Влияние транскрипционного фактора Dlx5 на онкотрансформацию T-лимфоцитов у трансгенных мышей, экспрессирующих активированную форму протеинкиназы Akt2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Тимахов, Роман Анатольевич
Тимахов, Роман Анатольевич
кандидат биологических наук
2012
- Специальность ВАК РФ03.01.03
- Количество страниц 109
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимахов, Роман Анатольевич
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Киназа АКТ. История открытия
1.2. Строение АКТ
1.3. Активация АКТ и ее роль в передачи сигнала
1.3.1. Роль АКТ-киназы в контроле пролиферации
1.3.2. АКТ-киназы и выживаемость клеток
1.3.3. АКТ-киназы как регуляторы метаболизма
1.3.4. АКТ и клеточный рост
1.4. Процессы, происходящие при повреждении сигнального пути АКТ
1.5. in vivo модели активации АКТ 18 1.5.1. Активация АКТ в Т-клетках
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Реактивы
2.2 Создание трансгенной линии мышей
2.3 Работа с культурами клеток
2.3.1. Культивирование клеток в жидких средах
2.3.2. Культивирование клеток в мягком агаре
2.4. Кариотипирование и FISH
2.5. Выделение ДНК
2.6. Выделение РНК
2.7. Нозерн-блоттинг
2.8. ПЦР
2.9. ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени
2.10. FACS/проточная сортировка клеток
2.11. Ретровирусная трансдукция лимфоцитов
2.12. РНК-интерференция 2
2.13. Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах 29 (array CGH)
2.14. Вестерн-блоттинг
2.15. Подготовка лигандов и молекулярный докинг 3
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Создание линий трансгенных мышей LCKmyrAkt2, 32 спонтанно развивающих агрессивные Т-клеточные лимфомы
3.2. Детальный анализ транслокации t( 14; 15)
3.3.Детальный анализ inv(6)
3.4. Выявление потенциальных онкогенов на границах инверсии
3.5. Свойства Dlx5 как онкогена
3.6. Поиск низкомолекулярных ингибиторов Dlx5
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ 76 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный альбумин,
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,
кДНК - кодирующая ДНК,
мРНК - матричная РНК,
ОТ-ПЦР - ПЦР после обратной транскрипции,
п.н. - пары нуклеотидов,
ПЦР - полимеразная цепная реакции,
РНК - рибонуклеиновая кислота,
рРНК - рибосомная РНК,
т.п.н. - тысячи пар нуклеотидов,
Ig-подобный - иммуноглобулин-подобный,
FBS - fetal bovine serum (эмбриональная телячья сыворотка),
PB S - Phosphate buffer saline (фосфатно-солевой буфер),
PIN - prostate intraepitelial neoplasia (простатическая интраэпителиальная
неоплазия), PIP3 - фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат,
PIP2 - фосфатидилинозитол 4,5-дифосфат,
Runx2 - Runt-подобный транскрипционный фактор 2 (Runt-related transcription factor 2),
T-ALL - Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, TBS - Tris buffer saline (трис-солевой буфер), 5'ТОР - 5' концевой олигопипримидиновый участок, РКА - протеинкиназа А, РКС - протеинкиназа С,
RAG - Специфичные для Т-лимфоцитов рекомбиназы, продукты генов, активирующих рекомбинацию (recombination activating genes — RAG) RSS - сигнальная последовательность рекомбинации (recombination signal sequence), распознаваемая рекомбиназами RAG.
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Молекулярная биология», 03.01.03 шифр ВАК
Роль NEDD9 в регуляции онкогенной молекулярной сигнализации в эпителиальных опухолях яичников2016 год, кандидат наук Габбасов Рашид Тагирович
«Исследование активации MAPK и PI3K протеинкиназных сигнальных каскадов у больных c волосатоклеточным лейкозом, с В-клеточным хроническим лимфоцитарным лейкозом, В-клеточной селезеночной лимфомой из клеток маргинальной зоны»2017 год, кандидат наук Якутик, Игорь Александрович
Роль PIK- киназ в клеточном ответе на ядрышковый и репликативный стрессы2020 год, кандидат наук Лужин Артем Васильевич
Роль белка NEDD9 в регуляции прогрессирования немелкоклеточного рака легкого и ответа на терапию данного заболевания2023 год, кандидат наук Тихомирова Мария Владимировна
Исследование молекулярных механизмов дерегуляции супрессора опухолевого роста PDCD4 в опухолевых клетках2014 год, кандидат наук Вихрева, Полина Никитична
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние транскрипционного фактора Dlx5 на онкотрансформацию T-лимфоцитов у трансгенных мышей, экспрессирующих активированную форму протеинкиназы Akt2»
ВВЕДЕНИЕ
В современной клинической практике для борьбы с онкологическими заболеваниями используется широкий набор лекарственных средств, однако даже при использовании всех доступных препаратов доля больных, отвечающих на терапию, очень невелика. Это свидетельствует о необходимости разработки новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний, основанных на глубоком понимании молекулярных механизмов канцерогенеза.
За прошедшее время было выяснено, что в механизмах канцерогенеза одну из ключевых ролей играют протеинкиназы. Так, у мышей было идентифицировано семейство, включающее три изоформы Akt-протеинкиназ, гомологичных онкобелку v-akt. Показано, что Akt-киназы играют ключевую роль в процессах онкотрансформации, контролируя такие важные процессы как пролиферация и выживаемость, стабильность генома, клеточный размер/рост, метаболизм глюкозы и неоваскуляризацию. Стало очевидно, что Akt-киназы - важные участники сигнального каскада, состоящего из таких белков как PI3K, PTEN, mTOR, eIF4E и NF-kB. В то же время была обнаружена частая гиперактивация АКТ-киназ в опухолях человека, а в дальнейшем показано, что большинство из белков АКТ каскада ассоциировано с развитием онкологических заболеваний.
Исследования in vivo показали, что повреждения отдельных звеньев сигнального каскада Akt (АКТ) приводят к развитию новообразований, а кооперация с другими онкогенами определяет возникновение более агрессивных фенотипов. Однако, было установлено, что конститутивная активация той или иной изоформы самой Akt-киназы в клетках молочной железы, простаты и поджелудочной железы трансгенных модельных мышей не приводит к опухолеобразованию, тогда как в незрелых Т-клетках происходит раковое перерождение. Наличие у этих мышей латентного периода продолжительностью в 10-20 недель, предшествующего развитию
злокачественных лимфом, позволил предположить, что механизм генерации лимфом является опосредованным, и для полной трансформации требуются дополнительные генетические события/участники.
Цель и задачи работы. Целью этой работы было выяснение на моделях трансгенных мышей механизмов онкотрансформации, происходящей при активации протеинкиназы Akt2 в Т-лимфоцитах.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Создать трансгенные линии мышей, в которых используется Lck промотор для запуска экспрессии конститутивно активированной (за счет миристилирования) формы Akt2 на ранних стадиях развития тимоцита; у этих Lck-MyrAkt2 мышей изучить случаи спонтанного опухолеобразования и цитогенетические изменения, возникающие в Т-клеточных лимфомах.
2. Идентифицировать гены, затронутые хромосомными перестройками у Lck-MyrAkt2 мышей, и показать, что они обладают онкогенным потенциалом.
3. Разработать низкомолекулярные ингибиторы для продуктов найденных генов и выяснить, блокируют ли эти молекулы пролиферацию Lck-MyrAkt2 лимфомных клеток, содержащих специфические хромосомные перестройки.
Научная новизна и практическая значимость работы. Получена новая Akt-трансгенная мышиная модель, уникальной особенностью которой является способность развивать опухоли спонтанно. При кариотипировании развивающихся злокачественных лимфом в нескольких независимых линиях мышей наблюдали две повторяющиеся от опухоли к опухоли (recurrent) соматические хромосомные абберации, затрагивающие локусы генов Т-клеточных рецепторов: транслокацию хромосом 14 и 15 — t(14;15) и инверсию хромосомы 6 - inv(6). Показано, что результатом транслокации t(14;15) является повышение экспрессии известного онкогена с-тус.
