Роль NEDD9 в регуляции онкогенной молекулярной сигнализации в эпителиальных опухолях яичников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Габбасов Рашид Тагирович

• Габбасов Рашид Тагирович
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Габбасов Рашид Тагирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпителиальный рак яичников: общие сведения

1.1.1. Клинические особенности ЭРЯ

1.1.2. Классификации злокачественных эпителиальных опухолей яичников: связь с концепциями этиологии и патогенеза ЭРЯ

1.2. Влияние иммунного микроокружения на развитие ЭРЯ

1.3. Молекулярные механизмы развития ЭРЯ

1.3.1. Участие белков фокальных контактов в развитии ЭРЯ

1.3.2. ЭРЯ и регуляция апоптоза: PI3K/AKT/mTOR каскад

1.3.3. ЭРЯ и регуляция клеточного деления: ERBB2-RAS-MAPK сигнальный путь

1.3.4. ЭРЯ и регуляция клеточного деления: Aurora-киназы

1.3.5. ЭРЯ, межклеточные контакты и эпителиально-мезенхимальный переход

1.3.6. STAT3: участие в воспалительных процессах и метастазировании ЭРЯ

1.4. МЕВВ9 как участник молекулярной сигнализации злокачественных новообразований

1.4.1. История открытия и названия NEDD9

1.4.2. Строение белка NEDD9

1.4.3. Участие NEDD9 в молекулярной сигнализации и развитии злокачественных патологий

1.4.3.1. Регуляция экспрессии NEDD9

1.4.3.2. NEDD9 как регулятор работы фокальных контактов и мишеней их сигнализации

1.4.3.3. NEDD9 как регулятор Aurora A киназы

1.4.3.4. NEDD9 и эпителиалъно-мезенхималъный переход

1.4.3.5. Участие NEDD9 в передвижении и злокачественных патологиях клеток системы иммунитета

1.4.3.6. NEDD9 и рак яичников

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Реактивы и оборудование

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Оборудование

2.2. Объекты исследований

2.2.1. In vivo мышиные модели ЭРЯ

2.2.1.1. Мыши, нокаутные по Nedd9

2.2.1.2. Мышиная модель спонтанного ЭРЯ

2.2.1.3. Сингенетическая мышиная модель ЭРЯ

2.2.2. Клеточные линии

2.3. Исследование влияния экспрессии NEDD9 на развитие спонтанного ЭРЯ in vivo

2.3.1. In vivo магнитно-резонансная томография

2.3.2. Исследование инфильтрации иммунных клеток в мышах при помощи проточной цитометрии

2.4. In vitro эксперименты на культурах клеток ЭРЯ человека и мыши

2.4.1. Исследование клеточной пролиферации

2.4.2. Исследование клеточной адгезии

2.4.3. Клеточная миграция и инвазия в градиенте ФБС

2.4.4. Исследование клеточной миграции на двумерной поверхности

2.4.5. Нокдаун гена NEDD9 в клетках ЭРЯ мыши и человека

2.4.6. Нокдаун генов STAT3, Fak и Src в клетках MOVCAR 5009 и иммунофлюоресцентный анализ

2.5. Сравнение влияния внутриопухолевой экспрессии NEDD9 на развитие ЭРЯ в с таковым в микроокружении опухоли

2.6. Исследование общей генной экспрессии в спонтанных опухолях мышей MISIIR-TAg

2.7. Иммунологические методы

2.7.1. Вестерн-блоттинг

2.7.2. Коиммунопреципитация

2.7.3. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток

2.8. Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Роль NEDD9 в развитии спонтанного ЭРЯ

3.1.1. Влияние делеции Nedd9 на развитие спонтанных опухолей яичников

3.1.2. Влияние делеции Nedd9 на молекулярную сигнализацию в опухолях MISIIR-TAg мышей

3.2. Влияние NEDD9, экспрессируемого в микроокружении опухоли, на развитие ЭРЯ

3.2.1. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на развитие опухолей яичников

3.2.2. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на молекулярную сигнализацию в опухолях яичников

3.2.3. Влияние делеции Nedd9 на инфильтративность клеток системы иммунитета

3.3. Влияние экспрессии NEDD9 в клетках первычных опухолей на развитие эпителиального рака яичников

3.3.1. Влияние делеции Nedd9 на агрессивность клеток ЭРЯ in vitro

3.3.2. Подтверждение in vitro наблюдений при помощи нокдауна Nedd9 в Nedd9+/+ клетках ЭРЯ

3.3.3. Влияние внутриклеточной делеции Nedd9 на агрессивность ЭРЯ in vivo

3.3.4. Влияние делеции Nedd9 в первичных опухолях на молекулярную

сигнализацию

3.4. Роль NEDD9 в регуляции активации и локализации STAT3 в клетках ЭРЯ

3.4.1. Регуляция активации и локализации БТЛТ3 в фокальных контактах клеток ЭРЯ

3.4.2. Исследование образования комплекса между рБТЛТ3Г705, ^ББЯ и рЕЛК1397

3.5. NEDD9 как регулятор генной экспрессии в контексте ЭРЯ

3.5.1. Влияние делеции Nedd9 на генную экспрессию в опухолях MISIIR-TАg мышей

3.5.2. Участие N£009 в экспрессии генов, регулируемых ЕОХЛ

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

AURKA (B, C) - Aurora A (B, C) kinase - киназа Aurora A (B, C) CAS - Crk-associated substrate - Crk-ассоциированный субстрат DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид E-cad - E-кадгерин

EGFR - epidermal growth factor receptor - рецептор эпидермального фактора роста

FAK - focal adhesion kinase - киназа фокальных контактов

GFP - green fluorescent protein - зелёный флюоресцентный белок

HDAC6 - histone deacetylase 6 - деацетилаза гистонов

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

JAK - Janus activated kinases - янус-активируемые киназы

MAPK - mitogen-activated protein kinase - митоген-активируемая

протеинкиназа

N-cad - N-кадгерин

NEDD9 - neural precursor cells expressed, developmentally downregulated 9 -экспрессирующийся предшествениками нейронов, понижающий экспрессию по мере развития

PBS - phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буфер Ser - серин

STAT3 - signal transducer and activator of transcription 3 - трансдуктор

сигналов и активатор транскрипции

Tyr - тирозин

Thr - трионин

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВКМ - внеклеточный матрикс

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

киРНК - короткие интерферирующие РНК

кОТ-ПЦР - количественная обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция

кшРНК - короткошпилечные РНК

МО - микроокружение опухоли

МРТ - магнитно-резонансная томография

(Н)РТК - (не)рецепторная тирозинкиназа

ОЯ - опухоли яичников

ОМЖ - опухоли молочных желез

ПААГ - полиакриламидный гель

ПР - первичная ресничка

ПФА - параформальдегид

ПЭЯ - поверхностный эпителий яичников

РМЖ - рак молочной железы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РШМ - рак шейки матки

ТКР - Т-клеточный рецептор

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФК - фокальный контакт

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход

ЭРЯ - эпителиальный рак яичников

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль NEDD9 в регуляции онкогенной молекулярной сигнализации в эпителиальных опухолях яичников»

Актуальность проблемы

Ежегодно рак яичников (РЯ) диагностируется у более чем 220 тысяч женщин в мире, и уносит жизни около 140 тысяч из них (Siegel et al., 2013). В Российской Федерации РЯ выявляют примерно у 11 тысяч женщин в год, причём отмечается прирост заболеваемости (Савельева и др., 2009). По показателю летальности РЯ находится на первом месте среди всей онкогинекологической патологии (Siegel et al., 2013).

До 90% случаев РЯ имеют эпителиальную природу (Савельева и др., 2009), поэтому основная доля смертности от данного заболевания связана именно с карциномой, или эпителиальным раком яичников (ЭРЯ). Средняя пятилетняя выживаемость больных ЭРЯ не превышает 40% (Banerjee and Kaye, 2013), а на поздних стадиях может составить менее 20% (Kim et al., 2012a). Высокая летальность ЭРЯ связана с рядом факторов, среди которых можно выделить отсутствие надёжных методов ранней диагностики, низкую эффективность применяемых сегодня способов лечения и почти полную невозможность заранее спрогнозировать развитие заболевания (Vaughan et al. 2011, Kim et al., 2012). Для улучшения качества борьбы с карциномой яичников необходимо более глубокое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе развития данной патологии.

В числе белков, активно изучаемых в настоящее время в контексте биологии злокачественной патологии, находится скаффолд-протеин NEDD9. Показано, что изменённая - как правило, повышенная - экспрессия NEDD9 способствует онкогенезу и повышает агрессивность клеток ряда солидных и гематологических злокачественных опухолей (Shagisultanova et al., 2015). NEDD9 принимает участие во множестве молекулярных процессов как в нормальных, так и раковых клетках. Известно, что данный белок регулирует работу фокальных контактов и экспрессию E-кадгерина, и таким образом может участвовать в миграции и инвазии раковых клеток (O'Neill et al., 2007, Tikhmyanova and Golemis, 2011). Также NEDD9 контролирует активность

протеинкиназы B, регулирующей апоптоз (Tikhmyanova et al., 2010). Кроме того, NEDD9 участвует в клеточном делении, опосредованно регулируя экспрессию и активность ERK, одной из митоген-активируемых киназ, и связываясь с киназой Aurora A, участвующей в клеточном делении (Tikhmyanova et al., 2010, Ice et al., 2013).

В последние два десятилетия развилось представление о клеточно-молекулярном микроокружении опухоли, в частности о клетках системы иммунитета, как интегральной части опухоли яичников, принимающей участие как на ранних стадиях развития заболевания, так и в процессе метастазирования (Tsai et al., 2014). В связи с этим, особый интерес представляют данные об участии NEDD9 в миграции и хемотаксисе Т- и B-лимфоцитов (Minegishi et al., 1996, Manie et al., 1997).

Несмотря на имеющиеся сведения об онкогенности NEDD9 в различных видах рака, на момент написания настоящей работы механизмы участия NEDD9 в опухолях яичников неизвестны. В связи с этим, была поставлена цель - выявить механизмы участия NEDD9 в регуляции онкогенных молекулярных процессов, происходящих в эпителиальных опухолях яичников.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Определить роль NEDD9 в развитии и распространении карциномы яичников, а также регуляции экспрессии и активации сигнальных белков, участвующих в миграции, пролиферации и выживании клеток ЭРЯ;

2. Сравнить влияние экспрессии NEDD9 в клеточном микроокружении на рост, метастазирование и онкогенную сигнализацию в эпителиальных опухолях яичников с таковым в клетках первичной опухоли;

3. Установить, участвует ли NEDD9 в активации STAT3 и локализации последнего в фокальных контактах клеток ЭРЯ;

4. Исследовать влияние NEDD9 на общую генную экспрессию в опухолях яичников для возможного обнаружения ранее неизвестных молекулярных взаимодействий NEDD9.

Научная новизна

В работе впервые рассмотрены молекулярные механизмы участия скаффолд-протеина NEDD9 в развитии рака яичников. Показано, что делеция гена Nedd9 замедляет рост и уменьшает агрессивность эпителиальных опухолей яичников, что связано с понижением активации онкогенных киназ FAK, Src, AKT1 и экспрессии E-кадгерина и Aurora A киназы. Обнаружены ранее неизвестные молекулярные взаимодействия NEDD9. Так, в настоящей работе показано, что белки NEDD9 и FAK, но не Src, физически взаимодействуют с транскрипционным фактором STAT3 и участвуют в активации и локализации последнего в фокальных контактах клеток ЭРЯ. Кроме того, выявлено участие NEDD9 в отрицательной регуляции генной и белковой экспрессии транскрипционного фактора FOXJ1 и транскрипции регулируемых FOXJ1 генов, в частности, участвующих в работе подвижных ресничек. Убедительно продемонстрировано, что принципиальный вклад в агрессивность ЭРЯ вносит экспрессия NEDD9 в первичной опухоли, но не клеточном микроокружении.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные вносят вклад в понимание механизмов миграции, инвазии, пролиферации и выживания клеток в контексте карциномы яичника; представляют интерес с клинической точки зрения, в частности, говорят о том, что NEDD9 малопригоден как маркер для малоинвазивного прогнозирования карциномы яичников. Данные о транскрипицонной регуляции ряда генов со стороны NEDD9 открывают возможности для новых направлений иследований молекулярной сигнализации в эпителиальных опухолях яичников.

1. В контексте эпителиального рака яичников NEDD9 положительно регулирует экспрессию и активацию киназ FAK, Src, AKT1, а также общую экспрессию E-кадгерина и киназы Aurora A. Кроме того, NEDD9, а также FAK, но не Src, физически взаимодйствуют с транскрипицонным фактором STAT3, регулируют его экспрессию и активацию, а также локализацию STAT3 в фокальных контактах клеток карциномы яичников.

2. Экспрессия NEDD9 в первичных опухолях, но не в их клеточном микроокружении, способствует агрессивности эпителиального рака яичников через положительную регуляцию онкогенной сигнализации, роста и метастазирования опухолей, а также частоты развития опухолевых асцитов.

3. В контексте спонтанной карциномы яичников NEDD9 регулирует генную и белковую экспрессию транскрипционного фактора FOXJ1, и таким образом опосредованно участвует в регуляции транскрипции генов-мишеней FOXJ1: Dnalil, Dynlrb2, Kif9, Nek5, Rsph4a, Spa17, Spag6 и Tubala.

Апробация работы

Основные результаты исследований представлялись на 18-ой, 19-ой и 20-ой ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Онкологического центра «Фокс Чейз» (Филадельфия, США, 2013-2015); 2-ом и 3-ем ежегодных симпозиумах университета Тэмпл, посвящённых проблемам трансляционной науки (Филадельфия, США, 2013 и 2014); 105-ом ежегодном конгрессе Американской Ассоциации по исследованию рака (Сан-Диего, США, 2014); 4-ой Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014); 7-ом и 8-ом Всероссийских конгрессах молодых биологов «Симбиоз-Россия» (Екатеринбург, 2014 и

Новосибирск, 2015); 10-й Международной (19-ой всероссийской) Пироговской научной конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2015); 2-ой Международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов в рамках площадки открытых коммуникаций OpenBio (Новосибирск, Кольцово, 2015).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, среди которых 2 публикации в журналах базы SCOPUS.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 138 наименований.

1.1. Эпителиальный рак яичников: общие сведения

1.1.1. Клинические особенности ЭРЯ

Основной причиной высокой летальности эпителиального рака яичников является отсутствие эффективных методов ранней диагностики заболевания. ЭРЯ развивается бессимптомно, что приводит к позднему его выявлению - как правило, на III-IV стадии по классификации Международной ассоциации акушеров и гинекологов (Leitao and Barakat, 2009). На момент диагностики у больной зачастую имеются перитонеальные метастазы вне тазовой полости и/или очаговые метастазы в лимфатических узлах (стадия III), а в худшем случае (стадия IV) - метастазы за перделами брюшной полости, паренхимальные метастазы в печени и/или плевральная эффузия (Leitao and Barakat, 2009). Показано, что в течение пяти лет выживают менее 20% женщин, на момент выявления ЭРЯ имевших множественные метастазы в брюшной полости (перитонеальный карциноматоз), в то время как у пациенток без карциноматоза выживаемость может составить 90% (Freedman et al., 2004).

