Клонирование генов синтеза пролина proB и proA термофильной бактерии Thermus ruber, их характеристика и анализ кодируемых ими белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Яклинчкин, Сергей Юрьевич

• Яклинчкин, Сергей Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яклинчкин, Сергей Юрьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕРМОФИЛОВ

1.1. Понятие термофила и общая характеристика

1.2. Молекулярные особенности термофилов

1.2.1. Структура плазматической мембраны

1.2.2. Структура ДНК генов термофилов

1.2.3. Особенности белков термофилов

1.2.4. Небелковые стабилизирующие факторы

ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА THERMUS

3.1. Экология бактерий рода Thermus

3.2. Идентификация бактерий рода Thermus

3.3 Морфология и клеточный состав бактерий рода Thermus

3.4. Физиология и метаболизм бактерий рода Thermus

3.5. Биотехнологическое применение термофильных микроорганизмов и бактерий рода Thermus

-33. 6. Использование различных генов в качестве маркеров для генной инженерии

растений и бактерий

ГЛАВА 4. БИОСИНТЕЗ ПРОЛИНА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИ

4.1. Биосинтез пролина и его регуляция в клетках бактерий

4.2. Картирование генов биосинтеза пролинаргоВ, ргоА иргоС эубактерий и их регуляция экспрессии

4.3. Использование генов биосинтеза пролина в промышленной и научной практике

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СИНТЕЗА ПРОЛИНА PROB И PROA ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ THERMUS RUBER, ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА И АНАЛИЗ КОДИРУЕМЫХ ИМИ БЕЛКОВ

6.1. Клонирование генов биосинтеза пролина proBA Thermus ruber

6.2. Определение и анализ нуклеотидной последовательности плазмиды рТР1

-46.3. Характеристика генаproB и его продукта

6.4. Характеристика генаргоАтл его продукта

6.5. Анализ аминокислотного состава ГК и ГФР

6.6. Вторичная структура белков РгоВ и РгоА

6.7. Синтез белков РгоВ и РгоА в системе транскрипции-трансляции in vitro

6.8. Определение активности ГФР и ГК

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

81

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование генов синтеза пролина proB и proA термофильной бактерии Thermus ruber, их характеристика и анализ кодируемых ими белков»

ВВЕДЕНИЕ

Термофильные бактерии адаптировались к существованию в среде с высокой температурой. Температура среды их обитания составляет 50-100° С. Большинство известных термофильных бактерий имеют морское происхождение, некоторые обнаруживаются в континентальных гейзерах и горячих источниках. Белки и ферменты термофильных микроорганизмов функционируют в этих условиях оптимально и с большой эффективностью.

Термофильные микроорганизмы представляют большой интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и прикладных исследований. Фундаментальные исследования термофилов привели к открытию целого ряда новых закономерностей в формировании структуры биомолекул, позволяющей им существовать в условиях экстремальных температур. В связи с этим в молекулярно-биологических исследованиях некоторые белки термофилов выбраны в качестве модельных из-за их высокой стабильностью и удобством работы.

С позиций биотехнологии термофилы вызывают интерес в связи с тем, что они являются источниками уникальных ферментов, обладающих чрезвычайно высокой термостабильностью. Это свойство данных ферментов позволяет решать ряд биотехнологических задач, где использование ферментов мезофильных организмов весьма затруднено или практически невозможно. Так представляется перспективным их использовать для высокотемпературных ферментаций, а также для переработки промышленных отходов, минералообразования, получения суперпродуцентов целого ряда ценных биологических продуктов (аминокислот, жирных кислот, белков и т.д.).

Широкое распространение получили ферменты термофилов в исследовательской практике и медицинской диагностике ( ДНК-полимеразы, ДНК- лигазы, некоторые рестриктазы ). На основе необычных свойств этих ферментов разработаны новые методы исследований (полимеразная цепная реакция).

Сравнительно недавно ферменты термофилов стали использовать в качестве маркеров в исследовательской работе по генной инженерии микроорганизмов и растений. Простота тестирования ферментов термофилов в мезофильном организме позволяет надеяться, что белки термофилов будут широко использоваться в мониторинге трансгенных микроогранизмов и растений при переносе их в окружающую среду. Так, простой прогрев экстракта клеток мезофила позволяет

инактивировать практически все ферменты, не затрагивая активность и стабильность фермента термофила. Для решения этой и целого ряда других задач было проведено данное исследование.

За последнее десятилетие клонированы более сотни генов термофилов и охарактеризовано множество кодируемых ими ферментов. В настоящее время завершено секвенирование генома гипертермофильной бактерии Aquifex aeolicus и ряда термофильных архебактерий. Продолжается определение нуклеотидной последовательности генома гипертермофила Termatoga martima.

В данной работе мы клонировали и секвенировали оперон ргоВА биосинтеза пролина термофильной бактерии Thermus ruber. Пролин является осмопротектором в клетках бактерий и растений. Он повышает устойчивость клетки к различным стрессовым воздействиям окружающей среды. У бактерий в биосинтезе пролина участвуют продукты трех генов: ргоВ, ргоА и ргоС. Продукт гена ргоВ (у-фосфоглутамилкиназа) (ГК); АТФ:-Ь-глутамат-5-фосфотрансфераза, ЕС 2.7.2.11) является ключевым ферментом пути биосинтеза пролина. ГК взаимодействует с пролином и регулирует его биосинтез по принципу обратной связи. ГК действует в комплексе с белком РгоА (у-глутамилфосфатредуктаза; (ГФР) Ь-глутамат-5-полуальдегид: NADPH+ оксидоредуктаза, ЕС 1.2.1.41). Оба гена в хромосоме бактерий организованы в единый оперон.). У растений эти оба гена встречаются в 2х различных формах. У таких растений как томат, (Fujita et al.,1998) обнаружены оба гена ргоВ и ргоА, объединенные в один оперон, но и имеется и другая форма, представляющая собой единый ген, кодирующий бифункциональный фермент Д1-пирролин-5-карбоксилатсинтетазу (П5КС). Этот белок содержит N-концевую часть белка РгоВ и С-концевую часть белка РгоА. Показано, что гены бактерий могут экспрессироваться в растительной клетке У растений Vigna aconitifolia и Arabidopsis thaliana два гены слиты и кодируют П5КС.

В настоящее время гены синтеза пролина привлекают большое внимание генных инженеров, так как их клонирование в растениях и бактериях может дать большой хозяйственный эффект, выражающийся в повышении осмоустойчивости хозяйственно полезных бактерий и растений, улучшения их приспособленности к стрессовым условиям обитания, увеличения урожайности растений.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было выделение генов бисинтеза пролина ргоВА термофильной бактерии Thermus ruber и изучение некоторых свойств ферментов, кодируемых генами данного оперона. Исходя из поставленной цели, быгш определены следующие задачи работы:

1. Клонирование оперона ргоВА биосинтеза пролина Thermus ruber.

