнь регистрируется более чем в 30 странах мира, чаще в странах с более прохладным климатом. Так, в Финляндии абсолютное число заболевших в 2001 году составило720 человек, в Швеции - 579, в Дании - 285 человек. В РФ (по данным ЦЬЖИЭ Минздрава России) ежегодно регистрируется 4-5 тысяч случаев иерсиниоза, т.е. 6-7 случаев на 100 тысяч населения. В некоторых регионах этот показатель намного выше: во Владивостоке он достигает 40-50 случаев на 100 тысяч В Саратовской области по данным Областного ЦСЭН наблюдается рост заболеваемости: в 1999 году зарегистрировано 10 случаев, в 2000 году - 26, в 2001 году - 18. Фактическая заболеваемость кишечным иерсиниозом превышает официально регистрируемую, так как не во всех регионах РФ на эту инфекцию обязательно исследуют в случае острых кишечных инфекций.

Болеют кишечным иерсиниозом и сельскохозяйствененые животные. Особенно восприимчив к Y.enterocolitica молодняк свиней. Иерсинии выделены от свиней, коров, мелкого рогатого скота, кроликов, птицы, а также от грызунов и диких животных (Зыкин, Щербаков, Хапцев, 2002). При иммунологическом обследовании животных Саратовской области в РА в высоком проценте случаев выявлены антитела к Y.enterocolitica (Хапцев, 2000)

Источниками инфекции являются сельскохозяйственные животные и грызуны, а факторами передачи - продукты животноводства и корма. С 1996 года введена официальная регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных, но это заболевание по-прежнему остается инфекцией, мало известной ветеринарным работникам, главным образом, в силу отсутсвия нормативно-технической документации, необходимых сред и диагностических препаратов.

В 1997 году профессором Зыкиным Л.Ф. и сотрудниками кафедры микробиологии Саратовского Аграрного Университета эта инфекция была выявлена среди сельскохозяйственных животных области, главным образом, среди свиней и КРС. В 2000-2003 годах к.б.н. 3. Ю. Хапцевым и к.б.н. Е. С. Осипчук от сельскохозяйственных животных были изолированы 45 штаммов Yersinia enterocolitica. Все выделенные культуры обладали характерными для вида фенотипическими свойствами. Доказана роль молока и мяса в передаче возбудителя, кишечного иерсиниоза.

Следующим этапом работы должно было стать всестороннее изучение штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных, в том числе генетическими методами.

Для Yersinia enterocolitica характерен внутривидовой полиморфизм: этот вид включает более 70 серовариантов, 6 биовариантов, встречаются патогенные и непатогенные представители. Для выявления патогенных иерсиний, согласно рекомендациям, определяют маркеры вирулентности: зависимость от ионов Са2+ при выращивании при 37 °С, сорбцию пигмента конго-красного или гемина из среды роста, способность агглютинироваться сывороткой СВИ (сыворотка к вирулентным иерсиниям), аутоагглютинацию на среде Кларка и температурозависимость колоний.

Для максимального проявления патогенных свойств по современным воззрениям, необходимо присутствие в клетках иерсиний плазмиды pYV и экспрессия кодируемых ею белков. Размеры плазмиды составляют около 70 тыс. пар оснований, что соответствует молекулярной массе 45-47 мДа. Штаммы, содержащие эту плазмиду, как правило, являются вирулентными, тогда как штаммы, лишенные ее, авирулентны. Поэтому обнаружение плазмиды pYV является важным признаком, указывающим на возможную эпидемическую и эпизоотологическую опасность исследуемого штамма.

Имеют значение для патогенности и многие факторы, кодируемые хромосомными генами. Например, ген inv кодирует белок инвазин, играющий важную роль в проникновении бактерий внутрь эпителиальных клеток. На основе специфических участков гена inv и плазмиды pYV созданы коммерческие ПЦР-тест-системы, рекомендуемые производителями для идентификации патогенных иерсиний.

Нашей задачей было изучить биохимические свойства Y.enterocolitica, выделенных от сельскохозяйственных животных, для того, чтобы определить биоварианты этого микроба различного происхождения, с помощью генетических методов обнаружить плазмиду вирулентности в клетках и присутствие гена инвазина в хромосоме, а также выяснить, возможно ли применять указанные ПЦР-тест-системы для индикации патогенных иерсиний.

Всего подробно были изучены сорок девять штаммов Y.enterocolitica: шестнадцать из них были выделены в 2000 году З.Ю. Хапцевым от больных поросят и поросят с признаками диареи в хозяйствах Саратовского и Марксовского районов Саратовской области, двадцать девять культур изолированы в 2003 году Е.С. Осипчук из молока коров в хозяйствах Петровского района и четыре штамма - музейные культуры из коллекции кафедры микробиологии СГАУ. Биохимические признаки штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных Саратовской области были типичными и в целом соответствовали описанным в литературе.

