Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Юрченко, Юлия Валерьевна

• Юрченко, Юлия Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юрченко, Юлия Валерьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Щелочная фосфатаза микроорганизмов и высших организмов

1.1.1. Распространение и локализация

1.1.2. Структура щелочной фосфатазы

1.1.3. Механизм ферментативного действия

1.1.4. Свойства щелочной фосфатазы

1.1.5. Механизм регуляции экспрессии (на примере Е. coli)

1.2. Ферменты термофильных микроорганизмов

1.2.1. Термофильные микроорганизмы

1.2.2. Физико-химические особенности ферментов термофильных 23 микроорганизмов

1.2.3. Термостабильные щелочные фосфатазы

1.3. Практическое применение щелочных фосфатаз

1.3.1. Использование щелочных фосфатаз для получения 33 ферментативных конъюгатов в методе ELISA

1.3.2. Применение щелочных фосфатаз в генной инженерии, 34 молекулярной биологии и диагностике

1.3.3. Использование щелочных фосфатаз в качестве репортерного 37 гена

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культивирование штаммов микроорганизмов

2.2. Клонирование фрагмента гена щелочной фосфатазы М. ruber

2.3. Клонирование полноразмерного гена щелочной фосфатазы М. 41 ruber

2.4. Конструирование плазмид для экспрессии гена щелочной 42 фосфатазы М. ruber в клетках Е. coli

2.5. Выделение и очистка рекомбинантных щелочных фосфатаз М. 45 ruber

2.6. Определение активности щелочной фосфатазы М. ruber

2.7. Определение оптимума pH и температуры и термостабильности 48 щелочной фосфатазы М. ruber

2.8. Изучение влияния ионов металлов и химических агентов на 48 активность щелочной фосфатазы М. ruber

2.9. Определение субстратной специфичности щелочной фосфатазы 49 М. ruber

2.10. Дефосфорилирование 5' -концов ДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клонирование гена щелочной фосфатазы М. ruber

3.1.1. Клонирование ПЦР-фрагментов гена

3.1.2. Клонирование полноразмерного гена

3.2. Нуклеотидная последовательность гена щелочной фосфатазы М. 55 ruber

3.3. Сравнение аминокислотных последовательностей щелочной 59 фосфатазы М. ruber и других бактериальных щелочных фосфатаз

3.4. Биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber в 61 клетках Е. coli

3.5. Выделение и очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. 67 ruber

3.6. Биохимические характеристики рекомбинантной щелочной 69 фосфатазы М. ruber

3.6.1. Влияние pH и температуры на активность щелочной 70 фосфатазы М. ruber, термостабильность фермента, субстратная специфичность и величина Кт для 4НФФ

3.6.2. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы 74 М. ruber

3.6.3. Влияние химических агентов на активность щелочной 76 фосфатазы М. ruber

3.6.4. Дефосфорилирование 5'-концов ДНК с помощью щелочной 77 фосфатазы М. ruber

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка»

Актуальность работы

В настоящее время большой интерес представляют ферменты экстремофилов - микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях. Интерес к этим ферментам обусловлен двумя причинами. Во-первых, выяснение конкретных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышенную стабильность к разным критическим факторам внешней среды, является актуальной задачей современной энзимологии и белковой инженерии, так как в будущем позволит направленно создавать химерные белки с заданными свойствами. Во-вторых, такие стабильные ферменты, устойчивые к критическим условиям, крайне важны для решения целого ряда практических задач. В связи с этим особого внимания заслуживают термостабильные ферменты из термофильных микроорганизмов. В качестве такой модели нами была выбрана термостабильная щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber 132-4К. Следует отметить, что щелочная фосфатаза привлекательна не только в качестве модели при изучении механизмов, обуславливающих термостабильность, но и широким применением в молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии и клинической диагностике, где особенно велика потребность в стабильных ферментах. Все вышесказанное определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и характеристике щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К.

Цель работы

Целью данной работы является клонирование и экспрессия в клетках Escherichia coli гена щелочной фосфатазы термофильной бактерии Meiothermus ruber, установление нуклеотидной последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного белка и определение его основных физико-химических и биохимических характеристик.

Научная новизна

Впервые клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli ген щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К. Установлена нуклеотидная последовательность клонированного гена, рекомбинантный белок выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4К представляет собой термостабильный фермент с рядом свойств, общих для большинства бактериальных щелочных фосфатаз. Аминокислотная последовательность щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К показывает высокую степень гомологии по отношению к аминокислотным последовательностям щелочных фосфатаз родственных бактерий Thermus sp. и Thermus caldophilus и демонстрирует консерватизм аминокислотных остатков, вовлеченных в формирование активного центра фермента. В то же время, фермент из Meiothermus ruber 132-4К обладает рядом таких уникальных черт, как узкий рабочий интервал pH, строгая зависимость активности от наличия экзогенного Mg2+ и устойчивость к тиол-восстанавливающим агентам - 2-меркаптоэтанолу и дитиотреитолу.