Что касается инверсии хромосомы 6, то ее границы затрагивают ген эмбрионального транскрипционного фактора Dlx5, что приводит к
драматическому повышению продукции последнего. Впервые показано, что ген Э1х5 является онкогеном: сверхэкспрессия Б1х5 в клетках мыши вызывает повышение пролиферативной активности, а подавление его экспрессии с помощью РНК-интерференции, напротив, снижает пролиферативный потенциал клеток. Сверхэкспрессия гена БЬХ5 была обнаружена в клинических образцах 3 из 7 исследованных лимфом человека. По результатам скрининга панели образцов опухолей человека N0-60 экспрессия БЬХ5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака.
На основании анализа кристаллической структуры транскрипционного фактора БЬХ5 предсказано несколько десятков химических структур его лигандов. После тестирования на культурах клеток 14-ти предсказанных соединений для 2 из них впервые показана специфическая способность блокировать пролиферацию АкЙ-трансгенных лимфомных клеток мыши с инверсией хромосомы 6, характеризующихся повышенной экспрессией 01x5, в отличие от АШ-трансгенных лимфомных клеток, не экспрессирующих В 1x5.
Поиск и изучение молекулярных процессов, вовлеченных в развитие опухолей, является необходимым условием для создания новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний. Настоящая работа позволила идентифицировать ген й1х5 (ОЬХ5) как ранее неизвестный онкоген, который может служить мишенью для терапевтического воздействия при Т-клеточных лимфомах, а, возможно, и при других злокачественных новообразованиях, и выявила несколько перспективных низкомолекулярных ингибиторов белка ВЬХ5.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 АКТ. История открытия
В 1977 г в Национальном институте здоровья США (NHI) от мышей линии AKR, развивающих Т-клеточные лимфомы, был выделен ретровирус, в последствии названный АКТ8 (AKR Thymoma №8) [1]. Оказалось, что ретровирус несет онкоген, названный \-Akt, для которого у человека в дальнейшем были найдены гомологи. Первым картированным гомологом л?-Akt у человека стал ген АКТ1 на хромосоме 14 [2], позднее ген А KT2 был картирован на хромосоме 19 [3, 4]. Чуть позже на хромосоме 1 был обнаружен и ген АКТЗ [5]. Анализ последовательности у-Akt выявил высокую степень гомологии с киназами группы протеинкиназы С (РКС).
1.2. Строение АКТ-киназ
Все АКТ-киназы человека относятся к классу AGC-киназ (related to AMP/GMP kinase and protein kinase С), который включает также все 3'-фосфотидилинозитид-зависимые киназы (РКА, РКС, PDK1). АКТ-киназы содержат три консервативных домена: N-концевой PH-домен (гомологичный плекстрину), киназный домен и С-концевой гидрофобный домен [6].
Кристалическая структура PH-домена АКТ была разрешена с высокой точностью; было показано, что с ним с одинаковой афинностью взаимодействует фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфат (PIP3) и фосфатидилинозитол-(3,4)-дифосфат (PIP2) [7].
Аминокислотные последовательности киназных доменов всех трех изоформ АКТ различаются на один аминокислотный остаток в АТФ-связывающей области: А1а230 в АКТ1 заменен на А1а232 в АКТ2 и Val228 в АКТЗ. Киназные домены АКТ-киназ высокогомологичны киназным доменам других представителей класса AGC-киназ [8].
Третий домен каждой из изоформ АКТ представляет собой С-концевой «хвост» длиной около 40 аминокислотных остатков. Эта область содержит FXX-F/Y-S/T-Y/F гидрофобный мотив (где X - любой аминокислотный остаток), который характерен для семейства протеинкиназ AGC. Этот гидрофобный мотив - характерная особенность всех AGC-киназ, а также киназ р70 и р90 рибосомного белка S6 [9].
1.3. Активация АКТ-киназы и ее роль в передаче сигнала
Активация АКТ - это многоступенчатый процесс передачи сигнала, который инициируется связыванием гормона роста или цитокинов со своими рецепторами и включает транслокацию АКТ из цитоплазмы в мембрану с последующим фосфорилированием АКТ [10]. Отдельные этапы этого процесса схематически представлены на рис. 1 и будут поэтапно рассмотрены ниже.
Критический этап передачи сигнала - фосфорилирование фосфатидилинозитол-3-киназой PI3K мембрансвязанных фосфатидилинозитов с образованием PIP3 и PIP2. Оба фосфолипида связываются с РН-доменом АКТ и способствуют ее транслокации в плазматическую мембрану. В мембране АКТ фосфорилируется по двум положениям: в киназном домене по остатку треонина (Thr308 в АКТ1, Thr309 в АКТ2 или Thr305 в АКТЗ) и в С-концевом домене по остатку серина (Ser473, Ser474 или 472), что приводит к активации АКТ.
»Himvtf«
у
/ V
У 1
tell growth, transtotian
cell proliferation
Рис 1. Сигнальный каскад АКТ
Фосфорилирование в киназном домене абсолютно необходимо для активации АКТ, тогда как С-концевое фосфорилирование повышает активность АКТ, вероятно, способствуя копформационным изменениям в киназном домене. Фосфорилирование 5ег473 в С-концевом домене осуществляется с помощью РВК1, другой РН-домен-содержащей АСС-киназы, также активируемой через Р1РЗ и Р1Р2 [11, 12].
Наряду с активацией, существуют и механизмы инактивации АКТ. Сигнальный каскад РТЗК/АКТ напрямую ингибируется фосфатазой РТПМ, дефосфорилиругощей по З'-положению фосфорилированые фосфоинозитидь! [13]. В инактивации АКТ также могут участвовать некоторые другие серин-треониновые фосфат азы. включая протеи нфосфатазу 2А, [14, 15].
1.3.1. Роль АКТ-киназы в контроле пролиферации
АКТ участвует в огромном спектре происходящих в клетке процессов, начиная с контроля пролиферации и выживаемости клеток до метаболизма глюкозы и роста сосудов (Рис 1). Большинство субстратов АКТ, за некоторыми исключениями, содержат консенсусную последовательность RXRXXS/T, распознаваемую и фосфорилируемую киназой.
Пролиферативное действие АКТ связано с фосфорилированием множества субстратов. К примеру, фосфорилирование белка GSK3P, приводящее к его ингибированию, предотвращает деградацию циклина D1 [16]. По такому же механизму происходит активация mTOR-пути, в результате чего усиливается трансляция мРНК циклинов D1 и D3 [17]. Кроме того, АКТ напрямую ингибирует действие белков-ингибиторов клеточного цикла p21WAF1 и p27Kipl: фосфорилирование с помощью АКТ остатков, расположенных в этих белках рядом с сигналом ядерной локализации, приводит к задержке их переноса из цитоплазмы в ядро [18].
1.3.2. АКТ-киназы и выживаемость клеток
Известно, что АКТ может ингибировать процессы апоптоза посредством нескольких независимых механизмов, что в конечном итоге приводит к повышению выживаемости клеток [17, 19, 20]. АКТ - одна из киназ, фосфорилирующих про-апоптотический фактор BAD, что предотвращает выход цитохрома С из митохондрий и является ключевым моментом, запускающим каспазный каскад [21]. Параллельно, АКТ напрямую способна ингибировать каспазный каскад, фосфорилируя прокаспазу-9, а также фосфорилированием повышая стабильность ингибитора каспазы-3, PED/PEA15 [22]. Как упомянуто выше, АКТ, фосфорилируя p21WAF1[23], ограничивает его вход в ядро, в
результате чего он связывается в цитоплазме с киназой ASK1, ингибируя апоптоз. АКТ также ограничивает вход в ядро транскрипционных факторов семейства forkhead по механизму, сходному с ингибированием p27Kipl, а именно фосфорилируя его сигнал ядерной локализации, и тем самым препятствует транскрипции проаптотических генов Fas ligand, BIM, TRAIL и TRADD.
Кроме того, АКТ повышает транскрипцию антиапоптотические генов BFL1, cIAPl и сIAP2, регулируемую NF-кВ. Это достигается тем, что АКТ активирует путем фосфорилирования киназу IKK, которая в свою очередь инактивирует белок-ингибитор 1кВ, способствующий выведению NF-кВ из ядра.
Все больше данных указывает и на анти-апоптотические функции AKT/mTOR сигнального пути, но в то же время, все детали процесса до конца не исследованы и, скорее всего, связаны с регулируемой mTOR трансляцией мРНК [24].
Кроме того, АКТ может ингибировать р53-зависимые точки контроля клеточного цикла, влияя на апоптоз через регуляцию субклеточной локализации ингибитора р53, Mdm2. Известно, что фосфорилирование Mdm2 с помощью АКТ необходимо для локализации Mdm2 в ядро, где этот белок может образовывать комплекс с р53 и усиливать его убиквитин/протеасомно-опосредованную деградацию [25].