Вследствие анатомического расположения яичников, ЭРЯ распространяется преимущественно по перитонеальной полости. Большинство карцином проходят типичные этапы метастазирования: разрушение базальной мембраны, инвазия в локальную строму, интравазация, экстравазация, адгезия ко вторичному месту роста и образование новой опухоли (Hanahan and Weinberg, 2000). В случае же ЭРЯ, клетки поверхностного эпителия яичников, отслаиваясь, попадают непосредственно в брюшную полость, где адгезируются на брюшных стенках и абдоминальных органах и образуют вторичные опухоли, и лишь на поздних стадиях могут сформировать отдалённые метастазы вне перитонеальной полости (Landen etal., 2008).

Следствием перитонеального карциноматоза зачастую является опухолевый асцит - скопление в брюшной полости 0,5 - 2 литров свободной жидкости. При ЭРЯ асцит развивается из-за обструкции лимфатических сосудов, происходящей вследствие блокировки лимфотока метастазирующими раковыми клетками, а также повышенной проницаемости кровеносных сосудов в опухоли (Barbolina etal., 2009). В асцитах содержится большое количество растворённых факторов роста и цитокинов, которые могут способстовать распространению ЭРЯ. Кроме того, асцит может приводить к брюшным болям и нарушениям работы абдоминальных органов, что значительно ухудшает качество жизни пациентки (Roussos et al., 2011). Наличие асцита является независимым отрицательным прогностическим фактором при карциноме яичников (Kipps et al., 2013).

На начальных этапах терапии карцинома яичников хорошо поддаётся стандартным методам лечения (хирургическое удаление опухоли и применение препаратов платины), но в 80% случаев рецидивирует в устойчивой к химиотерапии форме (Ozols et al., 2004) в среднем, в течение 18 месяцев (Rubin et al., 1999).

К основным факторам риска развития ЭРЯ относят возраст (с возрастом риск развития заболевания повышается) и гормональный профиль, который напрямую зависит от репродуктивной истории: высокое число беременностей понижает риск развития ЭРЯ, а раннее менархе или поздняя менопауза - повышают (Liliac et al., 2012, Чернобай, 2013). Кроме того, некоторое значение имеют наследственные факторы. Большинство случаев наследственного ЭРЯ связано с носительством мутантных аллелей генов-супрессоров опухолей BRCA1, BRCA2, а также генов ответственных за мисмэтч-репарацию: MLH1, MSH1 и MSH6 (Liliac et al., 2012, Landen et al., 2008). Однако, наследственными являются лишь около 10% злокачественных опухолей яичников. Подавляющее же большинство случаев ЭРЯ носят спорадический характер, не связаны с мутациями генов BRCA и MLH, и не

имеют выраженного генетического или молекулярного профиля (Landen et al., 2008).

Итак, карцинома яичников - это опасное заболевание, большинство случаев которого сложно своевременно диагностировать и лечить, и практически невозможно заранее спрогнозировать.

1.1.2. Классификации злокачественных эпителиальных опухолей яичников: связь с концепциями этиологии и патогенеза ЭРЯ

Согласно классической концепции, ЭРЯ начинает развиваться на поверхностном эпителии яичников (ПЭЯ) (Landen et al., 2006). В результате частых повреждений, связанных с овуляцией, ПЭЯ инвагинируется и образует в кортексе яичника кистозные включения (Liliac et al., 2012). Далее эпителиальная ткань, оказавшаяся внутри кистозных включений, под влиянием различных местных стимулов (гормональная стимуляция, воспалительные процессы, и т.п.), может претерпеть метаплазию и развить морфологические признаки эпителия маточной трубы, эндометрия, шейки матки, влагалища или желудочно-кишечного тракта. Вследствие злокачественного перерождения перечисленные метаплазии могут развиться, соответственно, в следующие гистологические классы опухолей: серозные, эндометроидные, муцинозные и светлоклеточные (Shih and Kurman, 2004). На долю серозных опухолей приходится 75% эпителиальных опухолей яичников.

Каждый из перечисленных классов опухолей яичника (ОЯ) по клиническим проявлениям можно разделить на три подкласса, являющимися суть этапами малигнизации: доброкачественные, пограничные и злокачественные опухоли. Независимо от этого, серозные злокачественные опухоли также подразделяют на низко- и высокодифференциированные. Первые являются неинвазивными, вторые - агрессивными (Shih Ie and Kurman, 2004).

Наряду с признанием гистологической классификации ЭРЯ, в 2004 году Shih и Kurman предложили деление эпителиальных опухолей яичника на два типа по характеру клинических и молекулярных особенностей их развития. Согласно авторам, опухоли I типа развиваются медленно, постепенно проходя типичные стадии малигнизации от пограничной к злокачественной, и обычно диагностируются ещё до метастазирования. Опухоли этого типа генетически стабильны и часто имеют мутации в генах KRAS, BRAF и PTEN. К ним относятся низкодифференциированные серозные, эндометроидные, муцинозные, светлоклеточные опухоли. Ко II типу относят в первую очередь высокодифференцированные серозные, а также смешанные мезодермальные и недифференциированные опухоли. Для опухолей этого типа характерно быстрое развитие, высокая агрессивность, генетическая нестабильность и наличие мутаций в гене p53. Также в опухолях II типа относительно часто встречаются мутации генов ERBB и AKT2 (Shih Ie and Kurman, 2004)

1.2. Влияние иммунного микроокружения на развитие ЭРЯ

Злокачественная опухоль является открытой системой: она взаимодействует с окружающими её клетками, тканями и выделяемыми ими веществами, совокупность которых представляет собой клеточно-молекулярное микроокружение опухоли (МО). МО участвует во всех стадиях развития опухоли, регулируя, в том числе, ангиогенез, экспрессию сигнальных молекул, степень эластичности внеклеточного матрикса, воспалительные процессы и иммунный ответ (Lheureux and Oza, 2015).

В процессе развития опухоли участвуют компоненты как врождённого, так и адаптивного иммунитета. Так, показано, что NK1.1+ естественные киллеры препятствуют росту перитонеальных аллографтов в мышах (Gajewski et al., 2013). Присутствие миелоидных супрессорных клеток, напротив, как правило относят к факторам, способствующим туморогенезу (Khaled et al., 2013), однако есть сообщение и о том, что

наличие в асцитах мышей с серозным ЭРЯ CD11b+Gr-1+ миелоидных супрессорных клеток имело отрицательное влияние на развитие опухолей (Shin etal., 2010). Кроме того, показано, что наличие в брюшной полости F4/80+ макрофагов способствует метастазированию ОЯ через повышение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и матриксной металлопротеиназы 9 (Robinson-Smith et al., 2007).

Множество исследований посвящено и роли адаптивного иммунного ответа в развитии ОЯ. Высокое содержание в асцитах пациенток с ЭРЯ интерлейкина 17 (Wilke etal., 2013), продуцируемго исключительно CD4+ Т-хелперами и инфильтрация CD8+ цитотоксических Т-клеток в ОЯ является положительным прогностическим фактором при РЯ. В то же время, наличие в опухолях FoxP3+ регуляторных Т-лимфоцитов снижает продолжительность жизни пациенток с наследственным раком яичников (Mhawech-Fauceglia et al., 2013). При этом ОЯ с низкой инфильтрацией Т-лимфоцитов продуцирут больше ангиогенных факторов (Gajewski et al., 2013), способствующих развитию опухоли. В свою очередь, наличие CD19+ B-лимфоцитов в брюшной полости ассоциировано с резким снижением продолжительности жизни пациенток (Yang et al., 2013).

1.3. Молекулярные механизмы развития ЭРЯ

В течение последних трёх десятилетий ведётся интенсивное изучение особенностей молекулярной сигнализации злокачественных новообразований, в частности карциномы яичников. Ниже рассмотрены некоторые молекулярные механизмы развития ЭРЯ; многие из этих механизмов общи для различных солидных опухолей.

1.3.1. Участие белков фокальных контактов в развитии ЭРЯ

Наличие клеточно-субстратной и межклеточной адгезии -необходимые условия для выживания эпителиальных клеток и выполнения ими физиологических функций (Basu, 2003). Потеря клеточно-матриксной

адгезии в физиологических условиях ведёт к аноикису - одному из вариантов механизма запрограммированной смерти клетки (Sulzmaier et al., 2014). Способность клеток существовать в неадгезированном состоянии часто является показателем злокачественного перерождения (Basu, 2003).

Основную роль в прикреплении клетки к внеклеточному матриксу (ВКМ) играют интегрины - трансмембранные белки, являющиеся связующим звеном между компонентами ВКМ и клеточным скелетом. Интегрины представляют собой гетеродимеры, состоящие из а и в субъединиц. Связывание с субстратом ведёт к кластеризации интегринов и сборке вокруг них фокальных контактов, или фокальных адгезий - сложных многобелковых комплексов, обладающих механическими и сигнальными функциями (Wozniak et al., 2004). Динамика ФК определяет способность клеток к мигрции. Кроме того, через ФК, посредством цитоплазматических киназ, интегрины регулируют множество сигнальных путей.

Киназа фокальных контактов (focal adhesion kinase, FAK)-цитоплазматическая нерецепторная тирозинкиназа (НРТК), связывающаяся с белками на мембране и некоторыми белковыми комплексами в ядре клетки (Parsons, 2003). В фокальных контактах FAK взаимодейстует с цитоплазматическим доменом интегринов. Кластеризация интегринов приводит к димеризации и автофосфорилированию FAK в тирозине 397 (Tyr397). Это ведёт к активации FAK, формированию комплекса с Src и дальнейшей активации белков, приводящих к целому ряду потенциально онкогенных клеточных фенотипов (Sulzmaier et al., 2014).

Так, FAK контролирует клеточную миграцию, регулируя динамику фокальных контактов через активацию и протеолиз адаптерных белков талина и паксиллина. Кроме того, FAK участвует в регуляции клеточной инвазии, активируя матриксные металлопротеиназы - цинк-зависимые эндопептидазы, разрушающие ЭКМ и играющие важнейшую роль в клеточной инвазии (Li et al., 2011, Fan et al., 2013). Наряду с этим, FAK транскрипционно индуцирует факторы, приводящие к эпителиально -

мезенхимальному переходу (ЭМП, подробнее рассмотрен ниже) (Sulzmaier et al., 2014), что также вносит вклад в клеточную миграцию и адгезию.

FAK участвует и в выживании клеток, причём играет в этом процессе как киназную, так и некиназную роли. С одной стороны, среди мишеней тирозиновой активности FAK находятся белки PI3K/AKT/mTOR каскада, которые посредством NF-kB ингибируют апоптоз. В то же время FAK может выступать адаптером между MDM2 и Р53, что приводит к убиквитинизации и протеосомной деградации последнего (Sulzmaier et al., 2014).

Экспрессия FAK повышена приблизительно в 37% серозных ОЯ (Sulzmaier etal., 2014). При этом, фосфорилирование в Tyr397 увеличивается по мере развития опухоли (Zhao and Guan, 2009). Более того, у пациентов с ЭРЯ активация FAK фосфорилированием в Tyr397 была ассоциирована с отдалёнными метастазами (Aust et al., 2014)

Упомянутая выше Src-киназа - типичный и наиболее изученный представитель семейства Src-киназ (Src family of kinases, SFK). SFK -крупнеейшее семейство НРТК, включающее, кроме Src, ещё 8 членов: Blk, Fgr, Fyn, Hck, Lck, Lyn, Yes и Yrk. В неактивном состоянии Src заблокирована в нерабочей конформации фосфорилированием в Tyr527 в регуляторном С-конце белка. Вне- и внутриклеточных сигналы, идущие, в частности, через интегрины и РТК, фосфорилируют Src в Tyr416, после чего данная киназа принимает каталитически активную конформацию. В число мишеней киназной активности Src входят компоненты MAPK- и PI3K сигнальных путей, и, как уже упоминалось, FAK (Vlaeminck-Guillem et al., 2014).

Повышенная активация Src встречается во многих солидных злокачественных опухолях, в том числе и ЭРЯ (Irby and Yeatman, 2000).

Таким образом, фокальные контакты играют существенную роль в развитии ЭРЯ через регуляцию нижерасположенных мишеней, повышая мигративность и инвазивность раковых клеток, а также их способность противостоять апоптозу.

Одной из мишеней сигнализации фокальных контактов является PI3K/AKT/mTOR сигнальный путь. Основные участники этого каскада -семейство фосфатидилиназитол-3-киназ (PI3K) и протеинкиназ B (AKT), а также мишеней рапамицина млекопитающих (mTOR). В результате мутаций и амплификации генов, кодирующих белки-участники PI3K/AKT/mTOR, данный каскад активирован в 70% ЭРЯ. Это приводит к повышенным клеточному росту, пролиферации, ангиогенезу и перестроению клеточного метаболизма (Li et al., 2014).

Семейство липидных киназ PI3K делится на три класса. Показано, что PI3K I-го (наиболее изученного) класса регулируют клеточный рост, II-го класса - мембранный транспорт, III-го - эндоцитоз и автофагию (Samuels and Ericson, 2006, Markman et al., 2010). PI3K активируются цитокиновыми рецепторами, РТК, в том числе ERBB2, а также НРТК. Активированная PI3KI класса фосфорилирует фосфатидидилинозитол-4,5-бифосфат (PIP2), превращая его в фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP3). Последний является важным липидным вторичным мэссенджером, прикреплённым к цитоплазматической мембране, передающим сигнал нижерасположенным мишеням, в частности белкам AKT (Miao et al., 2010).

Семейство серин-триониновых киназ AKT занимает центральное место в PI3K/AKT/mTOR каскаде. Все три представителия данного семейства -AKT1, AKT2 и AKT3, взаимодействует с PIP3, что приводит к перемещению AKT от мембраны в цитоплазму и последующему фосфорилированию (Miao et al., 2010). AKT1, или протеиновая киназа B, играет важную роль в регуляции апоптоза, опосредованно приводя к деградации p53 (Basu, 2003). Также, гипереэкспрессия AKT1 увеличивает миграцию, инвазию и пролиферацию клеток ЭРЯ (Meng et al., 2006). AKT2 способствует эпителиально-мезенхимальному переходу и возрастанию инвазивности клеток (Larue and Bellacosa, 2005). AKT3 регулирует фактор роста эндотелия

сосудов (VEGF) в яичниковых опухолях, тем самым участвуя в ангиогенезе при ЭРЯ (Liby et al., 2012).

mTOR - семейство серин-треониновых киназ, играющих важную роль в регуляции клеточного роста, апоптоза и клеточного движения. mTOR функционирует посредством двух мультипротеиновых комплексов, mTORC 1 и mTORC2, каждый из которых взаимодействует с киназами AKT. В частности, mTORC2 фосфорилирует AKT1 в серине 473 (Ser473), что ведёт к активации AKT1 (Li et al., 2014).

1.3.3. ЭРЯ и регуляция клеточного деления: ERBB2-RAS-MAPK сигнальный

путь

Другая группа мишеней сигналов, идущих от ФК - компоненты сигнальной оси ERBB2-RAS-MAPK.