Были определены биовары изучаемых культур Большинство культур -одиннадцать, изолированных от павших и больных поросят, относились к биовару 4, одна - к биовару 3, и лишь четыре штамма - к непатогенному биовару 1А. Важно отметить, что Y.enterocolitica биоваров 3 и 4 принадлежали к эпидемиологически и эпизоотологически значимой серогруппе ОЗ, тогда как четыре «непатогенных» штамма - к иным сероварам, т.е. установлена корреляция между серогруппами и биоварами Y. enterocolitica.

Результаты наших исследований совпадают с литературными данными о биовариантах иерсиний, циркулирующих среди животных. Различные исследователи указывают на важное значение 2-5 биоваров (Чеснокова, Марамович, Климов, 1997), на выделение от свиней в большинстве случаев четвертого биовара, и реже - третьего и второго (Климов, Чеснокова, Марамович, 1997; Маркик, 1993; Стефанов, 1989). Из молока коров изолируются Y.enterocolitica первого и третьего биоваров (Павлов и др., 1988). В последние годы появились сообщения о выделении иерсиний биовара 1А от больных людей (Grant, Bennet-Wood, Robins-Brown, 1998). Наши исследования показывают возможность выделения биовара 1А и от больных животных.

Биотипирование Y.enterocolitica различного происхождения показало, что определение биоварианта выделенной культуры возбудителя кишечного иерсиниоза - необходимая процедура при исследовании Y.enterocolitica ветеринарного происхождения.

Следующий раздел нашей работы предполагал исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами. Работ, посвященных генетическим исследованиям Y.enterocolitica , выделенных от сельскохозяйственных животных, в отечественной литературе мало, поэтому этот раздел важен не только с теоретических, но и с практических позиций.

Плазмидный скрининг культур позволил дифференцировать штаммы, содержащие плазмиду от бесплазмидных. Оказалось, что плазмиду вирулентности pYV удалось обнаружить лишь в клетках культур, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи. Внехромосомный репликон молекулярной массой 45-47мДа был обнаружен у семи штаммов из шестнадцати. Важно, что наличие плазмиды не всегда совпадало с маркерами вирулентности, кодируемыми плазмидой, например, с кальцийзависимостью. Культуры, изолированные от поросят хозяйства «Трудовое» Марксовского района, имели полный набор маркеров вирулентности, но не имели плазмиду pYV. Штаммы Y.enterocolitica, изолированные из молока коров, не содержали плазмиду вирулентности pYV. Однако пятнадцать из двадцати девяти «молочных» штаммов имели полный набор маркеров вирулентности. Объяснить это можно было бы, предположив, что плазмида интегрирована в хромосому. Такая возможность была показана А.Л. Гинцбургом с соавторами (1989). При этом может сохраняться экспрессия детерминант патогенности. Реальность этой гипотезы может быть проверена экспериментально методом генетического зондирования или полимеразной цепной реакции.

Для этого мы провели ПЦР-анализ штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от больных и павших поросят и из молока КРС. Были использованы две тест-системы: «ДиаГен-Yersinia'» для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV Y.enterocolitica и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-210», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv вирулентных штаммов Y.enterocolitica.

Результаты ПЦР-исследования культур тест-системой «ДиаГен-Yersinia» почти полностью совпали с результатами плазмидного скрининга. ДНК плазмиды pYV обнаружена только у Y.enterocolitica, выделенных от павших и больных поросят, в шести случаях из шестнадцати. Плазмидный скрининг определяет присутствие автономного репликона в клетках. ПЦР обнаруживает нуклеотидную последовательность, независимо от того, автономна плазмида или встроена. Положительные результаты ПЦР и плазмидного анализа были получены у одних и тех же штаммов. Совпадение результатов плазмидного скрининга и ПЦР свидетельствует о том, что интеграция плазмиды в хромосому у изученных штаммов маловероятна (хотя и не исключается).

Определив плазмидный профиль культур, мы получили еще один аргумент в пользу того, что основным резервуаром и источником иерсиниозной инфекции являются свиньи. Именно от них выделяются высоковирулентные штаммы Y.enterocolitica. Тот факт, что ни у одной из двадцати девяти культур, изолированных из молока, не обнаружена плазмида вирулентности pYV, свидетельствует, по нашему мнению, о том, что КРС не "имеет большого значения как источник инфекции. К такому же выводу пришли в своей работе немецкие ученые М. Bucher, М. Fredriksson-Ahomaa и A. Stolle (2002).

Проведен ПЦР-анализ другой тест-системой, «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21§y>. Она направлена на распознавание хромосомного гена inv в клетках Y.enterocolitica. Ген inv обнаружен у двадцати культур из сорока пяти изученных. Оказалось, что этот ген одинаково распространен как среди культур, изолированных от больных и павших поросят (у восьми культур из шестнадцати), так и .среди штаммов, выделенных из молока КРС (у двенадцати из двадцати девяти). Корреляции с патогенными свойствами, принадлежностью к определенным биовариантам и серогруппам не было обнаружено. По литературным данным, ген инвазина обнаруживается как у патогенных, так и у непатогенных штаммов иерсиний (Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002). Наши исследования этот факт подтверждают.