1.3.3. АКТ-киназы как регуляторы метаболизма
Одна из важных функций АКТ-киназ связана с регуляцией метаболизма глюкозы [26, 27]. Первым свидетельством, указывающим на эту роль АКТ-киназ, стало наблюдение, что синтез гликогена возрастает после фосфорилирования АКТ-киназой и последующей инактивации киназы 3 гликогенсинтазы GSK3ß [28]. Кроме того, известно, что инсулин усиливает
транспорт глюкозы, что опосредовано через фосфорилирование с помощью АКТ транспортеров глюкозы GLUTI и GLUT4 [29] (Рис 1). АКТ также стимулирует гликолиз через фосфорилирование фосфофруктокиназы 2 [30]. Действительно, в последнее время было обнаружено, что активация АКТ напрямую ответствена за усиленный гликолиз в опухолевых клетках в анаэробных условиях [31]. В раковых клетках, постоянно экспрессирующих активную форму АКТ, гликолиз проходит на повышенном уровне, в связи с чем увеличивается образование молочной кислоты, а также отношение NAD(P)H/NAD(P) [31]; в то же время потребление кислорода, влияющее на окислительное фосфорилирование, остается прежним [31]. Это явление было описано как "эффект Варбурга" более 50 лет назад [32].
1.3.4. АКТ и клеточный рост
Клеточный рост - это ответ клетки на увеличение количества питательных веществ. Роль АКТ-семейства в росте клетки была открыта в экспериментах на мушках Drosophila. Гомолог АКТ у Drosophila, Daktl, в раннем эмбриогенезе регулирует апоптоз [33], а в позднем эмбриогенезе модулирует передачу сигнала с рецептора инсулина, что стимулирует рост клетки и увеличивает размер органа [34]. Таким образом, Daktl участвует в клеточном ответе на питательные вещества и действует в том же направлении, что и белки клеточного цикла, которые ограничивают деление клеток при недостатке питательных веществ [35].
Клеточный рост модулируется АКТ через киназу mTOR, которая стимулирует синтез белков. Механизм активации mTOR связан с опухолевыми супрессорами TSC1 и TSC2, известными также как гамартин и туберин, дефект каждого из которых приводит к наследственному синдрому, известному как туберозный склероз (см. ниже). Комплекс белков TSC1 и TSC2 ингибирует GTP-азу Rheb, в функцию которой входит активация mTOR (Рис 1). Киназа
АКТ фосфорилирует Т8С2, дестабилизируя его взаимодействие с ТБО [36, 37], что повышает уровень активной, связанной с ГТФ ЯИеЬ и стимулирует тТСЖ-киназную активность [38]. тТ(Ж в свою очередь стимулирует белковый синтез через фосфорилирование мишеней, которые влияют на трансляцию р70-киназы рибосомного белка 86 и белков, связывающих эукаротический фактор инициации 4Е (4Е-ВР) [39, 40, 41, 42, 43]. Фосфорилирование с помощью тТСЖ белков 4Е-ВР снижает ингибирование инициирующего фактора еПЧЕ, который усиливает кэп-зависимую трансляцию мРНК таких белков как циклин Б1, с-Мус и УЕОБ. В то же время фосфорилирование киназой р70 рибосомного белка 86 усиливает трансляцию [39, 44, 45].
Ранние исследования показали, что туберин (ТБС2) находится в центре пересечения негативных и позитивных сигналов. АКТ, фосфорилируя туберин и нарушая его взаимодействие с гамартином, доставляет позитивные сигналы от гормонов роста внутрь клетки. С другой стороны, негативные сигналы, которые сообщают о стрессе, гипоксии, низком уровне энергии и питательных веществ и пр., активируют туберин через его фосфорилирование АМФ-активируемой протеинкиназой (АМРК) [46]. Таким образом, киназа АМРК служит важным регулятор метаболизма, перераспределяющим энергию в зависимости от факторов, способных изменить баланс АМФ/АТФ [47, 48]. При стрессе АМРК фосфорилируется и активирует несколько ключевых мишеней, усиливая окисление жирных кислот и гликолиз. В дополнение, усиливаются реакции катаболизма, так как активация АМРК ингибирует анаболические пути, такие как липогенез, биосинтез холестерола и белковый синтез [47, 48].
Примечательно, что в таких характерных для опухолевых клеток процессах как клеточная инвазия, метастазирование, непрерывный рост сосудов и бесконечный пролиферативный потенциал, АКТ также играет ключевую роль [49]. Так, АКТ способствует ангиогенезу через повышение продукции оксида азота, продуцируемого с помощью фосфорилированной эндотелиальной
синтазы оксида азота (eNOS) [50, 51]. Субъединица теломеразы с активностью обратной транскриптазы также является субстратом АКТ [52]. Кроме того, АКТ играет важную роль в опухолевой инвазии/метастазировании, стимулируя секрецию цитозольных металлопротеиназ [53]. В дополнение, на клетках рака толстой кишки было показано, что активация АКТ усиливает хромосомную нестабильность через повышение количества анафазных сшивок [54].
1.4. Процессы, происходящие при повреждении сигнального пути АКТ
Повреждения сигнального пути АКТ - распространенное явление в опухолевых клетках человека и животных..Так, сигнальный каскад АКТ активирован в опухолях человека посредством различных механизмов, включая амплификацию, сверхэкспресиию и точковые мутации генов АКТ-киназ и ее активаторов. Одним из механизмов, способных активировать киназу АКТ у человека, является делеция гена фосфатазы PTEN или снижение уровня ее экспрессии [55]. Также активировать АКТ могут: повышение копийности/экспрессии гена PIK3CA [56], мутации PIK3CA или PIK3R1 [57, 58], сверхэкспрессия рецепторов ростовых факторов, таких как HER-2/neu при раке молочной железы [23, 59, 60] и эпидермальный стволовой фактор (EGF) в глиобластомах [61], активация PI3K через аутокринную или паракринную стимуляцию рецепторов тирозиновых киназ [62, 63, 64] и/или активация Ras [65]. Более того, в некоторых гематологических опухолях АКТ может быть постоянно активирована другими тирозиновыми киназами, которые в свою очередь активируются благодаря транслокациям. Примерами активации тирозиновых киназ является транслокация t(9;22) при хронической миелоидной лейкемии (CML), приводящая к образованию химерного белка BCR-ABL [66], и транслокация t(2;5), наблюдаемая в некоторых анапластических крупноклеточных лимфомах, приводящая к образованию химерного белка
NPM-ALK [67]. Также активация АКТ-киназ в некоторых опухолях может происходить вследствие точковых активирующих мутаций в киназном домене [68, 69, 70].
С другой стороны, за ингибирование сигнального каскада АКТ часто ответственны делеции, сверхэкспресиия субстрата eIF4E и/или инактивация опухолевых супрессоров (Рис. 1). Однако совершенно очевидно, что гиперактивация АКТ-киназы - это одно из самых распространенных повреждений сигнального каскада АКТ в опухолевых клетках
Рассмотрим данные по активации АКТ-киназы детально.
В 1992 году впервые, в нескольких карциномах яичника, было обнаружено увеличение копийности и повышение экспресии гена АКТ2 [71]. При анализе экспрессии 8 клеточных линий и 15 первичных образцов опухоли в 2 клеточных линиях и 2 первичных опухолях была выявлена повышенная экспресиия АКТ2. В клеточных линиях с повышенной экспрессией АКТ2 была обнаружена амплификация этого гена. В более обширных исследованиях были получены сходные результаты: было продемонстрировано увеличение копийности АКТ2 в 16 из 132 (12%) карцином яичника и только в 3 из 106 (3%) опухолей молочной железы [72]. Нозерн-блот анализ подтвердил повышенную экспрессию АКТ2 в 3 из 25 опухолей яичника без увеличения копийности АКТ2. В нормальных условиях ростовые факторы не способствуют усиленной пролиферации, однако при увеличении копийности/повышенной экспрессии АКТ2 наблюдается более активный ответ на них [18, 73].
