Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Солодовникова, Наталия Юрьевна

• Солодовникова, Наталия Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Солодовникова, Наталия Юрьевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ Уагго\ую Про1уПса, ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ

9

КИСЛОТ

1.1. Сверхсинтез лимонных кислот дрожжами при выращивании

9

на глюкозе

1.1.1. Физиологические особенности синтеза

9

лимонных кислот

1.1.2. Биохимические особенности процесса сверхсинтеза лимонных

10

кислот

1.1.2.1. Ферментные системы, участвующие в метаболизме глюкозы

дрожжами

1.1.2.2. Изменение биоэнергетического состояния клеток дрожжей

14

в условиях лимитирования роста культуры источником азота

1.2. Сверхсинтез кетокислот дрожжами Уатжга Ыро1уИса

при выращивании на глюкозе

ГЛАВА 2. НАД^-ЗАВИСИМАЯ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗА

И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ У ДРОЖЖЕЙ

2.1. Характеристика НАД^-гооцигратдегидрогеназы

2.2. Влияние метаболитов на НАД^-изоцитратдегидрогеназу

2.3. НАД^-изоцитратдегидрогеназа и энергетический обмен

ГЛАВА 3. МЕТАБОЛИЗМ ИСТОЧНИКА АЗОТА У ДРОЖЖЕЙ

3.1. Ассимиляция аммония дрожжами

3.2. Активность ферментов начальных этапов азотного метаболизма

ло

у дрожжей

3.3. Субклеточная локализация ферментов азотного метаболизма

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4Л. Объект исследования

4.2. Культивирование дрожжей

4.3. Методика контроля роста биомассы

4.4. Определение органических кислот в культуральной жидкости

4.5. Определение концентрации ионов аммония в

33

культуральной жидкости

4.6. Определение концентрации глюкозы в

34

культуральной жидкости

4.7. Измерение интенсивности дыхания и ингибиторный анализ

4.8. Экстракция нуклеотидов

4.9. Определение адениловых нуклеотидов

4.10. Определение пиридиннуклеотидов

4.11. Получение бесклеточных гомогенатов

4.12. Субклеточное фракционирование

4.13. Определение активности ферментов

4.13.1. НАД^-зависимая изоцитратдегидрогеназа

4.13.2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

4.13.3. Фумарат-гидратаза

4.13.4. НАД'-зависимая глутаматдегидрогеназа

4.13.5. НАДФ+-зависимая глутаматдегидрогеназа

4.13.6. Аланинаминотрансфераза

4.13.7. Аспартатаминотрансфераза

4.13.8. Глутаминсинтетаза

4.14. Очистка НАД^-зависимой изоцитратдегидрогеназы

4.15. Определение молекулярного веса и субъединичного

состава НАД^-зависимой изоцигратдегидрогеназы

4.16. Определение концентрации белка

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 5. ДИНАМИКА АДЕНИЛОВЫХ И ПИРИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ Уаггомш 1лро1уПса В УСЛОВИЯХ СВЕРХСИНТЕЗА

ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ

5Л. Рост дрожжей У. Иро1уйса 704 на глюкозе

в условиях лимитирования источником азота

5.2. Интенсивность дыхания и чувствительность

к цианиду при лимитировании роста дрожжей источником азота

5.3. Экстракция нуклеотидов

5.4. Внутриклеточное содержание адениловых нуклеотидов

при лимитировании роста дрожжей источником азота

5.5. Внутриклеточное содержание НАД* и НАДН 53 при лимитировании роста дрожжей источником азота

