Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат медицинских наук Кокорина, Галина Ивановна

• Кокорина, Галина Ивановна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Кокорина, Галина Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Клинические особенности проявлений псевдотуберкулеза в различных регионах мира. Роль отдельных генетических

детерминант патогенности в инфекционном процессе

Молекулярно-генетические методы определения детерминант

вирулентности

Классы специфических антител, их обнаружение у

экспериментальных животных и у больных иерсиниозами

Серологическая диагностика иерсиниозной инфекции на разных

стадиях заболевания

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Глава 1. Генотипическая характеристика штаммов Y. pseudotuberculosis,

выделенных в различных регионах мира

1.1. Детерминанты вирулентности, локализованные на плазмиде pVM82

1.2. Характеристика некоторых генетических детерминант вирулентности у представителей мировой популяции Y. pseudotuberculosis

1.3. Распространение штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов на мировой территории

1.4. Распространение штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территории России

1.5. Применение генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis в

эпидемиологической практике

Глава 2. Характеристика псевдотуберкулезной инфекции, вызванной

Y. pseudotuberculosis различных генотипов

Глава 3. Разработка варианта тест-системы для диагностики

иерсиниозов методом иммуноблота

3.1. Получение гипериммунных кроличьих сывороток

3.2. Разработка условий постановки метода иммуноблота

3.2.1. Приготовление блотовых стрипов с антигенами

3.2.2. Выявление специфических антител методом ИФА

3.2.3. Учет результатов

3.3. Характеристика диагностической ценности набора Иммуноблот (А)

в модельных опытах

3.3.1. Испытание лабораторного образца набора с кроличьей гипериммунной сывороткой

3.3.2. Результаты испытания набора в модельных опытах

3.4. Оценка диагностической эффективности набора Иммуноблот (А)

3.5. Применение метода иммуноблота для диагностики иерсиниозов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

Практические рекомендации

Персперктивы дальнейшей разработки темы

Список использованных сокращений

Список использованной литературы

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Псевдотуберкулез остается актуальной проблемой здравоохранения в России и во многих странах мира. Заболевание отличают выраженный полиморфизм клинических проявлений, отсуствие четких патогномоничных симптомов, склонность к затяжному и хроническому течению. Между тем причины, обуславливающие данное многообразие и сложность патогенеза остаются невыясненными.

Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В этой связи чрезвычайно актуально изучение роли генетических детерминант вирулентности бактерий Y. pseudotuberculosis и влияния их продуктов на течение инфекционного процесса, территориальное распространение болезни.

В отдельных работах предприняты попытки объяснить разнообразие клинических форм псевдотуберкулеза за счет наличия у возбудителя тех или иных детерминант вирулентности (Fukushima Н. et al., 2001; Carniel Е., 2001; Mollaret Н., 1990; Чеснокова М.В. и соавт., 2006). В то же время среди популяции возбудителя псевдотуберкулеза выявлены особенности циркуляции штаммов Y. pseudotuberculosis, содержащих уршА или «остров» высокой па-тогенности, связанные с географическими регионами (Fukushima Н. et al., 2001). Основные клинические симптомы инфекции, вызванной Y. pseudotuberculosis в России, Японии и Южной Корее разнообразнее и тяжелее, чем на Европейских территориях и характеризуются системными проявлениями болезни. Типичный для России симптомокомплекс псевдотуберкулеза получил название - дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (ДСЛ).

Открытие способности к синтезу суперантигена и установление его роли в патогенезе инфекции позволили пересмотреть механизм появления некоторых симптомов при псевдотуберкулезе. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит и синдром Кавасаки (Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al, 1986; BabaK. et al., 1991).

Хорошо изучен «остров» высокой патогенности Y. pseudotuberculosis, ответственный за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа. Считают, что он необходим для проявления высоковирулентного фенотипа возбудителя (Carniel Е., 2001).

Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), обнаруживаемая до настоящего времени у штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О: lb только в России, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia. Доказано, что наличие плазмиды pVM82 у возбудителя способствует более тяжелому течению инфекции (Шу-рыгина И.А., 2007). Однако, ее нуклеотидная последовательность до настоящего времени не расшифрована, равно как не исследовано её наличие у штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих в различных регионах мира.

Учитывая многообразие вариантов течения болезни, обусловленного различиями в патогенных свойствах возбудителя псевдотуберкулеза, для клинической практики актуально, прежде всего, изучение биологических характеристик штаммов Y. pseudotuberculosis циркулирующих на различных территориях. Вместе с тем для оптимизации мониторинга за возбудителем, а также выбора тактики обследования больных требуются наиболее полные знания о влиянии возбудителя псевдотуберкулеза с различным набором генетических детерминант вирулентности на особенности течения инфекции и совершенствование специфической диагностики заболевания.

Ограниченные возможности распознавания случаев заболевания иер-синиозами, в частности псевдотуберкулеза, на поздних сроках приводят к ги-

подиагностике, развитию хронических форм (до 30% случаев) и осложнений. Это обуславливает необходимость поиска новых, более чувствительных методов этиологической диагностики заболевания.

В связи с изложенным, представлялось актуальным изучение генетических характеристик штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и разработка набора для серологической диагностики иерсиниозов.

Степень разработанности темы исследования

Клинические особенности проявлений псевдотуберкулеза в различных регионах мира. Роль отдельных факторов вирулентности в инфекционном

процессе

Псевдотуберкулез, вызываемый Y. pseudotuberculosis, поражает человека и многие виды диких и сельскохозяйственных животных. Это заболевание широко распространено в мире, но более характерно для стран с холодным климатом. В России, Китае, Японии и Корее заболеваемость носит эпидемический и спорадический характер и регистрируется на высоком уровне, клинические проявления тяжелее, чем на американских и австралийском континентах, скандинавских и европейских странах, ряде южноазиатских стран, где заболевания чаще носят спорадический характер, а клинические проявления менее выражены [8, 21, 86].

С момента первого выделения псевдотуберкулезного микроба L. Malassez и V. Vingal в 1883 г. от морских свинок и до начала 50-х годов XX века у людей описано 30 случаев заболевания, среди которых только 12 являются бесспорно доказанными [32]. Как самостоятельная нозологическая форма псевдотуберкулез был признан после сообщения W. Кпарр и W. Masshoff в 1953 г. о группе мезентериальных лимфаденитов (наблюдаемых у детей с клиникой острого аппендицита) псевдотуберкулезной этиологии, то есть через 70 лет после открытия возбудителя [30].

Официально о первых случаях заболевания псевдотуберкулезом сообщил W. Knapp в 1958 в Великобритании. В Канаде псевдотуберкулез регистрируется с 1962 г. [148], в США - с 1969 г. [81]. Псевдотуберкулез описан в Бразилии [117], Новой Зеландии [108], Австралии [133], Швеции [49], Дании [43], Финляндии, Норвегии [83, 103, 139], Бельгии [116], Германии [102], Австрии [149], Франции [128, 122], Испании, Италии [156], Польше [144], Болгарии [129]. В этих странах у большей части пациентов заболевания протекали с клинической картиной мезаденита, аппендицита, реже гастроэнтерита, узловой эритемы [38]. Также псевдотуберкулез регистрируется в Прибалтике [125], Казахстане [25], Японии, Китае, Корее [86] и Иордании [47]. Можно утверждать, что псевдотуберкулез распространен повсеместно.

В России клинические проявления псевдотуберкулеза настолько кардинально отличаются от симптомов заболевания в европейских странах, что Знаменскому В.Н. и Вишнякову А.К. только в 1966-1967 гг. опытом самозаражения удалось доказать псевдотуберкулезную этиологию одного из наиболее часто встречающегося на российской территории симптомокомплекса псевдотуберкулеза, так называемой, дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (ДСЛ) [15, 16, 23]. Название этого заболевания указывает на его клиническое сходство со скарлатиной.

Многообразие клинических симптомов является причиной отсуствия единой классификации псевдотуберкулеза в России. Васильев C.B. с соавт. (1993) [5] приводит одну классификацию - Залмовера И.Ю. (1969), в ней различают следующие формы заболевания: генерализованную, абдоминальную, желтушную, артралгическую, скарлатиноподобную и катаральную. В монографии Бутяновой Н.Г. с соавт. (1991) приводится 12 классификаций, каждая из которых по своему актуальна, но в клинике обычно используется классификация Матковского B.C. (1977). [4, 24]. По основным клиническим проявлениям в ней различают генерализованную, абдоминальную, желтушную, артралгическую, скарлатиноподобную, смешанную, катаральную и стертую формы; по степени тяжести - тяжелое, средней тяжести и легкое течение

псевдотуберкулезной инфекции, которая может протекать с рецидивами или без.

Существуют классификации, общие для псевдотуберкулеза и иерси-ниоза. Так, Покровский В. И. и соавт. (1986) приводят такую классификацию клинических форм иерсиниозов: гастроинтестинальная (проявляется в виде гастроэнтерита, энтероколита или гастроэнтероколита), абдоминальная (проявляется в виде мезентериального лимфаденита, терминального илеита или острого аппендицита), генерализованная (смешанная, септическая, септико-пиемическая), вторично-очаговая (артрит, узловатая эритема, миокардит, гепатит, менингит, синдром Рейтара). Проявления псевдотуберкулеза и иерси-ниоза в остром периоде и исходы болезней имеют значительное сходство.

В течении заболевания псевдотуберкулезом выделяют несколько периодов: инкубационный (4-21 день), начальный (от нескольких часов до 5 дней), разгар болезни (3-10 дней и более), ремиссия (у 2/3 больных совпадает с периодом реконвалесценции), рецидивов и обострений, реконвалесцен-ции [26].

Начало заболевания чаще всего острое, с повышения температуры до 37,5 - 39,7 0 С. Наиболее часто встречаются симптомы интоксикации: общей слабости - 97,3%, лихорадки - 96,1%, головной боли - 92,5%; боли в суставах - 59,4%; гиперемии слизистой оболочки зева - 49,8%; боли в животе -33,4 - 71,4%, увеличения печени - 31,9 - 85%, артралгии - 14-97%, которые не являются патогмоничными [21, 28]. Может наблюдаться развитие конъюнктивита, аппендицита, терминального илеита, мезаденита, артрита, гепа-типа и т.д. Характерным для псевдотуберкулеза в России является отечно-гиперемический синдром, который проявляется в виде одутловатости и красноты кожи лица и шеи - симптом «капюшона»; кистей и стоп - симптом «перчаток» и «носков», бледного носогубного треугольника, зудом ладоней и подошв, сопровождающимся появлением экзантемы с последующим отрубе-видным шелушением. По литературным данным сыпь и симптом «перчаток» и «носков» наблюдались в 42, 3 - 85% случаев [26].

В европейских странах для проявлений псевдотуберкулеза наиболее характерно возникновение лихорадки и болей в животе, иногда тошноты и рвоты. Боли внизу живота справа могут привести к хирургической операции по удалению аппендикса. При вскрытии чаще всего оказывается, что червеобразный отросток не изменен, хотя наблюдается ярко выраженный мезенте-риальный аденит и/или острый терминальный илеит. У ослабленных больных, особенно с циррозом печени вследствие алкоголизма, или с гемохрома-тозами и другими заболеваниями печени, возбудитель псевдотуберкулеза имеет особенность распространяться из пищеварительного тракта в другие органы через кровь, вызывая при этом сепсис. В целом заболевания псевдотуберкулезом в европейских странах протекают легче, чем в России, Японии и Корее [61].

В большинстве случаев заболевание имеет благоприятный прогноз и заканчивается выздоровлением. Однако проблема затяжного и хронического течения болезни с вовлечением в процесс ряда органов и систем больного остается актуальной до настоящего времени [6, 11]. При этом формирование хронических заболеваний характерно после острой инфекции как псевдотуберкулезной, так и кишечноиерсиниозной этиологии, и на данном этапе практическому врачу нередко очень трудно или даже невозможно клинически проводить между ними дифференциальную диагностику. Так, среди взрослых больных Скандинавии и России высока частота артритов иерсини-озной этиологии (от 10 до 30%) [3, 88, 110]. Чаще поражаются суставы коленей и лодыжек, но могут вовлекаться другие, в частности, межфаланговые суставы рук и стоп. Нередко поражения суставов сопровождаются уретритом, конъюнктивитом (болезнь Рейтера) и встречаются у пациентов с артритом, обусловленным Yersinia, в 5 - 10% случаев; другие заболевания - увеит, ирит, конъюнктивит, гломерулонефрит, уретрит - выявляются реже [54]. Для иерсиниозов с хроническим течением наиболее характерно возникновение эритемы нодозум, хронического поражения желудочно-кишечного тракта [28, 88,31].

Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды, поэтому постоянно требуется изучение генетических детерминант вирулентности бактерий Y. pseudotuberculosis и влияния их продуктов на течение инфекционного процесса, территориальное распространение болезни.

Наиболее изученным из известных генетических детерминант вирулентности Yersinia является плазмида вирулентности иерсиний pYV 46 МДа (Plasmid associated with Yersinia virulence), обнаруженная у патогенных иерсиний: Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; у Y. pestis названа рСД1 (Calcium Dependence plasmid). Полагают, что основное значение в формировании патогенных свойств принадлежит плазмиде, которая кодирует белки наружной мембраны иерсиний Yops (Yersinia outer membrane proteins), способствующие подавлению фагоцитарной активности клеток иммунной системы макроорганизма, оказывающие воздействие на адгезию и инвазию бактерий. В таблице 1. приведены основные Yops иерсиний и их функции. При непосредственном взаимодействии с клетками макроорганизма Y. pseudotuberculosis осуществляет введение эффекторных молекул внутрь клеток лимфоидной ткани, используя при этом систему секреции III типа. Гены, ответственные за функционирование этой системы локализуются, главным образом, на плазмиде вирулентности. pYV 46 МДа определяется во всех свежевыделенных штаммах Y. pseudotuberculosis, и, по ее присутствию дифференцируют патогенные иерсинии от не патогенных [55, 71, 72, 86]. При культивировании in vitro, особенно, при 37 °С Y. pseudotuberculosis может утрачивать эту плазмиду [84].

«Остров» высокой патогенности HPI (High Pathogenicity Island), ответственный за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа, расположен на хромосоме. Впервые «остров» высокой патогенности HPI обнаружен у бактерий рода Yersinia. Его размер у Y. pseudotuberculosis составляет 36 kb. HPI состоит из 2-х частей: правой консервативной части R-HPI

Таблица 1. Белки наружной мембраны иерсиний и их функции

Факторы вирулентности Функция Гены Оптимальная температура экспрессии, °С Молекулярная масса, кДа

Уаё А Ведущий адгезин иерсиний уас1 А 37 45

Белки-эффекторы - направляются внутрь клетки-мишени (Уор5)

УорЕ Цитотоксин, блокирунт деление клеток макроорганизма уор Е 37 23

УорН Тирозинфосфатаза, инги-бирует фагоцитоз уор Н 37 51

Урк А/Уор О Протеинкиназа, проявляет цитотоксическую активность, приводит к морфологическим изменениям клеток уркА /уор О 37 81,7

Уор 1/Уор Р Апоптоз клеток лимфо-идной ткани уор Д/уор Р 37 31-32,5

УорТ Цитотоксин, приводит к изменению цитоскелета уорТ 37 35,5

УорМ Ингибирует активность тромбоцитов уор М 37 41,6 (56,9)

Белки, необходимы для переноса эффекторов

Уор В Контактный гемолизин; супрессирует фактор некроза опухоли Оперон 1сЮУ эус В уор ВБ 37 41,745/41,942

Уор Б Участвует в переносе белков-эффекторов 37 33,357/33,234

ЬсгУ (V антиген) Контакт с рецептором клетки-мишени, иммуно-супрессия Оперон 1сЮУ8ус-БуорВВ 37 37

Белки аппарата секреции III типа (более 20) УБС 37

Белки, контролирующие перенос эффекторов

Уор Ы/ЬсгЕ уор N 37 32,6

Туе А 1уе А 37 10,8

ЬсЮ 1сЮ 37 11

Уор К/Уор уор регулон 37

(«Yersiniabactin locus») и «нестабильной» левой части размером 9 kb. Yersiniabactin локус состоит из 11 генов, организованных в четыре оперона. По выполняемым функциям они разделены на 3 группы, отвечающие за биосинтез иерсиниабактина, образование рецептора в наружной мембране для иерсиниабактин-опосредованной транспортировки железа внутрь клетки и регуляцию этой системы. Одним из регуляторов экспрессии yersiniabactin локуса является ген irp2, он находится в правой части HPI, необходим для проявления высоковирулентного фенотипа. Ген fyuA участвует в образовании рецептора. Большинство генов, локализованных на HPI участвуют в сидерофор опосредованном захвате железа [60]. Считают, что HPI может быть спонтанно утерян из хромосомы [111].

