ВИЗУАЛИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИКИ ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КУЛЬТУРЕ И ТКАНЯХ С ПОМОЩЬЮ СУБДИФРАКЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Клементьева Наталия Владимировна

• Клементьева Наталия Владимировна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Клементьева Наталия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Разрешающая способность светового микроскопа

1.2. Технологии флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (ФМСР)

1.2.1. Ближнепольная микроскопия

1.2.2. TIRF микроскопия

1.2.3. Микроскопия дальнего поля

1.2.4. SIM микроскопия

1.2.5. STED микроскопия

1.2.6. Локализационная микроскопия одиночных молекул (SMLM)

1.3. Флуоресцентные метки для SMLM

1.3.1. Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ)

1.3.2. Квантовые точки

1.3.3. Фотоактивируемые флуоресцентные красители

1.3.4. Флуорогенные красители

1.4. Актиновый цитоскелет как объект визуализации со сверхвысоким разрешением

1.5. Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и расходные материалы

2.1.2. Культуральные среды, растворы и посуда для работы с бактериальными штаммами

2.1.3. Культуральные среды и пластик, растворы для работы с эукариотическими клетками

2.1.4. Генно-инженерные конструкции

2.1.5. Бактериальные штаммы и эукариотические клеточные линии

2.1.6. Буфер для STORM-имиджинга

2.1.7. Животные

2.1.8. Оборудование

2.2. Методы

2.2.1. Химическая трансформация клеток E. coli

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК

2.2.3. Культивирование и временная трансфекция клеток эукариот

2.2.4. Приготовление образцов живых и фиксированных клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки

2.2.5. Окраска клеток синтетическими красителями, конъюгированными с фаллоидином

2.2.6. Окраска образцов флуорогенным красителем SiR-actin

2.2.7. Создание модели первичной опухоли

2.2.8. Приготовление образцов опухолевой ткани для микроскопического анализа

2.2.9. МТТ-тест

2.2.10. Патоморфологический анализ

2.2.11. Флуоресцентный TIRF имиджинг

2.2.12. Фотоконверсия белка Dendra2 в растворе in vitro

2.2.13. Конфокальная лазерно-сканирующая микроскопия

2.2.14. Обработка данных микроскопии и получение изображений со сверхвысоким разрешением

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оптимизация фотоконверсии фотоактивируемого флуоресцентного белка Dendra2

3.2. Обнаружение способности к "миганию" у красных флуоресцентных белков

3.3. Визуализация ультраструктуры актина в тканевых образцах с помощью флуорогенного красителя SiR-actin

3.4. Изучение перестроек актинового цитоскелета в опухолевых клетках под воздействием химиотерапевтических агентов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПЕРЕЧЕНЬ ПУБЛИКАЦИЙ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ВИЗУАЛИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИКИ ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КУЛЬТУРЕ И ТКАНЯХ С ПОМОЩЬЮ СУБДИФРАКЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ»

Актуальность темы исследования

Для изучения структурных и функциональных особенностей клеток широко применяется метод флуоресцентной микроскопии. Однако, разрешающая способность флуоресцентного микроскопа ограничена дифракционным пределом (200-300 нм), поэтому визуализация многих процессов и структур остается за пределами возможностей традиционной флуоресцентной микроскопии.

Революционным событием стала разработка методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (ФМСР). С помощью ФМСР удается получать изображения с субдифракционным пространственным разрешением (2050 нм), что открывает широкие перспективы по изучению тонкой структуры цитоскелета клеток. Актин и другие белки цитоскелета формируют в клетке обширную сеть, построенную из тончайших волокон, которые могут быть разрешены только на субдифракционном уровне. С помощью ФМСР становится возможным наблюдение индивидуальных филаментов и детектирование динамических перестроек в системе цитоскелета.

Среди технологий ФМСР выделяют группу методов, объединенных общим названием локализационная микроскопия одиночных молекул (single-molecule localization microscopy, SMLM1). Этот подход основан на использовании специальных флуоресцентных меток, способных к обратимому или необратимому переходу между "темновым" и флуоресцентным состояниями. Под "темновым" состоянием в этом случае подразумевается состояние флуорофора, не детектируемое при выбранных условиях из-за низкого квантового выхода флуоресценции или отсутствия полосы поглощения, соответствующей возбуждающему свету.

Первые работы по SMLM относятся к 2006 году, поэтому в настоящее время данное направление все еще активно развивается. Постоянно идет поиск и создание эффективных флуорофоров, совершенствуются алгоритмы обработки

1 В зарубежной литературе используется аббревиатура SMLM (single-molecule localization microscopy), для которой в русском языке пока отсутствует общепринятый аналог.

данных, предлагаются новые схемы организации оптического пути микроскопа. Одна из основных тенденций - это создание методик, наименее повреждающих живые клетки и пригодных для изучения динамических процессов.

В настоящей работе мы разрабатывали подходы к локализационной микроскопии одиночных молекул, которые позволили бы исследовать структурные и функциональные особенности цитоскелета клеток млекопитающих, в том числе на тканевом уровне организации.

Степень разработанности научной проблемы

ФМСР можно по праву считать главным технологическим прорывом последних 20 лет в области оптической микроскопии. В 2014 году за пионерские работы в данной области была присуждена Нобелевская премия по химии.

С развитием ФМСР расширились возможности изучения тонкой структуры цитоскелета. Визуализация белков цитоскелета зачастую служит демонстрацией эффективности работы того или иного метода ФМСР. Вместе с тем, совершенствование данных технологий способствует более глубокому пониманию работы систем микрофиламентов и микротрубочек как для накопления фундаментальных знаний, так и для решения биомедицинских задач. Особо важное внимание уделяется развитию подходов, совместимых с визуализацией цитоскелета в живых клетках, а также переход от работы с клетками in vitro к микроскопии клеток в составе тканей и целых организмов. Однако, методы SMLM обычно плохо совместимы с живыми клетками, поскольку требуют длительной съемки образца и сопровождаются высокой фототоксичностью. Кроме того, исследователи часто сталкиваются с трудностями адаптации данных методик к изучению объектов на тканевом уровне.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в разработке и использовании новых подходов к изучению структуры и динамики цитоскелета клеток в культуре и в тканях млекопитающих на основе субдифракционной микроскопии.

Были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оптимизировать процесс фотоактивации флуоресцентного белка Dendra2 в условиях локализационной микроскопии одиночных молекул ^МЬМ) для визуализации ультраструктуры живых клеток млекопитающих.

2. Протестировать красные флуоресцентные белки, слитые в одной рамке считывания с белками цитоскелета, на способность к переходу между флуоресцентным и "темновым" состояниями для проведения SMLM живых клеток.

3. Визуализировать структуру актина с субдифракционным разрешением в опухолевых тканях в мышиных моделях.