Практическая значимость

Новая термостабильная щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4К может быть использована в генной инженерии для дефосфорилирования 5'-концов нуклеиновых кислот, в молекулярной биологии и диагностике в качестве компонента нерадиоактивных систем детекции, в методе ELISA, а также в качестве репортерного гена. Кроме того, фермент может быть использован в качестве модели при изучении термостабильных белков.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Юрченко, Юлия Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген щелочной фосфатазы термофильной бактерии Meiothermus ruber 132-4К и определена его полная нуклеотидная последовательность. Открытая рамка считывания состоит из 1509 п.н. ATG-кодону предшествует сайт связывания рибосомы, последовательность которого близка к канонической. За терминирующим кодоном UAA следует высокостабильная шпилька, которая может служить терминатором транскрипции.

2. Проведен анализ предсказанной аминокислотной последовательности щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К. Полная аминокислотная последовательность белка состоит из 503 аминокислотных остатков, его рассчитанный молекулярный вес составляет 54229 Да. Первые 26 аминокислотных остатков формируют гипотетический сигнальный пептид, таким образом предсказанный зрелый белок состоит из 477 аминокислотных остатков с рассчитанным молекулярным весом 51693 Да.

3. Выявлен высокий консерватизм аминокислотных остатков, важных для катализа и вовлеченных в формирование активного центра фермента. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К по отношению к аминокислотным последовательностям щелочных фосфатаз родственных бактерий Thermus sp. и Т. caldophilus: число идентичных аминокислотных остатков составляет 64%, число консервативных замен составляет около 75%.

4. Разработан и проанализирован ряд экспрессионных конструкций, отобрана конструкция, позволяющая осуществлять биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К в клетках Escherichia coli.

5. Разработана процедура очистки, и получен электрофоретически чистый препарат рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К с удельной активностью около 24 Ед/мг.

6. Охарактеризованы биохимические свойства очищенного рекомбинантного белка. Щелочная фосфатаза из М. ruber 132-4К является металлоферментом, и ее активность зависит от наличия ионов металла (предпочтительно, магния) в реакционной среде. Оптимальные для активности фермента значение рН и температура составляют, соответственно, 11,0-11,5 и 60°С. Исследована температурная стабильность фермента. Определены величина Кт по отношению к 4НФФ (0,039 мМ) и субстратная специфичность фермента. Проведен ингибиторный анализ активности рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К: сильный ингибирующий эффект оказывают SDS, ванадат натрия и хелатор металлов ЭДТА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы столкнулись с проблемой получения высокого уровня биосинтеза активной растворимой рекомбинантной щелочной фосфатазы в гетерологичной экспрессионной системе. Предпринятые нами многочисленные попытки, которые, в частности, включали изменение условий культивирования, использование альтернативного штамма-хозяина, разнообразных конструкций, коэкспрессию совместно с шаперонами GroESL, не привели к увеличению выхода активного растворимого белка. В то же время при использовании некоторых разработанных нами конструкций уровень биосинтеза белка щелочной фосфатазы в виде телец включения был очень высок и мог достигать около 50% от общего клеточного белка.

По нашему мнению, эта проблема может носить достаточно универсальный характер, в частности при решении биотехнологических задач, связанных с экспрессией гетерологичных генов. Мы полагаем, что в случае щелочной фосфатазы М. ruber данная проблема имеет два аспекта. Первый аспект связан с наработкой в гетерологичной клетке-хозяине потенциально токсичных или летальных продуктов. Второй аспект связан со сворачиванием (фолдингом) белка в не свойственном ему окружении в условиях, весьма далеких от нативных, и влиянием на этот процесс дополнительных факторов, таких, например, как ионы металлов.

Очевидно, что для любой клетки наличие фермента, способного катализировать реакцию отщепления неорганического фосфата от широкого круга жизненно важных для клетки соединений, таких как moho-, олиго- и полинуклеотиды, макроэргические соединения типа АТФ, фосфосахара и т.д., может представлять не просто серьезную опасность, но попросту быть летальным. В связи с этим в ходе эволюции у организмов, обладающих щелочной фосфатазой, должен был выработаться механизм самозащиты. Например, у Е. coli экспрессия гена щелочной фосфатазы строго контролируется: pho-регулон, в состав которого входит около 30 генов, обеспечивает репрессию синтеза щелочной фосфатазы, когда в среде имеется достаточное количество неорганического фосфата (см. раздел Обзор литературы, п. 1.1.5). Клетки Е. coli вряд ли регулярно испытывают фосфатное голодание, однако когда такое случается, происходит индукция биосинтеза щелочной фосфатазы, причем уровень экспрессии может быть очень высоким: щелочная фосфатаза может составлять до 5-10% от общего клеточного белка (Reid and Wilson, 1971). Очевидно, что еще одной мерой самозащиты может являться синтез белка в виде профермента с последующей его секрецией в периплазматическое пространство. Однако вопрос о том, является ли щелочная фосфатаза активной внутри клеточной цитоплазмы в виде белка-предшественника или ее активность приурочена исключительно к периплазматическому пространству, по-видимому, нельзя считать окончательно решенным: имеются сведения о том, что каталитические свойства предшественника щелочной фосфатазы мало чем отличаются от свойств зрелого белка (Крупянко и соавт., 1981).