5.6. Рост дрожжей Y. lipolytica 704 на глюкозе при

лимитировании тиамином

5.7. Интенсивность дыхания и чувствительность

57

к цианиду в условиях лимитирования роста дрожжей тиамином

5.8. Внутриклеточное содержание адениловых и пиридиновых

57

нуклеотидов в клетках дрожжей, лимитированных тиамином

ГЛАВА 6. МЕТАБОЛИЗМ ИСТОЧНИКА АЗОТА

У ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica

6.1. Динамика активностей ферментов начальных этапов

метаболизма азота

6.2. Локализация ферментов азотного обмена

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ НАД+-ЗАВИСИМОЙ

ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica

7.1. Очистка НАД^-изоцитратдегидрогеназы

7.2. Характеристика НАД^-изоцитратдегидрогеназы

7.3. Влияние метаболитов на активность НА Д+-из о цитр атд ег идр о геназ ы

7.4. Кинетическое поведение и регуляция НАД^-изоцигратдегидрогеназы

7.5. Зависимость скорости реакции от концентрации НАД^

7.4.2. Зависимость скорости реакции от концентрации изоциграта

и влияние АМФ

7.4.3. Влияние АТФ на кинетические параметры фермента

7.4.4. Ингибирование БАД^-изоцитратдегидрогеназы НАДН

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

8.1. Сравнение обеспеченности клеток дрожжей Y.lipolytica энергетическими и восстановительными эквивалентами

в условиях сверхсинтеза лимонных и кетокислот

8.2. Метаболизм источника азота у дрожжей -

продуцентов органических кислот

8.3. Регуляция НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы дрожжей

Yarrowia lipolytica

8.4. Биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот

дрожжами Y. lipolytica на глюкозе

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica»

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время дрожжи Yarrowia lipolytica являются наиболее изучаемым видом из группы "нетрадиционных" дрожжей (Barth & Gaillardin, 1997). Такой интерес связан, во-первых, с принципиальным отличием этой группы дрожжей от хорошо изученных в отношении филогенетической эволюции, физиологии, генетики и молекулярной биологии дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe. Во вторых, дрожжи Y. lipolytica секретируют в большом количестве ряд метаболитов (органические кислоты, внеклеточные белки), что делает их привлекательным объектом для разработки биотехнологических процессов получения этих метаболитов.

В Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов (ранее Лаборатория окислительного обмена веществ) ведутся работы по исследованию процессов сверхсинтеза органических кислот (лимонной, изолимонной, пировиноградной и 2-оксоглутаровой) дрожжами Y.lipolytica при использовании разных источников углерода. Сверхсинтез лимонной и изолимонной кислот происходит при ограничении роста дрожжей источником азота. Если среда культивирования является дефицитной по тиамину, то выделяются пировиноградная и 2-оксоглутаровая кислоты. Физиологические основы образования этих продуктов дрожжами изучены достаточно хорошо, однако биохимический механизм сверхсинтеза кислот до конца не ясен.

Сверхсинтез метаболитов микроорганизмами возможен при блокировании метаболического потока на каком-либо участке и нарушении согласованного функционирования катаболинеских и анаболических путей. При этом место блокирования метаболического потока определяется природой лимитирующего фактора и его специфическим воздействием на клеточный метаболизм.

Проводившиеся ранее исследования показали, что лимитирование роста дрожжей Y. lipolytica тиамином приводит к значительному снижению активности тиаминзависимой

2-оксоглутаратдегидрогеназы. Активность тиаминзависимой пируватдегидрогеназы также снижается, но в меньшей степени (Катаева с соавт., 1986; Катаева и Финогенова, 1987). Лимитирование роста дрожжей источником азота прежде всего должно сказываться на метаболизме азотсодержащих соединений. Однако сверхсинтез лимонных кислот, являющихся интермедиатами ЦТК, возможен при ингибировании НАД^-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦЦГ). Очевидно, что в условиях сверхсинтеза кетокислот этот фермент должен активно работать, чтобы обеспечить образование 2-оксоглутарата.

НАД-ИЦЦГ эукариот - это крупный алло стер ический фермент, регуляция которого определяет интенсивность функционирования ЦТК. При этом, важным фактором регуляции является энергетическое состояние клеток. По мнению некоторых исследователей, лимитирование роста дрожжей источником азота, приводящее к остановке биосинтеза азотсодержащих соединений, вызывает накопление в клетках АТФ и НАДН, которые в этих условиях не используются на биосинтетические цели (Evans & Ratledge, 1985с). Такая ситуация должна отрицательно сказываться на работе НАД-ИЦДГ.

