Молекулярные механизмы внутриклеточной инфекции бактерии Mycoplasma gallisepticum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Матюшкина, Дарья Сергеевна

• Матюшкина, Дарья Сергеевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Матюшкина, Дарья Сергеевна

Оглавление

Список сокращений

Актуальность работы

Цель работы

Научная новизна и практическая значимость работы:

1. Введение

1.1 Характеристика бактерий класса Mollicutes

1.2 Регуляция у бактерий рода Mycoplasma

1.3 Пертурбационные модели изучения микоплазм

1.3.1 Модель теплового шока

1.3.2 Модель окислительного стресса

1.3.3 Модель осмостресса

1.3.4 Модель взаимодействия с хозяином

1.4 Механизмы патогенеза микоплазм

1.5 Пути взаимодействия микоплазм с клектой-хозяином

1.5.1 Адгезия

1.5.2 Инвазия

1.5.3 Слияние

1.5.4 Индуцирование сигнальных каскадов при микоплазменной инвазии

1.5.5 Механизмы угнетения клетки-хозяина при микоплазменной инфекции

1.6 Бактерия Mycoplasma gallisepticum как модельный объект исследования

2. Материалы и методы

2.1 Клеточные культуры и условия культивирования

2.2 Заражение клеточных линий HD3, HeLa, mES микоплазмой

2.3 Флуоресцентное окрашивание эукариотических клеток с M. gallisepticum и конфокальная микроскопия

2.4 Сканирующая электронная микроскопия

2.5 Светлопольная микроскопия

2.6 Двумерный электрофорез с дифференциальным окрашиванием

2.7 Триптический гидролиз белка в геле для последующего МАЛДИ-масс-спектрометрического анализа

2.8 МАЛДИ-масс-спектрометрия

2.9 Гидролитическое расщепление белков для ВЭЖХ-МС анализа

2.10 Создание спектральной библиотеки

2.11 Относительный квантификационный анализ методом мониторинга множественных реакций (MRM)

2.12 Метаболомное профилирование M. gallisepticum

2.13 Определение общего содержания АТФ в клеткахM. gallisepticum

2.14 Получение штаммовM. gallisepticum с усиленной экспрессией генов

2.15 Измерение продукции перекиси водорода

2.16 Анализ повреждённости ядерной ДНК

2.17 Полногеномный анализ M. gallisepticum

2.18 Электорофорез ДНК в агарозном геле

2.19 Выделение РНК и синтез кДНК

2.20 Количественная ПЦР в реальном времени

2.21 Статистическая обработка результатов

3. Результаты и обсуждение

3.1 M. gallisepticum способна к внутриклеточной инфекции эукариотических клеток

3.2 2D-дифференциальный электрофорез демонстрирует глобальную протеомную реорганизацию М. gallisepticum при внутриклеточной инфекции

3.3 Новый безметочный подход для относительной квантификации белков Mycoplasma gallisepticum S6 непосредственно в момент взаимодействия с клеткой-хозяином

3.4 SpxA и YebC/PmpR являются глобальными регуляторами M. gallisepticum для адаптации к внутриклеточным условиям

3.5 Взаимодействие с клеткой хозяина приводит к смене поверхностных Vlh-антигенов у M.

gallisepticum

3.6 На уровне генома у МИЭК наблюдаются однонуклеотидные замены в генах VlhA-гемагглютининов

3.7 Выработка перекиси водорода как один из механизмов взаимодействияM. gallisepticum с хозяином

3.8 Для инвазии и внутриклеточной персистенцииM. gallisepticum необходимо АТФ

3.9 При взаимодействии с клеткой-хозяином уМ. gallisepticum наблюдается аттракторная модель поведения

Заключение

Выводы

Список литературы

Приложение 1

Приложение 2

Приложение 3

Приложение 4

Приложение 5

Приложение 6

Приложение 7

Приложение 8

Приложение 9

Список сокращений

АTФ - аденозинтрифосфат БTШ - белки теплового шока

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Д^ - дитиотреитол

кДНК - комплементарная ДНК

КОЕ - колонио-образующая единица

МАЛДИ - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация МИЭК - микоплазма, изолированная из эукариотических клеток MC - масс-спектрометрия НАД - никотинамид-аденин-динуклеотид

OT-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной траскрипцией

ПААГ - полиакриламидный гель

п.о. - пара оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

TЕMЕД - N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин

TФ - транскрипционные факторы

TФУ - трифторуксусная кислота

ФХ - фосфатидилхолин

ЭДTА - этилендиаминтетраацетат

ACN - acetonitrile, ацетонитрил

BSA - Bovine Serum Albumin, бычий сывороточный альбумин CHAPS-3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate,

3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат CTAB - cetyltrimethylammonium bromide, цетил-триметил-аммоний бромид DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole, 4', 6-диамидино-2-фенилиндол DCNa - sodium deoxycholate, дезоксихолата натрия DDA - Data-Dependent Acquisition, дата-зависимый режим IAA - iodoacetic acid, йодацетамид

MRM - Multiple Reaction Monitoring, метод мониторинга множественных реакций PBS - phosphate buffered saline, натрий-фосфатный буфер SDS - sodiumdodecylsulfate, додецилсульфат натрия

NP40 - nonyl phenoxypolyethoxylethanol, нонил-феноксиполиэтоксилэтанол

Актуальность работы

Представителями рода Mycoplasma (класс Mollicutes) являются Грам-положительные бактерии без клеточной стенки. Обусловленная паразитическим образом жизни значительная редукция генома (0.58-2.20 Mb) и, соответственно, редукция всех молекулярных систем клетки, но сохраненная способность микоплазм расти на искусственной питательной среде, делает эти организмы очень удобным модельным объектом для исследований в области системной биологии. Несмотря на значительное уменьшение генома, и как следствие потерю многих метаболических генов и их продуктов, адаптивные способности микоплазм остаются достаточными, чтобы в условиях in vivo и in vitro приспосабливаться к воздействию антибиотиков, теплового и осмотического стрессов, уклоняться от действия иммунной системы хозяина [1-4]. Однако механизмы патогенности и адаптации этих бактерий очень плохо изучены.

Системный анализ разных видов микоплазм in vitro, а также синтез «искусственного» варианта генома молликут JCVI-syn3.0, клетки с содержанием которого способны к автономной репликации на искусственной среде [5], выявил неожиданные свойства этих микроорганизмов. Концепция минимальной клетки, которая казалось простой на первый взгляд, при более тщательном анализе задала больше вопросов, чем было получено ответов: исследователи пока не понимают как при небольшом количестве генов и их продуктов микоплазмы могут обладать феноменом автономной репликации и высокими адаптивными свойствами.

Практически одновременно в нескольких лабораториях было обнаружено удивительное свойство микоплазм - очень слабая корреляция между транскрипционным ответом и синтезом белков в ответ на воздействие на бактериальную культуру различных факторов внешней среды, таких как тепловой шок, гиперосмотический и перекисный стрессы [2,3]. В нашей лаборатории при исследовании этой корреляции на различных пертурбационных моделях [1,3,6,7] было обнаружено, что протеом микоплазм практически не меняется в условиях стресса при довольно значительных изменениях на уровне транскриптома, т.е. протеом можно сравнить с хорошо «забуференной» системой, которая, несмотря на довольно сильные и множественные изменения в содержании транскриптов, не следует за логикой транскрипционного ответа, а скорее является хорошо предадаптированной системой, которая не требует

специализированного изменения определенных функций, а настраивает этот ответ исходя из функциональных комплексов и других, пока еще неизвестных, не изученных механизмов. При этом основная интрига наших предыдущих исследований заключалась в вопросе: возможно ли вообще изменить протеомный профиль клеток рода Mycoplasma и если это возможно, то какие молекулярные механизмы лежат в основе таких изменений?

Проанализировав разные подходы, которые могли бы привести к вариабильности протеома, мы остановились на модели внутриклеточной инфекции. Объектом данного исследования являлась бактерия Mycoplasma gallisepticum, относящаяся к инвазирующим видам молликут и способная проникать внутрь эукариотических клеток, оставаясь при этом интактной и способной к размножению там. M. gallisepticum является патогеном птиц и приводит к развитию хронических заболеваний респираторного тракта, в первую очередь, у куриц и синуситов у индеек. Недавно было показано, что M. gallisepticum может инфицировать диких зябликов, которые ранее не считались хозяевами данной бактерии [8,9]. Ее ближайшими родственниками являются бактерии Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium, а также представители рода Ureaplasma, вызывающие воспалительные заболевания разной локализации у человека. Кроме того, в последнее время появляется все больше публикаций о том, что многие тяжелые заболевания человека, такие как рассеянный склероз, болезнь Крона, солидные раки, лейкемия, лимфома, боковой амиотрофический склероз, синдром Шегрена, болезнь Альцгеймера, синдром Гийена-Барре и ряд других, ассоциируются с микоплазмами [10-14]. В связи с этим, M. gallisepticum является удобной моделью для изучения структуры и функции молликут, патогенных для человека, а также для изучения механизмов влияния бактерий на макроорганизм и процессов, приводящих к трансформации эукариотических клеток вследствие инфекции.

Значительное редуцирование многих метаболических путей делает существование микоплазм сильно зависимым от взаимодействия с хозяином. В настоящее время известно, что хозяевами микоплазм являются практически все живые существа. Появляется все больше и больше данных о способности бактерий класса Mollicutes расширять свой ареал обитания. Так недавно стало известно, что Молликуты относятся к одному из типов эндобактерий грибов ("Mollicutes-related endobacteria"; MRE) [15,16]. Они были обнаружены в мицелии и спорах эндомикоризных грибов [17].

Поэтому изучение микоплазм актуально с точки зрения необычайной способности бактерий адаптироваться к окружающей их среде и занимать новые ниши для обитания.

Интересной особенностью микоплазм является их способность длительное время персистировать в организме хозяина, будучи им незамеченными и не вызывая иммунного ответа. Было показано, что после проникновения в организм курицы через дыхательную систему M. gallisepticum персиситирует по всему телу. В экспериментально инфицированных курицах микоплазма была обнаружена в селезенке, сердце, мозге и почках [18], но механизмы проникновения M. gallisepticum в клетку хозяина и перехода локальной инфекции в системную остаются неизученными. Все эти качества делают их удобной моделью для изучения принципов и молекулярных механизмов перехода от паразитизма к эндосимбиозу. Такие переходы известны не только для MRE, но также и для других микроорганизмов, например, для Wolbachia [19,20].

Микоплазмы являются "грозой" эукариотических клеточных культур. Инфицируя культуры клеток, разные виды микоплазм-контаминантов способны длительное время в них персистировать, не приводя моментально к гибели эукариотические клетки, но медленно нарушая их нормальное функционирование, что приводит к искажению получаемых данных в экспериментах in vitro. К сожалению, на практике не всегда удается детектировать инфицирование клеточных линий на ранних этапах. Кроме того, зараженные клеточные культуры чрезвычайно трудно поддаются "лечению", проводимому для полной элиминации этих бактерий. Поэтому изучение микоплазм поможет разработать новые подходы для элиминации их из лабораторных клеточных культур, что в значительной степени улучшит качество экспериментов, проводимых in vitro.