Мы имели возможность сравнить две иерсиниозные ПЦР-тест-системы. Они не отличались по чувствительности и специфичности. Чувствительность обеих тест-систем составляет <1x103 КОЕ/мл. Обе они оказались достаточно специфичны. Положительные результаты наблюдались только с Y.enterocolitica, но не с культурами испытанных гетерологичных микроорганизмов (E.coli, S.enteritidis, S.faecalis и Y.pseudotuberculosis). Хорошо зарекомендовали себя тест-системы и при исследовании биологических объектов - фекалий свиней, искусственно контаминированных Y. enterocolitica в дозе 1x105 мт/мл. Положительные результаты были получены при использовании и «ДиаГен- Yersinia» и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21§y>.

Все три генетических метода, которые мы применили, могут быть рекомендованы для исследования штаммов Y. enterocolitica. ПЦР с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21 ()» для выявления гена инвазина может использоваться для обнаружения возбудителя кишечного иерсиниоза, а также для дополнительной характеристики штамма. Аналогичные рекомендации даны Корчагиным Г.А. (2002) в связи с высокой распространенностью и сохранностью при пересевах гена inv. Однако для индикации патогенных иерсиний необходимо определить плазмидный профиль выделенной культуры, так как важнейшее значение для реализации патогенных свойств микроба имеет присутствие в клетках плазмиды pYV.

Наши исследования четко показали - хромосомный ген inv распространен равномерно у штаммов, циркулирующих среди разных групп животных, а плазмида вирулентности встречается исключительно у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших поросят и от поросят с явлениями диареи, т.е. в случаях, когда клинически проявляются патогенные свойств микроба. Нельзя забывать о наличии у половины культур, выделенных из молока, полного набора маркеров вирулентности. Данные литературы свидетельствуют о расширении спектра возможных возбудителей иерсиниоза. Поэтому для решения вопроса о патогенности выделенной культуры необходимо определение комплекса признаков: серогрупповой принадлежности, биоварианта, наличия маркеров вирулентности и присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV. Поскольку результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен- Yersinia» практически идентичны результатам плазмидного скрининга, для выявления плазмиды можно выбирать любой метод в зависимости от возможностей исследователя. Плазмидный скрининг даже предпочтительнее, т.к. требует меньше специального оборудования и материальных затрат. Аналогичные рекомендации даны для возбудителей кишечного иерсиниоза человека (Климов и др., 1997) В последних методических рекомендациях по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003; Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) предусматривается возможность использования ПЦР для выявления генетических детерминант, локализованных в плазмиде вирулентности. Мы подтвердили возможность применения на практике ПЦР-тест-системы «ДиаГен- Yersiniav> и плазмидного скрининга и можем рекомендовать эти методы для диагностики кишечного иерсиниоза.

Генетические исследования штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных показали необходимость определять наличие плазмиды pYV у «ветеринарных» штаммов Y. enterocolitica с целью выяснения их эпидемиологической и эпизоотологической значимости. Особенно это касается культур, изолированных от свиней.

Наши исследования показывают необходимость комплексного подхода к вопросу о патогенности Y. enterocolitica и дальнейшего изучения особенностей этого микроорганизма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Спиряхина, Татьяна Владиславовна, 2005 год

1. АляпкинаЮ.С., Аксенов М.Ю., Чернов Б.К., Гинцбург A.J1. Количественный ПЦР-анализ: разработка системы определения содержания амплифицированного фрагмента ДНК. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1994. - № 5. - С. 22-26.

2. Балахонов С.В., Лапа С.Э., Пинтусов В.И. Использование ПНР и плазмидного скрининга в эпидемиологическом надзоре за внутрибольничным сальмонеллезом. // Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология XXI век». -2005. - С. 29-30.

3. Бантинг Г., Кантор Ч., Коллинз Ф., Колсон А., Кокс Д., Эрлих Г., Гудфеллоу П., Гиленстен У. Анализ генома. Методы. Под ред. К. Дейвиса.-М.: Мир, 1990. 264с.

4. Белова М. А., Ющенко Г.В. Случай выделения Yersinia enterocolitica от человека.//ЖМЭИ. 1968. - № 9. - С. 148-150.

5. Водопьянов С.О.; Олейников И.П.; Гурлева Г.Г.; Мишанькин Б.Н. Генотипическое изучение штаммов Yersinia enterocolitica в полимеразной цепной реакции с использованием универсальных праймеров // Биотехнология. 1995.- № 3-4.- С. 35-37.

6. Гвинджилия Е. С., Зыкин Л.Ф. Выделение возбудителя кишечного иерсиниоза из молока КРС // Практик. 2002.- № 3-4.- С. 18-29.

7. Гвинджилия Е.С. Иерсиниоз КРС в Петровском районе Саратовской области // Тезисы научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 115- летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова. Саратов, 2002.- Ч. 2.- С. 19-20.