4. Применить разработанные подходы к субдифракционной микроскопии для изучения перестроек актинового цитоскелета в опухолевых клетках и тканях под влиянием химиотерапевтических препаратов.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе мы впервые протестировали флуорофоры и режимы съемки, ранее не используемые в SMLM. Был предложен новый способ фотоактивации флуоресцентного белка Dendra2 без использования токсичного фиолетового облучения в условиях детекции одиночных молекул. Мы впервые продемонстрировали возможность использования некоторых красных флуоресцентных белков в качестве эффективных инструментов для проведения субдифракционной локализационной микроскопии. На основе полученных данных разработаны оригинальные методики для визуализации структурных и функциональных особенностей цитоскелета клеток млекопитающих со сверхразрешением. Предложенные подходы к субдифракционной микроскопии направлены на снижение фототоксичности при наблюдении образца и сокращение времени съемки, и, таким образом, способствуют поддержанию жизнеспособности клеток и изучению нативных ультраструктур в них.

Вторая часть работы состояла в реализации перехода от SMLM культур

клеток к тканям млекопитающих. Нами была создана методика визуализации эндогенного актина в тканевых образцах со сверхразрешением. Впервые было показано, что в опухолевой ткани мышей можно наблюдать обширную сеть актиновых волокон, морфологически напоминающих стресс-фибриллы, но не свойственных нормальным тканям. Впервые выявлены ультратонкие изменения актинового цитоскелета в опухоли в ответ на химиотерапевтическое воздействие.

Предложенные нами подходы способствуют большей доступности методов SMLM для исследователей. Методика визуализации актина в тканях со сверхразрешением потенциально может быть применена для изучения различных злокачественных образований, в том числе для исследования ультратонких особенностей опухолевых клеток первичных узлов и метастазов, как на модельных опухолях животных, так и на клинических образцах.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложен новый режим фотоактивации флуоресцентного белка Dendra2 без использования фиолетового лазера, пригодный для наблюдения живых клеток млекопитающих в условиях SMLM.

2. Обнаружена способность к переходу между флуоресцентным и "темновым" состояниями у некоторых красных флуоресцентных белков, на основе которой возможно проведение SMLM и получение субдифракционных изображений цитоскелета живых клеток.

3. Разработан метод получения субдифракционных изображений эндогенного актина в образцах опухолевых тканей мышей с использованием флуорогенного красителя SiR-actin в условиях SMLM.

4. С помощью предложенных подходов выявлены особенности тонкой организации актинового цитоскелета в раковых клетках в культуре и в опухоли, в том числе при воздействии химиотерапии.

Апробация полученных результатов

Результаты диссертационной работы были представлены на научной школе EMBL Advanced Course "Super-resolution microscopy" (Гайдельберг, Германия, 2014), а также на конференциях и симпозиумах, в том числе SPIE Photonics West BiOS (Сан-Франциско, США, 2014); Topical problems of Biophotonics (Нижний Новгород, 2015); Super-resolution in different dimensions (Москва, Россия, 2015); SPIE/OSA European Conferences on Biomedical Optics (Мюнхен, Германия, 2015); Advanced Fluorescence Imaging Methods (Сочи, Россия, 2016).

Публикации по теме работы

По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 1 обзор в российских и международных научных журналах.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 106 страницах, состоит из введения, трех основных глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов, списка сокращений, перечня публикаций по теме диссертации и списка цитированной литературы, содержащего 193 ссылки. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Разрешающая способность светового микроскопа

Среди разновидностей микроскопического анализа особое место занимает флуоресцентная микроскопия. Основным её преимуществом является возможность специфического мечения изучаемых структур и их детектирования с очень высокой чувствительностью. Кроме того, флуоресцентная микроскопия характеризуется низкой инвазивностью и позволяет наблюдать за живой клеткой в режиме реального времени [1-3]. С открытием флуоресцентных белков стало доступным изучение экспрессии генов, локализации и функциональной активности белков в живой клетке [4,5].

Комбинация флуоресценции и конфокальных систем позволила проводить 3D-визуализацию клеток и тканей [6]. Такие ключевые достижения, как разработка лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и спиннинг-диск конфокальной микроскопии, сделали оптический микроскоп одним из мощнейших и универсальных инструментов для решения задач современной клеточной биологии [7-9].

Однако, даже при использовании высококачественной оптики разрешающая способность светового микроскопа имеет ограничение, обусловленное самой природой световой волны. Оптический микроскоп можно рассматривать как систему линз, дающих увеличенное изображение малого объекта. При размещении объекта в фокальной плоскости световые лучи от каждой его точки должны сходиться в единую точку на его проекции. Дифракция света в системе линз микроскопа приводит к отклонению от законов геометрической оптики [10] и размытию сфокусированного пятна. В действительности, точечный объект мы наблюдаем в виде дифракционных колец, формирующихся в результате интерференции света. Такая дифракционная картина в латеральной плоскости микроскопа известна как диск Эйри. Размер центрального пятна в диске Эйри зависит от длины волны используемого света и апертурного угла объектива (угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом,

попадающим в объектив) и может использоваться для оценки разрешающей способности микроскопа. Теория дифракционно-лимитированной разрешающей способности микроскопа была предложена Эрнстом Аббе и доработана лордом Рэлеем. Согласно Аббе, разрешение микроскопа может быть определено следующим образом:

Ax,y = X/2NA, Az = 2X/NA2, (1)

где dxy и dz - латеральное и аксиальное разрешение микроскопа, соответственно, X - длина волны возбуждающего света, n - показатель преломления среды, NA - числовая апертура объектива, NA = n*sina (a -апертурный угол) [11,12].

Трехмерное распределение интенсивности света в фокальной плоскости микроскопа описывается функцией рассеяния точки (point spread function, PSF). В идеальной оптической системе PSF симметрична относительно оптической оси и соответствует диску Эйри, имеющего форму эллипса в аксиальной проекции. Размер PSF также может выступать в качестве критерия разрешения. Для этого используют понятие полная ширина на уровне половинной амплитуды (full width at half-maximum, FWHM). Две точки, расстояние между которыми меньше, чем FWHM функции PSF, не могут быть разрешены относительно друг друга, так как их изображения будут перекрываться. Таким образом, разрешение микроскопа может быть определено как минимальное расстояние между двумя точечными источниками флуоресценции, на котором они детектируются как индивидуальные объекты.

В латеральной проекции FWHM функции PSF выражается формулой:

Ax,y = 0.61XNA. (2)

По оси z эта величина в 2-3 раза больше, в зависимости от геометрии объектива. Теоретический предел разрешения при облучении видимым светом (около 500 нм) и при использовании объектива с масляной иммерсией и NA=1.40

составит примерно 200 нм и 500 нм в латеральной и аксиальной плоскостях, соответственно (Рисунок 1) [13].