Хотя во многих случаях локализация щелочной фосфатазы в клетке не является точно выясненной, наличие у большинства щелочных фосфатаз гипотетических сигнальных последовательностей указывает на то, что щелочная фосфатаза синтезируется в виде белка-предшественника и затем подвергается секреции. Сигнальные последовательности щелочных фосфатаз из различных источников демонстрируют высокую степень дивергенции (DuBose and Yartl, 1990; см. также рис. 12 в разделе Результаты и обсуждение). Тем не менее, во всех случаях, в том числе и в случае щелочной фосфатазы из М. ruber, сохраняется единый принцип структурной организации сигнального пептида: центральная гидрофобная область фланкирована заряженным N-концом и полярным С-концом. Ранее было показано, что центральная область сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е. coli может быть удлинена или замещена другой при условии, что заменяющие остатки являются высоко гидрофобными (Kendall et al., 1986). Также была продемонстрирована высокая толерантность последовательности зрелого белка в отношении инсерций и делеций на ее N-конце: слитые белки, содержавшие делецию первых тринадцати N-концевых остатков последовательности зрелой щелочной фосфатазы или инсерцию 150 аминокислотных остатков, функционировали сходным с щелочной фосфатазой дикого типа образом (Hoffman and Wright, 1985). С учетом изложенного выше, создавая экспрессионную конструкцию, содержавшую полноразмерный ген щелочной фосфатазы М. ruber, мы надеялись, что ее собственная сигнальная последовательность сможет функционировать в клетках Е. coli, эффективно направляя секрецию белка в периплазму. Наша надежда, однако, не оправдалась. Важно отметить, что попытка заменить собственную сигнальную последовательность на специфичную для клеток штамма-хозяина Е. coli лидерную последовательность pelB также не увенчалась успехом.

В связи с этим мы полагаем, что ведущая роль в том, что синтезированная в клетках Е. coli рекомбинантная щелочная фосфатаза М. ruber образовывала тельца включения вместо того, чтобы оставаться в растворимом виде или секретироваться в периплазму, принадлежит процессу фолдинга и возможному влиянию на него дополнительных факторов. По-видимому, процесс фолдинга щелочной фосфатазы М. ruber имеет высокий энергетический барьер, преодолеть который при нормальной температуре роста данного микроорганизма, составляющей 56°С, оказывается существенно легче, чем при температуре культивирования Е. coli. Дополнительные факторы также могут влиять на процесс фолдинга. В частности, известно, что ионы металлов способствуют правильному фолдингу металлоферментов (Proudfoot et al., 1996). В случае щелочной фосфатазы М. ruber, также являющейся металлоферментом, добавление экзогенных магния и цинка в культуральную среду не привело к желаемому результату. Таким образом, возможно, что именно термодинамическому фактору принадлежит решающая роль в том, что синтезируемая щелочная фосфатаза агрегирует в тельца включения. В данном контексте весьма симптоматично, что, несмотря на то, что имеется несколько публикаций, посвященных клонированию генов щелочной фосфатазы из представителей рода Thermus (Yuan et al., 1998; Park et al., 1999), родственных M. ruber, получение рекомбинантного фермента путем экспрессии в гетерологичной системе до настоящего времени, насколько нам известно, в литературе описано не было.

Известно, что ген щелочной фосфатазы присутствует в геномах эволюционно далеко отстоящих друг от друга организмов. Сравнение последовательностей щелочной фосфатазы из организмов, принадлежащих к различным таксонам, показывает, что в ходе эволюции фермент претерпел множество изменений (Murphy et al., 1995). Например, первичная последовательность щелочной фосфатазы из плаценты человека проявляет лишь около 10% сходства с последовательностью фермента из Е. coli (Le Du et al.,

2001). В то же время организация активного центра и лиганды, принимающие участие в координации ионов металлов, являются высоко консервативными, так что архитектура фермента в целом сохраняется.

В связи с тем, что в данной работе нам удалось впервые определить нуклеотидную последовательность гена щелочной фосфатазы из представителя термофильных бактерий рода Meiothermus и соответствующую ей аминокислотную последовательность, нам представлялось целесообразным сопоставить филогенетическое положение этого белка по отношению к щелочным фосфатазам из ряда других организмов (бактерий, архебактерий, грибов, млекопитающих).

Как видно из представленного на рис. 18 филогенетического древа, в связи с удаленным эволюционным положением организмов, выбранных для анализа, в единый кластер надежно объединяются только щелочные фосфатазы из видов одного рода, как например Е. coli и Е. fergusonii, а также Т. caldophilus, Т. thermophilics и Т. sp. Любопытно, что плацентарная щелочная фосфатаза человека оказывается филогенетически ближе к щелочной фосфатазе из кишечника теленка, чем к неспецифической тканевой щелочной фосфатазе человека.

