Разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Yersinia Enterocolitica в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.06, кандидат биологических наук Светличкин, Олег Вячеславович

• Светличкин, Олег Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Светличкин, Олег Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Характеристика иерсиний и их распространение в объектах ветеринарно-санитарного контроля.

1.2. Методы индикации и идентификации иерсиний.

1.2.1. Бактериологический метод индикации Y. enterocolitica. f 1.2.2. Иммунологические методы.

1.2.3. Методы ДНК-диагностики

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы исследований.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Выделение хромосомных ДНК бактерий.

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.3. Включение тритиевой метки в ДНК методом ник-трансляции

2.2.4. Включение биотиновой метки в ДНК методом ник-трансляции.

2.2.5. Получение меченых зондов с помощью полимеразной цепной реакции.

2.2.6. Гибридизация ДНК с тритиевой меткой.

2.2.7. ДНК-гибридизация с использованием тест-набора с ДНК-зондами, меченными биотином.

2.2.8. Методика гибридизации колоний.

2.2.9. Методика полимеразной цепной реакции.

2.2.10. Амплификация ДНК методом рассеянной затравки.

2.2.11. Статистическая обрабока результатов.

2.3. Результаты исследований.

2.3.1. Разработка тест-системы индикации Y. enterocolitica на основе ПЦР.

2.3.2. Разработка методов и тест-систем индикации Y. enterocolitica с использованием генных зондов.

2.3.3. Разработка методик индикации патогенных штаммов Y.enterocolitica с использованием плазмидной ДНК.

2.3.4. Оценка методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления Y.enterocolitica при мониторинге кормов и мясной продукции

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Yersinia Enterocolitica в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики»

Актуальность темы

Обеспечение населения высококачественной и безопасной продукцией является актуальной задачей современности. Эта актуальность обусловлена возрастанием экологического неблагополучия под действием различных факторов, приводящих к контаминации производств и продукции опасными для здоровья человека и животных возбудителями заболеваний.

Получение высококачественной животноводческой продукции тесно связано с созданием эффективной системы ветеринарно-санитарного контроля, всей «пищевой цепи» - от кормов до готовой продукции.

Микробиологические критерии традиционно являются одним из главных показателей безопасности животноводческой продукции.

В последнее время все более актуальной проблемой является индикация возбудителей кишечного иерсинеоза. Это заболевание регистрируется по всей территории РФ и в других странах. ( Ющук Н.Д. и др., 1987,2000; Ющенко Г.В., 2000; Кононенко А.Б. и др., 2000; Славчев Г., 1986,1989; Стефанов И., 1989). По данным ряда исследователей кишечный иерсиниоз по значимости среди пищевых зоонозов занимает вторе место после сальмонелеза.

Возбудителем кишечного иерсиниоза является Y. enterocolitica. Животные разных видов являются источниками возбудителя инфекции. Иерсинии выделены от грызунов, свиней, коров, диких животных и птицы (Кирьянов Е.А. и др., 1989; Каланадзе Е.П. и др., 1991).

Бактерии Y. enterocolitica встречаются в овощах, корнеплодах, зеленых кормах, в молоке ( Славчев Г., 1986,1989; Стефанов И., 1989 ).

Мясо может быть контаминировано в процессе убоя и разделки животных - бактерионосителях. В последнее время серьезное значение в инфицировании иерсиниями приобретает водный фактор. Y. enterocolitica часто выделяют из открытых и закрытых водоемов, подземных вод, колодцев, питьевой воды, сточных вод (Старыгина Г.А. и др., 1989).

Прямым следствием распространения иерсиний в животноводческих хозяйствах является обсемененность пищевых продуктов животноводства: молока (1,0-6,0%), мяса (1,0-6,0%), тушек цыплят (2,0-12,0%), поверхности яиц (0,5-8,0%) (Ющенко Г. В., Дунаев В. И., 1980).

Существующие методы классического бактериологического анализа, предусматривают выделение чистых культур на селективных питательных средах, что делает эти анализы длительными и трудоемкими.