Более короткие длины волн возбуждения практически не используются в силу фотоповреждающего действия ультрафиолетового света [14,15], а также из-за необходимости применения более дорогих оптических компонентов [16].

Наблюдение объектов, размером менее 200 нм, таких как вирусы, ДНК, митохондрии, стало возможным с появлением электронной микроскопии [17]. Современный электронный микроскоп характеризуется максимальной разрешающей способностью до 0.2 нм, что позволяет получать изображения отдельных молекул [18]. Однако, данный метод имеет ряд технических особенностей, которые затрудняют его широкое распространение в биологических и биомедицинских исследованиях. Трудоемкая и многостадийная процедура приготовления образцов может приводить к появлению артефактов при интерпретации изображений [19,20]. Основной же недостаток электронной микроскопии заключается в отсутствии возможности изучения процессов, протекающих в живой клетке [21,22].

Рисунок 1. Функция рассеяния точки (PSF) для стандартного объектива с масляной иммерсией и числовой апертурой NA = 1.40, демонстрирующая итоговое изображение фокусного пятна. Длина волны возбуждающего света X = 550 нм, среда с показателем преломления n = 1.515. Латеральное и аксиальное разрешение микроскопа равно 220 нм и 520 нм, соответственно. Рисунок взят из источника [13].

1.2. Технологии флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (ФМСР)

Исследование живой клетки на уровне макромолекулярных комплексов стало возможным благодаря технологиям флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (ФМСР). Данные методы, преодолевая дифракционный предел разрешения традиционного светового микроскопа, объединяют в себе преимущества электронной микроскопии и неинвазивного флуоресцентного имиджинга [21]. В 2014 году за пионерские работы в данной области Эрик Бетциг, Штефан Хелл и Уильям Мёрнер были удостоены Нобелевской премии по химии [23,24].

1.2.1. Ближнепольная микроскопия

Преодоление дифракционного предела на примере биологического образца впервые было продемонстрировано в 1992 году с помощью метода сканирующей микроскопии ближнего поля (Near-Field Scanning Optical Microscopy, NSOM, или Scanning Near-Field Optical Microscopy, SNOM) [25]. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В микроскопах по типу NSOM нет линз, а изображение получается с помощью освещения объекта через малую диафрагму субмикронного оптического зонда, расположенного на расстоянии много меньше длины волны излучения [26]. Сверхвысокое разрешение (до 20 нм в латеральной плоскости) [27,28] достигается за счет того, что в области ближнего поля распространение света не подвержено дифракционным или интерференционным эффектам [29]. Тем не менее, метод NSOM не нашел широкого применения в биологических исследованиях [30], так как он ограничен визуализацией поверхностных клеточных структур и технически сложен [31,32].

1.2.2. TIRF микроскопия

Более пригодным методом стала флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF), основанная на использовании свойств индуцированной быстрозатухающей волны, которая возникает в зоне, близко прилегающей к исследуемому образцу [33]. Возбуждение флуорофоров происходит в области толщиной не более 100-200 нм, при этом значительно повышается отношение сигнал-шум, а эффект фотообесцвечивания флуорофоров, находящихся вне фокальной плоскости, напротив, снижается. Было показано, что комбинация нескольких последовательных TIRF-изображений, полученных при разном угле падения возбуждающего света, позволяет реконструировать 3D-модель клеточных структур с аксиальным разрешением до 20 нм [34]. В условиях TIRF микроскопии возможно детектирование сигнала от одиночных молекул [35,36], однако, этот метод имеет свои ограничения. Так же, как и NSOM, TIRF микроскопия эффективна для исследования цитоскелета распластанных клеток и процессов, протекающих на плазматической мембране [37,38], но не применима для визуализации внутриклеточных структур [8]. Кроме того, TIRF дает улучшение разрешения только вдоль оси z [39].

1.2.3. Микроскопия дальнего поля

Наиболее значительные успехи в визуализации со сверхвысоким разрешением были достигнуты благодаря микроскопии дальнего поля, использующей линзы, относительно удаленные от образца [40]. Стоит упомянуть о микроскопах I5M и 4Pi, которые комбинировали в себе два высокоапертурных объектива для освещения объекта с двух сторон, и тем самым позволяли добиться разрешения до 100 нм по оси z [41-43]. Тем не менее, латеральное разрешение по-прежнему оставалось подчинено закону Аббе.

В конце 20-го - начале 21-го века появились принципиально новые,

революционные технологии флуоресцентной микроскопии, дающие действительно субдифракционные изображения биологического объекта. Среди них можно выделить три большие группы: микроскопия структурированного освещения (Structured Illumination Microscopy, SIM), микроскопия на основе истощения [флуоресценции] вынужденным излучением (STimulated Emission Depletion, STED) и локализационная микроскопия одиночных молекул (Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM) [29]. В этих технологиях сверхвысокое разрешение достигается либо за счет пространственного и/или временного модулирования перехода флуорофора из одного молекулярного состояния в другое, либо за счет уменьшения физического размера PSF [44].

1.2.4. SIM микроскопия

Метод микроскопии структурированного освещения (SIM) базируется на использовании подвижных оптических решеток, размещенных на пути лазерного пучка [45]. При совмещении известного паттерна освещения с неизвестной структурой исследуемого флуоресцентного образца возникает так называемый "муаровый узор" - интерференционная картина с пространственной частотой ниже, чем у двух изначально взаимодействующих структур [46]. В SIM-микроскопе решетчатая структура смещается или поворачивается поэтапно перед захватом каждого последующего изображения. Затем посредством математических алгоритмов реконструируется изображение со сверхразрешением [47].

С использованием конфигурации многоцветного 3D-SIM была визуализирована структура ядра эукариотической клетки с выявлением особенностей строения единичных комплексов ядерной поры, которые прежде можно было наблюдать только в электронном микроскопе [48]. С помощью 3D-SIM также были получены изображения растительной клетки, демонстрирующие детальную структуру индивидуальных плазмодесм [49].

Преимущество метода SIM состоит в возможности быстро анализировать

большие поля зрения, кроме того, для него пригодны практически все современные флуоресцентные метки, устойчивые к фотообесцвечиванию [50]. Однако для анализа множества муаровых изображений требуются сложные компьютерные программы, и на результирующей реконструкции могут наблюдаться артефакты. Стоит учитывать, что пространственное разрешение в SIM-микроскопе может быть улучшено лишь в 2 раза по сравнению с широкопольным микроскопом, и составляет примерно 100 нм и 300 нм в плоскости xy и вдоль оси z, соответственно [13].

Позднее была разработана технология микроскопии насыщающего структурированного освещения (Saturated Structured Illumination Microscopy, SSIM), основанная, помимо муарового эффекта, на свойстве флуорофоров к нелинейному возрастанию эмиссии в зависимости от дозы облучения. Этот метод дает разрешение до 50 нм в плоскости xy, однако требует высокой мощности лазера и, как следствие, флуорофоров с высокой фотостабильностью [51]. В результате, из-за фототоксического воздействия на клетки SSIM не пригодна для имиджинга живых образцов [52].