Показано, что полный «остров» патогенности присутствует у штаммов Y .pseudotuberculosis серотипа 0:1, в то время как R-HPI характерен для штаммов серотипа ОЗ [56, 130]. Обнаружены, главным образом, европейские штаммы Y.pseudotuberculosis серотипов 0:1а и -lb, несущие полный HPI [87]. Такие клинические штаммы обуславливают псевдотуберкулез с гастроинте-стинальными симптомами, с диссеминацией возбудителя из пищеварительного тракта в кровяное русло, и вызывают нередко тяжелое течение болезни. При введении мышам такие штаммы вызывают летальность в низких дозах. Клинические штаммы из того же региона серотипов 0:2, -4, -5 и -6, но без HPI выделены от больных с легкой кишечной инфекцией и не летальны для мышей в низких дозах [46, 60, 87]. Штаммы всех 3-х биотипов Y. pestis содержат HPI, в то время как у штаммов Y. enterocolitica он определен только среди штаммов высокопатогенного биотипа 1В [74]. В настоящее время HPI обнаруживают среди многих видов энтеробактерий: у штаммов Escherichia coli, разных видов Klebsiella, Salmonella enterica и других [48, 104, 105].

Другим фактором патогенности хромосомной природы являются гены суперантигена, ответственные за синтез суператигена YPMs, названного -суперантигенный токсин Y. pseudotuberculosis (Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen) [41, 119, 120]. До открытия YPMs у Y. pseudotuberculosis полагали,

что бактериальные суперантигены (стафилококковый энтеротоксин, стрептококковый пиогенный экзотоксин и другие) экспрессировались только грам-положительными бактериями или Mycolasma artritidis. Было показано, что уровень гомологии между YPMs и токсинами этих бактерий достаточно низкий и исследователи пришли к выводу, что был открыт новый тип суперантигенов у первой грамнегативной бактерии [61]. Тем, что суперантигенный токсин синтезируют как Y. pseudotuberculosis так и Streptococcuc pyogenes (возбудитель скарлатины) - объясняется некоторая схожесть клинических проявлений этих заболеваний и необходимость проведения между ними дифференциальной диагностики.

Впервые штаммы возбудителя псевдотуберкулеза, продуцирующие этот токсин были выделены от пациентов с симптомами синдрома Кавазаки и от больных из вспышки псевдотуберкулеза в Японии [41, 152]. Суперантигенный токсин Y.pseudotuberculosis имеет 3 варианта a, b и с, которые кодируют соответствующие гены [131]. Ген уршВ на 88,9% гомологичен ypmA, а YPMa (молекулярный вес 14,5 кДа) имеет 83% гомологии с YPMb. Ген уртС отличается от ypmA на один нуклеотид [61].

Хорошо изучено воздействие YPMa на макроорганизм: стимулирует поли-клональную активацию Т-лимфоцитов (СД4+, СД8+). При этом во взаимодействие вовлекаются от 10 до 40% всех лимфоцитов. Это ведет к неуправляемой гиперпродукции цитокинов, таких как IL-2, TNF-a, IFN-y, что может вызвать синдром токсического шока [22, 101]. Было показано, что введение мышам, предварительно сенсибилизированным D-галактозамином, YPMa вызывает летальный шок. Развитие шока блокируется введением монокло-нальных антител к CD4+, TNFa и IFNy. [121, 63]. И, хотя токсический шок обычно не наблюдается у пациентов с псевдотуберкулезом, но эти экспериментальные данные показывают токсичность YPMa in vivo и потенциальные вирулентные свойства суперантигенного токсина Y. pseudotuberculosis. Другие варианты суперантигена также обладают супеантигенной активностью [61].

При исследовании 225 штаммов Y. enterocolitica и нескольких штаммов возбудителя чумы - YPMs не обнаружен [61].

Показано, что почти все клинические штаммы Y. pseudotuberculosis -95%, выделенные в Дальневосточной Азии, содержат уршА. Клинические симптомы заболевания псевдотуберкулезом на этих территориях сходны с проявлениями ДСЛ. В то же время уртВ и уртС гены были обнаружены, главным образом, у изолятов от животных и из окружающей среды [41, 64, 87]. В настоящее время высказывают предположение о том, что штаммы, обладающие геном уртВ, непатогенны и относятся к недавно открытому виду - Y. similis. [49, 140]. В проведенных ранее исследованиях выдвинута гипотеза об ассоциации генов YAPI и суперантигена [69].

Адгезивный «остров» патогенности иерсиний - YAPI (Yersinia Adhesion Pathogenicity Island), размером 98 kb, локализован на хромосоме Y. pseudotuberculosis. Он состоит из консервативной левой части, в которую входит pil локус, и правой части с метаболическими генами, в том числе содержит ген api74. Правая часть отсуствовала у некоторых штаммов этого вида, тогда как левую часть определяли у всех YAPI - позитивных штаммов, pil локус, размером 11 kb, кодирует пили IV типа - филаментозные структуры, отходящие от поверхности бактериальной клетки, короче и многочисленнее жгутиков[68]. Пили IV типа обнаружены у некоторых грамнегативных бактерий (энтеропатогенная Escherichia coli, Salmonella enterica и Vibrio cholerae) [40, 46, 50, 112, 155]. Эти структуры участвуют в клеточной адгезии на пейе-ровых бляшках [115], бактериофагальной адсорбции, плазмидном переносе [100, 106], формируют флагелин - независимую подвижность бактерии [118, 143]. При попадании в пищеварительный тракт пили помогают бактерии колонизировать клетки кишечника. Показано, что инактивация генов pil локуса приводит к уменьшению вирулентности Y. pseudotuberculosis для мышей при введении бактерий орально [67].

YAPI не обнаружен в геноме генетически близкородственного вида - у штаммов Y. pestis, тогда как его гомолог у Y. enterocolitica находится на хромосоме [67].

Не все штаммы Y. pseudotuberculosis несут YAPI, а его присуствие не зависит от серотипа штамма [67]. Клинические проявления у больных псевдотуберкулезом, от которых выделены штаммы Y.pseudotuberculosis с YAPI мало изучены.

До настоящего времени роль плазмиды pVM82 - плазмиды с мол. массой 82 МДа остается недостаточно выясненной. Последовательность нуклео-тидов не расшифрована. Показано на экспериментальных моделях, что штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие плазмиду pVM82 оказывают антифагоцитарное и иммуносупрессивное действие, однако механизм его в настоящее время не ясен [14, 10, 35, 37]. Гинзбург A. JI. и соавт. (1988) полагает, что угнетение иммунитета связано с модификацией соответствующих антигенов в результате действия продуктов, кодируемых pVM82. Следствием этого может быть антигенная мимикрия, приводящая к появлению структурного подобия бактериальных антигенов с антигенами организма хозяина, либо эта модификация может нарушать процесс приведения антигенов к имму-ногенной форме, доступной для Т и В лимфоцитов.

Продукты, кодируемые pVM82 могут оказывать влияние непосредственно на взаимодействие Т и В лимфоцитов. В то же время утрата плазмиды не влияет на способность микроорганизмов вызывать летальную инфекцию у мышей [7]. Показано также, что Y. pseudotuberculosis с плазмидами pYV 46 МДа и pVM82, по сравнению с Y. pseudotuberculosis, содержащей только pYV 46 МДа, вызывает угнетение продукции иммуноцитокинов. Увеличивается уровень интерлейкина-1, интерлейкина-6, усиливается выработка TNF -а, который обладает тканеповреждающим действием. Таким образом, активизация фагоцитов носит негативный характер, приводя к несбалансированной продукции иммуноцитокинов. Это ведет к состоянию иммунологической недостаточности, которая проявляется преобладанием генерализованных

форм псевдотуберкулеза и более тяжелым течением заболевания. Двухплаз-мидные штаммы, содержащие плазмиды pYV 46 МДа и pVM82 ингибирова-ли «окислительный взрыв», угнетали бактерицидную способность лимфоцитов [14].

Шубин Ф.Н. с соавт. (1997) уделяет особое место плазмидной характеристике штаммов при изучении вспышек и спорадической заболеваемости псевдотуберкулезом, указывая на роль плазмиды pVM82 в формировании более серьезных эпидемиологических осложнений [36], хотя при проведении более поздних исследований установлено, что наличие плазмиды pVM82 у штаммов Y .pseudotuberculosis не оказывает влияние на интенсивность эпидемического процесса [33].

Показано, что штаммы Y. pseudotuberculosis, обладающие плазмидами pVM82 и pYV 46 МДа, по сравнению со штаммами, несущими только pYV 46 МДа, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза, приводя к развитию более выраженных симптомов интоксикации, частому вовлечению в процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, возникновению арт-ралгий и артритов[39]. Однако вывод о роли pVM82 в проявлении клинических симптомов нельзя считать окончательным, поскольку у изученных штаммов не определяли YAPI.

Ряд исследователей считают, что плазмида pVM82 встречается у Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и не определяется у других генетически близкородственных видов Yersinia. Она широко распространена среди штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в Сибири, 60,8% штаммов [33].

Таким образом, приведенные материалы свидетельствуют о связи генетических детерминант вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis с клиническими проявлениями заболевания псевдотуберкулезом.

Молекулярно-генетические методы определения детерминант вирулентности иерсиний Определение родства штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от грызунов (источник инфекции), пищевых продуктов, объектов внешней среды (фактор передачи) и больных людей, определение циркуляции штаммов в мировой популяции Y. pseudotuberculosis, являются основной задачей эпидемиологического надзора, основу которого составляет микробиологический мониторинг за иерсиниозами. Определение факторов вирулентности у возбудителей псевдотуберкулеза позволяет установить клиническое разнообразие инфекции на территории ее распространения, а также помогает понять патогенез инфекции. До недавнего времени такая штаммовая дифференциация (внутривидовое типирование) в основном строилась на выявлении феноти-пических признаков - ферментативной активности, серо- и фаговариантно-сти, бактериоциногении. Для псевдотуберкулезного микроба такие дифференциации ограничивались преимущественно типированием 21, известного на данный момент, серотипа. В последние годы проводят также так называемое серогенотипирование, то есть с помощью мультиплексной ПЦР определяют О-серотип штамма бактерии [52]. Хотя метод серотипирования наиболее приемлем для практических целей, он не позволяет выявить различия близкородственных штаммов одного сероварианта. Гораздо большую разрешающую способность и специфичность имеют генетические методы маркирования [38].

В 2001 г. Fukushima и соавт. изучили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) распространение таких известных на тот момент генетических детерминант вирулентности, как: pYV 46 МДа, урш и HPI [87]. Известно, что принцип метода ПЦР основан на многократном (по числу циклов) удвоении определенного участка ДНК на термоциклере, при этом специфическая амплификация нуклеиновых кислот инициируется синтетическими оли-гонуклеотидными праймерами [147]. В ходе реакции определяют участок гена, кодирующего фактор вирулентности. Так как гены суперантигена имеют

3 аллели: ypmA, ypmB и уртС; а «остров» высокой патогенности может быть полный (HPI) или с утраченной левой нестабильной частью (R-HPI) - эти факты были учтены при подборе праймеров для постановки реакций при исследовании 2235 изолятов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории всех континентов, в том числе 110 штаммов из дальневосточных территорий России. Возбудители псевдотуберкулеза изолированы от больных людей, млекопитающих, птиц, рыб, с поверхности овощей, из почвы и воды. Штаммы Y. pseudotuberculosis были разделены на 6 генетических групп по содержанию генетических детерминант вирулентности, причем автор предпринял попытку описать клинические проявления, обусловленные штаммами каждой группы. В первую группу, содержащую патогенный тип бактерий, включены штаммы ypmA+HPI+, серотипов О:lb, -3, -5а, -5Ь и несколько нетипируемых штаммов, все они изолированы на территориях Дальнего Востока. Клинические проявления псевдотуберкулеза, вызываемого этими штаммами требовали уточнения. Во вторую группу вошли штаммы Y. pseudotuberculosis ypm" НР1+, серотипов О:la и -lb; отнесенные к европейскому гастроэнтеральному патогенному типу. Клинические штаммы из этой группы были выделены от больных псевдотуберкулезом с проявлениями, характерными для Европы: лихорадка, гастроэнтеральные симптомы, мезаденит. Третья группа включала штаммы уршА+НРГсеротипов О: lb, -2а, -2Ь, -2с. -3, -4а, -4b,-5a, -5Ь, -6, -10 и нетипируемые штаммы. Эта группа получила название - дальневосточный системный патогенный тип бактерий, штаммы из этой группы обуславливают псевдотуберкулез с чертами ДСЛ, распространены, главным образом на Дальнем Востоке. Четвертая группа представляет непатогенный тип Y. pseudotuberculosis, штаммы из нее содержат только YPMb+ и относятся к серотипам 0:1Ь, -5а, -5Ь, -6, -7, -9, -10, -11, -12; были выделены от животных или из окружающей среды на территориях Дальнего Востока. В настоящее время штаммы не ферментирующие мелибиозу, входившие в эту группу, относят к недавно описанному виду Y. similis, для человека не патогенной [109, 140]. Пятая группа состояла из штаммов YPMc+R-HPI+, серотипа 0:3. Назва-

на - европейский низкопатогенный тип, так как распространена в основном на Западе. Штаммы выделяли в 98% случаев от животных, клинические проявления у больных требуют уточнения. По данным других авторов штаммы из этой группы вызывали у животных кишечные заболевания и аборты [114]. И последняя, 6 группа, состояла из штаммов НРГурш" 15-ти различных серо-типов, не содержащих ни один из исследуемых факторов вирулентности, кроме pYV 46 МДа в 50% случаев. Группа названа патогенной, однако роль штаммов в проявлениях заболевания требует уточнения. Штаммы выделяли в основном от животных и из окружающей среды.

Таким образом, большинство штаммов разделено на два основных клона: ypm"HPI+ - европейский гастроэнтеральный патогенный тип и ypmA+HPI* - дальневосточный тип (заболевания с симптомами ДСЛ). Установлено также, что у штаммов существует прямая связь с географическим положением стран, где они выделены: третья группа штаммов уршА+НРГ доминирует в России, Японии, Корее; вторая урш"НР1+ - в Европе, Австралии и Северной Америке. Выдвинуто предположение о происхождении этих штаммов -уртА+НРГ - Дальний Восток; ypm"HPI+ - европейские территории. Также существует мнение, что те несколько штаммов европейского типа, обнаруженные на территории Дальнего Востока могли быть туда завезены между 1700и 1800 гг. с зараженным мясом животных, также как патогенная Y. enterocoliti-са в 1970 г. попала в Японию с зараженной европейской свининой и говядиной [85].

В 2006 г. Чеснокова М. В. и соавт. провели типирование штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в Сибири, по наличию генов HPI, суперантигена и плазмидному спектру методом ПЦР [33]. Выделена доминирующая группа штаммов для территорий Сибири - ypmA+HPTpYV+pVM82+, серотипа О:lb. Однако в этих исследованиях не учитывался YAPI.

