Сравнительная характеристика цитотоксических белков и апоптотических процессов в клетках лимфоидной и нелимфоидной природы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Яшин, Денис Владимирович

• Яшин, Денис Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яшин, Денис Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Цитолитические лимфоциты.

Цитолитические Т-лимфоциты.

Естественные киллерные клетки (ЕКК).

Лимфокинактивированные киллеры (ЛАК клетки).

Механизмы лизиса клеток-мишеней.

Результаты и обсуждение.

Описание системы.

Характеристика механизмов цитотоксичности ЛАК клеток.

Анализ цитотоксических белков ЛАК клеток.

Апоптотическая активность белков ЛАК клеток.

Выводы:.

Материалы и методы.

Белки, ферменты и реактивы.

Выделение мембран клеток.

Аффинная хроматография.

Хроматография.

Электрофорез и Western блот.

Вестерн блот анализ.

Масс-спектрометрический анализ.

Гельфильтрация.

Определение цитолитической активности.

Определение фрагментации ДНК.

Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика цитотоксических белков и апоптотических процессов в клетках лимфоидной и нелимфоидной природы»

Одним из приоритетных направлений современной биологии является изучение молекулярных механизмов иммунитета.

Иммунная система защищает организм от инфекций. Различают два типа иммунитета - врожденный и адаптивный. Врожденный иммунитет является первой линией обороны против болезней. Клетки врожденного иммунного ответа способны распознавать ограниченный набор молекул на поверхности патогенов и поэтому врождённый иммунитет не может отвечать на некоторые заболевания. Однако его отличает быстрое время реакции на инфекцию. Система адаптивного иммунного ответа базируется на клональном отборе из большого репертуара лимфоцитов, несущих на себе высоко специфичные рецепторы против огромного количества чужих антигенов. Это позволяет иммунной системе распознавать практически любой чужеродный антиген. В адаптивном иммунном ответе антиген-специфичные лимфоциты пролиферируют и дифференцируются в эффекторные клетки для того, чтобы уничтожить патоген. Клетки адаптивного иммунитета способны не только уничтожить патоген, но и, базируясь на клональном отборе, образовать долгоживущую популяцию клеток памяти, способных на более быстрый и эффективный иммунный ответ при повторном заражении. Известно, что ключевую роль в уничтожении опасных для организма клеток, таких как зараженные вирусом клетки и раковые клетки, выполняют цитолитические лимфоциты. Описаны два вида цитолитических лимфоцитов: цитолитические Т-лимфоциты и естественные киллеры. Естественные киллеры являются важной частью врожденной иммунной системы, в то время как цитолитические Т-лимфоциты являются высокодифференцированной и эффективной частью адаптивного иммунного ответа. Однако для всех цитолитических лимфоцитов предполагается существование единых механизмов лизиса клеток.

При взаимодействии рецепторов цитолитических лимфоцитов с чужеродными антигенными детерминантами происходит активация эффектора. При этом повышается уровень экспрессии генов цитотоксических белков и происходит встраивание этих белков в мембрану или секреция их в зону контакта. При взаимодействии клеток-мишеней с цитотоксическими белками клетки гибнут.

На сегодняшний день известно огромное количество цитотоксических белков, выделяемых клетками иммунной системы. Наиболее известными из них являются такие белки как фактор некроза опухолей (TNF), TRAIL, Fas-лиганд, лимфотоксины, y-интерферон, перфорин. Но трудно объяснить цитолитическое действие лимфоцитов лишь описанными белками.

Поэтому изучение цитотоксических белков и механизмов их действия может способствовать лучшему пониманию механизмов действия иммунной системы.

Обзор литературы.

Цитолитические лимфоциты.

Защита организма от вредного воздействия патогенных бактерий, вирусов, злокачественных образований осуществляется клетками иммунной системы. Основная роль в уничтожении ставших опасными для организма собственных клеток (зараженных вирусом или трансформировавшихся в раковые) отводится цитолитическим лимфоцитам. Как уже упоминалось, существует два вида цитолитических лимфоцитов: цитолитические Т-лимфоциты и естественные киллеры. Они различаются происхождением, представленными на поверхности антигенами и специфичностью лизиса клеток-мишеней.(1)

Цитолитические Т-лимфоциты.

Т-лимфоциты являются важнейшей составной частью адаптивного иммунного ответа. Предшественники Т-лимфоцитов генерируются в костном мозге, и несут на себе маркер CD34.(2) Далее предшественник мигрирует в специальный орган иммунной системы — тимус, где и происходит созревание, дальнейшее развитие и дифференцировка Т-лимфоцитов. Незрелые тимоциты несут на клеточной мембране поверхностные маркеры CD2, CD44 и HAS, а также экспрессируют ключевой фермент RAG, ответственный за перестройку иммуноглобулиновых генов и генов Т-клеточных рецепторов. (3) Ферменты этого семейства ответственны за генерацию Т и B-лимфоцитами широкого репертуара рецепторов, потенциально способных к узнаванию практически любых молекул. Разница между иммуноглобулинами и Т-клеточным рецептором заключается в том, что Т-клеточный рецептор способен узнавать антигены лишь в комплексе с соответствующим комплексом гистосовместимости МНС.

МНС (главный комплекс гистосовместимости)-это семейство генов в организме, предназначенное для презентации клеткам адаптивной иммунной системы различных антигенов. Два главных представителя этого семейства — это МНС 1 и 2 класса, которые презентируют пептиды Т-клеточному рецептору.(4) Отличительной чертой всех генов семейства МНС является огромный полиморфизм.(5) Это свойство МНС является ключевым для его функции.(б) Т клетки узнают свой антиген как пептид, связанный с определённой молекулой МНС. Т клетки не узнают этот же пептид, связанный с другой молекулой МНС. Высокий полиморфизм МНС генов обуславливает 3 свойства МНС молекул - 1) набор пептидов, способных связаться с молекулой МНС, 2) конформация связанного пептида и 3) взаимодействие молекулы МНС с Т-клеточным рецептором. (7) Поскольку возможности каждой отдельной молекулы МНС для связывания пептидов ограничены, то для выживания популяции необходимо, чтобы имелся как можно более широкий спектр таких молекул. Тогда возможна презентация Т. клеткам самых различных пептидов. Наследование МНС кодоминантное, то есть на клетках организма представлено по 6 разных молекул МНС 1 класса и по 8 - МНС 2 класса. (8)

Созревание Т-лимфоцитов происходит в тимусе. (9) Под действием RAG-рекомбиназы тимоциты генерируют Т-клеточный рецептор. (10) Локусы генов Т клеточного рецептора состоят из большого набора элементов, каждый из которых может сформировать один из сегментов молекулы Т-клеточного рецептора. Вариабельная часть рецептора состоит из 2 сегментов для лёгкой цепи У(вариабельный) и 1(связывающий) и 3 сегментов для тяжёлой V, D и J. RAG рекомбиназа, экспрессирующаяся в лимфоцитах на данном этапе развития, случайным образом проводит рекомбинацию участков хроматина между генами этих сегментов. В результате удаляется большая часть генов и остаётся по одному гену для каждого сегмента рецептора. Получившийся Т-клеточный рецептор состоит из случайным образом выбранных генов из полного репертуара. Специфичность получившегося рецептора определяется случайной комбинацией генов его сегментов, и потенциально этот рецептор обладает возможностью распознать практически любой антиген. (11)

У удачно экспрессировавших свой рецептор Т-клеток пропадает поверхностный маркер CD2, но появляется CD3 и CD25. (12) В дальнейшем CD25 позитивные клетки на периферии отвечают за толерантность аутореактивных Т-лимфоцитов. После того, как Т~ клетки перестроят свой Т-клеточный рецептор, они начинают экспрессировать маркеры зрелых Т-клеток CD4 и CD8, причём оба одновременно (двойные позитивные Т-лимфоциты). (13) Далее в тимусе происходит процесс, называемый клональной селекцией. Т клеточный рецептор отбирается в организме таким образом, чтобы он был способен узнавать пептиды, связанные с теми молекулами МНС, которые экспрессированы у данного индивида. Те тимоциты, Т-клеточный рецептор которых высокоафинно взаимодействует с собственными пептидами организма в контексте с МНС, уходят в апоптоз и элиминируются, так как их дальнейшая пролиферация способна привести к аутоиммунным заболеваниям. (14) Те тимоциты, Т-клеточный рецептор которых взаимодействует с собственными пептидами организма в контексте с МНС с низкой афинностью, также погибают, не получая достаточного сигнала для выживания. (15-16) Эти тимоциты не способны эффективно узнавать собственный МНС и поэтому не могут индуцировать иммунный ответ. На этой же стадии происходит дифференцировка в эффекторные CD8 Т-лимфоциты или в регуляторные CD4 в зависимости от типа МНС, в контексте которого их Т-клеточный рецептор узнаёт пептиды. (17) CD4 позитивные Т-лимфоциты узнают пептиды в контексте МНС 2 типа, концентрируясь на модуляции иммунного ответа путём производства костимуляторных сигналов для других клеток. CD8 позитивные Т-лимфоциты узнают пептиды в контексте МНС 1 типа, таким образом концентрируясь на обнаружении внутриклеточных патогенов, таких как вирусы, и уничтожении их носителей. После этого необученные Т-лимфоциты мигрируют из тимуса в органы переферической иммунной системы и остаются там на длительное время, ожидая своего сигнала для активации.(18-19) В этом состоянии они находятся в GO фазе клеточного цикла, не делятся, практически не производят белков и показывают очень низкий уровень экспрессии генов и высокий уровень компактизации хроматина. Они несут маркеры CD8, CD45RA для цитолитических Т-лимфоцитов и CD4, CD62L, CD45RA, CD5 для регуляторных. После того, как цитолитический Т-лимфоцит встретит соответствующий его Т-клеточному рецептору антиген в контексте МНС 1 класса, он активируется. (20)Активированный Т-лимфоцит становится одной из самых быстро делящихся клеток организма, делясь 3 и более раз в сутки. Такая активность должна поддерживаться присутствием антигена, то есть зараженных вирусом клеток. Быстро амплифицируя свою численность, Т-лимфоциты переходят в терминальную стадию своей дифференцировки - эффекторная CD8 Т клетка или ЦТЛ. (21) Эти клетки представляют из себя очень эффективную систему для уничтожения клеток-мишеней. Для них характерна экспрессия на поверхности CD8, CD44, а также эффекторная молекула FasL и рецептор для неё - Fas. Рецептор для FasL необходим для того, чтобы сдерживать численность активированных Т-лимфоцитов после того, как инфекция будет элиминирована из организма, причём количество копий Fas растёт в зависимости от продолжительности нахождения клетки в активированном состоянии. Также внутри клетки обычно развиваются заметные гранулы, содержащие цитотоксичные молекулы гранзимы и перфорин, и регуляторный IFN-y. При контакте с клеткой, экспрессирующей МНС 1 класса со специфичным для данной Т-клетки пептидом, происходит лизис данной клетки. (22-24)

Существует два типа ЦТЛ, отличающихся морфологически: крупные клетки с хорошо развитым секреторным аппаратом, содержащие гранулы, и малые негранулярные лимфоциты. И те, и другие ЦТЛ обладают цитолитической активностью.

Таким образом ЦТЛ представляют собой высоко дифференцированные клетки, способные уничтожать клетки собственного организма, несущие чужеродный или изменённый свой антиген в контексте определённого МНС 1 класса.

Естественные киллерные клетки (£КК).

ЕКК развиваются в костном мозге из общего для лимфоцитов предшественника и циркулируют в кровотоке. Они больше, чем Т- и В-лимфоциты, имеют хорошо различимые гранулы в цитоплазме и функционально различаются по своей способности убивать некоторые лимфоидные раковые клеточные линии in vitro без предварительной иммунизации или активации. Механизм убийства клеток для ЕКК точно такой же, как и у цитотоксических Т-лимфоцитов при адаптивном иммунном ответе. Однако, ЕКК зависимое убийство клеток индуцируется инвариантным рецептором. Известная функция ЕКК в иммунной защите показана для ранней фазы инфекции некоторыми внутриклеточными патогенами, например, вирусом герпеса. (25)Первоначально ЕКК были выделены как клетки способные лизировать опухолевые клетки без предварительной активации и без участия антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС).

ЕКК активируются в ответ на интерфероны или цитокины, выделяемые макрофагами. Хотя ЕКК, способные убить чувствительные мишени, можно выделить из неинфицированного донора, их активность возрастает в 20-100 раз после инкубации с IFN-a, IFN-P или ЕКК активирующим фактором - IL-12, который является одним из цитокинов, выделяющимся на ранних стадиях при многих инфекциях. Активированные ЕКК клетки служат для сдерживания вирусной инфекции, пока адаптивный иммунный ответ не выработает специфичные Т-лимфоциты, способные уничтожить инфекцию.(25) IL-12 вместе с TNF-a может также индуцировать продукцию ЕКК клетками больших количеств INF-y, важного цитокина для контроля многих инфекций. Его секреция на ранних стадиях очень важна для борьбы со многими заболеваниями.

Большая часть ЕКК человека несет на своей поверхности два характерных поверхностных маркера: это низкоаффинный FC-рецептор для IgG - CD16, и CD56 - белок с молекулярной массой 200 кДа, обеспечивающий адгезию клеток. Кроме того, ЕКК экспрессируют CD8 и СВ2-антигены, присущие Т-клеткам (26-29)

ЕКК клетки имеют два типа поверхностных рецепторов, контролирующих их цитотоксическую активность. Рецепторы первого типа - это активирующие рецепторы. Они индуцирует убийство клетки-мишени. Некоторые рецепторы передают этот активационный сигнал, например лектины С-типа, распознающие широкий спектр СН лигандов, представленных на большом количестве клеток, а также Toll рецепторы. Второй набор рецепторов ингибирует активацию и предотвращает убийство своих клеток. Эти ингибиторные рецепторы специфичны для МНС 1 класса аллелей. Изменённая экспрессия МНС 1 класса является общей чертой для клеток, заражённых внутриклеточными патогенами. (30)

Эти рецепторы у людей способны узнавать различные аллели HLA-B и HLA-C (это аллели МНС 1 класса, кодируемые в локусах В и С человеческого МНС или HLA гена) ЕКК рецепторы принадлежат к суперсемейству иммуноглобулиновых генов. Их обычно называют р58 и р70 или KIR. В дополнение к этому, ЕКК клетки экспрессируют гетеродимер двух лектинов С-типа: CD94 и NKG2. Они распознают HLA-E молекулу, которая связывается с лидерными пептидами других молекул МНС 1 класса. Таким образом этот рецептор может быть чувствительным к присутствию нескольких различных аллелей МНС 1 класса.(31)

ЕКК клетки способны лизировать клетки собственного организма, заражённые вирусами, изменяющими либо подавляющими экспрессию молекул МНС 1 класса, тем самым понижая уровень ингибирующего сигнала для ЕКК клеток, или клетки, содержащие изменённые гликозилированные белки, что обычно происходит при вирусном заражении. Также, поскольку многие раковые опухоли несут на себе пониженный уровень молекул МНС 1 класса, (избегая, таким образом, распознавания клетками адаптивной иммунной системы) ЕКК играют важную роль в уничтожении раковых клеток, даже если раковые клетки не несут на себе специфичных антигенов. (32)

Лимфокинактивированные киллеры (ЛАК клетки).