Изучение молекулярных механизмов взаимодействия бактерии M. gallisepticum с эукариотической клеткой является актуальным и необходимым для понимания фундаментальных принципов взаимодействия патогена с хозяином, его способности приводить к различным трансформациям эукариотических клеток, а также основных принципов перехода от паразитизма к эндосимбиозу. Оно поможет найти новые способы борьбы с патогенами человека и новые подходы для элиминации микоплазм из лабораторных клеточных культур.

Цель работы

Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярных механизмов адаптации Mycoplasma gallisepticum при внутриклеточной инфекции.

Для реализации данной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Создание биологической модели для изучения внутриклеточной инфекции бактерииM. gallisepticum.

2) Протеомное профилирование M. gallisepticum при инфицировании клетки-хозяина и последующей культивации в культуральной среде.

3) Анализ изменений на уровне генома, которые претерпевает M. gallisepticum в результате внутриклеточной инфекции.

4) Метаболомное профилирование M. gallisepticum после внутриклеточной инфекции.

Личный вклад автора.

1. Дизайн и проведение биологических экспериментов, микробиологическая работа (культивирование M. gallisepticum, сокультивирование M. gallisepticum с эукариотическими клеточными линиями, определение кинетики роста, подсчет КОЕ).

2. Подготовка образцов для анализа с помощью флуоресцентного сканирующего микроскопа.

3. Подготовка образцов для электронной микроскопии.

4. Проведение двумерного дифференциального гель-электрофореза.

5. Подготовка образцов для масс-спектрометрического протеомного и метаболомного анализа. Проведение гидролитического расщепления белка.

6. Проведение масс-спектрометрического анализа и идентификация белков.

7. Обработка данных протеомного анализа.

8. Выделение бактериальной геномной ДНК и подготовка образцов для полногеномного секвенирвания.

9. Проведение экспериментов по измерению концентрации перекиси водорода и АТФ.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Впервые проведено исследование внутриклеточной инфекции Mycoplasma gallisepticum. Показано, что бактерия M. gallisepticum способна проникать в эукариотические клетки, принадлежащие к разным хозяевам, а именно куриные эритробласты (линия HD3), мышиные эмбриональные стволовые mES клетки и клетки HeLa (линия раковой опухоли шейки матки человека). Обнаружено явление протеомного «фазового перехода», которое претерпевает M. gallisepticum при инвазии в эукариотические клетки и которое остается стабильным при последующей изоляции бактерии из клеток-хозяев и длительном культивировании на питательной среде в лабораторных условиях. Обнаружено, что изменения протеома M. gallisepticum являются универсальными для всех исследуемых клеточных линий, несмотря на различия в структуре и организации клеток-хозяев. Необходимо отметить, что мы впервые наблюдали такие значительные изменения протеомного профиля по сравнению с результатами белкового анализа микоплазм, полученных ранее в нашей лаборатории и другими группами исследователей. Идентифицированы основные группы белков, представленность которых меняется в результате внутриклеточной инфекции. На моделях острой и хронической инфекции показано, что паттерн белковых изменений в большой степени зависит от длительности взаимодействия M. gallisepticum с эукариотической клеткой. Определены поверхностные VlhA-антигены, которые в первую очередь реагируют на первичный контакт с клеткой хозяина и определяют смену клеточного фенотипа в процессе инфекции. После внутриклеточной персистенции микоплазмы на уровне генома определены однонуклеотидные замены в vlhA генах, которые в основном локализуются в кластере 4. Представлены доказательства участия двух регуляторных белков, SpxA и YebC/PmpR, в процессе взаимодействия M. gallisepticum с эукариотической клеткой. На метаболомном уровне при взаимодействии M. gallisepticum с клеткой хозяина обнаружена активация путей утилизации глицерина и синтеза ацетата из пирувата, что приводит к образованию перекиси водорода.

Исходя из полученных результатов, была предложена аттракторная модель поведения M. gallisepticum при взаимодействии с клеткой-хозяином, где в главной роли переключателей состояния (аттракторов) выступают два регулятора: SpxA и YebC/PmpR. Настоящая работа является теоретической и экспериментальной основой

для последующих прикладных исследований в области взаимодействия патогенных микоплазм с хозяевами. Работа может служить основой для последующих исследований механизмов адаптации и ухода микоплазм от иммунного ответа. Данное исследование поможет разработать новые подходы для элиминации микоплазм из лабораторных клеточных культур, что в значительной степени улучшит качество экспериментов, проводимых in vitro. Полученные результаты помогут пролить свет на механизмы адаптации и бактериальную эволюцию.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на 38-ом Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ, FEBS (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013), на IV Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», (Казань, 29 октября - 1 ноября 2014), на научной конференции молодых ученых ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России (Москва, 13-14 апреля 2015), на итоговой научно-практической конференции ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России (Москва, 15-16 декабря 2015), на V Съезде биохимиков России (Дагомыс, 4-9 октября 2016), на «7th International Conference and Expo on Proteomics», (Рим, 22-27 октября 2016), на итоговой научно-практической конференции ФНКЦ ФХМ ФМБА (Москва, на 20-21 декабря 2016).

Объем работы

Диссертационная работа изложена на 144 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов, списка литературы и приложений. Диссертация содержит 8 таблиц и 23 рисунка.

По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах из перечня, рекомендованного ВАК Минобрнауки России. Результаты работы представлены в виде тезисов и докладов на 7 российских и международных конференциях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы внутриклеточной инфекции бактерии Mycoplasma gallisepticum»

1. Введение

1.1 Характеристика бактерий класса Mollicutes

Одним из наиболее интересных и удобных модельных объектов для системных исследований являются бактерии класса Mollicutes, состоящего из трех основных родов: Mycoplasma, Spiroplasma и Acholeplasma. Представители класса Mollicutes относятся к отдельной ветви филогенетического древа Грам-положительных бактерий, характеризующейся низким содержанием G+C оснований. К этой филогенетической ветви также относятся Lactobacillus, Bacillus и Streptococcus. Особенностью молликут является отсутствие клеточной стенки, достаточно сильно редуцированный геном, изменение функции кодона UGA со стоп-кодона на кодирование триптофана, а также необходимость наличия стеролов в культуральной среде для нормального функционирования клетки. Вследствие паразитизма данных бактерий у них редуцированы многие метаболические пути. Род Mycoplasma, как наиболее широко распространенный из молликут, исследовался на протяжении многих лет различными группами ученых, но до сих пор не удалось определить механизмы инвазии микоплазм в клетку хозяина, а также механизмы их последующей изоляции (выхода) из этих клеток. Микоплазмы способны вызывать заболевания практически у всех живых существ. Их характерной особенностью также является то, что они способны привести к развитию у хозяина длительной хронической инфекции, которая порой может протекать без выраженных клинических симптомов.

Число известных заболеваний, в развитии которых играют роль бактерии рода Mycoplasma, благодаря развивающимся методам их обнаружения с каждым годом все увеличивается. Принято считать, что микоплазмы являются непосредственными агентами возникновения ряда заболеваний, а в некоторых случаях, «кофакторами» возникновения многих болезний, таких как синдром хронической усталости, синдром фибромиалгии, волчанки, рассеянного склероза, псориаза, склеродермии, болезни Крона, солидных раков, лейкемии, лимфом, бокового амиотрофического склероза, воспалительных заболеваний органов таза, астмы, атипичной пневмонии, синдрома Шегрена, интерстициального цистита, болезни Альцгеймера и сердечно-сосудистых заболеваний. Помимо этого, были обнаружены ассоциации микоплазм с различными нейродегенеративными заболеваниями аутоиммунной природы, которые могут вызвать определенные изменения в нервной проводимости, чувствительности и

демиелинизацию (дегенеративный процесс, который разрушает миелиновую оболочку, которая обычно защищает нервные волокна) [11,12,21].

Микоплазмы могут также нарушать нормальное функционирование иммунной системы хозяина. Они способны стимулировать лимфоциты секретировать цитокины, что приводит к возникновению воспаления. Поскольку патогенные микоплазмы способны экспонировать на поверхности мембры большую часть клеточного материала хозяина, они могут спровоцировать аутоиммунную реакцию, в которой иммунная система хозяина начинает атаковать собственные клетки, т.е. инициировать процесс, который может привести к тяжелым повреждениям. В то же время, микоплазмы способны уходить от действия иммунной системы, скрываясь внутри клеток-хозяина или путем слияния с клеточной мембраной [22]. После проникновения в клетки хозяина, микоплазмы могут вызывать образование активных форм кислорода, которые модифицируют молекулы РНК и ДНК клеток. В конечном итоге, это может приводить к злокачественной трансформации.

Среди примерно 200 известных видов Молликут, хозяевами которых являются различные растения, животные и человек, только небольшое количество, относящиеся, в основном, к представителям рода Mycoplasma, известны в качестве патогенов, приводящих к развитию тяжелых инфекционных заболеваний. Большинство из них являются пристеночными, мембранными паразитами, но некоторые, такие как M. pneumoniae, M. genitalium, M. penetrans, могут проникать и персистировать внутри эукариотических клеток. Подобные данные были получены также и для M. gallisepticum [23].

Патогенные микоплазмы обладают выраженным сродством к клеткам эпителия различной локализации. В основном, в ходе инфекции колонизируются эпителиальные покровы урогенитального и респираторного трактов. В свою очередь, микоплазмы, являющиеся комменсалами, способны длительно находиться в организме хозяина, не приводя к развитию заболеваний, но персистируя в паренхиматозных органах. Для комменсальных микоплазм характерно антигенное сходство с патогенными микоплазмами, поэтому они также могут приводить к серологической кросс-реакции, что сильно затрудняет диагностику микоплазменных заболеваний с использованием традиционных серологических тестов. Микоплазмозы большинства животных являются хроническими заболеваниями с высокой степенью инфицирования и относительно

низкой летальностью. Инкубационный период нередко значительно варьирует и может продолжаться несколько недель или месяцев.

1.2 Регуляция у бактерий рода Mycoplasma

Исследования транскрипционной активности бактерий продемонстрировали сложность ее организации даже у «простых» организмов. Классические представления об организации бактериальной транскрипции предполагают, что кодирующие последовательности организованы в опероны - геномные регионы, имеющие промотор, транскрипционный терминатор и одну или несколько кодирующих последовательностей между ними, и транскрибируются в виде одной молекулы РНК. Однако последние наблюдения говорят о том, что опероны бактерий могут иметь внутренние промоторы и терминаторы, а также может наблюдаться феномен "лестничной" транскрипции оперона, когда кодирующие последовательности одного оперона представлены разным числом копий в пуле РНК. Также, для значительной доли мРНК был обнаружен феномен их присутствия в количестве меньшем, чем одна копия на клетку в определенный момент времени, при том, что соответствующий белок оказывается представленным в среднем в каждой клетке [2].

Бактерии с большими геномами имеют сложные системы регуляции экспрессии генов: сотни транскрипционных факторов (ТФ) [24], множество структурных ДНК-связывающих белков и несколько сигма-факторов, каждый из которых играет ключевую роль в реакции на физиологические и средовые воздействия [25]. Как достигается такая структурная организация и какое влияние она оказывает на регуляцию транскрипции до конца неизвестно. Кроме того, не определено также, обладают ли бактерии с редуцированным геномом и уменьшенным количеством копий структурных белков определенной топологией ДНК. Было показано, что изменения в суперспирализации ДНК могут контролировать транскрипцию у бактерий [26], и этот механизм может играть важную роль у бактерий с малым геномом, таких как микоплазмы [27]. Несмотря на отсутствие многих структурных ДНК-связывающих белков [28], микоплазмы способны контролировать экспрессию генов путем изменения локальной структуры ДНК [27,29].