2. Определение нуклеотидной последовательности оперона и соответствующей аминокислотной последовательности кодируемых им белков.

3. Анализ особенностей нуклеотидной последовательности генов ргоВА Thermus ruber и первичной структуры продуктов генов.

4. Изучение некоторых физико-химических свойств термостабильных ферментов у-глутамилкиназы и у-глутамилфосфатредуктазы.

Научная значимость и новизна работы.

В настоящей работе впервые был клонирован оперон ргоВА биосинтеза пролина термофильной бактерии Thermus ruber. Определена нуклеотидная последовательность оперона. Проведен анализ нуклеотидной последовательности оперона и аминокислотной последовательности кодируемых генами ргоВА у -глутамилкиназы и у -глутамилфосфатредуктазы (ГК, ГФР). Изучены такие свойства ГК и ГФР как термостабильность, температурный оптимум активности, оптимум рН, а также влияние концентрации различных ионов в среде инкубации на активность фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕРМОФИЛОВ 1.1. Понятие термофила и общая характеристика.

В зависимости от температуры оптимального роста различают три следующих обширных класса организмов: психрофилы, растущие при низких температурах, мезофилы, живущие в температурном диапазоне от 25°-45°С, термофилы, способные расти от 55° С до температуры кипения воды и выше. До сих пор не существует универсального общепринятого определения термина термофил. Одно из определений термофила- организм, способный жить при максимальных температурах, известных для организмов отдельной таксономической группы (Brock, 1986). В соответствии с этим определением термофильными позвоночными будут те, которые живут при температуре около 37° С, термофильные грибы - при 60° С, термофильные цианобактерии- температуре около 70°С.

Способность жить при высоких температурах находится в обратной зависимости от уровня организации организмов. Для многоклеточных растений и животных верхней температурной границей является 50°С. Эукариотические микроорганизмы также ограничены в температурном диапазоне по сравнению с прокариотами.

По Броку (Brock, 1986) температурная граница существования термофильных бактерий, отделяющая их от других организмов могла бы отвечать температуре 5560° С (см. Рис.1). Объясняется это как с экологической, так и эволюционной точки зрения. Температуры ниже 50° С широко распространены в биосфере, и ассоциируются с местами обитания, нагреваемыми солнцем, тогда как температуры выше 55-60° С связаны с геотермальными источниками. Другая причина для определения температурной границы термофильных бактерий в пределах 60й С связана с тем, что данная температура является верхней температурной границей существования эукариотических организмов. Автор указывает на условность данных температурных границ термофильных микроорганизмов, подчеркивая большую значимость температурного континуума, поскольку температурный оптимум роста во многом зависит от условий, в которых организм развивается (Brock, 1986).

Граница термофилии (50-60° С)

св H о о а.

л

н

о

о

su

о

X

U

Термотолерангный организм

Факультативный (умеренный) термофил

Облигатный (экстремальный)

\ термофил

Температура ( С)

Рис. 1. Взаимосвязь между скоростью роста и температурой у различных бактерий.

Изначально по оптимальной температуре роста среди термофилов выделяли три группы (Farrell and Campbell, 1969): облигатные термофилы, имеющие оптимум роста при 65-70° С, но не растущие ниже 40-42° С; факультативные (умеренные) термофилы, растущие оптимально при 50-60° С, а также способные расти при комнатной температуре; термотолерантные бактерии, растущие при 45-50° С и комнатной температуре. Позже были открыты так называемые кальдоактивные или экстремальные термофилы, которые имеют максимум роста выше 70° С, оптимум выше 65° и минимум выше 40° С (Williams, 1975). Наиболее высокотемпературными микроорганизмами является группа гипертермофильных микроорганизмов, живущих в диапазоне температур от 80 до 100° С.

Видовое разнообразие бактерий, живущих при высоких температурах, поразительно велико: sulfur, hydrogen - oxidizing bacteria, облигатные анаэробные и аэробные гетеротрофы. Некоторые бактерии не только являются экстремальными термофилами, но и кислотофилами. На сегодняшний день из термофильных аэробных эубактерий наиболее хорошо изучены виды бактерий родов Bacillus, Thermus, Thermomicrobium (Brock, 1986). Из рода Bacillus лучше всего изучена термофильная бактерия Bacillus stearothermophilus. Этот микроорганизм относится к умеренным термофилам, растет при температуре 50-65° С. В. caldolyticus, В. caldovelox живут при более высоких температурах 75-85° С. В. acidocaldarius, термофил, растет оптимально в диапазоне 60-65° С, предпочтительно в кислом диапазоне pH от 2 до 6, имеет

оптимум рН-3. Из рода Thermus наиболее хорошо изучены Т. thermophilus Т. aquaticus, Т. flavus. Данные бактерии являются грам-отрицательными, имеют палочковидную форму, не образуют споры. Бактерии Т. aquaticus, Т. flavus растут оптимально при 70° С, в то время как Т. thermophilus имеет несколько более высокий оптимум роста 75° С. (Более детальное описание бактерий данного рода можно прочитать в главе 3.).

Исследованные анаэробные термофильные эубактерии представленью бактериями рода Clostridium: С. tartarivorium и С. thermosaccharolyticum - являются умеренными термофилами, растущие оптимально при 55-60°С. С. thermocellum хорошо растет в диапазоне 55-60°С.

Другое царство термофильных микроорганизмов - архебактерии. Изученные рода термофильных архебактерий включают Thermoplasma, Sulfolobus, Methanobacterium, Methanothermus и др. (Brock, 1986).

Проблема происхождения термофильных микроорганизмов остается не решенной по сей день. Были предложены две основные гипотезы (Brock, 1985): 1) первые организмы возникли в высокотемпературной среде, поэтому термофильные организмы являются родоначальниками последующих организмов, которые отделились в процессе эволюции; 2) первоначальные организмы не были термофилами и существовали в умеренных температурных условиях. В последующем термофильные организмы эволюционировали как от психрофильных, так и мезофильных организмов. По мнению Брока (Brock, 1985), если термофилы произошли от мезофилов, то многие генетические изменения должны были бы произойти более или менее мгновенно, что крайне сложно представить. Если же предположить происхождение мезофилов от термофилов, то мутации приводящие к появлению температуро-чувствительного мутанта (не способного расти при высоких температурах) кажутся более реальными. Тем не менее при принятии данной точки зрении, возникает сложность в объяснении множества филогенетических ветвей бактерий. Поэтому, если термофилия имеет один источник, то общий организм-предшественник должен был дать начало всем формам жизни. Решение этой непростой проблемы может быть достигнуто при получении новых данных по термофилам и мезофилам.

-111.2. Молекулярные особенности термофилов

Термофилы эволюционно выработали комплекс приспособительно-механизмов, которые позволяют им жить в экстремальных условиях. Эти механизмы непосредственно связанны с особенностями клеточной и молекулярной организации, некоторые из которых будут рассмотрены в этой главе.

1.2.1. Структура плазматической мембраны.