Одной из наиболее удобных лабораторных систем для изучения цитотоксичности является система лимфокинактивированных киллеров (ЛАК клеток).

В 1982 году Розенбергом было открыто и описано действие интерлейкина-2 на цитотоксичность лимфоцитов периферической крови человека.(ЗЗ) Длительная инкубация клеток с интерлейкином-2 позволяет получить лейкоциты с высокой цитотоксичностью, независимо от иммунного статуса донора. Это свойство и делает ЛАК клетки удобной лабораторной моделью для изучения цитолитического действия лимфоцитов. Происхождение ЛАК клеток до настоящего времени считается спорным. Маловероятно, что предшественником ЛАК клеток является какой-либо один тип клеток. ЛАК клетки являются гетерогенной популяцией. (34)

1Ь-2 это один из наиболее важных цитокинов для развития Т-клеточного иммунного ответа. В организме он выделяется CD4 Т-клетками и некоторыми антиген-презентирующими клетками при появлении инфекции в организме, и являются необходимым сигналом для активации Т-лимфоцитов. Это небольшой белок, состоящий из 133 а. к., действующий в виде мономера и имеющий малое время жизни в кровотоке. На Т-клетках имеется рецептор к нему, состоящий из 3 субъединиц. Субъединица у рецептора (СБ 132) является общей для многих рецепторов цитокинов, например для рецепторов к 1Ь-4,1Ь-7,1Ь-9 и 1Ь-15. Эта субъединица экспрессируется на многих клетках иммунной системы, в том числе на большинстве В- и Т-лимфоцитов, ЕКК клетках, нейтрофилах и тучных клетках. Она способна передавать сигнал от 1Ь-2 и самостоятельно, но имеет очень низкую афинность взаимодействия с цитокином. р субъединица (СБ 122) экспрессируется на ЕКК клетках и покоящихся Т-лимфоцитах и принадлежит к семейству фибронектиновых генов 3 типа. При совместной экспрессии двух субъединиц афинность взаимодействия с 1Ь-2 повышается, но остаётся низкой. Однако этого бывает достаточно для активации клеток, а субединица рецептора (СБ25) экспрессируется на активированных Т- и В-лимфоцитах и на моноцитах. Её афинность к цитокину намного выше, поэтому активированные Т-клетки пролиферируют даже в присутствии малых количеств 1Ь-2. Интересно, что субпопуляция СБ25 и СБ4 позитивных Т-лимфоцитов, имеющаяся в организме в отсутствие иммунной реакции, ответственна за подавление аутореактивных Т-лимфоцитов и контролирует аутоиммунные процессы.(35)

ЛАК клетки принципиально отличаются от ЕКК, так как они способны лизировать как ЕКК-чувствительные, так и ЕКК-резистентные клетки (27).Нельзя отнести ЛАК клетки и к ЦТЛ, действие которых ограничено белками главного комплекса гистосовместимости (27).

ЛАК клетки обладают сильно развитой гранулярной системой. Морфологически и фенотипически они подобны большим гранулярным лимфоцитам, которые, в свою очередь, являются гетерогенной популяцией (27).

Выявлена зависимость экспрессии маркеров на поверхности ЛАК клеток от времени инкубации с большими дозами (1000 ед.) интерлейкином-2. На 3-4 сутки инкубации экспрессируются поверхностные антигены СБ 16+, СБ8+, СБЗ-, характерные для естественных киллерных клеток, на 6-7 сутки - СБЗ+, СБ8+, СО 16-, характерные для цитолитических Т-лимфоцитов. (36-39)

Изменение фенотипа вызывает изменение других параметров: цитолитической активности, специфичности к мишеням, секреции белков, обладающих цитотоксическим действием. Было показано, что цитолитическая активность ЛАК клеток значительно изменяется от времени инкубации с интерлейкином-2 (рис. 1), проявляя два максимума цитолитической активности, коррелирующие с изменением фенотипа ЛАК клеток.(40-41)

Таким образом, ЛАК клетки представляют собой гетерогенную популяцию клеток, изменяющей свой фенотип и цитотоксичность в зависимости от времени инкубации с интерлейкином-2.

Механизмы лизиса клеток-мишеней.

После того, как ЕКК или ЦТЛ обнаружат подходящую для себя мишень, они запускают механизмы, приводящие к лизису этой клетки. Этих механизмов существует несколько. Важной отличительной чертой механизмов лизиса собственных клеток является наличие внутри клеток специально заготовленной программы, после активации которой клетка сама уничтожает себя с наименьшими потерями для целого организма. Эта программа генетически встроена во все клетки организма. Таким образом, ЕКК или ЦТЛ для лизиса своей мишени необходимо лишь активировать эту программу. Процесс реализации программы, запускающей собственную смерть клетки, называется апоптозом. Для активации процесса апоптоза с помощью внешних факторов, все клетки организма экспрессируют на своей поверхности специальные рецепторы. Все эти рецепторы принадлежат к суперсемейству ТМ7-рецептора. Интересно, что все рецепторы, участвующие в проведении апоптотического сигнала, содержат в своей цитоплазматической части специальный домен, известный как ББ — домен смерти.

Существует два пути цитолиза клеток-мишеней под действием цитолитических лимфоцитов: контактный и секреторный (42). При взаимодействии рецепторов клеток-мишеней с цитотоксическими белками, расположенными на мембране лимфоцита, реализуется контактный путь лизиса. Секреторный путь реализуется посредством секреции лимфоцитом цитотоксических белков в зону контакта. Почти все цитотоксические белки принадлежат к семейству цитокинов.

Цитокины это маленькие белки(25 кД), которые секретируются различными клетками организма, обычно в ответ на активирующие стимулы, и индуцирующие ответ при связывании со специфичным рецептором. Они могут работать как аутокринно, влияя на поведение тех же клеток, которые выделяют его, так и паракринно, влияя на поведение соседних клеток. Некоторые цитокины могут действовать эндокринно, влияя на удаленные клетки, однако это зависит от их способности проникать в кровоток и длительности существования. Хемокины - это класс цитокинов, обладающий своством хемоаттрактантов, индуцируя клетки, имеющие соответствующий рецептор, мигрировать по направлению к источнику хемокина. (43)

Основными белками, ответственными за контактный путь лизиса считаются Fas-лиганд и мембранно-связанный TNF. За секреторный же путь отвечают, в основном, гранулярные белки: перфорин и BLT-эстеразы (протеазы серинового типа).

Лизис клеток-мишеней может реализоваться по пути некроза или апоптоза.

Некроз начинается с повреждения цитоплазматической мембраны клетки-мишени, приводящего к нарушению нормального распределения ионов и необратимому изменению внутреннего гомеостаза. Некротическая гибель клетки заканчивается коллоидно-осмотическим лизисом.

Апоптоз характеризуется активацией внутриклеточных систем деградации клетки, которая значительно опережает необратимые изменения мембраны. Отличительной чертой апоптотической гибели клетки является упорядоченная фрагментация ДНК и истощение запасов АТФ.(44-45)

Цитолитические лимфоциты, а также секретированные цитолитические факторы, могут индуцировать в различных клетках как апоптотический, так и некротический путь цитолиза. Вклад апоптотических и некротических характеристик зависит от типа эффектора, концентрации и времени инкубации с эффектором или цитотоксическим фактором, природы лиганда, а также типа и физиологического состояния клеток-мишеней.

Одной из центральных проблем иммунологии является описание цитотоксических белков, опосредующих цитолиз. Среди наиболее хорошо охарактеризованных цитотоксических факторов, которые экспрессируются лимфоцитами, можно перечислить TNF-a, TNF-ß (лимфотоксин), Fas-L, у-интерферон, Tag-7. (46-48)

TNF был впервые описан в 1975 году, как белковый фактор, вызывающий гибель трансформированных клеток по пути некроза, но при этом не оказывающий цитотоксического воздействия на нормальные клетки. Он был выделен из моноцитов, и, как считается, макрофаги являются главным источником растворимого TNF. Однако было показано, что TNF является одним из основных белков, вызывающих апоптоз. На данный момент TNF является наиболее изученным цитотоксическим белком. Этот белок был впервые клонирован, а также первым цитотоксическим белком, у которого была изучена первичная структура. TNF-a имеет молекулярную массу 17 кД, хотя, по некоторым данным, его гомологи могут иметь массы от 50 до 225 кД. Аминокислотная последовательность TNF совпадает с липотропным гормоном -кахексином.

Описаны два рецептора к TNF, CD 120а-антиген, белок с молекулярной массой 55 кДа, и С0120Ь-антиген, представленный белком с молекулярной массой 75 кДа. Оба этих рецептора имеют высокую степень сродства как для TNF, так и для лимфотоксинов (LT). Константы связывания TNF с рецептором CD 120а составляет 5-Ю"10М, с рецептором CD120b -М0"1ОМ. Показано, что TNFR1 является рецептором, проводящим апоптотический сигнал, тогда как TNFR2 блокирует его проведение. Таким образом, при образовании гомотримера апоптотический сигнал проходит внутрь клетки, а при образовании гетеротримера его проведение блокируется.

TNF является многофункциональным белком и способен вызывать как индуцирующие клеточную гибель процессы, так и активацию клетки. Даже при проведении сигнала на апоптоз клетки он может индуцировать несколько каскадов реакций. Наиболее изученным является процесс активации каскада протеаз семейства каспаз. После связывания тримера TNF с рецептором происходит тримеризация рецептора и сборка на цитоплазматической части рецепторов сигнального комплекса, передающего апоптотический сигнал внутрь клетки. Этот комплекс получил название DISC или Death Inducing Signaling Complex. Этот комплекс обладает протеолитической активностью и способен к расщеплению предшественника каспазы 8 и продукции активной каспазы 8. В дальнейшем каспаза 8 индуцирует процесс апоптоза в клетке. Последние данные показывают, что для TNF комплекс DISC может только инициировать свою сборку на рецепторе, а затем перемещаться с клеточной мембраны в цитозоль, где и осуществлять протеолиз каспаз-8 и 10.(49)

Альтернативой этому пути проведения сигнала гибели клетки служит проведение сигнала с участием церамида. Тример активирует TNFR, что приводит к активации тирозинкиназы и фосфорилированию внутреннего домена TNFR. Это фосфорилирование сопряжено с активацией фосфокиназы С и протеинкиназы С (50). Фосфорилирование pTNF может контролироваться G-белком и усилением GTP-азной активностью (51). Дальнейшая передача сигнала связана с активацией сфингомиелиназы и накопления продукта расщепления I сфингомиелина - церамида. Церамид индуцирует Mg -зависимую протеинкиназу. Далее сигнал может передаваться по двум направлениям: активация архидоновой кислоты или транскрипционного фактора NF-кВ. Активация NF-кВ повышает резистентность к TNF-зависимому лизису, и, возможно активирует пролиферацию. Активация архидоновой кислоты способствует включению программы гибели клетки.

TNF может вызывать лизис клеток, как по пути некроза, так и апоптоза.

Кроме участия в некрозе и апоптозе трансформированных клеток для TNF показана важная роль в дифференцировке и росте клеток. Показано, что он стимулирует рост некоторых нормальных клеток, влияет на специфические аспекты метаболизма, участвует в ответе на эндотоксический шок, контролирует гематопоэзис, и вместе с IL-1 участвует в воспалительных реакциях, являясь одним из важнейших регуляторных белков в иммунной системе. Именно участие в воспалительных реакциях ограничило применение TNF в терапии раковых заболеваний.(52-53) Этот альтернативный путь проведения сигнала связан с активацией транскрипционного фактора NF-kB. При активации NF-kB начинает экспрессироваться множество белков, в частности, молекула FLIPl, которая является ингибитором проведения сигнала через комплекс каспазы 8. Таким образом, при активации NF-kB блокируется проведение сигнала на апоптоз клетки.

Лимфотоксин впервые был выделен из супернатантов лимфоцитов, стимулированных антигенами. Лимфотоксин-а (LT, LT-а, TNF-ß) является членом семейства TNF. Его гомология с TNF-a по аминокислотной последовательности составляет 30%, а по нуклеотидной 46%. ЬТ-а гомотример связывается с двумя рецепторами к ТМ7 на поверхности клеток, р5 5 (Т№Ш) и р75 СШР112). ЬТ-а также формирует ассоциированный с мембраной гетеротример со второй субъединицей ЬТ~р. Этот комплекс имеет другой рецептор - ЬТРЯ. ЬТ-а играет важную роль во многих биологических процессах, в том числе в развитии органов иммунной системы, в воспалительных процессах, в аллергических реакциях. Молекулярный вес ЬТ-а составляет 18 кД, в то время как размеры членов семейства ЬТ, по данным разных авторов, варьируются от 12 до 200 кД. (54-55)Также выделены еще два белка обладающих иммунологическим сходством с ТЫТ и ЬТ (56-57). Это лимфотоксин-Р и лимфотоксин-у (ЬТ-Р и ЬТ-у). ЬТ-Р имеет молекулярную массу в невосстановленном состоянии 79 кДа, в восстановленном 21 и 42 кДа. ЬТ-у имеет молекулярную массу 69 кДа. Оба эти белка способны лизировать широкий спектр мишеней. у-интерферон (ШИ-у) часто экспрессируется вместе с ТЫБ и ЬТ. Что касается эффектов от у-интерферона в отдельности, то результаты варьируются от публикации к публикации. Однако есть данные, что он подавляет активность клеток миеломы в культурах клеток из костного мозга. Показано, инкубация клеток в присутствии у-интерферона увеличивает количество рецепторов ТЫБК1 и ТЬИ?!^ на поверхности клеток, чем усиливает действие ШР и ЬТ. (58)

Перфорин был обнаружен в гранулах ЦТЛ, ЕКК и ЛАК клетках. В восстанавливающих условиях перфорин обладает молекулярной массой 67-70 кДа, в невосстанавливающих - 60-62 кДа. Молекулярная масса, гомология первичной структуры, функциональная активность, иммунологическая реактивность свидетельствуют о его сходстве с С9-белком системы комплемента.(59)

Функциональная активность перфорина связана с его свойством полимеризоваться в присутствии ионов Са2+. Взаимодействуя с мембраной клетки-мишени, перфорин образует клеточные поры -трансмембранные каналы с внутренним диаметром 5-20 мкм (60). Образование таких каналов приводит к нарушению ионно-солевого гомеостаза клетки и коллоидно-осмотическому лизису.

Эти белки участвуют в цитолизе клеток мишеней главным образом по секреторному пути. Для мембранного пути лизиса характерны белки, описанные ниже.

Изучение механизмов апоптоза привело к открытию нового рецептора и нового лиганда, индуцирующих апоптоз. Антиген CD95 (Fas/APO-1), опосредующий апоптоз, был независимо открыт в двух лабораториях с помощью моноклональных антител anti-Fas и anti-АРО-1, которые вызывали апоптоз в некоторых человеческих клетках. Антиген CD95 относится к семейству рецепторов к фактору роста нервов, в которое также входят рецепторы к TNF и антигены CD27 и CD40, играющие важную роль в дифференцировке клеток. Fas является трансмембранным гликопротеином с молекулярной массой 43-48 кД. Структура экзогенной части Fas гомологична рецептору к TNF. Ее основой являются высокоспирализованные домены с высоким содержанием цистеина. Экзогенная часть Fas антигена состоит из трёх таких доменов, тогда как TNFR1 из четырёх. Однако различие в числе доменов определяет специфичность к лиганду. Для проявления апоптотической активности необходима кластеризация Fas антигена. Сам Fas антиген является рецептором для Fas-лиганда (Fas-L), который входит в суперсемейство лигандов. Fas-L является трансмембранным белком с молекулярной массой 40-42 кД, имеющим сходство с TNF. (61) Негликозелированная форма имеет мол. массу 32 кДа. Он экспрессируется на кортикальных тимоцитах, различных лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В-клетках. . Известна растворимая форма Fas-L. Растворимый Fas-L является гликопротеином с молекулярной массой 26 кД. Показано, что у раковых больных, в чьих опухолях отсутствует антиген CD95, существенно хуже выживаемость. (62-63) Fas-лиганд экспрессируется преимущественно в активированных Т-клетках (42).