Кроме того, несмотря на простоту организации, бактерии класса Mollicutes демонстрируют сложные транскрипционные ответы на различные стрессовые условия, что противоречит нашим представлениям (редуцированные аннотированные механизмы

регуляции на генном уровне). Проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что молликуты эволюционировали в сторону упрощения архитектуры промотора, что коррелирует с уменьшающейся ролью регуляции транскрипции и увеличением транскрипционного шума [7]. Регуляция экспрессии значительной части генов происходит с помощью "неспецифических" механизмов, связанных со структурными особенностями генома, таких как структура промотора (например, инициирующий нуклеотид и GC-состав окружения промотора), а также с помощью регулируемых терминаторов [3]. Используя технологию 5-обогащённых библиотек было установлено, что промотор M. gallisepticum, как правило, включает один основной элемент —10 бокс с последовательностью TAWAAT (W=A или T). При этом важен также инициирующий нуклеотид (первый нуклеотид РНК), который может быть только G или A. Спейсер между -10 боксом и точкой инициации транскрипции составляет 5-7 нуклеотидов. В частности, спейсер, состоящий из 6 нуклеотидов, является основным. Спейсеры, состоящие из 5 или 7 нуклеотидов, возникают в том случае, если на оптимальной позиции находится C или T, а G или A являются соседними. Также для промотора важно AT-богатое окружение в диапазоне порядка 10 нуклеотидов от -10 бокса. Сильные промоторы часто имеют дополнительный EXT-элемент перед -10 боксом с последовательностью TRTG (R=A или G). Спейсер между EXT-элементом и -10 боксом составляет 1 нуклеотид. Также ряд промоторов имеют -35 элемент TTRAMA (R=A или G, M=A или C). Регуляторные элементы были обнаружены только у 7 промоторов и представляют собой CIRCE элемент - регулятор ответа на тепловой шок. В ходе данного анализа также были обнаружены два класса терминаторов: сильные, представляющие собой внутренние терминаторы со шпилечной структурой, и слабые -такие, у которых шпилечная структура не выражена. При этом для обоих типов наблюдается схожая кривая изменения нуклеотидного состава относительно точки терминации транскрипции. Было показано, что специфические белки-регуляторы контролируют экспрессию лишь малой доли генов. К настоящему времени нами также установлено, что транскрипционные факторы регулируют экспрессию генов шаперонов (4 отдельных гена), кластера деления (1 оперон из 4 генов) и системы рестрикции-модификации (1 оперон из 4 генов). При этом ключевой является регуляция на уровне трансляции (на уровне связывания мРНК с рибосомой), механизмы которой до конца не описаны [30]. Тем не менее нам удалось показать, что при адаптации микоплазм к

разным условиям, рибосома является фактором, подавляющим "шумовую" экспрессию генов, возникающую при стрессовом ответе, т.е. множество транскриптов, увеличивающих свою представленность при стрессе, не связываются с рибосомой. При этом трансляция только небольшого количества мРНК генов, вовлечённых в процесс адаптации, увеличивается.

Для микоплазм характерно наличие малого репертуара транскрипционных факторов, у M. gallisepticum существует десять потенциальных ТФ, восемь из которых находятся внутри оперонов. Регулярные консервативные структуры были обнаружены в промоторах трех из них: Fur-семейства ТФ, WhiA-семейства ТФ и XRE-семейства ТФ [7]. Функциональный анализ соответствующих оперонов показал, что белок семейства Fur может регулировать AP-эндонуклеазу и реагировать на окислительный стресс. Полученные транскриптомные данные соответствуют этой гипотезе [7]. Белок семейства WhiA может регулировать тиоредоксинредуктазу и SecG субъединицу системы экспорта белка. Семейство ТФ XRE и весь последующий оперон системы рестрикции-модификации является общим для M. gallisepticum и M. hominis и, по-видимому, были приобретены данными бактериями через горизонтальный перенос. Таким образом, семейство ТФ XRE, скорее всего, является регулятором своего собственного оперона и может играть роль в качестве глобального регулятора, контролирующего метилирование геномной ДНК. Кроме того, для M. gallisepticum характерно наличие специализированной системы, включающей в себя неизвестный альтернативный сигма-фактор для контроля взаимодействия с иммунной системой хозяина [31]. Но, к сожалению, несмотря на изучение регуляции микоплазм разными научными группами, точной модели, которая смогла бы описать все уровни и механизмы регуляции данных бактерий, не удается постороить. Для того, что бы продвинуться в этом вопросе исследователи используют различные пертурбационные модели анализа микоплазм.

1.3 Пертурбационные модели изучения микоплазм

Биологические функции и клеточный ответ на внешние стимулы регулируются сложным взаимодействием ДНК, РНК, белков и метаболитов в клетке. Для понимания фундаментальных процессов, происходящих в живых системах на молекулярном уровне, обычно проводят качественные и количественные анализы основных внутриклеточных процессов при различных условиях роста и стресса.

Для исследования бактерий рода Mycoplasma ученые применяют несколько устоявшихся стрессовых моделей: тепловой шок; перекисный шок; осмостресс [3,27,3235]. Микоплазмы, благодаря их уникальной организации, резистентны к различным факторам, например к антибиотикам, подавляющим синтез клеточной стенки, таким как пенициллин и его производные, в связи с отсутствием ригидной клеточной стенки. Они чувствительны к ингибиторам синтеза мембранных и внутрицитоплазматических белков (антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам, линкозаминам, аминогликозидам и хинолонам).

Такие подходы анализа микоплазм могут помочь в понимании основных принципов регуляции, но не являются адекватной моделью для изучения регуляции в естественных условиях, в которые попадает патоген при взаимодействии с хозяином. В связи с этим ряд исследовательских групп используют альтернативный подход, при котором микоплазма изучается в другом физиологическом состоянии - взаимодействии с клетками хозяина, что является наиболее приближенным к ее состоянию in vivo.

1.3.1 Модель теплового шока

Одной из наиболее часто применяемых моделей исследования регуляции микоплазм является тепловой шок. Ее использование обословлено тем, что в результате инфекционного процесса у хозяина развивается воспаление, одним из проявлений которого является повышение температуры. Таким образом, тепловой шок является частным случаем модели инфекции.

Белки теплового шока (БТШ) представляют собой группу белков, активность которых проявляется в стрессовых условиях, таких как температурные экстремумы, высокое давление и воздействие токсичных соединений, приводящих к нарушению фолдинга и денатурации полипептидов [36]. Обычно БТШ относятся к шаперонам, белкам, обеспечивающим правильный фолдинг других белков. Они действуют путем связывания с открытыми гидрофобными остатками в неправильно сложенных белковых структурах. Они могут также участвовать в сборке или разборке мультимерных белковых структур и транслокации белков через мембраны. Дополнительный класс БТШ включает протеазы, которые приводят к деградации неправильно свернутых белков или белковых агрегатов [36,37]. БТШ являются высококонсервативными и, по-видимому, универсальными белками, необходимыми для нормального роста клеток. У бактерий, относящихся к типу Firmicutes, БТШ подразделяются на четыре общих класса

в зависимости от их регуляции. Гены, регулируемые репрессором HrcA, относятся к классу I, регулируемые альтернативным сигма-фактором B - к классу II, а гены класса III регулируются с помощью CtsR [38]. Гены, которые не попадают в эти три группы, относят к классу IV.

В генах класса I репрессор HrcA связывается со специфической инвертированной повторяющейся последовательностью, элементом CIRCE, в промоторе [39]. Микоплазмы не обладают специфическими сигма-факторами, участвующими в реакции на высокотемпературные сдвиги. До настоящего времени только один общий сигма-фактор был идентифицирован в геномах микоплазм [40-47]. Кроме того, считается, что те гены, которые подвергаются регуляции, контролируются ограниченным числом регуляторов транскрипции, обнаруженных в минимальном геноме [22]. Вероятно, что одним из этих регуляторов является HrcA.

В 1990 году было проведено два исследования по идентификации белков теплового шока с помощью гель-электрофореза у Mycoplasma capricolum subsp. capricolum и Acholeplasma laidlawii [48,49]. Позднее, для идентификации набора генов, которые реагируют на изменение роста температуры, было выполнено транскрипционное профилирование для M. pneumoniae [50] для идентификации набора генов, которые реагируют на изменение роста температуры. Результаты этого исследования показали, что 47 генов увеличивали свою экспрессию, а 30 генов ее снижали во время температурного сдвига от 32 до 42 °С при значении Р value 0,001. Это исследование также примечательно тем, что оно было первым транкрипционным профилированием, выполненным на клетках микоплазмы. Позже и другими научными группами были проведены для различных видов микоплазм исследования по изменению транскрипции в ответ на тепловой шок [3,34,50,51].

Так, исследование M. hyopneumoniae показывало значительные изменения транскрипционной активности в многочисленных генах, предполагая, что микоплазма, как и другие бактерии, жестко регулирует свои гены в ответ на внешние воздействия [51]. Кроме того, для M. hyopneumoniae был также проведен анализ регуляции в стрессовых условиях на уровне малых РНК (sRNA) [52]. Был выявлен дифференциальный профиль экспрессии для двух sRNA в ответ на стрессовые условия окислительного и теплового шока, предполагая, что на их экспрессию оказывают влияние внешнесредовые сигналы.

Для M. pneumonia также было проведено масштабное исследование поведения бактерии в условиях стресса (тепловой шок, повреждение ДНК и осмостресс) [2]. Но в отличии от геномного уровня, наблюдаемые изменения на уровне белка были незначительными. Наши предыдущие эксперименты также не продемонстрировали значительных белковых изменений в условиях теплового стреса [3]. В результате интеграции данных транскриптомного и протеомного профилирования мы показали, что в исследованных модельных состояниях белковый ответ M. gallisepticum не выражен. Было выявлено 96 белков, чья представленность достоверно отличалась в культурах, подвергнутых тепловому стрессу, по сравнению с контролем. Из них представленность только 4 белков менялась более чем в 2 раза (белок семейства Vlh, осмопротектор OsmC, рибосомальный белок RpsG и шаперон ClpB), остальные белки менялись менее чем в 2 раза), в то время как уровень транскрипции существенно изменялся у порядка 400 генов (амплитуда изменения от двух до нескольких десятков раз). На основе полученных нами данных о строении промоторов и терминаторов M. gallisepticum мы изучили механизм ответа на тепловой стресс на уровне транскрипции [3]. Полученные нами и другими группами исследователей данные о регуляции экспрессии генов в микоплазмах [53,54], свидетельствуют о том, что для M. gallisepticum характерен крайне ограниченный репертуар известных механизмов регуляции.