Плазматическая мембрана является уязвимым клеточным компонентом и поэтому должна обладать высокой стабильностью, поскольку её поверхность непосредственно с соприкасается с высокотемпературной окружающей средой.

Было показано преобладание содержание жирных кислот с разветвленными боковыми цепями в мембране многих термофильных бактерий (Daron, 1970). Brock (Brock, 1967) предположил, что увеличение содержания насыщенных жирных кислот с разветвленными боковыми цепями в мембране термофилов может обеспечить её стабильность при увеличении температуры окружающей среды. В составе липидов плазматической мембраны бактерий рода Thermus (Hughes and Shaw, 1982) обнаружено исключительно высокое содержание углеводов. Предполагается, что это придает ей высокую стабильность.

1.2.2. Структура ДНК генов термофилов.

Генетический аппарат термофильных бактерий рода Thermus достаточно плохо изучен. Регуляция и экспрессия генов термофилов исследована лишь для скудного их количества. Наиболее изучаемые бактериальные объекты рода Thermus представлены микроорганизмами- Т. thermophilus, Т. aquaticus и Т. flavus. Изучены гены метаболических путей биосинтеза аргинина, пиримидина, пролина, лейцина бактерии Т. thermophilus (Van de Casteele, 1994; Van de Casteele et al., 1990, 1997; Kosuge, 1994; Hoshino et al., 1994, Tamakoshi et al., 1998).

Подробно была охарактеризована структура гена 3-изопропилмалатдегидрогеназе Т. thermophilus (Kagawa et al., 1984). Наиболее примечательной особенностью гена 3-изопропилмалатдегидрогеназы (leuB) Т.

thermophilus является использование синонимов кодонов. В кодирующем области гена leuB Т . thermophilus GC-содержание составляет 70.4%, а в некодирующей участке-64.8%. GC-содержание гена и некодирующего участка гена близко среднему GC-содержанию всей хромосомы Т. thermophilus (Oshima and Imahori, 1974). Высокое содержание С в первой букве кодона гена приводит к повышенному содержанию Val, Leu, Glu, Gly в кодируемом белке. Четыре основания почти равнозначно используются во второй букве кодона гена, хотя содержание G несколько ниже остальных оснований. Третья буква кодона особенно богата GC. GC-содержание в третьей букве кодона гена leuB составляет около 90%. Использование GC кодонах гена leuB изображено на рис. 2.

Рис. 2. Частота использования оснований в первой (-), второй (-----) и

третьей (-) буквах кодонах гена leuB Т. thermophilus (Oshima, 1986).

Соответственно, использование кодонов в процессе трансляции мРНК у термофилов отличается от оптимального используемого у Е. coli (Ikemura, 1981). Так, оптимальные кодоны GUU и GUA для валинового аминокислотного остатка у Е. coli не используются в гене leuB Т. thermophilus. Неоптимальные же кодоны для Е. coli, GUC и GUG встречаются в термофильном гене 12 и 20 раз, соответственно. Кодон AUA (Ile), "кодон модулятор", является одним из наиболее редко используемых кодонов в гене Е. coli, в связи с тем, что он репрессирует его экспрессию (Ikemura, 1981). Однако, этот кодон один раз используется в кодирующей области гена 3-изопропилмалатдегидрогеназы Т. thermophilus. Остается непонятным, как с такими

дивергентными кодонами клонированные гены Т. thermophilus, в частности leaB достаточно эффективно гетерологично экспрессируется в клетках Е. coli.

Высокое GC-содержание характерно для целого ряда других известных генов бактерий этого рода: argC, argJ Т. thermophilus (Baetens et al., 1998), изоцитратдегидрогеназы Т. aquaticus YT1 (Miyazaki, 1996), ген ДНК-лигазы Т. filiformis (Kim and Kwon,1998 ) и др.

1.2.3. Особенности белков термофилов

Пионерские исследования термофильных белков начались с изучения гликолитических ферментов, в частности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГФДГ). К моменту изучения термофильных, ГФДГ была выделена и охарактеризована из различных мезофильных источников, что позволило провести сравнительный физико-химический анализ ферментов. Первой была изучена и кристаллизована ГФДГ из умеренного термофила В. stearothermophilus 1503. Этот фермент оказался очень термостабильным (Amelunxen 1966). Затем, были выделены ГФДГ в гомогенном виде из двух экстремально термофильных бактерий Т. thermophilus (Hocking and Harris, 1973), Т. aquaticus (Fijita et al., 1976). Одним из самых термостабильных ферментов этого класса оказался фермент из гипертермофильной бактерии Thermatoga martima. Фермент остается стабильными при 100° С (Jeanicke, 1996 ).

ГФДГ термофилов обладает схожими физико-химическим свойствами с аналогичными ферментами из мезофильных организмов. Так, все НАД-зависимые ГФДГ термофилов и мезофилов имеют сходный молекулярный вес (около 144000 Да), являются тетрамерами, состоящие из одинаковых субъединиц, содержат четыре НАД+, имеют схожие константы седиментации, аминокислотный состав и первичную структуру (Singleton and Amelunxen, 1973). ГФДГ термофильных микроорганизмов показывают значительно более высокую термостабильность, чем ферменты мезофилов . ГФДГ В. stearothermophilus имеет Топт =50-65° С и Тмакс =70-75° С, наиболее высокий температурный оптимум имеют ГФДГ из гипертермофильных организмов Thermatoga martima (ТОПт=850 С), Pyrococcus woessi (Тогп=100° С) (Jaenicke, 1991).

Все термофильные ГФДГ демонстрируют повышенную устойчивость к денатурирующим агентам белков (мочевина, гуанидин-HCl) по сравнению мезофильными гомологами. Так, ГФДГ В. stearothermophilus очень устойчива к денатурации в 8 M мочевине. Кинетика диссоциация фермента описывается реакцией первого порядка и частичная реактивация происходит в присутствии цистеина (Amelunxen et al., 1970). ГФДГ T. aquaticus устойчива к денатурации как 8 M мочевине, так и 5 M гуанидин-HCl (Hocking and Harris, 1976), в фермент же из В. stearothermophilus быстро и необратимо инактивируется в последнем денатурирующем агенте. ГФДГ T. martima демонстрирует аномальную конформационную жесткость при 37° С, обусловленную более компактной упаковкой полипептидной цепи по сравнению с мезофильными аналогами; это свойство исчезает при повышении температуры, т. е в условиях соответствующие условиям функционирования (Jaenicke, 1991).