Fas-лиганд вызывает апоптотический лизис в Fas-экспрессирующих клетках. Схема проведения апоптотического сигнала с помощью FasL/Fas аналогична TNF. Однако именно для FasL/Fas проведение сигнала на апоптоз внутрь клетки изучено лучше всего. После сборки комплекса DISC на тримеризованом рецепторе там начинается процессирование регуляторной каспазы-8, которая может потом гидролизовать предшественника эффекторной каспазы 3 — прокаспазу-3 и активировать её. Если каспаза-3 активируется, то для клетки пути назад уже нет — она умрёт по апоптозу. При этом сигнал через FasL/Fas передаётся очень быстро, смерть клетки наступает уже через несколько минут после добавления FasL. Fas экспрессируется на активированных Т- и B-лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах (64).

Система Fas - Fas-лиганд вовлечена в регуляцию гибели предшественников при созревании Т-клеток в тимусе. Также Fas-лиганд участвует в контроле над постоянным уровнем активированных Т-лимфоцитов в переферических органах иммунной системы (65).

Кроме Fas/Fas-L в мембранном пути цитолиза участвуют другие белки. Известны мембранные формы TNF-a, имеющие молекулярные массы 26 и 50 кД. При этом показано, что мембранный белок с молекулярной массой 26 кД был цитотоксичен не только для TNF-чувствительных, но и для TNF-резистентных клеточных линий.(52)

Хотя основными белками, ответственными за лизис клеток-мишеней считаются Fas-лиганд, TNF, гранулярные белки: перфорин и BLT-эстеразы (протеазы серинового типа), известно, что Fas-лиганд встраивается в мембрану только специфических ЦТЛ, действия которых ограничено главным комплексом гистосовместимости клеток-мишеней, а перфорин не всегда присутствует в гранулах ЕКК, ЛАК и некоторых клонов ЦТЛ. Поэтому трудно объяснить цитолитическую активность лимфоцитов только Fas- и перфорин-зависимым лизисом.

Недавно в лаборатории Молекулярной Иммуногенетики Рака Института Биологии Гена РАН было показано, что ЛАК клетки способны выделять при разных способах стимуляции секреции широкий спектр ранее не охарактеризованных цитотоксических белков с молекулярными массами: 75, 70, 55, 40, 38, 32, 30, 25, 22, 17 кДа (66). Иммуноферментный анализ этих белков показал, что они не взаимодействуют ни с антителами к TNF, Fas-лиганду и у-интерферону, то есть с наиболее изученными белками. Было показано, что белки с молекулярными массами 30, 17 и отчасти 55 кДа способны взаимодействовать с антителами к недавно выделенному мышиному белку tag7

Продукция цитотоксических факторов может быть вызвана в лимфоцитах стимуляцией интерлейкинами, воздействием форболового эфира с ионофором и при контакте с клеткамимишенями. (67-69) Ранее активную роль в иммунном ответе приписывали лимфоцитам. Однако последние данные показали, что клетка-мишень играет активную роль в процессе цитолиза. В частности, в лаборатории "Молекулярной иммуногенетики рака" института Биологии Гена РАН, где и проводилось данное исследование, было показано, что клетка-мишень является активным участником цитолитического процесса. (70) Было продемонстрировано, что клетка-мишень влияет на количество секретированных лимфоцитами цитотоксических белков и их состав. Также индукция апоптотических или некротических механизмов лизиса зависит от типа клетки-мишени.

Но показано, что способность экспрессировать цитотоксические белки не является уникальной особенностью лимфоидных клеток. Существуют данные о том, что при контакте клеток опухоли с лимфоцитами последние гибнут. При этом опухолевые клетки экспрессируют на своей мембране цитотоксический белок Баз-Ь, который и позволяет им убивать лимфоидные клетки. (71-73) Показано, что механизм индукции апоптоза при помощи Раэ/РаБ-Ь играет особую роль в нашем организме. Например, он используется иммунной системой в специальных органах, в которых нельзя использовать стандартный иммунный ответ. В качестве примера можно привести глаз, в котором инициация обычного воспалительного процесса могла бы привести к потере зрения. При вирусном поражении глаза уничтожение зараженных клеток осуществляется при помощи Раэ-Ь - зависимого апоптоза. Поэтому в обычных тканях РаБ-Ь экспрессируется редко.

Есть данные о том, что ТЫР-а и ТЫР-р могут экспрессироваться различными культурами раковых клеток. (74) В этой работе показано, что некоторые раковые клетки способны экспрессировать мРНК генов ТМ^-а и ТИБ-Р, но белок ЮТ-а секретировался при этом лишь одной из проверенных клеточных линий. Однако его секрецию в клетках, в которых была детектирована транскрипция гена ТОТ-а, можно вызвать обработкой культуры форболовым эфиром. Что касается ЮТ-Р, то все клетки, в которых была детектирована транскрипция этого гена, секретировали соответствующий белок. Однако, экспрессия гена ТОТ-Р была найдена только в клеточных линиях лимфоидной природы. При этом экспрессия гена ТКР-а встречалась значительно чаще, чем гена ТЫБ-р. Все эти данные говорят о том, что некоторые нелимфоидные клетки способны секретировать различные цитотоксические белки.

Долгое время считалось, что свойством отвечать на воздействия клеток чужой природы обладают лишь лимфоидные клетки. Но существуют данные, что нелимфоидные клеточные культуры способны взаимодействовать друг с другом. К настоящему времени описаны и изучены на морфологическом уровне интересные явления, индуцированные контактом клеток разного происхождения.

В одних случаях это может привести к изменению метаболизма. Так показано, что в ряде случаев смешанное культивирование ведет к существенному изменению метаболизма обеих культур. Культивирование гепатоцитов в присутствии фибробластов позволяет, например, стабилизировать экспрессию специфических печеночных ферментов, а также вызывать более быстрый рост культуры клеток гепатоцитов. В этом случае можно говорить о стимуляции одной культурой клеток деятельности другой культуры. (75)

В других случаях совместное культивирование может привести к дифференцировке клеток. Показано, что пигментные эмбриональные клетки ретины способны индуцировать дифференцировку промиелоцитов в смешанной культуре. Здесь совместная культивация двух культур клеток вызывает повышение экспрессии и секреции факторов, вызывающих пролиферацию одной из культур. (76)

Смешанное культивирование нормальных и трансформированных клеток может быть использовано в качестве модели для изучения взаимодействия раковых и нормальных клеток при первичной инвазии, ангиогенезе и метастазировании опухоли. Полученные к настоящему моменту данные достаточно противоречивы. Так, показано, что некоторые линии нормальных фибробластов могут стимулировать, а некоторые могут подавлять развитие опухолевых клеток. Это доказывает, что нелимфоидные клетки способны экспрессировать некие факторы, влияющие на развитие клеток, и, в ряде случаев, подавлять активность раковых клеточных линий. (77)

Аналогичные противоречивые данные получены на смешанных культурах стромальных клеток костного мозга и различных видах раковых клеток. Эти результаты показывают, что, хотя раковые клетки в целом взаимодействуют со слоем стромальных клеток костного мозга, эти клетки существенно подавляют рост опухолевых культур, препятствуя метастазированию. (78) Полученные данные указывают на существование у нелимфоидных клеток некоторого механизма, контролирующего клеточную совместимость, а также механизма подавления развития несовместимых клеток.

Огромный интерес представляет взаимное цитотоксическое воздействие нормальных и трансформированных клеток в смешанной культуре. Так, продемонстрировано цитотоксическое воздействие выстилающего эпителия сосудов на опухолевые клетки и наоборот, что, несомненно, может играть существенную роль в процессе метастазирования опухоли. (79) В этой работе продемонстрировано, что некоторые клеточные линии меланомы способны повреждать выстилающий эпителий сосудов при помощи активных форм кислорода, что может объяснить высокий метастазирующий потенциал меланомы.

В нашей лаборатории были проведены исследования, показывающие, что при совместной инкубации двух культур клеток нелимфоидной природы, а именно, клеток эритроидной природы человека линии К-562 и трансформированных фибробластов мыши Ь-929, в раствор секретировалось несколько белков, обладающих цитотоксическими свойствами. (80) Эти белки вызывали апоптоз в обеих культурах клеток. Существенно, что в этой работе кроме морфологического описания процессов гибели клеток проведены исследования, выявляющие факторы, которые вызывают смерть клеток. Таким образом, для клетки нелимфоидной природы одним из способов для борьбы с клетками другого вида является экспрессия и секреция в раствор цитотоксических белков. В этой работе были описаны цитотоксические белки, убивающие клетки по секреторному пути. Среди них был ЛПМР-а.

Цитотоксические белки, которые экспрессируются лимфоцитами, токсичны для большого ряда клеток. В некоторых случаях эти белки вызывают гибель клеток по апоптотическому пути. (82-83) В других случаях наблюдалась гибель клеток по некротическому пути. (41, 82, 83) Апоптотический путь проведения сигнала наиболее интересен, так как клетка сама запускает процессы, приводящие ее к лизису.

В настоящее время интерес к механизмам регулируемой клеточной смерти чрезвычайно вырос. Охарактеризованы основные пути цитолиза - апоптоз и некроз. При некрозе происходит повреждение мембран, сопровождающееся коллоидно-осмотическим шоком. Одним из белков, вызывающих некроз клеток, является перфорин. Субпопуляция гранулярных лимфоцитов секретируют гранулы, содержащие перфорин и гранзимы, которые инициируют гибель клеток-мишеней.

При апоптотическом пути лизиса происходит деградация ДНК при сохраняющей свою целостность мембране. Процессы, происходящие в клетке при апоптотической гибели, активно изучаются, так как очевидно, что регуляторы апоптоза играют важную роль в поддержании гомеостаза, эмбриогенезе, патогенезе рака и многих аутоиммунных заболеваний. В настоящее время охарактеризовано несколько путей, по которым может передаваться апоптотический сигнал.

Механизмы апоптоза или программируемой клеточной смерти довольно сложны и включают в себя несколько путей проведения сигнала и множество механизмов регуляции. Однако, несмотря на свою сложность, механизм программируемой клеточной смерти имеет тенденцию к универсальности, то есть в итоге ответ на большое количество внешних и внутренних сигналов сводится к одному механизму гибели клетки, элиминирующему данную клетку из целого организма без серьёзных потерь для организма в целом.

Этот механизм реализуется в клетке с помощью специального семейства протеаз, несущих в активном центре аминокислоту цистеин и специфично гидролизующие свои мишени после остатка аспарагиновой кислоты. (84-85) Эти протеазы называются каспазы (цистеин аспаргин ассоциированные киназы). На данный момент их насчитывается 12, функции многих из них ещё предстоит выяснить.

Известно, что каспазы 2, 8, 9, 10 являются регуляторными, то есть участвуют в регуляции процессов апоптоза, каспазы 3, 6, 7 являются эффекторными, то есть непосредственно индуцируют в клетке процессы, приводящие её к смерти. Остальные каспазы принимают участие в процессах дифференцировки клетки, а не в апоптозе.(86)

Неактивные предшественники этих протеаз находятся в цитоплазме, где могут активироваться под действием различных факторов как экзогенной, так и эндогенной природы. Так, например, реализуется апоптоз под действием ТЫБ-а и БаБ-Ь. При активации от предшественников саврасе отщепляется пептид, протеаза активируется, и начинает расщеплять другие субстраты, активируя или наоборот подавляя их активность. Эти протеазы специфически расщепляют свои субстраты по остаткам аспаргина. Все протеазы семейства савразе делятся на эффекторные, которые расщепляют апоптотические субстраты, и регуляторные. Субстратами в цитоплазме для регуляторных саБраБе могут быть предшественники других протеаз этого семейства. Тем самым активируется целый каскад ферментативных реакций. Протеазы семейства савраБе функционируют в виде комплексов. Так, например, для регуляторной саБра8е-8 показано, что после активации она расщепляется на две субъединицы с молекулярными массами 10 и 20 кД, а затем собирается в комплекс, содержащий две субъединицы с массой 20 кД и две с массой 10 кД. Этот комплекс обладает протеолитической активностью. (87)

Наиболее изучен механизм проведения апоптотического сигнала для FasL/Fas. Молекулы FasL располагаются на поверхности лимфоцитов в виде тримеров, так как сама молекула обладает сайтом, который индуцирует тримеризацию, даже, если FasL находится в растворимой форме. Связывании тримера лиганда с рецептором приводит к тримеризации рецептора. Именно тримеризация рецептора и сближение таким образом его цитоплазматических доменов приводит к сборке целого комплекса молекул, передающего апоптотический сигнал внутрь клетки. Как уже говорилось, все рецепторы смерти имеют специфичный участок на своем цитоплазматическом фрагменте, называемый домен смерти или Death Domain. Система проведения сигнала с помощью рецепторов смерти по своему уникальна, так как построена на довольно редко применяющемся в организме принципе гомотопического связывания. Этот принцип основан на связывании двух молекул при помощи абсолютно одинаковых участков. Для присоединения к комплексу эффекторных молекул используются белки-адапторы, которые одним своим концом идентичны одной молекуле в комплексе, а другим концом идентичны фрагменту молекулы, которую необходимо к этому комплексу присоединить. Схема проведения сигнала с помощью FasL/Fas выглядит следующим образом. С доменами смерти рецепторов ассоциируется адапторная молекула FADD, одним своим концом идентичная домену смерти рецептора, а другим DED (Death Enhanced Domain) домену на регуляторном участке молекулы прокаспазы 8. Последние данные свидетельствуют о том, что после ассоциации молекул прокаспазы 8 с комплексом рецептора, происходит димеризация молекул прокаспазы 8. Получившийся димер прокаспазы обладает протеолитической активностью и способен к расщеплению другого такого же димера прокаспаз. Таким образом, молекула прокаспазы 8 способна к автогидролизу только в виде димера, когда для неё будут подготовлены специфические условия. (87) Сначала от молекулы прокаспазы отщепляется маленький домен р10, а затем происходит отщепление большого протеолитического домена р18 от регуляторного участка прокаспазы. Получившаяся активная каспаза 8 функционирует в виде комплекса 2 маленьких доменов и 2 больших доменов. Интересно, что у получившейся каспазы 8 меняется специфичность - она больше не способна расщеплять молекулу прокаспазы 8, зато приобретает способность к гидролизу предшественника эффекторной каспазы 3 - прокаспазы 3. Весь этот комплекс молекул, образующийся на рецепторе, получил название DISC (Death Inducing Signaling Complex) - индуцирующий смерть сигнальный комплекс. Механизмы регуляции индукции апоптотического сигнала включают в себя ряд молекул, способных к образованию комплексов с адапторной молекулой FADD вместо прокаспазы 8. Эти молекулы FLIPl и FLIPs при их высокой концентрации препятствуют образованию активных димеров прокаспаз 8 и блокируют проведение апоптотического сигнала.