1.3.2 Модель окислительного стресса

Для реализации успешной инфекции микоплазмам необходимо эффективно противодействовать окислительному стрессу, возникающему вследствие высвобождения активных форм кислорода из нейтрофилов и макрофагов во время иммунного ответа хозяина. Токсичность окислительного стресса у бактерий обусловлена в значительной степени необратимым повреждением ДНК [55]. Это особенно важно для организмов с редуцированными системами репарации ДНК, такими как микоплазмы [1], которые могут оказаться неэффективными при восстановлении этого типа повреждения ДНК [56]. Перекись водорода как побочный продукт дыхания или работы врожденной иммунной системы защиты хозяина может взаимодействовать со свободным железом в клетке и приводить к образованию гидроксильных радикалов, которые способны взаимодействовать с ДНК основаниями и фрагментами сахаров. Эти взаимодействия могут вызывать модификации ДНК, включая разрывы цепей [55]. Для

имитации атаки бактерии макрофагами и нейтрофилами, исследователи применяют модель перекисного (окислительного) стресса с использованием пероксида водорода.

Транскрипционное профилирование M. hyopneumoniae в условиях окислительного стресса выявило значительное снижение уровня активности генов гликолитических путей, генов, кодирующих белки, участвующие в транскрипции, а также белка, который, как известно, активирует окислительные стрессорные каскады в нейтрофилах [33]. Шестьдесят девять процентов генов, повышающих свою экспрессию, были гипотетическими, с неохарактеризованной функцией. Это исследование также выявило дифференциально экспрессированные гены, являющиеся общими и для других стрессовых реакций, что указывает на то, что микоплазмы обладают универсальными системами реагирования на различные стрессовые воздействиями, что, возможно, связано со значительной редукцией их геномов.

В нашей лаборатории также было проведено исследование влияния перекисного стресса на клетки M. gaШsepticum. Наблюдалось увеличение экспрессии 40 и уменьшение экспрессии 27 генов. Среди генов, увеличивающих уровень транскрипции, находятся те, которые связанны с защитой от окислительного стресса и сборкой FeS-кластеров. На протеомном уровне существенных отличий нами не наблюдалось.

1.3.3 Модель осмостресса

Большинство прокариот защищено от осмотического стресса за счет наличия ригидной пептидогликановой клеточной стенки. В свою очередь, клетки животных защищаются с помощью механизма регулировки осмотического баланса между внутриклеточным пространством и внешней средой, что главным образом обеспечивается за счет действия ионных каналов. Для микоплазм, для которых характерно отсутствие ригидной клеточной стенки и ее предшественников, также имеется механизм транспорта ионов для защиты от осмотического лизиса.

Клетки M. gaШsepticum наиболее устойчивы к осмотическому воздействию по сравнению с другими микоплазмами [57]. Мембрана M. gaШsepticum, как и других микоплазм, обладает ограниченной проницаемостью к малым моновалентным катионам [58]. Тем не менее, физические свойства этих мембран отличаются от мембран многих других микоплазм. В состав мембраны M. gaШsepticum входит ненасыщенный фосфатидилхолин (ФХ) [59]. Высокое его содержание индуцирует формирование сегрегированных липидных доменов: холестерин-обедненные домены, которые

находятся в относительно жидком состоянии, и холестерин-богатые липидные домены, которые остаются в твердом состоянии. Было выдвинуто предположение, что наличие неупорядоченных границ на разделе фаз между жесткими и пластичными участками может привести к транспорту малых молекул. В условиях осмотического стресса, внутриклеточные компоненты могут экспортироваться наружу, что приводит к снижению внутреннего осмотического давления и, тем самым, служит системой защиты от набухания клетки.

Исследовательской группой под руководством Joel B. Baseman был разработан микрочип для исследования транскрипционных изменений у M. genitalium после осмотического шока. Используя физиологически релевантное состояние осмолярности (0,3 М NaCl) было идентифицировано 72 гена с пониженной экспрессией и 39 гена, увеличивающих свою экпрессию, причем 21 из них были с неизвестными функциями и 15 - кодировали связанные с мембраной белки. Большинство генов со сниженной регуляцией кодировали ферменты, участвующие в энергетическом обмене, и компоненты процесса трансляции белка.

В проведенных в нашей лабораторией исследованиях мы также использовали модель гиперосмотического стресса. Для M. gallisepticum сублетальная концентрация NaCl составила 1,2 М при обработке клеток в течение 1 часа [1]. Наблюдалось увеличение транскрипции генов, связанных с метаболизмом альдегидов и ацетил-КоА, а также общим, неспецифическим ответом на стресс [3]. В геноме M. gallisepticum отсутствуют гены, связанные с классическими путями адаптации к гиперосмотическому стрессу, такие как специализированные транспортёры осмопротекторов: пролина и глицин-бетаина (proP, betP, opuA), что позволяет предполагать наличие альтернативных механизмов адаптации. Но, несмотря на наличие транскрипционных изменений, на уровне белка достоверных отличий не наблюдалось.

1.3.4 Модель взаимодействия с хозяином

В связи с сильной редукцией генома и отсутсвием многих метаболических путей выживаемость микоплазм сильно зависит от взаимодействия с хозяином. Микоплазмы способны проникать в организм контактным или воздушно-капельным путями, преодолевать муциновые слизистые структуры и достигать клеток эпителия, вероятно, с помощью хемотаксиса. При попадании в организм хозяина бактерия испытывает не разрозненно направленные на нее воздействия, такие как тепловой или перекисный

стресс, а совокупный ответ хозяина, направленный на элиминацию патогена. Но, несмотря на видимое преимущество модели изучения микоплазмы при взаимодействии с хозяином по сравнению с другими вышеперечисленными моделями, полученные в ходе проведенных исследований разными научными группами результаты не привели к четкому пониманию, какие изменения необходимы бактерии для адаптации и выживания внутри клетки-хозяина [8,23,60-63,63-69].

Было проведено исследование с использованием микрочипов для анализа транскрипционных изменений M. gallisepticum штамма Rlow при взаимодействии с линией фибробластов легких MRC-5 [63]. Наблюдались изменения в представленности 58 генов, большую часть из которых составляли гены, кодирующие белки транспорта, метаболизма и трансляции. В свою очередь, 20 генов из идентифицированных 58 относились к генам с неохарактеризованной функцией.

В работе других авторов было показано, что уровень метилирования ДНК M. hyorhinis при внутриклеточном персистировании в трофобластах человека HTR8/SVneo отличался по сравнению с контрольным штаммом, культивирующимся в лабораторных условиях. Наблюдалось снижение CG-специфического метилирования геномной ДНК после инвазии в клетки хозяина. Авторы предположили, что варьирование уровня метилирования в геноме M. hyorhinis способствует лучшему выживанию данной бактерии как внутри, так и вне эукариотических клеток.

Интересное исследование было проведено для M. gallisepticum, штаммов, изолированных от зябликов [8]. Был впервые показан усиленный захват CRISPR кассетами новых спейсеров и общая реорганизация с последующей редукцией этих CRISPR кассет.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Матюшкина, Дарья Сергеевна, 2017 год

Список литературы

1. Gorbachev A.Y. et al. DNA repair in Mycoplasma gallisepticum. // BMC Genomics. BMC Genomics, - 2013. - Vol. 14, - № 1. - P. 726.

2. Maier T. et al. Quantification of mRNA and protein and integration with protein turnover in a bacterium // Mol. Syst. Biol. - 2014. - Vol. 7, - № 1. - P. 511-511.

3. Mazin P. V. et al. Transcriptome analysis reveals novel regulatory mechanisms in a genome-reduced bacterium // Nucleic Acids Res. - 2014. - Vol. 42, - № 21. - P. 1325413268.

4. Pflaum K. et al. Global changes in Mycoplasma gallisepticum phase-variable lipoprotein gene vlhA expression during in vivo infection of the natural chicken host // Infect. Immun. - 2016. - Vol. 84, - № 1. - P. 351-355.

5. Hutchison C.A. et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. -2016. - Vol. 351, - № 6280. - P. aad6253-aad6253.

6. Fisunov G. et al. Ribosome profiling reveals an adaptation strategy of reduced bacterium to acute stress // Biochimie. - 2017. - Vol. 132. - P. 66-74.

7. Fisunov G.Y. et al. Reconstruction of Transcription Control Networks in Mollicutes by High-Throughput Identification of Promoters // Front. Microbiol. - 2016. - Vol. 7, - № December. - P. 1977.

8. Delaney N.F. et al. Ultrafast evolution and loss of CRISPRs following a host shift in a novel wildlife pathogen, Mycoplasma Gallisepticum // PLoS Genet. - 2012. - Vol. 8, - № 2. - P. e1002511.

9. Tulman E.R. et al. Extensive variation in surface lipoprotein gene content and genomic changes associated with virulence during evolution of a novel North American house finch epizootic strain of Mycoplasma gallisepticum // Microbiol. (United Kingdom). -2012. - Vol. 158, - № 8. - P. 2073-2088.

10. Cimolai N. Do mycoplasmas cause human cancer? // Can. J. Microbiol. - 2001. - Vol. 47, - № 8. - P. 691-697.

11. Kuwahara M. et al. Characterization of the neurological diseases associated with

Mycoplasma pneumoniae infection and anti-glycolipid antibodies // J. Neurol. Springer Berlin Heidelberg, - 2016. - Vol. 264, - № 3, - P. 467-475.

12. Makonahalli R., Seneviratne J., Seneviratne U. Acute small fiber neuropathy following Mycoplasma infection: a rare variant of Guillain-Barre syndrome // J Clin Neuromuscul Dis. - 2014. - Vol. 15, - № 4. - P. 147-151.

13. Rogers M.B. Mycoplasma and cancer: In search of the link // Oncotarget. - 2011. - Vol. 2, - № 4. - P. 271-273.

14. Riviera Tapia J.A., Rodriguez Preval N. Possible role of mycoplasmas in pathogenesis of gastrointestinal diseases. // Rev Biomed. - 2006. - Vol. 17, - № 2. - P. 132-139.

15. Naito M., Morton J.B., Pawlowska T.E. Minimal genomes of mycoplasma-related endobacteria are plastic and contain host-derived genes for sustained life within Glomeromycota // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2015. - Vol. 112, - № 25. - P. 77917796.

16. Torres-Cortés G. et al. Mosaic genome of endobacteria in arbuscular mycorrhizal fungi: Transkingdom gene transfer in an ancient mycoplasma-fungus association. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2015. - Vol. 112. - P. 7785-7790.

17. Naumann M., Schüssler A., Bonfante P. The obligate endobacteria of arbuscular mycorrhizal fungi are ancient heritable components related to the Mollicutes. // ISME J. - 2010. - Vol. 4. - P. 862-871.

18. Much P. et al. Mycoplasma gallisepticum: Influence of cell invasiveness on the outcome of experimental infection in chickens // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2002. - Vol. 34, - № 3. - P. 181-186.

19. Nikoh N. et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2014. - Vol. 111, - № 28. - P. 10257-10262.

20. Werren J.H., Baldo L., Clark M.E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology // Nat. Rev Microbiol. - 2008. - Vol. 6, - № 10. - P. 741-751.

21. Zhou M. et al. Meningitis in a Chinese adult patient caused by Mycoplasma hominis: a rare infection and literature review // BMC Infect. Dis. BMC Infectious Diseases, - 2016. - Vol. 16, - № 1. - P. 557.

22. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. United States, - 1998. - Vol. 62, - № 4. - P. 1094-1156.

23. Winner F., Rosengarten R., Citti C. In vitro cell invasion of Mycoplasma gallisepticum.

// Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, - № 7. - P. 4238-4244.

24. Perez-Rueda E., Collado-Vides J. The repertoire of DNA-binding transcriptional regulators in Escherichia coli K-12. // Nucleic Acids Res. England, - 2000. - Vol. 28, -№ 8. - P. 1838-1847.