Следует отметить, что в литературе имеются данные по содержанию адениловых нуклеотидов и изменению соотношения АТФ/АМФ в дрожжах Y.lipolytica (Marchai et al, 1977; Mitshushima et al., 1978) и в так называемых "липидных" дрожжах (Botham & Ratledge., 1979; Boulton & Ratledge., 1983; Evans et al., 1983) при ограничении их роста источником азота. Однако эти данные противоречивы. Определение содержания пиридиновых нуклеотидов в этих условиях у дрожжей, к сожалению, не проводилось. О содержании адениловых и пиридиновых нуклеотидов в клетках дрожжей Y.lipolytica в условиях сверхсинтеза кетокислот также ничего не известно.

Регуляция НАД-ИЦДГ у "липидных" дрожжей (Evans et al., 1983; Evans & Ratledge, 1985a) и дрожжей Y.lipolytica (Marchai et al., 1977; Mitshushima et al., 1978; Соколов с

соавт., 1995а) изучалась ранее на грубых или частично очищенных препаратах. Исследователи единодушно сходятся во мнении об определяющей роли соотношения АТФ/АМФ в регуляции активности этого фермента. Однако, существует противоречие по влиянию 2-оксоглутарата на активность НАД-ИЦДГ, Таким образом, для объяснения механизма сверхсинтеза органических кислот дрожжами У. Нро1уЫса необходима очистка и изучение кинетических параметров этого фермента. Кроме того, нам представляется необходимым исследование азотного метаболизма в клетках дрожжей УНро1уИса при ограничении их роста источником азота, так как есть непосредственная связь между процессом сверхсинтеза лимонных кислот и метаболизмом азотсодержащих соединений, к числу которых относятся и нуклеотиды.

На основании вышеизложенного целью настоящего исследования являлось изучение биохимического механизма сверхсинтеза органических кислот дрожжами У. Иро1уНса.

В задачи исследования входило:

1) сравнительное изучение динамик АТФ, АДФ, АМФ, НАДН и НАД* в клетках дрожжей У.Нро1уИса в условиях сверхсинтеза лимонных кислот и сверхсинтеза кетокислот при выращивании на глюкозе;

2) изучение азотного обмена в клетках дрожжей У. Иро1уИса при использовании глюкозы в качестве источника углерода;

3) выделение и характеристика НАД1-зависимой изоцитратдегидрогеназы дрожжей У.Иро1уИса, исследование механизмов ее регуляции.

Научная новизна работы. Исследована динамика адениловых и пиридиновых нуклеотидов в дрожжах У. Нро1уйса в условиях сверхсинтеза органических кислот. Установлено принципиальное отличие процессов сверхсинтеза лимонных кислот и сверхсинтеза кетокислот в обеспеченности клеток дрожжей восстановительными и

энергетическими эквивалентами. Показано, что процесс сверхсинтеза лимонных кислот сопровождается значительным снижением внутриклеточного содержания адениловых и пиридиновых нуклеотидов, однако соотношения АТФ/АМФ и НАДН/НАД* возрастают после исчерпания источника азота из среды культивирования. Процесс сверхсинтеза кетокислот происходит в условиях снижения соотношений АТФ/АМФ и НАДНХНАД*. Исследована динамика и субклеточная локализация ферментов азотного обмена у дрожжей Y.lipolytica в условиях лимитирования их роста источником азота. Проведено детальное исследование кинетических и регуляторных свойств очищенной до гомогенного состояния НАД-ИЦЦГ дрожжей Y.lipolytica. Показано отсутствие ингибирующего воздействия физиологических концентраций АТФ на активность этого фермента, что позволило сделать заключение о регуляции фермента in vivo уровнем АМФ, а не соотношением АТФ/АМФ. Показано отсутствие ингибирования НАД-ИЦЦГ 2-оксоглутаратом и глутаматом. Предложен биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y.lipolytica. Ключевая роль отводится регуляции НАД-ИЦДГ уровнем АМФ и соотношением НАДН/НАД+ в клетках.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований создано представление о механизмах тонкой регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y.lipolytica, которое может бьггь использовано для разработки или усовершенствования процессов промышленного получения лимонных или кетокислот дрожжами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конкурсе научных работ ИБФМ РАН, декабрь 1995 г.; на конференциях молодых ученых г.Пущино в мае 1996 г. и апреле 1998 г.; на Втором съезде Биохимического общества, г.Москва, май 1997г.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Солодовникова, Наталия Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Исследование динамики внутриклеточного содержания адениловых и пиридиновых нуклеотидов при выращивании дрожжей Yarrowia lipolytica на глюкозе показало, что лимитирование роста дрожжей источником азота приводит к снижению общего пула нуклеотидов и увеличению соотношений АТФ/АМФ и НАДН/НАД*. Это свидетельствует о повышенном энергетическом и восстановительном потенциале клеток дрожжей в условиях сверхсинтеза лимонных кислот.