Для проведения сигнала с помощью TNF механизм индукции каспазы 3 немного другой. Судя по последним данным, в комплекс рецептора и адапторных белков не входит сама каспаза 8 или 10. Они рекрутируются в этот комплекс позднее, когда после интернализации рецептора адапторные молекулы диссоциируют от процессируемого рецептора и у них станут доступными сайты связывания для каспаз 8 и 10. Таким образом, процесс активации апоптоза через TNF медленнее, чем через FasL.(49)

Эффекторная каспаза 3 функционирует тоже в виде комплекса из двух белков р 17 и двух белков р12, получающихся из двух молекул неактивного предшественника при протеолизе, например, активной каспазы 8. Для каспазы 3 показано, что при апоптозе активный фермент проникает в ядро, где его мишенями становятся некоторые транскрипционные факторы, предшественник эндонуклеазы, которая предположительно участвует во фрагментации хроматина, делая невозможным продолжение нормальной жизнедеятельности клетки. На этой стадии гибель клетки уже предрешена. Также мишенями для каспазы 3 являются другие эффекторные каспазы, такие как каспазы 6 и 7. Сейчас считается, что каспаза 3 играет центральную роль в индукции апоптоза в клетке. Именно к ней в конечном итоге сводятся все остальные сигнальные пути.(86)

В описанном выше пути проведения сигнала имеется интересный механизм регуляции, основанный на состоянии клетки на момент поступления в неё апоптотического сигнала. Если у клетки не генерируется достаточное количество активной каспазы 8, необходимое для преодоления порогового значения для активации каспазы 3, то путь проведения сигнала проходит с участием митохондрии. В самой митохондрии заложен механизм, контролирующий её правильное функционирование. Сбои в её работе приводят к разобщению процессов переноса электронов во внутренней мембране митохондрий и генерации опасных для клетки активных форм кислорода. Поэтому в митохондрии существует механизм, запускающий апоптоз в клетке при серьезном нарушении работы митохондрии. Этот механизм реализуется с участием белков, кодируемых семейством генов ВСЬ-2. (88-90) Семейство белков ВСЬ-2 включает в себя ряд про- и антиапоптотических белков, от соотношения которых зависит пороговое значение, необходимое для активации программы апоптоза в клетке. Антиапоптотические белки включают в себя BCL-2, BCL-Xl, BCL-W и другие. В их структуру входят 4 домена, при этом четвертый играет важную роль для их активности. В проапоптотических белках (ВАХ, ВАК, BCL-XS) важную роль играет третий домен, ответственный за их апоптотическую активность. Существуют белки, содержащие только этот домен (BID, BAD), проявляющие проапоптотическую активность. При этом показано, что белки этого семейства функционируют в виде димеров. При этом гомодимеры апоптотических белков вызывают апоптоз, а гетеродимеры предотвращают его. Часть из белков локализована в цитоплазме, а часть находится на мембране митохондрий. В самой митохондрии находится механизм, контролирующий ее нормальное функционирование. Если работа митохондрий нарушена и ее деятельность опасна для самой клетки и ее окружения, то с помощью белков семейства BCL-2 в митохондриальной мембране образуются поры, через которые в цитоплазму выходит цитохром С. В комплексе с белком Apaf-1 и АДФ он образует высокомолекулярный комплекс - апоптосому, которая напоминает протеосому по своей структуре и является фабрикой по гидролизу прокаспазы 3 и производству активной caspase-З. Также апоптосома участвует в гидролизе других апоптотических субстратов. Кроме этого, из митохондрии выделяется ряд других белков, тем или иным способом влияющих на основные компоненты пути проведения апопототического сигнала. Например, выделяющийся из митохондрии вместе с цитохромом С белок Smac/DIABLO блокирует ингибиторы каспазы 3 белки IAP1 и 2, понижая таким образом пороговый сигнал для активации процесса апоптоза. Другой компонент, выделяемый из митохондрии, AIF (Apoptosis Inducing

Factor) был найден в ядре, где он способен взаимодействовать с некоторыми белками. (91-92)

Белки семейства BCL-2 являются важными участниками апоптотических процессов, так как именно через них другие клеточные системы, после возникновения в них серьёзных сбоев, запускают апоптоз в клетке. Это можно продемонстрировать при проведении сигнала через продукты сфингомиелинового цикла. (93) Для некоторых продуктов гидролиза сфингомиелина, таких как церамид, показано, что они могут вызывать апоптоз в некоторых клетках. В то же время другие продукты, как например, сфингозин-1-фосфат, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Показано, что церамид передаёт апоптотический сигнал тоже через митохондрию, используя имеющийся там механизм индукции апоптоза. (94)

Другие регуляторные каспазы ответственны за генерацию сигналов апоптоза из других клеточных компартментов, где возможны сбои в работе внутриклеточных процессов. Например, для каспазы 2 показано, что она локализуется в эндоплазматическом ретикулуме и способна активироваться в ответ на неполадки в системе эндо- и экзоцитоза.

Кроме протеаз семейства caspace существует целый ряд других протеаз, для которых показана важная роль в процессе апоптоза. В ядре, например, локализованы Са+-зависимые протеазы, активация которых происходит при повышении концентрации ионов Са+, наблюдаемой при апоптозе некоторых клеток. Их субстратами являются некоторые ядерные белки и ферменты. (95)

Кроме того, сериновые протеазы - гранзимы способны индуцировать апоптоз при попадании в цитоплазму клеток. Механизм их действия пока до конца не ясен. Показано, что они могут расщеплять белки по аспаргиновым остаткам и, таким образом, активировать каскад савразе. Однако они играют важную роль в процессе гибели клеток-мишеней, вызванной действием гранулярных лимфоцитов. (95)

Также показано, что важную роль в процессах апоптоза играет оксид азота N0. Однако здесь данные довольно противоречивы. С одной стороны, N0 способен в ряде случаев вызывать апоптоз, а с другой стороны, он является хорошим антиоксидантом, тем самым блокируя апоптоз, который вызывают в клетке повышенный уровень активных форм кислорода. Однако ясно, что оксид азота играет важную регуляторную роль в клетке. (96-98)

Здесь перечислены только основные пути передачи сигнала на апоптотическую смерть. Суммируя вешеизложенное, можно казать, что в клетке имеется 2 основных пути проведения апоптотического сигнала. В первом пути в проведении сигнала участвуют протеазы семейства каспаз, являющиеся основным компонентом клеточной системы апоптоза. Каскад реакций, начинающийся с активации регуляторных каспаз, приводит к активации эфекторной каспазы 3 -центральной каспазы в процессе апоптоза. Этот путь проведения сигнала отличается быстрой кинетикой и ориентирован на специфичное и быстрое уничтожение клетки, запускаемое синалом извне. В проведении сигнала по второму пути участвует митохондрия и её белки. Этот механизм ориентирован на обработку сигналов о различных сбоях внутри самой клетки, и необходим для элиминации из многоклеточного организма тех клеток, которые стали потенциально опасны для всего организма и не могут больше поддерживать свою жизнедеятельность. В итоге при передаче сигнала по второму пути все равно активируется каспаза 3, и далее процессы апоптоза протекают одинаково. После того, как активировалась каспаза 3, пути назад для клетки уже нет. Однако, существует немало других механизмов, которые, как правило, на какой-то стадии сводятся к этим двум.(86)

В связи с этим представляется важным охарактеризовать пути передачи сигнала тем или иным белком для того, чтобы узнать, какие апоптотические механизмы вовлечены в данную систему, какие белки участвуют в передаче сигнала, и, таким образом, точно охарактеризовать процессы, протекающие в клетке и ведущие к ее гибели.

В рамках данной работы исследуется взаимодействие клеток иммунной системы и раковых клеток. В первую очередь интересны механизмы лизиса раковых клеток лимфоцитами, а также исследуются механизмы защиты раковых клеток. Это исследование представляется важным для понимания процессов, протекающих в организме человека при противоопухолевом иммунном ответе.

Результаты и обсуждение.

Описание системы.

Для работы была использована система ЛАК клеток. ЛАК клетки получали на 6 день инкубации с цитокином IL-2. В зависимости от продолжительности их инкубации с IL-2 они проявляют два пика цитолитической активности: на 4 и 6 сутки инкубации. На 4 сутки инкубации их популяция представлена в основном ЕКК клетками, экспрессирующими на своей поверхности CD 16. На 6 сутки инкубации их популяция в основном представлена CD3+, CD8+ лимфоцитами - ЦТЛ. Активность ЛАК клеток выше на 6 сутки, поэтому в работе будут приводиться данные для ЛАК клеток, полученных на 6 сутки инкубации с IL-2.

Для анализа состава популяции получаемых ЛАК клеток было проведено исследование с помощью проточной цитофлуометрии с использованием маркеров эффекторных Т-клеток CD3 и CD8, а также ЕКК-клеток CD 16 и CD56.

На рисунке 1 приведены данные по анализу популяции ЛАК клеток. Как видно, большую часть клеток составляют ЦТЛ CD3+ CD8+. При этом в составе клеток присутствует две субпопуляции Т-лимфоцитов - малые негранулярные и большие гранулярные Т-лимфоциты. Как видно из данных проточной цитофлуометрии, малые негранулярные клетки (окно А) практически все несут маркер CD3, а половина из них ещё и CD8. В то же время большие гранулярные клетки (окно В) состоят из CD3+ С D8+ ЦТЛ лишь на 35%, хотя именно эта субпопуляция клеток обладает наибольшей удельной активностью. При этом ни в одной из субпопуляций клеток не зафиксировано значительного количества ЕКК клеток.

SS

Рис.1 Анализ популяции JIAK клеток с помощью проточной цитофлуометрии. (FS/SS). (Форма частиц/размер)Окно А-большие гранулярные клетки, окно B-маленькие негранулярные. Рядом с окнами указан % от общего числа клеток, находящихся внутри окна.

Маркер Окно А Окно В

CD3 59% 98.4%

CD8 35.4% 48.8%

CD16 0% 0.7%

CD56 2.7% 0.8%

Данные статистики по субпопуляциям ЛАК клетках.

Основной эксперимент в данной системе выглядит следующим образом. После инкубации с IL-2 ЛАК клетки совместно инкубируются со своими мишенями - трансформированными клетками эритроидной природы К-526. Клетки культуры К-562 интересны тем, что экспрессируют на своей поверхности Fas рецептор. При контакте с трансформированными клетками ЛАК клетки активируются и индуцируют лизис этих клеток-мишеней. При этом в раствор секретируется набор белков, обладающих цитолитической активностью. Эти белки не лизируют клетки К-562 и сами лимфоциты, однако проявляют свою активность против других мишеней. Для анализа кондиционная среда после совместной инкубации ЛАК клеток и их мишеней К-562 анализируется на токсичность на другой культуре клеток L-929-культуре трансформированных фибробластов мыши. Для этой культуры клеток интересным является то, что они не экспрессируют Fas рецептора и их лизис проходит по другим механизмам, чем лизис

Рис.2 Схема основного эксперимента.

Характеристика механизмов цитотоксичности ЛАК клеток.

При инкубации ЛАК клеток с трансформированными клетками К-562 смерть клеток наблюдается уже после 3 часов совместной инкубации.

Fas+К-562. iBief.A антитела

На рис.3 приведена активность JIAK-клеток по отношению к клеткам-мишеням, содержащим и не содержащим Fas-рецептор на цитоплазматической мембране. Можно видеть, что не содержащие Fas клетки линии L-929 (рис. 3.2) лизируются в значительно меньшей степени, чем содержащие Fas-рецептор клетки линии К 562 (рис. 3.1).

Активность, % -А М W Ü1 3 О О О О О 1 1 1 1 1 Hh

1 2 3

Рис. 3. Цитолитическая активность JIAK-клеток в соотношении 20:1 по отношению к Fas содержащим (1,3) и Fas не содержащим (2) клеткам-мишеням после 3 часов совместной инкубации. 1 - цитотоксичность JIAK-клеток по отношению к линии клеток К-562; 2 - цитотоксичность JIAK-клеток по отношению к линии клеток L-929; 3 - цитотоксичность JIAK-клеток по отношению к линии клеток К-562 в присутствии антител к Fas L.

Активность JIAK клеток по отношению к Fas содержащим клеткам практически полностью подавлялась антителами к Fas L. Эти результаты свидетельствуют о том, что при контакте ЛАК клеток с клетками мишенями на мембране лимфоцитов активируется Fas L, индуцирующий апоптоз в чувствительных клетках.

Секреторные механизмы лизиса выявляются после длительной инкубации ЛАК-клеток с клетками - мишенями (18 ч) и обусловлены выделением ЛАК-клетками в зону контакта растворимых цитотоксических белков (99). Обычно в литературе секреторный механизм лизиса связывается с экзоцитозом лимфоцитами в зону контакта цитолитических гранул, содержащих специфические протеазы - гранзимы и порообразующий белок -перфорин (100). Из приведенных на рис.4 результатов можно видеть, что гранзимы действительно присутствуют в супернатанте ЛАК-клеток, тогда как перфорин, по-видимому, не секретируется ЛАК-клетками в данном случае.

0,350,3 • 0,25

I 0,2ю о 0,15' ш

0,1 '

0,05 < 0«

10

-г

15

Время, мин т—

20

25

30

Рис. 4. Протеолитическая активность гранзимов в супернатанте ЛАК-клеток. 2 - супер натант ЛАК-клеток получали в присутствии 4мМ ЕвТА.

Свойственная перфорину гемолитическая активность не была зарегистрирована, что коррелирует с литературными данными, свидетельствующими об активации перфорина в ЛАК-клетках на уровне транскрипции, а не трансляции (101).Секреторный механизм лизиса не ограничивается экзоцитозом гранул, как видно из результатов, приведенных на рис. 5. Цитотоксическая активность супернатанта ЛАК-клеток практически не снижается при связывании экзогенного кальция в присутствии 4 мМ ЕвТА, блокирующего экзоцитоз (рис. 5). В то же время активность гранзимов в супернатанте ЛАК-клеток в присутствии 4 мМ ЕвТА (рис. 4.2) составляла не более 5% от исходной, что очевидно связано с уменьшением секреции гранулярных белков.

Рисунок 5. Активность супернатанта ЛАК клеток полученного в присутствии 4мМ ЕвТА, 5 мг/мл брефелдина А и антител к Рав(1:500).

В литературе принято считать, что цитотоксические белки в основном активируются на мембране средних и малых лимфоцитов, а цитотоксичность больших гранулярных лимфоцитов преимущественно связана с экзоцитозом цитолитических гранул (102). Мы показали, что ЛАК-клетки, среди которых наибольшую активность проявляют большие гранулярные лимфоциты, могут осуществлять, как контактный путь лизиса, так и секрецию цитотоксических белков, не заключенных в цитолитические гранулы. Было решено проверить, поступают ли эти белки во внеклеточное пространство путем непрерывной секреции через аппарат Гольджи. Это предположение согласуется с имеющимися в литературе электронномикроскопическими исследованиями, свидетельствующими о гипертрофии и активации аппарата Гольджи как в малых, так и в больших гранулярных лимфоцитах и о перемещении комплекса Гольджи в зону контакта с клетками-мишенями (103). Чтобы проверить, участвует ли в секреции комплекс Гольджи, мы использовали ингибитор Брефелдин А — антибиотик, блокирующий транслокацию белков в аппарат Гольджи. В присутствии 5 мг/мл Брефелдина А лимфоциты не секретировали цитотоксических белков, как видно на рисунке 5. Цитотоксическая активность кондиционной среды ЛАК клеток снижалась до уровня спонтанной гибели раковых клеток. Таким образом, можно сделать выводы о том, что секреция цитотоксических белков ЛАК клеток проходит через аппарат Гольджи.