Кроме того, влияние различных биотических и абиотических факторов может приводить к L-трансформации в популяции микроорганизмов и появлению L-форм, которые трудно быстро выявить с помощью классических бактериологических методов (Прозоровский С.В. и др., 1981; Павлова И.Б., 1999).

Наиболее перспективными в плане чувствительности и специфичности индикации и идентификации микроорганизмов показали себя методы генной диагностики (ДНК-гибридизация, амплификация генов) (Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., 1976; Антонов А. С. др., 1980; Панин А.Н. и др., 1997; Palva А.А., 1983; Hachimoto J. et al., 1995). Они позволяют выявлять микроорганизмы и вирусы в смешанных культурах, обнаруживать L-формы бактерий и дифференцировать патогенные культуры от непатогенных (Гинцбург А.А., 1998; Falkow S., Moseley S., 1982; Hill W., Modden J., 1983; Moseleu S.A., Hyg J., 1989; Rifai S. et. al., 1989).

Вследствие сказанного, разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики — одна из важных задач ветеринарно-санитарного контроля. Актуальным является адаптация методов к конкретным объектам и дифференциация патогенных форм бактерий.

Цель и задачи исследований Целью исследований являлась разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики.

В задачи исследований входило: разработать тест-систему индикации Y.enterocolitica на основе ПЦР; разработать методы и тест-сиситемы индикации Y.enterocolitica с использованием ДНК-зондов, меченных биотином и тритием; разработать метод индикации патогенных штаммов Y. enterocolitica с использованием плазмидной ДНК; провести оценку методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления

Y. enterocolitica при мониторинге кормов и мясных продуктов. Научная новизна. Разработаны тест-сиситема индикации Y.enterocolitica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных биотином, и тест-сиситема на основе ПЦР; разработана методика индикации патогенных штаммов Y. enterocolitica с использованием плазмидной ДНК; разработана тест-сиситема индикации патогенных и непатогенных штаммов Y. enterocolitica на основе амплификации и ДНК-гибридизации. Практическая ценность. На основании результатов исследований разработаны:

- Методические указания по индикации Y. enterocolitica методом полимеразной цепной реакции (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г., № 13-5-2/196).

- Методические рекомендации по индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 18. 03. 2004 г).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарии» (г.Ставрополь, 2000);

- Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2000 г.);

- Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ВНИТиБП РАСХН (г. Щелково, 2001 г.);

- Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.);

- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2004 г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.). Публикации. Результаты исследований отражены в 7 научных статьях.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза», Светличкин, Олег Вячеславович

выводы

1. Разработаная тест-система индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах, включающая набор для выделения ДНК с лизирующим реагентом гуанидинтиоизоционатом и сорбентом NucleoS™, набор для постановки ПЦР и реагенты для детектирования амплифицированной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, позволяют выявлять искомые бактерии в присутствии близкородственных видов бактерий с чувствительностью 10-10 клеток в пробе в течение 6-8 часов без предварительного обогащения.

2. Разработанная методика индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных тритием, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизоцима, депротеинизации додецилсульфатом натрия и протеиназой, гибридизации на фильтрах и детектирования гибридных молекул жидкостной сцинтилляцией, позволяет проводить индикацию 105 микробных клеток в пробе за 6-8 часов.

3. Разработанные методика и тест-система индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных биотином, включающая реагенты для лизиса клеток, депротеинизации ДНК додецилсульфатом натрия и хлороформом, постановки реакции точечной гибридизации, реакции с коньюгатом, субстратом и красителем на фильтрах и детектирования гибридных молекул по интенсивности окрашивания позволяет проводить индикацию с чувствительностью!О4 клеток в пробе за 812 часов.

4. Предварительное обогащение культуры Y. enterocolitica при 4° С в течение 24 часов позволяет повысить чувствительность индикации ДНК-зондами до 10 - 100 клеток в пробе.