Щелочная фосфатаза М. ruber образует единую группу со щелочными фосфатазами 3 видов рода Thermus. Примечательно, что щелочная фосфатаза вида Deinococcus radiodurans, которого согласно современной систематике вместе с родом Thermus относят к единому классу Deinococci (Wheeler et al., 2000), оказывается филогенетически далеко отстоящей от щелочных фосфатаз рода Thermus и Meiothermus. Щелочная фосфатаза D. radiodurans оказывается филогенетически более тесно связанной со щелочной фосфатазой млекопитающих, чем с бактериальными щелочными фосфатазами.

Известно, что микроорганизмы, относящиеся к наиболее рано дивергировавшим линиям эволюции, такие как Т. maritima и D. radiodurans, также содержат связанные родством гомологи гена щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать о том, что этот ген возник на самых ранних этапах эволюции бактерий. При этом, не будучи жизненно необходимым, ген встречается практически среди всех таксонов живых организмов, от бактерий до человека. Возможно, такая персистентность гена может быть обусловлена эволюционными преимуществами, которые обеспечивало его наличие.

Saccharomyces cerevisiae

Deinococcus radiodurans Human non-specific Calf intestine

999 Human placental

642

100C

756

354 Escherichia coli 1000 Escherichia fergusonii

Meiothermus ruber

1000

Thermus species 1000

Thermus thermophilus

944

Thermus caldophilus

-Bacillus subtilis

703

-Pyrococcus abyssi

749

- Thermotoga maritima o.i

Рис. 18. Филогенетическое древо щелочных фосфатаз из 14 видов прокариотических и эукариотических организмов. Филогенетический анализ проводили при помощи программы ClustalW, свободно доступной на сайте http://spiral.genes.nig.ac.ip/homology/clustalw.shtml. в основе которой лежит алгоритм объединения соседей (Neighbor Joining) (Saitou and Nei, 1987). При проведении анализа использовали параметры, установленные по умолчанию: использована коррекция по методу Кимуры, позиции с пропусками игнорируются, количество бутстрэп-выборок равно 1000. Для построения филогенетического древа использовали программу TreeView (Page, 1996). Шкала в левом нижнем углу соответствует 0,1 аминокислотной замене на сайт. Устойчивость построенного древа определяли методом бутстрэпинга. Цифры у точки дихотомического ветвления показывают, сколько раз виды объединялись вместе в выборке из 1 ООО бутстрэп-древ.

Щелочные фосфатазы вместе с фосфоглицератмутазами (не зависимыми от кофактора 2, 3-дифосфоглицерата), фосфопентозомутазами и сульфатазами входят в суперсемейство щелочной фосфатазы, объединяющее металлоферменты, у которых ключевая роль в катализе принадлежит фосфосериновому интремедиату (Galperin et al., 1998). Также важно отметить отдаленную эволюционную взаимосвязь щелочных фосфатаз с фосфодиэстеразами и нуклеотидпирофосфатазами. В литературе имеются сообщения о том, что щелочная фосфатаза Е. coli обладает фосфодиэстеразной и сульфатазной активностями (O'Brien and Herschlag, 2001), что служит дополнительным указанием на существование функциональной взаимосвязи между фосфатазами, фосфодиэстеразами и сульфатазами. Каталитическая «неразборчивость» щелочной фосфатазы могла обеспечивать селективное преимущество и тем самым способствовать дивергентной эволюции через дупликацию гена.

Таким образом, семейство щелочной фосфатазы, объединяющее в себе ферменты-гомологи из организмов, относящихся практически ко всем царствам живого (за исключением вирусов), обеспечивает уникальные возможности для исследования механизмов катализа и стабилизации вторичной, третичной и четвертичной структур белка в различных условиях (в частности, в диапазоне температур от 0 до 100°С), для установления взаимосвязи между структурной организацией фермента и его функциональными характеристиками, а также для исследования закономерностей молекулярной эволюции генов и кодируемых ими белков, что может иметь важное значение для реконструкции филогенеза и понимания молекулярных механизмов изменчивости и популяционнного разнообразия. В связи с этим дальнейшее изучение новых представителей этого семейства продолжает оставаться актуальной задачей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юрченко, Юлия Валерьевна, 2005 год

1. Иммуноферментный анализ. / Под ред. Нго Т.Г., Ленхоффа Г. М.: Мир, 1988.

2. Вилкинсон Д. // Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981. С. 154-169, 355-384,387-393, 464-478, 540-542.

3. Глик Б., Пастернак Д. // Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002. С. 179-203.

4. Дзантиев Б.В., Гаврилова Е.М., Егоров A.M. // Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизированные ферменты. / Под ред. Березина И.В., Мартинека K.M.: Изд-во МГУ, 1982, С. 343-352.

5. Егорова Л.А., Логинова Л.Г. (1984). Отбор культуры, образующей щелочную фосфатазу у термофильных бактерий рода Thermus. Микробиология. Т. 53, вып. 2, 242-245.

6. Зуева H.H., Далев П.Г., Лазарова Д.Л. (1993). Свойства, получение и практическое применение щелочной фосфатазы. Биохимия. Т.58, вып. 7, 1009-1023.

7. Квеситадзе Г.И. // Ферменты микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях. М.: Наука, 1990. С. 11-16,20-27.