Для ЛАК клеток нами было также показано, что выделение в супернатант цитотоксических белков зависит от взаимодействия РавЬ на поверхности лимфоцитов с Рав-рецептором на мембране клеток-мишеней. Супернатант ЛАК клеток полностью неактивен, если получать его в присутствии антител к Раз-рецептору.(рис.5) По-видимому, РавЬ-РаБ взаимодействие играет важную роль в индукции секреции других цитотоксических белков.

Из приведённых выше данных следует, что ЛАК клетки на 6 сутки инкубации с цитокином IL-2 состоят в основном из Т-лимфоцитов. При этом в их составе наблюдается 2 субпопуляции клеток - малые негранулярные клетки, состоящие из малых негранулярных лимфоцитов (~100% клеток экспрессируют CD3 и ~50% - CD8), и большие гранулярные клетки, треть которых является большими гранулярными ЦТЛ. Контактная цитолитическая активность ЛАК клеток выше для мишеней, которые экспрессируют Fas рецептор. Однако, активность цитолитических агентов, секретированных ЛАК клетками в ответ на взаимодействие с Fas-содержащими клетками-мишенями, способна проявлятся и на Fas" мишени. Эта цитотоксичность против Fas-негативных мишеней, возможно, помогает клеткам иммунной системы в организме инфильтрировать опухоль, клетки которой начали терять Fas рецептор. Для этого типа цитотоксичности было показано, что он проявляется через секрецию с помощью аппарата Гольджи.

Анализ цитотоксических белков ЛАК клеток.

Анализ выделяемых ЛАК клетками белков с помощью антител к известным цитотоксическим белкам: TNF-a, TNF-P, растворимой форме Fas L, у-интерферону, показал их отсутствие в исследуемых нами условиях. Кроме того, цитолитическая активность супернатанта ЛАК клеток не изменялась в присутствии антител к приведенным выше белкам.(рисунок 6)

S.P 35 0s*

J 30

8 25

20

15 g 10

Г Л

Рисунок 6. Цитотоксическая активность белков супернатанта ЛАК клеток в присутствии антител к известным цитокинам.

Было показано, что ЛАК клетки выделяют широкий спектр цитотоксических белков. (99) Иммуноферментный анализ этих белков показал, что они обладают высоким сродством к антителам к цитотоксическому белку Tag7(PGRP-S). Цитотоксичность тотальной кондиционной среды снижалась на 90% в присутствии антител к Tag7(PGRP-S), как это видно на рисунке 6. Иммуноферментный анализ показал, что в супернатанте ЛАК клеток присутствует 3 мажорных белка, взаимодействующие с антителами к Tag7. (рисунок 7)

20кД

14.4кД

Ем ЦП 5 • В " • --ч . •• t . .г«п.

Рисунок 7. Вестерн-блот анализ супернатанта ЛАК клеток антителами к Tag7.

Эти белки имеют молекулярные массы 17, 30, 50 кД. Так как сам белок Tag7(PGRP-S) имеет молекулярную массу 21 кД, мы предприняли исследование с помощью масс спектрометрии с целью установить, не являются ли эти белки мономером, димером и тримером белка Tag7.

Результаты масс спектрометрического анализа:

Р17 рЗО р50 Тад7 Н HSP70

Масса Пептид + Масса Пептид + :

616,0 614,5 614,3 615,62 5 К 614,77 7-8

696,5 696,80 41-42 Na

800,2 800,6 799,86 52 К

801,0 800,91 34-35 Na

1199,1 1198,40 18

1221,8 1221,40 18 Na

1258,7 1257,7 1258,41 39

1310,7 1311,46 68 Na

1487,9 1489,3 1488,59 4 Na

1489,3 1489,67 44 Na

1628,3 1628,6 1628,04 2-3 - 1626,90 17-18

1668,5 1666,87 6 С

1701,3 1699,69 23 Na

1782,5 1783,04 62-64

1848,9 1848,03 64-67 К

2013,7 2014,26 19-20 К

2139,3 2139,0 2138,7 2137,47 42-44

2150,3 2152,0 2150,47 61-64 К

2259,7 2261,60 12-13 с

2261,4 2263,9 2261,60 12-13 с 2262,51 63-66 Na

2263,9 2263,49 5-6 с+к

3243,7 3243,52 23-26 К

5647,3 5651,7 5651,51 10-12 Na 5650,52 49-51 К

5751,7 5751,7 5752,8 5751,73 2-6 К 5755,39 37-41 C+Na

В таблице приведены значения масс пептидов, полученных в результате триптического гидролиза белков ЛАК клеток 17, 30, 50 кД, а также рекомбинантных белков Tag7 и Hsp70. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что исходные белки 17, 30, 50 кД ЛАК клеток состоят из нескольких белков, не расходящихся в денатурирующих условиях в SDS-электрофорезе. Эти данные позволили нам предположить, что в состав белков кроме Tag7 входит ещё белок теплового шока Hsp70. (Heat Shock Protein)

Поэтому мы использовали антитела к этому белку для дальнейшего анализа белков из кондиционной среды ЛАК клеток. Было показано, что цитотоксичность тотальной кондиционной среды почти полностью ингибируется добавлением антител к Hsp70, также как и антител к Tag7. (рис. 6)

Было высказано предположение, что белки ЛАК клеток являются фрагментами комплекса 2 белков -Tag7 и Hsp70. Однако спектр молекулярных масс белков ЛАК клеток (17, 30, 50 кД) не соответствует молекулярной массе комплекса двух белков Tag7(PGRP-S)(20^) и Нзр70(70кД). Для поиска предшественника цитотоксических белков ЛАК клеток было предпринято исследование мембранной фракции ЛАК клеток. Данные о том, что белки ЛАК клеток выделяются из аппарата Гольджи, позволили заняться изучением грубой мембранной фракции ЛАК клеток. Из мембранной фракции ЛАК клеток удалось выделить белок, обладающий цитотоксической активностью. На SDS-электрофорезе в мягких условиях (без (S-меркаптоэтанола) этот белок имеет молекулярную массу 90 кД, соответствующую полноразмерному комплексу Tag7/Hsp70. Данный белок взаимодействовал с антителами к Tag7(PGRP-S) и Hsp70, что дало нам возможность заключить, что он является исходным комплексом белков Tag7/Hsp70(pnc. 8). Мы выдвинули предположение, что широкий спектр цитотоксических белков, наблюдаемый в кондиционной среде ЛАК клеток, являются фрагментами полноразмерного исходного комплекса Tag7(PGRP-S) и HSP70, имеющего массу 90кД. анти Tag7 анти Hsp70

Рисунок 8. Электрофорез в мягких условиях мембранной фракции белков ЛАК клеток. Проявление осуществлялось антителами к Tag7(PGRP-S) и Нзр70.

Для определения цитотоксической активности белков супернатанта ЛАК клеток мы сконцентировали его и провели НРЬС хроматографию на колонке 8ирегёех75.

30kD aHTH-HSP70 В анти-Тад7 И Белки ЛАК

Рисунок 9. HPLC гельфильтрация супернатанта ЛАК клеток. Кондиционная среда ЛАК клеток концентрировалась и разделялась на колонке Superdex 75. Собранные фракции использовались в тестах на токсичность с антителами к Tag7(PGRP-S) или Hsp70.

На рисунке 9 виден профиль цитотоксичности, получаемый при фракционировании кондиционной среды ЛАК клеток на колонке Superdex75 (Pharmacia Biosciences), при скорости тока 0.5 мл/мин. Из представленных на рисунке данных видно, что белки с молекулярными массами 90, 70, 55, 30 и 17 кД обладают цитотоксической активностью. Причём цитотоксическая активность каждой фракции ингибируется антителами к Tag7(PGRP-S) и Hsp70.

АТФ играет важную роль для шаперонной функции белка Шр70. Взаимодействие с АТФ вызывает вызывает диссоциацию комплекса белка с №р70. В то же время гидролиз АТФ важен для цитотоксичности, так как добавление 5мкМ негидролизуемого аналога АТФ - АМР-РЫР полностью блокирует цитотоксическую активность кондиционной среды. В противоположность негидролизуемому аналогу, добавление АТФ в кондиционную среду, содержащую цитотоксические белки, увеличивает их активность.(рис. 10).

Sn LAK + 5|jM ATP + 5рМ AMP-PNP

Рисунок 10.Влияние АТФ и негидролизу емого аналога АТФ на цитотоксичность супернатанта JIAK клеток.

Более точный анализ с помощью масс спектрометрии позволил локализовать участки молекул Tag7 и Hsp70, участвующие в формировании активных белков JIAK клеток. На рисунке 11 показаны участки молекулы Hsp70 и Tag7, принимающие участие в формировании цитотоксических белков ЛАК клеток.

Рисунок 11. Структурный анализ фрагментов белка Hsp70 и Tag7 найденных в белках ЛАК клеток.

Из данных масс спектрометрического анализа видно, что взаимодействие белков в комплексе не является одноточечным. Кроме участка, ответственного за взаимодействие с пептидами, в молекуле Hsp70 в образовании комплекса участвует фрагмент из АТФ-азного домена, связывающий АТФ. Такое расположение участков молекулы Hsp70, принимающих участие в связывании с Tag7, позволяет объяснить зависимость цитотоксичности от АТФ, так как 1 фрагмент находится в АТФ-азном домене. В свою очередь, в молекуле Tag7 также выявлено 2 участка взаимодействия с Hsp70, располагающихся на разных концах молекулы Tag7.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что ЛАК клетки секретируют через аппарат Гольджи набор белков, обладающих цитотоксической активностью. Эти белки являются фрагментами комплекса 2 белков Hsp70 и Tag7. Активность белков

ЛАК клеток АТФ-зависима, что подтверждается ингибированием с помощью негидролизуемого аналога АТФ - АМР-РЫР.

Апоптотическая активность белков ЛАК клеток.

Ранее при исследовании кинетики цитолиза в лаборатории Молекулярной Иммуногенетики рака было установлено, что цитотоксичность, индуцируемая белками ЛАК клеток, составляет сумму отдельных цитолитических процессов, протекающих с различной скоростью (104). При этом гибель клеток мишеней осуществлялась по пути апоптоза. Как можно видеть из результатов, приведенных на рис. 12 наиболее характерные максимумы активности проявляются через 3 и 24 часа.

Кинетическая кривая цитотоксичности

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, часы

Рисунок 12. Кинетическая кривая цитотоксичности белков ЛАК клеток.

Подобная дискретность цитотоксичности и резко различающаяся скорость цитолиза составляющих процессов могли быть вызваны включением различных механизмов трансдукции апоптотического сигнала, и мы попытались выяснить, какие механизмы апоптоза включены в процесс проведения сигнала. Наиболее изученными механизмами являются проведение сигнала через каскад протеаз каспаз и через митохондрию. Поэтому было решено проверить, какова роль каспаз и митохондрий в регуляции цитолиза, вызванного действием цитотоксических белков ЛАК клеток. Также мы посмотрели, какова роль лизосом, которые принимают участие в гидролизе белков, полученных клеткой путём экзоцитоза, а также использовали ингибитор экзоцитоза цитохалазин Б. Результаты опытов представлены на рисунках 13 и

Цитотоксичность супернатанта ЛАК клеток после 3 часов ингибитор О контроль

Рисунок 13. Цитотоксичность белков ЛАК клеток в присутствии ингибиторов апоптоза после 3 часов инкубации с клетками-мишенями.

Цитотоксичность супернатанта ЛАК клеток после24 часов.

Ионил УД/АОСНО Хлороквин Циклоспорин Цитохалазин Б А ингибитор @ контроль

Рисунок 14. Цитотоксичность белков ЛАК клеток в присутствии ингибиторов апоптоза после 24 часов инкубации с клетками-мишенями.

На рис. 13 и 14 представлены результаты по определению цитотоксичности в присутствии ингибитора каспазы 1 (УЛ/АОСНО), имеющего сродство ко всем протеазам семейства каспаз; антиоксиданта ионила, снижающего уровень супероксида кислорода и перекисей, накапливающихся в митохондриальных мембранах на ранних стадиях апоптоза; Хлороквина - ингибитора лизосом, препятствующего понижению рН в лизосомах, что предотвращает деградацию экзоцитированных белков; Циклоспорина А, ингибирующего образование ранних пор на мембране митохондрии, через которые в цитозоль клетки выходят апоптотические субстраты; и Цитохалазина Б - препарат, блокирующий экзоцитоз, препятствуя сборке микротрубочек.

Данные экспериментов позволяют предположить, что цитотоксическим белкам ЛАК клеток для проявления своей активности необходимо проникновение внутрь клетки-мишени.

Цитохалазин Б блокирует проведение цитотоксического сигнала и после 3 часов, и после 24 часов инкубации.

Можно видеть, что быстрые цитолитические процессы оказались каспазо-зависимыми — ингибитор каспазы 1 полностью блокировал цитотоксичность, развивающуюся через 3 часа инкубации клеток-мишеней с цитотоксическими белками. Медленные процессы, проявляющиеся через 24 часа инкубации, не ингибировались, а слегка активировались ингибитором каспаз.

Добавление к клеткам ионила полностью блокировало процесс апоптоза после 24 часов инкубации, но не влияло на смерть клеток через 24 часа. Эти данные коррелировали с действием ингибитора лизосом-хлороквина. Он также ингибировал активность только на 24 час инкубации.

Однако циклоспорин А ингибировал только быстрые по времени апоптотические процессы, не оказывая влияния на смерть клеток через 24 часа. Эти данные позволяют предположить, что в клетке существует ряд механизмов, участвующих в проведении апоптотического сигнала. Более быстрый механизм реализуется с участием протеаз семейства каспаз. Также в нем принимают участие апоптотические субстраты, которые проникают в цитоплазму клетки через поры в мембране митохондрии (например цитохром С), что также приводит к активации каспаз.

Однако другие процессы, требующие больше времени для гибели клетки (24 часа), также идут с участием митохондрии. В этом случае, по-видимому, необходима протеолитическая деградация цитотоксических белков ЛАК клеток в лизосоме. Продукты такой деградации способны вызывать разобщение процессов переноса электронов на внутренней мембране митохондрии и приводить к генерации значительных количеств активных форм кислорода.

Поэтому антиоксидант ионил блокирует смерть клеток, генерирующих активные формы кислорода. Гибель клеток после 24 часов инкубации каспаз-независима.

Опираясь на полученные данные, можно заключить, что схема реализации этих механизмов выглядит следующим образом: (рисунок 15)

Брефелдин А анти^ая актиРазЬ г ^ л 4 У

Га8+клетк,

Та«!?

Гае цитоток-сические ♦ белки ф • | а» aнтиTag' лизосома

Цитохалазин Б ^УуС г д у- Хлороквин

- 4У

ЦиклоспоринА« ^у- - —уг - ^ / / и |/ Цитохром С ^Ч^ V \

-нов ^Митохондрия *

I каспазы

VADCHO!