5.Разработана методика на основе гибридизации колоний иерсиний с плазмидой pYV, позволяющая выявлять патогенные штаммы Y. enterocolitica в течение 48 часов.

6. Разработана методика на основе ампплификации с помощью рассеянной затравки с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами и последующей гибридизацией с иммобилизованными ДНК-зондами плазмидных и хромосомных ДНК. Методика позволяет одновременно устанавливать наличие Y. enterocolitica и дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы в течение 8 часов без предварительного обогащения материала. Чувствительность анализа составляет 10-100 клеток в пробе.

7. Высокая чувствительность и специфичность, корреляция с результатами бактериологического метода обнаружения иерсиний, значительное сокращение продолжительности анализа позволяют рекомендовать разработанные методы и тест-системы ДНК-диагностики для проведения мониторинговых исследований кормов и мясной продукции.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны:

- Методические указания по индикации Y. enterocolitica методом полимеразной цепной реакции (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г. № 13-5-2/196).

- Методические рекомендации по индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 18. 03. 2004 г).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Светличкин, Олег Вячеславович, 2004 год

1. Антонов А.С. Молекулярные основы геносистематики // Изд. МГУ, М., 1980, с. 24-31.

2. Ахмедов Р.А. Кишечный иерсиниоз как природноочаговое заболевание//Тезисы докладов научной конференции «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций», Ставрополь, 1991.-С.156-158;

3. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий // М., 1976.

4. Брехова-Колесникова А.В., Ющенко Г.В. Результаты исследования больных острыми кишечными заболеваниями на кишечные иерсиниозы (иерсиниоз и псевдотуберкулез) в Краснодарском крае// Актуальные вопросы инфекционной патологии.- Саратов, 1981.-С. 60-61;

5. Бузолева Л. С., Бурцева Т. И., Сомов Г.П. /Влияние температуры культивирования на содержание нуклеиновых кислот у бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia psedotyberculosis. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2000.-№ 6.-С. 22-25

6. Бурыкина И.М.,Сафронова Л.В. /Мониторинг за развитием Yersinia enterocolitica в обеспечении качества и безопасности молочныхпродуктов // Сборник трудов седьмого всероссийского конгресса « Политика здорового питания в России», Москва, 2003, с. 88.

7. Вальехо-Роман К. М. Гибридизация ДНК В кн.: Молекулярные основы геносистематики //Изд-во МГУ, М., 1980, с.86-105.

8. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Померанцев Д. А., Русалеев B.C., Каврук JI.C. Биологические свойства фагов Yersinia enterocolitica // Ветеринария,- 2003.-N 1.-С. 25-28

9. Ю.Воскресенская Е. А., Протективное и диагностическое значение антигенов иерсиний псевдотуберкулеза // микробиология., Санкт-Петербургский научно- исследовательский институт Эпидемиологии и Микробиологии имени Пастера.-Санкт-Петербург.-1994.

10. П.Гинцбург A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний // Журнал микробиологии, эпизоотологии и иммунологии, 1998, № 3, с. 86-95.

11. Гинцбург A.JI. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов и решение задач медицинской микробиологии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1999, № 5, с.22-26.

12. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде // Журнал микробиологии, эпизоотологии и иммунологии, 1997, № 3, с. 116-121.

13. Гордейко В.А., Литвин В.Ю., Шустрова И. М. Иерсинии в почве полей, орошаемых сточными водами свинокомплекса// Гигиена и санитария.-1991.- №1.-С. 28-30.

14. Гордейко В. А., Воронцова Т. А., Литвин В.Ю. Сероэпидемиологическое изучение кишечного иерсиниоза у работников свинокомплексов// ЖМЭИ.-1990.-№3.-С. 111-112.

15. Гречищева Т.С. Кишечные иерсиниозы (псевдотуберкулез и иерсиниоз) у людей в Егорьевском районе Московской области// Актуальные вопросы инфекционной патологии.- Саратов, 1981.-С. 46-48.

16. Гурлева Г.Г. Упрощенный способ определения серологических вариантов Y.enterocolitica// Лабораторное дело.-1989 №7-С. 70-72.