8. Крупянко В.И., Колот М.Н., Несмеянова М.А. (1981). Сравнительное изучение свойств периплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы Е. coli. Биохимия. Т.46, вып. 7, 1249-1257.

9. Логинова Л.Г. // Биология термофильных микроорганизмов. М.: Наука, 1986. С. 5-22.

10. Логинова Л.Г., Егорова Л.А. (1975). Облигатно-термофильные бактерии Thermus ruber в гидротермах Камчатки. Микробиология. Т. 44, вып. 4, 661665.

11. И. Логинова Л.Г, Храпцова Г.И., Богданова Т.Н., Егорова Л.А., Серегина Л.М. (1978). Термофильные бактерии Thermus ruber, продуцирующие ярко-оранжевый пигмент. Микробиология. Т.47, вып. 3, 561-562.

12. Мецлер Д. // Биохимия. М.: Мир, 1981. Т. 2. С. 118-119.

13. Спиро Т.Г. // Неорганическая биохимия. Т. 1. / Под ред. Эпхгорна Г.М.: Мир, 1978. С. 633-644, 656.

14. Хьюз М. // Неорганическая химия биологических процессов. М.: Мир, 1983. С. 28, 74-79.

15. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Марданова A.M., Нехотяева Н.В., Дементьев A.A., Вершинина O.A., Гарусов A.B., Лещинская И.Б. (1998). Получение и характеристика секретируемой щелочной фосфатазы Bacillus intermedius. Биохимия. Т. 63, вып. 10,1385-1390.

16. Adams M.W., Kelly R.M. (1994). Thermostability and thermoactivity of enzymes from hyperthermophilic Archaea. Bioorg. Med. Chem. 2,659-667.

17. Amemura, M., Shinagawa, H., Makino, K., Otsuji, N. & Nakata, A. (1982). Cloning of and complementation tests with alkaline phosphatase regulatory genes (phoS and phoT) of Escherichia coli. J. Bacteriol. 152,692-701.

18. Argos P., Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. (1979). Thermal stability and protein structure. Biochemistry. 18, 5698-5703.

19. Bauer K., Struyve M., Bosch D., Benz R., Tommassen J. (1989). One single lysine residue is responsible for the special interaction between polyphosphate and the outer membrane porin PhoE of E. coli. J. Biol. Chem. 264, 1639316398.

20. Becker G., Hengge-Aronis R. (2001). What makes an Escherichia coli promoter os dependent? Role of the —13/—14 nucleotide promoter positions and region 2.5 of os. Mol. Microbiol. 39, 1153-1165.

21. Baykov A.A., Evtushenko O.A., Avaeva S.M. (1988). A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal. Biochem. 171, 266-270.

22. Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Boichem. 72,248-254.

23. Bradshaw R.A., Cancedda F., Ericsson L.H., Neumann P.A., Piccoli S.P., Schlesinger M.J., Shriefer K., Walsh K.A. (1981). Amino acid sequence of

24. Escherichia coli alkaline phosphatase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 78, 34733477.

25. Braig K., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L., Sigler P.B. (1994). The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature. 371, 578-586.

26. Burley S.K., Petsko G.A. (1985). Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization. Science. 229,23-28.

27. Chang A.C.Y., Cohen S.N. (1978). Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134, 1141-1156.

28. Chang C.N., Kuang W.-J., Chen E.Y. (1986). Nucleotide sequence of the alkaline phosphatase gene of Escherichia coli. Gene. 44, 121-125.

29. Chen H., Leder P. (1999). A new signal sequence trap using alkaline phosphatase as a reporter. Nucleic Acids Res. 27,1219-1222.

30. Cole P.A. (1996). Chaperone-assisted protein expression. Structure. 4,239-242.

31. Coleman J.E. (1992). Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21,441-483.

32. Cowan D.A., Daniel R.M. (1982). Purification and some properties of an extracellular protease (caldolysin) from an extreme thermophile. Biochim. Biophys. Acta. 705, 293-305.

33. Cupo P., El-Deiry W., Whitney P.L., Awad W.M. (1980). Stabilization of proteins by guanidination. J. Biol. Chem. 255, 10828-10833.

34. Dong G., Zeikus J.G. (1997). Purification and characterization of alkaline phosphatase from Thermotoga neapolitana. Enzyme Microb. Technol. 21, 335— 340.

35. DuBose R.F., Yartl D.L. (1990). The molecular evolution of bacterial alkaline phosphatase: correlating variation among enteric bacteria to experimental manipulations of the protein. Mol. Biol. Evol. 7(6), 547-577.

36. Ehle H., Bublitz R., Horn A. (1985a). Intralumenal alkaline phosphatase of the calf intestine. Biomed. Biochim. Acta. 44,223-233.

37. Ehle H., Muller E., Horn A. (1985b). Alkaline phosphatase of the calf intestine hydrolyzes phospholipids. FEBS Letters. 183,413-416.

38. Facchiano A.M., Colonna G., Ragone R. (1998). Helix stabilizing factors and stabilization of thermophilic proteins: an X-ray based study. Protein Eng. 11, 753-760.