Использование факторов вирулентности как эпидемиологических маркеров позволило определить разнородность циркулирующих штаммов одного серологического варианта. Полученные результаты продемонстрировали

полезность использования генотипирования выделенных культур по наличию генетических детерминант вирулентности для установления их роли в разнообразной клинической симптоматике псевдотуберкулеза.

Принцип метода дот - блот гибридизации основывается на прямом нанесении растворов нуклеиновых кислот на фильтр (дот-блот), затем их гибридизации с ДНК- или РНК-зондами, имеющими метку. Традиционно для получения зондов используют радиоактивно меченые с помощью 32Р, 35 8, 1251 нуклеотиды, которые после гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью выявляют методом радиоавтографии. Однако большинство этих изотопов имеют малый период полураспада, что влечет за собой необходимость частого приготовления зондов. Кроме того, работа с радиоизотопами требует соблюдения строгих мер безопасности, а мероприятия по захоронению радиоактивных отходов дороги. Поиски эффективных нерадиоактивных маркеров для мечения зондов привели к созданию как минимум 2-х меток: на основе биотина и дигоксигенина. Некоторые авторы, однако, считают, что неизотопные методы не обеспечивают столь высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости результатов, как изотопные [34].

В основе большинства методов нерадиоактивного мечения лежат ферментативные реакции с участием нуклеозидтрифосфатов, ковалентно связанных с молекулой-свидетелем (обычно биотином). После гибридизации зонды выявляют с помощью системы на основе авидина и стрептавидина или с помощью конъюгированных с флуоресцентным красителем или ферментом антител к зонду. Использование в качестве метки дигоксигенина, по-видимому, обеспечивает большую специфичность и воспроизводимость, а чувствительность метода близка к таковой для случая радиоактивно меченых зондов [34, 53].

Дот - блот гибридизация дает простой ответ по типу да - нет и особенно полезна в тех случаях, когда проводится анализ большого числа образцов. Метод позволяет выявить аномальные (измененные или экзогенные) нуклео-тидные последовательности в любом клиническом образце, из которого

можно выделить нуклеиновые кислоты, к примеру изучение мутаций в гене ретинобластомы. Также метод позволяет выявлять участки геномной ДНК бактерий и вирусов с помощью ДНК-блотов или соответствующие РНК-транскрипты с помощью РНК-блотов [34, 157]. В результате чего была предложена схема определения патогенных У. еп1егосо1Шса с помощью РНК-зондов методом дот-блот гибридизации [82].

Для определения первичной нуклеотидной последовательности генов или генома в целом проводят секвенирование ДНК. В настоящее время для стандартного секвенирования генов обычно применяют классический метод, разработанный Сэнгером и соавт. с дезоксинуклеозидтрифосфатами (сШЫТР). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР. В основе метода, называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежит принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченые терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченых терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сик-венсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде [9].

Известные методы секвенирования позволяют обрабатывать только сравнительно небольшие фрагменты ДНК. Новая, более простая и дешевая методика секвенированиядлинной геномной ДНК посредством разрезания ее на мелкие фрагменты с последующим их обычным секвенированием и финальным сопоставлением всех анализируемых участков молекулы ДНК в единую геномную карту организма называется методикой «дробовика» (Shotgun sequencing) [44].

Для определения некоторых генов вирулентности исследователи пользуются методом секвенирования участков ДНК, несмотря на его относительную дороговизну. Так, для дифференциации генов уршА и ypmC Fukushima и соавт. (2001 г.) применил метод секвенирования, так как нуклеотидные последовательности этих генов, как было установлено ранее [64], отличаются на один нуклеотид, и, следовательно, такие методы как ПЦР или ДНК гибридизация обладают недостаточной чувствительностью для их дифференциации.

В настоящее время расшифрована последовательность полного генома трех штаммов Y. pseudotuberculosis: штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 серотипа Olb, выделенного от больного псевдотуберкулезом человека, с симптомами заболевания, характерными для Европы; штамма Y. pseudotuberculosis РВ1Л серотипа 0:1b и штамма Y. pseudotuberculosis YPIII серотипа 0:3 [65, 46]. Нуклеотидные последовательности этих штаммов можно найти в GenBank и использовать для сравнения с геномами других штаммов.

Краткая характеристика молекулярно-генетических методов, применяемых для внутривидового типирования штаммов Y. pseudotuberculosis по наличию генетических детерминант вирулентности, дает представление о новых информативных возможностях «молекулярной эпидемиологии» - определение ареала возбудителя, его клоновой структуры, генетического родства между штаммами из различных источников.

Классы специфических антител, их обнаружение у экспериментальных животных и у больных иерсиниозом Гуморальный ответ на иерсиниозную инфекцию. В исследованиях, проведенных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), у больных или переболевших иерсиниозной инфекцией теплокровных и человека обнаруживаются антитела А, М, и в. Было установлено, что определяют в течении 1-го - 3-х месяцев от начала заболевания, что свидетельствует о наличии острой инфекции; ^О регистрируют до 5-14 месяцев от начала заболевания. Отмечены особенности динамики 1§А: так, у пациентов с артритом, вызванным иерсиниями, их обнаруживали в период до 9-ти - 14-ти месяцев от начала заболевания, а при отсуствии артрита - только первые 3 месяца [70, 73, 89, 142]. У больных с иерсиниозным увеитом присуствие в сыворотке расценивали как наличие острой или персистентной (латентной) инфекции [73, 96]. Для доказательства персистенции возбудителя в организме человека были проведены специальные исследования. Так, при обследовании 10 больных с хроническим течением иерсиниозной инфекции (ХИ), подтвержденной выделением культуры и/или наличием высоких титров антител (в остром периоде), у 9-ти больных с помощью иммуноблота определяли ^А и взаимодействующие по крайней мере с 2 ассоциировавши с вирулентностью белками с мол. массой 36 и 46 кДа, а у одного Полученные данные позволили авторам сделать вывод, что длительная продукция ^А свидетельствует о постоянной стимуляции лимфоидной ткани персистирующими вирулентными иерсиниями, особенно, если учесть, что период полураспада ^А равен нескольким дням. Это предположение было подтверждено при проведении непрямой реакции иммунофлуоресценции с О-специфической антисывороткой и при биопсии [97]. В таблице 2. представлены данные, обобщающие результаты проведенных ранее исследований.

Таким образом, можно полагать, что при наличии инфекции в острой фазе заболевания в сыворотке крови определяются 1§М, и/или 1^А; при хроническом течение иерсиниозов - и/или ^А.

Позднее НеБеешап и соавт. (1998 г.) на кроличьей модели с помощью иммуноблота установил, что на белки У. егйегосоНйса, кодируемые плазми-дой, на 6-ой день после иммунизации индуцируются и 1§А, которые он определял до 5-ти - 7-ми и 8-ми - 10-ти месяцев соответственно; обнаруживал на 9-й день и определял в течении года от начала инфицирования [94].

Таблица 2. Сроки обнаружения иммуноглобулинов при иерсиниозной инфекции

Иммуноглобулины

1§М 1§А 1ВС

Появление от начала заболевания (дни) 6 6 9

Длительность обнаружения (месяцы) 5-7 3 без артрита 9-14 с артритом 5-15

С помощью иммуноблота установлено также, что при заражении двух групп кроликов вирулентным (1-я группа) и авирулентным (2-я группа) штаммами У.еп1егосо1Шса 0:3, в обоих случаях обнаруживали [94]. При этом мажорные полосы и более продолжительный иммунный ответ на цельно-клеточный лизат регистрировали у кроликов, иммунизированных вирулентным штаммом. Антитела к белкам, кодируемым рУУ 46 МДа, в сыворотках кроликов 2-й группы не регистрировали. После реинфицирования этих же кроликов вирулентным штаммом У.еп1егосо1Шса 0:3 спустя 14 месяцев наблюдали иммунный ответ в обеих группах. Нарастание уровня на белки, кодируемые рУУ 46 МДа отмечали у кроликов из 1 -й группы, а у кроликов из 2-й группы выявляли 1§М, 1§А, а затем и что свидетельствует о важной роли УорБ в инфекционном процессе. Ряд работ, выполненных в по-

следующем, подтверждают роль белков наружной мембраны иерсиний как антигенов, являющихся триггером для иммунной системы, играющих важную роль в патогенезе инфекции. Так, 81аЫЬе^ и соавт., проводя иммуноб-лот с сыворотками крови больных, переболевших иерсиниозом, регистрировал антительный ответ против ряда УорБ [141]. При этом иммунодоминант-ными являлись белки с мол. массой 26; 34; 45, 52,5 кДа. связывался с белками с мол. массой 26 и 45 кДа; 26; 34 и 52,5 кДа; с белками с мол. массой 26; 34; 45 и 52,5 кДа, причем последние взаимодействовали активнее, чем другие иммуноглобулины. И. В. Малов (1994 г.) также указывал на диагностическое значение белка с мол. массой 26 кДа при псевдотуберкулезной инфекции [20].

Испанские исследователи изучали иммунный ответ на заражение кроликов У.ег^егосоШюа 0:9 рУУ+, вводя им антиген внутривенно или через рот [80]. С помощью иммуноблота были определены к мажорным белкам с мол. массой 51кДа (Уор Н) и 41кДа (ЬсгУ) в двух группах кроликов, однако только у животных, зараженных через рот, определялись к кодируемым плазмидой белкам с мол. массой 35кДа (Уор Ы) и 20кДа(Уор С>). С помощью ИФА к УорН определяли количественно, при этом наибольший уровень регистрировали на 2-3 неделе от начала заболевания, а затем наблюдали его прогрессивное снижение.

Помимо Уор б, исследовали формирование антител на другие антигены белковой природы. Японские исследователи показали важную роль суперантигена (УРМ) У. рзеиёоШЬегсиП818 в патогенезе иерсиниозной инфекции [42]. При острой инфекции у 20 (61%) из 33 больных были обнаружены ^О к УРМ. При этом отмечено, что у больных с системными поражениями, такими как лимфоаденопатия, ренальная дизфункция, артрит уровни обнаружены в более высоких значениях, чем у пациентов с гастроэнтестинальными проявлениями. Авторы указывают на возможное влияние суперантигена на тяжесть течения заболевания.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что при иерсиниозной инфекции в организме человека и животных вырабатываются антитела к широкому спектру антигенов, среди которых иммунодоминант-ными являются белки с мол. массой 25-26, 36-37, 45-47 и 58 кДа [20, 75, 93, 123, 142]. Доказано, что бактерии рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis и Y. еп-terocolitica) обладают сходными антигенными детерминантами, а антитела к Yops этих видов иерсиний перекрестно взаимодействуют в иммуноблоте с белковыми антигенами [93].

Гуморальный ответ при затяжном и хроническом течении иерсиниозов. Под затяжным течением иерсиниозов (ЗИ) понимают продолжение заболевания от 3 до 6-ти месяцев, под хроническим течением - больше 6-ти месяцев [19]. Затяжное течение иерсиниозов формируется после острого периода у 518% больных и чаще всего проявляется в виде реактивного артрита, миоак-рдита, длительного лихорадочного состояния, затяжного гастроэнтероколита, синдрома Рейтара, увеита и т. д. [138]. При остром, затяжном и хроническом течении псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза у больных людей и животных в сыворотке крови выявляется спектр антител к различным антигенам возбудителей, таблица 3.

Видно, что антитела трех классов взаимодействовали с различными антигенами Y. pseudotuberculosis и Y .enterocolitica. При этом значительно лучше изучен иммунный ответ на заражение Y. enterocolitica. Полагают, что антигены с мол. массой 19, 26, 34, 36, 46, 52,5 кДа оказывают воздействие на формирование реактивного артрита [45, 97, 141].

В одной из работ показано, что у больных с реактивным артритом, ассоциированным с иерсиниями не определили каких либо дополнительных белков, вовлеченных в иммунный ответ, в то время как связывающиеся с IgA антигены с мол.массой 26; 34 и 52,2 кДа имели тенденцию обнаруживаться при длительной персистенции возбудителя у таких больных [141].

Appel Н. и соавт. (1999) при изучении гуморального иммунного ответа на биохимически очищенный белок 19 кДа (уреазная субъединица

Таблица 3. Спектр антител к иерсиниям в сыворотках людей и животных

Источник Антитела Белки У.р8еиёоШЬегси1о818 (мол. масса, кДа) Белки У. е^егосоШюа (мол. масса, кДа)

Острое и затяжное течение инфекции

Люди 1§М 25 [13], 26 [141], 36, 38[13], 45 [141], 46, 58[13]

18А 25, 36[13] 25 [13], 26, 34 [141], 36, 38 [13], 52,5 [141]. артрит: 19 [42]

22, 26, 33, 37, 45, 59, 67 [20] 14 [141], 25 [13], 26, 28, 33, 34, 35 [141], 36, 38 [13], 45 [141], 46 [13], 50, 52,5 [141], 58 [13], 63 [141]

Животные 1ёМ, 20 УорС>, 35 УорИ [80], 35,5 [75], 41ЬсгУ, 51 УорН [80], НБРбО [154], 60 [154] артрит: 33-36, 63, 76, 88 [42]; Уас1А [113], 54, 66 [45]

Хроническое течение инфекции

Люди 1§А 23УорЕ, 33 УорЫ, 35УорБ, 35УорБ, 41УорВ, 44 УорМ, 51 УорН [66] артрит: 19 [42], 26, 34 [141], 36, 46 [97], 52,5 [141]

ДО 14 [141], 23УорЕ(34), 25 [13], 26, 28 [141], 33 [141, 142], 34 [141], 36 [13, 141], 37 ЬсгУ [51], 38 [13], 41УорВ, 44 УорМ [66], 45 [141], 46 [13, 66], 50, 52,5 [141], 58 [13], 63 [141]

У. егИ:егосо1Шса) у больных реактивным артритом, возникшим после заболевания, вызванного У. еп1;госо1Шса 0:3, показал, что 93% и 56% ^А связывались с этим белком. Авторы считают, что этот белок участвует в возникновении реактивного артрита и рекомендуют его определение при скрининге данной патологии [45].

При моделировали реактивного артрита в опытах на хомяках, инфицированных У. егЛегосоНйса 0:8, с помощью реакции иммунофлуоресценции бактериальные антигены обнаруживали в суставе с последующей регистрацией антител в сыворотке крови, взятой на 26 день от начала заболевания, при отсутствии высева У.еггёегосоНйса из синовиальной жидкости [77]. Автором также были обнаружены антитела к антигенам с мол. массой 66 и 54 кДа. В другой работе при моделировании реактивного артрита на животных обнаружили иммуноглобулины к белкам с мол. массой 88, 76, и 33-36 кДа [76].

При изучении вероятной связи иерсиниозной инфекции с развитием переднего увеита было показано, что антитела к антигенам с мол. массой 36 и 27 кДа У. еп1егосо1Шса определяются чаще у пациентов с увеитом, чем в контрольной группе [58].

Другие авторы показали, что антитела к белку теплового шока У. еп1егосо1Шса НЭРбО, обнаруженные у пациентов с увеитом, перекрестно реагировали с ретинальным экстрактом человека и быка [145].

Имеются сообщения об участии У. егИ:егосо1Шса в формировании аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Так, с помощью иммунофлуо-ресцентного анализа было показано, что антитела, индуцированные антигенами иерсиний, вступали в перекрестные реакции с тиреоидными эпителиальными клетками, в то время как Уорэ содержат в себе участок для связывания тиротропина [95]. Были обнаружены также 2 Уорэ с низкой мол. массой (5,5 и 8 кДа), перекрестно реагирующие с рецептором тиротропина [66, 113]. Эти белки представлены в липополисахариде У .е^егосо1Шса и не были обнаружены в других бактериях семейства Еп1егоЬас1епасеае.

Японские ученые определяли у пациентов с первичным билиарным циррозом антитела на белок теплового шока (HSP60), полученный от У. enterocolitica, в ИФА [154].

Однако выявленные связи отдельных белковых компонентов иерсиний с развитием системных аутоимунных заболеваний или осложнений фрагментарны, требуют дальнейшего изучения.