1.2.5. STED микроскопия

В 1994 году был предложен новый тип сканирующей флуоресцентной микроскопии STED на основе эффекта подавления спонтанного испускания [53]. Данный подход основан на уменьшении диаметра светящейся точки при помощи дополнительного STED-лазера, который подавляет спонтанную эмиссию во внешней области флуоресцентного пятна за счет эффекта вынужденного излучения (Рисунок 2).

Рисунок 2. Принципы STED микроскопии. Схема показывает различия между традиционной (вверху) и STED (внизу) лазерной сканирующей конфокальной микроскопией. В традиционной микроскопии фокусировка возбуждающего лазера (голубое пятно) и соответствующее пятно эмиссии (зеленое) ограничены дифракцией света, что приводит к размыванию изображения (смайлик) и потере мелких деталей. В STED микроскопии использование дополнительного мощного лазера, облучающего область в форме "пончика" (обозначено красным) вокруг возбуждающего пятна, приводит к вынужденному излучению, и, как следствие, снижению спонтанной эмиссии в этой области. В результате пятно эмиссии, размером существенно меньше дифракционного барьера, наблюдается только из центра "пончика", что позволяет получать более детализированное изображение. Рисунок взят из обзорной статьи автора диссертации - Клементьева и др, СТМ, 2016.

Пучки возбуждающего и STED-лазера тщательно выравниваются, причем распределение интенсивности STED-лазера в фокусе имеет форму "пончика", с нулевой интенсивностью в центре. Спонтанное излучение возбужденного флуорофора (флуоресценция) и вынужденное излучение за счет STED-лазера конкурируют между собой. В результате, при больших интенсивностях STED-лазера, флуоресцируют только те молекулы, которые расположены близко к области с нулевой интенсивностью [54], в то время как в зоне высокой интенсивности происходит преимущественно вынужденное излучение флуорофоров, отбрасываемое в оптическом пути из-за совпадения с длиной волны STED-лазера. Последовательное сканирование всего исследуемого образца дает

полную картину со сверхразрешением. Другими словами, STED микроскоп - это лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с дополнительным STED-лазером, субдифракционное разрешение в котором достигается путем избирательного тушения флуорофора [55].

Чем выше мощность STED-лазера, тем лучшее разрешение можно получить. Теоретически, можно достичь сколь угодно высокого разрешения [56], однако на практике фотоповреждение биологического образца ведет к ограничению мощности STED-пучка и разрешающая способность обычно составляет примерно 30-80 нм в плоскости xy [8].

Использование времяразрешенных детекторов, синхронизированных с импульсным возбуждающим лазером (gated STED), позволяет существенно снизить мощность STED-лазера. В подобных системах, помимо интенсивности флуоресценции, учитывается время жизни флуоресцентного состояния, обеспечивая отбрасывание фотонов с временем жизни флуоресценции, сильно отличающимся от ожидаемого. Это позволяет достичь сверхразрешения и высокого соотношения сигнал/шум в изображении при пониженной интенсивности STED-лазера, что уменьшает риск фотоповреждения живых образцов [57].

Системы на базе STED микроскопа оказались более популярны, чем методы микроскопии ближнего поля, и нашли широкое применение при решении как физических [58], так и биологических задач, особенно в области нейробиологии. Так, с применением STED микроскопа были обнаружены ультратонкие морфологические особенности дендритных шипиков пирамидальных нейронов в срезах гиппокампа мыши [59]. Детально были описаны перемещения везикул, содержащих нейротрансмиттеры, в первичных культурах нейронов крысы [60]. Позднее было продемонстрировано успешное приложение STED микроскопии для изучения динамики нейронов в коре головного мозга мыши in vivo [61]. Важное преимущество метода STED состоит в том, что улучшение в разрешении достигается в режиме реального времени и обычно не требует долговременной обработки данных.

Главные недостатки метода STED микроскопии - это дороговизна оборудования и высокоинтенсивное лазерное облучение, что сильно сужает круг пригодных флуорофоров [62,63]. С практической точки зрения, STED микроскопия эффективна, в основном, для работы с фиксированными образцами, меченными фотостабильными флуоресцентными красителями [64]. Получение многоцветных STED-изображений крайне сложно, так как требует тщательно продуманной конструкции детектирующих каналов и комбинации определенных красителей [65].

Некоторые недостатки STED микроскопии позволяет преодолеть метод RESOLFT (REversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions, микроскопия обратимого насыщенного оптического линейного флуоресцентного перехода). Технология RESOLFT реализована за счет долгоживущих "темновых" (состояний флуорофора с низким квантовым выходом) и флуоресцентных состояний обратимо фотопереключаемых флуорофоров с использованием лазеров с распределением интенсивности излучения в форме "пончика", аналогично методу STED [66]. Для запуска подобных оптических переходов флуорофоров достаточны низкие мощности гасящего лазера, в 105-106 раз ниже, чем необходимые для метода STED. Таки образом, RESOLFT пригоден для долговременного исследования живых клеток и тканей с разрешением до 50-100 нм [67]. Например, этот метод позволил отслеживать динамические перестройки актина в дендритных шипиках живых нейронов гиппокампа в течение нескольких часов без признаков деструкции ткани, с разрешением, в 3 раза превосходящим разрешение конфокального микроскопа [68].

1.2.6. Локализационная микроскопия одиночных молекул (SMLM)

В 2006 году три научные лаборатории независимо друг от друга продемонстрировали новый принцип ФМСР. Были представлены такие методы как STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy, микроскопия стохастической оптической реконструкции) [69], PALM (PhotoActivated

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Клементьева Наталия Владимировна, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Periasamy A. Methods in Cellular Imaging. Springer, 2001. 448 p.

2. Ishikawa-Ankerhold H.C., Ankerhold R., Drummen G.P.C. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. 2012. Vol. 17, № 4. P. 4047-4132.

3. Ettinger A., Wittmann T. Fluorescence live cell imaging // Methods in Cell Biology. 2014. Vol. 123. P. 77-94.

4. Lippincott-Schwartz J., Patterson G.H. Development and Use of Fluorescent Protein Markers in Living Cells // Science. 2003. Vol. 300, № 5616. P. 87-91.

5. Chudakov D.M. et al. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues // Physiol. Rev. 2010. Vol. 90, № 3. P. 1103-1163.

6. Lichtman J.W., Conchello J.-A. Fluorescence microscopy // Nat. Methods. 2005. Vol. 2, № 12. P. 910-919.

7. Stehbens S. et al. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy // Methods Enzymol. 2012. Vol. 504. P. 293-313.

8. Schermelleh L., Heintzmann R., Leonhardt H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy // J. Cell Biol. 2010. Vol. 190, № 2. P. 165-175.