25. Helmann J.D. Bacillus subtilis extracytoplasmic function (ECF) sigma factors and defense of the cell envelope. // Curr. Opin. Microbiol. England, - 2016. - Vol. 30. - P. 122-132.

26. Cameron A.D.S., Stoebel D.M., Dorman C.J. DNA supercoiling is differentially regulated by environmental factors and FIS in Escherichia coli and Salmonella enterica. // Mol. Microbiol. England, - 2011. - Vol. 80, - № 1. - P. 85-101.

27. Zhang W., Baseman J.B. Transcriptional regulation of MG_149, an osmoinducible lipoprotein gene from Mycoplasma genitalium. // Mol. Microbiol. England, - 2011. -Vol. 81, - № 2. - P. 327-339.

28. Herrmann R., Reiner B. Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium: a comparison of two closely related bacterial species. // Curr. Opin. Microbiol. England, -1998. - Vol. 1, - № 5. - P. 572-579.

29. Trussart M. et al. Defined chromosome structure in the genome-reduced bacterium Mycoplasma pneumoniae // Nat. Commun. - 2017. - Vol. 8. - P. 14665.

30. Fisunov G.Y. et al. Ribosome profiling reveals an adaptation strategy of reduced bacterium to acute stress // Biochimie. Elsevier B.V, - 2017. - Vol. 132. - P. 66-74.

31. Liu L., Panangala V.S., Dybvig K. Trinucleotide GAA repeats dictate pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum by affecting spacing between flanking regions // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, - № 5. - P. 1335-1339.

32. Zhang W., Baseman J.B. Transcriptional response of Mycoplasma genitalium to osmotic stress // Microbiology. - 2011. - Vol. 157, - № 2. - P. 548-556.

33. Schafer E.R. et al. Global transcriptional analysis of Mycoplasma hyopneumoniae following exposure to hydrogen peroxide // Microbiology. - 2007. - Vol. 153, - № 11. -P. 3785-3790.

34. Musatovova O., Dhandayuthapani S., Baseman J.B. Transcriptional heat shock response in the smallest known self-replicating cell, Mycoplasma genitalium. // J. Bacteriol.

United States, - 2006. - Vol. 188, - № 8. - P. 2845-2855.

35. Maier T. et al. Quantification of mRNA and protein and integration with protein turnover in a bacterium. // Mol. Syst. Biol. - 2011. - Vol. 7, - № 1. - P. 511.

36. Neidhardt F.C. Escherichia coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology, Vol. 1 (of2) // Trends Biochem. Sci. - 1988. - Vol. 13, - № 12. - P. 493-494.

37. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. // Microbiol. Rev. United States, - 1992. - Vol. 56, - № 4. - P. 592-621.

38. Helmann J.D. et al. Global transcriptional response of Bacillus subtilis to heat shock. // J. Bacteriol. United States, - 2001. - Vol. 183, - № 24. - P. 7318-7328.

39. Hecker M., Schumann W., Volker U. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis. // Mol. Microbiol. England, - 1996. - Vol. 19, - № 3. - P. 417-428.

40. Chambaud I. et al. The complete genome sequence of the murine respiratory pathogen Mycoplasma pulmonis. // Nucleic Acids Res. England, - 2001. - Vol. 29, - № 10. - P. 2145-2153.

41. Fraser C.M. et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. // Science. United States, - 1995. - Vol. 270, - № 5235. - P. 397-403.

42. Glass J.I. et al. The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum. // Nature. England, - 2000. - Vol. 407, - № 6805. - P. 757-762.

43. Minion F.C. et al. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis. // J. Bacteriol. United States, - 2004. - Vol. 186, - № 21. - P. 7123-7133.

44. Sasaki Y. et al. The complete genomic sequence of Mycoplasma penetrans, an

intracellular bacterial pathogen in humans. // Nucleic Acids Res. England, - 2002. - Vol. 30, - № 23. - P. 5293-5300.

45. Vasconcelos A.T.R. et al. Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae. // J. Bacteriol. United States, - 2005. - Vol. 187, - № 16. - P. 5568-5577.

46. Westberg J. et al. The genome sequence of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC type strain PG1T, the causative agent of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP). //

Genome Res. United States, - 2004. - Vol. 14, - № 2. - P. 221-227.

47. Papazisi L. et al. The complete genome sequence of the avian pathogen Mycoplasma gallisepticum strain R(low). // Microbiology. England, - 2003. - Vol. 149, - № Pt 9. - P. 2307-2316.

48. Borchsenius S.N., Budantseva E. V., Vonsky M.S. The heat shock proteins of Acholeplasma laidlawii. // Zentralbl. Bakteriol. - 1990. - Vol. 20. - P. 657-658.

49. Dascher C.C., Poddar S.K., Maniloff J. Heat shock response in mycoplasmas, genome-limited organisms // J. Bacteriol. - 1990. - Vol. 172, - № 4. - P. 1823-1827.

50. Weiner J. 3rd et al. Transcription profiles of the bacterium Mycoplasma pneumoniae grown at different temperatures. // Nucleic Acids Res. England, - 2003. - Vol. 31, - № 21. - P. 6306-6320.

51. Madsen M.L. et al. Transcriptional profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during heat shock using microarrays. // Infect. Immun. United States, - 2006. - Vol. 74, - № 1. - P. 160-166.

52. Siqueira F.M. et al. Mycoplasma non-coding RNA: identification of small RNAs and targets. // BMC Genomics. England, - 2016. - Vol. 17, - № Suppl 8. - P. 743.

53. Yus E. et al. Impact of genome reduction on bacterial metabolism and its regulation. // Science. - 2009. - Vol. 326, - № 5957. - P. 1263-1268.

54. Güell M. et al. Transcriptome complexity in a genome-reduced bacterium. // Science. -2009. - Vol. 326, - № 5957. - P. 1268-1271.

55. Gusarov I., Nudler E. NO-mediated cytoprotection: instant adaptation to oxidative stress in bacteria. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. United States, - 2005. - Vol. 102, - № 39. -P. 13855-13860.

56. Zou N., Dybvig K. DNA Replication , Repair and Stress Response // Mol. Biol. - 2002-№ 64. - P. 303-321.

57. Rottem S., Kahane I. Mycoplasma Cell Membranes. - 1993. - Vol. 20.

58. Rottem S., Shirvan M.H., Gross Z. Phase separation, ion permeability, and the isolation of membranes from osmotically stable mycoplasmas. // Yale J. Biol. Med. United States, - 1983. - Vol. 56, - № 5-6. - P. 405-411.

59. Rottem S., Verkleij A.J. Possible association of segregated lipid domains of Mycoplasma gallisepticum membranes with cell resistance to osmotic lysis. // J. Bacteriol. United States, - 1982. - Vol. 149, - № 1. - P. 338-345.

60. Kornspan J.D., Tarshis M., Rottem S. Invasion of melanoma cells by Mycoplasma hyorhinis: Enhancement by protease treatment // Infect. Immun. - 2010. - Vol. 78, - № 2. - P. 611-617.

61. Hegde S. et al. In vitro and in vivo cell invasion and systemic spreading of Mycoplasma agalactiae in the sheep infection model. // Int. J. Med. Microbiol. - 2014. - Vol. 304, - № 8. - P. 1024-1031.

62. Chernov A. V et al. Depletion of CG-Specific Methylation in Mycoplasma hyorhinis Genomic DNA after Host Cell Invasion // PLoS One. - 2015. - Vol. 10, - № 11. - P. 113.

63. Cecchini K.R., Gorton T.S., Geary S.J. Transcriptional responses of Mycoplasma gallisepticum strain R in association with eukaryotic cells // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, - № 16. - P. 5803-5807.

64. Much P. et al. Mycoplasma gallisepticum: Influence of cell invasiveness on the outcome of experimental infection in chickens. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. England, -2002. - Vol. 34, - № 3. - P. 181-186.

65. Rosengarten R. et al. Host-pathogen interactions in mycoplasma pathogenesis: virulence and survival strategies of minimalist prokaryotes. // Int. J. Med. Microbiol. - 2000. - Vol. 290, - № 1. - P. 15-25.

66. Li Y. et al. Mycoplasma ovipneumoniae induces sheep airway epithelial cell apoptosis through an ERK signalling-mediated mitochondria pathway // BMC Microbiol. BMC Microbiology, - 2016. - Vol. 16, - № 222. - P. 1-13.

67. Vogl G. et al. Mycoplasma gallisepticum invades chicken erythrocytes during infection // Infect. Immun. - 2008. - Vol. 76, - № 1. - P. 71-77.

68. Majumder S., Silbart K. Interaction of Mycoplasma gallisepticum with Chicken Tracheal Epithelial Cells Contributes to Macrophage Chemotaxis and Activation. - 2016. - Vol. 84, - № 1. - P. 266-274.

69. Ron M. et al. Mycoplasma gallisepticum in vivo induced antigens expressed during infection in chickens. // Vet. Microbiol. Netherlands, - 2014. - Vol. 175, - № 2-4. - P. 265-274.

70. Hallamaa K.M. et al. Differential expression of lipoprotein genes in Mycoplasma pneumoniae after contact with human lung epithelial cells, and under oxidative and acidic stress. // BMC Microbiol. - 2008. - Vol. 8. - P. 124.

71. Goret J. et al. Surface lipoproteome of Mycoplasma hominis PG21 and differential expression after contact with human dendritic cells. 2016. - Vol. 11, - № 2. - P. 179.

72. Simecka, J.W., Davis, J.K., Davidson, M.K., Ross, S.E., Stadtlander, C.T.K.-H. & Cassel G.H. Mycoplasma diseases of animals. In J. Maniloff (Ed.), Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. // Washington, DC Am. Soc. Micro- Biol. - 1992. -P. 391-415.

73. McAuliffe L. et al. Biofilm formation by mycoplasma species and its role in environmental persistence and survival // Microbiology. - 2006. - Vol. 152, - № 4. - P. 913-922.

74. Razin S., Jacobs E. Mycoplasma adhesion. // J. Gen. Microbiol. England, - 1992. - Vol. 138, - № 3. - P. 407-422.

75. Noormohammadi A.H. Role of phenotypic diversity in pathogenesis of avian mycoplasmosis. // Avian Pathol. - 2007. - Vol. 36, - № 6. - P. 439-444.

76. Yogev D. et al. A surface epitope undergoing high-frequency phase variation is shared by Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma bovis. // Infect. Immun. United States, -

1994. - Vol. 62, - № 11. - P. 4962-4968.

77. Keeler C.L.J. et al. Cloning and characterization of a putative cytadhesin gene (mgc1) from Mycoplasma gallisepticum. // Infect. Immun. United States, - 1996. - Vol. 64, - № 5. - P. 1541-1547.

78. Roche R.J., Moxon E.R. Phenotypic variation of carbohydrate surface antigens and the pathogenesis of Haemophilus influenzae infections. // Trends Microbiol. England, -

1995. - Vol. 3, - № 8. - P. 304-309.

79. Senior K.E., Demarco de Hormaeche R., Jessop H.L. Immunization of guinea pigs with epitope C-rich lipopolysaccharide from Neisseria gonorrhoea; in vivo selection of gonococcal variants. // Microb. Pathog. England, - 1989. - Vol. 6, - № 4. - P. 251-264.