8. Гвинджилия Е. С., Зыкин Л.Ф., Матвиевский В.Я. Дальнейшее исследование молока КРС на наличие возбудителя кишечного иерсиниоза и влияние различных режимов пастеризации навыживаемость Y. enterocolitica в молоке // Практик. 2002. - №11 - 12. -С. 18-22.

9. Зыкин Л.Ф., Щербаков А.А., Хапцев З.Ю. Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных.//Саратов, 2002. -70с.

10. Иерсиниозы// Санитарные правила СП 3.1.094-96, Ветеринарные правила ВП 13.3.13.18-96. -М., 1996.

11. Калошина Л.А., Ющенко Г.В., Шестопалов Н.В. и др. Эпизоотический процесс псевдотуберкулеза и иерсиниоза в популяции грызунов крупного города.// Тезисы докладов XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней. Новосибирск, 1989. -С.83-84.

12. Кирьянов Е. А., Савчук И.И. Иерсиниоз сельскохозяйственных животных // Болезни сельскохозяйственных животных в Забайкалье и на Дальнем Востоке.- 1987. С. 22-26.

13. Кирьянов Е. А., Савчук И.И. Роль Y. enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных// Тезисы Всесоюзной научно-практической конференции «Иерсиниозы». Владивосток, 1989. чЛ. -С.89-91.

14. Киселева И.С. Мясо как фактор передачи инфекции при иерсиниозе // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.- Саратов , 2005.

15. Киселева И.С., Зыкин Л.Ф. Выделение Y.enterocolitica из мяса и мясопродуктов // Практик.- 2004.- №5-6. -С. 10-13.

16. Киселева И. С., Зыкин Л.Ф. Первый случай выделения 7. enterocolitica из мяса в Саратовской области // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Тезисы 2-ой региональной конференции молодых ученых. -Саратов, 2004. -С. 30-31.

17. Королюк A.M., Михайлов Н.В., Мирошниченко И.В. Диагностическая ценность ПЦР при иерсиниозах. // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов. М. 1997.- С. 180-181.

18. Корчагин Г.А. Диагностика кишечного иерсиниоза у свиней и КРС.// Вестник УГСХА.-Ульяновск, 2002.- С. 15-17.

19. Корчагин Г.А. Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики кишечного иерсиниоза. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.-Саратов, 2002.

20. Корчагин Г.А.; Васильев Д.А. К вопросу о диагностике заболевания, вызываемого энтеропатогенными иерсиниями, у мелких домашних животных // Вестник Ульяновской ГСХА, серия "Ветеринария".- 2002.- № 8. С. 15-17.

21. Кузнецов В.Г. Сигнальная идентификация потенциально патогенных иерсиний//Клиническая лабораторная диагностика. 2000.-№1,-С. 46-48.

22. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Пиразинамидазная активность бактерий рода Yersinia. II Лабораторное дело. -1990 .- № 9. С. 72-73.

23. Куклева JI.M., Кутырев В.В., Проценко О.А. Молекулярно-генетические аспекты инвазивных и антифагоцитарных свойств патогенных иерсиний. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 1996.-№ 1.- С. 11-16.

24. Куликовский А.В. Yersinia enterocolitica и Campilobacter jejuni возбудители пищевых отравлений человека // Труды ВИЭВ. 1984.- Т. 61.-С. 125-131.

25. Маниатис Т.,Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М., «Мир», 1984.

26. Международная классификация болезней. 10-й пересмотр. М.: Медицина.- 1995. -Т 1.- С. 105- 118.

27. Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах. Министерство сельского хозяйства РФ. Москва, 2005.

28. Осипчук Е.С. Молоко как фактор передачи возбудителя кишечного иерсиниоза.// Дисс. канд. биол. наук. -Саратов, 2003.-130с.

29. Померанцев Д.А. Васильев Д.А. Yersinia enterocolitica как возможный этиологический агент при желудочно-кишечных заболеваниях сельскохозяйственных животных. //Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертизы. -Ульяновск, 1998. -С. 103-116.

30. Попов Ю.А., Булгакова Е.Г., Куличенко А.Н., Шишкина О.Г., Лежнев А.И., Федотов Э.А., Кириллина О.А. Конструирование тест-системы на основе генетических зондов для идентификации чумного микроба //Генетика.- 1991.- Т 27,- С. 2063-2071.

31. Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз. (Экология, эпизоотология, лабораторная диагностика у сельскохозяйственных животных) Методические рекомендации // Вологда, 2003.

32. Псевдотуберкулез, иерсиниоз (эпидемиология, клиника, диагностика, терапия). Методические рекомендации // Санкт-Петербург, 2005.

33. Родионова В. Б., Муравьев В.Н., Малофеева Н.А. Роль иерсиний в патологии репродукции свиней.// Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 80-летию Московской ветеринарной академии. М.- 1999. С. 191-192.