17. Дранкин Д.И., Гельдыев А.Г., Хотько Н.И. Вода и инфекция-Ашхабад:, Мирап, 1994.- 67с.

18. Дунаев В.И., Амиркулов А.И. Антигенное родство Y. enterocolitica с родом Brucella// Актуальные вопросы инфекционной патологии.-Саратов -1981.- С. 58-60;

19. Емельяненко Е. Н. Некульти в ируемые формы иерсиний и листерий в почве и при взаимодействии с растениями, Научно- исследовательский институт эпидемиологии имени Н.Ф. Гамалеи, М.,1997.

20. Золотарев Ф.Н, Голубев Д.Б., Петров Н.А. Метод точечной гибридизации в вирусологии.// Успехи современной биологии.- 1989.-том 108.- с. 375382.

21. Золотарев Ю.В., Мешандин А.Г., Золотарева Л.В. Серологическая диагностика сальмонеллезов // Клин. лаб. диагностика, 2001, № 1, с.52-54.

22. Коромыслов Г.Ф., Фомин Б. А., Артюшин С.К. и др. Диагностикумы инфекционных болезней сельскохозяйственных животных на основе генной инженерии // Труды ВИЭВ, 1994, т. 69, с. 8-14.

23. Корчагин Г., Васильев Д.А. /Возможности использования ПЦР для идентификации иерсиний/.,// Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: Сборник научных работ/ Ульянов, гос. с-х. акад.- Ульяновск, 2000.-С. 67-70

24. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н., Клименко В.В. Роль рефрижераторов в распространении бактерий рода Yersinia// Гигиена и санитария -1992.-№2.-С. 43-46.

25. Кузнецов В.Г., Тимченко Н.Ф., 1998 Взаимодействия между бактериями рода Yersinia в водной среде Журн. микробиол.,1998, №6, С. 26-29.

26. Куликовский А.В., Джентемирова К.М. Иерсиниоз- актуальная проблема ветиринарной медицины// Ветеринария.- 1993.-№11-12.-С. 28-35.

27. Ленченко Е.М., Куликовский А.В., Павлова И.Б. Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики // Москва, 1998.

28. Литвин В.Ю. Сапрофитическая фаза в экологии возбудителей инфекционных заболеваний// ЖМЭИ.- 1985.- №6.-С. 98-101;

29. Маккреди Б.Д., Чимера Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами // В кн. Молекулярная клиническая диагностика, М., изд. «Мир», 1999, с.496-506.

30. Маниатис Т., Фрич Э., Дж. Сэмбрук Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., Мир, 1984.

31. Медников Б.Н. Дивергенция геномов и некоторые вопросы эволюционной теории // Автореф. на соискании ученой степени доктора биологических наук, М., 1978.

32. Павлова И.Б. Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде (электронно-микроскопическое исследование) // Диссертация в виде научного доклада, М., 1999.

33. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-форма бактерий // М., изд. «Медицина», 1981, с. 5-112.

34. Славчев Г. Развитие и преживаемост на Yersinia enterocolitica в краве масло//Ветеринарна сбирка.-1989.-№3.-С. 50-52.

35. Славчев Г. Развития и проживаемост на Yersinia enterocolitica в постъеризирано мляко и сладолед// Ветеринарно- медицински науки.- 1986.-№6.-С. 77-85.

36. Славчев Г. Термоустойчивост на Yersinia enterocolitica в краве мляко// Ветеринарна сбирка. —1989.-№2.-С. 46-47.

37. Славчев Г. Продукция на термастобилен ентеротоксин от щамове на Y.enterocolitica серотип 03//Ветеринарна сбирка.-1990.-№5,6-С.43-45.

38. Славчев Г., Цанев Н. Доказане на Y.enterocolitica серотип 0:3 в мляко и млечни продукти посредством коаглутинационния тест// Ветеринарна сбирка.- 1989.-№6.-С. 18-19.

39. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез // М.,1990, С. 1.