Повышение копийности и/или повышение экспрессии АКТ2 наблюдалось в 10-20% опухолях простаты [73, 74, 75], а в двух клеточных линиях (PANC1 и ASPC1) с повышенной экспрессией АКТ2 было обнаружено 30-кратное и 50-кратное увеличение копийности гена АКТ2 и высокие уровни мРНК АКТ2 и самого белка [73]. В той же работе было выяснено, что способность к образованию клетками PANC1 опухолей у nude мышей ингибировалась при
трансфекции с антисмысловой конструкцией к АКТ2, но не с контрольной антисмысловой конструкцией [73]. Более того, клетки PANC1 и ASPC1, как и клетки карциномы простаты, в которых АКТ2 не экспрессируется (COLO 357), были трансфицированы антисмысловой конструкцией к АКТ2. Затем их рост и инвазивность были охарактеризовны на крысах с применением метода трахеальной ксенотрансплантации. Клетки ASPC1 и PANC1, экспрессирующие антисмысловые РНК для АКТ2, оставались в трахеальном просвете, а нетрансфицированые клетки инвазировали в стенку трахеи. Разницы между контролем и клетками COLO 357, трансфицированными антимысловыми конструкциями, не наблюдали. Суммарно эта информация говорит о важной роли АКТ2 в росте и инвазивности человеческих проточных карцином простаты, а также о том, что селективное блокирование экспрессии АКТ2 может иметь важную терапевтическую роль.
Также заметную роль в повышении экспрессии АКТ играют увеличение копийности хромосомной области 19ql3.1-ql3.2, где располагается ген АКТ. Увеличение копийности этой области приводило к увеличению экспрессии АКТ, что было обнаружено в клеточных линиях рака яичника [76]. Кроме того, увеличение копийности АКТ2 было показано в неходжскинских лимфомах [77].
В 40% исследованных гепатоцеллюлярных карцином был обнаружен высокий уровень экспресии белка АКТ2, тогда как экспресиия АКТ1 или варьировала, или была намного меньшей [78]. Увеличение продукции АКТ2, но не АКТ1, оказалось независимым прогностическим маркером при гистохимическом анализе опухолей ободочной и прямой кишки с использованием антител к pan-АКТ [79].
Стабильное увеличения копийности АКТ1 наблюдается очень редко. Общирные исследования 103 злокачественных глиальных опухолей показали только один случай (глиосаркома) с увеличением копийности и экспрессии АКТ1 [80]. Однако, все же в некоторых типах опухолей уровень экспрессии
АКТ1 может повышаться. К примеру, иммуногистохимический анализ большой группы опухолей молочной железы выявил повышение экспрессии АКТ1 в 24% образцов, и только в 4% была обнаружена повышенная экспрессия АКТ2 [81].
До настоящего времени увеличения копийности АКТЗ не наблюдали ни в одной из опухолей человека. Однако дополнительная копия длинного плеча хромосомы l(lq), где располагается АКТЗ, иногда присутствует в различных типах опухолей [82], а это значит, что небольшое повышение копийности АКТЗ все же возможно в некоторых видах опухолей. Так, в ассоциированных с гепатитом С гепатоцеллюлярных карциномах было показано увеличенее копийности генов, располагающихся в lq, включая АКТЗ [83]. Также была показана повышенная экспрессия АКТЗ мРНК в опухолях молочной железы [84].
Фибробласты NIH3T3 могут быть трансформированы при сверхэкспрессии дикого типа АКТ2, однако АКТ1 такой способностью не обладает. Несмотря на это, фибробласты NIH3T3, стабильно экспрессирующие MyrAktl, образуют колонии на мягком агаре и агрессивные опухоли у nude мышей [85, 86, 87]. Также экспрессия v-Akt и My г Akt в клетках карциномы языка приводила к эпителиально-мезенхимальным переходу и повышенной инвазивности [87].
Исследования in vitro на клетках рака молочной железы и яичника человека показали, что повышенная экспрессия АКТ2 повышает экспрессию интегринов ßl и усиливает инвазивность/метастазирование [89]. Более того, трансфекция клеток конструкцией, содержащей неактивный киназный домен (kinase-dead) АКТ2, но не конструкцией с kinase-dead АКТ1 или АКТЗ, предотвращает инвазию, индуцированную активацией PI3K или повышенной экспрессией HER-2/neu.
В совокупности эти эксперименты указывают на то, что из всего семейства АКТ, АКТ2 может иметь наибольшее значение для Р13К-зависимых эффектов, таких как адгезия, подвижность, инвазия и метастазирование.
Описано, что АКТ-киназы часто активированы в самых разных типах опухолей, включая карциномы, глиобластомы и гематологические опухоли. В некоторых из этих опухолей активация АКТ ассоциирована с агрессивными фенотипами или плохим прогнозом развития заболевания.
Повышенная киназная активность АКТ1 была обнаружена примерно в 40% опухолях молочной железы и яичников и более чем в 50% опухолей простаты [90], причем 78% всех опухолей с активированной АКТ1 были на III/IV стадии развития опухоли. Активация АКТ2 была обнаружена в 30-40% раков яичника и поджелудочной железы [91, 92]. Повышенная киназная активность АКТЗ была найдена в клеточных линиях опухолей молочной железы с дефицитом рецептора эстрогена и андрогенинтенсивных опухолей простаты [5], эти данные могут свидетельствовать о там, что АКТЗ способствует злокачественности стероидзависимых опухолей.
1.5. Модели активации АКТ in vivo
Создание животных моделей с тканеспецифической активацией экспрессии АКТ открыло новое направление в исследованиях роли этого киназного семейства в развитии опухолей. Эти исследования также позволили определить физиологическую роль АКТ в организме и обнаружить новые сигнальные пути, отвечающие за активность АКТ-киназ.
В большинстве работ описано создание трансгенных мышей с использованием либо миристилированой формы АКТ1 (MyrAKTl) либо конструкций, в которых два активационных сайта АКТ1 (Thr308 и Ser473) замещены на Asp (AKT1-DD), для создания сходства с фосфорилированным
белком. Оба варианта не нуждаются в PIP3 в качестве активатора и поэтому не могут ингибироваться фосфатазой PTEN. Другой подход связан с использованием мышей с удаленным с помощью рекомбиназы Сге геном Píen, что позволяет избежать эмбриональной летальности, ассоциированной с полным нокаутом Pten [93, 94, 95], в тоже время позволяя понять роль активации Akt в процессах ракового перерождения.
В пионерских экспериментах для введения АКТ1 [96] или AKT1-DD [97] в эпителий молочной железы мышей использовали вирус MMTV. В обоих случаях длительное наблюдение самок мышей с высоким уровнем экспрессии трансгена не выявило опухолей. Однако позднее было показано, что опухоли все же развиваются, но только в двойной трансгенной системе, экспрессирующей мутантный ЕгЬВ-2 и AKT1-DD [98]. Клетки опухоли обладали низкой инвазивной способностью и более высоким уровнем дифференцировки, что, возможно, указывает на участие АКТ1 в ускорении дифференциировки опухолевых клеток [98].
При скрещивании мышей MMTV-WNT-1 с мышами, несущими мутантный Pten, выявлялось раннее развитие и дифференциация молочной железы, повышенная пролиферация и задержка апоптоза. В отличие от трансгенной модели АКТ1, эти мыши развивали опухоли молочной железы между 2 и 12 месяцами; большая временная задержка, предшествующая развитию опухоли, свидетельствует о недостаточности удаления Pten и о необходимости дополнительных событий/генетических повреждений для развития опухоли [38].
Для понимания роли АКТ в патогенезе глиобластом MyrAKTl была сверхэкспрессирована в нейральных/глиальных зародышевых клетках с помощью системы RCAS/tv-a. Эта система основана на трансгенной ткане-специфичной экспрессии птичьего вирусного рецептора Tva, который не имеет гомологов у млекопитающих. Как следствие, рецептор-экспрессирующие
клетки могут быть специфичеси инфицированы репликативно-зависимыми птичьими векторами, производными от лейкозных векторов (RCAS), которые экспрессируют любой онкоген. Трансдукция нейрально/глиальных стромальных клеток такой конструкцией, несущей MyrAKTl не вызывала развития опухоли. Однако, опять же, если была совместно экспрессирована активированная форма Kras, это приводило к развитию опухолей, в которых наблюдались гигантские многоядерные MyrAKT-позитивные клетки [99]. Это еще раз подтверждает тот факт, что активация АКТ не достаточна для развития опухоли. Более того, эта комбинация онкогенов не могла трансформировать терминально дифференцированые астроциты. Астроциты развивали опухоль саркомного фенотипа только после комбинированной активации Kras, АКТ и делеции Ink4a-Arf[ 100].