34. Светличкин О.В. ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Разработка тест-систем обнаружения Yersinia enterocolitica с использованием- полимеразной цепной реакции и ДНК-зондов //

35. Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов. -Щелково, 2000. С. 388.

36. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Культуральные свойства и вирулентность иерсиний.// ЖМЭИ. 1991. - № 9. - С. 13-15.

37. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близких к нему микроорганизмов.//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2004.-Т 6, №1. -С. 10-21.

38. Тихонов В.К. Иерсиниозы животных в центральном и правобережном агрорайоне Нижегородской области. //Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук- С -Петербург, 1999.

39. Хапцев З.Ю. Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.// Диссертация кандидата биологических наук. Саратов, 2000.-124с.

40. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. - Т. 4. - № 3. -С. 248-266.

41. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез СПб, 1992. - 60 с.

42. Ценева Г.Я. Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза.//СПб, 1997.-62с.

43. Чеснокова М.В., Марамович А.С., Климов В.Т. Основные направления эпидемиологического надзора за иерсиниозами. //Материалы 7-го съезда ВНОЭМП. М.Д997.-Ч. 1.-С. 167-168.

44. Шумилов К.В.; Мельниченко Л.П.; Селиверстов В.В. Современные данные об иерсиниозе животных // Ветеринария. -1998.-№4.-С. 7-13.

45. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина Г.Н., Бродов Л.Е. Иерсиниозы. -М.: Медицина, 2003. 208 с.

46. Asplund К.; Tuovinen V.; Veijalainen P.; Hirn J. The prevalence of Yersinia enterocolitica 0:3 in Finnish pigs and pork // Acta Veter. scand, 1990.- T. 31, N 1, P. 39-43.

47. Bezanson G., Fernander R., Haldane D., Burbridge S., Marrie T. Virulence of patient and water isolated of Legionella pneumophila varies with bacterial genotype.//Can. J. Microbiol. 1994. - V 40, № 6 .- P. 426431.

48. Bhaduri S., Conway L.K., Lachica R.V. Assay of Crystal Violet Binding for Rapid Identification of Virulent Plasmid-Bearing Clones of // J. clin. Microbiol. 1987.-V.6. -P. 1039-1042.

49. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucleic Acids Res. 1979.- V7. -P. 1513-1523.

50. Borie C.E.; Jara M.A.; Sanchez M.L.; San Martin В.; Arellano C.; Martinez J.; Prado V. Aislamiento у caracterizacion de Yersinia enterocolitica de cerdos у bovinos en Chile // J. Veter.Med.Ser.В.- 1997.- V. 44, N 6. P. 347-354.

51. Bucher M., Fredriksson-Ahomaa M. und. Stolle A Vorkommen von Yersinien-Arten in Kalbern und Jungrindern // Fleischwirtschaft -2002.- № 9. -C. 125-127.

52. Bullians J.A. Yersinia species infection of lambs and cull cows at an abattoir //N. Z. veter. J.- 1987.- T. 35, N 5.- P. 65-67.

53. Catteau M.; Krembel C.; Wauters C. Isolement de yersinia enterocolitica de langues // Res. Med. veter, 1983.- T. 159, N 2. P. 89-94.

54. Corbel M.J.; Brewer R.A.; Hunter D. Characterisation of Yersinia enterocolitica strains associated with ovine // Veter. Rec.- 1990.- T. 127, N 21.-P. 526-527.

55. Christensen S.G. Yersinia enterocolitica i levnedsmidler // Dansc. Veter.-Tidsskr.- 1984.- T. 76, N 11. P. 531-533.

56. Czernomysy-Furowicz D.; Furowicz A.J.; Karakulska J.; Nawrotek P.; Peruzynska A.; Kalisinska E. A case of isolation Yersinia enterocolitica from duck muscles // Adv.in agr.Sc. -Szczecin.- 1999.- V. 6, f.l.- P. 19-23.

57. Daris F.; Crevatin E.; Cocevari M. Isolation of Yersinia enterocolitica in pigs reared in the Friuli-Venezia Giulia region // Clin. Veter.- 1986.- T. 109, N4.-P. 303-307.

58. Datta N., Hedges R.W.// J. Gen. Microbiol. 1972. -V.70.

59. Dee W. Bakteriologische Untersuchungen zum Vorkommen und zur Epizootiologie von Yersinia enterocolitica beim Tier // Mh. Veter.-Med, 1986.-T. 41, N3.-S. 99-100.

60. Fukushima H.; Ito Y.; Saito K. Ecological studies of Yersinia enterocolitica. 3. Cross-protection against fecal excretion between Y. enterocolitica serovars 3 and. 5.27 in pigs // Veter. Microbiol.- 1984.- T. 9, N4.-p. 383-389.

61. Fukushima H.; Nakamura R.; Ito Y. Ecological studies of Yersinia enterocolitica. 2. Experimental infection with Y. enterocolitica in pigs // Veter. Microbiol.- 1984.- T. 9, N 4. P. 275-281.