9. Феофанов А.В. Cпектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. 2007. Т. 47. С. 371-410.

10. Gu M. Advanced Optical Imaging Theory. Springer Science & Business Media, 2000. 214 p.

11. Schermelleh L., Heintzmann R., Leonhardt H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy // J. Cell Biol. 2010. Vol. 190, № 2. P. 165-175.

12. Requejo-Isidro J., Jose R.-I. Fluorescence nanoscopy. Methods and applications // J. Chem. Biol. 2013. Vol. 6, № 3. P. 97-120.

13. Huang B., Bates M., Zhuang X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy // Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78, № 1. P. 993-1016.

14. Wiedenmann J., Oswald F., Nienhaus G.U. Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges // IUBMB Life. 2009. Vol. 61,

№ 11. P. 1029-1042.

15. Wäldchen S. et al. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy // Sci. Rep. 2015. Vol. 5. P. 15348.

16. Botchway S.W. et al. A series of flexible design adaptations to the Nikon E-C1 and E-C2 confocal microscope systems for UV, multiphoton and FLIM imaging // J. Microsc. 2015. Vol. 258, № 1. P. 68-78.

17. Bozzola J.J., Russell L.D. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. Jones & Bartlett Learning, 1999. 670 p.

18. van Heel M. et al. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution // Q. Rev. Biophys. 2000. Vol. 33, № 4. P. 307-369.

19. Ayache J. et al. Sample Preparation Handbook for Transmission Electron Microscopy: Methodology. Springer Science & Business Media, 2010. 250 p.

20. Hayat M. Fixation for Electron Microscopy. Elsevier, 2012. 521 p.

21. Henriques R. et al. PALM and STORM: unlocking live-cell super-resolution // Biopolymers. 2011. Vol. 95, № 5. P. 322-331.

22. Leung B.O., Chou K.C. Review of Super-Resolution Fluorescence Microscopy for Biology // Appl. Spectrosc. 2011. Vol. 65, № 9. P. 967-980.

23. Möckl L., Lamb D.C., Bräuchle C. Super-resolved Fluorescence Microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner // Angew. Chem. Int. Ed. 2014. Vol. 53, № 51. P. 13972-13977.

24. Stelzer E.H.K. Better Imaging through Chemistry // Cell. 2014. Vol. 159, № 6. P. 1243-1246.

25. Betzig E., Trautman J.K. Near-field optics: microscopy, spectroscopy, and surface modification beyond the diffraction limit // Science. 1992. Vol. 257, № 5067. P. 189-195.

26. Dunn R.C. Near-field scanning optical microscopy // Chem. Rev. 1999. Vol. 99, № 10. P. 2891-2928.

27. Alu A., Engheta N. Cloaked Near-Field Scanning Optical Microscope Tip for Noninvasive Near-Field Imaging // Phys. Rev. Lett. 2010. Vol. 105, № 26.

28. Oshikane Y. et al. Observation of nanostructure by scanning near-field optical

microscope with small sphere probe // Sci. Technol. Adv. Mater. 2007. Vol. 8, № 3. P. 181-185.

29. Fernandez-Suarez M., Ting A.Y. Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. Vol. 9, № 12. P. 929-943.

30. Han R. et al. Recent Advances in Super-Resolution Fluorescence Imaging and Its Applications in Biology // J. Genet. Genomics. 2013. Vol. 40, № 12. P. 583-595.

31. Dickenson N.E. et al. Near-field scanning optical microscopy: a tool for nanometric exploration of biological membranes // Anal. Bioanal. Chem. 2010. Vol. 396, № 1. P. 31-43.

32. van Zanten T.S., Cambi A., Garcia-Parajo M.F. A nanometer scale optical view on the compartmentalization of cell membranes // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1798, № 4. P. 777-787.

33. Yamamura H., Suzuki Y., Imaizumi Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy // J. Pharmacol. Sci. 2015. Vol. 128, № 1. P. 1-7.

34. Fu Y. et al. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016. Vol. 113, № 16. P. 4368-4373.

35. Axelrod D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology // Traffic. 2001. Vol. 2, № 11. P. 764-774.

36. Kudalkar E.M., Davis T.N., Asbury C.L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy // Cold Spring Harb. Protoc. 2016. Vol. 2016, № 5. P. 435-438.

37. Jaiswal J.K., Simon S.M. Imaging single events at the cell membrane // Nat. Chem. Biol. 2007. Vol. 3, № 2. P. 92-98.

38. Rappoport J.Z. Focusing on clathrin-mediated endocytosis // Biochem. J. 2008. Vol. 412, № 3. P. 415-423.

39. Chung E. et al. Two-Dimensional Standing Wave Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy: Superresolution Imaging of Single Molecular and Biological Specimens // Biophys. J. 2007. Vol. 93, № 5. P. 1747-1757.

40. Dyba M., Hell S.W. Lens-based fluorescence nanoscopy // Q. Rev. Biophys. 2015. Vol. 48, № 02. P. 178-243.

41. Lippincott-Schwartz J., Manley S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work // Nat. Methods. 2009. Vol. 6, № 1. P. 21-23.

42. Dyba M., Marcus D., Hell S.W. Focal Spots of Size I / 23 Open Up Far-Field Florescence Microscopy at 33 nm Axial Resolution // Phys. Rev. Lett. 2002. Vol. 88, № 16.

43. Bewersdorf J., Schmidt R., Hell S.W. Comparison of I5M and 4Pi-microscopy // J. Microsc. 2006. Vol. 222, № Pt 2. P. 105-117.

44. Nienhaus K., Nienhaus G.U. Where Do We Stand with Super-Resolution Optical Microscopy? // J. Mol. Biol. 2016. Vol. 428, № 2 Pt A. P. 308-322.

45. Gustafsson M.G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy // J. Microsc. 2000. Vol. 198, № Pt 2. P. 82-87.

46. Yamanaka M., Smith N.I., Fujita K. Introduction to super-resolution microscopy // Microscopy. 2014. Vol. 63, № 3. P. 177-192.

47. Komis G. et al. Superresolution live imaging of plant cells using structured illumination microscopy // Nat. Protoc. 2015. Vol. 10, № 8. P. 1248-1263.

48. Schermelleh L. et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy // Science. 2008. Vol. 320, № 5881. P. 1332-1336.

49. Fitzgibbon J. et al. Super-resolution imaging of plasmodesmata using three-dimensional structured illumination microscopy // Plant Physiol. 2010. Vol. 153, № 4. P. 1453-1463.

50. Lakadamyali M. Super-resolution microscopy: going live and going fast // Chemphyschem. 2014. Vol. 15, № 4. P. 630-636.

51. Gustafsson M.G.L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. Vol. 102, № 37. P. 13081-13086.

52. Zhang H., Zhao M., Peng L. Nonlinear structured illumination microscopy by surface plasmon enhanced stimulated emission depletion // Opt. Express. 2011.