Мембранная рецепторная тирозиновая протеинкиназа (РТК) ERBB2, называемая также HER2/neu, является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR). ERBB2 стоит во главе многих важных сигнальных путей, таких как упомянутый выше Р13К-путь, или митоген-активируемый протеинкиназный (MAPK) каскад. Экспрессия ERBB2 повышена в 9-30% ЭРЯ (Lee-Jones, 2004).

RAS - семейство низкомолекулярных гуанин-трифосфатаз, участвующих во многих сигнал-трансдуцирующих каскадах. В частности, RAS служит посредником между EGFR и участниками MAPK-каскада. Многократно показано участие белков RAS в злокачественном перерождении, инвазии и метастазировании различных видов рака (Leitao and Barakat, 2009).

Митоген-активируемый протеинкиназный (mitogen-activated protein kinase, MAPK) каскад является важным сигнал-трансдуцирующим сигнальным путём, передающим стимулы от разнообразных рецепторов обширному ряду нижерасположенных мишеней. МАРК протеинкиназы -сборная группа белков, включающая три небольших семейства

протеинкиназ: p38, JNK/SAPK (c-JunN-terminal kinase/Stress activated protein kinase) и ERK (Exracellular signal regulated kinase) (Потехина и Надеждина, 2001). Все МАРК протеинкиназы в неактивном состоянии находятся на мембране, но после активации перемещаются в ядро (Cargnello and Roux, 2011).

Каждое из семейств MAPK состоит из трёх последовательно включающихся в работу киназ: собственно MAPK, MAPK-киназа (MAPKK) и MAPKK-киназа (MAPKKK). MAPKKK взаимодействует с белками семейства RAS, и, после активации, передаёт сигнал нижерасположенным мишеням. Киназа p38 участвует в имунном и воспалительном ответах, клеточной пролиферации и подавляет апоптоз. В свою очередь, JNK, и в особенности ERK известны как регуляторы клеточной пролиферации (Cargnello and Roux, 2011).

Родственные серин-триониновые киназы ERK1 и ERK2 (гомология кодирующей последовательности составляет ~85%, в следствие чего эти белки зачастую рассматриваются совместно) необходимы для быстрого прохождения клетки из G1 в S фазу (Cargnello and Roux, 2011). ERK1/2 активируются в ответ на фосфорилирование в Tyr204/187, и трионине Thr 202/185, причём для киназной активности ERK1/2 необходимо фосфорилирование как по тирозину, так и по треонину (Roskoski, 2012).

MAPK-каскад конститутивно активен в 70-80% пограничных и низкодифференциированных, и примерно в 40%

высокодифференциированных серозных ОЯ. Предположительно, в низко- и высокодифференциированных ОЯ работают разные механизмы активации механизмы MAPK-каскада (Hsu et al., 2004).

1.3.4. ЭРЯ и регуляция клеточного деления: Aurora-киназы

Семейство серин-триониновых киназ Aurora состоит из трёх белков: Aurora kinase A (AURKA), Aurora kinase B (AURKB), и Aurora kimse C (AURKC). Все три Aurora-киназы являются незаменимыми участниками

процесса клеточного деления (Do et al., 2013). Нарушения в экспрессии и активности киназ Aurora, приводят к генетической нестабильности, анэуплоидии и клеточной смерти.

В контексте настоящей работы наиболее интересной представляется AURKA. Данная киназа координирует работу клеточного центра, сборку веретена деления и расхождение хромосом. Кроме того, AURKA участвует в регуляции так называемой точки проверки сборки веретена деления и перехода от фазы G2 к фазе M (Goldenson and Crispino, 2014). Ингибирование AURKA приводит к остановке клеточного цикла на G2/M переходе и апоптозу (Gautschi et al., 2008). Гиперэкспрессия AURKA, связанная с амплификацией и/или транскрипционной активацией гена AURKA, обнаружена во многих опухолях, в том числе и в ЭОЯ (Do et al., 2013). AURKA непосредственно фосфорилирует p53, контролируя стабильность и активность последнего. Гиперекспрессия AURKA приводит к деградации р53 через MDM2 и таким образом может быть связана с сигнализацией AKT (Katayama et al., 2004).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Габбасов Рашид Тагирович, 2016 год

• Источник питания

• Камера для ДНК-электрофореза

• Камеры для белкового электрофореза

• Камеры для переноса белков на

BioRad (США) Amerex Instruments (США) Sartorius AG (Германия) Precision (США) VWR (США)

Bertin Technologies (Франция)

EC Apparatus (США)

Invitrogen (США) Invitrogen (США) Invitrogen (США)

Corporation

нитроцеллюлозную мембрану

• Качалка лабораторная

• Клеточный in vitro анализатор RTCA

• Лазерный флюоресцентный сканер SureScan Microarray Scanner

• Ламинарный шкаф Steril Gard III Advance

• Оптический фазово-контрастный микроскоп TS100

• Планшетный спектрофотометр-фотоэлектроколориметр Synergy HT

• Проточный цитометр LSR-II

• Проявитель рентгеновских плёнок

• Реал-тайм ПЦР-амплификатор 7900 HT

• СО2 инкубатор для культур клеток млекопитающих Thermo Forma Series II

• Спектрофотометр Nanodrop 1000

• Термоциклер PTC-100

• Установка для детекции биолюминисценции IVIS Spectrum

• Флюоресцентный микроскоп Eclipse TE 2000-U

• Центрифуга 5810R

• Центрифуга Centrifuge 5424

• Центрифуга J2-HS

• ЯМР-спектрометр DRX-300

Thermo Scientific(США) Roche (Германия)

Agilent Technologies (США)

The Baker Company (США)

Nikon (США)

Bio-Tek (США)

Becton Dickinson (США) Hope (США)

Applied Biosystems (США) Thermo Scientific(США)

Thermo Scientific (США) MJ Research (США) Perkin Elmer (США)

Nikon (США)

Eppendorf (Германия) Eppendorf (Германия) Beckman (США) Bruker (США)

2.2.1. In vivo мышиные модели ЭРЯ

Все манипуляции, проведённые в рамках настоящего исследования над мышами, а также биоматериалами человека и животных, были одобрены этическим комитетом Онкологического центра Фокс Чейз (Fox Chase Cancer Center, г. Филадельфия, США). До начала экспериментов мыши содержались в асептических условиях. По достижении опухолевой массой суммарного

-5

объёма ~2000 мм , животные усыплялись в камере с CO2. Во время некропсии выполнялось следующее: замер размеров опухолей и, при наличии, объема асцитной жидкости; забор опухолей и образцов абдоминальных органов для гистопатологических и молекулярно-биологических исследований (фрагменты опухолей при этом замораживали в жидком азоте и хранили при -80оС); исследование стенок и органов брюшной полости на наличие метастазов и подсчёт последних, а также измерение размеров наиболее крупных метастазов. Объём опухолей и крупных метастазов V вычислялся по формуле ):

V = (1 х w2 х 0,5),

где l -длина опухоли, w - ширина опухоли (Hensley et al., 2012).

2.2.1.1. Мыши, нокаутные по Nedd9

Мыши, нокаутные по гену Nedd9 были выведены Seo и коллегами из Университета Токио (University of Tokyo, Токио, Япония) в 2005 году (Seo et al., 2005) на основе линии C57BL/6, и любезно предоставлены для данного исследования. Nedd9-' мыши здоровы и фертильны. Единственная описанная у данных мышей аномалия это сниженная мигративность лимфоцитов, что приводит к резкому понижению популяции B-лимфоцитов в маргинальной зоне, а также количества лимфоцитов в костном мозге и тимусе.

Для изучения влияния экспрессии NEDD9 на развитие спонтанных опухолей ЭРЯ были использованы мыши линии MISIIR-TAg-DR26, скрещённые с мышами, нокаутными по Nedd9. Трансгенная линия мышей MISIIR-TAg была получена Connolly и сотрудниками в 2003 году (Connolly et al., 2003) на основе линии C57BL/6. MISIIR-TAg животные экспрессируют протоонкогены - большой и малый T-антигены (TAg) обезъяньего вируса SV40 под контролем промотора рецептора антимюллерова гормона II типа (Müllerian inhibiting substance type II receptor, MISIIR). Как показали Connolly и коллеги, экспрессия MISIIR у мышей высока в клетках поверхностного эпителия яичников. Соответственно, у самок MISIIR-TAg-мышей онкогены TAg экспрессировались преимущественно в ПЭЯ, что приводило к образованию билатеральных спонтанных опухолей яичника. По гистопатологическим и генетическим особенностям образующиеся мышиные опухоли были сходны с высокодифференциированными серозными карциномами яичников человека (Connolly et al., 2003). Как и ЭРЯ человека, данные опухоли часто метастазировали в брюшную полость и сопровождались асцитами. Спустя несколько лет после первого сообщения о MISIIR-TAg мышах, той же группой были выведены мыши MISIIR-TAg-DR26, развивающие ОЯ с пенентрантностью 100% к четвёртому месяцу жизни (Hensley et al., 2007). По характеру генетических изменений, опухоли MISIIR-TAg мышей можно отнести к опухолям II типа по классификации Kurman и Shih (Shih Ie and Kurman, 2004; см. раздел 1.1.2).

Для получения MISIIR-TAg-Nedd9-/' мышей, MISIIR- TAg-DR26 животных скрещивали с Nedd9'/' мышами, по следующей схеме (TAg = MISIIR-TAg-DR26; отбиравшийся для последующего скрещивания генотип подчёркнут):

1. P: $Nedd9-/- x tfTAg+/+ F1: TAs+/';Nedd9+/'

2. P: $Nedd9'/- x tfTAs+/';Nedd9+/-F1: TAg+/';Nedd9+/'

TAg'/';Nedd9+/' TAg'/';Nedd9'/' TAg ';Nedd9"

3. P: $Nedd9-/-x tfTAg' ';Nedd9" F1: TAg-/- ;Nedd9'/'

TAg+/';Nedd9'/'

Для экспериментов отбирали MISIIR-TAg+/';Nedd9+/+ (в качестве контроля) и MISIIR-TAg+/';Nedd9'/' мышей.

2.2.1.3. Сингенетическая мышиная модель ЭРЯ

В 2010 году Quinn и коллеги охарактеризовали мышиную линию MISIIR-TAg-low, производную линии MISIIR-TAg. Животные MISIIR-TAg-low экспрессируют гены TAg на относительно низком уровне, вследствие чего не развивают спонтанных опухолей, в отличие от MISIIR-TAg мышей (Quinn et al., 2010). Была показана возможность использования MISIIR-TAg-low мышей как иммунокомпетентных реципиентов для ортотопической имплантации клеток MOVCAR, о которых рассказано ниже. Таким образом, мыши MISIIR-TAg-low использовались для создания сингенетической мышиной модели ЭРЯ. Мышей MISIIR-TAg-low;Nedd9-/- получали по схеме, аналогичной описанной в подразделе 2.2.1.2.

2.2.2. Клеточные линии

Культуры клеток мыши и человека инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для клеток мыши использовали ростовую среду DMEM с добавлением 4% ФБС, 1x ITS, 2 мМ L-глутамина и пенициллин-

стрептомицина (100 ед./мл и 100 мкг/мл, соответственно). Клеточные линии человека инкубировали в ростовой среде RPMI-1640 с добавлением 10% ФБС, 1x ITS, 2 мМ L-глутамина и пенициллин-стрептомицина (100 ед./мл и 100 мкг/мл, соответственно). В некоторых экспериментах использовали среды DMEM и RPMI-1640 без добавок. Для снятия адгезированных клеток со дна флаконов, монослой промывали PBS и заливали раствором трипсин-ЭДТА на 2-5 минут.

Nedd9+/+ и Nedd9'-' клетки MOVCAR (от англ. mouse ovarían carcinoma -карцинома яичников мыши) были ранее выделены из асцитов мышей MISIIR-TAg с соответствующими генотипами (Connolly et al., 2003). В экспериментах использовали следующие клеточные линии MOVCAR (названы по номерам мышей, из которых были изолированы): Nedd9+/+ линии MOVCAR 6111, 5009, 8248, 8250, и Nedd9-/- линии MOVCAR 136, 143, 145, 168.

Кроме того, в данной работе использовали клеточные линии ЭРЯ человека: A1847 и NIH:OVCAR5, приобретённые в отделе культур тканей Онкологического центра Фокс Чейз.

Оценку жизнеспособности и подсчет плотности клеток производили на гемоцитометре после окраски клеток 0,4%-ным раствором трипанового синего.

Расчёт виталитета клеток (V) производили по формуле: V = (a-b) х 100% / a, где a - общее количество клеток

b - количество синих (нежизнеспособных) клеток

В экспериментах использовали суспензии с количеством жизнеспособных клеток не менее 90%.

2.3. Исследование влияния экспрессии NEDD9 на развитие

спонтанного ЭРЯ in vivo

2.3.1. In vivo магнитно-резонансная томография

Для оценки влияние экспрессии NEDD9 на развитие спонтанного ЭРЯ, динамику роста опухолей MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISUR-TAg;Nedd9~/~ мышей отслеживали, еженедельно измеряя объёмы опухолей при помощи магнитно -резонансной томографии (МРТ; пример томограммы приведён на рис. 3). Использовали спектрометр Bruker DRX 300 c индукцией магнитного поля в 7 Тл, и программное обеспечение для микроимиджинга. Мышей наркотизировали в камерах с подачей 2% изофлюрана в течение 10 минут; на время сканирования концентрацию изофлюрана понижали до 1%. Для вычесления объёма опухолей открытой компьютерной программе MRIcro изображение опухоли в каждом слое выделяли цветом, после чего объём V расчитывали по формуле:

V = (0,01 X z X Щ X n2),

где 0,01 -площадь пикселя на изображении в мм , Z - толщина слоя (как правило, 1 мм), П - количество пикселей в выделенной области, n2 - количество слоёв .

Рисунок 3. Пример томограммы MISIIR-TAg мыши с билатеральными опухолями яичника (слева, отмечены жёлтыми стрелками); справа: то же, опухоли закрашены в программе МЫсго для последующего расчёта объёма.

2.3.2. Исследование инфильтрации иммунных клеток в мышах при помощи

проточной цитометрии

Влияние экспрессии NEDD9 на инфильтрацию иммунных клеток в ОЯ (спонтанные или аллографты), перитонеальньную полость и другие органы мышей MISIIR-TAg и MISIIR-TAg-low исследовали при помощи проточной цитометрии. Во время некропсии из мыши изолировали опухоли яичников, мезентериальные лимфатические узлы и селезёнку. Также проводили забор смывов перитонеального экссудата. Для последнего, до начала вскрытия в брюшную полость предварительно усыплённой мыши шприцем вводили 5 мл раствора PBS с добавлением 2% ФБС. После короткого массирования брюшной области мыши, раствор собирали шприцем. Суспензированные в перитонеальном смыве клетки осаждали центрифугированием 5 минут при 5000 об/мин на холоду. Селезёнку для гомогенизации помещали в чашку Петри, добавляли 1 мл PBS и растирали между шершавыми поверхносятми двух стерильных предметных стёкол. Таким же образом гомогенизировали лимфатические узлы. Опухоли же для гомогенизации разрезали на небольшие фрагменты, инкубировали в течение часа на водяной бане при 37оС в растворе ферментов (0.09% коллагеназы, 0.09% диспазы и 0.9% ФБС в чистом DMEM), после чего процеживали через ситечко для клеток (100 мкм; BD, США). Для удаления эритроцитов, клетки, полученные из перитонеальных смывов и гомогенизированных органов, несколько раз промывали 1% раствором NH4Cl.