С использованием мышей, экспрессирующих рекомбиназу Сге, был получен гетерозиготный тканеспецифический нокаут Pten+/~ в дифференцированых клетках головного мозга мыши, таких как гранулярные нейроны мозжечка и зубчатой извилины [101, 102] и клетках Пуркинье [103]. Эти нокаутные модели подтвердили, что потеря Pten и активация Akt не достаточны для развития опухолей в этих типах клеток. Кроме того, наблюдали остановку гипертрофии нейронов после введения ингибитора mTOR CCI-779, что указывает на прямое участие Akt/mTOR путь в определении размера нейронов [104].
У трансгенных мышей, экспрессирующих MyrAKTl в вентральной части простаты под контролем промотора гена пробазина крысы, в течение 8 недель развивались интраэпителиальные неоплазмы простаты (PIN) [105]. В неоплазмах содержалось много клеток увеличенного размера; а поскольку уровень спонтанного апоптоза был одинаков у трансгенных мышей и в контроле, возрастание количества клеток должно быть следствием ускорения пролиферации [106]. Хотя наличие этого фенотипа наблюдалось в раннем
возрасте, что могло бы быть свидетельствовать о самодостаточности одиночной активации АКТ1 для развития PIN, однако этому противоречит тот факт, что эти мыши никогда не развивали инвазивный рак, даже при наблюдении в течение 1,5 лет. Последствия активации АКТ1 в этой модели снимаются ингибированием mTOR, что не только возвращает в норму клеточный размер и пролиферацию, но и индуцирует апоптоз в клеточной популяции, которая потеряла контакт с базальной мембраной [106]. В то же время тканеспецифическое удаление Pten вызывает не только развитие PIN через 6 недель жизни, но и развитие инвазивного и метастатического рака, начиная приблизительно с 9 недель жизни [107, 108, 109].
При инъекции в мышиную хвостовую вену аденовирусной конструкции, несущей MyrAKTl, в течение четырех дней развивалась массивная гепатоцитарная инфекция, гепатомегалия и, в конце концов, дегенерация печени [110]. Сходное тканеспецифическое удаление Pten вызывало гиперпластическую жировую дегенерацию печени [111]. После 44 недель 47% мутантных мышей образовывали микроскопические аденомы, а после 78 недель все мыши развивали аденомы и карциномы.
В поджелудочной железе сверхэкспрессия MyrAKTl под контролем промотора гена крысиного инсулина II вызывала островковую гиперплазию, но не трансформацию Р-клеток [112].
Введение RCAS/tv-a MyrAKTl в эпителий яичника мыши не приводило к образованию опухолей, несмотря на активацию Kras или с-тус [113].
В целом, данные, полученные при изучении моделей in vivo, свидетельствуют о недостаточности активации АКТ для развития опухоли как минимум в контексте эпителиального канцерогенеза, который может требовать множественных независимых мутаций онкогенов и опухолевых супрессоров [114].
1.5.1. Активация АКТ в Т-клетках
Существует только одна неэпителиальная животная модель, в которой одиночная сверхэкспрессия миристилированной формы АКТ приводит к образованию опухолей. Новообразования развиваются у трансгенных мышей, несущих конструкцию MyrAKTl или МугАКТ2 под контролем тканеспецифического Ick промотора, эксперссирующего трансген на ранних стадиях развития тимоцитов. Такие мыши развивают агрессивные лимфомы на 10-20 недели жизни [115, 116, 117], тогда как линии с низким уровнем экспрессии трансгена развивают аутоиммунные заболевания, сопровождающие лимфому [115, 116]. Трансгенные Т-клетки характеризуются увеличенным размером, повышенной пролиферативной активностью и устойчивостью к апоптозу.
Высокий уровень пролиферации и пониженный уровень апоптоза представляют собой совокупность эффектов, наблюдаемых при активации АКТ в типичных эпителиальных тканях [114]. В Т-клетках наблюдаются более агрессивные эффекты, что указывает на Т-клетки как более "подходящую" мишень для проявления онкогенных свойств активированной АКТ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы
В работе использовали реактивы только высокой степени очистки производства фирм Sigma и FisherScientific. Набор для иммуноприципитации ExactaCruz D и антитела против Dssl (N-15 и FL-70), Tcrb (Н-197), Dlx5 (С20 и Y20) и Dlx6 (С20) произведены Santa Cruz Biotechnology. Моноклональные анти-Tcrb антитела (Н57-597) были получены из BD PharMingen. Другие использованные коммерческие антитела: антитела к антигену гемагглютенина (anti-HA) (16В12) из Convance, анти-фосфо-Akt из Santa Cruz или Cell Signaling Technologies и anti-ß-актин из Santa Cruz или Sigma. Антитела против Akt2, phospho-Akt, mTOR, phospho-mTOR и Мус бьши заказаны в Cell Signaling Technologies (Danvers, Massachusetts).
2.2. Создание трансгенной линии мышей
В работе использовали чистую линию мышей С57Ы6. Для создания трансгенной линии мышей использовали плазмиду pUC19LCK-mjr^4Ä:/2-hGH. 3 мкг плазмиды смешивали с рестриктазой SacII и инкубировали 2 ч при температуре 37°С. После этого продукты реакции были нанесены на гель. Часть плазмиды, содержащая hC¥^-myrAkt2-\\GW, была вырезана из геля и очищена с помощью набора RapidRureMini Kit. Чистоту конструкции определяли посредством электрофореза в агарозном геле.
Трансгенных мышей скрещивали с мышами дикого типа. Все исследования проводили на гетерозиготных мышах Тг+/\ При первых клинических признаках появления опухоли животных выводили из эксперимента .
2.3. Работа с культурами клеток
2ЗА. Культивирование клеток в жидких средах
Т-клетки выделяли из Т-лимфом путем пропускания ткани опухоли через 100Â нейлоновый фильтр (BDFalcon) и культивировали в среде Iscove's MDM, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки культивировали на среде Iscove's MDM, содержащей 10% ЭТС. Остальные клеточные линии культивировали в среде RPMI с 10% ЭТС. Все клеточные культуры содержали при 37°С в атмосфере 5% С02. Потенциальные ингибиторы DLX5 (Dlx5) в концентрации 10 мкМ добавляли в среду, содержащую 105 опухолевых клеток, с последующей инкубацией в течение 96 ч при 37°С. Пролиферацию клеток оценивали с помощью набора Celltiter 96 Aqueous One Solution Assay («Promega») в соответствии с протоколом производителя. Каждый опыт повторяли не менее 3 раз. 2.3.2. Культивирование клеток в мягком агаре
Фибробласты Rat-1 (2 xlO6 клеток) рассевали в 6-луночные плашки и инкубировали при 37°С 12 ч. Клетки ко-трансфицировалы 2 мкг каждой из плазмид с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через 48 ч после трансфекции клетки отбирали путем культивирования в среде, содержащей 100 мкг/мл гигромицина (Invitrogen) и 400 мкг/мл G418 (Invitrogen). Через две недели выжившие клетки трипсинизировали и подсчитали. Затем 1x104 клеток от каждой стабильной клеточной линии суспендировали в 1 мл среды RPMI, содержащей 10% ЭТС. и добавляли 1 мл 0.6% раствора агара (полученного из свежего 3% Noble Agar с RPMI 1640, содержащей 10% ЭТС. Клетки переносили в 6-луночные плашки, оставляли при комнатной температуре на 20 мин и затем инкубировали при 37°С, еженедельно добавляя 1 мл среды RPMI с 10% ЭТС. После 14 дней инкубации клетки фиксировалиь в течение 5 мин 10% формальдегидом в PBS и окрашивали 0.5 мл 0.005% Crystal Violet (Sigma) в течение 1-2 ч. Подсчитывали число колоний, содержащих более 200 клеток.