Vol. 19, № 24. P. 24783-24794.

53. Hell S.W., Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy // Opt. Lett. 1994. Vol. 19, № 11. P. 780-782.

54. Blom H., Widengren J. STED microscopy - towards broadened use and scope of applications // Curr. Opin. Chem. Biol. 2014. Vol. 20. P. 127-133.

55. Willig K.I. et al. STED microscopy resolves nanoparticle assemblies // New J. Phys. 2006. Vol. 8, № 6. P. 106-106.

56. Harke B. et al. Resolution scaling in STED microscopy // Opt. Express. 2008. Vol. 16, № 6. P. 4154-4162.

57. Vicidomini G. et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating // Nat. Methods. 2011. Vol. 8, № 7. P. 571-573.

58. Rittweger E. et al. STED microscopy reveals crystal colour centres with nanometric resolution // Nat. Photonics. 2009. Vol. 3, № 3. P. 144-147.

59. Nägerl U.V. et al. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105, № 48. P. 18982-18987.

60. Lauterbach M.A. et al. Comparing video-rate STED nanoscopy and confocal microscopy of living neurons // J. Biophotonics. 2010. Vol. 3, № 7. P. 417-424.

61. Berning S. et al. Nanoscopy in a Living Mouse Brain // Science. 2012. Vol. 335, № 6068. P. 551-551.

62. Neupane B., Ligler F.S., Wang G. Review of recent developments in stimulated emission depletion microscopy: applications on cell imaging // J. Biomed. Opt. 2014. Vol. 19, № 8. P. 080901.

63. Hell S.W. Toward fluorescence nanoscopy // Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21, № 11. P. 1347-1355.

64. Combs C.A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods // Curr. Protoc. Neurosci. 2010. Vol. Chapter 2. P. Unit2.1.

65. Bückers J. et al. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses // Opt. Express. 2011. Vol. 19, № 4. P. 3130-3143.

66. Schwentker M.A. et al. Wide-field subdiffraction RESOLFT microscopy using

fluorescent protein photoswitching // Microsc. Res. Tech. 2007. Vol. 70, № 3. P. 269-280.

67. Hofmann M. et al. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. Vol. 102, № 49. P. 17565-17569.

68. Testa I. et al. Nanoscopy of Living Brain Slices with Low Light Levels // Neuron. 2012. Vol. 75, № 6. P. 992-1000.

69. Rust M.J., Bates M., Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) // Nat. Methods. 2006. Vol. 3, № 10. P. 793796.

70. Betzig E. et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution // Science. 2006. Vol. 313, № 5793. P. 1642-1645.

71. Hess S.T., Girirajan T.P.K., Mason M.D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy // Biophys. J. 2006. Vol. 91, № 11. P. 4258-4272.

72. Sengupta P., Van Engelenburg S., Lippincott-Schwartz J. Visualizing Cell Structure and Function with Point-Localization Superresolution Imaging // Dev. Cell. 2012. Vol. 23, № 6. P. 1092-1102.

73. Vogelsang J. et al. Make them blink: probes for super-resolution microscopy // Chemphyschem. 2010. Vol. 11, № 12. P. 2475-2490.

74. Tam J., Merino D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods // J. Neurochem. 2015. Vol. 135, № 4. P. 643-658.

75. Thompson R.E., Larson D.R., Webb W.W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes // Biophys. J. 2002. Vol. 82, № 5. P. 2775-2783.

76. Almada P., Culley S., Henriques R. PALM and STORM: Into large fields and high-throughput microscopy with sCMOS detectors // Methods. 2015. Vol. 88. P. 109-121.

77. Sage D. et al. Quantitative evaluation of software packages for single-molecule localization microscopy // Nat. Methods. 2015. Vol. 12, № 8. P. 717-724.

78. Li Y. et al. Fast and efficient molecule detection in localization-based superresolution microscopy by parallel adaptive histogram equalization // ACS Nano. 2013. Vol. 7, № 6. P. 5207-5214.

79. Endesfelder U., Heilemann M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 3. P. 235-238.

80. Banterle N. et al. Fourier ring correlation as a resolution criterion for superresolution microscopy // J. Struct. Biol. 2013. Vol. 183, № 3. P. 363-367.

81. Xu K., Babcock H.P., Zhuang X. Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actin cytoskeleton // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 2. P. 185-188.

82. Shtengel G. et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 9. P. 3125-3130.

83. Huang B. et al. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy // Science. 2008. Vol. 319, № 5864. P. 810-813.

84. Burnette D.T. et al. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 108, № 52. P. 21081-21086.

85. Simonson P.D., Rothenberg E., Selvin P.R. Correction to Single-Molecule-Based Super-Resolution Images in the Presence of Multiple Fluorophores // Nano Lett. 2013. Vol. 13, № 3. P. 1366-1366.

86. Wang Y. et al. Sub-diffraction imaging with confocal fluorescence microscopy by stochastic photobleaching // Opt. Commun. 2014. Vol. 312. P. 62-67.

87. Dertinger T. et al. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI) // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 52. P. 2228722292.

88. Geissbuehler S. et al. Mapping molecular statistics with balanced super-resolution optical fluctuation imaging (bSOFI) // Optical Nanoscopy. 2012. Vol. 1, № 1. P. 4.

89. Geissbuehler S., Dellagiacoma C., Lasser T. Comparison between SOFI and

STORM // Biomed. Opt. Express. 2011. Vol. 2, № 3. P. 408-420.

90. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement // Biotechniques. 2007. Vol. 42, № 5. P. 553, 555, 557 passim.

91. Lukyanov K.A. et al. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol. 6, № 11. P. 885-890.

92. Hinner M.J., Kai J. How to obtain labeled proteins and what to do with them // Curr. Opin. Biotechnol. 2010. Vol. 21, № 6. P. 766-776.

93. Fuchs J. et al. A photoactivatable marker protein for pulse-chase imaging with superresolution // Nat. Methods. 2010. Vol. 7, № 8. P. 627-630.

94. Mishin A.S. et al. Novel uses of fluorescent proteins // Curr. Opin. Chem. Biol. 2015. Vol. 27. P. 1-9.

95. Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells // Science. 2002. Vol. 297, № 5588. P. 18731877.

96. Shcherbakova D.M. et al. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging // Annu. Rev. Biophys. 2014. Vol. 43. P. 303-329.

97. Chang Y.-W. et al. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 7. P. 737-739.

98. Subach F.V. et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy // Nat. Methods. 2009. Vol. 6, № 2. P. 153-159.

99. Gunewardene M.S. et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells // Biophys. J. 2011. Vol. 101, № 6. P. 1522-1528.

100. Subach F.V. et al. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells // J. Am. Chem. Soc. 2010. Vol. 132, № 18. P. 6481-6491.