Ионил

Лизис клетки

Рисунок 15. Схема путей проведения апоптотического сигнала в клетках мишенях под действием цитотоксических белков ЛАК клеток.

Характеристика цитотоксических белков нелимфоидных клеток.

Выбранная система позволяет не только моделировать ситуацию при иммунном ответе на трансформированные клетки. В случае если мы возьмем избыток трансформированных клеток над лимфоцитами(20:1), мы получим обратную ситуацию.

Трансформированные клетки К-562 выделяют набор белков, вызывающих лизис лимфоцитов.(рис. 16) При этом цитотоксичность ингибировалась добавлением антител к TNF-a, но не антител к Tag7.

Рисунок 16. Активность белков нелимфоидных клеток в присутствии антител к TNF-a и Tag7.

Этот процесс описан в литературе и воспроизводит ситуацию, возникающую при антираковом иммунном ответе при инфильтрации лимфоцитами раковой опухоли. При рассмотрении ситуации в системе с избытком раковых клеток наблюдается смерть лимфоцитов. При этом трансформированные клетки К-562 секретируют в раствор набор белков с молекулярными массами 17, 26, 40, 53 кД. Иммунологический анализ показал, что эти белки имеют сродство к антителам к TNF-a.(pnc. 17)

Рисунок 17. Вестерн-блот анализ белков из супернатанта нелимфоидных клеток антителами к Т№-а.

Полученные данные очень хорошо согласовались с результатами нашей предыдущей работы, выполненной совместно с сотрудниками лаборатории С. В. Разина на смешанных культурах нелимфоидных клеток.

Сравнительный анализ путей проведения апоптотического сигнала в клетках-мишенях под действием цитотоксических белков лимфоидных и нелимфоидных клеток.

В рамках данной системы мы исследовали воздействие цитотоксических белков лимфоцитов и трансформированных клеток на культуру Ь-929. При этом мы сравнивали воздействие цитотоксических белков, полученных из лимфоцитов и полученных из трансформированной культуры клеток К-562.

В данной системе в обоих случаях смерть клеток под действием белков нелимфоидной природы реализовалась по апоптотическому пути. Было установлено, что цитотоксичность также определяется рядом отдельных цитотоксических процессов, протекающих с различной скоростью, (рис. 18) Такой вид кинетической кривой цитотоксичности и резко различающаяся скорость цитолиза составляющих процессов может быть вызван включением различных механизмов трансдукции апоптотического сигнала, также как и для цитотоксических белков ЛАК клеток. В кинетике цитолиза в обоих случаях наблюдалось два характерных пика цитотоксической активности после 3 и 24 часов инкубации.

Апоптотическая активность супернатанта нелимфоидных клеток.

25 т

20

§ 15 х

Г и о Ю о н Я

Я" 5 0

Л / 1 ; I / I

I \ у I

10 15 20

Время, часы

25

Рисунок 18. Кинетическая кривая цитотоксичности белков супернатанта нелимфоидных клеток.

Для выяснения путей проведения сигнала программируемой клеточной гибели прод децствием белков нелимфоидных клеток был проведён анализ с использованием тех же ингибиторов, что и для экспериментов с ЛАК клетками. В опытах использовались ингибитор каспаз УУАЭСНО, антиоксидант ионила, ингибитор лизосом хлороквин и циклоспорин А. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что для проявления своих цитотоксических свойств белкам необходимо проникновение в клетку. Ингибитор экзоцитоза цитохалазин Б полностью блокировал эффект, как и для белков лимфоцитов. Результаты экспериментов представлены на рисунках 19 и 20.

Цитотоксичность через 3 часа инкубации.

25 г --------------------------------------------,—-------------------------------.------ --------------

Иония УЛ/АйСНО Хлороквин Цитохалазин Б Супернатант К562 + ингибитор ШСупернатант К562

Рисунок. 19. Цитотоксическая активность супернатантов нелимфоидных клеток через 3 часа инкубации с клетками-мишенями.

Цитотоксичность через 24 часа. л Iо о

X т 5 о X о н о Iи -Л у чХ р гч т рЬ гЬ гЬ х 1 г Г— о/ Супернатант К562 + ингибитор ПСупернатант К562

Рисунок 20. Цитотоксическая активность супернатантов нелимфоидных клеток через 24 часа инкубации с клетками-мишенями.

Гибель клеток Ь929 через 3 часа инкубации с цитотоксическими белками нелимфоидных клеток связана с проведением сигнала при помощи семейства протеаз каспаз, также как и для белков ЛАК клеток. Однако, в отличие от белков ЛАК клеток, генерация активных форм кислорода начинается в клетках-мишенях после 3 часов инкубации. Ингибирование апоптотического сигнала антиоксидантом ионилом вновь коррелирует с действием ингибитора лизосом хлороквина, только для белков нелимфоидных клеток проведение сигнала по этому пути происходит быстрее, чем для белков ЛАК клеток. Проведение апоптотического сигнала через 24 часа инкубации не зависит от протеаз каспаз, для него необходимо участие клеточной митохондрии. Цитотоксическая активность белков раковых клеток после 24 часов инкубации ингибировалась только циклоспорином А. Из этих данных следует, что смерть клеток под действием цитотоксических белков нелимфоидных клеток после 24 часов инкубации проходит с образованием пор в мембране митохондрии. Для белков ЛАК клеток кинетика проведения апоптотического сигнала через митохондрию другая. Для лимфоидных клеток быстрая смерть клеток (3 часа) наступает вследствие образования пор в мембране митохондрии, а медленная (24 часа) из-за накопления активных форм кислорода. Для нелимфоидных клеток, наоборот, быстрая смерть клеток наступает из-за накопления активных форм кислорода, а медленная из-за образования пор в мембране митохондрии.

Таким образом можно заключить, что для проявления своих цитотоксических свойств белкам лимфоидных и нелимфодных клеток необходимо проникновение внутрь клетки-мишени. В обоих случаях апоптоз клеток после 3 часов инкубации наступал из-за проведения сигнала с помощью каспаз. Механизмы проведения сигнала через митохондрию различны для белков лимфоидных и нелимфоидных клеток. Для белков нелимфоидных клеток показано, что они разобщают перенос электронов в митохондрии через 3 часа инкубации, причём этот процесс коррелирует с активностью лизосом. Через 24 часа инкубации эти белки вызывают образование первичных пор в митохондриальной мембране, индуцируя выход апоптотических молекул в цитозоль.

Установлено, что ЛАК клетки, активированные IL-2 в течении 6 суток, лизируют раковые клетки различными путями -контактный путь лизиса зависит от Fas-FasL взаимодействия, а секреторный реализуется с помощью цитотоксических для Fas" клеток L-929 белков. Показано, что секреция цитотоксических белков лимфоцитами проходит через аппарат Гольджи. Выявлено, что цитотоксические белки лимфоцитов являются фрагментами комплекса Tag7-Hsp70. Продемонстрировано, что при избытке раковых клеток они лизируют лимфоциты, используя для этого набор цитотоксических белков, родственных TNF-a. Установлено, что апоптотический сигнал в клетках-мишенях проходит несколькими путями, быстрая смерть клеток через 3 часа зависит от проведения сигнала через каспазы, медленная через 24 часа идет только с участием митохондрии. Однако механизмы проведения сигнала с участием митохондрии различны для белков ЛАК клеток и раковых клеток.

Материалы и методы

Белки, ферменты и реактивы.

В работе использовались реактивы, производимые фирмами Sigma (USA), Merck (Germany), Amersham Biosciences (Sweden), Gibco BRL (USA) и ферменты производства фирм Fermentas (Litvenia), Promega (USA).

Экспрессированный в дрожжах Tag7/PGRP-S мыши был получен и предоставлен Беневоленским C.B.

Культивирование трансформированных клеточных линий, лимфоцитов.

В работе были использованы трансформированные клетки линий К562 (эритроидная лейкемия человека), L929 (фибросаркома мыши). Использованные клеточные линии описаны в American Tissue Culture Collection (USA). Клетки линий К562 представляют собой суспензионную культуру; L929, сорбируются на пластике. Клетки культивировали в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% С02 в 25 см пластиковых матрасах (Costar). Клетки линий К562: культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco BRL) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco BRL) в присутствие 100 мкг/мл канамицина. L929 культивировали в среде DMEM (Gibco BRL) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco BRL) в присутствие 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. При пересаживании монослойных линий клеток на новый матрас клетки промывали раствором трипсина (Gibco BRL) и десорбировали с пластика раствором Версена (Gibco BRL).

Для получения лимфоцитов человека использовалась лейкомасса периферической крови человека здоровых доноров, полученная из Гематологического Научного Центра РАМН. Лейкомасса очищалась в градиенте Ficoll-Paque Plus (Amersham

Biosciences) центрифугированием 30 мин при 400g. Лимфоциты трижды отмывали PBS (фосфатно-солевой буфер) от Ficoll-Paque Plus, центрифугируя 15 минут при 200g. Далее лимфоциты растворялись в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки(СШсо BRL) и 100 мкг/мл канамицина до концентрации 4 млн. клеток на 1 мл. Для активации к лимфоцитам добавляли 1000ед./мл IL-2, и инкубировали в течение 6 суток. IL-2 добавляли каждые 2 суток инкубации.

Выделение мембран клеток.

100 млн лимфоцитов периферической крови человека осаждались 5 мин при 200g, дважды отмывались от среды PBS. Осажденные клетки 10 раз охлаждались в жидком азоте и оттаивали в теплой воде (20°С). Клеточный лизат центрифугировали 15 минут при 900g для осаждения ядер. Затем клеточные органеллы осаждались центрифугированием 20 мин при 14 000 об/мин. Мембранные фракции осаждались центрифугированием 45 мин при 100 000g. Липиды из мембранных фракций удалялись двукратной экстракцией эфира. Остатки эфира испарялись ночь при 4°С. Количество белка определялось по методу Bradford (Sigma).

Аффинная хроматография.

Синтез иммуносорбента.

1 г. CNBr-активированной сефарозы 4В (Pharmacia Biosciences) после набухания в 1 мМ растворе НС1 промывали на плотном стеклянном фильтре небольшими порциями того же раствора. Гель сушили на стеклянном фильтре. Затем к нему добавляли 4,5 мг сорбирующегося белка или антител, предварительно диализованных против 0,1 М NaHC03 рН 8.3 с 0,6 М NaCl. Реакцию проводили в течение 17 часов при температуре 4°С. Избыток белка, не связавшийся с гелем, отмывали 0,1 М NaHC03 рН 8.3. Оставшиеся активные группы блокировали 1 М моноэтаноламином рН 9.0 при комнатной температуре в течение 2 часов. Блокирующий реагент и адсорбированный белок отмывали тем же карбонатным буферов, а затем 0,1 М ацетатом натрия рН 4.0 и PBS рН 7.4.

Хроматография.

На колонки (10x10мм) с иммобилизованными на Sepharose4B (Amersham Biosciences) антителами к Tag7 или Hsp70, белками Tag7 или Hsp70, предварительно уравновешенные PBS, наносили образцы, растворенные в том же буфере. При нанесении на колонки с Tag7 или с Hsp70 скорость подбирали из расчета нанесения образцов не менее 1 часа. Не связавшиеся белки устраняли промывкой 10 объемами колонки буфером: PBS + 0,5 М NaCl, затем 10 объемами PBS без NaCl, и водой. Элюцию проводили четырьмя объемами колонки 0,25 М триэтиламина рН 12. Количество белка во фракциях определяли по методу Bradford (с использованием реактива Bradford, Sigma). Фракции с максимальным количеством белка объединялись и лиофилизировались на SpeedVac (Jouan) в течение ночи. Высушенные белки растворялись в нужном объеме воды или PBS.

Электрофорез и Western блот.

Приготовление образцов для электрофореза:

Образцы, подвергшиеся иммунопреципитации наносили на электрофорез в 20-50 мкл буфера для нанесения (0,063 М Tris НС1 рН 6.8, 5% р-меркаптоэтанол, 2% SDS, 10% глицерол), использованного для элюции иммунореактивного материала. Лиофилизованные образцы растворялись в 20-50 мкл буфера для нанесения.

Супернатанты клеток, а также при превышении объема исследуемого материала 25 мкл, образцы осаждали 70% от насыщения сульфатом аммония. После центифугирования 20 минут при 14 ООО об/мин, белковый осадок растворяли в 20-50 мкл буфера для нанесения. Перед нанесением на электрофорез образцы денатурировали кипячением в течение 5 минут.

Электрофорез в SDS/PAGE и электроперенос:

Разделение белков проводилось в денатурирующем 10-15 % SDS-полиакриламидном геле (толщина 0,75 мм) по Лэммли (105) в камере для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific). Состав электродного буфера: 25 мМ TrisHCl рН 8.3, 0,192 М глицин, 0.1% SDS. Электрофорез осуществляли при постоянном токе: 20 мА в концентрирующем геле, 25 мА - при разделении белков. Длина

разделяющего геля 7 см. Составы гелей:

Реактивы Концентрирующий гель (2 мл) разделяющий (10 мл) гель

10% 12% 15%

Н20 1,4 мл 4 мл 3,33 мл 2,3 мл

30 % акриламид-бисакриламид (19:1) 330 мкл 3,3 мл 4 мл 5 мл

1 М Tris НС1, рН 6.8 250 мкл — — —

1.5 М Tris-HCl, рН 8.8 — 2,5 мл 2,5 мл 2,5 мл

10% SDS 20 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл

10% персульфат аммония 20 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл

TEMED 2 мкл 4 мкл 4 мкл 4 мкл

В качестве стандартов молекулярных весов использовались LMW Calibration Kit for SDS electrophoresis (Amersham Biosciences). После окончания гель-электрофореза белки в геле окрашивали либо переносились на мембрану.

Окрашивание осуществляли водным раствором 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Serva), содержащим 40% этанола, 7% уксусной кислоты в течение 1 часа или в течение ночи, затем гель несколько раз отмывали раствором 40% этанола, 7% уксусной кислоты для выявления полос белков.

Электроперенос осуществляли на мембрану PVDF (Hibond-P, Amersham Biosciences), предварительно смоченную в метаноле. Перенос проводили в аппарате для полусухого электроблоттинга Hoefer SemiPhor (Pharmacia Biotech) при постоянном токе 100 мА в течение 1 часа в Трис-глициновом буфере (20 мМ Tris, 0.2 М глицин, рН 8.5), содержащем 20 % метанола, или в буфере 10 мМ CAPS рН 11 с 10% метанола.

Вестерн блот анализ.

После электропереноса мембраны либо окрашивали, либо помещали в блокирующий раствор для последующего иммуноблоттинга. Окрашивание осуществляли двумя способами: раствором 0,1% Coomassie G-250, содержащим 50% метанола в течение 5 минут с последующей отмывкой водным раствором, содержащим 50% метанола, 5% уксусной кислоты и промывкой водой; раствором PONSO (Roanal), содержащим 5% уксусной кислоты в течение 5 минут с последующей отмывкой водой.