Сравнение аминокислотного состава трех термофильных и пяти мезофильных ГФДГ выявило несколько более высокое содержание остатков Leu и незначительное большее количество остатков Arg (Amelunxen and Mundlock, 1977). Во всех термофильных ГФДГ констатировалось меньшее количества остатков Cys по сравнению с мезофильными гомологами. Предполагалось, что термостабильность ГФДГ В. stearothermophilus и других белков (на основании сравнения аминокислотной последовательности) связана с небольшими изменениями гидрофобности и большей встречаемости в термофильных белках аминокислотных остатков предпочтительных для формирования спиралей (Agros et al., 1979). Наиболее частые аминокислотные замены в белках термофилах отмечались: Gly на Ala, Ser на Ala, Ser на Thr, Lys на Arg и Asp на Glu. Позднее эта модель был уточнена на основании большого количества белковых последовательностей и структур (Menendenz -Arias&Argos, 1989). Было показано, что наиболее частые замены в термофильных белках следующие: Lys на Arg, Ser на Ala, Gly на Ala, Gly на Ala.

Сравнение пространственной структуры ГФДГ Т. martima с мезофильными аналогами и ГФДГ В. stearothermophilus не позволило выявить строгой закономерности в предпочтительном использовании определенных аминокислотных остатков в термофильном ферменте (Schultes et al, 1990). Были обнаружены замены: Lys на Arg, Leu на Ile, Ser на Thr. Уровень же содержания Gly, Ala, Val в ферменте Т.

martima в среднем такой же, как и у мезофитов. Анализ пространственной структуры ГФДГ Т. aquaticus позволил установить, что замены Ala на lie, Val на Не, Ser на Thr в белках, увеличивают разветвление боковых цепей. Это увеличивает поверхность гидрофобных взаимодействий, что вносить вклад в стабилизацию струкуры белка (Tanner et al., 1995). Кроме этого, консервативная S-петля термофилов, вовлеченная в взаимодействие между субъединицами тетрамера, более гидрофобна, увеличивая тем самым термостабильность ферментов термофилов за счет вклада гидрофобных взаимодействий (Schultes et al, 1990).

Проведенный обширный статистический и сравнительный анализы по белкам, кодируемым генами четырех мезофилов и двух гипертермофилов, не выявил очевидной закономерности предпочтительного использования отдельных аминокислот в составе термофильных белков (Deckert G, et al, 1998). Очевидные отличия аминокислотного состава белков гипертемофилов обнаруживается в том, что они содержат в среднем больше заряженных аминокислотных остатков, чем белки мезофилов (См. Рис.3). Значительно отличаются белки гипертермофов меньшим содержанием глутаминовых остатков. Это может быть связано с повышенной скоростью дезаминирования этого остатка при высоких температурах.

а Я В

es %

a

<u d о и <u о s ts «i sr e a И

50 45 40 -35 -30 -25 20 H 15 10 5 0

Мзар.ао Тзар.ао Мпол.ао Тпол.ао Мгид.ао Тгид.ао

Рис.3. Гистограмма суммарного процентного содержания аминокислотных остатков в белках, кодируемых геномами четырех мезофильных и двух гипертермофильных микроорганизмов (Deckert G, et al, 1998). Обозначения: M-мезофильные белки, Т-термофильные белки; 3ap.ao-(Glu, Asp, Arg, Lis, His), пол. ao-(Gly, Ser, Thr, Asn, Gin, Tyr, Cys), гид. ao-(Leu, Val, Ile, Ala, Pro, Trp, Met).

Рентгеноструктурный анализ показывает, что топология ГФДГ Т. martima, близка к ферменту из омара и В. stearothermophilus. Найдены вставки и делении исключительно на поверхности молекулы. Наиболее существенное различие представляет сеть заряженных остатков, участвующих в образовании периферических ионных пар. Дополнительно увеличение стабильности достигается за счет усиления гидрофобных взаимодействий, особенно на поверхности субьединиц. Обобщая выше сказанное следует заключить о ГФДГ и других белках термофилов факты (Янике, 1998):

1. Белкам термофилов присущ высокий уровень стабильности: стабильность становится ограниченной при оптимальной температуре их функционирования, как и в случае белков мезофилов

2. Имеющиеся данные по структуре доказывают, что белки термофилов очень сходны со своими мезофильными аналогами по части основной топологии и ферментативному механизму.

3. Корреляция между заменами аминокислотной последовательности и изменениями термостабильности сложна и не позволяет вывести общие правила.

1.2.4. Небелковые стабилизирующие факторы

Некоторые белки термофилов после выделения и очистки не стабильны при оптимальное температуре роста данных бактерий. Это дает возможность предположить, что в их термостабильности важную роль играют такие клеточные компоненты как: кофакторы, субстраты, мембраны и высоко заряженное молекулярное внутриклеточное окружение. Ярким примером одного из таких субстратов является NH/ и глутамат, которые повышают стабильность глутаматсинтетазы Bacillus stearothermophilus. В качестве модификаторов данного фермента выступают такие соединения как: аланин, гистидин, пролин, СТР (Welder and Hoffmann, 1974). Кальций необходим для стабилизации термолизина В. thermoproteolyticus (Feder et al., 1971). Глицералдегид-З-фосфатдегидрогеназа В.

coagulans требует высоко заряженного ионного окружения для поддержания своей термостабильности (Amelunxen and Singelton, 1976).

Рассмотренные в данной главе особенности молекулярного строения термофилов показывают, что адаптация термофилов к высоким температурам окружающей среды происходила по целому ряду структурных элементов. Именно благодаря этим структурным изменениям термофилы освоили ту экологическую нишу в которой они обитают практически не имея конкурентов. Все данные о механизмах термосталбильности термофилов могут быть рассмотрены только в комплексе с использованием системого подхода, который является единственным, способным дать ответ на вопрос об удивительной термоустойчивости термофильных организмов. Однако, в настоящее время наука еще не располагает достаточным количеством данных для системного моделирования термостабильности живых организмов.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Яклинчкин, Сергей Юрьевич

выводы

1. Клонирован фрагмент хромосомной ДНК термофильной бактерии Thermus ruber, комплементирующий proBA -мутацию в клетках Escherichia coli и содержащий две открытые рамки считывания, кодирующие ферменты биосинтеза пролина у - глутамилкиназу и у - глутамилфосфатредуктазу.

2. Нуклеотидная последовательность клонированных генов ргоВА имеет повышенное содержание GC, а аминокислотная последовательность белков РгоА и РгоВ содержит большое количество Glu, Arg, Leu, Pro, что характерно для аналогичных белков термофилов. По своей вторичной структуре белки РгоВ и РгоА относятся к типичным а, ß - белкам.

3. Молекулярная масса белков РгоВ и РгоА, рассчитанная на основе нуклеотидной последовательности, составляет 41984 Да и 44419 Да, соответственно. Эти данные подтверждаются результатом синтеза данных белков в системе in vitro и определения их молекулярного веса с помощью электрофореза.

4. Температурный оптимум ферментативной активности у - глутамилкиназы и у - глутамилфосфатредуктазы бактерии Thermus ruber находится в области 55 - 65°С. Ферменты могут быть рекомендованы для использования в научных исследованиях с целью изучения термостабильности белков, для мониторинга трансгенных бактерий и растений, повышения засухоустойчивости хозяйственно полезных бактерий и растений, а так же и в промышленной практике для получения суперпродуцента пролина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Яклинчкин, Сергей Юрьевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Логинова Л. Г., Богданова Т. И., Серегина Л. М. Развитие облигатно-термофильных бактерий на среде с парафином. Микробиология, 1981., т. 50, н. 1, стр. 49 - 54.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. 1984, М., Мир.