2.4. Кариотипирование и FISH
Подготовка метафазных хромосом и G-окрашивание проведены по стандартным процедурам. Идентификация хромосом и обозначения в кариотипе были проведены в соответствии с рекомендациями U. Washington guidelines (http://www.pathology.washington.edu/research/cytopages/idiograms/mouse/) ВАС-клоны для FISH были заказаны в Children's Hospital Oakland Research Institute. BAC-ДНК была выделена с использованием PSI clone BIG ВАС DNA kit (Princeton Separations). Для каждой пробы 500 нг ВАС ДНК метили Spectrum Orange или Spectrum Green (Vysis) методом случайного праймера с использованием набора BioPrime DNA Labeling kit (Invitrogen). Меченные пробы очищали на колонках Sephadex G-50 (GE Healthcare), смешивали с Cot-1 ДНК (Invitrogen), добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия, pH 5.2, и осаждали 100% этанолом. Перед гибридизацией осадок отмывали и ресуспендировали в Hybrisol VII (MP Biomedicals). Малые FISH-пробы метили с помощью ник-трансляции с использованием ДНК-полимеразы I (Invitrogen, Carlsbad, California). Гибридизацию проб с метафазными хромосомами и детекцию FISH сигналов проводи в соответствии со стандартными протоколами.
2.5. Выделение ДНК
Для выделения ДНК из тканей использовали набор GENTRA PUREGEN, из агарозного геля - Qbiogene Genclean III, из плазмид - наборы QIAGEN Maxi prep kit и Qbiogene RapidPure kit согласно инструкции производителей.
2.6. Выделение РНК
РНК из тканей выделяли реагентом TRIZOL, из клеток - Quiagen Rneasy. РНК для нозерн блоттинга выделяли с использованием Totally RNA kit (Ambion). Все
операции проводили согласно инструкции производителя. Количество РНК определяли на спектрофотометре Nanodrop ND-1000.
2.7. Нозерн-блоттинг
Нозерн-блот анализ провили с использованием Northern Max Ambion kit, согласно рекомендациям производителя. В качестве пробы для Dlx5 использовалась конструкция, содержащая полноразмерную кДНК Dlx5, (любезно предоставлена Giorgio Merlo, Dulbecco Telethon Institute, Milano, Italy). В качестве пробы для Dssl использовали последовательность ДНК 1-114 п.н. кодирующей области гена Dssl. Проба для ß-актина из набора Northern MaxAmbion kit использована как внутренний контроль. Пробы (25 нг) метили а-P32-dCTP or y-P32-dCTP методом случайного праймера, используя Prime-It II Random Primer Labeling kit (Stratagene). Меченные пробы очищали с на Sephadex G-50, смешивали с Cot-1 ДНК мыши, добавляли Hybrisol, (Millipore, Billerica) и гибридизовали на мембране GeneScreen Plus (PerkinElmer).
2.8. ПЦР
ВспользовалЬ амплификаторы фирм MJ Research РТС-200 и Hybaid OMN-i. Для
генотипирования использовалЬ полимеразе Taq (Invitrogen), для клонирования в
Т-вектор и секвенирования - Platinum Taq (Invitrogen).
Праймеры для генотипирования
2572 - 5'AGG САС TGC ССТ СТТ GAA GC 3'
2396 - 5' ТТТ GGG GTT CTG ААТ GTG AG 3'
Программа для генотипирования: 94°С 5 мин; 40 циклов - 94°С 30 сек, 52°С 1 мин, 72°С 1 мин; финальный шаг 72°С 10 мин. Праймеры для границ инверсии
2927 - 5' ATA GAG ACT TGC ACT AAA GGT GAG GGT 3'
2928 - 5' TCA CTT AGC CAA TTC TAC САС AAA GC 3'.
Программа для ПЦР границ инверсии:94°С 5 мин; 40 циклов - 94°С 20 сек, 59°С 20 сек, 72°С 1 мин; финальный шаг 72°С 10 мин.
ПЦР с обратной транскрипцией проводилась с использованием обратной
транскриптазой SuperScript II (Invitrogen) и oligo-dT праймерами.
Программа для мультиплекс ОТ-ПЦР:94°С 4 мин; 40 циклов - 94°С 30 сек, 58°С
30 сек, 72°С 2 мин; финальный шаг 72°С 10 мин.
Праймеры, используемые в реакции:
Dlx5 прямой - ACAACCGCGTCCCGAGTGCC
Dlx5 обратный - CCCATCTAATAAAGCGTCCCGG
Dlx6 прямой - CCAGGCTTTAAACCATCGCTTTC
Dlx6 обратный - AATGCTGCCATGTTTGTGCAGATT
Ldbl прямой - GGAAGGCCGGTTGTACCTGGA
Ldbl обратный - CACCCCCCGAGCTCATGGTG
Использовали агарозу UltraPure фирмы Invitrogen. Для загрузки ДНК в лунки использовали буфер BlueJuice (Invitrogen), в качестве разгонного буфера - TBE.
2.9. ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени
ОТ-ПЦР в реальном времени проводился специальной службой Фокс-Чейзовского онкологического центра. Пробы для оценки экспрессии генов с-тус, Dlx5 и ТЬр синтезированы фирмой «Applied Biosystems». Параметры реакции, состав буферов и реакционных смесей - по рекомендациям производителя.
2.10. FACS/проточная сортировка клеток
Для окраски использовали среду PBS с 3% ЭТС и 0,1% азидом натрия (далее -среда). Суспензию клеток получали, протирая опухоль через фильтр. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 7 мин, отбирали супернатант и ресуспендировали клетки в 1,5 мл раствора 0.165М NH4C1 для лизирования
эритроцитов. После 2 мин инкубации останавливали реакцию добавлением 1,5 мл среды, центрифугировали клетки при 1200 об/мин 8 мин, и суспендировали в 1 мл среды для подсчета клеток. Для окрашивания использовали на 1 миллион клеток 1 мг/мл каждого антитела, проводя инкубацию на льду 20 мин в темноте. Затем клетки центрифугировали клетки при 1200, об/мин 3 мин, отмывали 15 мл среды, ресуспендировали в 100 мл среды для последующего анализа.
2.11. Ретровирусная трансдукция лимфоцитов
Упаковочные клетки Phoenix-E трансфицировали ретровирусным вектором pMiGII с использованием кальций-фосфатного метода. Клетки содержали в полной среде Iscove's, содержащей 20% ЭТС. Клетки JML-5 (1х106/мл) заражали в течение 12 час при 37°С, культивируя с супернатантом, содержащим ретровирусы. После 30 ч инкубации GFP-позитивные клетки выделяли на проточном цитометре. Для определения уровня пролиферации 104 GFP-позитивных клеток помещали в 100 мкл среды в 96-луночные плашки и. определяли количество клеток после 24 ч и 48 ч инкубации с использованием гемоцитометра.
2.12. РНК-интерференция
Последовательности, использованные для нокдауна экспрессии DLX5, были выбраны с использованием siRNA Design Tools (Ambion). Синтезированные короткошпилечные олигонуклеотиды (shRNA) были включены в вектор pLVTHM (любезно предоставлен D. Trono, University of Geneva, Geneva, Switzerland). Последовательности олигонуклеотидов: sh2 - TGG TGA ATG GCA AAC CAA A, sh4 AAG AAT CTG CAC AAA CTT GGC. Контрольная последовательность против LacZ: GGA TCA GTC GCT GAT TAA А. Клетки 293T ко-трансфицировали лентивирусным вектором, упаковочной плазмидой и плазмидой, содержащей гены оболочки. Супернатант собирали через 24 часа после трансфекции и добавляли к трансдуцируемым клеткам с последующей
инкубацией в течение 6 час. Уровни клеточной пролиферации оценивались через 3-5 дней после трансдукции.
2.13. Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах (array CGH)
Определение копийности ДНК проводили согласно протоколу Agilent's Oligonucleotide Array-based CGH protocol for Genomic DNA Analysis, Version 4.0. Геномную ДНК (0,5-3 мкг) из лимфомных клеток обрабатывали рестриктазами А1и\ и Rsal и метили с использованием набора Agilent's Genomic DNA Labeling Kit PLUS цианин-5'-ёиТР либо цианин-З'-dUTP в соответствии с рекомендациями производителя. Меченые ДНК-продукты очищали колонках Microcon YM-30 (Millipore, Billerica, Massachusetts). Выход ДНК и включение метки измеряли на спектрофотометре ND-1000. Меченые образцы ДНК смешивали с Cotl ДНК мыши, раствором Agilent 10х Blocking Agent и буфером Agilent 2х Hybridization Buffer. Меченый раствор гибридизовали на микрочипе Agilent 244К Mouse Genome CGH Microarray (G4415A) с использованием гибридизационной камеры SureHyb. После гибридизации микрочипы были отмыты и высушены в соответствии с процедурами, описанными в протоколе Agilent. После этого слайды немедленно анализировали с использованием сканера Agilent. Выходные файлы затем импортировали в Agilent's CGH Analytics for DNA для анализа копийности.