39. Ferreira A.M., Wait R., Nobre M.F., Costa M.S. (1999). Characterization of glycolipids from Meiothermus spp. Microbiology. 145, 1191-1199.

40. Fischer F., Zillig W., Stetter K.O., Schreiber G. (1983). Chemolithoautotrophic metabolism of anaerobic extremely thermophilic archaebacteria. Nature. 10, 511-513.

41. Galperin M.Y., Bairoch A., Koonin E.V. (1998). A superfamily of metalloenzymes unifies phosphopentomutase and cofactor-independent phosphoglycerate mutase with alkaline phosphatases and sulfatases. Protein Sci. 7,1829-1835.

42. Gettins P., Coleman J.E. (1983). 31P nuclear magnetic resonance of phosphoenzyme intermediates of alkaline phosphatase. J. Biol. Chem. 258, 408416.

43. Gettins P., Coleman J.E. (1984). Zn(II)-u3Cd(II) and Zn(II)-Mg(II) hybrids of alkaline phosphatase. 3IP and 113Cd NMR. J. Biol. Chem. 259,4991-4997.

44. Gettins P., Metzler M., Coleman J.E. (1985). Alkaline phosphatase. 31P NMR probes of the mechanism. J. Biol. Chem. 260,2875-2883.

45. Haney P.J., Stees M., Konisky J. (1999). Analysis of thermal stabilizing interactions in mesophilic and thermophilic adenylate kinases from the genus Methanococcus. J. Biol. Chem. 274,28453-28458.

46. Hendrix R.W. (1979). Purification and properties of GroE, a host protein involved in bacteriophage assembly. J. Mol. Biol. 129,375-392.

47. Hoffer S.M., Tommassen J. (2001). The phosphate-binding protein of Escherichia coli is not essential for Pj-regulated expression of the pho regulon. J. Bacteriol. 183,5768-5771.

48. Hoffman S.C., Wright A. (1985). Fusions of secreted proteins to alkaline phosphatase: an approach for studying protein secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 5107-5 111.

49. Holmes M.A., Matthews B.W. (1982). Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution. J. Mol Biol 160, 623-639.

50. Holtz K.M., Kantrowitz E.R. (1999). The mechanism of the alkaline phosphatase reaction: insights from NMR, crystallography and site specific mutagenesis. FEBS Lett. 462, 7-11.

51. Hulett F.M., Kim E.C., Bookstein C., Kapp N.V., Edwards C.W., Wyckoff H.W. (1991). Bacillus subtilis alkaline phosphatases III and IV. J. Biol Chem. 266, 1077-1084.

52. Hull W.E., Halford S.E., Gutfreund H., Sykes B.D. (1976). 31P nuclear magnetic resonance study of alkaline phosphatase: The role of inorganic phosphate in limiting the enzyme turnover rate at alkaline pH. Biochemistry, 15,1547-1561.

53. Ikai A. (1980). Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J. Biochem. (Tokyo). 88,1895-1898.

54. Imanaka T., Atomi H. (2002). Catalyzing "hot" reactions: enzymes from hyperthermophilic Archaea. Chem Rec. 2,149-163.

55. Jablonski E., Moomaw E.W., Tullis R.H., Ruth J.L. (1986). Preparation of oligodeoxynucleotide-alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probes. Nucleic Acids Res. 14, 6115-6128.

56. Jaenicke R. (1981). Enzymes under extremes of physical conditions. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 10, 1-67.

57. Janeway C.M.L., Xu X., Murphy J.E., Chaidaroglou A., Kantrowitz E.R. (1993). Magnesium in the active site of Escherichia coli alkaline phosphatase isimportant for both structural stabilization and catalysis. Biochemistry. 32, 16011609.

58. Ji C.N., Jiang T., Chen M.Q., Sheng X.Y., Mao Y.M. (2001). Purification, crystallization and preliminary X-ray studies of thermostable alkaline phosphatase from Thermus sp. 3041. Acta Cryst. D57, 614-615.

59. Karshikoff A., Ladenstein R. (1998). Proteins from thermophilic and mesophilic organisms essentially do not differ in packing. Protein Eng. 11, 867-872.

60. Kendall D.A., Bock S.C., Kaiser E.T. (1986). Idealization of the hydrophobic segment of the alkaline phosphatase signal peptide. Nature. 321, 706-709

61. Khatkhatay M.I., Desai M. (1999). A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J. Immunoassay. 20,151-183.

62. Kim Y.J., Park T.S., Kim H.K., Kwon S.T. (1997). Purification and characterization of a thermostable alkaline phosphatase produced by Thermus caldophilus GK24. J. Biochem. Mol. Biol. 30, 262-268.

63. Kim E.E., Wyckoff H.W. (1989). Structure of alkaline phosphatases. Clinic. Chim. Acta. 186,175-187.

64. Kim E.E., Wyckoff H.W. (1991). Reaction mechanism of alkaline phosphatase based on crystal structures. J. Mol Biol 218,449-464.

65. Klevan L., Gebeyehu G. (1990). Biotinylated nucleotides for labeling and detecting DNA. Methods Enzymol. 184, 561-577.