101. Ando R. et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 20. P. 12651-12656.

102. Wiedenmann J. et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 45. P. 15905-15910.

103. Tsutsui H. et al. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter // EMBO Rep. 2005. Vol. 6, № 3. P. 233-238.

104. Gurskaya N.G. et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24, № 4. P. 461-465.

105. Biteen J.S. et al. Three-dimensional super-resolution imaging of the midplane protein FtsZ in live Caulobacter crescentus cells using astigmatism // Chemphyschem. 2012. Vol. 13, № 4. P. 1007-1012.

106. Zhang M. et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 7. P. 727-729.

107. Chudakov D.M. et al. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking // Nat. Biotechnol. 2004. Vol. 22, № 11. P. 1435-1439.

108. Shroff H. et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 51. P. 20308-20313.

109. Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting // Science. 2004. Vol. 306, № 5700. P. 1370-1373.

110. Andresen M. et al. Photoswitchable fluorescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluorescence nanoscopy // Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26, № 9. P. 1035-1040.

111. Stiel A.C. et al. 1.8 Â bright-state structure of the reversibly switchable fluorescent protein Dronpa guides the generation of fast switching variants // Biochem. J. 2007. Vol. 402, № 1. P. 35-42.

112. Testa I. et al. Nanoscopy of Living Brain Slices with Low Light Levels // Neuron. 2012. Vol. 75, № 6. P. 992-1000.

113. Frost N.A. et al. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and

distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines // Neuron. 2010. Vol. 67, № 1. P. 86-99.

114. Rosenbloom A.B. et al. Optimized two-color super resolution imaging of Drp1 during mitochondrial fission with a slow-switching Dronpa variant // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. Vol. 111, № 36. P. 13093-13098.

115. Wang S. et al. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. Vol. 111, № 23. P. 8452-8457.

116. Lidke K. et al. Superresolution by localization of quantum dots using blinking statistics // Opt. Express. 2005. Vol. 13, № 18. P. 7052-7062.

117. Resch-Genger U. et al. Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels // Nat. Methods. 2008. Vol. 5, № 9. P. 763-775.

118. Dertinger T. et al. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI) // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 52. P. 2228722292.

119. Allen J.R., Ross S.T., Davidson M.W. Single molecule localization microscopy for superresolution // J. Opt. 2013. Vol. 15, № 9. P. 094001.

120. Holden S., Seamus H., Daniel S. Imaging: Super-resolution fight club // Nat. Photonics. 2016. Vol. 10, № 3. P. 152-153.

121. Bates M., Huang B., Zhuang X. Super-resolution microscopy by nanoscale localization of photo-switchable fluorescent probes // Curr. Opin. Chem. Biol. 2008. Vol. 12, № 5. P. 505-514.

122. Dempsey G.T. et al. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging // Nat. Methods. 2011. Vol. 8, № 12. P. 1027-1036.

123. Rust M.J., Mark B., Xiaowei Z. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) // Nat. Methods. 2006. Vol. 3, № 10. P. 793796.

124. Dempsey G.T. et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes // J. Am. Chem. Soc. 2009. Vol. 131, № 51. P. 18192-18193.

125. Bates M., Blosser T.R., Zhuang X. Short-range spectroscopic ruler based on a single-molecule optical switch // Phys. Rev. Lett. 2005. Vol. 94, № 10. P. 108101.

126. Beliveau B.J. et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 7147.

127. Boettiger A.N. et al. Super-resolution imaging reveals distinct chromatin folding for different epigenetic states // Nature. 2016. Vol. 529, № 7586. P. 418-422.

128. Dudok B. et al. Cell-specific STORM super-resolution imaging reveals nanoscale organization of cannabinoid signaling // Nat. Neurosci. 2015. Vol. 18, № 1. P. 7586.

129. van de Linde S., Sauer M. How to switch a fluorophore: from undesired blinking to controlled photoswitching // Chem. Soc. Rev. 2014. Vol. 43, № 4. P. 1076-1087.

130. Ha T., Tinnefeld P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging // Annu. Rev. Phys. Chem. 2012. Vol. 63. P. 595-617.

131. Uno S.-N. et al. A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging // Nat. Chem. 2014.

132. Lee M.K. et al. Small-molecule labeling of live cell surfaces for three-dimensional super-resolution microscopy // J. Am. Chem. Soc. 2014. Vol. 136, № 40. P. 14003-14006.

133. Grimm J.B. et al. Synthesis of a Far-Red Photoactivatable Silicon-Containing Rhodamine for Super-Resolution Microscopy // Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2016. Vol. 55, № 5. P. 1723-1727.

134. Patterson G. et al. Superresolution Imaging using Single-Molecule Localization // Annu. Rev. Phys. Chem. 2010. Vol. 61, № 1. P. 345-367.

135. Uchinomiya S., Ojida A., Hamachi I. Peptide tag/probe pairs based on the coordination chemistry for protein labeling // Inorg. Chem. 2014. Vol. 53, № 4. P. 1816-1823.

136. Correa I.R. Jr. Considerations and protocols for the synthesis of custom protein labeling probes // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1266. P. 55-79.

137. Crivat G., Taraska J.W. Imaging proteins inside cells with fluorescent tags // Trends Biotechnol. 2012. Vol. 30, № 1. P. 8-16.

138. Wombacher R., Richard W., Cornish V.W. Chemical tags: Applications in live cell fluorescence imaging // J. Biophotonics. 2011. Vol. 4, № 6. P. 391-402.

139. Sharonov A., Hochstrasser R.M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 50. P. 18911-18916.

140. Schoen I. et al. Binding-activated localization microscopy of DNA structures // Nano Lett. 2011. Vol. 11, № 9. P. 4008-4011.

141. Szent-Gyorgyi C. et al. Fluorogen-activating single-chain antibodies for imaging cell surface proteins // Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 26, № 2. P. 235-240.

142. Xu J. et al. Labeling Cytosolic Targets in Live Cells with Blinking Probes // J. Phys. Chem. Lett. 2013. Vol. 4, № 13. P. 2138-2146.

143. Yan Q. et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins // Chemphyschem. 2014. Vol. 15, № 4. P. 687-695.

144. Lukinavicius G. et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 7. P. 731-733.

145. Lukinavicius G. et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 8497.

146. Lukinavicius G. et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells // J. Am. Chem. Soc. 2016.

147. Whelan D.R., Bell T.D.M. Super-Resolution Single-Molecule Localization Microscopy: Tricks of the Trade // J. Phys. Chem. Lett. 2015. Vol. 6, № 3. P. 374382.

148. Hess S.T., Girirajan T.P.K., Mason M.D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy // Biophys. J. 2006. Vol. 91, № 11. P. 4258-4272.

149. Shroff H., White H., Betzig E. Photoactivated localization microscopy (PALM) of adhesion complexes // Curr. Protoc. Cell Biol. 2008. Vol. Chapter 4. P. Unit 4.21.