Вестерн блот анализ проводили по стандартной методике, рекомендуемой фирмой изготовителем мембраны и набора реагентов для анализа (Amersham Biosciences). Мембраны, содержащие исследуемые образцы, блокировали в буфере PBS-T

PBS + 0,05% Tween-20 (Loba Chemie), содержащем 1-5% BSA или нежирного молока в течение ночи. После трехкратной пятиминутной отмывки в PBS-T от блокирующего буфера мембраны инкубировали с поликлональными антителами кролика к рекомбинантному Tag7 мыши, рекомбинантному Hsp70 человека (разведение 1:10 000 в буфере PBS-T) в течение 1 часа. После трехкратной промывки мембран PBS-T их инкубировали в течение 1 часа со вторичными антителами козла к иммуноглобулинам кролика (разведение 1:10 000), конъюгированными с пероксидазой хрена. После трехкратной промывки мембран PBS-T, и однократной Н20 детекцию проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ECL+ и фотопленку Hyper Film (Amersham Biosciences), согласно рекомендациям фирмы изготовителя.

Масс-спектрометрический анализ.

Необходимые полосы белков вырезались из электрофоретического геля после 20 минутного вымачивания в воде и разрезались на мелкие кубики 1 мм х 1 мм.

Промывка геля от SDS и кумаси: гель заливался двумя объемами 50% ацетонитрила на 15 минут. Гель обесцвечивался. Если этого не происходило, тот операция повторялась.

Жидкость удалялась, и гель заливался 100% ацетонитрилом. При этом гель сжимался и полностью обесцвечивался.

Удалялся ацетонитрил и гель размачивался в 0,1 M гидрокарбонате аммония. Через 5 минут (после набухания) добавлялся равный объем 100% ацетонитрила.

Жидкость удалялась и гель сушился на SpeedVac 15 минут (до полного высыхания).

Восстановление и алкилирование:

Восстановление Б-З связей проводилось в буфере 10 мМ ЭТТ, 0,1 М гидрокарбоната аммония 45 минут при 56°С.

Жидкость удалялась, а гель охлаждался до комнатной температуры.

Алкилирование проводилось в 55 мМ йодацетамида 0,1 М гидрокарбоната аммония 30 минут в темноте при комнатной температуре.

Удалялся раствор, а гель дважды промывался ацетонитрилом/гидрокарбонатом аммония как описано выше.

Гель высушивался на БреесГУас 15 минут.

Трипсинолиз белков в геле:

Высушенные кусочки геля заливались буфером для гидролиза (40 мкл): 50 мМ гидрокарбоната аммония, 5 мМ хлорида кальция, 12,5 мкг/мл трипсина. Реакция проводилась 45 минут при 4°С.

Удалялись остатки буфера, гель заливался 20 мкл 50 мМ гидрокарбоната аммония, 5 мМ хлорида кальция и оставлялся на ночь при 37°С.

Экстракция пептидов из геля:

Кусочки геля заливались 30 мкл 25 мМ гидрокарбоната аммония, инкубировались 15 минут.

Добавлялся равный объем (30 мкл) 100% ацетонитрил. Инкубировалось 15 минут. Затем жидкость удалялась.

Пептиды экстрагировались дважды 5% муравьиной кислотой в течение 5 минут.

Пептиды высушивались на БреесГУас.

Пептиды растворялись в 3-5 мкл воды и высушивались на металлической подложке, затем на высохшую каплю наносилось 3-5 мкл матрикса БЫВ и высушивалось на воздухе. Спектры молекулярных масс пептидов снимались на приборе MALDI-TOF (в Центре Протеомики НИИ Биомедицинской химии РАМН). Молекулярные массы пептидов анализировались с помощью программы MASCOT Peptide Mass Fingerprint (Matrix Science, http://www.matrixscience.coni/cgi/searchform.pl) и банка данных NCBInr (Japan).

Гельфильтрация.

Tag7, Hsp70, Tag7 вместе с Hsp70, Tag7-EGFP, Tag7-EGFP вместе с Hsp70 диализовались ночь при 4°C против PBS с 5 мкМ АТФ, 5 мкМ MgC12 и с коктейлем ингибиторов протеаз EDTA-free (Boehringer Mannheim). Образцы наносились в 200 мкл колонку Superdex75 (Amersham Biosciences), предварительно уравновешенную против того же буфера. Разделение проводилось при скорости 0.5 мл/мин на AKTA-Purifîer (Amersham Biosciences). Разделяющиеся белки собирались по фракциям 0.5 мл. В качестве маркеров молекулярного веса использовали альдолазу (158 кДа), альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), миогобин (17,8 кДа) и цитохром С (12,4 кДа). За подвижностью белков следили по поглощению при 280 нм и 214нм.

Определение цитолитической активности.

Цитотоксичность комплексов и супернатантов определяли, как описано в работе Гнучев и соавторы (106). Клетки линии L929 инкубировались в 96-луночой плашке при концентрации 30 тысяч клеток в лунке. Перед добавлением образцов супернатант удалялся. Образцы растворялись и добавлялись в 200 мкл среды RPMI 1640. При использовании ингибиторов клетки предварительно икубировались с ионилом, YVADCHO, хлороквином, циклоспорином А, цитохалазином Б, в концентрации Ю^М. При исследовании влияния антител на цитолитическую активность образцов добавляли поликлональные антитела к Tag7, Hsp70, Fas-рецептору, FasL, TNF-a в разведении 1:500. После инкубации 24 часа при 37°С в атмосфере С02 клетки окрашивали 0,0125% раствором трипанового синего. Количество мертвых клеток подсчитывалось под микроскопом в камере Фукса-Розенталя. Обрабатывалось минимум 100 клеток для каждого образца. Цитотоксичность вычислялась по следующей формуле:

T-Sp) где St - количество окрашенных клеток, Sp — количество спонтанно окрашенных клеток (контроль), Т — общее количество клеток.

В некоторых случаях цитотоксичность определялась также и с помощью набора реактивов Cytotox96 (Promega), согласно рекомендациям производителя.

Определение фрагментации ДНК.

Для определения фрагментации ДНК 106 клеток дважды отмывали от среды и ресуспендировали в 1 мл PBS. Для фиксации клеток к суспензии по каплям добавляли 2 мл 100% этанола -20°С, и перемешивали на Вортексе 30 секунд. Фиксированные клетки трижды отмывали в PBS, растворяли в 300 мкл PBS, содержащего 12 мкг пропидиум йодита и 0,15 мг РНКазы и инкубировали 1 час при комнатной температуре в темноте. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре EPICS-V Elite (Coulter) в логарифмической шкале флуоресценции. Возбуждение флуоресценции осуществляли аргоновым лазером Innova-90-б (Coherent, USA). В каждом образце анализировали минимум 104 клеток. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ЕХР032 (Applied Cytometry Systems). Клетки с интенсивностью флуоресценции меньшей, чем основной пик флуоресценции считали гибнущими по апоптозу.

Окрашивание поверхностных CD человеческих лимфоцитов.

Клетки (1*106 кл/мл) дважды отмывали от среды и ресуспендировали в 1 мл холодного PBS с 1% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco BRL). К клеткам добавляли 5мкл моноклональных антител, коньюгированных с красителем фикоэритрином (RPE) фирмы Caltag. Далее клетки инкубировались 45 минут в темноте при 4°С. После этого клетки отмывали трижды в PBS с 1% эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугируя их при 800 об./мин. В течение 5 минут. Для фиксации клеток осадок растворяли в 100 мкл PBS и добавляли 900 мкл холодного 1% раствора параформальдегида, помешивая на Вортексе. Фиксированные клетки трижды отмывали в PBS, растворяли в 300 мкл PBS. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре EPICS-V Elite (Coulter) в логарифмической шкале флуоресценции. Возбуждение флуоресценции осуществляли аргоновым лазером Innova-90-6 (Coherent, USA) на длине волны 488 нм. Флуоресценцию красителя регистрировали на длине волны 600 нм. В каждом образце анализировали минимум 104 клеток. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ЕХР032 (Applied Cytometry Systems).

Фиксирующий раствор готовили из 1г параформальдегида (Sigma), растворённого в 100 мл 0.85% NaCl. Растворение осуществляется при 70°С, а затем pH раствора доводится до 7.4. Полученный раствор хранится при 4°С.

Для регистрации клеток, содержащих Fas и FasL, использовались антивидовые антитела, коньюгированные с красителем СуЗ. К приведённой выше методике при этом добавлялась стадия, когда после отмывания от первичных антител к клеткам добавлялось 5 мкл антикроличьих антител, коньюгированных с СуЗ (возбуждение 488нм, излучение 565-615нм, детектировали на 600 нм). Инкубация проводилась 30 минут в темноте при 4°С. Затем клетки отмывались 3 раза PBS с 1% эмбриональной телячьей сыворотки, и фиксировались, как было описано выше. Анализ осуществлялся также, как описано выше.

Благодарности.

Автор выражает глубокую признательность Сащенко Л.П., Духаниной Е.А., Гнучеву Н.В. за постоянное внимание к работе и научное руководство. Автор также благодарит всех сотрудников лаборатории молекулярной иммуногенетики рака Института Биологии Гена РАН за помощь в работе и написании диссертации. Автор благодарен Демину A.B., Коробко Е.В. и Габибову А.Г. за помощь в процессе работы.

Список литературы.

1 Janeway СА Jr. How the immune system works to protect the host from infection: a personal view. Proc Natl Acad Sci U S

A. 2001 Jun 19;98(13):7461-8.

2 van Ewijk W. T-cell differentiation i s influenced by thymic microenvironments. Annu Rev Immunol. 1991;9:591-615.

3 Anderson G, Moore NC, Owen JJ, Jenkinson EJ. Cellular interactions in thymocyte development. Annu Rev Immunol. 1996;14:73-99.

4 Song R, Harding CV. Roles о f proteasomes, transporter for antigen presentation (TAP), and beta 2 -microglobulin in the processing of bacterial or particulate antigens via an alternate class I MHC processing pathway. J Immunol. 1996 Jun l;156(ll):4182-90.

5 Grosberg RK, Hart MW. Mate selection and the evolution of highly polymorphic self/nonself recognition genes.Science. 2000 Sep 22;289(5487):2111-4.

6 Davis MM, Boniface JJ, Reich Z, Lyons D, Hampl J, Arden

B, Chien Y. Ligand recognition by alpha beta T cell receptors. Annu Rev Immunol. 1998;16:523-44.

7 Morrison LA, Lukacher AE, Braciale VL, Fan DP, Braciale TJ. Differences in antigen presentation to MHC class I-and class Il-restricted influenza virus-specific cytolytic T lymphocyte clones. J Exp Med. 1986 Apr 1;163(4):903-21.

8 Steimle V, Siegrist CA, Mottet A, Lisowska-Grospierre B, Mach B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 1994 Jul 1;265(5168): 106-9.

9 Zuniga-Pflucker JC, Lenardo MJ. Regulation of thymocyte development from immature progenitors. Curr Opin Immunol. 1996 Apr;8(2):215-24.

10 Oettinger MA, Schatz DG, Gorka C, Baltimore D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science. 1990 Jun 22;248(4962): 1517-23.

11 Shinkai Y, Rathbun G, Lam KP, Oltz EM, Stewart V, Mendelsohn M, Charron J, Datta M, Young F, Stall AM, et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell. 1992 Mar 6;68(5):855-67.

12 Petrie HT, Hugo P, Scollay R, Shortman K. Lineage relationships and developmental kinetics of immature thymocytes: CD3, CD4, and CD8 acquisition in vivo and in vitro. J Exp Med. 1990 Dec l;172(6):1583-8

13 Shortman K, Wu L. Early T lymphocyte progenitors. Annu Rev Immunol. 1996;14:29-47.

14 Sprent J, Webb SR. Intrathymic and extrathymic clonal deletion of T cells. Curr Opin Immunol. 1995 Apr;7(2): 196205.

15 Basson MA, Bommhardt U, Cole MS, Tso JY, Zamoyska R. CD3 ligation on immature thymocytes generates antagonistlike signals appropriate for CD8 lineage commitment, independently of T cell receptor specificity.J Exp Med. 1998 Apr 20;187(8): 1249-60.

16 Singer A, Bosselut R, Bhandoola A. Signals involved in CD4/CD8 lineage commitment: current concepts and potential mechanisms. Semin Immunol. 1999 Aug;ll(4):273-81.

17 Bommhardt U, Cole MS, Tso JY, Zamoyska R. Signais through CD8 or CD4 can induce commitment to the CD4 lineage in the thymus. Eur J Immunol. 1997 May;27(5):1152-63.

18 Madri JA, Graesser D. Cell migration in the immune system: the evolving inter-related roles of adhesion molecules and proteinases. Dev Immunol. 2000;7(2-4): 103-16.

19 Picker LJ. Control of lymphocyte homing. Curr Opin Immunol. 1994 Jun;6(3):394-406.

20 Griffiths GM. The cell biology of CTL killing. Curr Opin Immunol. 1995 Jun;7(3):343-8.

21 Harty JT, Tvinnereim AR, White DW. CD8+ T cell effector mechanisms in resistance to infection. Annu Rev Immunol. 2000;18:275-308.

22 Andreasen SO, Christensen JE, Marker O, Thomsen AR. Role ofCD40 ligand andCD28 in induction and maintenance of antiviral CD8+ effector T cell responses.J Immunol. 2000 Apr 1 ; 164(7):3689-97.

23 O'Rourke AM, Mescher MF. Cytotoxic T-lymphocyte activation involves a cascade of signalling and adhesion events. Nature. 1992 Jul 16;358(6383):253-5.

24 Henkart PA, Sitkovsky MV. Cytotoxic lymphocytes. Two ways to kill target cells. Curr Biol. 1994 Oct l;4(10):923-5.

25 Biron CA, Nguyen KB, Pien GC, Cousens LP, Salazar-Mather TP. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annu Rev Immunol. 1999;17:189-220.

26 T.Hercend, E.L. Reinherz, S. Mener, et al. Phenotypic and functional heterogeneity of human cloned natural killer cell line Nature, 1983, v.301, p.158-160.

27 J.R. Ortaldo, A.Masson, R.Overton, Lymphokine-activated killer (LAK) cells: analysis of progenitors and effectors, J.Exp.Med., 1986, v.164, p.l 193-1205.

28 J.H. Phillips, L.L. Lanier, "Dissection of the lymphokine-activated killer phenomenon: relative contribution of peripheral blood natural killer cells and T-lymphocytes to cytolysis", J.Exp.Med., 1986, v.136, p.1579-1585.

29 C.Riccardi, B.M. Vose, R.B. Herberman, "Modulation of IL-2-dependent growth of mouth NK cells by interferon and T-lymphocytes", J.ImmunoL, 1983, v.130, p.228-232.

30 Lanier LL. NK cell receptors. Annu Rev Immunol. 1998;16:359-93.

31 Vales-Gomez M, Reyburn H, Strominger J. Molecular analyses of the interactions between human NK receptors and their HLA ligands. Hum Immunol. 2000 Jan;61(l):28-38.

32 Ojcius DM, Young JD. Cell-mediated killing: effector mechanisms and mediators.Cancer Cells. 1990 May;2(5):138-45.

33 Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al, A progress report of 157 petiens with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone, N. Engl. J. Med., 1987, v.316, p.889-897.

34 B.S. Chadwick, R.G. Miller, Heterogeneity of the Lymphokine-activated killer cells phenotype, Cellular Immunol., 1991, v. 132, p. 168-174.

35 Ihle JN. Cytokine receptor signalling. Nature. 1995 Oct 19;377(6550):591 -4.

36 Сащенко Л.П., Гнучев H.B., Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Редченко И.В., Савцова З.Д., Блищенко Е.Ю., Чертов О.Ю., Луканидин Е.М., Функциональные изменения лимфокин-активированных лимфоцитов в зависимости от времени инкубации с ИЛ 2, ДАН, 1992, т.324, стр.475-479.