2. Лимитирование роста дрожжей Yarrowia lipolytica тиамином вызывает снижение соотношений АТФ/АМФ и НАДН/НАД+. Наблюдаемый в этих условиях сверхсинтез кетокислот происходит при низком энергетическом и восстановительном потенциале клеток.

3. Лимитирование роста дрожжей Yarrowia lipolytica источником азота вызывает переключение пути ассимиляции ионов аммония с глутаматдегидрогеназного на глутаминсинтетазный, по-видимому, в связи с существенно более высоким сродством последнего к ионам аммония. Повышение активности НАД1"-глутаматдегидрогеназы говорит б переключении клеток дрожжей на утилизацию эндогенных источников азота. Изучение субклеточного распределения ферментов азотного метаболизма выявило преимущественную цитозольную локализацию процессов ассимиляции и диссимиляции ионов аммония.

4. Для выяснения механизма сверхсинтеза органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica проведена очистка НАД+-зависимой из о цитр атдегидр о геназ ы и изучены ее свойства. Фермент имеет молекулярную массу 412 кДа и состоит из восьми субъединиц с молекулярной массой 52 кДа каждая. Установлено отсутствие

йнгибирования фермента 2-оксоглутаратом и глутаматом, а также физиологическими концентрациями АТФ. Фермент обладает низким сродством к аллостерическому активатору АМФ.

5. На основании полученных результатов предложен механизм регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Уаггочча 1гро1уИса. Ключевую роль в регуляции потока углерода (либо сверхсинтез цитрата и изоцитрата, либо превращение последнего в 2-оксоглутарат и сверхсинтез этого продукта) занимает НАД^-зависимая изоцитратдегидрогеназа. Активность фермента в условиях сверхсинтеза органических кислот регулируется уровнем АМФ и оотношением НАДН/НАД+ в клетках.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Солодовникова, Наталия Юрьевна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М.: Наука. 1989. 262 с.

Глазунова Л.М. и Финогенова Т.В. Активность ферментов цитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при синтезе лимонных кислот Candida lipolytica. Микробиология. 1976. Т.45. С.444-449.

Евстигнеева 3. Индукция глутаминсинтетазы аммонием и локализация ее в хлоропластах и цитозоле листьев гороха. Докл. АН СССР. 1977. Т.237. С.962-964.

Ермакова И.Т. и Финогенова ТВ. Участие глиоксилатного цикла в обмене веществ алкан-окисляющих дрожжей Candida lipolytica при биосинтезе а-кетоглутарата. Микробиология. 1971. Т.40. С.223-230.

Ермакова ИТ., Ермоленко Е.А., Финогенова Т.В. Биосинтез кетокислот тиаминауксотр о фны м и дрожжевыми организмами при использовании различных источников углерода. Прикл. биохимия и микробиология. 1986. Т.22. С.341-347.

Звягильская Р., Пер лова Н., Выскребенцева Э. Обнаружение аминотрансферазных активностей в митохондриях дрожжей E.magnusii. Биохимия. 1986. Т.51. С. 1315-1321.

Звягильская Р. Митохондрии дрожжей: отличительные свойства, вклад в решение общих проблем биоэнергетики. Прикл. биохимия и микробиология. 1995. Т.31: С.50-59.

Иванов В.Н. Энергетика роста микроорганизмов. Киев: Наукова думка. 1981. 140 с.

Катаева И.А., Ермакова И.Т., Финогенова Т.В. Активности тиаминзависимых ферментов у дрожжей Candida lipolytica при росте на глюкозе в условиях избытка и недостатка тиамина. Микробиология. 1986. Т.55. С.559-563.