3. Нерсиян А. А., Федорова Ю. А. , Хургес Е.М. Клонирование генов биосинтеза пролина Escherichia coli .- Генетика, 1986, т. XXII, с. 2713-2731.

4. Неумывакин Л.В.Добец Н.С., Пирузян Э.С. Получение мутанта Eschericha coli, суперпродуцирующего пролин и устойчивого к повьппенной концентрации NaCl. Генетика, 1990. т. 26, с. 1370-1379.

5. Сохансандж А., Неумывакин Л. В., Мосейко Н. А., Пирузян Э. С. Перенос бактериальных генов синтеза пролина в растения и экспрессия под контролем растительных промоторов. Генетика. 1997, т. 1997, с. 913-917.

6. Янике Р. Что можно узнать о стабилизации ультростабильных глобулярных белков. Биохимия, 1998, т.63, с 370-380.

7. Adams, Е and Frank, L. Metabolism of proline and the hydroxyprolines. Ann. Rev. Biochem., 1980, 49, p. 1005-1061.

- 8. Agros, P., Rossmann, M. G., Grau U. M., Zuber, H., Frank, G. & Tratschin, J. D. Thermal stability and protein structure. - Biochemistry, 1979, v. 18, p. 5698-5703.

9. Alfredsson, G. A., S. Baldursson, and J. K. Kristjansson. Nutritional diversity among Thermus spp, isolated from Icelandic hot springs. Syst. Appl. Microbiology, 1985, v. 6. p. 308-311.

10. Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro А. БсЬдйег, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. -Nucleic Acids Res. 1997.v. 25. p.3389-3402.

11. Amelunxen, R. E. 1966. Crystallization of thermostable glyceraldehyde-3-phoshate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. Biochim. Biophys. Acta. 1966, v. 122, p. 175-181.

-8212. Amelunxen, R. E., M. Noelken, and R. Singleton, Jr. Studies on the subunit structure of thermostable glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermohpilus. -Arch. Biochem. 1970. v. 141, p. 447-455.

13. Aral, B., Schlenzig, J. S., Liu, G. and Kamoun, P. Database cloning human delta 1-pyiroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) cDNA: a bifunctional enzyme catalyzing the first 2 steps in proline biosynthesis. -C. R. Acad. Sci. Ill, Sci. Vie. 1996, v. 319, p. 171178.

14. Bachmann B. J. Linkage map of Escherichia coli K 12. -Microbiological Rev., 1989, v. 47, p. 180-230.

15. Babu YS, Sack JS, Greenhough TJ, Bugg CE, Means AR, Cook WJ Three-dimensional structure of calmodulin. J Biol Chem 1973 May 10;248(9):3313-26.

16. Baich A. Proline synthesis in E. coli. A proline inhibitable glutamic acid kinase. -BBA, 1969, v. 192, p. 462- 467.

17. Baich A. The biosynthesis of proline in Escherichia coli, phosphate-dependent glutamate y-semialdehyde dehydrogenase (NADPH) the second enzyme in the pathway. - BBA, 1971, v. 244, p. 129-134.

18. Baetents M, Legrain C, Boyen A and Glansdorff N. Gene and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in the exteme thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. -Microbiolgy, 1998, v. 144, p. 479-492.

19. Becker, R. J. and M. J. Starzyk. Morphology and rotund body formation in Thermus aquaticus. -Microbios., 1984, v. 41. p. 115-129.

20. Berenguer, J., M., Faraldo L. M., and de Pedro, M. A. Ca2+ -stabilized oligomeric protein complexes are major components of the cell envelope of Thermus thermophilus HB-8. -J. Bacteriol. 1988. V.170. P. 2441-2447.

21. Bevan M. W., Flavell R. B., Chilton M. D. A chimeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation. -Nature, 1983, v. 304, p. 184-187

22. Brady R. A., Csonka L. N. Transcriptional regulation of the proC gene of Salmonella typhimurium. -J. Bacteriol., 1988, v. 1970, p. 2379-2382.

23. Brock, T. D. Life at High Temperatures. -Science, 1969, v. 158, p. 1012-1019.

24. Brock, T. D. Life at High Temperatures. -Science, 1985, v. 230, p. 132-138.

25. Brock, T. D. Thermophiles. 1986, A wiley-interscience publiction. John Wiley&Sons.

-8326. Brock, T. D. Thermophilic microorganisms and life at high temperatures. SpringerVerland, Heidberg.

27. Brock T. D. and L. K. Boylen. Presence of thermophilic bacteria in laundry and hot-water heaters. -Appl. Microbiol, v. 25. p. 72-76.

28. Brock, T.D. and M. R. Edwards. Fine structure of Thermus aquaticus, an extreme thermophile. J. Bacterid. 1970. V. 104, P. 509-517.

29. Brock, T. D. and H. Freeze, Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a non sporulating extreme thermophile. -J. Bacteriology, 1969, v. 98, p. 289-297.

30. Brock, T.D. and I. Yoder. Thermal pollution of a small river by a large university: bacteriological studies. -Proc. Indiana Acad. Sei., 1971, v. 80, p. 183-188.

31. Burley SK, Petsko GA Amino-aromatic interactions in proteins. Nature 1985 May 2-8;315(6014):37-40.

32. Bullock W.O. et al., -BioThechniques, 1987, V. 5, p. 376-378.

33. Chein, A., D. B. Edgar, and J. M. Trela. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. -J. Bacteriol., 1976, v. 127, p. 1550-1557.

34. Cohen, S. N., Chang, A. C. Y. ,Hsu, L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. -Proc. Natl. Acad. Sei., 1972, v. 69, p. 2110.

35. Cole,S.T. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. -Nature, 1998, v. 393 , p. 537-544

36. Collins, M. D. and D. Jones, Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implications. -Microbiol. Revs., 1981, v. 45, p. 316-354.

37. Condamine H. Sur la regulation de la prodution de proline chez E. col K12. Ann. Institute Pasteur (Paris), 1971, v. 120, p. 126-143.

38. Cometta, S., B. Sonnleitner, and A. Feicheer. The growth behavior of Thermus aquaticus in continuous cultivation. -Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 15. p. 6974. "

39. Cowan, D. A. and R M. Daniel. Purification and properties of an extracellular protease (caldolysin) from an extreme thermophile. -Biochim. Biophys. Acta., 1982, v. 705, p. 293-305.

-8665. Hartmann R. K., J. Wolters, B. Kroger, S. Schultze, T. Specht and V. A. Erdmann. Does Thermus represent another deep eubacterial branching? -Sys. Appl. Microbiol., 1989, v. 11. p. 243-249.