Для блокировки неспецифического связывания, клетки инкубировали в антителах к Fc-рецепторам (CD16/CD32; 1 мкг на 106 клеток) 15 минут при 4оС. Далее клетки трижды промывали в PBS и инкубировали в растворах антител, меченых флюоресцентной меткой 30 мин при 4оС. Использовали следующие антитела: CD45 eFlour450, CD4 FITC, CD8a APC, CD19 PE, Foxp3 APC, F4/80 APC, CD11b PE, NK1.1 APC, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) PE-Cy7. Клетки после инкубации дважды промывали в PBS и фиксировали в 0,5% ПФА. Следующие популяции клеток были мечены соответствующими

комбинациями антител: CD45 CD4 Т-хэлперы, CD45+FoxP3+ Т-регуляторные клетки, CD45+CD8+ T-киллеры, CD45+NK1.1+CD3e+ естественные киллеры (NK-клетки), CD45+CD19+ B-лимфоциты, CD45+F4/80+CD11b+ макрофаги и CD45+CD11b+Gr-1+ миелоидные супрессорные клетки.

Количество клеток в соответствующих популяциях определяли при помощи проточного цитометра Becton Dickinson LSR-II Flow Analyzer. Полученные данные обрабатывали в компьютерной программе FlowJo 9.8.

2.4. In vitro эксперименты на культурах клеток ЭРЯ человека и мыши

Все описанные в данном разделе эксперименты проводились в трёх повторностях, каждая из которых включала в себя по меньшей мере по три независимых технических репликации. Исключением являются опыты с использованием прибора xCELLigence, ввиду высокой стоимости расходных материалов проведенные в трёх повторностях с двумя техническими репликациями в каждой.

2.4.1. Исследование клеточной пролиферации

Клеточную пролиферацию оценивали при помощи реагента Cy-Quant (Invitrogen, США). Клетки рассевали в три 96-луночные плашки по 3000 клеток на лунку и растили в инкубаторе по 24, 48 и 72 часа. На каждой из временных точек одну из плашек замораживали на -80оС, предварительно удалив из лунок среду. После сбора плашек со всех временных точек, лунки заливали раствором Cy-Quant, содержащим лизисный буфер и флюоресцентный краситель, связывающийся с ДНК. Количество клеток определяли, сравнивая показатели флюоресценции в данной лунке с флюоресценцией стандартных разведений клеток исследуемой клеточной линии.

2.4.2. Исследование клеточной адгезии

Для исследования клеточной адгезии готовили 96-луночные плашки: в лунки заливали по 200 мкл растворов фибронектина (2 мкг/мл в PBS) или коллагена I-ого типа (10 мкг/мл в 0,02 нормальном ацетате), инкубировали при 37оС в течение часа, промывали PBS, хрнили при +4oC. Непосредственно перед началом эксперимента блокировали неспецифическое связывание раствором 3% БСА в чистой среде DMEM или RPMI 1640, в зависимости от клеточной линии. Во время эксперимента клетки ресуспензировали в чистой среде, рассевали по 3000 клеток на лунку и инкубировали в течение часа. Далее лунки трижды промывали PBS для удаления неадгезированных клеток.

Адгезированные клетки фиксировали 15 минут в 4% ПФА в PBS, окрашивали в 1% растворе кристального фиолетового в 25% метаноле и подсчитывали на инвертированном световом микроскопе.

2.4.3. Клеточная миграция и инвазия в градиенте ФБС

Анализ клеточной миграции и инвазии в градиенте ФБС проводили на клеточном анализаторе xCELLigence, работающем с 16-луночными плашками CIM-plate. Лунки плашек CIM-plate представляют собой модифицированные камеры Бойдена (Boyden, 1962; рис. 4). Особенностью плашек dM-plate является наличие с нижней стороны пористой мембраны сети электродов, связанных с анализатором xCELLigence. С помощью электродов прибор фиксирует изменения в электрическом сопротивлении, которые возникают при проникновении клеток в нижнюю камеру.

Рисунок 4. Схема строения лунки плашки С1М-рЫе. В нижний цилиндр помещается среда с хемоаттрактантом, в верхний - суспензия исследуемых клеток в среде без хемоаттрактанта.

Для исследования хемотактической миграции и инвазии в верхнюю камеру СГМ-рЫе помещали суспензию исследуемых клеток в чистой среде (2*104 клеток на лунку в 100 мкл), а в нижнюю - среду с содержанием 4% ФБС. Измерения проводили в каждые 15 минут в течение 24 часов. В контрольных лунках градиент ФБС отсутствовал, в обе камеры заливали чистую среду.

Непосредственно перед началом опыта по клеточной инвазии, в лунки наносили по 30 мкл раствора матригеля в чистой среде (0,5 мг/мл). Таким

образом, клеткам, помещённым в верхнюю камеру, для хемотаксиса в сторону увеличения градиента ФБС приходилось разрушать слой матригеля.

2.4.4. Исследование клеточной миграции на двумерной поверхности

Миграцию клеток в монослое при моделированиии раны (в англоязычной литературе именуемый scratch assay) исследовали следующим образом: клетки растили в 24-луночный плашках до полной конфлюэнтности, после чего по монослою проводили тонким пластиковым носиком от дозатора. В результате формировалась «рана» - свободная от клеток полоса. Клетки с обеих сторон этой полосы начинали миграцию в образовавшееся свободное пространство - это перемещение фиксировали, фотографируя клетки в начале эксперимента (T0), и спустя 6 часов (для клеток человека) или 12 часов (для клеток мыши) - TN. Время продолжительности экспериментов определяли эмпирически. Расстояния между монослоями в T0 и TN измеряли при помощи компьютерной программы ImageJ.

2.4.5. Нокдаун гена NEDD9 в клетках ЭРЯмыши и человека

Нокдаун гена Nedd9 провели в клетках MOVCAR 6111 и 5009. Кроме того, для исследования in vitro влияния экспрессии NEDD9 на клетки человека, был проведён нокдаун гена NEDD9 в клетках линий ЭРЯ человека OVCAR5 и A1847.

Клетки мыши и человека трансдуцировали, соответственно, лентивирусными векторами pLKO1 и pGIPZ, экспрессирующими короткие шпилечные РНК (кшРНК), гомологичные к последовательности гена NEDD9, а также ген устойчивости к пуромицину. Векторы приобретали в виде наборов глицериновых стоков Escherichia coli.

Клетки E. coli растили 16-18 часов в питатальной среде Luria-Bertani (LB) c добавлением 100 мкг/мл ампициллина в бактериальном инкубаторе

при 37оС с покачиванием в 300 об/мин. Выделение плазмидной ДНК проводили при помощи набора QIAFilter Plasmid Maxi Kit (Qiagen, США).

Для наработки лентивирусных частиц применяли клетки HEK293T и набор плазмид ViraPower Lentiviral Expression System (Invitrogen): pLP1, pLP2 и pLP/VSVG, экспрессирующие гены gag и pol, rev и vsv-g соответственно. Клетки HEK293T растили в чашках Петри в ростовой среде DMEM без добавления антибиотиков до максимальной конфлюэнтности (для данной клеточной линии - около 50%). Во время трансфекции, в отдельной пробирке смешивали 0,5 мл чистой среды DMEM, 3 мкг вектора с кшРНК и по 3 мкг каждой из плазмид ViraPower и (всего - 12 мкг). В другую пробирку в 0,5 мл среды добавляли 36 мкл катионного полимера Липофектамин 2000 (Invitrogen, США). После 5 минут инкубации при комнатной температуре, содержимое двух пробирок смешивали и инкубировали ещё 20 минут, после чего переносили в чашку с HEK293T. На следующий день среду у клеток HEK293T заменяли на свежую. Спустя 72 часа после начала трансфекции среду из чашек с HEK293T собирали, пропускали через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм (Corning, США) и замораживали. Вирусные стоки хранили при -80оС.

Клетки, предназначенные для трансдукции, растили в 24-луночных плашках до конфлюэнтности 30-40%, после чего ростовую среду заменяли вирусными стоками. Каждый из вирусных стоков применяли в различных разведениях (1/2, 1/4, 1/8, 1/16) в соответствующей среде c добавлением 10 мкг/мл катионного полимера Polybrene (Santa Cruz, США). Спустя 24 часа после начала трансдукции, клеточную среду с вирусными частицами заменяли на нормальную ростовую среду. Спустя ещё сутки ростовую среду заменяли селективной средой с добавлением пуромицина, в которой клетки инкубировали до появления стабильных клонов. Концентрации пуромицина, использованные для разных клеточных линий, приведены ниже; минимальные подавляющие дозы пуромицина для данной клеточной линии определяли эмпирически.

Клеточная линия Концентрация пуромицина, мкг/мл МОУСДЯ 6111 0.25

МОУСДЯ 5009 1

ОУСЛЯ5 0.75

А1847 2

В наборы кшРНК на основе векторов рЬКО1 и рО1Р7 входили по шесть клонов кшРНК; каждый клон был гомологичен определённому участку гена NEDD9 (Таблица 1). Кроме того, в каждый из наборов входили пустой вектор (отрицательный контроль), и вектор, содержащий кшРНК, гомологичный к гену ОБР (положительный контроль). Каждый из имеющихся клонов кшРНК был трансдуцирован в соответствующие клетки для определения наиболее эффективного нокдауна, степень которого анализировали методом Вестерн блот. Для каждой клеточной линии было определено два клона кшРНК, вызывающих максимальное уменьшение экспрессии МЕВВ9. Для клеток, трансдуцированных этими клонами кшРНК, проанализировали миграцию в монослое и адгезивность к фибронектину и коллагену I типа, как описано в разделах 2.4.2 и 2.4.4. В качестве контролей использовали клетки, трансдуцированные контрольными векторами.

Таблица 1. Список и нуклеотидные последовательности клонов кшРНК в наборах лентивирусных векторов. Последовательности, вызвавшие наиболее эффективный нокдаун МЕВВ9, выделены полужирным шрифтом

Вектор Нуклеотидные последовательности кшРНК (5'-3')

рЬКО1 АТТССТСТССААТАССТСАСС лллттсссталттстаатлаа ллталлслсслатттатасас тттаасттАаААтстаатааа ТАСТАСААССАААССААСТСС

татслтлтллаасссттас

тлттллалатслалллаас

ААТССТАСТСАТССАТССА

рОТР/

АСААССАСАССААСТСССС

тлслталлаатссттссст

ттлслталлаатссттссс

2.4.6. Нокдаун генов БТЛТЗ, Рак и Бгс в клетках ЫОУСЛЯ 5009 и

иммунофлюоресцентный анализ

Нокдаун генов $>1а13, Рак и Бгс в клетках линии МОУСЛЯ 5009 провели при помощи наборов соответствующих коротких интерферирующих РНК (киРНК) ОК-ТАКОЕТр1ш (БИагшасоп, США) при помощи реагента ВИагшаРЕСТ (ЭИагшасоп) в соответствии с инструкцией производителя. Последовательности киРНК в наборах приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Последовательности киРНК, использованные в наборах для нокдауна генов Рак и Бгс в клетках МОУСЛЯ 5009

Ген Последовательность киРНК (5'-3')

Бгс лаасстлллтаталллслстлс саслтлстатсталттлллслс

Рак сталллатстстсттатлтлла тлтсслалстататтасллтлт ататсттслллталттататлл

БгагЗ ссллсалссиасласллилии

2.5. Сравнение влияния внутриопухолевой экспрессии NEDD9 на развитие ЭРЯ в с таковым в микроокружении опухоли

Для более детального понимания роли МЕВВ9 в процессе развития ЭРЯ, исследовали зависимость роста и метастазирования ЭРЯ от экспрессии МЕВВ9 в первичной опухоли или в микроокружении опухоли. Для этого было проведено две серии экспериментов с имплантаций раковых клеток в мышей MISIIR-Tag-low, не развивающих спонтанные опухоли.

При проведении первой серии экспериментов проверяли гипотезу положительного влияния МЕВВ9, экспрессируемого в окружающих тканях, на развитие ЭРЯ (например, через повышенную активность периферических имунных клеток). Для этого Nedd9+/+ клетки МОУсАЯ 5009-1ис, экспрессирующие ген люциферазы светляка, ортотопически вживляли в Nedd9+/+ и Nedd9'/' MISIIR-Tag-low мышей (рис. 5А). Таким образом моделировали делецию Nedd9 в микроокружении опухоли, при том, что сама опухоль экспрессировала МЕВВ9. Провели три независимых эксперимента с использованием 10 мышей каждого генотипа в каждом повторе.

Исходной посылкой при выполнении второй серии экспериментов было предположение, что критическим для развития ЭРЯ является экспрессия МЕВВ9 в первичной опухоли. Для проверки данной гипотезы, в Nedd9+/+ мышей MISIIR-Tag-low имплантировали Nedd9+/+ и Nedd9'/' МОУслЯ клетки, то есть моделировали отсутствие экспрессии МЕВВ9 внутри опухоли в контексте Nedd9+/+ организма (рис. 5Б). Имлантации по данной схеме также были проведены в четырёх независимых повторностях, причём в каждой повторности использовали новые пары Nedd9+/+ и Nedd9'/' МОУслЯ клеток, соответственно: 6111-143, 8248-145, 8250-168 и 5009-136.

Рисунок 5. Схема ортотопических имплантаций в MISIIR-Tag-low мышей. Пояснение в тексте.

Клетки MOVCAR-5009, использовавшиеся в первой серии аллотрансплантаций, предварительно трансдуцировали ретровирусным вектором pWZL-luc, несущим гены люциферазы и устойчивости к гигромицину Б. Плазмиды pWZL-luc были любезно предоставленны лабораторией Maurene Murphy (Wistar Institute, Филадельфия, США). Наработку вирусных частиц проводили при помощи клеток Phoenix Eco, производных клеток HEK293 (Swift et al., 2001). Гены упаковки вирусных частиц встроены в геном клеток Phoenix. Клетки Phoenix Eco растили в чашках Петри в ростовой среде DMEM до конфлюэнтности ~50%. Плазмиду pWZL-luc инкубировали 10 минут при комнатной температуре в чистом DMEM с поликатионным липидом TransIT-2020 (Invitrogen) для формирования липосом, после чего добавляли в среду к клеткам Phoenix Eco. Спустя сутки, среду собирали, очищали от клеточного материала в фильтрах с диаметром пор 0,45 мкм (Corning, США), добавляли Polybrene до конечной концентрации 10 мкг/мл и переносили к целевым клеткам MOVCAR. Спустя ещё сутки, среду, содержащую вирусные частицы, заменяли нормальной ростовой средой с добавлением гигромицина Б (75мкг/мл) для селекции трансдуцированных клонов клеток MOVCAR.

Операция по вживлению аллографтов в мышей MISIIR-TAg-low описана Quinn и сотрудниками ^шпд & а!., 2010). Процедура имплантации проводилась в асептических условиях. Мышей анестезировали интраперитонеальной инъекцией гидрохлорида кетамина (95 мкл на 10 г массы при концентрации 10 мг/мл). Далее на спине животного, ближе к задней части и немного левее позвоночника, делали надрез, через который извлекали левую маточную трубу вместе с яичником. В яичниковую сумку левого яичника каждой мыши инъецировали 3*105 клеток, суспензированных в 20 мкл Матригеля (рис. 6), растворённом в чистой среде DMEM в концентрации 5 мкг/мкл. Края надрезов скрепляли степлером для кожи. Для восстановления мышей оставляли в асептическом вивариуме в течение недели.