Катаева И.А. и Финогенова Т.В. Активность ферментов основных путей обмена глюкозы в клетках тиаминдефицитных дрожжей Candida lipolytica при синтезе кетокислот. Биохимия. 1987. Т.52. С.850-855.

Козлова Т.М., Медведева Г.А., Глазунова JI M., Финогенова Т.В. О структурных изменениях клеток Candida lipolytica при биосинтезе лимонной кислоты.

Микробиология. 1982. Т.51. С.508-514.

Лозинов А.Б., Глазунова Л.М., Ермакова И Т. Активность ферментов цитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при росте дрожжей на гексадекане и глюкозе. Микробиология. 1976. Т.35. С. 33-39.

Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Лиепиньш Г.К., Кальниньш З.А., Слава В.А., Якобсон Ю.О., Пелцмане И.Ж. Накопление кетоглутаровой кислоты на средах с парафинами при культивировании дрожжей рода Candida. В сб.: Получение и применение аминокислот. Рига: Зинатне, 1970. С.51-55.

Лозинов А.Б. и Финогенова Т.В. Микробиологический синтез органических кислот из углеводородов нефти. Журнал ВХО им.Менделеева. 1972. Т. 17. С.526-532.

Лозинов А.Б., Финогенова Т В., Глазунова Л.М., Илларионова В.И. Лимитирование роста культуры Candida lipolytica и сверхсинтез некоторых метаболитов. Микробиология. 1974. Т. 43. С.786-790.

Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т 2. 1980. М.: Мир. Пер. с англ. 606 с.

Моргунов И.Г. Пути биосинтеза кетокислот из глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica. Канд.диссертация. 1994. ИБФМ РАН. Пущино.

Моргунов И.Г., Шарышев A.A., Микулинская О.В., Соколов Д.М., Финогенова Т.В. Выделение, очистка и некоторые свойства цитрат-синтазы дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica продуцентов лимонной кислоты. Биохимия. 1994. Т.59. С.975-981.

Мунтян Л.Н. Содержание тиаммина в клетках Candida lipolytica при выращивании на глюкозе и глицерине. Микробиология. 1971. Т.40. С. 1005-1009.

Мунтян Л.Н., Илларионова В.А., Финогенова Т В. Потребность в некоторых витаминах группы В дрожжей рода Candida, способных окислять н-алканы. Прикл.биохимия имикробиол. 1971. Т.7. С.410-415.

Пескова Е.Б., Шарышев A.A., Финогенова Т.В. Исследование внутриклеточной организации азотного метаболизма у дрожжей Yarrowia lipolytica и Candida maltosa. Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т.32. С.421-426.

Скоупс Р. Методы очистки белков. Пер. с англ. М.: Мир. 1985. 358 с. Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев A.A., Финогенова Т.В. Роль НАД-зависимой юоцитратдегидрогеназы в биосинтезе лимонной кислоты у дрожжей. Прикл.биохимия и микробиол. 1995а. Т.31. С.315-320.

Соколов Д.М., Шарышев A.A., Финогенова Т.В. Особенности субклеточной локализации ферментов метаболизма глюкозы у разных групп дрожжей. Биохимия. 19956. Т.60. С. 1731-1739.

Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев A.A., Финогенова Т.В. Роль фосфофруктокиназы в регуляции синтеза лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica. Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. С.315-319.

Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. Общие принципы торможения. М.: Мир. 1966. Пер. с англ. 862 с.

Финогенова Т.В. Биосинтез органических кислот дрожжевыми организмами и его регуляция. Докт. диссертация. 1982. ИБФМ АН СССР. Пущино.

Финогенова Т.В. Сверхсинтез метаболитов у дрожжей и его регуляция. В сб.: Метаболизм алканов и сверхсинтез продуктов микроорганизмами. Пущино. 1991. С.96-114.

Финогенова Т.В., Беликов В.М., Ермакова И.Т., Мунтян Л.Н., Лидеман Л.Ф., Корчемная ЦБ., Лозинов А.Б. Образование органических кислот при окислении н-

парафинов дрожжевыми организмами. Прикл. биохимия и микробиология. 1966. Т.2. С.156-162.

Финогенова Т В., Илларионова В.И., Лозинов А.Б. Оразование лимонных кислот дрожжами Candida lipolytica при росте на //-алканах. Микробиология. 1973. Т.42. С.790-794.