62. Gemsky P., Lazere j., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependence of Yersinia enterocolitica // Infect. Immun. 1980.-V.27. -P. 682-685.

63. Gierczynski R. Evaluation of the usefulness of selected virulence markers for identification of virulent Yersinia enterocolitica strains. II. Genotypic markers assousiated with the pYV plasmid. // Med. Dosw. Mikrobiol. -2000.- V 52,N 1.- P.-35-49.

64. Glunder G.; Hinz K.-H.; Weber A. Zum Vorkommen von Yersinien in Vogeln // Dt. tierarztl. Wschr.- 1986.- T. 93, N 1. S. 27-29.

65. Grant Т., Bennet-Wood V. and Robins-Brown R.M. Identification of Virulense-Assousiated Characteristics in clinical isolates of Y.enterocolitica lacking classical virulence markers .//Infect. And Immun. Mar. -1998.-P. 1113-1120.

66. Hamdy M.; Makeen S.; Fadl H.; Nouman T. Yersinia enterocolitica among sheep carcases // Assiut veter. med. J, -1990.- T. 23, N 45. P. 116119.

67. Harmon M.C.; Swaminathan В.; Forrest J.C. Isolation of Yersinia enterocolitica and related species from porcine samples obtained from abbatoir // J. appl. Bacteriol, -1984.- T. 56, N 3,- P. 421-427.

68. Hathaway S.C.; McKenzie A.I. Meat inspection in New Zealand: Prospects for change // N. Z. veter. J, -1991.- T. 39, N 1. P. 1-7.

69. Hayashidani H.; Kaneko K.; Sakurai K.; Ogawa M. Experimental infection with Yersinia enterocolitica serovar 0:8 in Beagle dogs // Veter.Microbiol.,- 1995.- Vol.47,N 1-2. P. 71-77.

70. Hayashidani H.; Kitahara E.; Ogawa M. Infectivity and pathogenicity of Yersinia enterocolitica serovar 0:8 to wild rodents in Japan // J. Veter.Med.Ser.B.- 1994.- V. 41, N 7/8. P. 504-511.

71. Hefnawy Y.; Moustafa S.; Refai R.S. Occurrence of Yersinia enterocolitica and Listeria monocytogenes in fresh water fish // Assiut veter. med. J, 1989.- T. 21, N 41. P. 135-137.

72. Heim D.; Fehllhaben K.; Scheibner G. Untersuchungen uber das Verhalten von Yersinia enterocolitica in Lebensmitteln tierischer Herkunft // Mh. Veter.-Med.- 1985.- T. 40, N 3. S. 95-98.

73. Hugenberg J. Zur Vorkommen und Nachweis von Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen in Niedersachsen //Inaug.-Diss., Hannover.- 1999. 106 c.

74. Ikheloa J.O.; Aruna M.B.; Ayoade G.O. Biotypes and sensitivity screening Yersinia enterocolitica as an infective agent in man and swine in Nigeria // Rev.Elevage Med.veter.- 1992.- T. 45, N 2. P. 135-137.

75. Jackova S.; Urgeova E. Nalezy Yersina enterocolitica 03 v ustnej dutine jatocnych osipanych, v mase i v masovych // Biologia. Bratislava.-1992.- R.47,№.9. P. 737-743.

76. Jakubczak A.; Maleszewski J. Przezywalnosc Yersinia enterocolitica w miesie wieprzowym w zaleznosci od wielkosci inoculum i temperatury zamrazania // Med.weter. -1992,- R.48, N 10. S. 466-467.

77. Jakubczak A.; Maleszawski J. Paleczki Yersinia enterocolitica w produktach zwierzecych // Med. Weter.- 1986.- T. 42, N 9.-P. 537-540.

78. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids//J.Bacter.- 1981.-V. 145.-P. 1365-1373.

79. Kahalil N.G.; Elyas A.H.; Nashed S.M. Studies on Yersinia enterocolitica in raw milk and ice-cream // Assiut veter.med.J. -1993.- Vol. 29, N57. P. 103-109.

80. Kandolo K., Wauters G. Pyrazinamidase activity in Y.enterocolitica and related organisms // J. clin. Microbiol. 1986. - Vol 21. N6. - P. 980 -982.

81. Kaneuchi C.; Shibata M.; Kawasaki T. Occurrence of Yersinia spp. in migratory birds, ducks, seagulls, and swallows in Japan // Japan. J. veter. Sc.- 1989.- T. 51, N 4. P. 805-808.

82. Kot В.; Jakubczak A. Genotypic markers of Yersinia enterocolitica virulence // Adv.in agr.Sc. -Szczecin, -2002.- N 8/1.- P. 53-58.

83. Kot В.; Wozniak-Kosek A.; Kawiak J.; Bukowski K. Zastosowanie metody PCR do wykrywania plazmidowych markerow chorobotworczosciszczepow Yersinia enterocolitica izolowanych od ludzi i swin // Med.weter. -2001.- R. 57, N 10.- S. 727-730.