Наиболее перспективными для использования в серологической диагностике иерсиниозов признаны антигены с молекулярной массой 51 кДа (УорН), 44 кДа (УорМ), 35 кДа (YopD), 23 кДа (УорЕ) [80, 141, 142].

Перекрестно реагирующие белки иерсиний. Мажорные белки с мол. массой 25 и 36 кДа обнаружены не только у У. pseudotuberculosis, но и у У. enterocolitica; они были предложены для скрининга заболеваний, вызванных иерсиниями этих двух видов [142]. По другим данным у У. pseudotuberculosis и У. pestis обнаруживаются мажорные белки с мол. массой 36; 62 (находили только при заражении живой культурой) и 73 кДа. Известно, что антигенная фракция 62 кДа соответствует белку теплового шока У .enterocolitica [13]. Антиген, имеющий мол. массу 73 кДа соответствует белку теплового шока кишечной палочки DnaK. У обоих видов иерсиний обнаруживали антитела на минорные антигены с мол. массой 13, 30, 34, 37, 5654 кДа.

Антигены с мол. массой 5,5 и 8 кДа кодируются хромосомой и представлены как у вирулентных так и у авирулентных иерсиний (У. pestis, У. pseudotuberculosis, У. enterocolitica). Эти белки вступают в перекрестные реакции с рецептором тиротропина [113].

Обнаружены антитела к белкам с мол. массой 11,5 и 21 кДа у У. enterocolitica, Brucella abortus и Afipia clevelandensis. Можно полагать, что эти антигены ответственны за перекрестные реакции между этими видами бактерий [78].

Таким образом, показано, что при хроническом течении иерсиниозной инфекции оптимально исследовать как минимум два иммуноглобулина IgG и

IgA. В организме больного или переболевшего иерсиниозами человека или животных образуются антитела к широкому спектру белков иерсиний, среди которых значительную роль в иммуногенезе играют Yops Yersinia.

Серологическяа диагностика иерсиниозной инфекции на разных

стадиях заболевания Многообразие клинических проявлений иерсиниозов, наличие значительного числа случаев с атипичным, стертым или хроническим течением нередко затрудняют клиническую диагностику этих инфекций. Вместе с тем надежная и достоверная серодиагностика во многих случаях играет решающую роль в выборе клинической тактики лечения больного и проведении профилактических мероприятий.

Широкое распространение иерсиниозов, их современные экологоэпи-демиологические особенности, а также значительная роль в инфекционной патологии человека делают вопросы лабораторной диагностики этих заболеваний актуальными.

С целью подтверждения диагноза в остром периоде заболевания исследуют испражнения больного или биопсийный материал при хирургических вмешательствах. Однако эффективность бактериологического метода не высока и составляет - 7-10%. В нашей стране для экспресс диагностики в остром периоде заболевания используют метод полимеразной цепной реакции (ПНР), однако в поздние сроки болезни его эффективность снижается [38]. После острого периода заболевания иерсинии, как правило, в выделениях больного не обнаруживают.

Серологические методы исследования направлены на выявление специфических антител в сыворотках крови у больных и переболевших и информативны, начиная со 2-3-й недели от начала болезни. В практической медицине для подтверждения диагноза широкое применение получили такие серологические методы, как реакция агглютинации (РА) и реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Наиболее распространенный метод серологической диагностики псевдотуберкулеза, используемый в практических лабораториях. Принцип реакции основывается на способности эритроцитов концентрировать антиген на своей поверхности и склеиваться, образуя видимый осадок, при вступлении в контакт со специфическими антителами. Набор для постановки РНГА выпускается СанктПетербургским НИИ вакцин и сывороток. Выпускаются наборы для диагностики антител только к Y. pseudotuberculosis 0:1 и Y. enterocolitica 0:3 и 0:9. Впервые при псевдотуберкулезе эту реакцию применил Королюк A.M. (1969г.) [17]. Диагностический титр РНГА - 1:200. При исследовании парных сывороток диагноз подтверждался в 77.5% - 81.7% случаев на 2-3-х неделях заболевания [18]. Бургасовой О.А. и соавт. (1996) показано, что во все периоды болезни процент обнаружения специфических антител составил от 8 до 46% при среднем значении титров антител 1:100 1:200, но не более 1:400 [2]. Следует заметить, что дигностическая эффективность РНГА в значительной степени зависит от качества диагностикума, так как эритроциты барана могут разрушаться при хранении.

Реакция агглютинации (РА).В основе этой реакции лежит способность корпускулярных антигенов склеиваться и выпадать в осадок под влиянием антител в среде с содержанием электролитов. РА позволяет обнаружить наличие специфических антител в сыворотке крови больных псевдотуберкулезом к 8-10-му дню болезни в 60-80% случаев [99]. Макси мальный их уровень наблюдается к Зй неделе с последующим снижением через 6-12 мес. Диагностическим титром, как и при РНГА, принят 1:200. Бургасова О.А. и соавт. (1996 г.) выявляли специфические антитела при псевдотуберкулезе в РА во все периоды болезни [2].

Следует отметить, что препараты для РНГА и РА получены на основе антигенов преимущественно липополисахаридной природы. Вместе с тем известно, что при начальных этапах взаимодействия Y. pseudotuberculosis с макроорганизмом и, особенно, в процессе инвазии и их размножения в орга-

низме хозяина важную роль играют белки наружной мембраны, детерминированные хромосомным inv геном и генами плазмиды вирулентности иерси-ний pYV 46 МДа. Последняя обнаруживается только у вирулентных бактерий рода Yersinia. Вместе с тем в указанных реакциях не учитываются низкие титры антител из-за возможных перекрестных реакций с другими бактериями (Brucella, Escherichia, Salmonella, Borrelia), хотя не редко этиологическое значение иерсиний нельзя отрицать [132].

В последнее время широкое применение получил иммуноферментный анализ (ИФА), эффективность которого наиболее высока в острый период заболевания [8].

Иммуноферментный анализ. Принцип этой реакции основан на образовании комплекса антиген антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена (конъюгат). При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по окрашенному продукту. Интенсивность реакции учитывают с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм, хотя возможна визуальная оценка реакции. Метод отличается высокой чувствительностью, возможностью качественного учета результатов и быстротой постановки реакции [90]. При исследовании сывороток крови больных отмечено, что титры антител, выявляемые методом ИФА, в сравнение с РА и РНГА превышают последние. Портнягиной О.Ю. и соавт. (2001) разработана тест-система на основе ИФА с использованием в качестве антигена видоспецифического белка - порина наружной мембраны Y. pseudotuberculosis, названного авторами иерсином [29]. Тест система прошла успешную апробацию на базе лечебных учреждений г. Владивостока. При исследовании 114 сывороток взрослых больных и 218 сывороток больных детей показано, что эффективность ИФА почти в 2 раза выше по сравнению с РНГА. В Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера разработана высокочувствительная ИФА тест система, в качестве антигена в которой используются 4 рекомбинантных белка наружной мембраны иерсиний. Тест система апробирована на вспышке

псевдотуберкулеза в г. Новый Уренгой и показала высокую эффективность [8].

Наибольшие трудности представляет диагностика иерсиниозов при хроническом течении заболевания. Чаще всего оно проявляется реактивным полиартритом, миокардитом, узловатой эритемой, синдромом Рейтара, увеитом и т. д. В мировой практике для этих целей применяется метод иммуноблота, основанный на качественном определении антител к конкретным Yops иер-синий, нанесенным на стрипы из нитроцеллюлозной мембраны. Для эитих целей используют белки иерсиний, полученные из живых бактерий или ре-комбинантные белки. При хронической инфекции рекомендуют определять IgG и IgA, хотя существуют наборы и для поиска IgM. Иммуноблот используют также как референс метод в сложных диагностических случаях и для определения перекрестной реактивности антител. Результаты проведенных исследований показывают высокую чувствительность и надежность этого метода. Rawlins M.L. и соавт. (2005) показал высокую диагностическую эффективность метода по сравнению с РСК и ИФА [132].

В настоящее время доступны коммерческие наборы для качественного определения in vitro антител класса G или А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме крови человека производства фирмы Euroimmun, а также фирмы Recom Veil. Однако исследование сывороток больных в имму-ноблоте не получило широкого распространения в практических лабораториях, а используется в основном в научных целях, возможно, из-за дороговизны исследования.

Таким образом, при остром течении иерсиниозов серологическую диагностику преимущественно проводят при помощи РНГА, РА и ИФА. Однако, для диагностики ХИ, наиболее перспективен метод иммуноблота, в настоящее время недостаточно распространенный в практических лабораториях.

Цели и задачи

Цель исследования:

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов

Y. pseudotuberculosis и совершенствование этиологической диагностики иер-синиозов.

Задачи работы:

1. Изучить наличие генетических детерминант вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных географических регионах мира.

2. Охарактеризовать генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения и их распространенность в разных регионах мира.

3. Установить особенности клинического течения псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis различных генотипов.

4. Разработать набор для серологической диагностики иерсиниозов.

Научная новизна

С использованием метода дот-блот гибридизации у штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения выявлена плазмида pVM82, несущая гены вирулентности, основные из них - гены icm/dot системы секреции IVB типа, опосредующие внутриклеточное персистирование микроорганизма в эпителиальных клетках, что может обуславливать скарлатиноподоб-ные проявления заболевания.

Впервые изучена распространенность pVM82 у представителей мировой популяции Y. pseudotuberculosis.

На основании содержания основных генетических детерминант вирулентности: pVM82, генов суперантигена, YAPI и HPI выделено 14 генотипов штаммов Y. pseudotuberculosis. Показано распространение штаммов

Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран пяти континентов.

Установлено, что псевдотуберкулез с симптомами ДСЛ вызывают все штаммы У. pseudotuberculosis, обладающие геном уршА, кодирующим УРМа.

Получены новые знания о тяжести течения псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами У. pseudotuberculosis генотипов За, ЗЬ, Зс. Полученные данные могут свидетельствовать о более тяжелом течении инфекции, вызванной штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3b (ypmA+L-YAPI+) и Зс (ypmA+L-YAPI+pVM82+), по сравнению с инфекцией, обусловленной штаммами У. pseudotuberculosis генотипа За (уртА+).

Теоретическая и практическая значимость работы

Изученные российские штаммы Y. pseudotuberculosis и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург.

Для повышения эффективности диагностики псевдотуберкулеза обоснованы показания к обследованию больных с симптомами острого аппендицита, мезентериального лимфаденита и гастроэнтеральными симптомами с целью выявления их инфицированности У. pseudotuberculosis генотипов 2а и 2Ь, вызывающих инфекцию с абдоминальными проявлениями.

Для микробиологического мониторинга за возбудителем псевдотуберкулеза предложена методика генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis.

Разработана методика конструирования набора для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, А, и М в крови или плазме человека методом иммуноблота.

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

1. Методические рекомендации для эпидемиологов, инфекционистов, педиатров и микробиологов «Псевдотуберкулез и иерсиниоз» Г.Я. Ценева, Г.И. Кокорина, Е.А. Воскресенская и др. СПб, 2005. - 49 с.

2. Материалы диссертации представлены в монографии «Иерсинии и иерси-ниозы» (Глава 8, «Современные возможности лабораторной диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза» Г.Я. Ценева, Г.И. Кокорина, Е.А. Воскресенская и др.) СПб.: ООО «Бастион», 2006. - 168 с.

3. СП 3.1.7.2615-10 «Профилактика иерсиниоза» М., 18 с.

4. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I». -№ 2465319 от 16.09.2011. - Авторы: Кокорина Г.И.

5. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы 1а». -№ 2465321 от 16.09.2011. - Авторы: Ценева Г.Я., Кокорина Г.И., Климов В.Т.

6. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы II». -№ 2465317 от 16.09.2011. - Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Чес-нокова М.В.

7. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы На». - № 2465318 от 16.09.2011. - Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Климов В.Т.

8. В Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» Российского НИПЧИ «Микроб» депонировано 4 охраноспособных штамма Yersinia pseudotuberculosis.

9. Материалы диссертации представлены в «Национальном руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: «Иерсинии»), - М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2011.- 2т.

Методология и методы исследования

Материал для исследования использованными методами представлен в таблице 4.

Таблица 4. Объем проведенных исследований различными методами

Методы Объем

1. Бактериологический:

1.1 Изучение характеристик циркулирующих штаммов Y. pseudotuberculosis 232 штамма

1.2 Культивирование на питательных средах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica 314 штаммов

2. Молекулярно-генетический:

2.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pVM 82 (секвенирование) методом «дробовика» 1 плазмида

2.2. Секвенирование участка генов урш локуса Y. pseudotuberculosis 23 штамма

2.3. Выделение тотальной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции 313 штаммов

2.4. Выделение плазмидной ДНК методом щелочной экстракции по Бирнбоу-Долли с модификацией 1 штамм

2.5. Дот-блот гибридизация ДНК каждого штамма с 10-ю 2770 реакций

мечеными зондами

2.6. ПЦР 650 реакций

3. Иммунологический:

3.1. Определение уровня антител в сыворотках крови людей методами РА, РНГА, ИФА, иммуноблота 3.2. Определение уровня антител в сыворотках крови иммунизированных животных методами РА, РНГА, ИФА, иммуноблота 241 образцов сыворотки крови (ОСК) бОСК

4. Экспериментальный: получение гипериммунных кроличьих иерсиниозных сывороток и сывороток на композицию рекомбинантных белков Yops 6 оке

5. Анализ историй болезни 256 историй болезни

6. Биоинформатические: - обработка данных с использованием компьютерных программ: BlastN - для сравнения исследуемой нуклеотидной последовательности с имеющимися в GenBank, Choice of Primers by the Octa-mer Frequency Disparity (OFD) Method - для выбора праймеров при постановке ПЦР; TIGR Manatee system - сборка и аннотация генома плазмиды. 3 пары праймеров плазмида

Штаммы. Методы культивирования Использовано 309 штаммов Y. pseudotuberculosis: 232 из коллекции национального Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами, выделенные на территории России и Украины за период 1989 по 2008 гг. и 77 штаммов полученных из Коллекции Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера (из 25 стран мира).

Штаммы выделены от людей, млекопитающих, птиц, с овощей и фруктов и из окружающей среды.

В работе использованы 4 референс-штамма, содержащие различные детерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis из Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера.

Плазмиду pVM82 выделяли из штамма Y. pseudotuberculosis IP31758, изолированного от больного псевдотуберкулезом, с типичными симптомами ДСЛ в Приморском крае.

Для иммунизации кроликов использовали охраноспособный штамм Y. enterocolitica 0:3 КМ 174 (Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», Саратов), содержащий плазмиду pYV 46 МДа из коллекции ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

В исследовании использованы как свежевыделенные культуры, так и музейные штаммы, хранящиеся при при -80° С. Бактерии выращивали в бульоне Luria Bertram или мясопептонном бульоне при 28° С 24 ч, затем культивировали при 28° С 24 ч на чашках с агаром Luria Bertram или агаре Хоттингера.

Выделение иерсиний из материала, полученного от больных, проводили посевом в пептонно-калиевую накопительную среду с инкубацией при температуре 5+1 °С и периодическим высевом на дифференциально-диагностическую плотную среду СБТС. Идентификацию культур проводили по общепринятой методике с учетом морфологических, культуральных и биохимических признаков. Серотипирование культур Y. pseudotuberculosis осуществляли в мультиплексной ПЦР с использованием специфичных прай-меров по методике Bogdanovich Т. [52] или с использованием набора коммерческих моновалентных сывороток (производства ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) к серотипам Y. pseudotuberculosis 0:1 и 0:3 с помощью реакции агглютинации на стекле по общепринятой методике.

Молекулярно-генетические методы Метод дот-блот гибридизации. Как известно, принцип метода заключается в нанесении на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) ДНК исследуемых штаммов с последующим отжигом их с мечеными зондами. По интенсивности включения зонда в гибридных молекулах можно определить наличие определенных последовательностей нуклеотидов.