Финогенова Т.В., Лозинов А.Б., Беликов В.М., Ермакова ИТ., Мунгян Л.М, Сафонова Э.Н. Образование кетокислот парафинокисляющими дрожжами. Микробиология. 1968. Т.37. С.38-43.

Финогенова Т.В., Мунтян Л.Н., Лозинов А.Б. Относительно потребности в тиамине дрожжей рода Candida, выращиваемых на углеводном и углеводородном питании. Микробиологический синтез. 1969. Т.7. С.26-30.

Финогенова ТВ., Шишканова Н.В., Катаева И.А. Сравнительное изучение дрожжей С.lipolytica с различной способностью продуцировать цитрат. Микробиология. 1989. Т.58. С.387-392.

Шатилов В. Глутаматдегидрогеназы.Итоги науки и техники. Сер. "Биол. химия". 1987. Т.24. С.5-86.

Шишканова Н.В. Цитологическая перестройка дрожжевых клеток в условиях сверхсинтеза кислот. В сб.: Метаболизм алканов и сверхсинтез продуктов микроорганиизмами. Пущино. 1991. С. 126-131

Atkinson D.E., Hathaway J. A., Smith Е.С. Kinetics of regulatory enzymes. J. Biol. Chem. 1965. V.240. P.2682-2690

Atkinson D.E. Cellular energy metabolism and its regulation. New York, San Francisco & London: Academic Press. 1977. 327 p.

Barnes L.D., Kuelni G.D., Atkinson D.E Yeast diphosphopyridine nuclejtide specific isocitrate dehydrogenase. Purification and some properties. Biochemistry. 1971. V. 10. P.3939-3944.

Barnes L.D., McGuire J.J., Atkinson D.E. Yeast diphosphopyiidine nucleotide specific isocitrate dehydrogenase. Regulation of activity and unidirectional catalysis. Biochemistry; 1972. V.ll. P.4322-4329.

BarthG., Gaillardin C. Physiology and genetics of dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol. Reviews. 1997. V. 19. P.219-237.

Bemofsky C., Swan M. An improved cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotide. Analitical biochemistry. 1973. V.53. P.452-458.

Botham P.A.and Ratledge C. A biochemical explanation for lipid accumulation in Candida 107 and other oleaginouse micro-organisms.J. Gen. Microbiol. 1979. V. 114. P.361-375.

Boulton C.A. and Ratledge C. Correlation of lipid accumulation in yeasts with possession of ATP:citrate lyase. J. Gen. Microbiol. 1981. V. 127. P. 169-176.

Boulton C.A. and Ratledge C. Use of transition studies in continuous culture of Lipomyces star key i, an oleaginous yeast, to investigate the physiology of lipid accumulation. J. Gen. Microb. 1983. V. 129. P.2871-2876.

Brown C. Nitrogen metabolism in bacteria and fungi. In: Continious culture: applications and new fields. Horwood. 1976. P. 179-183.

Brown C. Ammonium assimilation and utilization in bacteria and fungi. In: Microorganisms and nitrogen sources. Ed. Payne J., N.-Y.: I.Wiley aud Sons Ltd. 1980. P.511-535.

Burkholder P.R., McVeigh J., Moyer D. Vitamin deficiencies in yeasts. J. Bacterid. 1944. V. 48. P. 385-389.

Burn V., Turner P., Brown C. Aspects of iuorganic nitrogen assimilation in yeast. Ant. van Leewenhoek. 1974. V.40. P.93-102.

Camardella L. Nuclea and cytoplasmic glutamate dehydrogenases (NADP-dependent) in Saccharomyces cerevisiae. Biochem.Biophys. Res. Comm. 1973. V.64. P.773-777.

Choudary V., Rao G. Molecula basis of nitrate reductase induction in Candida utilis. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1976. V.72. P.598-602.

Cupp J.R., McAlister-Henn L. Cloning and characterization of the gene encoding the IDH1 subunit of NAD-dependent isocitrate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 1992. V.267. P. 16417-16423.

Cupp J.R. & McAlister-Heim L. Kinetic analysis of NAD+-isocitrate dehydrogenase with altered isocitrate binding sites: contribution of IDH1 & IDH2 subunits to regulation and catalysis. Biochemistry. 1993. V.32. P.9323-9328.