80. Madoff L.C. et al. Group B streptococci escape host immunity by deletion of tandem repeat elements of the alpha C protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. United States, -

1996. - Vol. 93, - № 9. - P. 4131-4136.

81. Brunham R.C., Peeling R.W. Chlamydia trachomatis antigens: role in immunity and pathogenesis. // Infect. Agents Dis. United States, - 1994. - Vol. 3, - № 5. - P. 218-233.

82. Mackowiak P.A. Microbial latency. // Rev. Infect. Dis. United States, - 1984. - Vol. 6, -№ 5. - P. 649-668.

83. Kupsch E.M. et al. Variable opacity (Opa) outer membrane proteins account for the cell tropisms displayed by Neisseria gonorrhoeae for human leukocytes and epithelial cells. // EMBO J. England, - 1993. - Vol. 12, - № 2. - P. 641-650.

84. Baseggio N. et al. Size and genomic location of the pMGA multigene family of Mycoplasma gallisepticum // Microbiology. - 1996. - Vol. 142, - № 6. - P. 1429-1435.

85. Glew M.D. et al. Expression of the pMGA genes of Mycoplasma gallisepticum is controlled by variation in the GAA trinucleotide repeat lengths within the 5' noncoding regions. // Infect. Immun. United States, - 1998. - Vol. 66, - № 12. - P. 5833-5841.

86. Glew M.D. et al. pMGA phenotypic variation in Mycoplasma gallisepticum occurs in vivo and is mediated by trinucleotide repeat length variation. // Infect. Immun. United States, - 2000. - Vol. 68, - № 10. - P. 6027-6033.

87. Markham P.F. et al. Expression of two members of the pMGA gene family of Mycoplasma gallisepticum oscillates and is influenced by pMGA-specific antibodies // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66, - № 6. - P. 2845-2853.

88. Noormohammadi A.H. et al. Mycoplasma synoviae has two distinct phase-variable major membrane antigens, one of which is a putative hemagglutinin. // Infect. Immun. United States, - 1997. - Vol. 65, - № 7. - P. 2542-2547.

89. Noormohammadi A.H. et al. A novel mechanism for control of antigenic variation in the haemagglutinin gene family of mycoplasma synoviae. // Mol. Microbiol. England, -2000. - Vol. 35, - № 4. - P. 911-923.

90. Narat M. et al. The hemagglutination-positive phenotype of Mycoplasma synoviae induces experimental infectious synovitis in chickens more frequently than does the hemagglutination-negative phenotype. // Infect. Immun. United States, - 1998. - Vol. 66, - № 12. - P. 6004-6009.

91. Goh M.S. et al. Molecular and biochemical analysis of a 105 kDa Mycoplasma gallisepticum cytadhesin (GapA). // Microbiology. England, - 1998. - Vol. 144. - P. 2971-2978.

92. Dybvig K., Voelker L.L. Molecular biology of mycoplasmas. // Annu. Rev. Microbiol. United States, - 1996. - Vol. 50. - P. 25-57.

93. Dallo S.F. et al. Biofunctional domains of the Mycoplasma pneumoniae P30 adhesin. // Infect. Immun. United States, - 1996. - Vol. 64, - № 7. - P. 2595-2601.

94. Krause D.C. Mycoplasma pneumoniae cytadherence: unravelling the tie that binds. // Mol. Microbiol. England, - 1996. - Vol. 20, - № 2. - P. 247-253.

95. Romero-Arroyo C.E. et al. Mycoplasma pneumoniae protein P30 is required for cytadherence and associated with proper cell development. // J. Bacteriol. United States,

- 1999. - Vol. 181, - № 4. - P. 1079-1087.

96. Dirksen L.B. et al. Sequence analysis and characterization of the hmw gene cluster of Mycoplasma pneumoniae. // Gene. Netherlands, - 1996. - Vol. 171, - № 1. - P. 19-25.

97. Layh-Schmitt G., Harkenthal M. The 40- and 90-kDa membrane proteins (ORF6 gene product) of Mycoplasma pneumoniae are responsible for the tip structure formation and P1 (adhesin) association with the Triton shell. // FEMS Microbiol. Lett. England, - 1999.

- Vol. 174, - № 1. - P. 143-149.

98. Balish M.F. et al. Stability of Mycoplasma pneumoniae cytadherence-accessory protein HMW1 correlates with its association with the triton shell. // J. Bacteriol. United States,

- 2001. - Vol. 183, - № 12. - P. 3680-3688.

99. Rottem S. Interaction of mycoplasmas with host cells. // Physiol. Rev. - 2003. - Vol. 83, - № 2. - P. 417-432.

100. Zuo L., Wu Y., You X. Mycoplasma lipoproteins and Toll-like receptors. // J. Zhejiang Univ. Sci. B. - 2009. - Vol. 10, - № 1. - P. 67-76.

101. Jan G., Brenner C., Wroblewski H. Purification of Mycoplasma gallisepticum membrane proteins p52, p67 (pMGA), and p77 by high-performance liquid chromatography. // Protein Expr. Purif. United States, - 1996. - Vol. 7, - № 2. - P. 160-166.

102. Muhlradt P.F. et al. Isolation, structure elucidation, and synthesis of a macrophage stimulatory lipopeptide from Mycoplasma fermentans acting at picomolar concentration. // J. Exp. Med. United States, - 1997. - Vol. 185, - № 11. - P. 1951-1958.

103. Himmelreich R. et al. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. // Nucleic Acids Res. England, - 1996. - Vol. 24, - № 22. - P.

104. Serebryakova M. V et al. The acylation state of surface lipoproteins of mollicute Acholeplasma laidlawii. // J. Biol. Chem. United States, - 2011. - Vol. 286, - № 26. - P. 22769-22776.

105. Jan G. et al. Acylation and immunological properties of Mycoplasma gallisepticum membrane proteins. // Res. Microbiol. France, - 1995. - Vol. 146, - № 9. - P. 739-750.

106. Kovacs-Simon A., Titball R.W., Michell S.L. Lipoproteins of bacterial pathogens. // Infect. Immun. United States, - 2011. - Vol. 79, - № 2. - P. 548-561.

107. Browning G.F. et al. The central role of lipoproteins in the pathogenesis of mycoplasmoses // Vet. Microbiol. Elsevier B.V., - 2011. - Vol. 153, - № 1-2. - P. 44-50.

108. Truchetet M.-E. et al. Potential role of Mycoplasma hominis in interleukin (IL)-17-producing CD4+ T-cell generation via induction of IL-23 secretion by human dendritic cells. // J. Infect. Dis. United States, - 2011. - Vol. 204, - № 11. - P. 1796-1805.

109. Cole B.C. et al. Isolation and partial purification of macrophage- and dendritic cell-activating components from Mycoplasma arthritidis: association with organism virulence and involvement with Toll-like receptor 2. // Infect. Immun. United States, -2005. - Vol. 73, - № 9. - P. 6039-6047.

110. Liu Y.-C. et al. Proteomics characterization of cytoplasmic and lipid-associated membrane proteins of human pathogen Mycoplasma fermentans M64. // PLoS One. United States, - 2012. - Vol. 7, - № 4. - P. e35304.

111. Shimizu T., Kida Y., Kuwano K. Ureaplasma parvum lipoproteins, including MB antigen, activate NF-{kappa}B through TLR1, TLR2 and TLR6. // Microbiology. England, - 2008. - Vol. 154, - № Pt 5. - P. 1318-1325.

112. Shimizu T., Kida Y., Kuwano K. A triacylated lipoprotein from Mycoplasma genitalium activates NF-kappaB through Toll-like receptor 1 (TLR1) and TLR2. // Infect. Immun. United States, - 2008. - Vol. 76, - № 8. - P. 3672-3678.

113. Czurda S. et al. Xer1-mediated site-specific DNA inversions and excisions in Mycoplasma agalactiae. // J. Bacteriol. United States, - 2010. - Vol. 192, - № 17. - P. 4462-4473.

114. Wise K.S. et al. Distinctive repertoire of contingency genes conferring mutation- based

phase variation and combinatorial expression of surface lipoproteins in Mycoplasma capricolum subsp. capricolum of the Mycoplasma mycoides phylogenetic cluster. // J. Bacteriol. United States, - 2006. - Vol. 188, - № 13. - P. 4926-4941.

115. Chaussee M.S., Cole R.L., Van Putten J.P.M. Streptococcal erythrogenic toxin B abrogates fibronectin-dependent internalization of Streptococcus pyogenes by cultured mammalian cells // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, - № 6. - P. 3226-3232.

116. Shaw J.H., Falkow S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae // Infect Immun. - 1988. - Vol. 56, - № 6. - P. 1625-1632.

117. Jensen J.S., Blom J., Lind K. Intracellular location of Mycoplasma genitalium in cultured Vero cells as demonstrated by electron microscopy. // Int. J. Exp. Pathol. -1994. - Vol. 75, - № 2. - P. 91-98.

118. Giron J.A., Lange M., Baseman J.B. Adherence, fibronectin binding, and induction of cytoskeleton reorganization in cultured human cells by Mycoplasma penetrans // Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64, - № 1. - P. 197-208.

119. Andreev J. et al. Invasion of HeLa cells by Mycoplasma penetrans and the induction of tyrosine phosphorylation of a 145-kDa host cell protein. // FEMS Microbiol. Lett. England, - 1995. - Vol. 132, - № 3. - P. 189-194.

120. Duensing T.D., Wing J.S., Van Putten J.P.M. Sulfated polysaccharide-directed recruitment of mammalian host proteins: A novel strategy in microbial pathogenesis // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, - № 9. - P. 4463-4468.

121. Yavlovich A., Rottem S. Plasminogen Binding and Activation by. - 2001. - Vol. 69, - № 4. - P. 1977-1982.

122. Furnkranz U. et al. Factors influencing the cell adhesion and invasion capacity of Mycoplasma gallisepticum. // Acta Vet. Scand. England, - 2013. - Vol. 55. - P. 63.

123. Finlay B.B., Ruschkowski S., Dedhar S. Cytoskeletal rearrangements accompanying salmonella entry into epithelial cells. // J. Cell Sci. England, - 1991. - Vol. 99 ( Pt 2). - P. 283-296.

124. Borovsky Z. et al. Protein kinase C activation and vacuolation in HeLa cells invaded by Mycoplasma penetrans. // J. Med. Microbiol. England, - 1998. - Vol. 47, - № 10. - P. 915-922.

125. Oelschlaeger T.A., Kopecko D.J. Microtubule dependent invasion pathways of bacteria. // Subcell. Biochem. United States, - 2000. - Vol. 33. - P. 3-19.

126. Giron J.A., Lange M., Baseman J.B. Adherence, fibronectin binding, and induction of cytoskeleton reorganization in cultured human cells by Mycoplasma penetrans. // Infect. Immun. United States, - 1996. - Vol. 64, - № 1. - P. 197-208.

127. Elsinghorst E.A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. // Methods Enzymol. United States, - 1994. - Vol. 236. - P. 405-420.

128. Taylor-Robinson D. et al. Intracellular location of mycoplasmas in cultured cells demonstrated by immunocytochemistry and electron microscopy. // Int. J. Exp. Pathol. -1991. - Vol. 72, - № 6. - P. 705-714.