Генотипирование штаммов Y. pseudotuberculosis с помощью метода дот-блот гибридизации включает несколько основных этапов, рисунок 1.

Выделение тотальной бактериальной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции как описано ранее [59].

ДНК штаммов денатурировали в термоциклере при 95 °С в течении 5 минут и наносили по 5 мкл на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Hybond К1"; Amersham, Англия) размером 10 х 13 см, подсушивали при комнатной температуре. На одну мембрану наносили 4 ДНК референс-

Вьщеление ДНК

Перенос ДНК на мембрану

\J \J \J

Фиксация ДНК

Учет

результатов

Гибридизация

зондами

Рисунок 1 - Этапы генотипирования Y. pseudotuberculosis с помощью метода дот-блот гибридизации.

штаммов по 1,5 нг (таблица 5.) в двух повторностях и максимально до 88 ДНК исследуемых штаммов. На мембране ДНК фиксировали, облучая

Таблица 5. Референс штаммы Y. pseudotuberculosis, использованные при проведении дот-блот гибридизации и ПЦР

Номер штамма Серотип О- Детерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis Источник

IP32953 1Ь уорМ1", yscQ+, irp2+, fyuA+ P.S.G. Chain [65]

487/90 6 ypmB+ C. Carnoy [64]

IP32777 lb pilPQ+, api74+, yopM+, yscQ+ F. Collyn [67]

IP31758 lb ypmA+, pilPQ+, dotO+, mucAB+ Изучен в данном исследовании

ультрафиолетовыми лучами в течение 4 минут с использованием прибора GS Gene Linker UV Chamber (Bio Rad) в режиме СЗ.

Зонды получали с помощью 10 пар праймеров, специфичных для искомых генов (табл. 6), синтезируя их методом ПЦР, используя как матрицу соответствующие референс штаммы (таблица 5). Праймеры, впервые синтезированные для этой работы подбирали с использованием компьютерной программы Choice of Primers by the Octamer Frequency Disparity (OFD) Method; с помощью BlastN сравнивали найденную нуклеотидную последовательность с имеющимися в GenBank.

Для очищения продуктов ПЦР от агарозы и примесей применяли набор микроколонок QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Мечение продукта ПЦР пероксидазой и использование его в качестве комплементарного ДНК-зонда для гибридизации с фиксированными на мембране ДНК исследуемых штаммов осуществляли при 42 °С с помощью набора реагентов для мечения ECL в соответствии с инструкцией производителя (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems; Amersham, Англия). Для выявления ДНК иерсиний, гибридизованных с зондами, мембрану обрабатывали с помощью набора реагентов ECL и экспонировали в течении 30 минут на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL, помещенной в кассету.

Таблица 6. Последовательности праймеров, использованные для генетического типирования штаммов У.р5еиёоШЬегси1о818

Фактор вирулентности Ген Праймер последовательность (5"-3') Размер продукта ПЦР (п.н.) Источник

УРМЬ уртВ Б: СТАОАТААТАААААТСАОААТСАТСО И: ОСТААТССАОАОАААААТСТТААТСТС 102 Данное исследование

УРМа, УРМс уршА, уртС Б: САСТТТТСТСТСОАСТАОСО Я: АСАООАСАТТТССТСА 422 [61]

НР1 щ>2 Б: ААООАТТСОСТСТТАССООАС И: ТССТСОООСАОССТТТСТТСТ 280 [132]

НР1 1уиА Б: СТТТАТССТСТСОССГШОО К: СТСАСААСАСТАОАСОАО 149 Данное исследование

УАР1 рПР() Б: ТАТСТТССТСОАООСТСАО К: ОСОААСТАТСАОСТАТАСО 569 [69]

УАР1 ар! 74 Б: ООТСОСТСТСТОТТТСТТСА Я: АААТТАСООААСССАСТАОСС 941 [68]

рУУ уорМ Р: АТААСТСАТСОООООСААААТ Я: ОССТТАТТТАТССОААТТТАОС 565 [151]

рУУ уБсО Б: ТАТССОСАТТАТСТСОООАС Я: ТТААССОССОАСТТАСТАОО 178 Данное исследование

рУМ82 аою Р: АТСАГСОАГООТТСАСТООО Я: АТТСАТТССТТСАООТСТТСО 2811 Данное исследование

рУМ82 тисАВ Р: ТТАСТТСТТССООСТАТСОО Я: ТСТССТТТАТСОСАААООО 1165 Данное исследование

Пленку проявляли, фиксировали, используя реактивы Кодак, и высушивали при комнатной температуре.

После проявления пленки, результаты учитывали визуально по интенсивности включения зонда в гибридных молекулах (Рисунок 2).

В ходе постановки метода применен зонд уорМ, полученный с помощью ПЦР, используя ДНК референс штамма 1Р32953 в качестве матрицы и специфические праймеры уорМ-Р и уорМ -Л. В позиции А - 1 (1Р32777), 2 (487/90), 3 (1Р31758), 4 (1Р32953) и Н - 9 (1Р32777), 10 (487/90), 11 (1Р31758), 12 (1Р32953) нанесены ДНК референсных штаммов. Интенсивность пятен А-1, 4 и Н- 9, 12 - использовали в качестве положительного контроля (ДНК содержит уорМ); А-2,ЗиН-10, 11- использовали в качестве отрицательного контроля (ДНК не содержит уорМ).

Рисунок 2 - Результаты дот-блот гибридизации. Пленка НурегШт ЕСЬ после проявки.

При сомнительном результате искомую детерминанту вирулентности исследуемого штамма определяли с помощью ПЦР со специфичными прай-мерами для каждого гена (Таблица 5.).

ДНК референсных штаммов Положительный результат

ДНК референсных штаммов

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) применяли для приготовления зондов и для детекции генетических детерминант вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis. Финальный объем реакционной смеси для ПЦР составил 50 мкл и содержал 1,25 U Taq ДНК полимеразы (Roche/Cetus) с прилагаемым буфером, MgCl2 в концентрации 2 мМ и по 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид- трифосфатов. Все праймеры использовали в финальной концентрации 0,3 мкМ. ПЦР проводили по программе: 1 цикл 94 °С -3 мин; 30 циклов амплификации 94 °С - 30 сек, 55 °С - 1 мин, 72 С - 2 мин; 72 °С - 10 мин на термоцикл ере РТС-100 (MJ Pesearch, Inc). Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием эти-дий бромидом.

Определение нуклеотидной последовательности генома плазмиды по методике «дробовика». Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочной экстракции ДНК по Бирнбоу-Долли с модификацией как описано ранее [79].

Плазмидную ДНК подвергали случайному дроблению как описано ранее [124]. Последовательность генома плазмиды была собрана используя Се-lera assembler как описано ранее [98]. Для аннотации генома использовали TIGR Manatee system.

Определение нуклеотидной последовательности участка гена суперантигена. Для секвенирования генов уртА и уртС проводили ПЦР со штаммами Y. pseudotuberculosis с использованием праймеров уртА (таблица 2.3.). Продукт ПЦР очищали, применяя набор микроколонок QIAquick PCR purufi-cation Kit (Qiagen). Секвенирование проводили, используя Big Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Perkin-Elmer) и ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer).

Способы получения гипериммунных сывороток

Штамм Y. enterocolitica 0:3 KM 174 в S-форме культивировали 24 ч в мясопептонном бульоне, затем 24 ч на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 28 °С,

готовили взвесь бактерий в физиологическом растворе с концентрацией 109 кл/мл.

Для получения гипериммунных сывороток использовали кроликов массой 2,5 - 3 кг. Животных иммунизировали штаммом Y. enterocolitica 0:3 КМ 174 по схеме: под конъюнктиву - 0,1 мл, через Здня и далее вводили такую же дозу внутривенно трехкратно с интервалом Здня, через 7 дней - под конъюнктиву, через 3 дня однократно внутривенно.

Также готовили гипериммунные сыворотки к комплексу рекомбинант-ных белков (Yops) YopM Y. enterocolitica, YopE Y. enterocolitica, YopH Y. enterocolitica, YopD Y. enterocolitica (Cat. No. #RPY003, #RPY004, #RPY005, #RPY006 «Omnio AB», Швеция). Кроликов иммунизировали по схеме: внутримышечно - 10 мкг двукратно с интервалом в 7 дней, внутрибрюшинно - 2,5 мкг через 14 дней, подкожно - 15 мкг через сутки, внутрибрюшинно двукратно по 15 мкг через 3 дня, внутривенно по 15 мкг через 4, 2, и 2 дня соответственно.

Иммунологические методы

Иммуноблот. Для выявления антител к иерсиниям методом иммуноб-лота применяли диагностический набор Иммуноблот (А) для качественного определения in vitro антител классов G, М и А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме крови человека методом Лайн-блота, разработанный в ходе настоящего исследования. Электрофорез белков проводили по Laemmli U. К. [107], с использованием камеры для вертикального электрофореза Mini-Protean Tetra Cell; Bio-Rad, США. Для переноса белков на НЦМ по Towbin Н. [150] полусухим методом применяли аппарат Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad, США.

В качестве препарата сравнения использовали коммерческий набор (Иммуноблот (К)) для качественного определения in vitro антител класса G или А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме крови человека методом Вестерн-блота «Иерсинии IgG Вестерн-блот» и «Иерсинии IgA

Вестерн-блот» производства «Euroimmun», Германия. Исследование проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для выявления антител к иерсиниям использовали РНГА с коммерческими эритроцитарными диагно-стикумами: псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозными 0:3 и 0:9 (производство НИИВС, Санкт-Петербург). Постановку реакций проводили согласно прилагаемым инструкциям.

Реакция агглютинации (РА). Для постановки РА использовали иерси-ниозные корпускулярные антигены наиболее распространенных серотипов: Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и 0:3, Y. enterocolitica серотипов 0:3; 0:5,27; 09 (производство ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Корпускулярные антигены представляют собой 10 млрд. взвесь иерсиний эталонных штаммов указанных серотипов в S-форме, инактивиро-ванных формалином, суспендированных в 0,9 % растворе хлорида натрия. Перед постановкой антигены разводили 1:10, исследуемые сыворотки прогревали при 56 °С 30 мин для устранения неспецифических гемагглютини-нов. Реакцию ставили методом равных объемов (0,5 мл сыворотки + 0,5 мл антигена). Диагностический титр - 1:160. Постановку и учет реакции проводили в соответствии с инструкцией по применению.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для выявления иерсиниозных антител методом ИФА использовали коммерческие тест-системы «Иерсиниоз-ИФЛ-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM» (ООО «Ом-никс», Санкт-Петербург), предназначенные для выявления антител классов А, М и G к белкам наружной мембраны иерсиний. Постановку реакций проводили согласно прилагаемым инструкциям.

Методы математической обработки данных Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической М, среднего квадратического

отклонения 5 и ошибки средней арифметической ш по формулам 2.1, 2.2, 2.3 соответственно:

ТУ

М = (2.1)

п

3 = (2.2)

V п

т = (2.3)

л/И

где - У[УгУп] - варианты признака; п - число вариант.

Расчет показателя, выраженного в процентах производился по известной формуле:

р = — х100% (2.4)

п

где N - количество объектов, имеющих данный признак; п - общее количество объектов (общее число выборки). Стандартная ошибка показателя, выраженного в процентах определялась по формуле 2.5:

где шр - стандартная ошибка показателя; р - показатель.

- Отличия между выборками оценивались по параметрическому критерию Стьюдента (1:). I - критерий рассчитывали по формуле 2.6: М-М

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кокорина, Галина Ивановна

Выводы

1. Методом дот-блот гибридизации у штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружены нуклеотидные последовательности плазмиды pVM82, несущей гены вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа, umuDC.

2. У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях России и Японии, наиболее часто выявлены хромосомные генетические детерминанты вирулентности: ypmA (95,5±1,4%), L-YAPI (70±3,2%) и плаз-мида pVM82 (58,5±3,4%). У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки наиболее часто выявлены HPI (46,7±4,7 %) и L-YAPI (23,8±4 %).

3. У штаммов У. pseudotuberculosis различного географического происхождения охарактеризовано 14 генотипов. На территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки широко распространены генотипы 2а (НР1+) - 29,3±4,3%, 2Ь (НРГ L-YAPI+) - 10±2,8% и 6а (НРГ урш" УАРГ pVM82") - 25,8±4,1%, 6b (L-YAPI+) - 9,2±2,7%. На территориях России у изученных штаммов, выделенных их различных источников, выявлено 7 генотипов, доминирующими являются генотипы За (ypmA+) - 21±2,8%, 3b (уртА+ L-YAPI+) - 14,5±2,4% и Зс (уртА+ L-YAPI+ pVM82+) - 55±3,5%.

4. На территориях России распространенность штаммов Y. pseudotuberculosis генотипов 2а и 2Ь (обуславливающих псевдотуберкулез с симптомами мезентериального лимфаденита, острого аппендицита и гастроинтестинальными проявлениями) составляет 6,1±1,7%.

5. На территориях России от больных псевдотуберкулезом выделены штаммы У. pseudotuberculosis генотипов Зс в 60±3,8% случаев, ЗЬ в 17,6±2,9%, За в 16,3±2,8%. Установлена зависимость частоты развития поражений печени и тяжести течения болезни от генотипа возбудителя.

Развитие поражений печени у больных достоверно чаще (р<0,001) в 65,5±8,9% и 57,5±5,3% случаев возникает под влиянием Y. pseudotuberculosis генотипов ЗЬ и Зс по сравнению с Y. pseudotuberculosis генотипа За.

6. Сконструирован отечественный диагностический набор, предназначенный для качественного определения специфических противоиерси-ниозных атител G, М и А в сыворотке или плазме крови человека методом Лайн-блот для лабораторной диагностики иерсиниозов с острым и хроническим течением. Чувствительность диагностического набора 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.

Практические рекомендации

1. Для микробиологического мониторинга за псевдотуберкулезом с целью прогнозирования эпидемической ситуации рекомендуется определять основные генетические детерминанты вируленности (ypmA, ypmB, уртС, YAPI, L-YAPI, HPI, R-HPI, pVM82, pYV 46 МДа) и определять генотипы у штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих на территории наблюдения, методом дот-блот гибридизации или ПЦР.

2. С целью выявления заболевания, обусловленного штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 2а и 2Ь, рекомендуется проводить диагностические исследования на псевдотуберкулез у больных с симптомами мезентериального лимфаденита, острого аппендицита и гастроинтестинальными проявлениями.

3. Для повышения эффективности этиологической диагностики иерси-ниозов, особенно с хроническим течением заболевания, рекомендуется использовать диагностический набор для определения специфических противоиерсиниозных IgG, IgM или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Лайн-блота.

Перспективы дальнейшей разработки темы

В дальнейшем планируется продолжить изучение распространения штаммов Y. pseudotuberculosis на не исследованных территориях России с определением генотипа возбудителя псевдотуберкулеза. Необходимо проводить исследования для изучения влияния отдельных генетических детерминант вирулентности на клиническое течение болезни.