2.14. Вестерн-блоттинг
Клетки инкубировали в буфере для лизирования на льду в течение 15 мин. Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорд. Белок ресуспендировали в 2х воссанавливающем буфере и нанесили на гель Novex SDS-PAGE (Invitrogen). После разделения белков в образцах (50 мкг) электрофорезом на SDS-PAGE геле их переносили для иммуноблоттинга на поливинилидин-дифторидные мембраны, инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи, а
затем со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, в течение 60 мин при комнатной температуре.
2.15. Подготовка лигандов и молекулярный докинг
Для оптимизации времени вычислительного скрининга библиотека компании ENAMINE, состоящая из 106 соединений, была кластеризована с использованием алгоритма Джарвиса-Патрика [118, 119] с ускорением [120], содержащегося в пакете программ QUANTUM. Мерой схожести молекул выбрана так называемая метрика Танимото, рассчитанная с помощью Daylight фингерпринтов молекул [121]. Параметры кластеризации выбирались таким образом, чтобы каждый кластер в среднем состоял из примерно десяти родственных структур, а общее количество некластеризованных молекул не превышало 20% от исходного количества соединений. Соединения, представляющие собой центройды кластеров, были выбраны для дальнейшего скрининга. Для увлечения скорости молекулярного докинга из всей библиотеки центройдов отобрали молекулы с наименьшей молекулярной массой. Все выбранные соединения были извлечены из поставляемых ENAMINE sdf файлов и обработаны в пакетном режиме. Дополнительного обогащения библиотеки молекулами активными в отношении онкологических мишеней или другими способами не проводили. Типизация белка, лигандов и скрининг in silico были реализованы с помощью соответствующих инструментов из пакета QUANTUM. Программа предсказывает константы связывания (аффинности) (Kd) малых молекул с белком-мишенью с точностью около одного порядка, путем оценки их межмолекулярных взаимодействий, используя точные модели атомных сил в водном окружении [122 - 125]. При расчётах использовали иерархию физических моделей молекулярных взаимодействий. Для первоначального нахождения положения лиганда в активном центре белка и оценки энергии связывания белок-лигандного комплекса производили докинг лиганда на
жесткую структуру белка, а затем результаты уточнялись на модели гибкого белка. Для оценки потенциальной энергии взаимодействия применяли модифицированную модель меж- и внутримолекулярных взаимодействий AMBER/GAFF [126]. Оценки свободной энергии проводили с помощью линейной модели взаимодействия [127]. Водное окружение моделировали с использованием модифицированной обобщенной модели Борна [128]. Алгоритм ранее был описан в статье [122], где применялся для поиска ингибиторов белок-белковых взаимодействий.
Молекулярный докинг молекул из исходной библиотеки соединений производился на жесткую структуру белка DLX5 2DJN, взятую из базы Protein Data Bank (PDB)[129]. Выделенная для молекулярного докинга область на трехмерной структуре была размером 20 х 20 х 20А. Лиганды с наилучшими предсказанными энергиями связывания были пересчитаны в модели с полностью подвижным белком [121, 130]. Для того чтобы убедиться, что обнаруженные молекулы не описаны ранее, наличие этих соединений и их аналогов проверяли в базах данных и в обзорах известных ингибиторов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Создание линий трансгенных мышей LCKmyrAkt2, спонтанно развивающих агрессивные Т-клеточные лимфомы
Создание трансгенных мышиных моделей, в клетках которых селективно сверхпродуцируется белок Akt2, дает возможность установить роль этого белка in vivo. С использованием ранее описанного вектора Lck-MyrAkt2 [131], который содержит Lck промотор для запуска на ранних стадиях развития тимоцита экспрессии конститутивно активированной (за счет миристилирования) формы Akt2 (MyrAkt2), было получено шесть трансгенных линий Lck-MyrAkt2 мышей. Животных трех из них (линии 42, 55 и 72) наблюдали в течение длительного времени с целью оценки вероятности опухолеобразования и агрессивности опухолей. В этих линиях в 95-100% случаев развивались спонтанные Т-клеточные лимфомы с медианой выживаемости от 75 до 140 дней (Рис. 2). Иммуноблоттинг белков выявил в опухолях по сравнению с тимоцитами дикого типа повышенный уровень Akt2 (за счет экспрессии MyrAkt2 трансгена), а также повышенные уровни с-Мус и активацию сигнального каскада Akt/mTor (Рис. 3).
Для каждой из шести трансгенных линий проведено кариотипирование нескольких опухолей; результаты суммированы в Таблице 1. У мышей линии 42 во всех 15 кариотипированных лимфомах обнаруживалась одинаковая хромосомная перестройка - инверсия хромосомы 6, inv(6) с идентичными точками разрыва (А2;В1) (Рис. 4А), в то время как в нормальных тканях тех же мышей выявлялся нормальный кариотип. В лимфомах, полученных от линий мышей 72 и 54, выявлялся другой тип хромосомной перестройки -транслокация t(14;15)(C2;Dl) (Рис. 4В).
Таблица 1. Клональные хромосомные перестройки в лимфомных клетках у ЬСК-МугАШ трансгенных мышей.
Линия -фаундер Число карио-типированных опухолей Частые перестройки Другие частые изменения
42 15 ШУ(6)(А2В1) [15]а +14 [6],+15 [12],+16 [3]
54 2 1(14;15)(С2;Г)1) [2] +10 [1], +14 [1], +с1ег(14Ж14;15) [1],+15[1],+ёег(15Ж14;15) [2]
55 7 ШУ(6)(А2В1) [1] 1(14;15)(С2;Б1) [4] +10 [3], +14 [1], +ёег(14Ж14;15) [1], +15 [2], +ёег(15)1(14;15) [4], +16 [2]
62 5 К14;15)(С2;01) [2] +10 [1], +14 [2], +с1ег(14)1:(14;15) [1], +15 [3], +ёег(15Ж14;15) [2], +16 [2]
72 5 К14;15)(С2;Е>1) [5] +10 [3], +14 [1], +<1ег(14)1;(14;15) [2], +ёег(15)1(14; 15) [5]
79 3 шу(6)(А2В1) [1] 1(14;15)(С2;Б1)[1] +10 [1], +14 [1], +15 [2], +ёег(15Ж14;15) [1]
а Цифры в квадратных скобках соответствуют числу опухолей, в которых были обнаружены данные хромосомные перестройки
Days
Рис. 2. Кривые выживаемости Ьск-МугАШ трансгенных мышей линий 42, 55 и 72. Усреднены данные по 30 животным.каждой линии.
.<м
t
& 10
СО о
т—
&
to
00 £
о й
ct) CV
00 O)
cn,
Akt2 p-Akt
p-mTOR mTOR
Рис. 3. Сверхэкспрессия с-Мус в Т-клеточных лимфомах LCK-myr-Akt2 трансгенных мьгшей линий 42, 55 и 72 (первые цифры в номерах образцов опухолей), по сравнению с тимоцитами дикого типа (WTI, WT2). по данным вестерн-блоттинга. Также наблюдается активация Akt/m'Tor сигнального каскада, выражающаяся в повышении уровней фосфорилированной Akt (р-Akt)> mTor и р-ш'Гог.
А2 В1
N6 1ПУ{6)
N6 ¡ПУ(6)
В
Рис. 4. Клональные хромосомные перестройки, наблюдаемые в Т-клеточных лимфомах от Ьск-МугАк12 мышей. Стрелками отмечены аномальные хромосомы, скобками - аномальные сегменты. (А). Инверсия в хр. 6. Левая панель: частичный кариотип опухоли с 1пу(6) в сравнении с нормой (N6). Правая панель: схематическое изображение
частичных кариотипов N6 (показано расположение точек разрыва А2 и В1) и хромосомы, с ¡пу(6)(А2;В1). (В), Транслокация между хр. 14 и 15. Верхняя панель: частичный кариотип опухоли с 14; 15)(С2;01) и дополнительная копия с!ег( 15). N14 и N15 -нормальные хромосомы.
Нижняя панель', схематическое изображение частичных
кариотипов нормальных хр. 14 и 15 (показано расположение точек разрыва С2 и 01) и хр. 14 и 15 после транслокации (с1ег14 и с1ег15) опухоли с 1:(14;15) (С2;Ш), где чертой обозначены границы транслокации.