Estabrook R.W.. Williamson J.R., FrenkelR., Maitra P.K The fluorimetric determinatin of mitochondrial adenine and pyridine nucleotides. Methods in ezymology. 1968. V.12. P.474-482.

Evans C.T. and Ratledge C. The role of the mitochondrial NAD+:isocitrate dehydrogenase in lipid accumulation by the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides CBS 14. Can. J. Microbiol. 1985a. V.31. P.845-850.

Evans C.T. and Ratledge C. Possible regulatory role of ATP:citrate lyase, malic enzyme and AMP deaminase in lipid accumulation by RJiodosporidium CBS 14. Can. J. Microbiol. 1985b. V.31. P. 1000-1005.

Evans C.T. and Ratledge C. The physiological significance of citric acid in the control of metabolismin lipid-accumulating yeasts. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1985c. V.3. P.85-111.

Evans C.T., Scragg A.H. and Ratledge C. Regulation of of citrate efflux from mitochondria of oleaginous and non-oleaginous yeasts by adenine nucleotides. Eur. J. Biochem. 1983. V.132. P.609-615.

Forest W.W. Adenosine triphosphate pool during the growth cycle in Streptococcus faecalis. J. Bacterid. 1965. V.90. P. 1013-1018.

Gabriel J., Plaut G. Structural requirements for the binding of AMP to the allosteric site of NAD-specific isocitrate dehydrogenase from baker's yeast. Biochemistry. 1990. V.29. P.3528-3533.

Gabriel J.L., Plaut C.W.E. Kinetic regulation of yeast NAD-specific isocitrate dehydrogenase by citrate. Biochemistry. 1991. V.30. P.2594-2599.

Goldin B , Frieden C. Glutamate dehydrogenases. Curr. Topics. Cell. Regul. 1974. V.4. P. 169-172.

Gonzalez B , Francois J., Renaud M. A rapid and reliable methods for metabolite extraction in yeast using boihng buffered ethand. Yeast. 1997. V.13. P.1347-1356.

Hathaway J.A. and Atkinson D.E. The effect of adenine acid on yeast nicotinamide adenine dinucleotide isocitrate dehydrogenase, a possible metabolic control mechanism. J. Biol. Chem. 1963. V.238. P.2875-2881.

Hollenberg C., Riks W., Borst P. The glutamate dehydrogenases of yeast extramitohondrial enzymes. Biochim. Biophys. Acta. 1970. V.201. P. 13-20.

Johnson B., Brown C. The enzymes of amrninia assimilation in Schizosaccaromyces spp. and Sacckaromyces luchvigii. J. Gen. Micribiol. 1974. V.85. P. 169-172.

Keys D.A. & McAlister-Henn L. Sub unit structure, expression and function of NAD(H)-specific isocitrate dehydrogenase in Saccharornices cerevisiae. J. Bacteriol. 1990. V.172. P.4280-4287.

Kimmicli G.A., Randless J., Brand IS. Assay of picomole amount of ATP, ADP, and AMP using the luciferase enzyme system. Analytical biochemistry. 1975. V.69. P. 187-206.

Knowles C.J. Microbial metabolic regulation by adenine nucleotide pools. Symposia Society General Microbiology. 1977. V.27. P.241-283.

Romberg A. and Pricer W.E.J. Di and triphosphoridine nucleotide isocitrate dehydrogenase in yeast. J. Biol. Chem. 1951. V.189. P. 123- 126.

Ruby S.A., Noltmann E.A. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (cristalline) from brewer's yeast. Methods enzymol.. Ed. Wood W.A., New York & London: Academic Press. 1969. V.9. P. 116-125.

Ruehn G.D., Barnes L.D. & Atkinson D.E. Yeast diphosphopyiidine nucleotide specific isositrate dehydrogenase. Binding ofLigancls. Biochemistry. 1971. V.10. P.3945-3951.

Large P. Degradation of organic nitrogen compounds of yeast. Yeast. 1986. V.2. P. 1-34. London J. & Knight M. Concentration of nicotinamide nucleotide coenzymes in micro-organisms. J.Gen.Microbiol. 1966. V.44. P.241-254.