66. Hawkes R., Grutter M.G., Schellman J. Thermodynamic stability and point mutations of bacteriophage T4 lysozyme. -J. Mol Biol., 1984, v. 175(2), p. 195-212.

67. Heringa J, Argos P., Egmond M., Vielg J. Increasing thermal stability of subtilisin from mutations suggested by strongly interacting side-chain clusters. -Protein Eng., 1995, v.8(l), p.21-30.

68. Helmer G, Casadaban M, Bevan M, Kayes L, Chilton M. D. A new chimeric gene as a marker for plant transformation: The expression of Escherichia coli (3-galactosidase in sunflower and tobacco cells. -Bio/Technology, 1984, v. 2, p. 520-527

69. Hensel R. W., Demharter O., Kandler R. M., Kroppenstedt and E. Stackebrandt. Chemotaxanomic and molecular-genetics studies of the genus Thermus: Evidence for a phylogenetic relationship of Thermus aquaticus and Thermus ruber to the genus Deinococcus. -Int. Syst. Bacterid., 1986, v. 36. p. 444-453.

70. Herrera-Estrella L,Depicker A, Van Montagu M, Schell J. Expression of chimeric genes transformed into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector. -Nature, 1983, v.303, p. 209-213

71. Hecht MH, Sturtevant JM, Sauer RT Effect of single amino acid replacements on the thermal stability of the NH2-terminal domain of phage lambda repressor. Biochemistry 1987 Jan 13;26(1): 178-82.

72. Hocking, J. D. , and J. I. Harris. Purification by affintity chromatography of thermostable glyceraldhyde-3-phosphate dehydrogenase from Thermus aquaticus. -FEBS Lett., 1973, v. 34, p. 280-284.

73. Horovitz A, Serrano L, Avron B, Bycroft M, Fersht AR Alber T Mutational effects on protein stability. Annu Rev Biochem. 1989;58:765-98.

74. Hoshino, T., T. Kosuge, Y. Hidaka, K, Tabata, and T. Nakahara. Molecular cloning and sequence analysis of the proC, encoding A^pyrroline -5-cardoxylate reductase from an extremely thermophilic eubacterium, Thermus thermophilus HB27. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, v. 199, p. 410-417.

-8775. Hu, C. A. Delauney, A. J. and Verma, D. P. A bifunctional enzyme (pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, p. 9354-9358.

76. Hu CQ, Sturtevant JM. Thermodynamic study of yeast phosphoglycerate kinase. FEBS Lett 1986 Jul 28;203(2): 139-43.

77. Hudson, J. A., H. W. Morgan, and R. M. Danniel. A numerical classification of some Thermus isolates. -J. Gen. Microbiol. 1986, v. 132. p. 532-540.

78. Hudson, J. A., H. W. Morgan, and R. M. Daniel. Thermus filiformis sp. nov., a filamentous caldoactive bacterium. -Int. Syst. Bacteriol., 1987, v. 37. p. 431-436.

79. Hudson, J. A., H. W. Morgan, and R. M. Daniel. Numerical classification of Thermus isolates from globally distributed hot springs. -Sys. Appl. Microbiol., 1989. v. 11. p. 250256.

80. Hunter I. S. Cloning of the genes in Streptomyces. - In: Glover D. M. (ed). DNA cloning. A practical approach., 1985, v. 12, IRL Press Oxford Washington DC, p. 267.

81. Hurley JH, Baase WA, Matthews BW. Design and structural analysis of alternative hydrophobic core packing arrangements in bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol 1990 Dec 20;216(4): 1031-44.

82. Jaenicke, R. Protein stability and molecular adaptation to extreme condition. -Eur. J. Biochem. 1991, v. 202, p. 715-728.

83. Jaenicke R, Zavodszky P. Proteins under extreme physical conditions. FEBS Lett 1993 Jun 28;325(l-2):5-16.

84. Jefferson R. A., Burgess S. M., Hirsh D. (3-Gluciironidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. -Proc Natl Acad Sci., 1986, v. 83, p. 8447-8451.

85. Ikemura T. Correlation between the abundance of Escherichia coli transfer RNAs and the occurrence of the respective codons in its protein genes: a proposal for a synonymous codon choice that is optimal for the E. coli translational system. -J. Mol Biol., 1981, v. 151(3), p.389-409.

86. Innis, M. A., K. B. Myambo, D. H. Gelfand, and M. A. D. Brow. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.- Proc. Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, p. 9436-9440.

-8887. Kaledin, A. S., A. G. Slyusarenko, and S. I. Gorodetskii. Isolation and properties of DNA polymerase from extremely thermophilic bacterium Thermus aquaticus YT1. Biokhimiya, 1986, v. 45, p. 494-501.

88. Kaneko, T. et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803 II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. -DNA Res., 1996, v. 3, p. 109-136.

89. Kagawa Y., Nojima H. , Nukiwa N., Ishizuka M., Nakajima T., Yasushara, Tanaka T., and Oshima T., High Guanine plus Cytosine Content in the Third Letter of Codons of an Extreme Thermophile. -J of Biol. Chem., 1984, v. 259, p. 2956-2960.

90. Kelly C. A., Nishiyama M., Ohnishi Y., Beppu T., Birkoft J. Determinants of protein thermostability observed in the 1.9-A crystal structure of malate dehydrogenase from the thermophilic bacterium Thermus flavus. -J. Biochem., 1993, v. 32, p. 3913-3922.

91. Kim H. K., Kwon S.T. Cloning, nucleotide sequence, and expression of the DNA ligase-encoding gene from Thermus filiformis. -Mol. Cells., 1998. v. 31, N. 8 (4), p. 438443.

92. Koncz C, Olsson 0, Langridge W. H. R, Schell J, Szalay A. A. Expression and assembly of functional bacterial luciferase in plants. -Proc Natl Acad Sci, 1987, v. 84 p. 131-135.

93. Kosuge T., K. Tabata, and T. Hoshino. Molecular cloning and sequencing analysis of proBA operon from extremely thermophilic eubacterium Thermus thermophilus HB27. -FEMS Microbiol. Lett., 1994, v. 157, p. 73-79.

94. Kraepelin G., and H. U. Gravenstein. Experimentelle indktion von 'rotund dodies' bei Thermus aquaticus Zeitschr. -Algm. Mikobiol. v. 20: p. 33-45

95. Kristjansson J. K., G. O. Hreggvidsson and G.A. Alfresson. Isolation of halotolerant Thermus spp. From submarine hot springs in Iceland. -Appl. Environ. Microbiol. 1986, v. 52. p. 1313-1316.

96. Kwon, S.-T., I. Terada, Matsuzawa, and T. Ohta. Nucleotide sequence of the gene for aqualysin I (thermophilic alkaline serine protease) of Thermus aquaticus YT1 and characteristics of deduced primary structure of the enzyme. -Eur. J. Biochem., 1988, v. 173, p. 491-497.

97. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assebly of the head of bacteriophage T4. -Nature, 1970, v. 227, p. 680-685.