66. Kojoh K., Matsuzawa H., Wakagi T. (1999). Zinc and N-terminal extra stretch of the ferredoxin from a thermoacidophilic archaeon stabilize the molecule at high temperature. Eur. J. Biochem. 264, 85-91.

67. Kreil G. (1981). Transfer of proteins across membranes. Annu. Rev. Biochem. 50,317-348.

68. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

69. Lazdunski M., Petitclerc C., Chappelet D., Lazdunski C. (1971). Flipflop mechanisms in enzymology. A model: the alkaline phosphatase of E. coli. Europ. J. Biochem., 20, 124-139.

70. Le Du M.H., Stigbrand T., Taussing M.J., Menez A., Stura E.A. (2001). Crystal structure of alkaline phosphatase from human placenta at 1.8Ä resolution. J. Biol. Chem. 276, 9158-9165.

71. Machida S.Yu.Y., Singh S.P., Kim J.-D., Hayashi K., Kawata Y. (1998). Overproduction of ß-glucosidase in active form by an Escherichia coli system coexpressing the chaperonin GroEL/ES. FEMS Microbiol. Lett. 159,41-46.

72. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kimura S., Nakata A., Ishihama A.1988). Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli. Activation of pstS transcription by PhoB protein in vitro. J. Mol. Biol. 203, 85-95.

73. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kawamoto T., Yamada M., Nakata A.1989). Signal transduction in the phosphate regulon of Escherichia coli involves phosphotransfer between PhoR and PhoB proteins. J. Mol. Biol. 210, 551-559.

74. Makino K., Amemura M., Kim S., Nakata A., Shinagawa H. (1993). Role of the a70 subunit of RNA polymerase in transcriptional activation by activator protein PhoB in Escherichia coli. Genes Dev. 7, 149-160.

75. Marmur J. (1961). A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218.

76. Martinez M.B., Schendel F.J., Flickinger M.C., Nelsestuen G.L. (1992). Kinetic properties of enzyme populations in vivo: alkaline phosphatase of the Escherichia coli periplasm. Biochemistry. 31, 11500-11509.

77. Matsumura M., Signor G, Matthews B.W. (1989). Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds. Nature. 342,291-293.

78. Mori S., Okamoto M., Nishibori M., Ichimura M., Sakiyama J., Endo H. (1999). Purification and characterization of alkaline phosphatase from Bacillus stearothermophilus. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, 235-239.

79. Moss D.W. (1992). Perspectives in alkaline phosphatase research. Clin. Chem. 38/12,2486-2492.

80. Murphy J.E., Kantrowitz E.R. (1994). Why are mammalian alkaline phosphatases much more active than bacterial alkaline phosphatases? Mol. Microbiol. 12,351-357.

81. Murphy J.E., Xu X., Kantrowitz E.R. (1993). Conversion of a magnesium binding site into a zinc binding site by a single amino acid substitution in Escherichia coli alkaline phosphatase. J. Biol. Chem. 268,21497-21500.

82. Murphy J.E., Tibbitts T.T., Kantrowitz E.R. (1995). Mutations at positions 153 and 328 in Escherichia coli alkaline phosphatase provide insight towards the structure and function of mammalian and yeast alkaline phosphatases. J. Mol. Biol. 253,604-617.

83. Nickerson D.A., Kaiser R., Lappin S., Stewart J., Hood L., Landegren U. (1990). Automated DNA diagnostic using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87, 8923-8927.

84. O'Brien P.J., Herschlag D. (2001). Functional interrelationships in the alkaline phosphatase superfamily: phosphodiesterase activity of Escherichia coli alkaline phosphatase. Biochemistry. 40 (19), 5691-5699.

85. Oshima T. In Enzyme engineering, Broun G.B. et al. (eds.), N. Y.: L.: Plenum Press. 1978. Vol. 4,41-46.

86. Oshima T. (1982). A pentaamine is present in an extreme thermophile. J. Biol. Chem. 257, 9914-9914.

87. Oswald T., Wende W., Pingoud A., Rinas U. (1994). Comparison of N-terminal affinity fusion domains: effect on expression level and product heterogeneity of recombinant restriction endonuclease EcoRV. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 73-77.

88. Otvos J.D., Alger J.R., Coleman J.E., Armitage I.M. (1979). 31P NMR of alkaline phosphatase. Saturation transfer and metal phosphorus coupling. J. Biol. Chem. 254,1778-1780.

89. Pace C.N. (1992). Contribution of the hydrophobic effect to globular protein stability. J. Mol. Biol. 226,29-35.

90. Page R.D.M. (1996). TREEVIEW: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput. Appl. Biosci. 12, 357-358.

91. Pantazaki A.A., Karagiorgas A.A., Liakopoulou-Kyriakides M., Kyriakidis D.A. (1998). Hyperalkaline and thermostable phosphatase in Thermus thermophilics. Appl. Biochem. Biotechnol. 75, 249-259.

92. Park T., Lee J.H., Kim H.K., Hoe H.S., Kwon S.T. (1999). Nucleotide sequence of the gene for alkaline phosphatase of Thermus caldophilus GK24 and characteristics of the deduced primary structure of the enzyme. FEMS Microbiol. Letters. 180,133-139.

