Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к стрессовым воздействиям тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Бирюкова, Елена Николаевна

• Бирюкова, Елена Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бирюкова, Елена Николаевна

Список сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Состояние вопроса.

1.3 Цель и задачи исследования.

1.4 Научная новизна.

1.5 Практическая значимость.

1.6 Апробация работы.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Окислительный стресс.

1.1. Источники АФК.

1.2. Механизм действия АФК.

1.3.3ащитные системы против окислительного стресса.

1.3.1. Антиоксидантные системы.

Альтернативные переносчики электронов (терминальные оксидазы).

Образование изоформ ферментов.

1.3.4. Системы, поддерживающие редокс-потенциал в клетке.

1.3.5. Системы, восстанавливающие повреждения.

1.3.6. Полиамины в защите клеток от окислительного стресса.

1.4. Регуляция генной экспрессии антиоксидантных систем.

Глава 2. Тепловой стресс.

2.1. Белки теплового шока.

2.2. Регуляция синтеза белков теплового шока.

2.3. Убиквитин.

2.4. Белки общего стрессорного ответа.

2.5. Трегалоза.

2.6. Спирты, участвующие в защите клеток от теплового воздействия.

Глава 3. Этанольный стресс.

3.1. Влияние этанола на плазматическую мембрану.

3.2. Метаболизм этанола.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Микроорганизмы и условия выращивания.

4.2. Определение активности дыхания.

4.3. Создание стрессовых условий.

4.4. Определение выживаемости клеток.

4.5. Определение влияния рН на выживаемость клеток.

4.6. Экстракция и определение цАМФ.

4.7. Получение бесклеточных экстрактов.

4.8. Определение супероксиддисмутазы.

4.9. Определение каталазы.

4.10. Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

4.11. Определение глутатионредуктазы.

4.12. Определение НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы.

4.13. Определение белка.

4.14. Ультратонкие срезы клеток

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Адаптация Y. lipolytica к действию оксидантов.

5.1. Выживаемость клеток в зависимости от действия оксидантов (Н202, менадиона и юглона).

5.2. Перекрёстная устойчивость Y. lipolytica к различным оксидантам.

5.3. Активность антиоксидантных ферментов Y. lipolytica.

Глава 6. Адаптация Y. lipolytica к действию температуры.

6.1 Выживаемость Y. lipolytica после воздействия температуры.

6.2. Перекрёстная устойчивость клеток к различным стрессам.

6.3 Влияние рН на термоустойчивость Y. lipolytica.

6.4. Активность антиоксидантных ферментов Y. lipolytica в условиях теплового стресса.

Глава 7. Адаптация Y. lipolytica к действию этанола.

7.1 Выживаемость клеток после воздействия этанола.

7.2 Перекрёстная устойчивость клеток к различным стрессам.

7.3 Активность антиоксидантных ферментов в условиях этанольного стресса.

Глава 8. Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях окислительного теплового и этанольного стрессов.

8.1 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях окислительного стресса.

8.2 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях теплового стресса.

8.3. Участие альтернативной оксидазы в адаптивном ответе клеток на окислительный и тепловой стрессы.

8.4 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях этанольного стресса.

8.5 Участие альтернативной оксидазы в адаптивном ответе клеток на действие этанола.

Глава 9. Изменение динамики внутриклеточного пула цАМФ при воздействии оксидантов, температуры и этанола.

Глава 10. Изучение изменений ультраструктуры клеток Y. lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов.

10.1. Ультраструктура клеток из различных фаз роста.

10.2. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях окислительного стресса.

10.3. Ультраструктура клеток К lipolytica в условиях теплового шока.

10.4. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях этанольного стресса.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к стрессовым воздействиям»

1. Актуальностьпроблемы.