40. Сомов Г.П. Особенности экологии внеорганизменных популяций патогенных бактерий и их отражение в эпидемиологии инфекций //ЖМЭИ, 1997,№5, с.7-11.

41. Стефанов И. Биохимична и серологична характеристика и потенциална патогенност на щамове Yersinia enterocolitica, изолиране от свине//Епид., микр., инф. болести.- 1990.-№2.-С. 30-36.

42. Стефанов И. Изолирана на Yersinia spp. от тонзили и езици на рядовно заклани свине//Ветеринарна сбирка.-1989.-№8.-С.41-43.

43. Стефанов И. Иерсинии и йерсиниози по животните// Ветеринарна сбирка.-1989.-№7.-С. 39-40.

44. Тимченко Н.Ф. Генетико-биохимические механизмы патогенности бактерий и перспективы их изучения //Бюлл. АМН СССР, 1986, №4, с. 66-71.

45. Турова Т.П. Определение таксономического положения микроорганизмов с помощью метода гибридизации ДНК // Биологические науки, 1989, № 2, с. 26-28.

46. Хапцев З.Ю. Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных (микробиология).-Саратов-2000.

47. Хачатрян Т.С. Обсемененность овощей иерсиниями в условиях г. Еревана// Актуальные вопросы краевой инфекционной патологии.-Ереван, 1988.- Выпуск VIII.-C. 106-107;

48. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика // М, изд. «Мир», 1999, с.558.

49. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез-СПб:, 1992.-60с.

50. Ценева Г.Я. Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза- СПб:,1997.-62с.бб.Чан Т.В.Т. Гибридизация нуклеиновых кислот // В кн. Молекулярная клиническая диагност, методы, М., 1998, изд. «Мир», с. 374-394.

51. Черкасский Б.Л., Подунова Л.Г., Акулова Н.К. Пищевые зоонозы у людей в России. Пищевые зоонозы сальмонеллезы, кампилобактриоз, иерсиниозы, листериоз // Методы и средства диагностики, лечения и профилактики: Тез.докл.М., 1995.С. 18-19.

52. Шумилов К.В., Мельниченко Л.П., Селиверстов В.В./ Современные данные об иерсиниозе животных // Ветеринария.-1998.-N4.-C.7-13.

53. Шумилов К.В., Мельниченко Л.П., Селиверстов В.В. Современные данные об иерсиниозе животных//Ветеринария.-1998.-№4.-С. 7-13.

54. Ющенко Г.В. Антропогенная трансформация природных очагов иерсиниозов и особенности эпидемиологии// Тезисы докладов XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней, Новосибирск, 10-12 октября 1989.-С.144-145.

55. Ющенко Г.В. Род Yersinia// Энтеробактерии: (Руководство для врачей)/ Под ред. В.И. Покровского.- М.: Медицина, 1985,-Гл.З.-С. 220239.

56. Ющенко Г.В., Дунаев В.И. Методика выделения и идентификации Yersinia pseudotuberculosis и Y. enterocolitica// Лабораторное дело.-1980.-№6.-С. 367-370.

57. Ющенко Г.В., Некрасова Л.И. Псевдотуберкулез и иерсиниоз у людей в Архангельске// Актуальные вопросы инфекционной патологии -Саратов,1981.-С.54-55.

58. Ющук Н.Д., Кареткина Г.Н. Иерсиниоз// Советская медицина.-1987.-№ 9.-С.54-58.

59. Arends M.J. Identification of HPV: in situ hybridization or polymerase chain reaction //J.Pathol., 1991, v. 164, № 3, p. 191-193.

60. Arrand J. Preparation of nucleic acid probes: Nucleic acid hybridization: a practical approach // ED. By BD Hames, IRL Rpess, 1986, p. 40.

61. Asai Т., Zaporojets D., Squires C., Squires C.L. // An Escherichia coli strain with all chromosomal rRNA operons inactivated: Complete exchange of rRNA genes between bacteria // PNAS, 1996, v.96, p. 1971-1976.