Рисунок 6. Изображение яичника во время операции по имплантации клеток MOVCAR.

Динамику роста опухолей в MISIIR-TAg-low мышах отслеживали in vivo при помощи биолюминисцентной визуализации (имиджинга) на установке IVIS Spectrum и/или еженедельной пальпации. За 10 минут до начала имиджинга мышам интраперитонеально вводили 200 мкл раствора D-люциферина, растворённого в PBS (100 мг/кг). За это время, с животных со стороны надреза сбривали мех, который иначе поглощал бы

биолюминисцентный сигнал (у мышей MISIIR-TAg-low мех чёрный). Визуализацию опухоли проводили еженедельно. Биолюминесцентный сигнал количественно обрабатывали в компьютерной программе Living Image 4.1.

-5

По достижении объёма опухолевой массы в ~2000 мм , мышей усыпляли и вскрывали.

2.6. Исследование общей генной экспрессии в спонтанных опухолях

мышей MISIIR-TAg

Выделение тотальной РНК проводили при помощи набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Фрагменты опухолей массой 10-20 мг помещали в центрифужные пробирки, на 2/3 заполненные стеклянными бусинами диамтером 1 мм, добавляли 0,5 мл буфера Buffer RLT Plus и встряхивали на гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin Technologies, Франция). Дальнейшую процедуру проводили по инструкции производителя.

Контроль качества выделенной РНК, и последующие амплификацию и флуоресцентное мечение РНК проводили при помощи наборов Agilent Bioanalyzer RNA (Agilent, США) и RNA input linear amplification kit (Agilent, США), соответственно, по протоколам производителя. Меченые кРНК гибридизировали на микроплашках Agilent Mouse Whole Genome Microarray 4x44K (Agilent, США). Исходные данные по всем образцам корректировали по фоновому сигналу и нормализовали по квантилям. Для определения различий в экспрессии генов, использовали методологию LIMMA (Linear Models for Microarray Data) компьютерной программы Bioconductor Smyth, 2004 Gentleman et al., 2004. За критерий различия приняли двукратное изменение генной экспресии при p<0.001 и false discovery rate равном 5%.

При дальнейшем анализе литературы определили гены, имеющие наиболее близкое отношение к раку яичников или молекулярной сигнализации NEDD9. Экспрессия выбранных генов была проверена при помощи количественного обратно транскрипционного ПЦР, результаты которого вычисляли по методу 2-AACT (Livak and Schmittgen, 2001).

2.7.1. Вестерн-блоттинг

Экспрессию и фосфорилирование белков в опухолях и клеточных линиях определяли при помощи метода Вестерн блот.

Для выделения белкового лизата из опухолей, фрагменты опухолей (~10-20 мг) гомогенизировали, с использованием стеклянных бусин, как описано в разделе 2.6, в лизисном буфере Tissue Protein Extraction Reagent T-Per с добавлением смеси ингибиторов протеаз cOmplete Mini (1 таблетка на 10 мл лизисного буфера) и фосфатаз Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail. Гомогенат инкубировали на льду 30 минут и осаждали 10 минут при 104 об/мин; супернатант переносили в чистую пробирку. Концентрацию белка в лизате определяли калориметрически при помощи набора реагентов BCA (Pierce, США) по инструкции производителя; в качестве контроля использовали серию стандартных разведений БСА.

Лизаты разделяли в 4-12% SDS-ПААГ геле NuPAGE (наносили 15 мкг белка на лунку) в буфере MOPS SDS и переносили на PVDF-мембрану в буфере для переноса (25 мМ Tris, 192 мМ глицина, 20% метанола, 0,001% SDS) методом электроблоттинга. Для блокировки неспецефических связываний, мембраны в течение часа полоскали в 5% растворе сухого молока в PBST (0,1% Tween 20 в PBS) и оставляли инкубироваться в растворе первичных антител на ночь. Первичные антитела предварительно разводили в 3% БСА в PBST. На следующее утро мембрану трижды отмывали в PBST и выдерживали в растворе вторичных антител (растворяли в 5%-ном молоке в PBST), конъюгированных с пероксидазой хрена, в течение часа при комнатной температуре. Далее мембраны 5 минут выдерживали в растворе SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, США). Люминесценцию фиксировали на фотографическую плёнку. Изображения, полученные на фотоплёнке,

отцифровывали при помощи сканера и квантифицировали на компьютерной программе ImageJ. В качестве загрузочного контроля использовали Р-актин.

Для выделения белкового лизата из клеточных культур, клетки растили до образования монослоя в шестилуночных плашках, промывали ледяным PBS, добавляли в лунки 0,2-0,5 мл лизисного буфера Mammalian Protein Extraction Reagent M-Per, после чего собирали клетки клеточным скребком. Клеточные суспензии в лизисном буфере инкубировали на льду 30 минут. Далее лизат центрифугировали 10 минут при 104 об/мин, после чего супернатант переносили в чистую пробирку. В остальном процедура анализа была аналогична описанной в выше.

Экспрессию нефосфорилированных белков нормализовали к экспрессии загрузочного контроля в соответсвующем геле. Экспрессию фосфорилированных маркеров нормализовали к экспрессии нефосфорилированной формы соответствующего белка. На графиках показаны усреднённая экспрессия маркеров, полученная по меньшей мере из трёх повторных анализов.

2.7.2. Коиммунопреципитация

Белковые комплексы осаждали при помощи магнитных бусин Dynabeads Protein A (Invitrogen) по инструкции производителя. Вкратце, 50 мкл суспензии бусин добавляли к 200 мкл раствора первичных антител, специфических к pSTAT3, в PBST и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее бусины отделяли при помощи магнита, промывали PBST, добавляли к ним клеточный лизат (500-1000 мкл). После инкубирования в течение 30 минут при комнатной температуре, бусины снова отделяли при помощи магнита, трижды промывали промывочным буфером, и элюировали в 20 мкл буфера для элюции. Элюэнты разделяли в 412% SDS-ПААГ геле, переносили на PVDF мембрану и инкубировали в растворах антител, специфических к NEDD9, pFAK или pSrcY527. В качетве отрицательного контроля использовали элюэнты, полученные с

бусин, которые вместо инкубации в растворе первичных антител инкубировали в растворе IgG. В качестве положительного контроля при загрузке использовали неосаждённый клеточный лизат.

2.7.3. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток

Для иммунофлюоресцентного окрашивания, клетки MOVCAR 5009 растили на стерильных стеклянных предметных стёклах в нормальных условиях. Затем клетки фиксировали в 4% ПФА в PBS (15 минут), пермеабилизировали в 100% метаноле (30 минут) и блокировали в 5% ослиной сыворотке в буфере для разведения (PBS с добавлением 0,3% Triton X-100) в течение 60 минут. Далее клетки окрашивали антителами к винкулину, NEDD9, pFAKY397, pSrcY416 и pSTAT3Y705. Для этого предметные стёкла с клетками на них покрывали тонким слоем раствора антител в буфере для разведения и инкубировали в течение ночи при +4оС. Наутро клетки промывали PBS и инкубировали во вторичных антителах, конъюгированных с флюорохромом (60 минут). После этого, для визуализации ядер, клетки инкубировали в 0,3 ^M растворе DAPI (Thermo Scientific, США) в PBS (5 мин) и промывали PBS. Препараты накрывали покровными стёклами и фотографировали при помощи флюоресцентного микроскопа.

2.8. Статистический анализ

Статистический анализ данных проводили при помощи компьютерной программы GraphPad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., США). Полученные результаты представлены средними значениями (M), и стандартной ошибкой (±SEM). Группы сравнивали, с использованием непараметрического двустороннего t-критерия Уилкоксона. Статистически достоверным принималось различие при значении p<0,05. Для обозначения статистической значимости на графиках применили следующие знаки: * -p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001, **** - p<0,0001

3.1. Роль N£009 в развитии спонтанного ЭРЯ

3.1.1. Влияние делеции Nedd9 на развитие спонтанных опухолей яичников

Для определения влияния N£009 на развитие спонтанных опухолей яичников, рост ОЯ в мышах MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MSПR-TAg;Nedd9'/' отслеживали при помощи МРТ. В эксперимент включили 30 мышей каждого генотипа, из которых до окончания эксперимента выжило 24 MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и 27 MSПR-TAg;Nedd9'/' животных. Анализ результатов МРТ показал, что Nedd9-нокаутные мыши развивали опухоли статистически достоверно медленее контрольных (рис. 7А).

Количество метастатических узелков, обнаруженных в перитонеальных полостях и абдоминальных органах MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей было в среднем ниже, чем в Nedd9+/+ животных: 3,0 ± 1,6 против 4,7 ± 1,5. Однако это различие не оказалось статистически достоверным (рис. 7Б).

Кроме того, делеция Nedd9 привела к снижению развития опухолевых асцитов в MISIIR-TAg мышах (рис. 7В), однако и здесь наблюдаемые различия не оказались статистически достоверными.

Таким образом, было показано, что экспрессия N£009 ускоряет рост спонтанных эпителиальных опухолей яичника. Наблюдавшаяся у MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей тенденция к снижению метастазирования ОЯ и развития асцитов может быть принята как дополнительное свидетельство участия N£009 в положительной регуляции роста и развития спонтанной карциномы яичников.

/Ш5//Я-ТД g;Nedd9*/t МЯИЯ-ТАд^ссШ'

Рисунок 4. А: рост спонтанных опухолей яичников в MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышах. Для удобства на рисунке отображены значения линейных трендов графиков роста опухолей; каждая точка на графике соответствует одной мыши. Б: количество метастатических узелков в MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышах. В: частота развития опухолевых асцитов в MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышах.

3.1.2. Влияние делеции Nedd9 на молекулярную сигнализацию в опухолях

MISIIR-TAg мышей

Далее провели скрининг экспрессии ряда белков в опухолях MISIIR-Tag мышей, выбранных на основе публикаций об участии МЕВВ9 во внутриклеточной сигнализации (см. раздел 1.4). Это были белки, участвующие в интегриновой сигнализации (РАК, Бгс), воспалительных

Рисунок 8. Анализ влияния делеции Nedd9 на белковую экспрессию в спонтанных ОЯ MSПR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей. Образцы Вестерн-блотов (сверху) и данные количественного анализа (снизу).

процессах (БТАТЗ), апоптозе (АКТ1), эпителиально-мезенхимальном переходе (Т'ШБТ! Е- и ^кадгерины), и клеточном делении (ЕКК1/2, АЦРКА). Экспрессия каждого белкового маркера была проанализирована по меньшей мере в восьми опухолях каждого генотипа (рис. 8).

Наиболее близким к МЕВВ9 по строению и функциям является скаффолд-белок р130СаБ (Т1кИшуапоуа et al., 2010). Учитывая функциональную схожесть двух белков, не исключалась возможность компенсаторного повышения экспрессии р130СаБ в ОЯ в ответ на делецию Nedd9. Однако в опухолях MISIIR-TAg мышей не было выявлено Nedd9-зависимых различий в экспрессии р130СаБ.

В опухолях MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей обнаружено понижение уровня автофосфорилирования БАК в Туг397 и тенденция к пониженному фосфорилированию БАК в Туг861. При этом изменения уровня экспрессии общего БАК не выявлено.

Фосфорилирование Бгс в Туг527 в TAg;Nedd9'/' опухолях было значительно выше, чем в опухолях контрольных мышей. В то же время, делеция Nedd9 в мышах MISIIR-TAg не привела к значимым изменениям в экспрессии общего Бгс в ОЯ. Судя по фосфорилированию в Туг416, делеция Nedd9 также не привела к изменениям в киназной активности Бгс.

Показано, что БТАТ3 может участвовать в метастазирвоании ОЯ через регуляцию клеточной миграции, однако механизмы данной регуляции неизвестны (ОгЙБта et al., 2015). Учитывая важную роль МЕВВ9 в клеточной миграции, мы предположили, что МЕВВ9 может осуществлять регуляцию БТАТ3. Действительно, в спонтанных опухолях MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей наблюдалось понижение уровня активированной формы БТАТ3, фосфорилированной в Туг705 при отсутствии изменений в общей экспрессии БТАТ3.

Кроме того, делеция Nedd9 в MISIIR-TAg мышах привела к понижению активации АКТ1 в ОЯ, о чём говорило снижение уровня фосфорилирования АКТ1 в Бег473. Различий в общей экспрессии АКТ1 между Nedd9'/' и Nedd9+/+ опухолями не обнаружено.

Интересно, что опухоли MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей продемонстрировали повышение общей экспрессии БЯКШ. Тем не менее,

изменений в уровнях активированных форм ERK1/2, фосфорилированных в Thr202/Tyr204, выявлено не было.

Как было упомянуто ренее, NEDD9 - единственный член семейства CAS, принимающий участие в клеточном делении через непосредственное связывание и регуляцию AURKA Pugacheva et al., 2007. В ОЯ MISIIR-TAg;Nedd9-/- мышей уровень общей экспрессии AURKA был значимо понижен.

В опухолях мышей MISIIR-TAg наблюдалась коэкспрессия NEDD9 и Е-кадгерина. Nedd9-зависимых изменений в экспрессии N-кадгерина и TWIST1 обнаружено не было.

3.2. Влияние NEDD9, экспрессируемого в микроокружении опухоли, на

развитие ЭРЯ

3.2.1. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на развитие

опухолей яичников

В разделе 1.4.3.5 было упомянуто, что NEDD9 участвует в миграции лимфоцитов через регуляцию интегриновой сигнализации. В то же время присутствие некоторых популяций иммунных клеток может способствовать развитию ЭРЯ (см. раздел 1.3). Исходя из этих посылок, мы предположили, что понижение туморогенных процессов в MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышах может быть связано изменениями в микроокружении опухоли, в частности понижением инфильтрационных возможностей иммунных клеток.

Для проверки данной гипотезы смоделировали развитие NEDD9-положительных опухолей в клеточном микроокружении, не экспрессирующем NEDD9.

В общей сложности аллографты (клетки MOVCAR 5009-luc) вживили в 35 мышей каждого генотипа, из которых выжили 27 MISIIR-TAg-low;Nedd9"'' и 29 MISIIR-TAg-low;Nedd9+,+ животных. Мыши реципиенты обоих генотипов достигли критерия для эвтаназии за равные промежутки времени (52.8 ± 9.8 дней у Nedd9'-' мышей против 53.1 ± 9.6 дня у Nedd9+,+ мышей). Важно

Рисунок 9. А: объёмы аллографтов MISIIR- TAg;Nedd9 и MISIIR-TAg;Nedd9' /' мышей на момент эвтаназии; Б: графики роста аллографтов в MISIIR-TAg-low;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg-low;Nedd9" мышах. На графиках отображно отнешение флюоресценции в данную неделю к таковой в первую неделю; В: количество метастастатических узелков в MISIIR-TAg-low;Nedd9+,+ и MISIIR-TAg-low;Nedd9'-' реципиентах; Г: частота мышей-реципиентов, развивших асциты.