129. Stadtlander C.T. et al. Cytopathogenicity of Mycoplasma fermentans (including strain incognitus). // Clin. Infect. Dis. United States, - 1993. - Vol. 17 Suppl 1. - P. S289-S301.

130. Siegel D.P. Energetics of intermediates in membrane fusion: comparison of stalk and inverted micellar intermediate mechanisms. // Biophys. J. United States, - 1993. - Vol. 65, - № 5. - P. 2124-2140.

131. Rottem S. Unique choline-containing phosphoglycolipids in Mycoplasma fermentans. // Chem. Phys. Lipids. Ireland, - 2015. - Vol. 191. - P. 61-67.

132. Deutsch J., Salman M., Rottem S. An unusual polar lipid from the cell membrane of Mycoplasma fermentans. // Eur. J. Biochem. England, - 1995. - Vol. 227, - № 3. - P. 897-902.

133. Almagor M. et al. Protective effects of the glutathione redox cycle and vitamin E on cultured fibroblasts infected by Mycoplasma pneumoniae. // Infect. Immun. United States, - 1986. - Vol. 52, - № 1. - P. 240-244.

134. Shibata K., Sasaki T., Watanabe T. AIDS-associated mycoplasmas possess phospholipases C in the membrane. // Infect. Immun. United States, - 1995. - Vol. 63, -№ 10. - P. 4174-4177.

135. Rosenshine I., Finlay B.B. Exploitation of host signal transduction pathways and cytoskeletal functions by invasive bacteria. // Bioessays. United States, - 1993. - Vol. 15, - № 1. - P. 17-24.

136. Salman M. et al. Membrane lipids of Mycoplasma fermentans. // FEMS Microbiol. Lett.

England, - 1994. - Vol. 123, - № 3. - P. 255-260.

137. Shibata K. et al. Acid phosphatase purified from Mycoplasma fermentans has protein tyrosine phosphatase-like activity. // Infect. Immun. United States, - 1994. - Vol. 62, - № 1. - P. 313-315.

138. Pollack J.D., Williams M. V, McElhaney R.N. The comparative metabolism of the mollicutes (Mycoplasmas): the utility for taxonomic classification and the relationship of putative gene annotation and phylogeny to enzymatic function in the smallest free-living cells. // Crit. Rev. Microbiol. England, - 1997. - Vol. 23, - № 4. - P. 269-354.

139. Paddenberg R. et al. Mycoplasma nucleases able to induce internucleosomal DNA degradation in cultured cells possess many characteristics of eukaryotic apoptotic nucleases. // Cell Death Differ. England, - 1998. - Vol. 5, - № 6. - P. 517-528.

140. Balla K.M., Troemel E.R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. // Cell. Microbiol. England, - 2013. - Vol. 15, - № 8. - P. 1313-1322.

141. Mylonakis E., Aballay A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. // Infect. Immun. United States, - 2005. - Vol. 73, - № 7. - P. 3833-3841.

142. Meijer A.H., Spaink H.P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. // Curr. Drug Targets. Netherlands, - 2011. - Vol. 12, - № 7. - P. 10001017.

143. Deutschbauer A. et al. Evidence-based annotation of gene function in Shewanella oneidensis MR-1 using genome-wide fitness profiling across 121 conditions. // PLoS Genet. United States, - 2011. - Vol. 7, - № 11. - P. e1002385.

144. Majumder S., Zappulla F., Silbart L.K. Mycoplasma gallisepticum Lipid Associated Membrane Proteins Up-regulate Inflammatory Genes in Chicken Tracheal Epithelial Cells via TLR-2 Ligation through an NF-kB Dependent Pathway. // PLoS One. - 2014. -Vol. 9, - № 11. - P. e112796.

145. Indikova I. et al. Role of the GapA and CrmA cytadhesins of Mycoplasma gallisepticum in promoting virulence and host colonization. // Infect. Immun. United States, - 2013. -Vol. 81, - № 5. - P. 1618-1624.

146. Hudson P. et al. Identification of a virulence-associated determinant, dihydrolipoamide dehydrogenase (lpd), in Mycoplasma gallisepticum through in vivo screening of transposon mutants. // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74, - № 2. - P. 931-939.

147. Tseng C.W. et al. MalF is essential for persistence of Mycoplasma gallisepticum in vivo. // Microbiol. (United Kingdom). - 2013. - Vol. 159, - № 7. - P. 1459-1470.

148. Markham P.F. et al. The organisation of the multigene family which encodes the major cell surface protein, pMGA, of Mycoplasma gallisepticum. // FEBS Lett. - 1994. - Vol. 352, - № 3. - P. 347-352.

149. Glew M.D. et al. Expression studies on four members of the pMGA multigene family in Mycoplasma gallisepticum S6. // Microbiology. - 1995. - Vol. 141, - № 11. - P. 30053014.

150. Liu L. et al. GAA trinucleotide repeat region regulates M9/pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum. // Infect. Immun. United States, - 2000. - Vol. 68, - № 2. - P. 871-876.

151. Liu L., Panangala V.S., Dybvig K. Trinucleotide GAA repeats dictate pMGA gene

expression in Mycoplasma gallisepticum by affecting spacing between flanking regions. // J. Bacteriol. United States, - 2002. - Vol. 184, - № 5. - P. 1335-1339.

152. Markham P.F. et al. Expression of two members of the pMGA gene family of

Mycoplasma gallisepticum oscillates and is influenced by pMGA-specific antibodies. // Infect. Immun. United States, - 1998. - Vol. 66, - № 6. - P. 2845-2853.

153. Glew M.D. et al. pMGA phenotypic variation in Mycoplasma gallisepticum occurs in vivo and is mediated by trinucleotide repeat length variation. // Infect. Immun. - 2000. -Vol. 68, - № 10. - P. 6027-6033.

154. Vanyushkina A. a et al. Metabolomic analysis of three Mollicute species. // PLoS One. -2014. - Vol. 9, - № 3. - P. e89312.

155. Lee S.-W., Browning G.F., Markham P.F. Development of a replicable oriC plasmid for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma imitans, and gene disruption through homologous recombination in M. gallisepticum. // Microbiology. England, - 2008. - Vol. 154, - № Pt 9. - P. 2571-2580.

156. Olive P.L., Banath J.P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. // Nat. Protoc. England, - 2006. - Vol. 1, - № 1. - P. 23-29.

157. Langmead B., Salzberg S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. // Nat. Methods. United States, - 2012. - Vol. 9, - № 4. - P. 357-359.

158. Li H. et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. // Bioinformatics. England, - 2009. - Vol. 25, - № 16. - P. 2078-2079.

159. Yu J. et al. Interaction of enteric bacterial pathogens with murine embryonic stem cells. // Infect. Immun. United States, - 2009. - Vol. 77, - № 2. - P. 585-597.

160. Van Der Merwe J., Prysliak T., Perez-Casal J. Invasion of bovine peripheral blood mononuclear cells and erythrocytes by Mycoplasma bovis. // Infect. Immun. - 2010. -Vol. 78, - № 11. - P. 4570-4578.

161. Hopfe M. et al. Host Cell Responses to Persistent Mycoplasmas - Different Stages in Infection of HeLa Cells with Mycoplasma hominis. // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, - № 1.

- P. e54219.

162. Lu P. et al. Absolute protein expression profiling estimates the relative contributions of transcriptional and translational regulation. // Nat Biotechnol. - 2007. - Vol. 25, - № 1. -P. 117-124.

163. Nie L., Wu G., Zhang W. Correlation of mRNA expression and protein abundance affected by multiple sequence features related to translational efficiency in Desulfovibrio vulgaris: A quantitative analysis. // Genetics. - 2006. - Vol. 174, - № 4. - P. 2229-2243.

164. Picard F. et al. Bacterial translational regulations: high diversity between all mRNAs and major role in gene expression. // BMC Genomics. - 2012. - Vol. 13. - P. 528.

165. Henderson B., Martin A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. // Infect. Immun.

- 2011. - Vol. 79, - № 9. - P. 3476-3491.

166. Henderson B. et al. Fibronectin: A multidomain host adhesin targeted by bacterial fibronectin-binding proteins. // FEMS Microbiol. Rev. - 2011. - Vol. 35, - № 1. - P. 147200.

167. Pancholi V., Fischetti V.A. A major surface protein on group A streptococci is a glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase with multiple binding activity. // J. Exp. Med. United States, - 1992. - Vol. 176, - № 2. - P. 415-426.

168. Pancholi V., Fischetti V.A. alpha-enolase, a novel strong plasmin(ogen) binding protein on the surface of pathogenic streptococci. // J. Biol. Chem. United States, - 1998. - Vol. 273, - № 23. - P. 14503-14515.

169. Dallo S.F. et al. Elongation factor Tu and E1 beta subunit of pyruvate dehydrogenase complex act as fibronectin binding proteins in Mycoplasma pneumoniae. // Mol. Microbiol. England, - 2002. - Vol. 46, - № 4. - P. 1041-1051.

170. Kuntumalla S. et al. In vivo versus in vitro protein abundance analysis of Shigella dysenteriae type 1 reveals changes in the expression of proteins involved in virulence, stress and energy metabolism. // BMC Microbiol. - 2011. - Vol. 11, - № 1. - P. 147.

171. Pieper R. et al. The Shigella dysenteriae serotype 1 proteome, profiled in the host intestinal environment, reveals major metabolic modifications and increased expression of invasive proteins. // Proteomics. - 2009. - Vol. 9, - № 22. - P. 5029-5045.

172. Pieper R. et al. Characterizing the escherichia coli O157:H7 proteome including protein associations with higher order assemblies. // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, - № 11.- P. e26554.

173. Shi L. et al. Proteomic analysis of Salmonella enterica serovar typhimurium isolated from RAW 264.7 macrophages: identification of a novel protein that contributes to the replication of serovar typhimurium inside macrophages. // J. Biol. Chem. United States, -2006. - Vol. 281, - № 39. - P. 29131-29140.

174. Suh M.-J. et al. Proteomes of pathogenic Escherichia coli/Shigella group surveyed in their host environments. // Expert Rev. Proteomics. - 2014. - Vol. 11, - № 5. - P. 593609.

175. Mann M. Functional and quantitative proteomics using SILAC. // Nat Rev Mol Cell Biol. Nature Publishing Group, - 2006. - Vol. 7, - № 12. - P. 952-958.

176. Wiese S. et al. Protein labeling by iTRAQ: a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. // Proteomics. Germany, - 2007. - Vol. 7, - № 3. - P. 340-350.

177. Abbatiello S.E. et al. Design, implementation and multisite evaluation of a system suitability protocol for the quantitative assessment of instrument performance in liquid chromatography-multiple reaction monitoring-MS (LC-MRM-MS). // Mol. Cell. Proteomics. United States, - 2013. - Vol. 12, - № 9. - P. 2623-2639.

178. Sengupta N., Alam S.I. In vivo studies of clostridium perfringens in mouse gas gangrene model. // Curr. Microbiol. - 2011. - Vol. 62, - № 3. - P. 999-1008.

179. Twine S.M. et al. In vivo proteomic analysis of the intracellular bacterial pathogen, Francisella tularensis, isolated from mouse spleen. // Biochem. Biophys. Res. Commun. United States, - 2006. - Vol. 345, - № 4. - P. 1621-1633.