62. Baker R.F. Binding of DNA to cellulose nitrate filters under denaturing conditions //Anal. Biochem, 1977, v.78, p. 569-571.

63. Berger С., Melchers F. In situ hybridization ofmRNA molecule in single cells // Annu rep, 1985, Basel Inst. Immunol, Basel, p. 1-10.

64. Bernet C., Carret M., de Barbeyrac B. Detection ofMycoplasma pneumoniae by Using the Polymerase chain Reaction // J.clin. Microbiol.-1989,-Vol. 27. N II.-p. 2492-2495.

65. Bevan I.S, Daw R.A., Day P.J.R., Ala F.A., Walker M.R. Polymerase chain reaction for detection of human cytomegalovirus infection in a blood donor population // Brit. J. Haematol., 1991, v.78, № 1, p. 94-99.

66. Bohm H., Karch H. DNA fingerprinting of Escherichia coli 0157.-H7 strains by pilsed-fild gel electroforesis //J. Clin. Microbiol., 1992, v.30, p.2169-2172.

67. Brechot C. Application du donare de 1 DNA du virus de 1 hepatite В pour le diagnostic des infection lines au virus de 1 hepatite В // Ann. Biol. Clin , 1985, №4, p. 351.

68. Brytting M, Sundgvist V.-A., Stahlhandske P., Linde A., Wahren B. Cytomegalovirus DNA detection of an immediate early protein gene with nested primer oligonucleotides // J. Virol. Meth., 1991, v. 32, № 2-3, p. 1127138.

69. Church R.B. Method for study of hybridization and reassociation of nucleic acids axtracted from cells of higher animals // In: Molecular techniques and approach in developmental biology, ed. by M. J. Chrispeels. N. Y., 1973, p. 223-301.

70. Conner C.P., Heithoff D.M., Julio S.M., Sinseheimer R.L., Mahan M.J. Differential papperns of acquired virulence genes distinguish Salmonella ctrains // PNAS, 1998, v.95, p.4641-4645.

71. Denhardt D.T. A membrane filter technique for the detection of complementery DNA // "Biochem. Biophys. Res. Commun", 1966, v.23, p. 641-646.

72. Ferenezy A. Latent papilomavirus and recurring genital warts // N. Engl. J. Mod., 1985, №14, p. 784.

73. Fukushima Iochi, Marugama Kenji, Omori Ichiro et al. Kontamination von Schweinen mit Yersinia im Schlachthaus// Fleischwirtschaft.-1990.-Vol. 70, №10.-P. 1330-1332.

74. Furowicz Antoni J., Czernomysy-Furowicz Danuta. Yersinia pseudotuberculosis infection in animals// Adv. Agr. Sci.-1996- Vol. 5, № 1.-P. 5-10

75. Gannon V. P., King R.K., Kim J.Y., Thomas EJ. Rapid and sensitive metod for detection of Shiga-like toxin-produsing Escherichia coli in ground beef using the polimerase chain reaction // Appl. Environ Microbiol, 1992; v.58, p.3809-3815.

76. Garrigue G., Poveda J.D., Carniel E. Yersinioses: Rappel bacteriologigue, epidemiologigue et clinigue. Etude de 8856 serologic en France// Feniel. Biol.-1993.-№ 190.- P. 25-28.

77. Gillespie D., Spiegelman S. A quantive assay for DNA-RNA hybrids with DNA-RNA immobilized on a membrane // J. Molecul. Biol., 1965, v. 12, p.829-842.

78. Gonul Sahika Aktug, Karapinar Mehmef. The microbiological guality of drinking water supplies of Izmir City: the incidence of Yersinia enterocolitica// Int. I. Food. Microbiol.- 1991.-Vol. 13, №1.-P. 69-73.

79. Haase A. Analysis of infections and pothological condition by in situ hybridization // DNA Probes: Appli. Genet and Infic. Disease and Cancer: Conf, Cold Spring Harbor. Apr. 20-23, 1986, Cold Spring. Harbor. N. Y., 1986, p. 113-118.