84. Kwaga J.; Iversen J.O. Plasmids and outer membrane proteins of Yersinia enterocolitica and related species of swine origin // Veter.Microbiol.- 1993.- Vol.36, N 3/4. P. 205-214.

85. Lotsch G. Untersuchungen zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica bei Speisefischen und ausgewahlten Fischprodukten // Mh. Veter.-Med.- 1986.- T. 41, N 14. S. 496-498.

86. Ludes A.; Weiss R. Zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica bei Schafen // Berl. u. munch, tierarztl. Wschr. -1984.- T. 97, N 6. S. 198-202.

87. Lyxell G.; Bernervall Y.; Danielsson-Tham M.-L. Yersinia enterocolitica: En livsmedelsburen patogen. Svensk // Veter.-Tidn. -1990.-T. 42, N 14. P. 599-602.

88. Maleszewski J.; Jakubczak A. Izolacja Yersinia enterocolitica z tusz trzody chlewnej przy uzyciu dwoch metod // Med. Weter.- 1988.- T. 44, N 12. P. 734-737.

89. Markic Z. Изолацкуа на б актерку ата Yersinia enterocolitica серовар 0:3 од свиньи // Макед.ветер.Прегл. -1993,- Г.22,бр.1/2. С. 13-16.

90. Markic Z. Nalazi bakterije yersinia enterocolitica serotipa 0:9 u svinja // Veter. Glasnik.- 1986.- T. 40, N 12. P. 893-896.

91. Myers L.L.; Firehammer B.D.; Border M.M.; Shoop D.S. Prevalence of enteric pathogens in the feces of healthy beef calves // Am. J. veter. Res, 1984,- T. 45. N 8. P. 1544-1548.

92. Mickova V.; Konecny S. Frekvence nalezu Yersinia enterocolitica u jatecne porazenych // Veterinarstvi.- 1987.- T. 37. N 7. P. 308-309.

93. Mickova V. Vyskyt a detekce Yersinia enterocolitica a ostatnich yersinii z potravin // Veterinarstvi.- 1990.- T. 40. N 6, P. 276-277.

94. Nakajama H., Inone M., Mori T. et al. Detection and identification of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica by ane imoroved PCR method. //J. Clin. Microbiol. 1992. - v. 30, - №9. - P. 2484-86.

95. Nattermann H.; Dedek J.; Loepelmann H. Serologische Untersuchungen zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica beim Schwarzwild // Mh. Veter.-Med.- 1986.- T. 41. N 16.- S. 565-567.

96. Nattermann H.; Horsch F.; Dee W.; Ortmann J. Die Yersinia-enterocolitica-Infektion bei landwirtschaftlichen Nutztieren // Mh. Veter.-Med.- 1986.- T. 41. N 1. P. 23-26.

97. Nattermann H.; Horsch F.; Seeger M. Epizootiologie der Yersinia-enterocolitica-Infektion in einem Schweinebestand // Mh. Veter.-Med.-1985.-T. 40. N 11.-S. 366-370.

98. Neubauer H.; Sprague L.D.; Hensel A. et al. Specific detection of plasmid bearing Yersinia isolated by PCR.// Clin. Lab. 2000. - V. 46. - P. 583-587.

99. Nielsen G.H.; Aalbaek В.; Jogensen M.M.; Hoorfar J. Identifikation af Yersinia enterocolitica ved hjaelp af automatiseret PCR // Dansk Veter.-Tidsskr.- 2001.- Arg.84,N 6. S. 6-11.

100. Nissen H.; Maugesten Т.; Lea P. Survival and growth of Escherichia coli 0157:H7, Yersinia enterocolitica and Salmonella enteritidis on decontaminated and untreated meat // Meat Sc.- 2001.- Vol.57, N 3. P. 291-298.

101. Novak S.; Polaharova A. Depistaz Yersinia enterocolitica u osipanych v juznej casti Stredoslovenskeho regionu //Veterinarstvi.- 1993,-R.43,c.5. S. 165-166.

102. Nwosuh E.N.; Adensiyun A.A. Prevalence of Yersinia enterocolitica infection in Nigerian chickens: cultural and serologic studies // Rev. Elevage Med. Veter.- 1987.- T. 40. N 3. P. 239-241.

103. Odinot P.,Meis F.,Gurgs J. et al. Two-step polymerase chain reaction assay for detection of Yersinia species in general and of pathogenic Y. enterocolitica strains specifically.// Int. I. Infec. Dis.-1997. -v.l, №4. P. 206-211.

104. Okoroafor E.; Adesiyun A.A.; Agbonlahor D.E. Prevalence and characteristics of Yersinia enterocolitica strains isolated from pigs in Jos, Nigeria//Brit, veter. J.- 1988.-T. 144, N2.-P. 131-138.

105. Platt-Samoraj A.; Szweda W.; Siwicki A.K. Wplyw zakazen Yersinia enterocolitica psow i kotow na wystepowanie jersiniozy u czlowieka // Med.weter. 2000.- R.56,N 6. - S. 379-381.