Список использованных сокращений

ДСЛ - Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка ЗИ - Затяжное течение иерсиниозов

Иммуноблот (А) - Авторский набор для определения IgG, IgM или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Лайн-блота

Иммуноблот (К) - Коммерческий набор для определения IgG или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Вестерн-блота ИФА - Иммуноферментный анализ НЦМ - Нитроцеллюлозная мембрана ОИ - Острое течение иерсиниозов ОКИ - Острые кишечные инфекции ОСК - Образцы сыворотки крови ПААГ - Полиакриламидный гель ПНР - Полимеразная цепная реакция РА - Реакция агглютинации РНГА - Реакция гемагглютинации ТБР - Трис-HCl буферный раствор ФСБ - Фосфатно-солевой буферный раствор ХИ - Хроническое течение иерсиниозов

ХС - Раствор хромогенного субстрата (нитроголубой тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор-З-индолил-фосфат)

HPI - «Остров» высокой патогенности (High Pathogenicity Island)

IgA - Иммуноглобулины класса А

IgG - Иммуноглобулины класса G

IgM - Иммуноглобулины класса М pVM82 - Плазмида с мол. массой 82 МДа pYV 46 МДа - Плазмида вирулентности иерсиний (Plasmid associated with Yersinia virulence)

SDS - Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate)

Yops - Белки наружной мембраны иерсиний (Yersinia outer membrane proteins)

YAPI - Адгезивный «остров» патогенности иерсиний (Yersinia Adhesion Pathogenicity Island)

YPM - Суперантигенный токсин Y. pseudotuberculosis (Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen)

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кокорина, Галина Ивановна, 2013 год

Список использованной литературы

1. Беседнова, Н.Н. Рецидивы псевдотуберкулеза и их прогнозирование / Н.Н. Беседнова, Г.П. Сомов // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2000. -№ 2. - С. 52-56.

2. Бургасова, О.А. Сравнительная оценка различных иммунологических реакций в диагностике псевдотуберкулеза / О.А. Бургасова [и др.] // Журн. микробиол. - 1996.- № 2. - С. 48-51.

3. Бургасова, О.А. К дифференциальной диагностике артритов псевдотуберкулезной и хламидийной этиологии / О.А. Бургасова [и др.] // Терапевт. архив.- 2011.-№ 10.-С. 31-34.

4. Бутянова, Н.Г. Псевдотуберкулез (дальневосточная скарлатинопо-добная лихорадка) и другин иерсиниозы у детей / Н.Г. Бутянова, В.Н. Дроздов, О.С. Дроздов. - Кемерово, 1991. - 182 с.

5. Васильев, С.В. Практика инфекциониста / С.В. Васильев, В.И. Комар, В.М. Циркунов. - Минск: Вышейшая школа, 1993. - 495 с.

6. Воротынцева, Н.В. Острые кишечные инфекции у детей / Н.В. Во-ротынцева, J1.H. Мазанкова. - М.: Медицина, 2001. - 480с.

7. Волков, Л.В. Роль плазмиды с молекулярной массой 82 МД при модуляции воздействия Yersinia pseudotuberculosis на пролиферативную активность лимфоидных клеток мыши pseudotuberculosis / Л.В. Волков [и др.] // Мол. генетика. - 1991. - № 12. - С. 29-32.

8. Воскресенская, Е.А. Генетические особенности Yersinia pseudotuberculosis и эпидемиологические черты групповых заболеваний в организованных коллективах / Е.А. Воскресенская [и др.] // Эпидемиол. и инфекц. болезни. - 2009. - № 3. - С. 31-34.

9. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение/ Б. Глик, Д. Пастернак. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

10. Гинцбург, А.Л. Новый признак патогенности, кодируемый плаз-мидой рУМ 82 Yersinia pseudotuberculosis / А.Л. Гинцбург [и др.] // Генетика.

- 1988. - Т.24, № 9. - С. 1562-1571.

11. Гордеец, А. В. Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз у детей (клиника, диагностика, вопросы патогенеза, лечение): автореф. дис. ... д-ра мед. наук: 14.00.09/ Гордеец Альвина Васильевна. - М., 1986. - 46 с.

12. Грунин, И.И. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка / И.И. Грунин, Г.П. Сомов, И.Ю. Залмовер // Воен.-мед. журн. - 1960. - № 8. -С. 62-66.

13. Дробков, В.И. Спектр антител после введения чувствительным животным бактерий Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis / В.И. Дробков [и др.] // Журн. микробиол. - 1996. - № 2. - С. 81-85.

14. Дубровина, Д.И. Характеристика фагоцитоза иерсиний псевдотуберкулеза с различным набором плазмид / Д.И. Дубровина [и др.] // Мед. паразитология. - 1999. - № 4. - С. 50-53.

15. Знаменский, В.А. Этиология дальневосточной скарлатиноподоб-ной лихорадки / В.А. Знаменский, А.К. Вишняков // Журн. микробиол. - 1967

- № 2. - С. 125-130.

16. Знаменский, В.А. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (псевдотуберкулез) / В.А. Знаменский // В кн.: Природно-очаговые болезни в Приморском крае. - Владивосток, 1975. - С. 136-160.

17. Королюк, A.M. Реакция непрямой гемагглютинации при псевдотуберкулезе (ДСЛ) / A.M. Королюк // Журн. микробиол. - 1969. - № 1. - С. 121-125.

18. Королюк, A.M. Серологическая диагностика псевдотуберкулеза (скарлатиноподобной лихорадки): автореф. дис. ...канд. мед. наук: 03.02.03 / Королюк Александр Михайлович. - Л., 1972. - 22 с.

19. Малов, И. В. К патогенезу затяжных форм иерсиниозов / И.В. Ма-лов [и др.] // Клин, медицина. - 1988. - № 7. - С. 115-118.

20. Малов, И.В. Анализ антител к белкам наружной клеточной мембраны иерсиний при различном течении псевдотуберкулеза у людей / И.В. Малов, И.А. Шурыгина, Ю.Е. Волченко // Терапевт, архив.- 1994.-N4.- С.62-

21. Марамович, A.C. Эпидемиология иерсиниозов / A.C. Марамович [и др.] / Инфекц. и паразитарные бол. - М.: НПО «Союзмединформ», 1990. -18 с.

22. Марамович, A.C. Влияние Yersinia pseudotuberculosis на продукцию цитокинов клетками цельной крови доноров in vitro / A.C. Марамович [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2002. - № 4. - С. 4851.

23. Матковский, B.C. Псевдотуберкулез / B.C. Матковский, B.C. Антонов, В.Г, Бочоришвили. - Тбилиси: Сабчота Сакатрвелло, 1976. - 100 с.

24. Матковский, B.C. Псевдотуберкулез // Инфекционные болезни /

B.C. Матковский. - Л., 1977. - 161-170 с.

25. Меркер, В.А. Эпидемиологическая экология иерсиниозов в Алма-ты / В.А. Меркер // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции: Материалы международ, конф. - СПб., 2000. - С. 39.

26. Павлова, Л.А. Иерсиниозы у детей: этиология, эпидемиология, клинические особенности, диагностика и тактика терапии / Л.А. Павлова, Л.Н. Мазанкова, Н.В. Матюнина // Прил. к журн. Consilium medicum. Педиатрия.-2010.-№ 1.-С. 107-109.

27. Петровская, В.Г. Общие принципы генетического контроля пато-генности бактерий / В.Г. Петровская, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1994. - № 3. - С. 106-110.

28. Помогаева, А.П. Клинико-иммунологические особенности псевдотуберкулеза у детей / А.П. Помогаева [и др.] // Бюл. сиб. мед. - 2006. - № 4. -

C. 103-110.

29. Портнягина, О.Ю. Диагностика псевдотуберкулеза с помощью иммуноферментной тест системы на основе белка порина из Y. pseudotuberculosis / О.Ю. Портнягина [и др.] // Тихоокеан. мед. журн. - 2001 -Т. 2, № 2. - С. 23-26.

30. Постовит, В.А. Руководство по инфекционным болезням / В.А. Постовит. - СПб.: СОТИС, 1997. - 502 с.

31. Рябчук, Ф.Н. Рецидивы иерсиниозной инфекции как фактор формирования хронической гастроэнтерологической патологии у детей / Ф.Н. Рябчук, З.И. Пирогова // Гастробюл. - 2000. - № 1-2. - С. 81.

32. Туманский, В.Н. Псевдотуберкулез / В.Н. Туманский. - М.: Мед-гиз, 1958.-81 с.

33. Чеснокова, М.В. Генотипирование Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, A.C. Марамович // Журн. микробиол. - 2006. - № 6. - С. 20-25.

34. Херрингтон, С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / С. Херрингтон, Д. Макги. - М.: Мир, 1999. - 558 с.

35. Шовадаева, Г.А. Альтернативная локализация детерминант пато-генности, кодируемых плазмидой pVM 82 Yersinia pseudotuberculosis / Г.А. Шовадаева [и др.] // Мол. генетика. - 1991. - № 11. - С. 23-27.

36. Шубин, Н.Ф. Эпидемиологические аспекты псевдотуберкулезной поликлональной инфекции / Н.Ф. Шубин // Журн. микробиол. - 1997. - № 5. -С. 22-25.

37. Шурыгина, И.А. Влияние биологических свойств возбудителя на морфологические проявления псевдотуберкулеза / И.А. Шурыгина, И.Ж. Се-минский, В.Т. Климов // Восточно-сиб. журн. инфекц. патологии. - 1994. - № 1.-С. 16-18.

38. Шурыгина, И.А. Псевдотуберкулез / И.А. Шурыгина [и др.] Новосибирск: Наука, 2003. - 319 с.

39. Шурыгина, И.А. Зависимость клинических проявлений псевдотуберкулеза от биологических особенностей возбудителя и характеристик пациента / И.А. Шурыгина // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - № 6. - С. 132136.

40. Aagesen, A.M. Sequence analyses of type IV pili from Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and Vibrio vulnificus / A.M. Aagesen, C.C. Häse // Mi-

crob. Ecol. - 2012. - Vol. 64, № 2. - P. 509-524.

41. Abe, J. Evidence for superantigen production by Yersinia pseudotuberculosis / J. Abe [et al.] // J. Immunol. - 1993. - Vol. 151, № 8. - P. 4183^1188.

42. Abe, J. Clinical role for a superantigen in Yersinia pseudotuberculosis infection / J. Abe [et al.] // J. Clin. Invest. - 1997. - Vol. 99, № 8. - P. 1823-1830.

43. Ammon, A. Integrated data collection on zoonoses in the European Union, from animals to humans, and the analyses of the data / A. Ammon, P. Makela // Int. J. Food Microbiol. - 2010. - Vol. 30, № 139. Suppl. 1 - P. 43^17.

44. Anderson, S. Shotgun DNA sequencing using cloned DNase I-generated fragments / S. Anderson // Nucleic Acids Res. - 1981. - Vol. 9, № 13. -P. 3015-3027.

45. Appel, H. The 19 kDa protein of Yersinia enterocolitica 0:3 is recognized on the cellular and humoral level by patients with Yersinia induced reactive arthrit The 19 kDa protein of Yersinia enterocolitica 0:3 is recognized on the cellular and humoral level by patients with Yersinia induced reactive arthritis / H. Appel [et al.] // J. Rheumatol. - 1999. - Vol. 26, № 9. - P. 1964-1971.

46. Aroeti, B. Retraction of enteropathogenic E. coli type IV pili promotes efficient host cell colonization, effector translocation and tight junction disruption / B. Aroet [et al.] // Gut. Microbes. - 2012. - Vol. 3, № 3. - P. 267-271.

47. Ashour, H.M. Species distribution and antimicrobial susceptibility of gram-negative aerobic bacteria in hospitalized cancer patients / H.M. Ashour, A. El-Sharif// J. Transl. Med. - 2009. - Vol. 19. - P. 7-14.

48. Bach, S. The Yersinia high-pathogenicity island is present in different members of the family Enterobacteriaceae / S. Bach, A.M. de Almeida, E. Carniel // FEMS Microbiol. Lett. - 2000. - Vol. 183, № 2. - P. 289-294.

49. Backhans, A. Occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis in small wild rodents / A. Backhans, C. Fellstrom, S.T. Lambertz // Epidemiol. Infect. - 2011. - Vol. 139, № 8. - P. 1230-1238.

50. Balakrishna, A.M. Structural basis of typhoid: Salmonella typhi type IVb pilin (PilS) and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator interac-

tion / A.M. Balakrishna [et al.] // Proteins. - 2009. - Vol. 77, № 2. - P. 253-261.

51. Bitzan, M. Significance of Yersinia enterocolitica isolates and antibody titers. A prospective study in patients with enteritis and healthy controls under bacteriological, serological, epidemiological and clinical aspects / M. Bitzan [et al.] // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. - 1983. - Vol. 254, № 1. - P. 78-88.

52. Bogdanovich, T. Use of O-Antigen Gene Cluster-Specific PCRs for the Identification and O-Genotyping of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pes-tis / T. Bogdanovich [et al.] // Clin.Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 5103-5112.

53. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein [et al.] // Am. J. Hum. Genet. -1980.-Vol. 32, №3.-P. 314-331.

54. Braunwald, E. Harrison's principles of internal medicine, 15 th ed / E. Braunwald [et al.] - New York: McGraw-Hill, 2001. - P. 993-1001.

55. Brubaker, RR. Factors promoting acute and chronic diseases caused by yersiniae / R.R. Brubaker // Clin. Microbiol. Rev. - 1991. - Vol. 4, № 3. - P. 309324.

56. Buchrieser, C. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be inserted into any of the three chromosomal asn tRNA genes / C. Buchrieser [et al.] // Mol. Microbiol. - 1998. - Vol. 30, № 5. - P. 965-978.

57. Bundle, D.R. Serological confirmation of Brucella abortus and Yersinia enterocolitica 0:9 O-antigens by monoclonal antibodies / D.R. Bundle [et al.] // Infect. Immun. - 1984. - Vol. 46, № 2. - P. 389-393.

58. Careless, D.J. Immunogenetic and microbial factors in acute anterior uveitis / D.J. Careless [et al.] // J. Rheumatol. - 1997. - Vol. 24, № 1. - P. 102108.

59. Carniel, E. The gene coding for the 190,000-dalton iron-regulated protein of Yersinia species is present only in the highly pathogenic strains / E. Carniel, O. Mercereau-Puijalon, S. Boneffoy // Infect. Immun. - 1989. - Vol. 57. - P. 1211-1217.

60. Carniel, E. The Yersinia high-pathogenicity island: an iron-uptake isl-

and // E. Carniel / Microbes Infect. - 2001. - Vol. 3, № 7. - P. 561-569.

61. Carnoy, C. Yersinia pseudotuberculosis superantigenic toxins / C. Car-noy., M. Simonet // Bacterial protein toxins: a comprehensive sourcebook: ed. by J.E. Alouf and J.H. Freer. - London.: Academic Press, 1999. - P. 611-622.

62. Carnoy, C. The superantigenic toxin of Yersinia pseudotuberculosis: a novel virulence factor? / C. Carnoy [et al.] // Int. J. Med. Microbiol. - 2000. - Vol. 290.-P. 477^482.

63. Carnoy, C. Superantigen YPMa exacerbates the virulence of Yersinia pseudotuberculosis in mice / C. Carnoy [et al.] // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, №5.-P. 2553-2559.

64. Carnoy, C. The superantigen gene ypm is located in an unstable chromosomal locus of Yersinia pseudotuberculosis / C. Carnoy [et al.] // J. Bacteriol. -2002. - Vol. 184, № 16. - P. 4489-4499.

65. Chain, P.S. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis / P.S. Chain[et al.] // Proc. Natl. Acad. Sei USA.- 2004. - Vol. 21, 101, № 38. - P. 13826-13831.

66. Chatzipanagiotou, S. Prevalence of Yersinia plasmid-encoded outer protein (Yop) class-specific antibodies in patients with Hashimoto's thyroiditis / S. Chatzipanagiotou [et al.] // Microbiol. Infect. - 2001. - Vol. 7. - P. 138-143.

67. Collyn, F. Yersinia pseudotuberculosis harbors a type IV pilus gene cluster that contributes to pathogenicity / F. Collyn [et al.] // Infect. Immun. -2002. - Vol. 70. - P. 6196-6205.

68. Collyn, F. YAPI, a new Yersinia pseudotuberculosis pathogenicity island / F. Collyn [et al.] // Infect. Immun. - 2004. - Vol. 72, № 8. - P. 4784^1790.

69. Collyn, F. Linkage of the horizontally acquired ypm and pil genes in Yersinia pseudotuberculosis / F. Collyn [et al.] // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73, №4.-P. 2556-2558

70. Colmegna, I. HLA-B27-associated reactive arthritis: pathogenetic and clinical considerations / I.Colmegna I, R. Cuchacovich, L.R. Espinoza // Clin. Microbiol. Rev. - 2004. - Vol. 17, № 2. - P. 348-369.