180. Schmidt F. et al. Time-resolved quantitative proteome profiling of host-pathogen interactions: The response of Staphylococcus aureus RN1HG to internalisation by human airway epithelial cells. // Proteomics. - 2010. - Vol. 10, - № 15. - P. 2801-2811.

181. Paape D. et al. Gel free analysis of the proteome of intracellular Leishmania mexicana. // Mol. Biochem. Parasitol. Netherlands, - 2010. - Vol. 169, - № 2. - P. 108-114.

182. Paape D. et al. Transgenic, fluorescent Leishmania mexicana allow direct analysis of the proteome of intracellular amastigotes. // Mol. Cell. Proteomics. United States, - 2008. -Vol. 7, - № 9. - P. 1688-1701.

183. Becker D. et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. // Nature. England, - 2006. - Vol. 440, - № 7082. - P. 303-307.

184. Boyce J.D. et al. Analysis of the Pasteurella multocida outer membrane sub-proteome and its response to the in vivo environment of the natural host. // Proteomics. Germany, -2006. - Vol. 6, - № 3. - P. 870-880.

185. Dehal P.S. et al. MicrobesOnline: An integrated portal for comparative and functional genomics. // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol. 38, - № SUPPL.1. - P. 1-5.

186. Leelakriangsak M., Zuber P. Transcription from the P3 promoter of the Bacillus subtilis spx gene is induced in response to disulfide stress. // J. Bacteriol. United States, - 2007. -Vol. 189, - № 5. - P. 1727-1735.

187. Rochat T. et al. Genome-wide identification of genes directly regulated by the

pleiotropic transcription factor Spx in Bacillus subtilis. // Nucleic Acids Res. - 2012. -Vol. 40, - № 19. - P. 9571-9583.

188. Kajfasz J.K. et al. Two Spx proteins modulate stress tolerance, survival, and virulence in Streptococcus mutans. // J. Bacteriol. - 2010. - Vol. 192, - № 10. - P. 2546-2556.

189. Galvao L.C.C. et al. Transcriptional and phenotypic characterization of novel Spx-regulated genes in Streptococcus mutans. // PLoS One. - 2015. - Vol. 10, - № 4. - P. 120.

190. Kajfasz J.K. et al. Transcription of Oxidative Stress Genes Is Directly Activated by SpxA1 and, to a Lesser Extent, by SpxA2 in Streptococcus mutans. // J. Bacteriol. -2015. - Vol. 197, - № 13. - P. 2160-2170.

191. Chen L. et al. SpxA1 involved in Hydrogen Peroxide production, stress tolerance and

endocarditis virulence in streptococcus sanguinis. // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, - № 6. -P. e40034.

192. Turlan C. et al. SpxA1, a novel transcriptional regulator involved in X-state

(competence) development in Streptococcus pneumoniae. // Mol. Microbiol. - 2009. -Vol. 73, - № 3. - P. 492-506.

193. Zheng C. et al. Two Spx regulators modulate stress tolerance and virulence in Streptococcus suis serotype 2. // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, - № 9. - P. e108197.

194. Pamp S.J. et al. Spx is a global effector impacting stress tolerance and biofilm formation in Staphylococcus aureus. // J. Bacteriol. - 2006. - Vol. 188, - № 13. - P. 4861-4870.

195. Chatterjee S.S. et al. Intracellular Gene Expression Profile of Listeria monocytogenes Intracellular Gene Expression Profile of Listeria monocytogenes. // Infect. Immun. -2006. - Vol. 74, - № 2. - P. 1323-1338.

196. Barendt S. et al. Transcriptomic and phenotypic analysis of paralogous spx gene

function in Bacillus anthracis Sterne. // Microbiologyopen. - 2013. - Vol. 2, - № 4. - P. 695-714.

197. Turner M.S., Yu P.T., Giffard P.M. Inactivation of an iron transporter in Lactococcus lactis results in resistance to tellurite and oxidative stress. // Appl. Environ. Microbiol. -2007. - Vol. 73, - № 19. - P. 6144-6149.

198. Kajfasz J.K. et al. The Spx regulator modulates stress responses and virulence in Enterococcus faecalis. // Infect. Immun. - 2012. - Vol. 80, - № 7. - P. 2265-2275.

199. Shiwa Y. et al. Bacillus subtilis degSU operon is regulated by the ClpXP-Spx regulated proteolysis system. // J. Biochem. - 2015. - Vol. 157, - № 5. - P. 321-330.

200. Leelakriangsak M., Kobayashi K., Zuber P. Dual negative control of spx transcription initiation from the P3 promoter by repressors PerR and YodB in Bacillus subtilis. // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, - № 5. - P. 1736-1744.

201. Nakano S. et al. Spx-dependent global transcriptional control is induced by thiol-specific oxidative stress in Bacillus subtilis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2003. - Vol. 100, -№ 23. - P. 13603-13608.

202. Leelakriangsak M., Kobayashi K., Zuber P. Dual negative control of spx transcription initiation from the P3 promoter by repressors PerR and YodB in Bacillus subtilis. // J.

Bacteriol. United States, - 2007. - Vol. 189, - № 5. - P. 1736-1744.

203. Nakano S. et al. Redox-sensitive transcriptional control by a thiol/disulphide switch in the global regulator, Spx. // Mol. Microbiol. England, - 2005. - Vol. 55, - № 2. - P. 498510.

204. Runde S. et al. The role of thiol oxidative stress response in heat-induced protein aggregate formation during thermotolerance in Bacillus subtilis. // Mol. Microbiol. -2014. - Vol. 91, - № 5. - P. 1036-1052.

205. Jousselin A. et al. The Staphylococcus aureus Thiol/Oxidative stress global regulator Spx controls trfA, a gene implicated in cell wall antibiotic resistance. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2013. - Vol. 57, - № 7. - P. 3283-3292.

206. Nakano S. et al. Multiple Pathways of Spx ( YjbD ) Proteolysis in Bacillus subtilis Multiple Pathways of Spx ( YjbD ) Proteolysis in Bacillus subtilis. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, - № 13. - P. 3664-3670.

207. Antelmann H., Scharf C., Hecker M. Phosphate starvation-inducible proteins of Bacillus subtilis: proteomics and transcriptional analysis. // J. Bacteriol. United States, - 2000. -Vol. 182, - № 16. - P. 4478-4490.

208. Newberry K.J. et al. Crystal structure of the Bacillus subtilis anti-alpha, global transcriptional regulator, Spx, in complex with the alpha C-terminal domain of RNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2005. - Vol. 102, - № 44. - P. 1583915844.

209. Lin A.A., Walthers D., Zuber P. Residue substitutions near the redox center of Bacillus subtilis Spx affect RNA polymerase interaction, redox control, and Spx-DNA contact at a conserved cis-acting element. // J. Bacteriol. - 2013. - Vol. 195, - № 17. - P. 39673978.

210. Leelakriangsak M., Zuber P. Transcription from the P3 promoter of the Bacillus subtilis spx gene is induced in response to disulfide stress. // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, - № 5. - P. 1727-1735.

211. Shin D.H. et al. Crystal structure of conserved hypothetical protein Aq1575 from Aquifex aeolicus. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 2, - № 1. - P. 53-66.

212. Liang H. et al. The YebC family protein PA0964 negatively regulates the Pseudomonas aeruginosa quinolone signal system and pyocyanin production. // J. Bacteriol. - 2008. -Vol. 190, - № 18. - P. 6217-6227.

213. Kolker E. et al. Identification and functional analysis of "hypothetical" genes expressed in Haemophilus influenzae. // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32, - № 8. - P. 23532361.

214. Zhang Y., Lin J., Gao Y. In silico identification of a multi-functional regulatory protein involved in Holliday junction resolution in bacteria. // BMC Syst. Biol. BioMed Central Ltd, - 2012. - Vol. 6, - № Suppl 1. - P. S20.

215. Daubenspeck J.M., Liu R., Dybvig K. Rhamnose Links Moonlighting Proteins to Membrane Phospholipid in Mycoplasmas. // PLoS One. - 2016. - Vol. 11, - № 9. - P. e0162505.

216. Ron M. et al. Mycoplasma gallisepticum in vivo induced antigens expressed during infection in chickens. // Veterinary microbiology. - 2015. - Vol. 175, - № 2-4. - P. 265274.

217. Szczepanek S.M. et al. Identification of lipoprotein MslA as a neoteric virulence factor of Mycoplasma gallisepticum // Infect. Immun. - 2010. - Vol. 78, - № 8. - P. 3475-3483.

218. Richard J.P. Mechanism for the formation of methylglyoxal from triosephosphates. // Biochem. Soc. Trans. England, - 1993. - Vol. 21, - № 2. - P. 549-553.

219. Shipanova I.N., Glomb M.A., Nagaraj R.H. Protein modification by methylglyoxal: chemical nature and synthetic mechanism of a major fluorescent adduct. // Arch. Biochem. Biophys. United States, - 1997. - Vol. 344, - № 1. - P. 29-36.

220. Schmidl S.R. et al. A trigger enzyme in mycoplasma pneumoniae: Impact of the glycerophosphodiesterase glpq on virulence and gene expression. // PLoS Pathog. -2011. - Vol. 7, - № 9. - P. e1002263.

221. Szczepanek S.M. et al. Hydrogen peroxide production from glycerol metabolism is dispensable for virulence of Mycoplasma gallisepticum in the tracheas of chickens. // Infect. Immun. United States, - 2014. - Vol. 82, - № 12. - P. 4915-4920.

222. Lambert G., Kussel E. Memory and Fitness Optimization of Bacteria under Fluctuating Environments. // PLoS Genet. - 2014. - Vol. 10, - № 9. - P. e1004793.

223. Wolf D.M. et al. Memory in microbes: Quantifying history-dependent behavior in a bacterium. // PLoS One. - 2008. - Vol. 3, - № 2. - P. e1700.

224. Casadesus J., D'Ari R. Memory in bacteria and phage. // BioEssays. - 2002. - Vol. 24, -

№ 6. - P. 512-518.

225. Mathis R., Ackermann M. Response of single bacterial cells to stress gives rise to

complex history dependence at the population level // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2016. -Vol. 113, - № 15. - P. 201511509.

226. Wolf D.M., Vazirani V. V., Arkin A.P. Diversity in times of adversity: Probabilistic strategies in microbial survival games. // J. Theor. Biol. - 2005. - Vol. 234, - № 2. - P. 227-253.

227. Kauffman S.A. The origins of order: Self-organization and selection in evolution. // Underst. Orig. - 1992. - Vol. 65, - № December. - P. 153-181.

228. Capra F. THE WEB OF LIFE. - 1996.

229. Dubrova E., Teslenko M., Martinelli A. Kauffman networks: Analysis and applications. // ICCAD-2005. IEEE/ACM Int. Conf. Comput. Des. -2005. - P. 479-484.

230. Cell S. et al. Transcriptional Heat Shock Response in the Smallest Known. // Society. -2006. - Vol. 188, - № 8. - P. 2845-2855.

231. Dubnau D., Losick R. Bistability in bacteria. // Mol. Microbiol. - 2006. - Vol. 61, - № 3. - P. 564-572.

232. Deris J.B. et al. Supplementary Materials for The Innate Growth Bistability and Fitness Landscapes of Antibiotic- Resistant Bacteria. // Science. - 2013. - Vol. 342, - № 6162. -P. 1237435.