-8998. Lacks S., Greenberg J. R. J. Mol. Biol., 1977, v. 114, p. 153.

99. Loginova, L.G., L. A. Egorova, R. S. Golovacheva, and L. M. Seregina. Thermus ruber sp. nov. rev. -Int. J. Syst. Bacterid. 1984, 34, 498-499.

100. Limaurio D., Falciatore A., Basso A.L., Florani G., and Maurillio De Felice. Proline biosynthesis in Streptococcus thermophilus: characterization of the proBA operon and its products. -Microbiology, 1996, v. 142, p. 3275-3285.

101. Malcolm BA, Wilson KP, Matthews BW, Kirsch JF, Wilson AC. Ancestral lysozymes reconstructed, neutrality tested, and thermostability linked to hydrocarbon packing. J Mol Biol 1992 Jul 5;226(l):29-35.

102. Matsuzawa, H., Hamaoaki M., and Ohta T. Production of thermophilic extracellular proteases (aqulysins I and II) by Thermus aquaticus YT-1, an extreme thermophile. Arg. Biol. Chem., 1983, v. 47, p. 25-28.

103. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) .Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 135-136.

104. Merkel, G.J., S. S. Stapleton, and J. J. Perry. Isolation and peptidoglycan of Gramnegative hydrocarbon-utilizing thermophilic bacteria. -J. Gen. Microbiol. 1978. v. 109, p. 141-148.

105. Matthews B.W.Structural and genetic analysis of protein stability. -Science. 1988, Jun 17;240(4859): 1648-52.

106. Menendez-Arias L., Argos P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics point to residue substitutions in alpha-helices. -J. Mol. Biology, 1989, v. 206(2). p. 397-406.

107. McKay, A., J. Quiller, and C. W. Jones. Energey conservation in the extreme thermophile Thermus thermophilus HB8. -Arch. Microbiol., 1982. v. 131. p. 43-50.

108. McClelland, M., L. G. Kessler, and M. Bitther. Site specific cleavage of DNA at 8-and 10-base pair sequences. -Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1984, v. 81, p. 983-987.

109. Minagawa, E., Kaminogawa S., Matsazawa H., Ohta T and K. Yamauchi. Isolation and characterization of a thermostable aminopeptidase (aminopeptidase T) from Thermus aquaticus YT1, an extreme thermophilic bacterium. -Agric. Biol. Chem., 1988, v. 52, p. 1755-1763.

-90110. Miyazaki K. Isocitrate dehydrogenase from Thermus aquaticus YT1: purification of the enzyme and cloning, sequencing, and expression of the gene. Appl. Environ. Microbiol. 1996, v. 62(12), p. 4627-4631.

111. Munster, M. J., A. P. Munster, J.R. Woodrow, and R. J. Sharp. Isolation and preliminary taxonomic studies of Thermus strains isolated from Yellowstone National Park, USA. -J. Gen. Microbiolgy, 1986, 132, 1677-1683.

112. Neumivakin L. V., Solovjov V. P. , Sokhansanji A., Tilba V. A. , Moseiko N. A. , Shachbasian R. V., Piruzian E. S. Increase in osmotolerance of Rhizobium fredii soybea isolate BD32 by the proBosmproA operon of Escherichia coli. BBRC. 1995, v. 217, p. 796-801.

113. Nobre, M.F., Trper, H.G., Da Costa, M. S. "Transfer of Thermus ruber (Loginova et al. 1984), Thermus silvanus (Tenreiro et al. 1995), and Thermus chliarophilus (Tenreiro et al. 1995) to Meiothermus gen. nov. as Meiothermus ruber comb, nov., Meiothermus silvanus comb, nov., and Meiothermus chliarophilus comb, nov., respectively, and emendation of the genus Thermus" Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, v. 46, p. 604-606.

114. Omori K., Suzuki S-I., Imai Y. and Komatsubara S. Analysis of the Serratia marcescens proBA operon and feedback control of proline biosynthesis. Journal of Gen. Microbiology. 1991, v. 137, p. 509-517.

115. Oshima T. and K. Imahori. Isolation of an extreme thermophile and thermostability of its transfer ribo nucleic acid and ribosomes. -J. Gen. Appl. Microbiology, 1971, v. 17. p. 513-517.

116. Oshima T, et al. Physiochemical properties of deoxyribonucleic acid from an extreme thermophile. -J. Biochem (Tokyo)., 1974, v. 75(1), p. 179-183.

117. Ow D. W., Wood K. V., DeLuca M, De Wet J. R, Helinski D. R, Howell S. H. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. -Science, 1986, v. 234, p. 856-859.

118. Pace CN. Contribution of the hydrophobic effect to globular protein stability. Nature 1991 Jul 4;352(6330): 17-8.

119. Piruzian E. S. , Monzavi-Karbassi B, Darbinian N. S., Goldenkova I. V., Kobets N. S., Mochulsky A. V. The use of a thermostable ß-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants. -Mol. Gen. Genet, 1998, v. 257, p. 561-567.

-91120. Plant A. R., Morgan H. W., and Daniel R. M. A highly stable pullunanase from Thermus aquaticus YT1. -Enz. Microb. Technol., 1986, v. 8, p. 668-672.

121. Prado, A., M. S. da Costa, and V.M.C. Maderia. Effect of the growth temperature on the lipid composition of two strains of Thermus sp. J. Gen. Microbiology. 1988. V. 134. P. 1653-1660.

122. Perutz M. F., Raidt H. Stereochemical basis of heat stability in bacterial ferredoxins and in haemoglobin A2. -Nature, 1975, v. 255, p. 256-259.

123. Petukhov M., Kil Y., Kuramitsu S., Lanzov V. Insights into thermal resistance of proteins from the intrinsic stability of their alpha helices. -Proteins, 1997, v. 29, p. 309320.

124. Pask-Hughes, R. A. and R. A. D. Williams. Cell components of strains belonging to the genus Thermus. J. Gen. Microbiol. 1978. V. 102. P. 65-72.

125. Pask-Hughes, R. A. and N. Shaw. Glycolipids from thermophilic bacteria belonging to the genus Thermus. 1982. J. Bacteriology. V. 149. P. 54-58.

126. Rice DW, Yip KS, Stillman TJ, Britton KL, Fuentes A, Connerton I, Pasquo A, Scandura R, Engel PC . Insights into the molecular basis of thermal stability from the structure determination of Pyrococcus furiosus glutamate dehydrogenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1984 Sep;81(18):5685-9/

127. Richardson J.S, Richardson D.C. Amino acid preferences for specific locations at the ends of alpha helices. Nature, 1979, Feb 22; 277(5698), 667-9.

128. Roberts, R. J. Restriction enzymes and their isoschizomers. Nucl. Acid. Res., 1989, v. 17, p. 347-387.

129. Rossi J.J., Vender J., Berg C. M., Coleman W. H. Partial purification and some properties of A1 -pyrroline -5 carboxylate reductase from Escherichia coli.- J. Bacterid., 1977, v. 129, p. 108-114.