71. Cornells, G.R. The Yersinia yop regulon / G.R. Cornelis [et al.] // Mol. Microbiol. - 1989. - Vol. 3, № 10. - P. 1455-1459.

72. Cornelis, G.R. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome / G.R. Cornelis [et al.] // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1998. - Vol. 62, № 4. - P. 1315-1352.

73. Cremer, J. Immunoblotting of Yersinia plasmid-encoded released proteins: a tool for serodiagnosis / J. Cremer, M. Putzker, M. Faulde, L. Zöller // Electrophoresis. - 1993. - Vol. 14. - P. 952-959.

74. De Almeida, A.M. Chromosomal irp2 gene in Yersinia: distribution, expression, deletion and impact on virulence / A.M. de Almeida [et al.] // Microb. Pathog. - 1993. - Vol. 14, № 1. - P. 9-21.

75. Di Genaro, M.S. Protective immunity induced by a Yersinia enterocoli-tica serovar 0:8 cellular extract / M.S. Di Genaro [et al.] // Biocell. - 1996. - Vol. 20, №3.-P. 235-241.

76. Di Genaro, M.S. Humoral immune response in Yersinia enterocolitica 0:5 induced arthritis in hamsters / M.S. Di Genaro [et al.] // Microbiol. Immunol. -1997. - Vol. 41, № 8. - P. 615-620.

77. Di Genaro, M.S. Arthritogenicity of Yersinia enterocolitica 0:8 in hamsters: analysis of the immune response / M.S. Di Genaro [et al.] // Folia Microbiol. (Praha). - 1998 - Vol. 43, № 6. - P. 690-696.

78. Drancourt, M. Afipia clevelandensis antibodies and cross-reactivity with Brucella spp. and Yersinia enterocolitica 0:9 / M. Drancourt, P. Brouqui, D. Raoult // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1997. - Vol. 4, № 6. - P. 748-752.

79. Feliciello, I. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli / I. Feliciello, G. Chinali // Anal. Biochem. - 1993. - Vol. 212, № 2. - P. 394-401.

80. Fernández-Lago, L. Analysis of the immune response to Yersinia enterocolitica serotype-0:9-released proteins by immunoblot and ELISA / L. Fernández-Lago [et al.] // Res. Microbiol. - 1994. - Vol. 145, № 7. - P. 553-561.

81. Finlayson, N.B. Pasteurella pseudotuberculosis infection: three cases in

the United States / N.B. Finlayson, B. Fagundes // Am. J. Clin. Pathol. — 1971. — Vol. 55, № l.-P. 24-29.

82. Fliss, I. Multiplex riboprobes for the detection of virulent Yersinia ente-rocolitica and simple methods for their preparation / J. Zhang, [et al.] // Hemoglobin. - 2012. - Vol. 36, № 5. - P. 464-473.

83. Fredriksson-Ahomaa, M. Different enteropathogenic Yersinia strains found in wild boars and domestic pigs / M. Fredriksson-Ahomaa [et al.] // Food-borne Pathog. Dis. - 2011. - Vol. 8, № 6. - P. 733-737.

84. Fukushima, H. Acute mesenteric lymphadenitis due to Yersinia pseudotuberculosis lacking a virulence plasmid / H. Fukushima [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29, № 6. - P. 1271-1275.

85. Fukushima, H. Introduction into Japan of pathogenic Yersinia through imported pork, beef and fowl / H. Fukushima [et al.] // Int. J. Food. Microbiol. -1997. - Vol. 35, № 3. - P. 205-212.

86. Fukushima, H. Putative origin of Yersinia pseudotuberculosis in western and eastern countries. A comparison of restriction endonuclease analysis of virulence plasmids / H. Fukushima [et al.] // Zentralbl. Bakteriol. - 1998. - Vol. 288, № l.-P. 359-365.

87. Fukushima, H. Geographical heterogeneity between Far Eastern and Western countries in prevalence of the virulence plasmid, the superantigen Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen, and the high-pathogenicity island among Yersinia pseudotuberculosis strains / H. Fukushima [et al.] // J. Clin. Microbiol. -2001.-Vol. 39, № 10.-P. 3541-3547.

88. Gaston, J.S.H. Arthritis associated with enteric infection / J.S.H. Gaston, M.S. Lillicrap // Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. - 2003. - Vol. 17. - P. 219-239.

89. Granfors, K. Measurement of immunoglobulin M (IgM), IgG, and IgA antibodies against Yersinia enterocolitica by enzyme-linked immunosorbent assay: persistence of serum antibodies during disease / K. Granfors // J. Clin. Microbiol. -1979. - Vol. 9, № 3. - P. 336-341.

90. Granfors, K. ELISA and RIA for serologic diagnosis of Yersiniosis / K. Granfors, A. Toivanen // Rev.Infect. Dis. - 1984. - Vol. 6, № 3. - P. 421^23.

91. Gripenberg-Lerche, C. Role of YadA in arthritogenicity of Yersinia en-terocolitica serotype 0:8: experimental studies with rats / C. Gripenberg-Lerche [et al.] // Infect. Immun. - 1994. - Vol. 62, № 12. - P. 5568-5575.

92. Gripenberg-Lerche, C. Role of YadA-mediated collagen binding in arthritogenicity of Yersinia enterocolitica serotype 0:8: experimental studies with rats / C. Gripenberg-Lerche, M. Skurnik, P. Toivanen // Infect. Immun. - 1995. -Vol. 63, № 8. - P. 3222-3226.

93. Heesemann, J. Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins released by enteropathogenic Yersinia sp. grown in calcium-deficient media / J. Heesemann [et al.] // Infect. Immun. - 1986. - Vol. 54, № 2. - P. 561-567.

94. Heesemann, J. Analysis of the class-specific immune response to Yersinia enterocolitica virulence-associated antigens in oro-gastrically infected rabbits / J. Heesemann, J. Schröder, M. Ulrich // Microb. Pathog. - 1988. - Vol. 5, № 6. -p. 437^147.

95. Heyma, P. Thyrotrophin (TSH) binding sites on Yersinia enterocolitica recognized by immunoglobulins from humans with Graves' disease / P. Heyma, L.C. Harrison, R. Robins-Browne // Clin. Exp. Immunol. - 1986. - Vol. 64, № 2. -P. 249-254.

96. Hild, M. Serologic diagnosis and follow-up in patients with uveitis. Antibodies to virulence antigens of Yersinia enterocolitica / M. Hild [et al.] // Fortschr. Ophthalmol. - 1990. - Vol. 87, № 5. - P. 484-487.

97. Hoogkamp-Korstanje, J.A. Persistence of Yersinia enterocolitica in man / J.A. Hoogkamp-Korstanje, J. de Koning, J. Heesemann // Infection. - 1988. -Vol. 16, №2.-P. 81-85.

98. Huson, D.H. Design of a compartmentalized shotgun assembler for the human genome / D.H. Huson [et al.] // Bioinformatics: Suppl. 1. - 2001. - № 17. -P. 132-139.

99. Inoue, M. Three outbreaks of Yersinia pseudotuberculosis infection /

M. Inoue [et al.] // Zbl. Bact. Hyd. - 1998. - Vol. 186. - P. 504-511.

100. Ishiwa, A. PilV adhesins of plasmid R64 thin pili specifically bind to the lipopolysaccharides of recipient cells / A. Ishiwa, T. Komano // J. Mol. Biol. -2004. - Vol. 343, № 3. - P. 615-625.

101. Ito, Y. Sequence analysis of the gene for a novel superantigen produced by Yersinia pseudotuberculosis and expression of the recombinant protein / Y. Ito [et al.] // J. Immunol. - 1995. - Vol. 154, № 11. - P. 5896-5906.

102. Kaasch, A.J. Yersinia pseudotuberculosis bloodstream infection and septic arthritis: case report and review of the literature / A.J. Kaasch [et al.] // Infection. - 2012. - Vol. 40, № 2. - P. 185-190.

103. Kangas, S. Yersinia pseudotuberculosis 0:1 traced to raw carrots, Finland / S. Kangas [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 14, № 12. - P. 19591961.

104. Karch, H. A. genomic island, termed high-pathogenicity island, is present in certain non-0157 Shiga toxin-producing Escherichia coli clonal lineages / H. Karch [et al.] // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, № 11. - P. 5994-6001.

105. Koczura, R. The Yersinia high-pathogenicity island in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from polymicrobialinfections / K. Koczura, J. Mokracka, A. Kaznowski // Pol. J. Microbiol. - 2012. - Vol. 61, № 1. - P. 71-73.

106. Krebs, S.J. Protection and attachment of Vibrio cholerae mediated by the toxin-coregulated pilus in the infant mouse model / S.J. Krebs., R.K. Taylor // J. Bacteriol.-2011.-Vol. 193, № 19.-P. 5260-5270.

107. Laemli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemli // Nature. - 1970. - Vol. 27. - P. 680-685.

108. Länada, E.B. A cohort study of Yersinia infection in goats / E.B. Läna-da [et al.] // Aust. Vet. J. - 2005. - Vol. 83, № 9. - P. 567-571.

109. Laukkanen-Ninios, R. Population structure of the Yersinia pseudotuberculosis complex according to multilocus sequence typing / R. Laukkanen-Ninios [et al.] //Environ. Microbiol. - 2011. - Vol. 13, № 12. - P. 3114-3127.

110. Leirisalo-Repo, M. Yersinia arthritis. Acute clinical picture and long-

term prognosis / M. Leirisalo-Repo // Contrib. Microbiol. Immunol. - 1987. - Vol. 9.-P. 145-154.

111. Lesic, B. Excision of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis requires the combined actions of its cognate integrase and Hef, a new recombination directionality factor / B. Lesic [et al.] // Mol. Microbiol. - 2004. -Vol. 52, №5.-P. 1337-1348.

112. Lieberman, J.A. Outer membrane targeting, ultrastructure, and single molecule localization of the enteropathogenic Escherichia coli type IV pilus secretin BfpB / J. A. Lieberman [et al.] // J. Bacteriol. - 2012. - Vol. 194, № 7. - P. 1646-1658.

113.Luo, G. Purification and characterization of Yersinia enterocolitica envelope proteins which induce antibodies that react with human thyrotropin receptor / G. Luo [et al.] // J. Immunol. - 1994. - Vol. 152, № 5. - P. 2555-2561.

114. Mair, N.S. Biochemical, pathogenicity and toxicity studies of type III strains of Yersinia pseudotuberculosis isolated from the cecal contents of pigs / N.S. Mair, E. Fox, E. Thai // Contrib. Microbiol. Immunol. - 1979. - Vol. 5. - P. 359-365.

115. Manning, P.A. Type-4 pili: biogenesis, adhesins, protein export and DNA import. Proceedings of a workshop / P.A. Manning, T.F. Meyer // Gene. -1997.-Vol. 192, № l.-P. 1-198.

116. Martinez, P.O. Variation in the prevalence of enteropathogenic Yersinia in slaughter pigs from Belgium, Italy, and Spain / P.O. Martinez [et al.] // Food-borne Pathog. Dis. - 2011. - Vol. 8, № 3. - P. 445^50.

117. Martins, C.H. Ribotyping and virulence markers of Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from animals in Brazil / C.H. Martins [et al.] // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. - 2007. - Vol. 102, № 5. - P. 587-592.

118. Merz, A.J. Pilus retraction powers bacterial twitching motility / A.J. Merz, M. So, M.P. Sheetz // Nature. - 2000. - Vol. 407, № 6800. - P. 98-102.

119. Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial enterotoxins bearing superantigenic properties / T. Miyoshi-Akiyama, T. Uchiyama // Nihon. Saikingaku. Zasshi. -

1995. - Vol. 50, № 2. - P. 501-508.

120. Miyoshi-Akiyama, T. DNA sequencing of the gene encoding a bacterial superantigen, Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YPM), and characterization of the gene product, cloned YPM / T. Miyoshi-Akiyama [et al.] // J. Immunol. - 1995. - Vol. 154, № 10. - P. 5228-5234.

121. Miyoshi-Akiyama, T. Identification of murine T cells reactive with the bacterial superantigen Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YPM) and factors involved in YPM-induced toxicity in mice / T. Miyoshi-Akiyama [et al.] // Microbiol. Immunol. - 1997. - Vol. 41, № 4. - P. 345-352.

122. Mollaret, H.H. Le monde des Yersinioses / H.H. Mollaret // Med et Malad. Infect. - 1982. - Vol. 12. - P. 658-663.

123. Najdenski, H. Experimental infections with wild and mutant Yersinia pseudotuberculosis strains in rabbits // H. Najdenski [et al.] // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. - 2003. - Vol. 50, № 6. - P. 280-288.

124. Nelson, K.E. Evidence for lateral gene transfer between Archea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritime / K.E. Nelson [et al.] // Nature. - 1999. - № 399. - P. 323-329.

125. Novoslavskij, A. Prevalence and genetic diversity of enteropathogenic Yersinia spp. in pigs at farms and slaughter in Lithuania / A. Novoslavskij [et al.] // Res .Vet. Sei 2012 8. doi: 10.1016/j.rvsc.2012.09.021.

126. Penny, J. Characterization of Novel Alleles of the Escherichia coli umuDC Genes Identifies Additional Interaction Sites of UmuC with the Beta Clamp / J. Penny [et al.] // J. Bacteriol. - 2009. - Vol. 191, № 19. - P. 5910-5920.

127. Putzker, M. Plague and other human infections caused by Yersinia species / M. Putzker, H. Sauer, D. Sobe // Clin. Lab. -2001. - Vol. 47. - P. 453^466.

128. Quintard, B. Efficacy of an oral live vaccine for veterinary use against pseudotuberculosis / B. Quintard [et al.] // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 33, № 6. - P. 59-65.

129. Radoucheva, T. The fate of Yersinia pseudotuberculosis lipopolysac-charide (LPS) in intraperitoneally and intraarticularly infected rats / T. Radouche-

va[et al.] // Zentralbl. Bakteriol. - 1999. - Vol. 289, № 2. - P. 135-145.

130. Rakin, A. Evidence for two evolutionary lineages of highly pathogenic Yersinia species / A. Rakin, P. Urbitsch, J. Heesemann // J. Bacteriol. - 1995. -Vol. 177, № 9. - P. 2292-2298.

131. Ramamurthy, T. Purification, characterization and cloning of a novel variant of the superantigen Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen / T. Ramamurthy [et al.] // FEBS Lett. - 1997. - Vol. 413, № 1. - P. 174^176.

132. Rawlins, M.L. Evaluation of a western blot method for the detection of Yersinia antibodies: evidence of serological cross-reactivity between Yersinia outer membrane proteins and Borrelia burgdorferi / M.L. Rawlins [et al.] // Clin. Di-agn. Lab. Immunol. - 2005. - Vol. 12. - P. 1269-1274.

133. Robins-Browne, R.M. Serological response of sheep to plasmid-encoded proteins of Yersinia species following natural infection with Y. enteroco-litica and Y. pseudotuberculosis / R.M. Robins-Browne, A.M. Bordun, K.J. Slee // J. Med. Microbiol. - 1993. - Vol. 39, № 4. - P. 268-272.

134. Scaturro, M. Characterization of a spontaneous avirulent mutant of Legionella pneumophila Serogroup 6: evidence of DotA and flagellin involvement in the loss of virulence / M. Scaturro [et al.] // J. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, № 6. -P. 768-773.

135. Schubert, S. Prevalence of the «high-pathogenicity island» of Yersinia species among Escherichia coli strains that are pathogenic to humans / S. Schubert [et al.] // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 480^185.

136. Schumaker, B.A. Evaluation of the Western immunoblot as a detection method for Brucella abortus exposure in elk / B.A. Schumaker [et al.] // J. Wildl. Dis. -2010. - Vol. 46. - P. 87-94.