В природных экосистемах микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды (стрессоров). К ним относится: недостаток элементов питания, активные формы кислорода (АФК), неоптимальная температура, рН, ионная сила, наличие ионов тяжёлых металлов, высокая концентрация этанола, высушивание, воздействие токсических метаболитов растительного, микробного и антропогенного происхождения (Ruis and Schuller, 1995). Понятием «стресс» определяют общий комплекс неспецифических компенсаторно-приспособительных процессов, развивающихся у организмов в ответ на воздействие стрессоров.

Первичный ответ микробной клетки направлен на то, чтобы нивелировать сдвиги внутриклеточного равновесия и обеспечить выживание. Если клетка не способна преодолеть стресс, возможно возникновение сигналов, приводящих к глобальным изменениям метаболизма, вызывающим повреждение мембран, денатурацию и агрегацию клеточных белков (Svensater et al., 2000).

Обязательным признаком стрессового состояния является его обратимость, возможность возврата к нормальному функционированию при соответствующих изменениях факторов окружающей среды (Феофилова, 2003).

Исследование адаптационных механизмов у микроорганизмов особенно актуально, поскольку именно в стрессовых условиях они способны осуществлять процессы, важные для человека, такие как детоксикация вредных соединений, синтез и накопление различных метаболитов (антибиотиков, токсинов, пигментов и др.).

В отличие от высших организмов, микроорганизмы ограничены в выборе своего микроокружения, но способны включать специальные реакции в ответ на изменения окружающей среды, что обеспечивает им выживание и конкурентоспособность по отношению к другим организмам. Кроме того, вследствие более примитивной организации и отсутствия промежуточных стадий регуляции микроорганизмы являются удобным объектом исследований, поскольку обладают высокой адаптационной способностью и выживаемостью в стрессовых условиях (Плакунов и др., 2004).

На данный момент различные аспекты адаптации к стрессовым воздействиям изучены для сравнительно ограниченного числа микроорганизмов. Исследования в основном проводились на бактериях Е. coli и дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а также фрагментарно - на Candida albicans и грибах - Neurospora crassa.

Объектом данного исследования были выбраны дрожжи Y. lipolytica, поскольку они являются продуцентами многих практически ценных соединений (органических кислот, липаз, цитохрома с и др.). Кроме того, Y. lipolytica представляют собой классическую модель для изучения энергетического обмена клеток - их митохондриальная дыхательная цепь содержит три пункта сопряжения, в чём сходна с дыхательной цепью животных и растительных клеток.

1.2. Состояние вопроса

В последние годы всё большее внимание исследователей привлекает двойственная роль, которую играет кислород в живых организмах, и которая получила название «парадокс кислорода». Для большей части современных организмов кислород является обязательным и ничем не заменимым компонентом окружающей среды. Это связано с ключевой ролью кислорода, которую он играет в энергетике клеток, являясь конечным акцептором электронов в дыхательной цепи. Организованный и управляемый поток электронов по дыхательной цепи от субстратов к кислороду составляет основу одного из самых эффективных молекулярных механизмов, выработанных организмами в процессе эволюции для получения энергии. С другой стороны, в процессе дыхания в результате неполного восстановления кислорода образуются АФК, включая Н2О2, 0{ и ОН". АФК высоко токсичны для клетки т.к. вызывают окисление липидов (Imlay et al., 1988), белков (Jamieson, 1995) и ДНК (Ruis and Schuller, 1995). Было высказано предположение (Piper,

1995), что действие стрессора может быть связано с нарушением митохондриальной цепи переноса электронов. Дыхательная активность клеток грибов в стрессовых условиях практически не изучена.

Влияние АФК на организмы неоднозначно. В последнее время механизмы окислительного стресса привлекают интерес исследователей, прежде всего, из-за его широко признанной роли в этиологии как «нормального» старения, так и серьёзных патологий, представляющих собой актуальную проблему для здравоохранения (Skulachev,

1996). У грибов Neurospora crassa (Белозерская и др., 2006) и миксомицетов Dictiostelium discoideum (Bloomfield and Pears, 2003) показано, что АФК играют роль сигнальных молекул, необходимых для цитодифференцировки на определенных этапах развития организма.