37 Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Лукьянова Т.И., Кабанова

0.Д., Редченко И.В., Блищенко Е.Ю., Сатпаев Д.М., Хайдуков С.В., Чертов О.Ю., Луканидин Е.М, Влияние ИЛ 2 на цитотоксическую активность, экспрессию поверхностных маркеров и секрецию цитотоксических белков ЛАК клетками, Экспериментальная онкология,

1992, т. 14, № 5, стр.54-58.

38 Ballas ZK, Rasmussen W, van Otegham JK. Lymphokine-activated killer (LAK) cells. II. Delineation of distinct murine LAK-precursor subpopulations. J Immunol. 1987 Mar 1;138(5): 1647-52.

39 Shshchenko L.P., Gnuchev N.V., Lykyanova T.I., Redchenko

1.V., Kabanova O.D., Lukanidin E.M., Blishchenko E.Yu., Satpaev D.K., Khaidukov S.V., Chertov O.Yu, Time-dependent of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins, Immunology Letters,

1993, v.37, p.153-157.

40 E.A. Grimm, K.M. Ramsey, A.Mazumder, D.J. Weison, J.Y.Dieu, S.A. Rosenberg, Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Precursor phenotype is serologically distinct from peripheral t lymphocytes, memory cytotoxic thymusderived lymphocytes and natural killer cells, J.Exp.Med., 1983, v.57, p.884-892.

41 Sashchenco L.P., Gnuchev N.V., Lykyanova T.I., Redchenko I.V., Kabanova O.D., Lukanidin E.M., Blishchenko E.Yu., Satpaev D.K., Khaidukov S.V., Chertov O.Yu, Time-dependent of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins, Immunology Letters, 1993, v.37, p.153-157.

42 Kagi D., et al., Fas and perforin pathway as major mechanisms of T cells-mediated cytotoxicity, 1994, Science, v.265, p.528-530.

43 Guidotti LG, Chisari FV. Cytokine-mediated control of viral infections. Virology. 2000 Aug l;273(2):221-7.

44 Bortner C.D., Oldenburg N.B.E., Cidlowski J.A., The role of DNA fragmentation in apoptosis, Trends in Cell Biology, 1995, v.5, p.21-26.

45 Zhivotovsky B., Wade D., Gahm A., Orrenius S., Nicotera P.L., Formation of 50 kb chromatin fragments isolated liver nuclei is mediated by protease and endonuclease activation, FEBS Lett., 1994, v.351, p.150-154.

46 Barber K. E., Crosier P. S., Watson J. D. The differential inhibition of hemopoietic growth factor activity by cytotoxins and interferon-y. The J. of Immunology 1987. 139. p. 11081112.

47 Pitti R.M., Marsters S. A., Lawrence D. A., Roy M., Kischkel F. C., Dowd P., Huang A., Donahue C. J., Sherwood S. W., Baldwin D. T., Godowski P. J., Wood W. I., Gurney A. L., Hillan K. J., Cohen R. L., Goddard A. D., Botstein D., Ashkenazi A. Genomic amplification of a decoy recepter for

Fas ligand in lung and colon cancer. Nature 1998. 396. p. 699703.

48 Миркина И. И., Киселев С. Л., Духанина Е. А., Лукьянова Т. И., Шаталов Ю. В., Сащенко Л. П., Гнучев Н. В. Tag-7-иммунореактивный цитотоксический белок продуцируется ЛАК-клетками человека. Доклады Академии Наук 1999. 366. Стр. 830-832.

49 Micheau О, Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling с omplexes.Cell. 2 003 Jul 25; 114(2): 181-90.

50 Johnon S.E., Baglioni C., TNF receptors and cyticidal activity are down-regulated by activators of protein kinase C, J.Biol.Chem.,1988, v.263, p.5686-5690.

51 Immamura K., Sherman M., Spriggs D., Kufe D., Effects of TNF on GTP-binding and GTP ase activity in HL60 and L929 cells, J.Biol.Chem., 1988, v.263, p. 10247-10250.

52 Browning J., Ribolini A. Studies on the differing effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin on the growth of several human tumor lines. The J. of Immunology 1989. 143. p. 1859-1867.

53 Wright S. C., Bonavida B. Selective lysis of NK-sensitive target cells by a soluble mediator, released from murine spleen cells and human perepheral blood lymphocytes. The J. of Immunology 1980. p. 1516-1521.

54 Sacca R., Cuff C.A., Lesslauer W., Ruddle N. H. Differential Activities of Secreted Lymphotoxin-a3 and Membrane Lymphotoxin-aiP2 in Lymphotoxin-Induced Inflammation: Critical Role of TNF Receptor 1 Signaling. The J. of Immunology 1998.160. p. 485-491.

55 Selmaj К., Raine С. S., Farooq M., Norton W. Т., Brosnan C. F. Cytokine cytotoxicity against oligodendrocytes. The J. о f Immunology 1991.147. p. 1522-1529.

56 Yamamoto R.S., Granger G.A., et al., The human LT system. Purification and functional studies of LT and TNF-like LT forms from human continious T cell line, J.Immunol., 1986, v.137, p-l 885-1892.

57 Yamamoto R.S., Ware C.F., Granger G.A., The human LT system. Identification of LT and TNF-like forms from stimulated natural killers, specific and nonspecific cytotoxic human T cells in vitro, J.Immunol., 1986, v.137, p.l878-1885.

58 Sayers T. J., Ransom J. H., Denn A. C., Herberman R. В., Ortaldo J. R. Analysis of a cytotoxic lymphokine produced by incubation of lymphocytes with tumor cells: relationship to leukoregulin and distinction from recombinant lymphotoxin, recombinant tumor necrosis factor, and natural killer cytotoxic factor. The J. of Immunology 1986. 137. p. 385-390.

59 Podack et al., Molecular machanisms of lymphocyte-mediated tumor cells lysis, Immunol. Today, 1987, v.8, p.29-31.

60 Young J .D.E., Cohh Z.A., Cell-mediated killing: a common mechanism, Cell, 1990, v.46, № 5, p.641-642.

61 Suda Т., Takahashi Т., Golstein P., Nagata S., Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family, 1993, Cell, v.75, p.l 1691178.

62 Карагидзе 3. Г. Иммунодиагностика и иммунотерапия опухолей. 1999. стр. 19-22.

63 Peter M. E., Krammer P. H. Mechanisms of CD 95(AP01/Fas) - mediated apoptosis. Current Opinion in Immunology 1998. 10. p. 545-551.

64 Gao Y., Herndon J.M., Zhang H., Griffith T.S., and Ferguson T.A., "Antiinflammatory effect of CD95 Ligand (FASL)-induced apoptosis", J.Exp.Med., 1998, v. 188, № 5, p.887-896.

65 Schneider P., Holler N., Bodmer J.L., Hahne M., Frei K., Fontana A., Tschopp J., Conversion of membrane-bound FAS(CD95)Ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity, J. Exp. Med., 1998, v.187, № 8, p.1205-1213.

66 Sashchenco L.P., Lykyanova T.I., Kabanova O.D., Mirkina I.I., Yatskin O.N., Pongor S., Gnuchev N.V., Different pathways of the release of cytotoxic proteins in LAK cells, 1996, Immunology Letters, v.53, p.25-29.

67 Chong A. S.-F., Scuderi P., Grimes W. J., Hersh E. M. Tumor targets stimulate IL-2 activated killer cells to produce Interferon-y and Tumor Necrosis Factor. The J. of Immunology 1989. 142. p. 2133-2139

68 Steffen M., Ottmann O. G., Moore A. S. Symultaneous production of Tumor Necrosis Factor-a and Lymphotoxin by normal T cells after induction with IL-2 and Anti-T3. The J. of Immunology 1988. 140. p. 2621-2624

69 Dett C. A., Gatanaga M., Ininns E., K., Cappuccini F., Yamamoto R. S., Granger G. A., Gatanaga T. Enhancement of Lymphokine-activated T killer cell Tumor Necrosis Factor receptor mRNA transcription, Tumor Necrosis Factor receptor membrane expression, and Tumor Necrosis Factor /

Lymphotoxin release by IL-lp, IL-4, and IL-6 in vitro. The J. of Immunology 1990. 146. p. 1522-1526.

70 Сащенко JI. П., Кабанова О. Д., Лукьянова Т. И., Гнучев Н. В. Роль клеток-мишеней в процессе цитолиза, индуцированного действием лимфокинактивированных киллеров. Доклады Академии Наук 1996. 346. Стр. 125128.

71 Bennett М. W., O'Connell J., O'Sullivan G. С., Brady С., Roche D., Collins J. K., Shanahan F. The Fas Counterattack In Vivo: Apoptotic Depletion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes Associated with Fas Ligand Expression by Human Esophageal Carcinoma. The J. of Immunology 1998. 160. p. 5669-5675.

72 Griffith T.S., Brunner Т., Fletcher S. M., Green D. R., Ferguson T. A. Fas Ligand-induced Apoptosis as a Mechanism of Immune Privilege. Science 1995. 270. p. 11891192

73 Gratas C., Tohma Y., Barnas C., Taniere P., Hainaut P., Ohgaki H. Up-Regulation of Fas (APO-1/CD95) Ligand and Down-Regulation of Fas Expression in Human Esophageal Cancer. Cancer Research 1998. 58. p. 2057-2062.

74 Kronke M., Hensel G., Schluter C., Scheurich P., Schutze S., Pfizenmaier K. Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Gene Expression in Human Tumor Cell Lines. Cancer Research 1988. 48. p. 5417-5421.

75 Okamoto M., Ishida Y., Keogh A., Strain A. Evaluation of the function of primary human hepatocytes co-cultured with the human hepatic stellate cell (HSC) line LI90. Int. J. Artificial Organs 1998. 21 (6). p. 353-359.

76 Osusky R., Malic P., Aurora Y., Ryan S. J. Monocyte-macrophage differentiation induced by coculture of retinal pigment epithelium cells with monocytes. Ophthalmic Research 1997. 29 (3). p. 124-129.

77 Bantel-Schaal U. Human fibroblasts are able to inhibit growth of human melanoma cells. Cancer Letters 1998. 129(1). p. 2127.

78 Brooks B., Bundred N. J., Howell A., Lang S. H., Testa N. G. Investigation of mammary epithelial cell-bone marrow stroma interactions using primary human cell culture as a model of metastasis. Int. J. Cancer 1997. 73(5). p. 690-696.

79 Offner F. A., Schiefer J., Wirtz H. C., Bigalke I., Pavelka M., Hollweg G., Ensinger C., Klosterhalfen BMittermayer C., Kirkpatrick C. J. Tumor-cell-endothelial interactions: free radicals are members of melanoma-induced endothelial cell damage. Virchows Arch. 1996.428 (2). p. 99-106.

80 Gnuchev N. V., Sashchenko L. P., Iarovaia O. V., Dukhanina E. A., Lukianova T. I., Razin S. V. Joint Cultivation of Human Erythroblastoid Cells and Mouse Fibroblasts Triggers Release of Wide Spectrum of Cytotoxic Factors. Biochemical and Biophysical Research Communications 1997. 234. p. 655659.

81 Duke R. C., Cohen J. J., Chervenak R. Differences in target cell DNA fragmentation induced by mouse cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells. The J. of Immunology 1986. 137. p. 1442-1447.

82 Laster S. M., Wood J. G., Gooding L. R. Tumor Necrosis Factor can induce both apoptotic and necrotic forms of cell lysis. The J. of Immunology 1988.141. p. 2629-2634

83 Zychlinski A., Zheng L. M., Liu C.-C., Young J. D. Cytolytic lymphocytes induce both apoptosis and necrosis in target cells. The J. of Immunology 1991. 146. p. 393-400.

84 Nicholson D. W., Thornberry N. A. Caspases: killer proteases. TIBS 1997. 22. p. 299-306.

85 Villa P., Kaufmann S. H., Earnshaw W. C. Caspases and caspase inhibitors. TIBS 1997. 22. p. 90-92.

86 Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of caspases. Oncogene. 2003 Nov 24;22(53):8543-67.

87 Chang DW, Xing Z, Capacio VL, Peter ME, Yang X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 2003 Aug 15;22(16):4132-42

88 Галитовский В. E., Гогвадзе В. Г. Ингибиторы энергетики митохондрий предотвращают межнуклеосомную фрагментацию ДНК в тимоцитах. Биохимия 1998. 63. Стр. 1616-1620.

89 Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S. J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes & Development 1999. 13. p. 1899-1911

90 Yin XM. Signal transduction mediated by Bid, a pro-death Bcl-2 family proteins, connects the death receptor and mitochondria apoptosis pathways. Cell Res. 2000 Sep; 10(3): 161-7.

91 Crompton M. Mitochondrial intermembrane junctional complexes and their role in cell death. J Physiol. 2000 Nov 15;529 Pt 1:11-21.

92 Duchen MR. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death. J Physiol. 2000 Nov 15;529 Pt 1:57-68.

93 Okazaki Т., Kondo Т., Kitano Т., Tashima M. Diversity and Complexity of Ceramide Signalling in Apoptosis. Cell Signal 1998. v. 10. N°10. p. 685-692.

94 Kolesnick R. The therapeutic potential of modulating the ceramide/sphingomyelin pathway. Clin Invest. 2002 Jul;110(l):3-8.

95 Куцый M. П., Кузнецова E. А., Газиев А. И. Участие протеаз в апоптозе. Биохимия 1999. 64. стр. 149-163.

96 Брюне Б., Сандау К., фон Кнетен А. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути. Биохимия 1998. 63. Стр. 966-975.

97 Ванин А. Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований. Биохимия 1998. 63. Стр. 867-869.

98 Горрен А. К. Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота. Биохимия 1998. 63. Стр. 870-880.

99 Sashchenko LP, Gnuchev NV, Lukjanova TI, Redchenko IV,

Kabanova OD, Lukanidin EM, Blishchenko EYu, Satpaev DK, Khaidukov SV, Chertov OYu. Time-dependent changes of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins.Immunol Lett. 1993 Aug;37(2-3): 153-7.

100 Сащенко JI. П., Лукьянова Т. И., Миркина И. И., Кабанова

О. Д., Понгор Ш., Гнучев Н. В. // Доклады РАН. 1998. Т. 360. С. 215-219.

101 Lowrey DM, Hameed A, Lichtenheld М, Podack ER. Isolation and characterization of cytotoxic granules from human lymphokine (interleukin 2) activated killer cells. Cancer Res. 1988 Aug 15;48(16):4681-8.

102 Clark WR. Perform—a primary or auxiliary lytic mechanism? Immunol Today. 1988 Apr;9(4):101-4.

103 Kupfer A, Dennert G, Singer SJ. The reorientation of the Golgi apparatus and the microtubule-organizing center in the cytotoxic effector cell is a prerequisite in the lysis of bound target cells.J Mol Cell Immunol. 1985;2(l):37-49.

104 Сащенко JI. П., Лукьянова Т. И., Миркина И. И., Кабанова О. Д., Понгор Ш., Гнучев Н. В. // Доклады РАН. 1998. Т. 360. С. 215-219.

105 Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970. 227. p. 680-685.

106 Гнучев H. В., Сащенко Л. П., Лукьянова Т. И., Ребизова Т. В., Кириллова М. А., Луканидин Е. М., Ребизова Е. С. // Молекуляр. биология. 1987. Т. 21. С. 1117-1122.