137. Segal, G. The Icm/Dot type-IV secretion systems of Legionella pneumophila and Coxiella burnetii / G. Segal, M. Feldman, T. Zusman // FEMS Microbiol. Rev. - 2005. - Vol. 29, № 1. - P. 65-81.

138. Smego, R.A. Yersiniosis I: microbiological and clinicoepidemiological aspects of plague and non-plague Yersinia infections / R.A. Smego, J. Frean, H.J.

Koornhof // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 18, № 1. - P. 1-15.

139. Sorensen, K.K. Acute toxoplasmosis in three wild arctic foxes (Alopex lagopus) from Svalbard; one with co-infections of Salmonella Enteritidis PT1 and Yersinia pseudotuberculosis serotype 2b / K.K. Sorensen [et al.] // Res. Vet. Sei. -2005. - Vol. 78, № 2. - P. 161-167.

140. Sprague, L.D. Yersinia similis sp. nov. / L.D. Sprague [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2008. - Vol. 58, № 4. - P. 952-958.

141. Stahlberg, T.H. Immunoblot analysis of human IgM, IgG and IgA responses to plasmid-encoded antigens of Yersinia enterocolitica serovar 03 // T.H. Stählberg, K. Granfors, A. Toivanen // J. Med. Microbiol. - 1987. - Vol. 24, № 2. -P. 157-163.

142. Stahlberg, T.H. Immunoblot analysis of IgM, IgG, and IgA responses to plasmid encoded released proteins of Yersinia enterocolitica in patients with or without yersinia triggered reactive arthritis / T.H. Stählberg [et al.] // Ann. Rheum. - 1989. - Dis. - Vol. 48, № 7. - P. 577-581.

143. Stopka, M.A. Flageila and pili-mediated near-surface single-cell motility mechanisms in P. aeruginosa / M.A. Stopka [et al.] // Biophys. J. - 2011. - Vol. 100, №7. -P. 1608-1616.

144. Szych, J. Antimicrobial susceptibility of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from humans in Poland during 20042009 / J. Szych [et al.] // Med. Dosw. Mikrobiol. - 2009. - Vol. 61, № 4. - P. 311319.

145.Tanaka, T. Common antigenicity between Yersinia enterocolitica-derived heat-shock protein and the retina, and its role in uveitis / T. Tanaka [et al.] // Ophthalmic. Res. - 1996. - Vol. 28, № 5. - P. 284-288.

146. Thomas, L.V. Antigenic relationships among type strains of Yersinia enterocolitica and those of Escherichia coli, Salmonella spp., and Shigella spp / L.V. Thomas [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 17, № 1. - P. 109-111.

147. Thiele, D. The technique of polymerase chain reaction—a new diagnostic tool in microbiology and other scientific fields (review) /D. Thiele // Zentralbl.

Bakteriol. - 1990. - Vol. 273, № 4. - P. 431-454.

148. Toma, S. Human and nonhuman infections caused by Yersinia pseudotuberculosis in Canada from 1962 to 1985 / S. Toma // J. Clin. Microbiol. - 1986. - Vol. 24, № 3. - P. 465-466.

149. Tomaso, H. Seroprevalence of anti-Yersinia antibodies in healthy Aus-trians / H. Tomaso [et al.] // Eur. J. Epidemiol. -2006. - Vol. 21, № 1. - p. 77-81.

150. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose shets: procedure and some applications / H.Towbin, T. Stae-helin, J. Gordon // Biotechnology. - 1992. - Vol. 24. - P. 145-149.

151. Tsukano, H. Detection and identification of Yersinia pestis by polymerase chain reaction (PCR) using multiplex primers / H. Tsukano [et al.] // Microbiol. Immunol. - 1996. - Vol. 40. - P. 773-775.

152. Uchiyama, T. Superantigenic properties of a novel mitogenic substance produced by Yersinia pseudotuberculosis isolated from patients manifesting acute and systemic symptoms / T. Uchiyama [et al.] // J. Immunol. - 1993. - Vol. 151, №8.-P. 4407^1413.

153. Wren, B.W. The yersiniae - a model genus to study the rapid evolution of bacterial pathogens / B.W. Wren // Nat. Rev. Microbiol. - 2003. - Vol. 1, № 1. -P. 55-64.

154. Yamaguchi, H. Detection and characterization of antibodies to bacterial heat-shock protein 60 in sera of patients with primary biliary cirrhosis / H. Yamaguchi [et al.] // Microbiol. Immunol. - 1994. - Vol. 38, № 6. - P. 483^187.

155. Zahavi, E.E. Bundle-forming pilus retraction enhances enteropathogen-ic Escherichia coli infectivity / E.E. Zahavi [et al.] // Mol. Biol. Cell. - 2011. -Vol. 22, № 14. - P. 2436-2447.

156. Zanchetta, S. Acute diarrhea: recent etiopathogenetic findings / S. Zan-chetta, G. Marcer, R. Praderio // Pediatr. Med. Chir. - 1989. - Vol. 11, № 5. - P. 501-505.

157. Zhang, J. The spectrum of a- and ^-thalassemia mutations in Yunnan Province of Southwestern China / J. Zhang [et al.] // Hemoglobin. - 2012. - Vol.

36, №5.-P. 464-473.

Приложение А (рекомендуемое)

Патент на изобретение тест-штамм Y. pseudotuberculosis генетической группы I

российская федерация

О а>

чг-СО

ю to

CNI

z> OZ

09) RU(1,)

2 465 31'

.(13)

C1

(51) МПК

C12N 1/20 (2006.01)

C12Q 1/02 (2006 01)

C12R 1/02 (2006.01)

федеральная служба по интеллектуальной собственности

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21}(22) Заявка. 2011138217/10, 16.09.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 16.09.2011

Приор! ггст(ы):

(22) Дата полачи заявки 16.09.2011

(«(5) Опубликовало- 27 10.2012 Бюл. №30 '

(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: К и 2422535 С1, 27.06.2011. ГШ 2354700 С2,

10.05.2009. №0 2002095066 АЗ, 28.11.2002. Ни 2377308 С1, 27.12.2009.2385941 С1.

10.04.2010.

Адрес для переписки:

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, НИИЭМ им. Пастера, патентный отдел, Г.Л. Никифоровой

(72) Автор(ы)

Кокорииа Галина Ивановна (1Ш)

(73) Патентообладателей):

Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" (1Ш)

(54) ТЕСТ-ШТАММ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ I

(57) Реферат:

Штамм бактерий Yersinia pseudotuberculosis 413 выделен от больного пеевдо гу беркулезом, депонирован в «Mnkpo6v> под предназначен в дифферен циации pseudotuberculosis

73 С

к>

«ь

а>

at <»>

со О

коллекции РосНИПЧИ номером КМ 211 и качестве тест-штамма для бактерий Yersinia

генетической труппы I. Особенностью штамма является содержание хромосомного гена суперантигена У. pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), гена адгезивного «острова» патогеняоеги

иерсиний УАР1 (рИРО). шшзмиды рУМ 82 с мол. массой 82 МДа, которые определяют методом ПЦР. Использование изобретения позволит проводить эпидемиологическое расследование спорадических и групповых заболеваний псевдотубсркулезом, установления источника инфекции в очаге заболезания и идентификации факторов передачи, а также мониторинг за циркуляцией штаммов на различных территориях. 2 пл., 1 табл.

Приложение А 1 (рекомендуемое)

Патент на изобретение тест-штамм Y. pseudotuberculosis генетической группы 1А

российская федерация

о

сч со ш to

Tics

(19) RUfU) 2<

(51) МПК

C12N то < 2006.0 п C12Q 1/02 (2006 01) C12R 1/01 (2006 01)

федеральная служьа ПО интеллектуальной собственности

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

, (13)

С1

(21)(22) Заявка. 2011138220/10, 16 09 2011

(24) Дата нач:ша отсчета срока действия патента-16.09 20И

Приоригет(ы).

(22) Дата подачи заявки- 16 09.2011

(45) Опубликовано. 27.10.2012 Бюл. № 30

(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске. Ни 2422535 С1, 27 06 2011. Яи 2354700 С2, 10.05.2009. \уо 2002095066 АЗ, 28.11.2002. ШД 2377308 С1, 27 12.2009. Яи 2385941 С1, 10 04 2010

Адрес для переписки.

197101, Санкт-Петербург, ул Мира, 14, НИИЭМ им Мастера, латентный отдел, Г.Л. Никифоровой

(72) Авгор(ы)-

Ценева Галина Яковлевна (Ки). Кокорнна Галина Ивановна (Яи), Климов Валерий Тимофеевич (ЯЫ)

(73) Патентообладатель(и)-

Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" (Ки)

(54) ТЕСТ-ШТАММ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ Гл

73 С

го ■е» о»

СП

со N3

О

(57) Реферат:

Штамм бактерий Yersinia pseudotuberculosis 634 выделен от больного псевдотубсркулезом.

коллекции РосНИПЧИ номером КМ 214 If качестве тест-штамма для бактерий Yersinia

депонирован в «Микроб» под предназначен в дифференциации pseudoluberculosis Особенностью штамма хромосомного гена

суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMaA'PMc

генетической группы 1д. является содержание

(уршА/С), гена адгезивного «острова» патогенности иерсиний УАР1 (рПРО). которые определяют методом ПЦР. Использование изобретения позволит проводить

эпидемиологическое расследование спорадических и групповых заболеваний нсевдотуберхулезом установления источника инфекции в очаге заболевания и идентификации факторов передачи, а также мониторинг за циркуляцией штаммов на различных территориях. 2 ил.. I табл.

Z) ОН

Приложение А 2 (рекомендуемое)

Патент на изобретение тест-штамм Y. pseudotuberculosis генетической группы II

российская федерация

о

со ю <£> ТГ

см

(19) цу о»

(51) МПК

CJ2N 1/20 (2006.01)

C12Q 1/02 (2006.01)

СПИ I/O/ (2006.01)

»(13)

С1

федеральная служба по интеллектуальной собственности

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21X22) Заявка 2011138215/10, 16.09.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента" 16.09.2011

Приоритеты):

(22) Дата полачи заявки- 16.09.2011

(45) Опубликовано: 27.10.2012 Бюл. Л» 30

(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске. 1Ш 2422535 С1, 27.06.2011. 1Ш 2354700 С2. 10.05.2009. \УО 2002095066 АЗ, 28.11.2002.1Ш 2385941 С1, 10.04.2010. Ки 2377308 С1, 27.(2 2009.

Алрес хм переписки-

197101, Санкт-Петербург, ул.'Мира, 14, НИИЭМ им. Пастора, патентный отдел, Г.Л. Никифоровой

(72) Автор(ы).

Кокорина Галина Ивановна (£Ш), Воскресенская Екатерина Александровна (Ки), Чеснокова Маргарита Валентиновна (1Ш)

(73) Патемтооиладатель(и).

Федеральное бюджетное учревдение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" (Ии)

(54) ГЕСТ-ШТАММ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ II

73 С

ю

СП СП W

о

(57) Реферат.

Штамм бактерий Yersinia pseudotuberculoses 1068 выделен от больного псевдотуберкулезом, депонирован в «Микроб» под предназначен в дифференциации pseudotuberculosis Особенностью штамма хромосомного гена

еуперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc

коллекции РосТШПЧИ номером КМ 213 и качестве тест-штамма для бактерий Yersinia

генетической группы II является содержание

(уршА/С) и плазмиды молекулярной массой определяют методом позволит проводить

pVM 82 (dotO) с 82МДа, которые ПЦР. Изобретение эпидемиологическое

расследование спорадических и групповых заболеваний псевдогуберкулеза: установления источника инфекции в очаге заболевания и идентификации факторов передачи, а также для мониторинга за циркуляцией штаммов на различных территориях. 2 ил., 1 табл.

К

Приложение А 3 (рекомендуемое)

Патент на изобретение тест-штамм Y. pseudotuberculosis генетической группы ИА

российская федерация

(19)

о

со

О

ю со

CN

RU

(11)

,(13)

С1

(51) мпк

C12N 1/20 (2006.01)

C12Q 1/02 (2006.01)

C12R 1/01 (2006.01)

федеральная служба по интеллектуальной собственности

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка 2011138219/10, 16.09.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента-16.09.2011

Приоритет(ы)

(22) Дата подачи заявки- 16.09.2011

(45) Опубликовано: 27.10.2012 Бюл. № 30

(56) Список документа, нитрованных в оучете о поиске- 1Ш 2422535 С1, 27.06.2011. Ии 2354700 С2,

10.05.2009. "ЛЮ 2002095066 АЗ, 28.11.2002. 1Ш 2377308 С1, 27.12.2009. Яи 2385941 С1,

10.04.2010.

Адрес для переписки:

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, НИИЭМ им. Пастера, патентный отдел, Г.Л. Никифоровой

(72) Автор(ы):

Кокорииа Галина Ивановна (1Ш), Воскресенская Екатерина Александровна !Ди). Климов Валерий Тимофеевич (1Ш)

(73) Патентообладатель^):

Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" (ЯЧ)

(54) ТЕСТ-ШТАММ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ ПА

73 С

го -е» ш сл со .

_а» 00

О

(57) Реферат:

Штамм бактерий Yersinia pseudotuberculosis 563 выделен от больного псевдотуберкулезом, депонирован в «Микроб» под предназначен в дифференциации pseudotuberculosis

коллекции РосНИПЧИ номером КМ 212 и качестве тест-штамма для бактерий Yersinia

генетической группы ПА Особенностью штамма является содержание хромосомного гена суперантигена Y.

pseudotuberculosis YPMa/YPMc (уршА/С), который определяют методом ПЦР. Использование изобретения позволит проводить эпидемиологическое расследование спорадических и групповых заболеваний псевдотуберкулезо.м. установления источника инфекции в очаге заболевания и идентификации факторов передачи, а также осуществлять мониторинг за циркуляцией штаммов на различных территориях. 2 ил.. 1 табл.

3

а:

Приложение В (рекомендуемое) Акт о внедрении набора

L. PASTEUR

Федеральное бюджетное учреждение на\ки

САНКТ-ПГГЕРБУРГСКИЙ НА>-ЧНО-ИССтеДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОКИОЛОПШ и VI. ПАСГЕРА Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Россия 197101 I Санм-Петербург. >л Мнра.д 14 Телефон (812) 325-ГЧ0. факсi8C)233-Р-С6 ¡--mail pa4curdnt'«;;andc\ ru

Ks

fe Si

M 01

2013 г

АКТ

о внедрении набора для качественного определения антител классов G. М и А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме человека

методом Лайн-блота

На заседании производственной комиссии научно-производственного отдела новых технологий в составе председателя - заведующего лабораторией биопрепаратов, к.х.н. Вербова В.Н. и членов комиссии: ст.н. сотр., к.б.н. Смородиновой И.П„ ст.н. сотр., к.б.н. Денисовой И.П., ст.н. сотр., к.б.н. Рока В.В. был заслушан доклад Вербова В.Н. о целесообразности освоения производственного выпуска «Набора для качественного определения антител классов G, М и А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме человека методом Лайн-блота», разработанного сотрудниками лаборатории бактериальных капельных инфекций НИИЭМ имени Пастера Кокориной Г.И. и Ценевой Г.Я.

Комиссия подтверждает, что выпуск данного набора реагентов будет способствовать совершенствованию серологической диагностики иерсиниозов. Разработанный набор прост в выполнении и позволяет определять истинные протективные антитела.

На основании выше изложенного комиссия считает целесообразным включить технологию производства «Набора для качественного определения антител классов G, М и А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме человека методом Лайн-блота» в перспективный^ план выпуска ИФТС отделом новых технологий на 2013-15 гг.

Председатель комиссии, начальник научно-производственного отдела новых технолгий, зав. лаборатории биопрепар^ов Члены комиссии:

7Сморо;д£ш<^ва И.Пу^ х КожухШшМ-^Ж

Вербов В.Н.

Рока B.B^jS^