130. Ramaley R. F. and J. Hixson. Isolation of non-pigmented, thermophilic bacterium similar to Thermus aquaticus. J. Bacterid. V. 103. P. 527-528.

131. Saiki, R. K., Gelfand D. H. , S. Stoffell, Scharf, S. J., Higguchi R. , Horn G. T., Mullis K. B. and Erlich H. A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with termostable DNA polymerase. -Science, 1988, v. 239, p. 487-491.

132. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition. 1989. Cold Spring Harbor, NY, 135-136.

-92133. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (DNA sequensing with chain - termination ingibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, V.74. P. 5463 - 5467.

134. Santos, M. A., R. A. D. Williams, and M. S da Costa. Numerical taxonomic study of Thermus isolates from Portuguese hot springs. 1989. Syst. Appl. Microbiol. V. 12. P. 221-235. Singleton, R., Jr., and R. E. Amelunxen. Proteins from thermophilic microorganisms. Bacteriol. Rev. 1973. V. 37. P. 320-342.

135. Stearman R. S., Frankel A. D. Frieir E., Liu В., Pabo C. Combining thermostable mutations increases the stability of lambda repressor. -Biochemistry, 1988, v.3, p. 75717574.

136. Stamm L. V. Barnes N. Y. Nucleotide sequence of the proA and proB genes of Treponemapallidium, the syphilis agent. Dna Seq., 1997, v. 8 (1-2), 63-70.

137. Sandberg WS, Terwilliger ТС. Influence of interior packing and hydrophobicity on the stability of a protein. Nature, 1990, May 3;345(6270):86-9.

138. Savoure, A., Jaoua, S., Hua, X. J., Ardiles, W., Van Montagu,M. and Verbruggen, N. Isolation, characterization, and chromosomal location of a gene encoding the delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase in Arabidopsis thaliana. -FEBS Lett., 1995, v. 372, p. 13-19.

139. Schindler, U., Sans, N. and Schroder, J. Ornithine cyclodeaminase from octopine Ti plasmid Ach5: Identification, DNA sequence, enzyme properties, and comparison with gene and enzyme from nopaline Ti plasmid C58. -J. Bacteriology., 1989, v. 171, p.847-854.

140. Schultes, V., Deutzmann, R& Janenicke.R. Complete amino sequence of glyceraldehyde-3-phosohate dehydrogenase from the hyperthermophilic eubacterium Thermatoga martima. -Eur. J. Biochem.,1990,192, p. 25-31.

141. Sharp R., J and R. A. D. Williams. Properties of Thermus ruber strains isolated from Icelandic hot springs and DNA: DNA gomology of Thermus ruber and Thermus aquaticus. -Appl. Environ. Microbiology, 1988, v. 54, p. 2049-2053.

142. Smith C. J., Deutch A. H., Rushlow К. E. Purification and characteristics of y-glutamyl kinase involved in Escherichia coli proline biosynthesis. J. Bacteriology., 1984, v. 1984, v. 157, p. 545-551.

143. Stramer, S. L. and M. J. Starzyk. The occurrence and survival of Thermus aquaticus. Microbios, 1981, 32, 99-110.

-93144. Stewart, C. R. Proline accumulation: biochemical aspects. In Physiology and Biochemistry of Drought Resistance in Plants. (Paleg, L.G. and Aspinall, D. eds). Sydney: Academic Press, 1985, p. 243-259.

145. Susuki, K., and K. Imahori. Glyseraldehyde-3-phosphate of Bacillus stearothermophilus. Kinetics and physicochemical studies. -J. Biochem., 1973, v. 74, p. 955-970.

146. Takase, M. and K. Horikoshi. A thermostable p-glucosidase isolated from a bacterial species of the genus Thermus. -Appl. Microbiol. Technol., 1988, v. 29, p. 55-60.

147. Tamakoshi M, Yamagishi A, Oshima T. The organization of the leuC, leuD and leuB genes of the extreme thermophile Thermus thermophilus. -Gene, 1998, v. 222(1), p. 12532.

148. Tindall, K. R. and Kunkel T. A. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 6008-6013.

149. Verbruggen N. ,Villaroel, R. and van Montagu, M. Isolation and characterization of pyrroline-5-carboxylate reductase genes from Arabidopsis thaliana. Poster abstracts at 3rd Int. Congress of the Int. Soc. Plant Mol. Biol., 8-11 October 1991, Tucson, AZ.

150. Van de Casteele, M., Demarez, M., Legrain, C., Glansdorff, N & Pierard, A. Pathways of arginine biosynthesis in extreme thermophilic archaeo and eubacteria. J. Gen. Microbiology, 1990, v. 136, p. 1177-1183.

151. Van de Casteele, M. Desmarez, L., Legrain, C., Chen, P. G., Van Lierde, K., Pierard, A, & Glansdorff, N. Gene encoding aspartate carbamoytransferase of Thermus aquaticus Z05 and Thermatoga martima MSB8: modes of expression in Escherichia coli and properties of their products. Biocatalysis, v. 112, p. 165-179.

152. Van de Casteele, M., Chen, P., Roovers, M., Legrain, C. & Glansdorff, N. Structure and expression of a pyrimidine gene cluster from the extreme thermophile Thermus Z05. -J. Bacteriology, 1997, v. 11, p. 3470-3481.

153. Villafranca J. E, Howell E.E, Oatley SJ, Xuong NH, Kraut J. An engineered disulfide bond in dihydrofolate reductase. Annu Rev Biochem, 1993;62:139-60.

154. Welder, F. C., and F. M. Hoffmann. Glutamine synthase of Bacillus stearothermophilus. Regulation and thermostability. -Biochemistry, 1974, v. 13, p. 3215-3221.

-94155. Wierenga, R.K.,Terptsta, P& Hoi, W.G.J. Predition of the occurence of the ADP-binding PaP-foldin proteins, using an amino acid sequence fingerprint. J. Mol. Biol, 1985, 187, 101-107.

156. Williams, R.A.D. Caldoactive and thermophilic bacteria and their thermostable protein. - Sci. Prog., 1975. v. 62, p. 373-393.

157. Walker J., Wanacott A., Harris, J. Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. -Eur. J. Biochem., 1980, v. 108, p. 581586.

158. Wrba A., Schweiger A., Schultes V., Jaenicke R., Zavodszky P. Extremely thermostable D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from the eubacterium Thermotoga maritima. -Biochemistry, 1990, v. 29. p. 7584-7592.

159. Williamson, C. L. and Slocum, R. D. Molecular cloning and evidence for osmoregulation pyrroline-5-carboxylate reductase (proC) gene in pea (Pisum sativum L. ). -Plant physiol., 1992, 100, p. 1464-1470.

160. Ulrich, J. T., G. A. McFeters, and K. L. Temple. Induction and characterization of J3-galactosidase in an extreme thermophile. -J. Bacteriology, 1972, v. 110, p. 691-698.