106. Portnoy D., Moseley S., Falkow S. Characterization of plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis //Infect. Immun. -1981. -V. 31. -P. 775-782.

107. Павлов А., Филиппов В., Хвърчилков В., Данев Й. Содержание Y.enterocolitica в молоке и пробах из прямой кишки коров. (НРБ)//Ветер. С6.-1988-Т.6, №2.-С. 47-49.

108. Saad N.M.; Moustafa S. Prevalence of yersinia enterocolitica in raw milk in Assiut city // Assiut veter. med. J.- 1989.- T. 22, N 43. P. 95-99.

109. Schiemann D.A. The pathogenicity of Yersinia enterocolitica for piglets // Canad. J. veter. Res.- 1988.- T. 52, N 3. P. 325-330.

110. Schiemann D.A. Yersinia enterocolitica in milk and dairy products // J. Dairy Sc.- 1987.- T. 70, N 2. P. 383-391.

111. Shayegani M.; Stone W.B.; DeForge I. Yersinia enterocolitica and related species isolated from wildlife in New York state // Appl. environm. Microbiol.- 1986.- T. 52, N 3. P. 420-424.

112. Singh S.; Sharma S.N.; Singh N.P. Effect of Yersinia enterocolitica infection on fertility of mice // Indian J.anim.- 1994.- Vol.64, N 4. P. 346347.

113. Sinha R.P.; Chauhan H.V.S.; Zahinuddin M. Comparative studies on dinitrochlorobenzene, johnin and tuberculin tests for diagnosis ofparatuberculosis in goats // Indian J. anim. Sc.- 1985.- T. 55, N 9. P. 759761.

114. Sinha A.K.; Narayan K.G.; Singh D.K. Evidence of autotrophic growth of Yersinia enterocolitica //Indian J. anim. Sc.- 1988.- T. 58, N 10. -P. 1138-1140.

115. Славчев Г. Проучвания на термостабилен ентеротоксин от щамове на Y. enterocolitica серотип 0:3 // Ветер. Сб.- 1990.- Т. 88, N 1. -С. 43-47.

116. Slee K.J.; Button С. Enteritis in sheep and goats due to Yersinia enterocolitica infection // Austral, veter. J.- 1990.- T. 67, N 11. P. 396-398.

117. Smego R.A., Frean J., Koornhof H. J. Yersiniosis: microbiological and clinicoepidemiological aspects of plaque and non- plaque Yersinia infections. //Eur J Clin Microbiol Infect Dis.- 1999.-№ 18.- P. 1-15.

118. Стефанов И.; Кунев Ж. Изолиране на Yersinia enterocolitica и подобните видове от редовно заклани свине // Ветер. Сб.- 1990.- Т. 88, N 5/6. С. 43-46.

119. Стефанов И. Выделение Yersinia spp из миндалин и языков убойных свиней. //Ветер. Сб. -1989.-С. 41-43.

120. Upmann М., Paulsen P., Jams С., Smulders F. Die Mikrobiologie von Kalte behandeltem Fleisch // Fleischwirtschaft.- 2000. -№ 8. -C. 90-96.

121. Verma N.K.; Misra D.S. Isolation of enterotoxigenic Yersinia enterocolitica from pigs in Uttar Pradesh // Indian J. anim. Sc.- 1984.- T. 54, N 7.- P. 659-662.

122. Vokoun P. Depistaz Yersinia enterocolitica 0:3 u psu a kocek // Veterinarstvi.- 1985.- T. 35, N 12. P. 550-551.

123. Василев П. Иерсиниа ентероколитика в гърлени секрети на свине //Ветер. Сб.- 1986.- Т. 84, N 2. Р. 30-31.

124. Wozniak-Kosek A.; Kot В.; Jakubczak A.; Grzybowski J. Zastosowanie metody PCR do identyfikacji markerow chorobotworczosciszczepow Yersinia enterocolitica izolowanych od ludzi i swin // Med.weter.-2001.- R.57,N 3. S. 183-186.

125. Weagant S., Jagow J., Jinneman K. Development of digoxigenin-labelled PCR-amplicon probes for use in the use in the detection and identification of enteropathogenic from food.// J. Food Prot. -1999.-v.62,N5.- P.438-443.

126. Yanguela Martinez J.; Herrera Marteache A.; Rivas Pala Т.; Brault J. Isolement de Yersinia enterocolitica de langues de pore et de carcasses de poulet // Microbiol. Aliments Nutrit.- 1987.- T. 5, N 4. P. 339-343.

127. Zheng X.B. Isolation of Yersinia enterocolitica from the faeces of diarrhoeic swine // J. appl. Bacteriol.- 1987.- T. 62, N 6. P. 521-525.

128. Zowghi E.; Ebadi A. Isolation and identification of Yersinia enterocolitica serotype 0:9 in cattle in Iran // Arch. Inst. Razi.- 1986.- T. 36/37. P. 79-83.