80. Haase A., Brahic M., Blum H. Detection of viral nucleic acids by in situ hybridization // Meth. Virol. Vol., Orlando c. a., 1984, p. 189-226.

81. Hashimoto Y., Itho Y., Fujinada Y., Khan A.Q., Sultana F., Miyake M., Hirose K., Yamamoto H., Ezaaki T. // Development of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella thyphimurium // J. Clin. Microbiol., 1995, v.33,p.775-777.

82. Hill W., Madden J. Foodbome enterotoxigenis Escherichia coli: detection and enumeration by DNA hybridization.// «Appl. and Enviro. Microbiol», 1983, №4, p.1324-1330.

83. Hill W., Payne A. Detection and enumeration of virulent Yersinia enterocalitica in food by DNA colony hybridization // Appl. F Environmental Microbiology, 1984, №4, p. 801-807.103. inflamation// Int. J. Tissue React.-1992.- Vol.- 16, №2.- P. 51-57.

84. Jakubczak Antoni, Plaff-Samoraj Aleksandra, Siemionen Jan et el. Wystepowanic pateczek z rodzaju Yersinia i zwierzat hodowlanych, domowych, drikow ozaz ryb pochodzacych z wojewodztwa Olstynskiego// Med. Weter.-1993.-Vol.49, №7.-P. 301-303.

85. Jakubczak Antoni, Simeonek Jan, Anusz Jbigniew Ocena testow na patogennosc szezepow Yersinia enterocolitica izolowanych od ludi i zwieri// Med. vet.-1992.-Vol. 48,№7.- P. 313-316.

86. Jeremic Svetlana, Veljavic L.J., Andelic D. Biochemical and serological characteristics of Yersinia ruckeri isolates whigh cause typical and alypical infections in californian trad (Onchorhynchus mykiss)// Acta vet.-1997-Vol. 47, №5-6.- P. 345-351.

87. Kacian D., Lawrence Т., Sanders M., Putnam J., Majlessi M., McDonough S., Ryder T. A rapid and sensitive chemiluminescent DNA probe system for detection of amplified HIV and HBV DNA // Fresenius J. Anal. Chem., 1990, v. 337, №1, p. 95.

88. Kaneuchi Choji, Shibata Masashi, Kawasaki Takako et al. Occurrence of Yersinia spp. in migratory birds, ducks, seaguels and swallows in Japan// Jap. J.vet. Sci.- 1989.-Vol 51,№4.- P. 805.

89. Karh H., Meyer Т. Evalution of oligonucleotide probes for identification of shiga-like-toxin-producing Esherichia coli // J. Clin Microbiol, 1998, v.27, p.1180-1186.

90. Kim H. et al. Applying of different methods for allocation DNA // J. of Food Sci., 1986, v. 5, № 3, p. 68-71.

91. Kim J., Nietfeldt J., Benson A.K. Octamer-based genome scanning distinguishes a unigue subpopulation of Escherichia coli 0157:H7 strains in cattle // Proc. Nail. Acad. Sci., USA, 1999, v. 96, Issue 23, p. 13288-13293.

92. Lanata C. Sensitivity and specifity of DNA probes with the stool blot technique for detection of Eschenchia coli enterotoxins.// "J. Infec. Diseases", 1985, №5, p. 1087-1090.

93. Lim J.K., Gunther N.W., Zhao H., Johnson D.E., Keay S.K., Mobley H.L.T. // In Vivo Phase Variation of Escherichia coli Type 1 Fimbrial Genes in Women with Urinary Tract Infection // Infection and immunity, 1998, v. 66, №7, p.3303-3310.

94. Louie M., de Azavedo J, Clarke R., Borczyk A., Lior H., Richter M., Brunton J. Sequence heterogeneity of the eae gene and detection of verotoxin-produsing Escherichia coli using serotype-specific primers // Epidemiol Infect; 1994, №112, p. 449-461.