93. Proudfoot A.E.I., Goffin L., Payton M.A., Wells T.N.C., Bernard A.R. (1996). In vivo and in vitro folding of a recombinant metalloenzyme, phosphomannose isomerase. Biochem. J. 318, 437—442.

94. Rao N.N., Wang E., Yashphe J., Torriani A. (1986). Nucleotide pool in pho regulon mutants and alkaline phosphatase synthesis in Escherichia coli. J. Bacterial. 166, 205-211.

95. Reid T.W., Wilson I.B. Escherichia coli alkaline phosphatase. In The Enzymes, P.D. Boyer (ed.), 3rd ed., Academic Press, New York. 1971. Vol. 4,373-415.

96. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

97. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Elich H.A. (1989). Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86,6230-6234.

98. Saitou N., Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4 (4), 406-425.

99. Schein C.H., Notebora M.H.M. (1988). Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Bio/Technology. 6,291-294.

100. Scholten M., Janssen R., Bogaarts C., van Strien J., Tommassen J. (1995). The pho regulon of Shigella flexneri. Mol. Microbiol. 15, 247-254.

101. Shine J., Dalgarno L. (1975). Determination of cistron specificity in bacterial ribosomes. Nature. 254,34-38.

102. Stec B., Holtz K.M., Kantrowitz E.R. (2000). A revised mechanism for the alkaline phosphatase reaction involving three metal ions. J. Mol. Biol. 299, 1303-1311.

103. Steed P.M., Wanner B.L. (1993). Use of the rep technique for allele replacement to construct mutants with deletions of the pstSCAB-phoU operon: evidence of a new role for the PhoU protein in the phosphate regulon. J. Bacteriol. 175, 67976809.

104. Tanner J.J., Hecht R.M., Krause K.L. (1996). Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 2.5 A resolution. Biochemistry. 35,2597-2609.

105. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. (1997). Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. Appl. Biochem. Biotechnol. 66, 197-238.

106. Tommassen J., de Geus P., Lugtenberg B., Hackett J., Reeves P. (1982). Regulation of the pho regulon of Escherichia coli K-12. Cloning of the regulatory genes phoB and phoR and identification of their gene products. J. Mol. Biol. 157,265-274.

107. Torriani A. (1990). From cell membrane to nucleotides: the phosphate regulon in Escherichia coli. Bioessays. 12, 371-376.

108. Vieille C., Zeikus G.J. (2001). Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev. 65, 1—43.

109. Walker J.E., Wonacott A.J., Harris J.I. (1980). Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 108, 581-586.

110. Wang C., Eufemi M., Turano C., Giartosio A. (1996). Influence of the carbohydrate moiety on the stability of glycoproteins. Biochemistry. 35, 72297307.

111. Wanner B.L., Latterell P. (1980). Mutants affecting alkaline phosphatase expression: evidence for multiple positive effectors for the phosphate regulon in E. coli. Genetics. 96, 353-366.

112. Wheeler D.L., Chappey C., Lash A.E., Leipe D.D., Madden T.L., Schuler G.D., Tatusova T.A., Rapp B.A. (2000). Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 28 (1), 10-14.

113. Willsky G.R., Bennett R.L., Malamy M.H. (1973). Inorganic phosphate transport in Escherichia coli: involvement of two genes which play a role in alkaline phosphatase regulation. J. Bacteriol. 113, 529-539.

114. Willsky G.R, Malamy M.H. (1976). Control of the synthesis of alkaline phosphatase and the phosphate-binding protein in Escherichia coli. J. Bacteriol. 127, 595-609.

115. Xu X., Kantrowitz E.R. (1991). A water-mediated salt link in the catalytic site of Escherichia coli alkaline phosphatase may influence activity. Biochemistry. 30,7789-7796.

116. Yang T.T., Sinai P., Kitts P.A., Kain S.R. (1997). Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechniques. 23,1110-1114.

117. Yazynin S., Lange H., Mokros T., Deyev S., Lemke H. (1999). A new phagemid vector for positive selection of recombinants based on conditionally lethal barnase gene. FEBS Lett. 452, 351-354.

118. Yeh M.F., Trela J.M. (1976). Purification and characterization of a repressible alkaline phosphatase from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 251,3134-3139.

119. Yuan Y.Z., Sheng X.Y., Lu H.Y., Tong S., Mao Y.M. (1998). Thermostable alkaline phosphatase from Thermus sp. FD3041: cloning of the gene and expression in E. coli. Yi Chuan Xue Bao. 25,375-380. (in Japanese).

120. Zappa S., Rolland J.L., Flament D., Gueguen Y., Boudrant J., Dietrich J. (2001). Characterization of a highly thermostable alkaline phosphatase from the euryarchaeon Pyrococcus abyssi. Appl. Environ. Microbiol. 67,4504-4511.

121. Zeikus J.G., Wolfe R.S. (1972). Methanobacterium thermoautotrophicus sp. nov., an anaerobic, autotrophic, extreme thermophile. J. Bacteriol. 109, 707715.