отметить, что гистологически аллографты были близки к спонтанным опухолям, образующимся в MISIIR-TAg мышах. На рис. 9А видно, что в среднем на момент эвтаназии аллографты мышей обоих генотипов были равного объёма.

Как показано на рис. 9Б, рост аллографтов в MISIIR-TAg-low;Nedd9',' реципиентах шёл несколько быстрее, чем в контрольной группе, однако статистической достоверности данное различие не достигло.

По итогам некропсии, в перитонеальных полостях и на абдоминальных органах MISIIR-TAg-low;Nedd9мышей было обнаружено в среднем 76,5 ± 12,4 метастатических узелка, в то время, как у мышей контрольной группы -по 53,3 ± 7,0 (рис. 9В).

Частота развития асцитов составила 22 из 28 (79%) у MISIIR-TAg-low;Nedd9''' и 17 из 29 (59%) у MISIIR-TAg-low;Nedd9+'+ реципиентов (рис. 9Г). Средние объёмы асцитов составили 2,3 ± 0.6 мл для Nedd9+,+ мышей и 3.34 ± 0.9 (не показано).

Таким образом, делеция Nedd9 в микроокружении опухоли не только не задержало рост и распространение Nedd9+f+ аллографтов, но и напротив, на уровне тенденции способствовало росту и метастазированию ОЯ.

3.2.2. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на молекулярную

сигнализацию в опухолях яичников

Для понимания биохимических процессов, происходящих в ОЯ при делеции Nedd9 в микроокружении опухоли, аллографты, выделенные из MISIIR-TAg-low;Nedd9+'+ и MISIIR-TAg-low;Nedd9''' мышей (n=4 для каждого генотипа), подвергли анализу экспрессии того же ряда белков, который анализировался в спонтанных опухолях MISIIR-TAg-мышей. Результаты анализа, проведённого методом Вестерн-блот, представлены на рис. 10.

Экспрессия большинства исследованых белков не различалась достоверно между аллографтами Nedd9+f+ и Nedd9'/' мышей. В то же время, общая экспрессия FAK была значимо выше в опухолях MISIIR-TAg-low;Nedd9'-' мышей. Более того, в аллографтах MISIIR-TAg-low;Nedd9-/-мышей наблюдалась тенденция к повышению фосфорилированных форм Src, AKT и ERK. Это позволяет заколючить, что в основе повышенной туморогенности аллографтов, описанных в предыдущем подразделе, в MISIIR-TAg-low;Nedd9-/- мышей лежат определённые молекулярные изменения.

Рисунок 5. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на протеиновую экспрессию в ОЯ. Сверху - примеры Вестерн-блотов, снизу -данные количественного анализа.

3.2.3. Влияние делеции Nedd9 на инфильтративность клеток системы

иммунитета

Далее исследовали влияние экспрессии МЕВВ9 на иммунное микроокружение имплантированных ОЯ MISIIR-TAg-low;Nedd9'/' и MISIIR-Tag-low;Nedd9+/+ мышей (п=6 для каждого генотипа). В перитонеальных экссудатах MISIIR-TAg-low;Nedd9'/' мышей количество естественных

Рисунок 11. Присутствие СБ45+ЫК1 .1 СЭЭе естественных киллеров (ЫК-клеток) в перитонеальном экссудате в MISIIR-Tag-low;Nedd9+/+ и ШБПЯ-TAg-low;Nedd9'/' мышей при наличии Nedd9+/+ аллографтов. Пример результатов приведён на точковом графике; указано процентное оотношение ЫК-клеток в общей популяции СЭ45+-клеток. На гистограмме показаны средние значения количества ЫК-клеток в перитонеальных смывах данного генотипа мышей-реципиентов.

киллеров было в среднем ниже, чем в животных контрольной группы (рис. 11). Количественных различий между другими проанализированными клеточными популяциями обнаружено не было (не показано).

Аналогичный анализ провели на опухолях, органах и смывах MISIIR-TAg мышей, развивающих спонтанный ЭРЯ. Исследовали наличие тех же популяций клеток, что и у MISIIR-TAg-low мышей. Было выявлено статистически достоверное уменьшение в количестве СВ45+СЭ4+ Т-лимфоцитов в селезёнках MISIIR-TAg-low;Nedd9'/' мышей (рис. 12).

Рисунок 12. Инфильтрация CD45+CD4+ Т-хэлперов в селезёнки MISIIR-Tag;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9'/' мышей. Пример полученных результатов приведён на точковом графике; указано процентное соотношение Т-хэлперов в общей популяции CD45+-клеток. На гистограмме справа - средние значения количества Т-хэлперов в селезёнке мышей данного генотипа.

3.3. Влияние экспрессии NEDD9 в клетках первычных опухолей на развитие эпителиального рака яичников

3.3.1. Влияние делеции Nedd9 на агрессивность клеток ЭРЯ in vitro

Итак, нами было показано, что экспрессия NEDD9 в микроокружении опухоли не играет значительной роли на рост и распространении ЭРЯ. Для исследования роли внутренней экспрессии NEDD9 в опухолевых клетках на развитие и молекулярную сигнализацию в ОЯ, провели серию in vitro экспериментов на группах Nedd9+/+ (MOVCAR 6111, 5009, 8248, 8250) и Nedd9'-' (MOVCAR 136, 143, 145, 168) клеточных линий, выделенных ранее из MISIIR-TAg мышей соответствующего генотипа.

Одна из первых описанных функций NEDD9 - это участие в интегриновой сигнализации и, как следствие, в клеточной адгезии. Анализировали адгезию MOVCAR клеток к фибронектину и коллагену I типа, компонентов ВКМ. Эксперименты не выявили различий между Nedd9+/+ и Nedd9'-' линиями MOVCAR в адгезии к этим субстратам (рис. 13,

Рисунок 13. Слева: анализ адгезии клеток MOVCAR к фибронектину. На гистограмме приведены данные для индивидуальных клеток (обозначены соответствующими номерами), и средние для данного генотипа (обозначены как Nedd9+/+ и Nedd9'/'). Справа: анализ пролиферации клеток MOVCAR, приведены средние значения для линий данного генотипа.

слева; данные адгезии к коллагену не приведены; здесь и далее тёмным цветом обозначены Nedd9+/+, светлым - Nedd9'/' клеточные линии).

NEDD9 также часто упоминается как фактор, способствующий клеточной пролиферации. Пролиферацию оценивали при помощи колориметрического реагента CyQuant (Thermo). Анализ не выявил различий, связанных с Nedd9-генотипом, в пролиферации клеток MOVCAR (рис. 13, справа).

Хемотаксис играет важную роль в метастатическом распространении злокачественных опухолей. Хемотактическую миграцию MOVCAR-клеток в градиенте ФБС измеряли на системе xCELLigence. Эксперименты выявили повышенный хемотаксис Nedd9+/+-клеток при наличии градиента ФБС (рис. 14, слева; индекс миграции - отношение значений миграции в градиенте ФБС к таковому в отутствие градиента). В то же время, было замечено, что в контрольных лунках без градиента ФБС Nedd9-'-клетки в среднем более мигративны, чем Nedd9+/+-клетки (не показано).

Рисунок 14. Инвазия клеток MOVCAR в слое Матригеля. Слева - инвазия в градиенте ФБС, справа - индексы инвазии.

Далее, также на системе xCELLigence, провели анализ инвазивности MOVCAR клеток в слое Матригеля. Достоверных различий в инвазивности между клетками разных генотипов обнаружено не было (рис. 14, справа). Однако, как и при анализе миграции, была замечена повышенная инвазивность Nedd9'/' клеток в отсутствие градиента ФБС (не показано).

Неожиданное наблюдение ускоренного перехода Nedd9-' клеток MOVCAR из верхнего цилиндра камеры Бойдена в нижнюю в условиях отсутствия градиента хемоаттрактанта могло указывать на повышенную спонтанную мигративность Nedd9"/"-клеток in vitro. Для поддтверждения этого наблюдения, дополнительно провели анализ миграции клеток в монослое при моделировании раны, отражающий способноость клеток к коллективной миграции, которая наблюдается in vivo в обширном ряде карцином (Крахмаль и др., 2015). На приведённом на примере микрофотографии отчётливо видно, что «рана» на монослое Nedd9-' клеток за 12 часов эксперимента сомкнулась сильнее, чем у контрольных клеток (рис. 15).

Рисунок 15. Коллективная миграция клеток MOVCAR при моделировании раны. Слева: примеры микрофотографий, клетки линий MOVCAR Nedd9+/+ 8250 и Nedd9'/' 136. Лидирующий фронт монослоя отмечен пунктиром. Справа: данные количественного анализа для индивидуальных клеточных линий и средние для всех клеток данного генотипа (в правой части гистограммы).

3.3.2. Подтверждение in vitro наблюдений при помощи нокдауна Nedd9 в

Nedd9+n клетках ЭРЯ

Для доказательства того, что наблюдавшиеся в Nedd9-' MOVCAR клетках эффекты вызваны именно делецией Nedd9, провели эксперименты с нокдауном гена NEDD9 в культурах клеток ЭРЯ человека (A1847 и NIH:OVCAR5) и мыши (MOVCAR 6111 и 5009). Для каждой клеточной

M0VCAR61.11

«-» «+» 1 2

ИЕ009 (3-актин

А1847

«-» «+» А Б

N£009 (3-актин

М0\/САК 5009 «-» «+» 1 2

— — —

—

СЛ/СА1*5

«+» А Б

• в

N£009 (3-актин

ЫЕ009 (3-актин

Рисунок 16. Проверка нокдауна гена NEDD9 в клеточных линиях ЭРЯ мыши (сверху) и человека (снизу). «-» и «+»- клетки, трансдуцированные, соответственно, контрольными векторами, не содержащими кшРНК, и содержащим кшРНК к GFP. 1, 2, А, Б - клетки, трансдуцированные различными кшРНК к гену NEDD9.

линии использовали две независимые кшРНК, специфичные к гену NEDD9, а также две контрольные кшРНК. Эффективность нокдауна на белковом уровне определяли методом Вестерн-блот (рис. 16).

Далее проанализировали эффект нарушения экспрессии NEDD9 на адгезию клеток к фибронектину и коллагену I типа и миграцию в монослое при моделировании раны. Нарушение экспрессии NEDD9 не привело к значимым изменениям адгезивности клеточных линий ЭРЯ человека и мыши (не показано). В то же время выявлено статистически достоверное повышение коллективной миграции всех проанализированных клеток при нарушении экспрессии NEDD9 (рис. 17).

Рисунок 17. Миграция монослоя клеток ЭРЯ мыши (слева) и человека (справа). Для условных обозначений см. рис. 16. Все значения сравнивались с

3.3.3. Влияние внутриклеточной делеции Nedd9 на агрессивность ЭРЯ in vivo

Далее смоделировали делецию Nedd9 в первичных ОЯ в контексте опухолевого микроокружения с нормальной экспрессией NEDD9.

Было проведено четыре независимых эксперимента, в каждом из которых использовались разные пары Nedd9+/+ и Nedd9'-' клеточных линий MOVCAR. Изначально каждая клеточная линия была имлантирована в 10 мышей. До окончания эксперимента выжили 35 мышей с Nedd9+/+ и 34 мыши с Nedd9'-' имлантами. Как показано на рис. 18, две из имплантированных клеточных линий (8250 и 145), не вызвали образования опухолей спустя продолжительное время после имплантации (соответственно, 24 и 23 недели). Мыши, в которых были имплантированы клетки MOVCAR 8250 145 были исключены из последующего анализа. Оставшиеся аллографты разных генотипов на момент эвтаназии в среднем имели опухоли равных объемов.

Делеция Nedd9 имела значительный отрицательный эффект на развитие первичных опухолей в MISIIR-TAg-low мышах. Во-первых, Nedd9'/' аллографты в среднем росли значительно медленнее контрольных (102 ± 7 дня для Nedd9'-' против 74 ± 4 дней для Nedd9+/+ опухолей; рис. 19А).

Рисунок 18. Объёмы Nedd9+ и Nedd9 аллографтов в MISIIR-TAg-

low;Nedd9+ + мышах-реципиентах на момент эвтаназии.

Во-вторых, в мышах с Nedd9'/' аллографтами, количество метастатических узелков на стенках перитонеальной полости и абдоминальных органах было значительно меньшим (30.7 ± 4.2 против 69.0 ± 3.7; рис 19Б и 19В).

В-третьих, как показано на рис. 19Г и 19Д, отсутствие экспрессии МЕВВ9 в первичных опухолях привело к уменьшению частоты появления асцитов (17 из 25 [68%] против 26 из 26 [100%]) и их среднего объёма (3.2 ± 0.9 мл против 9.4 ± 0.8 мл).

3.3.4. Влияние делеции Nedd9 в первичных опухолях на молекулярную

сигнализацию

Очевидно, что в основе резкой разницы влияния МЕВВ9 на агрессивность МОУСДЯ клеток в культуре и в аллографтах лежали изменения в молекулярной сигнализации. Поэтому мы провели исследование экспрессии того же ряда белков, что были исследованы в предыдущих экспериментах, в Nedd9+/+ и Nedd9'/' аллографтах. Для анализа, из каждой серии имплантаций аллографтов использовали по четыре Nedd9+/+ и Nedd9'/' опухоли. Обобщённые данные экспрессии исследованных белковых

маркеров в аллографтах из трёх экспериментах представлены на гистограмме на рис. 20.

В некоторых Nedd9-' аллографтах наблюдалась небольшая экспрессия NEDD9, которая объясняется присутствием в опухоли стромального компонента. Судя по фосфорилированию Tyr397 и Tyr861, уровень активации FAK был значительно ниже в Nedd9-' аллографтах. Активация Src была также понижена, о чём говорило повышенное фосфорилирования в Tyr527 и тенденция к понижению фосфорилирования в Tyr416 в Nedd9-' ОЯ. Кроме того, Nedd9-' аллографты продемонстрировали значимое понижение общей экспрессии FAK и STAT3, а также выраженную тенденцию к понижению общей экспрессии AURKA и фофсфорилирования AKT. Кроме того, Nedd9-' опухоли обнаружили статистически достоверное снижение экспрессии E-кадгерина.

Рисунок 19. А: средняя продолжительность роста аллографтов до достижения критерия для эвтаназии; Б: количество метастатических узелков в мышах-реципиентах, в которых были имплантированы соответствующие клеточные линии; В: то же, средние значения для мышей-реципиентов Nedd9+/+ и Nedd9'/' аллографтов; Г: частота развития асцитов и Д: средний объём асцитов в мышах-реципиентах Nedd9+/+ и Nedd9'/' аллографтов.

Рисунок 20. Молекулярная сигнализация в Nedd9 и Nedd9' ' аллографтах. Сверху: примеры Вестерн блотов. Для нормализации значений белковой экспрессии в разных опухолях, использовали лизат одного из аллографтов из первой имплантации (отмечен красной стрелкой). Снизу: данные количественного анализа. Показаны усреднённые значения экспрессии для всех трёх пар аллографтов.