Несмотря на наличие в литературе отдельных фактов, указывающих на влияние окислительного стресса на организмы, процессы адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу в настоящее время (особенно у дрожжей с аэробным типом обмена) изучены недостаточно и требуют дальнейшего исследования.

Важным фактором для сохранения жизнеспособности живых существ является температура. Резкие колебания температуры окружающей среды в сторону понижения или повышения являются обычным явлением в жизни микроорганизмов и сопровождаются значительными изменениями скорости роста, дыхания и всех метаболических процессов.

Этанол при высоких концентрациях способен подавлять физиологическую активность S. cerevisiae (Piper, 1995). Токсичность этанола и других спиртов связана с их способностью: подавлять биосинтез макромолекул (Ingram et al., 1984); денатурировать белки цитоплазмы (Mishra, 1993); снижать активность гликолитических ферментов (Costa et al., 1993); нарушать транспортные процессы ионов и метаболитов через плазматическую мембрану (Jones et al., 1989); изменять липидный состав мембран (van Uden, 1985). Данные о влиянии этанола на жизнеспособность и дыхательную активность дрожжей в настоящее время практически отсутствуют.

Таким образом, процесс адаптации дрожжей к стрессовым воздействиям на данный момент изучен в основном на S. cerevisiae, фрагментарно на Candida albicans и Neurospora crassa. Исследования стрессовых состояний у дрожжей необходимы для лучшего понимания особенностей биологии дрожжей.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Бирюкова, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Определена устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов. Найдены пути повышения выживаемости клеток: мягкая тепловая «закалка», предобработка клеток нелетальными дозами оксидантов или этанола. Показана перекрёстная устойчивость дрожжей к различным стресс-факторам.

2. Изучение дыхательной активности клеток в стрессовых условиях выявило участие альтернативной цианидрезистентной оксидазы в адаптивном ответе клеток. Альтернативный путь переноса электронов более устойчив к стрессовым воздействиям по сравнению с основной, цитохромной, дыхательной цепью.

3. Установлено, что в ответ на любое стрессовое воздействие в клетках происходит увеличение активностей антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы) и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы.

4. Во всех изученных стрессовых условиях обнаружены существенные изменения ультраструктурной организации клеток: увеличение размера митохондрий, возрастание количества и размеров пероксисом; накопление полифосфатных гранул, а также изменение цитоплазматической мембраны - образование инвагинаций (этанольный стресс) или глобулярных структур (окислительный и тепловой стрессы).

5. Показано снижение внутриклеточного уровня цАМФ у Y. lipolytica при различных стрессовых воздействиях, что коррелирует с увеличением активности антиоксидантных систем и НАД+зависимой алкогольдегидрогеназы. Однотипность стрессового ответа при повышении устойчивости клеток предполагает наличие общего центра активации защитных механизмов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бирюкова, Елена Николаевна, 2007 год

1. Абызов С.С., Мицкевич И.Н. (1993) Микрофлора континентальных и морских льдов Антарктики (к проблеме использования айсбергов как ресурсов пресной воды). Микробиология, 62, №6,994-998.

2. Андреев А.Ю., Кушнарёв Ю.Е., Старков А.А. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия, 70, вып. 2,246-264.

3. Баснакьян И.А. (2003) Стресс у бактерий. М. Медицина, 136.

4. Белозерская Т.А., Гесслер Н.Н. (2006) Окислительный стресс и дифференцировка у Neurospora crassa. Микробиология, 75, № 4, 497-501.

5. Брюханов A.JL, Нетрусов А.И. (2004) Каталаза и супероксиддисмутаза: распространение, свойства и физиологическая роль в клетках строгих анаэробов. Биохимия, 69, № 9,1170-1186.

6. Брюханов A.JL, Тауэр Р.К., Нетрусов А.И. (2002) Каталаза и супероксиддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов. Микробиология, 71, 330-335.