Lundin A., Thore A. Comparison of methods for extraction of bacterial adenine nucleotides determined by firefly assay. Appl. Microbiol. 1975. V.30. P.713 -721.

Marchal R., Vahdecasteele J.P. and Metche M. Regulation of central metabolism in relation to citric acid production in Sccharomycopsis lipolytica. Arch. Microbiol. 1977. V.133. P.99-104.

Marsluf G. Regulation of nitrogen metabolism and gene expression in fungi. Microbiol. Review. 1981. V.45. P.437-461.

Massey V. Fumarase. Methods Enzymol., Ed. Colowick S.P. and Kaplan N.O., New York: Academic Press. 1955. V.l. P.729-733.

Miflin B., Lea P. Ammo acid metabolism. Ann. Rev. Plant Physiol. 1977. V.28. P.299-329.

Miller R., Stadman E. Glutamate synthase from E.coli. J. Biol. Chem. 1972. V.247. P. 7407-7419.

Mitshushima K., Shinmyo A. and Enatsy T. Control of citrate and 2-oxoglutarate formation in Candida lipolytica mitochondria by adenine nucleotides. Biochem. Biophis. Acta. 1978. V.538. P.481-492.

Nichols B.J., Rigoulet M. & Denton R.M. Comparison of the effects of Ca2+, adenine nucleotides and pH on the kinetic properties of mitochondrial NAD:isocitrate dehydrogenase and oxoglutarate dehydrogenase from the yeast Saccharomices cerevisiae and rat heart. Biochem. J. 1994. V.303. P. 461-465.

Perlman P., Mahler H. Intracellular localization of enzymes in yeast. Arch. Biochem. Biophys. 1970. V. 136. P.245-253.

Priest F., Campbell I. The biochemistry and physiology of yeast growth. In: Brewing Microbiology, N.-Y., L.: Acad. Press. 1990. P. 137-139.

Reader V. The relation of the growth of certain microorganisms to the composition of the medium. J. Biochem. 1927. V.21. P.901-905.

Reardon J., Foreman.., Seary R.L. New reactants for the colorimetric determination of ammonia. Clin.Cliim. Acta. 19,66. V.14. P.403-405.

Slayman C.L. Adenine nucleotide levels in Neurospora, as influenced by condition of growth and by metabolic inhibitors. J. Bacteriol. 1973. V. 114. P.752-766.

Shatilov V.R., Kretovich W.L. The metabolism of L-aspartate in Candida utilis. Mol. Cell. Biochem. 1975. V. 15. P.201-212.

Tempest D. Glutamine (amide): 2-oxoglutarate amino transferase oxido-reductase (NADP), an enzyme involved in the synthesis of glutamate by sqme bacteria. J. Gen. Microbiol. 1970. V.64. P.187-193.

Ting H.Y., Jacobson E.L., Jacobson M.K. Regulation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate leveles in yeast. Arch. Bichem.Biophis. 1977. V. 183. P.98-104.

Wagner T.Ch. & Scott M.D. Singl extraction method for the spectrophotometric quantification of oxidized and reduced pyridine nucleotides in erytrocytes. Analitical biochemistiy. 1994. V.222. P. 417-426.

Wimpenny J.W.T & Firth A. Levels of nicotinamide adenine dinucleotide and reduced nicotinamide adenine cliuucleotide in facultative bacteria and the effect of oxygen. J. Bacterid. 1972. V. 111. p.24-32.

Yoshino M. and Murakami K. In situ studies AMP deaminase as a control system of the adenylate energy charge in yeast. Biochim. and Biophys. Acta. 1981. V.672. P.16-20.

Zwart K. Significance of microbodies in metabolism of L-aspartate in Candida utilis. FEMS Microbiol. Lett. 1983. V.l 9. P.273-278.

Выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям Татьяне Васильевне Финогеновой и Андрею Алексеевичу Шарышеву за постоянную поддержку и внимание, Александру Григорьевичу Меденцеву, Игорю Григорьевичу Моргунову, Игорю Александровичу Сидорову, Александру Павловичу Соколову, Надежде Васильевне Шишкановой за помощь в работе и ценные советы.