клетках ЭРЯ

3.4.1. Регуляция активации и локализации STAT3 в фокальных контактах

клеток ЭРЯ

Мы показали, что делеция Nedd9 приводит к понижению уровня активированной формы STAT3 в опухолях яичников. Ранее было сообщено о том, что FAK и Src принимают участие в локализации активированной формы STAT3 в фокальных контактах (Silver et al., 2004). Для понимания роли NEDD9 в данном процессе, а также для исследования механизма активации STAT3 белками фокальных контактов, были проведены следующие эксперименты. Клетки MOVCAR 5009, трансдуцированные кшРНК к Nedd9 (HmNEDD9), киРНК к Stat3 (raSTAT3), Fak (raFAK) или Src (^Src), окрашивали антителами, специфичными к винкулину (маркеру фокальных контактов) и pSTAT3. Нарушение экспрессии NEDD9 и активации STAT3, FAK и Src оценивали при помощи Вестерн-блот анализа (рис. 21Б)

Экспрессия pSTAT3 наблюдалась как в ядрах клеток, так и в областях фокальных адгезий, о чём говорила колокализация pSTAT3 с DAPI и винкулином, соответственно (рис. 21А). При этом в клетках, трансдуцированных кшNEDD9, наблюдалось общее снижение уровня pSTAT3, и в частности локализации pSTAT3 в фокальных адгезиях. То же было характерно и для клеток, трансдуцированных ^FAK, но не ^Src. Уровень экспрессии фосфорилированной формы STAT3 в клетках, трансдуцированных кшРНК и киРНК сравнивали с таковым в клетках, трансдуцированных контрольным вектором (рис. 21 А).

А Винкулин pSTAT3 % Б

Рисунок 21. Иммунофлюоресцентный анализ локализации pSTAT3 в клетках MOVCAR 5009. А: клетки, трансдуцированные векторами с кшРНК или киРНК, а также контрольные клетки, трансдуцированные пустыми векторами. Клеточные ядра окрашены DAPI, светятся синим. Б: нокдаун генов Stat3, Nedd9, Fak и Src в клетках MOVCAR 5009 оценивали при помощи Вестерн-блота.

3.4.2. Исследование образования комплекса между pSTAT3Y705, NEDD9 и

pFAKY397

Таким образом, можно было заключить, что NEDD9 регулирует активацию STAT3 в фокальных контактах через FAK. Для того, чтобы понять, каким образом происходит данная активация - через физическое связывание NEDD9 и FAK к STAT3, или опосредованно, мы провели

ИП: рБТАТЗ

ИП: рБТАТЗ

Лизат ИП ^

Лизат ИП ^

Тубул и н

р5ТАТЗ

Винкулин

рРАК*397

Рисунок 22. Коиммунопреципитация активированной формы БТАТЭ с №ЮБ9 (слева) и активированной формой БАК (справа). ИП -иммунопреципитация, в качестве положительного контроля использовали неосаждённый белковый лизат, в качестве отрицательного контроля - элюэнт бусин, инкубированных в 1§0.

иммунопреципитацию активированной формы БТАТЭ и проверили наличие комплекса БТАТЭ с МЕВВ9 и активированной формой БАК. Как показано на рис. 22, рБТАТЭ осаждался в комплексе как с №ЮБ9, так и с рЕАК¥397, что говорит о физическом взаимодействии между этими белками.

3.5. N£009 как регулятор генной экспрессии в контексте ЭРЯ

3.5.1. Влияние делеции Nedd9 на генную экспрессию в опухолях MISIIR-TАg

мышей

Для оценки влияния делеции гена Nedd9 на общую генную экспрессию в опухолях MISIIR-TАg-мышей, провели полногеномный скрининг экспрессии мРНК в опухолях MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9-/-мышей.

Получены следующие результаты. Сорок шесть проб мРНК были идентифицированы как наиболее различающиеся по экспрессии (рис. 23)

Рисунок 23. Экспрессия мРНК генов, наиболее различавшаяся в опухолях MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9-/-. Nedd9, Foxj1 и Bmpr1b отмечены красными стрелками.

Среди них было 14 кодирующих последовательностей с неописанными функциями и 32 известных гена. Краткая информация по каждому из этих генов приведена в Таблице 3.

На рис. 24 графически представлена система взаимодействий между продуктами генов, регулируемых Nedd9, построенная в компьютероной программы Cytoscape (Institute for Systems Biology, США) на основе данных, полученных в он-лайн базе данных GeneMania (GeneMania, 2016).

Таблица 3. Гены, регулируемые Nedd9 в опухолях яичников

Символ Соотношение экспрессии в опухолях Nedd9-/- и Nedd9+/+ Функция белкового продукта

Acss3 5.2 Активирует ацетат для его участия в биосинтезе липидов и производстве энергии (UniProt, 2016).

Atp2b2 16.0 Транспортирует кальций из клетки с использованием энергии АТФ. Участвует в работе вестибулярного и слухового аппаратов (UniProt, 2016).

Bmpr1b 19.9 Рецептор костного морфогенетического белка 7 (BMP7). Участвует в активации SMADов. Положительно регулирует дифференциацию хондроцитов (NCBI, 2016).

Cacna1g 8.2 Низкопороговый кальциевый канал Т-типа. Участвует в работе водителей ритма сердца (NCBI, 2016).

Cox6a2 0.110 Структурная субъединица цитохром с-оксидазы. Кодируются ядерным геномом. Участвует в сборке и регуляции работы комплекса цитохромоксидазы. Экспрессируется в поперечнополосатой мышечной ткани (NCBI, 2016).

Cyp2c44 2.6 Эпоксигеназа, участвует в превращениях арахидоновой кислоты. Экспрессируется в почках и стенках сосудов (Wang et al., 2014b).

Dmc1 0.088 Важный регулятор гомологичной рекомбинации при мейозе (NCBI, 2016).

Символ Соотношение экспрессии в опухолях Nedd9-/- и Nedd9+/+ Функция белкового продукта

Dusp26 4.9 Фосфатаза, обладающая двойной специфичностью: дефосфорилирует остатки как серина и треонина, так и тирозина. Среди субстратов - DUSP26 -MAPK1 и p53. Возможно участие в пролиферации нейронов и развитии глиобластомы (NCBI, 2016).

Fbln2 0.120 Относится к фибулинам, компонентам ВКМ. Связывается с различными внеклеточными лигандами, в т.ч. Ca2+; играет роль в процессе дифференциации компонентов скелета, нервной системы и сердца (NCBI, 2016).

Fdxr 0.226 Митохондриальный флавопротеин, транспортирующий электроны c NAPDH на комплексы ЭТЦ (Imamichi et al., 2014).

Foxjl 71.7 Транскрипционный фактор класса fork head. Регулирует транскрипцию ряда генов, контролирующих сборку двигательных ресничек, а также развитие право-левой асимметрии (NCBI, 2016).

Galntl4 4.7 Катализирует начальную реакцию биосинтеза O-связанных олигосахаридов (NCBI, 2016).

Kcnrg 4.5 Регулирует активность потенциал-зависимых калиевых каналов (NCBI, 2016).

Lin7a 6.4 Играет роль в асимметричном распределении каналов и рецепторов на плазматической мембране поляризованных клеток. Возможно участие в распределении синаптических везикул (UniProt, 2016).

Lrrtml 27.6 Модулирует клеточную адгезию при формировании нейрональных синапсов. У человека один из вариантов гена связан с повышенным риском развития шизофрении (Francks et al., 2007, Siddiqui et al., 2010).

Lypdl 2.9 Молекулярные функции неизвестны. Экспрессируется в нейронах. Нокаут гена приводит к повышению беспокойного поведения у

Символ Соотношение экспрессии в опухолях Nedd9-/- и Nedd9+/+ Функция белкового продукта

мышей (Tekinay et al., 2009).

Macrod2 2.7 Деацитилирует O-ацетил-АДФ рибозу, продукт деацитилирования гистонов и других белков (UniProt, 2016).

Mal2 30.7 Компонент липидных рафтов. Распологается, как правило, на апикальной стороне плазматической мембраны поляризованных клеток. Участвует в трансцитозе (NCBI, 2016).

Naaa 3.1 Преобразует биоактивные жирные амиды до соответствующих кислот (UniProt, 2016).

Nedd9 0.049 См. текст

Nell1 44.9 Регулирует активность важнейшего остеогенного фактора транскрипции Runx2. Вызывает дифференциацию и минерализацию остеобластов (UniProt, 2016).

Podxl 4.7 Экспрессируется на апикальной поверхности гломерулярных клеток и подоцитов, а также на поверхности эндотелия сосудов и гемопоэтических стволовых клеток. Функциональный лиганд E- и L-селектинов (Heby et al., 2015).

Ppp2r2c 81.3 Модулятор субстратной избирательности и каталитической активности протеиновой фосфатазы 2 (PP2A) (NCBI, 2016).

Ptprv 0.101 Ключевой медиатор р53-индуцированного ареста клеточного цикла (NCBI, 2016).

Rpgr 5.3 Участвует в сборке подвижных ресничек. Экспрессируется в палочках сетчатки глаза и необходим для их работы (NCBI, 2016).

Rsph4a 12.6 Компонент радиальной спицы, структурного компонента аксонемы двигательных ресничек и жгутиков (NCBI, 2016).

Символ Соотношение экспрессии в опухолях Nedd9'/' и Nedd9+/+ Функция белкового продукта

Slclal 27.7 Транспорт глутамата, аспартата и цистеина через ЦПМ. В головном мозге необходим для постсинаптической остановки действия глутамата и быстрого удаления последнего из синаптической щели (UniProt, 2016).

Synl 0.186 Относится к белкам синапсинам, играет роль в аксоногенезе и синаптогенезе (NCBI, 2016).

Tbx2 20.9 Важный транскрипционный регулятор генов, участвующих в дифференциации мезодермы в эмбриогенезе. Действует как транскрипционный репрессор, например через гистоновую деацетилазу 1 (HDAC1) (Wang et al., 2012).

Tnnil 0.212 Один из трёх субъединиц тропониного комплекса поперечнополосатых мышц. Блокирует связывание актина и миозина, что приводит к расслаблению мышцы (NCBI, 2016).

Tppp3 16.4 Связывается с тубулином, участвует в сборке микротрубочек в пучки. Возможно, участвует в клеточной пролиферации и митозе (NCBI, 2016).

Vaxl 0.066 Транскрипционный фактор. Необходим для формировании аксонов в эмбриональном переднем мозге. Возможно, принимает участие в развитии зрительного аппарата (UniProt, 2016).

Экспрессия повышена Экспрессия понижена Дополнительные маркеры

- Колокализация

---- Коэкспрессия

Предполагаемое взаимодействие |_| функция неизвестна

Рисунок 24. Взаимодействие генов, регулируемых Nedd9 в опухолях яичников MISIIR-TAg мышей. Изменение экспрессии данного гена показано относительно Nedd9'/' опухолей. Nedd9 на схеме расположен внизу справа. Гены были условно разделены по выполняемым функциям (перечислены на легенде, справа). Гены, обозначенные серым, были автоматически предложены программой для удобства построения связей.

Рисунок 25. Экспрессия генов Bmpr1b и Foxj1 в опухолях мышей MISIIR-TAg;Nedd9+/+ MISIIR-TAg;Nedd9'/'.

Судя по имеющимся в литературе данным, одноимённые продукты генов Bmpr1b и Foxj1, обратно регулирующихся Nedd9 в опухолях MISIIR-TAg мышей, ассоциированные соответственно, с предопухолевыми состояниями и опухолями яичников (Edson et al., 2010, Sui et al., 2013)

Для подтверждения того, что Nedd9 регулирует Bmpr1b и Foxj1 на генетическом уровне, провели количественную обратно-транскрипционную ПЦР (кОТ-ПЦР) с соответствующими праймерами. Полученные данные, приведённые на рис. 25, подтверждали результаты полногеномного скрининга.

Влияение NEDD9 на экспрессию BMPR1B и FOXJ1 на белковом уровне исследовали при помощи Вестерн-блот анализа. Изменений в экспрессии BMPR1B, ассоциированных с делецией Nedd9 в ОЯ MISIIR-TAg мышей, обнаружено не было. Экспрессия же FOXJ1 оказалась обратно ассоцирована с экспрессей NEDD9 (рис. 26).

Рисунок 26. Примеры Вестерн-блотов (сверху) и данные количественного анализа экспрессии BMPR1B и FOXJ1 (снизу, приведены средние значения для четырёх опухолей каждого генотипа).

3.5.2. Участие NEDD9 в экспрессии генов, регулируемых FOXJ1

Далее исследовали влияние делеции Nedd9 на экспрессию генов, регулируемых FOXJ1. Для этого объединили два опубликованных списка транскрипционных мишеней FOXJ1 (Didon et al., 2013, СИок^ et al., 2014) и выбрали повторяющиеся гены, экспрессию которых в опухолях MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9'/' измерили при помощи кОТ-ПЦР. Краткое описание функций белков, кодируемых проанализированными генами приведено в таблице 4.

Для анализа использовали РНК, выделенную из четырёх спонтанных опухолей М181Ж-ТА§ каждого генотипа. Как показано на рис. 27, экспрессия

всех генов, регулирующихся геном БОХЛ, была значительно выше в опухолях MSПR-TAg;Nedd9'/'.

Таблица 4 Экспрессия генов, регулируемых БОХ1 в опухолях

MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MSПR-TAg;Nedd9'/'

Символ Соотношение экспрессии в опухолях Nedd9'/' и Nedd9+/+ Краткая информация о белковом продукте

Dnali1 85.0 Продукт гомолога гена, кодирующего внутренние динеиновые ручки у Chlamydomonas. Участвует в биении двигательных ресничек (КСБ1, 2016)

Dynlrb2 92.3 Некаталитический структурный компонент комплекса цитоплазматического динеина 1 (КСБ1, 2016)

т 40.8 Член суперсемейства моторных белков кинезинов (ишРго1:, 2016)

Шк5 90.9 Обладает серин-триониновой активностью. Экспрессия данного белка достигает максимума в 02 фазе, что говорит об его участии в клеточном делении (ишРго1:, 2016)

Rsph4a 116.9 Входит в состав головки радиальной спицы, компонента аксонемы двигательных ресничек. Является скаффолдом для передачи сигнала от центральной пары микротрубочек к динеинам. Мутации в гене Rsph4a приводят к цилиарной дискинезии (КСБ1, 2016)

Spa17 2.8 Находится на поверхности клеток. Возможно участие в клеточно-клеточной адгезии, миграции и метастазировании иммунных клеток (КСБ1, 2016)

Spag6 73.5 Участвует в биении жгутика сперматозоидов, возможна связь с бесплодием у мужчин (КСБ1, 2016)

Tuba1a 2.8 Альфа-тубулин, один из структурных компонентов микротрубочек (КСБ!, 2016)

5п

ОД

о 4-1

и <1 <3

сч

3-

к ^

и и

ш о

о.

с

и

^ -И

ГГ) 11

-2

9

1

¿1

£

1

□ А¡ес!с19+/+

¿1

Л

«Р ^ ^ -<£ лл А»

/ ^ // ^ ^ / ^ ✓

Во всех случаях р<0,05

Рисунок 27. Экспрессия генов, регулируемых Foxj1, в опухолях мышей MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9-/-. Приведены средние логарифимированных значений экспрессии по каждому генотипу.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Рак яичников является одним из опаснейших видов злокачественных патологий. Сложность ранней диагностики и неэффективность терапии приводят к тому, что до 70% пациенток умирают в первый год после постановки диагноза (Никогосян и Кузнецов, 2013). При этом до 90% случаев рака яичников являются карциномами, поэтому именно эпителиальный рак яичников вносит основной вклад в структуру смертности от РЯ (Савельева и др., 2009).