7. Гаенко Г.П., Решетников И.В., Дуда В.И., Плеханова И.О., Гусев М.В. (1985) Супероксиддисмутаза в спорах Clostridium butyricum. Микробиология, 54, 322-324.

8. Гусев Н.Б., Богачёва Н.В., Марстон С.Б. (2002) Структура и свойства малых белков теплового шока и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия, 67, № 5, 613623.

9. Закирова О.Н., Смирнова Г.В. (2001) Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на температурные стрессы. Тезисы V Международной конференции по проблемам загрязнения окружающей среды. Пермь, 21.

10. Ильченко А.П., Чернявская О.Г., Финогенова Т.В. (2005) Метаболизм этанола у дрожжей Yarrowia и Torulopsis. Прикладная биохимия и микробиология, 41, № 5, 487494.

11. Лианг J1.K., Вонг К.К., Жу K.JL, Ши З.М. (2006) Накопление трегалозы мутантным штаммом Saccharomycopsis fibuligera sdu не является стрессовым ответом. Биохимия, 71, вып. 12,1589-1596.

12. Меденцев А.Г., Акименко В.К. (1992) Влияние условий культивирования на биосинтез нафтохиноновых метаболитов грибом Fusarium decemcellulare. Микробиология, 61,5, 542-546.

13. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (2001) Адаптация фитопатогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу. Микробиология, 70, № 1, 1-5.

14. Меденцев А.Г., Баскунов Б.П., Акименко В.К. (1988) Образование нафтохиноновых пигментов грибами Fusarium decemcellulare и их влияние на метаболизм продуцента. Биохимия, 53, № 3,413-423.

15. Меденцев А.Г., Акименко В.К. (1999) Развитие и активация цианидрезистентного дыхания у дрожжей Yarrowia lipolytica. Биохимия, 64, № 8,1123-1131.

16. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (2001). Содержание цАМФ в условиях индукции альтернативной оксидазы в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica. Микробиология, 70, № 1,29-33.

17. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. (1993) Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов. Успехи современной биологии, 113,4,442-452.

18. Николаев Ю.А. (2004) Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды. Прикладная биохимия и микробиология, 40, № 4, 387-397.

19. Плакунов В.К., Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В. (2004) Множественный стресс у микроорганизмов зло или благо? Юбилейный сборник к 70-летию института Микробиологии им. С.Н. Виноградского, 361-375.

20. Реммель Н.М., Титова В.А., Кратасюк В.А. (2003) Мониторинг окислительного стресса в биологических образцах биолюминисцентным методом. Бюлл. эксп. биол. и мед., 136, №8, 238-240.

21. Сингх Н.Н. (1995) Начальные этапы окисления первичных спиртов в клетках дрожжей, растущих на различных субстратах. Автореферат дис. канд. биол. наук. Пущипо: ИБФМ РАН, 19.

22. Смирнова Г.В., Музыка Н.А., Красных Т.А. (2001) Роль антиоксидантных ферментов в ответе бактерий Escherichia coli на осмотический шок. Тезисы V Международной конференции по проблемам загрязнения окружающей среды. Пермь, 45.

23. Терешина В.М. (2005) Термоустойчивость у грибов: роль белков теплового шока и трегалозы. Микробиология, 74, № 3, 293-304.

24. Терешина В.М., Меморская А.С., Морозова Е.В., Козлова В.П., Феофилова Е.П. (2000) Изменения в составе углеводов цитозоля спор грибов в связи с температурой обитания и в процессе хранения. Микробиология, 69, № 4, 511-517.

25. Феофилова Е.П. (1992) Трегалоза, стресс и анабиоз. Микробиология, 61, № 5, 741754.

26. Феофилова Е.П., Терешина В.М. (1999) Термофилия мицелиальных грибов с позиций биохимической адаптации к температурному стрессу. Прикл. Биохим. и микробиол., 35, № 5,546-556.

27. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С., Хохлова Н.С. (2ООО) О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов. Микробиология, 69, №5, 612-619.