150. Cooper. The Cell: A Molecular Approach. Sinauer Associates, 2000. 689 p.

151. Bezanilla M. et al. Cytoskeletal dynamics: A view from the membrane // J. Cell Biol. 2015. Vol. 209, № 3. P. 329-337.

152. Шутова М.С., Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания нормальных и трансформированных фибробластов. Роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения // Цитология. 2010. Т. 52, № 1. С. 41-51.

153. Yamaguchi H., Hideki Y., John C. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2007. Vol. 1773, № 5. P. 642-652.

154. Pawlak G., Geraldine P., Helfman D.M. Cytoskeletal changes in cell transformation and tumorigenesis // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. Vol. 11, № 1. P. 41-47.

155. Dugina V. et al. Tumor promotion by y and suppression by ß non-muscle actin isoforms // Oncotarget. 2015. Vol. 6, № 16. P. 14556-14571.

156. Swaminathan V. et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines // Cancer Res. 2011. Vol. 71, № 15. P. 50755080.

157. Stevenson R.P., Veltman D., Machesky L.M. Actin-bundling proteins in cancer progression at a glance // J. Cell Sci. 2012. Vol. 125, № 5. P. 1073-1079.

158. Gross S.R. Actin binding proteins: their ups and downs in metastatic life // Cell Adh. Migr. 2013. Vol. 7, № 2. P. 199-213.

159. Nürnberg A. et al. Nucleating actin for invasion // Nat. Rev. Cancer. 2011. Vol. 11, № 3. P. 177-187.

160. McKayed K.K., Simpson J.C. Actin in action: imaging approaches to study cytoskeleton structure and function // Cells. 2013. Vol. 2, № 4. P. 715-731.

161. Sharma S. et al. Correlative nanomechanical profiling with super-resolution F-actin imaging reveals novel insights into mechanisms of cisplatin resistance in ovarian cancer cells // Nanomedicine. 2012. Vol. 8, № 5. P. 757-766.

162. Olson M.F., Erik S. The actin cytoskeleton in cancer cell motility // Clin. Exp.

Metastasis. 2008. Vol. 26, № 4. P. 273-287.

163. Xu K., Zhong G., Zhuang X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons // Science. 2013. Vol. 339, № 6118. P. 452-456.

164. Gatesman Ammer A. et al. Multi-photon imaging of tumor cell invasion in an orthotopic mouse model of oral squamous cell carcinoma // J. Vis. Exp. 2011. № 53.

165. Tsai M.-R. et al. Characterization of oral squamous cell carcinoma based on higher-harmonic generation microscopy // J. Biophotonics. 2012. Vol. 5, № 5-6. P. 415-424.

166. Cox S., Jones G.E. Imaging cells at the nanoscale // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2013. Vol. 45, № 8. P. 1669-1678.

167. Geissbuehler S. et al. Live-cell multiplane three-dimensional super-resolution optical fluctuation imaging // Nat. Commun. 2014. Vol. 5. P. 5830.

168. Ries J. et al. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 6. P. 582-584.

169. Levet F. et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data // Nat. Methods. 2015. Vol. 12, № 11. P. 10651071.

170. Balzarotti F. et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes // Science. 2016.

171. Schindelin J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 7. P. 676-682.

172. Dempsey W.P. et al. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion // Nat. Methods. 2015. Vol. 12, № 7. P. 645-648.

173. Makarov N.S. et al. Steady-state and time-resolved spectroscopic studies of green-to-red photoconversion of fluorescent protein Dendra2 // J. Photochem. Photobiol. A Chem. 2014. Vol. 280. P. 5-13.

174. Biteen J.S. et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP // Nat. Methods. 2008. Vol. 5, № 11. P. 947-949.

175. Shaner N.C. et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum // Nat. Methods. 2013. Vol. 10, № 5. P. 407-409.

176. Winterflood C.M., Helge E. Single-Molecule Localization Microscopy using mCherry // Chemphyschem. 2014. Vol. 15, № 16. P. 3447-3451.

177. Merzlyak E.M. et al. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime // Nat. Methods. 2007. Vol. 4, № 7. P. 555-557.

178. Shaner N.C. et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins // Nat. Methods. 2008. Vol. 5, № 6. P. 545-551.

179. Shemiakina I.I. et al. A monomeric red fluorescent protein with low cytotoxicity // Nat. Commun. 2012. Vol. 3. P. 1204.

180. Shcherbo D. et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues // Biochem. J. 2009. Vol. 418, № 3. P. 567-574.

181. Schenk A. et al. Photodynamics of red fluorescent proteins studied by fluorescence correlation spectroscopy // Biophys. J. 2004. Vol. 86, № 1 Pt 1. P. 384-394.

182. Drobizhev M. et al. Primary role of the chromophore bond length alternation in reversible photoconversion of red fluorescence proteins // Sci. Rep. 2012. Vol. 2. P. 688.

183. Bourgeois D., Regis-Faro A., Adam V. Photoactivated structural dynamics of fluorescent proteins // Biochem. Soc. Trans. 2012. Vol. 40, № 3. P. 531-538.

184. Zhang M. et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 7. P. 727-729.

185. Lukinavicius G. et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton // Nat. Methods. 2014. Vol. 11, № 7. P. 731-733.

186. Cox S. et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 2. P. 195-200.

187. Dempsey G.T. et al. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging // Nat. Methods. 2011. Vol. 8, № 12. P. 1027-1036.

188. Fath K.R., Mamajiwalla S.N., Burgess D.R. The cytoskeleton in development of epithelial cell polarity // J. Cell Sci. 1993. Vol. 1993, № Supplement 17. P. 65-73.

189. Sormunen R. et al. Fodrin and actin in the normal, metaplastic, and dysplastic respiratory epithelium and in lung carcinoma // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1994. Vol. 11, № 1. P. 75-84.

190. Sugimoto K. et al. Expression of stress fibers in bullfrog mesothelial cells in situ // Cell Tissue Res. 1989. Vol. 258, № 2.

191. Trendowski M. et al. Chemotherapy with cytochalasin congeners in vitro and in vivo against murine models // Invest. New Drugs. 2015. Vol. 33, № 2. P. 290-299.

192. Ma Y., Zhao N., Liu G. Conjugate (MTC-220) of muramyl dipeptide analogue and paclitaxel prevents both tumor growth and metastasis in mice // J. Med. Chem. 2011. Vol. 54, № 8. P. 2767-2777.

193. Liu Y.-Z. et al. Alpha-carotene inhibits metastasis in Lewis lung carcinoma in vitro, and suppresses lung metastasis and tumor growth in combination with taxol in tumor xenografted C57BL/6 mice // J. Nutr. Biochem. 2015. Vol. 26, № 6. P. 607-615.