В настоящей работе исследовали влияние скаффолд-протеина N£009, участвующего в развитии широкого ряда солидных и гематологических опухолей, на экспрессию и активацию некоторых онкогенных белков в контексте ЭРЯ, а также на рост и метастазирование карциномы яичников. Особое внимание уделяли белкам, участвующим в работе фокальных контактов, так как большинство известных функций N£009 связаны с работой этих структур, непосредственно участвующих в клеточной миграции и передаче сигналов от интегринов к нижерасположенным мишеням. Кроме того, в настоящей работе была предпринята попытка исследовать роль клеточного микроокружения в развитии ЭРЯ, а также участие гена Nedd9 в регуляции генной экспрессии в опухолях яичников.

Роль N£009 в развитии спонтанных ОЯ изучалась при помощи мышей линии MISIIR-TAg, развивающих билатеральные спонтанные ОЯ, гистологически идентичные ЭРЯ человека. Другую, сингенетическую модель ЭРЯ на основе мышей MISIIR-TAg-low, использовали для того, чтобы понять, отличается ли влияние экспрессии N£009 на развитие ЭРЯ в первичной опухоли от такового в клеточном микроокружении опухоли.

Наши результаты показывают, что N£009 положительно влияет на рост и метастазирование как спонтанноразвивающихся (рис. 7А и Б), так и ортотопически имплантированных опухолей яичника (рис. 19А-В). При этом критическое влияние оказывает экспрессия N£009 в первичной опухоли, но не в клеточном микроокружении: как показано в серии ортотопических

имплантаций Nedd9+/+ и Nedd9-' клеток в MISIIR-TAg-low мышей, отсутствие экспрессии NEDD9 в аллографтах приводит к резкому замедлению развития и понижению количества метастазов. Интересно, что при этом общие суммарные объёмы метастазов обоих генотипов не различаются, что может говорить об ускоренном распространении опухолей, экспрессирующих NEDD9. Важным с точки зрения потенциального приложения результатов данного исследования в клинике является демонстрация положительного влияния NEDD9 на частоту развития опухолевых асцитов и их объём (рис. 7В, 19Г и 19Д). Как упоминалось ранее, наличие асцита является отрицательным прогностическим фактором, снижает продолжительность жизни и значительно ухудшает качество жизни больных ЭРЯ (Kipps et al.,

2013).

В контексте карциномы яичников NEDD9 регулирует сигнализацию фокальных контактов. Этот вывод следует из следующих наблюдений. Делеция Nedd9 как в спонтанных ОЯ (рис. 8), так и в аллографтах (рис. 20), приводит к снижению уровня автофосфорилирования FAK в Tyr397. Напомним, автофосфорилирование FAK в Tyr397 происходит в ответ на кластеризацию интегринов, создавая сайты присоединения для других белков, в частности Src (Sulzmaier et al., 2014). В свою очередь, Src дополнительно фосфорилирует FAK в Tyr861 и других сайтах, и повышает киназную активность последнего (Sulzmaier et al., 2014). Повышение уровня

Y527 /

pSrc в Nedd9'' опухолях (спонтанных и имплантированных, рис. 8 и 20) говорит о пониженной активности Src, так как в ответ на фосфорилирование в Tyr527 Src принимает неактивную конформацию (Vlaeminck-Guillem et al.,

2014). Делеция Nedd9 в спонтанных ОЯ закономерно привела к тенденции к пониженного фосфорилирования FAK в Tyr861 как в спонтанных, так и в имплантированных опухолях (рис. 8 и 20). Полученные биохимические данные согласуются с более ранним сообщениям о положительной роли NEDD9 в активации белков фокальных адгезий, полученных на мышиной модели РМЖ (Izumchenko et al., 2009, Little et al., 2014), а также на культурах

клеток и клинических образцах РШМ (Sima et al., 2013) и глиобластомы (Natarajan et al., 2006).

В настоящей работе впервые показано, что NEDD9 регулирует активацию транскрипционного фактора STAT3 в ОЯ in vivo (рис. 8) и локализацию активированной формы STAT3 (pSTAT3Y705) в фокальных контактах клеток карциномы яичников (рис. 21). Кроме экспрессии NEDD9, для локализации STAT3 в ФК была необходима экспрессия активной формы киназы FAK, но не Src (рис. 21), причём pSTAT3Y705 формировал комплекс с NEDD9 и pFAKY397 (рис. 22). По всей видимости, NEDD9 выполняет скаффолдинговые функции в процессе фосфорилирования STAT3 киназой FAK в фокальных контактах клеток ЭРЯ. Эти результаты дополняют полученные нами ранее данные о положительной роли STAT3 в мигративности и адгезивности клеток ЭРЯ in vitro, а также в перитонеальном распространении ЭРЯ в мышах (Gritsina et al., 2015).

Как было указано в разделе 1.3.2, AKT1 принимает участие в целом ряде про-онкогенных процессов, в том числе препятствует апоптозу и способствует мигративности клеток ЭРЯ. Наши данные показывают, что NEDD9 способствует повышению киназной активности AKT1 в ОЯ (рис. 8 и 20). Учитывая то, что активация митогенной киназы ERK в ОЯ не зависела от экспрессии NEDD9, можно предположить, что замедленние роста Nedd9-' спонтанных опухолей и аллографтов (рис. 7A и 19A) - с одной стороны -связано связано с понижением активности AKT1; напомним, что AKT1 препятствует апоптозу, опосредованно приводя к деградации супрессоров опухолей p53 и p73 (Basu, 2003). С другой стороны, NEDD9 положительно регулировал общую экспрессию митотической киназы Aurora A в спонтанных опухолях яичников и аллографтах (рис. 8 и 20), что указывает на возможную роль NEDD9 в регуляции роста эпителиальных опухолей яичников. Отметим, что нами не получено данных об участии NEDD9 в активации Aurora A киназы in vivo по причине отсутствия в продаже антител, специфических к фосфорилированным формам Aurora A мыши.

Судя по данным экспрессии E- и N-кадгеринов, а также транскрипционного регулятора TWIST1, NEDD9 не способстует ЭМП в опухолях яичников in vivo. Напротив, как в спонтанных опухолях, так и в аллографтах, наблюдалось положительное влияние NEDD9 на экспрессию E-кадгерина. Казалось бы, это противоречит данным, полученным на культурах клеток и мышиной модели рака молочной железы (см. раздел 1.4.3.4). Объяснить повышение экспрессии E-кадгерина в опухолях мышей MISIIR-TAg и Nedd9+/+ аллографтах мышей MISIIR-TAg-low можно следующим образом. Как упоминалось в разделе 1.3.5, в норме E-кадгерин не экспрессируется в поверхностном эпителии яичников. В процессе малигнизации клетки ПЭЯ сначала повышают экспрессию E-кадгерина, а затем теряют её, после чего могут отслаиваться и метастазировать. По всей видимости, причиной повышения экспрессии E-кадгерина в Nedd9+/+ ОЯ (рис. 8 и 20) стала не положительная регуляция со стороны NEDD9, а б0льшая степень злокачественности этих опухолей, о чём говорят и перечисленные выше данные о повышение активации FAK, Src, STAT3 и AKT.

Вне контекста опухоли NEDD9 также положительно влияет на злокачественность клеток ЭРЯ. В частности, нами показано, что клетки MOVCAR, экспрессирующие NEDD9, проявляли больший хемотаксис in vitro (рис. 14, слева). В то же время, делеция Nedd9 достоверно повышала спонтанную мигративность клеток MOVCAR in vitro (рис. 15). Последнее явление можно было объяснить тем, что делеция Nedd9 способствовала селекции более агрессивных клеток в мышах MISIIR-TAg. Подобное было ранее описано в мышах, развивающих спонтанный РМЖ (Singh et al., 2010; см. разд. 1.4.3.2). В нашем случае данной гипотезе противоречили следующие результаты. Во-первых, как было отмечено, делеция Nedd9 привела к уменьшению хемотаксиса в клетках MOVCAR in vitro. Во-вторых, нарушение экспрессии NEDD9 при помощи кшРНК в Nedd9+/+ MOVCAR-клетках и клетках ЭРЯ человека привело к тому же эффекту, что и в Nedd9-'

клетках MOVCAR (рис. 17). В-третьих, при возврате в опухолевую среду (имплантации в мышей MISIIR-TAg-low), Nedd9+/+ клетки развивались в более агрессивные опухоли по сравнению с Nedd9'/' аллографтами (рис. 19Б).

Из последнего наблюдения следует второе возможное объяснение повышенной мигративности Nedd9'/' клеток MOVCAR in vitro: эффект внутриклеточной экспрессии NEDD9 на агрессивность клеток ЭРЯ зависит от условий их роста и не проявляется в двумерной культуре. В литературе имеются данные, поддерживающие данное предположение. Так, ранее было показано, что Nedd9'/' мышиные эмбриональные фибробласты мигрировали быстрее контроля в условиях двумерного роста, и медленнее - в условиях роста в трёхмерном матриксе (Zhong et al., 2012). Оказалось, что NEDD9 стабилизирует фокальные адгезии. В отсутствие же экспрессии NEDD9 ФК обладают большей динамичностью, что приводит к повышенной мигративности Nedd9-' клеток в двумерной системе (Zhong et al., 2012).

Таким образом, можно предположить, что внутриклеточная экспрессия NEDD9 может способствовать развитию ЭРЯ через повышение хемотаксиса клеток данной карциномы. При этом, влияние NEDD9 на фенотипические характеристики клеток ЭРЯ происходит через регуляцию онкогенной молекулярной сигнализации, которая в свою очередь зависит от условий роста клеток. Способность NEDD9 индуцировать онкогенную сигнализацию в клетках ЭРЯ проявляется в контексте опухоли. Кроме того, побочно была подчёркнута важность подтверждения in vitro данных в животных моделях, так как проявление отрицательных свойств потенциально онкогенным белком, в данном случае NEDD9, может зависеть от условий роста раковых клеток. Разрабатывающиеся сегодня in vitro системы, позволяющие симулировать рост клеток в опухоли, могут в будущем повысить достоверность данных, полученных на культурах клеток (Schreiter et al., 2012, Edmondson et al., 2014, Ravi et al., 2015).

В настоящей работе, при помощи сингенетической модели ЭРЯ, впервые исследована роль NEDD9, экспрессируемого клеточным

микроокружением опухоли, на развитие злокачественного новообразования. Интересно, что делеция Nedd9 из клеточного микроокружения привела к тенденции ускоренного роста и метастазирования аллографтов, а также увеличения частоты встречаемости опухолевых асцитов (рис. 9). В то же время в брюшном экссудате MISIIR-TAg-low;Nedd9-/- мышей наблюдалось понижение количества NK1.1+CD3e+ естественных киллеров (рис. 11). Ранее Rowley с коллегами показали, что блокировка NK1.1+ лимфоцитов мышей способствует росту опухолей, образованных интраперитонеально введёнными клетками карциномы яичника (Rowley et al., 2008). Важно отметить, что авторы проводили своё исследование на мышах C57BL/6 - той же линии мышей, что была использована при получении трансгенных мышей линий MISIIR-TAg и MISIIR-TAg-low для настоящей работы.

Снижение перитонеальной инфильтарции NK-клеток в ответ на делецию Nedd9 в опухолевом микроокружении, однако, не наблюдалось у MISIIR-TAg животных, развивающих спонтанные опухоли. Исследование органов и тканей последних выявило NEDD9-зависимое повышение аккумуляции CD4+ Т-хэлперов в селезёнках MISIIR-TAg;Nedd9~/~ мышей (рис. 12). Различий в присутствии других популяций имунных клеток в тканях MSIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9-/' мышей выявлено не было. Принимая во внимание роль NEDD9 в регуляции миграции лимфоцитов (см. раздел 1.4.3.5), можно допустить, что повышение присутствия CD4+-клеток в MISIIR-TAg;Nedd9'/' животных вызвано затруднённой миграцией Т-хэлперов из селезёнки.

Онкогенная сигнализация имплантированных ОЯ в целом не зависела от генотипа клеточного микроокружения по Nedd9: за исключением киназы FAK, общая экспрессия которой была повышена в аллографтах, имплантированных в Nedd9'/' мышей, Nedd9-зависимых различий в экспрессии и активации белков фокальных контактов и их нижерасположенных мишеней (pAKT и pERK), а также экспрессии белков-участников ЭМП (TWIST1, E- и N-кадгерины) обнаружено не было (рис. 10).

Таким образом, показано, что несмотря на некоторую тенденцию положительного влияния экспрессии NEDD9 в имунном микроокружении опухоли на агрессивность ЭРЯ, в целом экспрессия NEDD9 в клеточном микроокружении опухоли не влияет на молекулярную сигнализацию ЭРЯ, его развитие и распространение. Исходя из этого, можно, в частности, заключить, что NEDD9 малопригоден как маркер для малоинвазивной диагностики ЭРЯ, например, через анализ крови.

Значительный интерес представляют результаты скрининга экспрессии мРНК в опухолях мышей MISIIR-TAg;Nedd9+/+ и MISIIR-TAg;Nedd9-/-. Нами показано, что экспрессия NEDD9 приводит к изменениям в транскрипции ряда генов, участвующих в эмбринальном развитии и функционировании нервной системы, работе мышц, остеогенезе, везикулярном транспорте, клеточном делении и миграции, а также общем метаболизме (таблица 3). Особенно интересно то, что данная регуляция имеет место в опухолях яичников. Вероятно, в будущем для некоторых из генов, экспрессия которых, судя по нашим данным, регулируется Nedd9, будет показана роль в развитии ЭРЯ. С другой стороны, полученные в ходе данного исследования данные о регуляции экспрессии ряда генов, указывают на новые потенциальные направления исследований роли NEDD9 в патологиях человека. В частности, достойна внимания теоретическая возможность участия гена NEDD9 в развитии шизофрении и анофтальмии через регуляцию экспрессии генов LRRTM1 и VAX1, соответственно (Ludwig et al., 2009, Slavotinek et al., 2012).

Кроме вышеизложенного, в данной работе показано, что в спонтанных ОЯ NEDD9 осуществляет отрицательную регуляцию транскрипционного фактора FOXJ1 на генном и белковом уровнях (рис. 25 и 26). Это приводит к изменениям в экспрессии ряда генов, регулируемых FOXJ1 (таблица 4, рис. 27). Среди них особенно интересны гены, принимающие участие в работе подвижных ресничек. Напомним, что NEDD9 участвует в регуляции работы первичных ресничек, активируя тубулиновую деацетилазу HDAC6 через

киназу АЦЕКА (Р^асИеуа et al., 2007). Полученные нами данные об участии МЕВВ9 в транскрипционной регуляции генов, кодирующих структурные компоненты подвижных ресничек и жгутиков {ВпаШ, Dynlrb2, К/9, ЯярИ4а, $>ра%6 и ТиЬа1а), позволяют предположить до настоящего времени неизвестную роль МЕВВ9 в регуляции этих органелл.

103 ВЫВОДЫ