95. Luk J.M., Kongmuang U., Trans R.S., Lindberg A.A. An enzyme-linked immunosorbent assay to detect PCR products of the rfbS gene from serogroup

96. D salmonellae: a rapid screening prototype // J. Clin. Microbiol., 1997, v.35, p.714-718.

97. Marmur J., Doty P. Heterogeneity in deoxyribonucleic acids. I. Dependens on composition of the configurational stbility of deoxyribonucleic acid // Nature, 1959, v. 183, p. 1427-1431.

98. Marmur J., Doty P. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acid. // J. Molecul. Biol., 1961, v.3, p.585-594.

99. Moseley S.L., Hyg J. Detection of enterotoxigen Esherichia coli by DNA colong hybridization // J. Infect, 1989, №6, p. 892-898.

100. Nataro J.P. Detection of an abherence factor of enteropathogenes Escherichia coli with a DNA probe // J. Infec. Diseases, 1985, №3, p.560-565.

101. Palva A. A gene in the detection of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae by nucleic acid sandwich hybridization // J. Clin. Microbiol., 1983, №1, p.92-100.

102. Pannwitz S. Roost H. Gehaufites Auftreten blutserologischer Brucellose-Reaktionen in einem Mastschweinebestand mit Yersinia- enterocolitica-Nachweis- Fallbericht//Tierarztl. Umsch.-2001.- Jg. 56,N 6.-S 306-314

103. Quaglio P., Aggazzotti G., Fabio A. et al. Presenza di batteri appartenenti al genere Yersinia in agna superficiali e di falda// Ann. ig.: Med. prev. comunita-1989.-Vol. l,№l-2.-P. 157-162.

104. Ramisse J., Manet G., Pellerin J. et. al. Biotypes de Yersinia retrouves dans des produits alimentaires. Des prelevements biologigues et des eaux//Microbiol., alim. nutr.- 1990.-Vol.8, №1.-P. 39-43.

105. Ranki M. Sandweich hybridization as a convmient method for detection ofnucleic acids in crude samples // Gene, 21, 1983, p. 77.

106. Rifai S., Barbancon V., Prevost G., Piemont Y. Staphylococcus aureus Synthetic exfoliative toxin A and В DNA probes for detecton of toxigenic Staphylococcus aureus strains // J. Clin. Microbiol., 1989, №3, p. 504-506.

107. Saebo A., Lassen J. Yersinia enterocolitica: An inducer of chronic inflomation // Int. J. Tissue React. Vol. 16, № 2. P. 51-57.

108. Saiki R. X., Chu-An Chang B.S., Levenson C.H., Warren T.C., Bochm C.D., Kazazian J.H., Erilch H.A. // New Eng. J. Mod. 1988. v. 391. p. 537-541.ft

109. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic ahalisis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, p. 6230-6234.

110. Stinson Stephen C. Identifying bacteria: looking for a fast track // Chem. and Eng. News, 1999-77, №13, p.36-38.

111. Vladik P., Prouza A. Naler Yersinia ruckeri u pstrohu duhovych v Ceskoslovensku// Vet. med.-1990.-Vol.35, №7.- P. 437-442.

112. Webb L., Carl M., Malloy D. et al. Detection of murine typhus infection in fleas by using the polymerase chain reaction// J. Clin. Micr.-1990.-Vol.28, N3.-P. 530-534.fe>

113. Wegmuller В., Luthy J., Candriau U. Direct polymerase chain reaction detection of Campylobacter jeuni and Campilobacter coli in raw milk and dairy products//Appl. Environ. Microbiol.- 1993.-V.59.-N 7.-P. 2161-2165.

114. Wright D.J., Chapman P.A., Siddons C.A. Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolating Escherichia coli 0157 from food samples // "Epidemiol infect", 1994, v. 113, p. 31-39.

115. Yesim Ozbas Z., Aykut Aytac S. Incidence of Yersinia enterocolitica in samples of pasteurized milk// Chem. microbiol. Technol. Lebensm.-1993.-Vol. 15, №5-6.-P 129-133.