28. Терешина В.М., Полотебнова М.В., Феофилова Е.П. (1987) Активность трегалазы спор дикого штамма Cunninghamella japonica с пониженной способностью к синтезу трегалозы. Микробиология, 56, №. 5, 753-758.

29. Ткаченко А.Г., Пшеничников М.Р., Нустерова Л.Ю. (1999) Структурно-функциональные свойства ДНК как объект защитных функций путресцина в адаптации Escherichia coli к окислительному стрессу. Микробиология, 68,27-32.

30. Alexandre Н., Rousseaux I., and Charpentier С. (1993) Ethanol adaptation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Appl. Biochem, 20,173-183.

31. Arthur H. and Watson K. (1976) Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and the themophilic yeasts. J. Bacterial, 128, № 1, 56-68.

32. Barth G. and Gaillardin C. (1997) Physiology and genetics of dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMSMicrobiology Reviews, 19,219-237.

33. Barton J.K., Den Hollander J.A. and Hopfield J.J. (1982). Shulman R.G. 13C nuclear magnetic resonance study of trehalose mobilization in yaest spores. J. Bacteriol, 151, № 1, 177-185.

34. Beaven M. J., Charpentier C. and Rose A. H. (1982). Production and tolerance of ethanol in relation to phospholipids fatty acyl composition in Saccharomyces cerevisiae NCYC 431. J. Gen. Microbiol, 128,1447-1455.

35. Beers R. and Siser I.W. (1952) A spectrophotometric method for measuring breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 195, №1,276-289.

36. Belazzi T. (1991) Negative regulation of transcription of the Saccharomyces cerevisiae catalase T (CTT1) gene by cAMP is mediated by a positive control element. EMBO J., 10, 585-592.

37. Benaroudj N., Do Нее Lee and Goldberg A.L. (2001) Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. J. Biol. Chem, 276, № 26,24261-24267.

38. Bertsova Y.V., Bogachev A.V. and Skulachev V.P. (1997) Generation of protonic potential by the c/-type quinol oxidase of Azotobacter vinelandii. FEBS Lett., 414,369-72.

39. Bissinger P.H., Weiser R., Schanz M., Adam G., HartingA., and Ruis H. (1989) Control of Saccharomyces cerevisiae catalase T gene (CTT1) expression by nutrient supply via the RAS-cyclic AMP pathway. Mol. Cell Biol., 9, №5, 309-315.

40. Bloomfield G. and Pears C. (2003) Superoxide signaling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci., 116, № 16, 3387-3397.

41. Brambilla L., Cairo G., Sestili P., O'Donnel V., Azzi A., and Cantoni O. (1997) Mitochondrial respiratory chain deficiency leads to overexpression of antioxidant enzymes. FEBS Lett., 418,247-250.

42. Bray T.M. and Bettger W.J. (1990) The physiological role of zinc as an antioxidant. Free Radic. Biol. Med., 8,281-291.

43. Brehelin C., Mouaheb N., Verdoucq L., Lancelin J.M. and Meyer Y. (2000) Characterization of determinants of the specificity of arabidopsis thioredoxins h in yeast complementation. J.Biol.Chem., 275, № 41, 31641-31647.

44. Bruschi M., Hatchikian E.C., Bonicel J., Bovier-Lapierre G. and Couchoud P. (1977) The N-terminal sequence of Superoxide dismutase from the strict anaerobe Desulfovibrio desulfuricans. FEBS Lett., 16, 121-124.

45. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Kostrikina N.A. and Chernykh N.A. (1990) Thermoproteus uzoniensis sp. nov., a new extremely thermophilic archaebacterium from Kamchatka continental hot springs. Arch. Microbiol, 154, 556-574.

46. Boorstein W.R. and Craig E.A. (1990) Regulation of a yeast HSP70 gene by a cAMP responsive transcriptional control element. EMBO J., 9,2543-2553.51.5457,58.