N14 с1ег(14)
N15 йег(15)
С2
А А к 1
СП
■ ■ ■
Ш ■ 1 01-" ■ \
■ т
■ > ■
■ >
N14 der(14)
N15 аег(15)
В лимфомах, полученых от линий мышей 55, 62 и 79, выявлялся один из вышеописанных типов хромосомных перестроек, либо инверсия inv(6) либо транслокация t(14;l 5), а также наблюдались другие цитогеиетические изменения. Суммарно в 31 из 37 кариотипированных лимфом (84%) наблюдалась либо inv(6) либо t(14;15)i У оставшихся 6 опухолей, две демонстрировали трисомию хромосомы 16, две трисомия хромосом 10 и 15, еще две имели различные сложные кариотипы с множественными хромосомными перестройками. Трисомия хромосом 14 и 15 наблюдалась в 21 из 37 опухолей. Все 14 опухолей несущие транслокациею t(14; 1 5) содержали одну или реже две дополнительные копии модифицированного варианта хромосомы 15, der(15)t(14;15), но только 5 из этих опухолей имели дополнительную копию модифицированного варианта от хромосомы 14. der( 14)t( 14; 15). Положение границ перестроек inv(6) и 1(14; 15) может указывать на вовлечение TCR локуса, который подвергается RAG (Recombination Activating Сепе8)-опосредованной рекомбинации с привлечением рекомбиназ Ragl/2 при созревании Т-клеток в тимусе в тот период времени, когда Lck промотор, управляющий экспрессией MyrAkt2 трансгена, активен (Mende et al., 2001).
3.2. Детальный анализ транслокации t(14;15)
Для того чтобы определить границы транслокации t( 14;15), нами было проведено FISH-картирование метафазных хромосом опухолей, используя пробы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС). FISH картирование границ транслокации в хромосоме 15, используя ВАС клоны, содержащие последовательности Мус (красные сигналы) и Тега энхансера (зеленые сигналы) выявило ко-гибридизацию этих проб на Аномальной хромосоме 15 (Рис. 5).
Рис 5, Р18Н-картирование границ транслокации Г(14;15)(С2;01) в лимфомных клетках. Ко-гибридизация ВАС-клонов, содержащих энхансер гена Тега (зеленые сигналы) или последовательность Мус (красные сигналы), в аномальных хр. 15 (АЬ 15). N14 и N15 -нормальные хромосомы, гибридизующиеся с ВАС-клонами, выявляющими ген Тега или Мус, соответственно
Для детального картирования границ транслокации был использован CGH анализ. Обычно сбалансированные транслокации не могут быть обнаружены при помощи CGI1 анализа, однако наличие дополнительной копии der(15)t(14;15) предоставило нам уникальную возможность идентифицировать точное расположение границ транслокации с помощью этой технологии. CGH анализ опухолей с транслокацией 1(14; 15) и дополнительной копией der(15)t(14;15) выявил увеличение сигнала в дистальной части хромосомы 14 и проксимальной части хромосомы 15; детальное исследование выявило, что увеличения сигнала в хромосоме 14 начинается с проксимальной части Тега локуса. Усиление сигнала в хромосоме \ 5 начинается в Pvt 1 локусе приводит к увеличению копийности гена Мус (Рис. 6). Стоит отметить, что в хромосоме 14 присутствует делеция размером -1 Mb, приводящая к удалению большей части Тега локуса. Гомозиготность делеции свидетельствует о том, что V(D)J перестройки происходят и в нормальной хромосоме 14. Для того чтобы определить границы транслокации t(14:l 5), кДНК из 10 t( 14; 15)-пози гивных лимфом анализировали методом RT-PCR с различными праймерами к кодирующим последовательностям локусов Myc-Pvt! и Тега.. При использовании пары Прайм еров к экзону 1 Prtl и константному участку Tcrct наблюдали образование ПЦР-продукта длиной 740 п.о. Его секвенирование выявило в двух опухолях наличие слитной последовательности, включающей экзон 1 PvtJ и константный участок Тега (Рис. 7). Таким образом транспозиция Тега и Myc-Pvt] приводит к сверхпродукции Мус, которую мы наблюдали с помощью вестерп-блоттинга в лимфомах линии мышей 72, несущих эти хромосомные перестройки (см. Рис 3).
Рис 6. Сравнительная геномная гибридизация на биочипах ДНК мыши и ДНК опухоли с 1(14; 15) и дополнительной копией <1ег(15) (как на рис. ЗВ). Присутствие второй копии ёег(15) приводит к дупликации Щи стальной части хр. 14 и проксимальной части хр. 15, что позволяет установить точные границы транслокации в областях 14С2 и 1501. Карты высокого разрешения границ транслокации в хр. 14 и 15 выявили, что увеличение копийности ДНК начинается в дистальной части локуса Тега в хр. 14 (слева) и РуН локусе в хр. 15 (справа), приводя к увеличению копийности гена Мус.
РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА
iPvtl sequence
Тега sequence
Pvtl norma! Tumor 1 Tumor 2 Теш М16118
tggcagcccc ggtgacctcg gagtcacogc tggatccacc ctcttgtctg аттттсттаа ctctactacg gtaagaagat сссстссатс tggcagcccc ggtgacctcg gagtcacsgc tggatccacc ct tggcagcccc gctíacctcg gagtcacsgc kkatcdücc ct
jjjACATC CAGAACCCAG AACCTGCTOT 5TACCAGTTA AMGATCCTC
SSACATC CAGAACCCAG AACCTGCTCrr GTACCAGTTA AAAGATCCTC
CCAAGCTCAC ATTCGGAGGS GGAACAA3GT TAACGGTCAG ACCCGACATC CAGAACCCAG AACC70CTÖT GTACCAGTTA, AMGATCCTC
4
Рис 7. Анализ последовательностей к ДНК для Т-клеточных опухолей с t(14;15) (Tumor ] и Tumor 2), выявивший точку соединения разорванных концов хр.14 и хр. 15 при транслокации (показана стрелкой). Верхняя последовательность соответствует кДНК экзона 1 гена Pvtl в нормальной хр. 15, нижняя - кДНК константного участка Тега в нормальной хр. 14.
3.3. Детальный анализ шу(6)
Для того чтобы определить границы шу(6), было проведено Р15 Н-картирование с ВАС-клонами, содержащими известные участки хромосомы 6. Дистальная граница инверсии была картирована в области расположения генов бета-цепи Т-клеточного рецептора (ТсгЬ) в участке 6В1 (Рис. 8А). Проксимальная граница инверсии была обнаружена в пределах области 100 т.п.н., содержащей ген йзя 1 (Рис. 8В).
Для детального картирования проксимальной границы инверсии с помощью ПЦР были синтезированы И 8 Н—пробы 1Р и 2Р длиной 2.2 т.п.н., комплементарные концам гена Ди/ (рис. 9, верхняя панель). При условии, что граница инверсии располагается в гене £>557, гибридизация двух флуоресцентно меченых зондов приведет к смещению сигнала гибридизации одного из них в более проксимальную область хромосомы. Гибридизация одиночного зонда |Р не выявила никакого отличия участка гибридизации в сравнении с нормальной хромосомой 6. Одновременная гибридизация с зондами 1Р и 2Г показала, что для зонда 2Р обнаруживаются сигналы сразу в двух участках хромосомы 6 (Рис. 9, нижняя панель). Этот результат мог означать, что граница инверсии действительно находится в гене Вяз!, в участке гибридизации зонда 2К, вследствие чего при инверсии часть комплементарной зонду 2Р последовательности остается на старом месте, а часть перемещается к проксимальной границе инверсии. Для подтверждения этого вывода нами был синтезирован еще один зонд (ЭР), комплементарный участку на 1 т.п.н. про гениальнее участка связывания зонда 2Р. При совместной гибридизации зонда ЗР с зондом 1Г было обнаружено смещение сигнала зонда ЗР в более Проксимальный регион хромосомы по сравнению с нормальной хромосомой 6 (Рис. 10). Таким образом, вывод о наличии точки разрыва в гене Д&7, равно как предположение о ее локализации в нитроне I этого гена, в области, комплементарной зонду 2Н, были подтверждены.
Рис. 8. Р15Н-картирование границ ту(6) показывает, что дистальная граница инверсии располагается в области расположения гена ТсгЪ (А), а проксимальная - гена (В). А, ВАС-клон ЯР23-442М8, содержащий
часть вариабельного и константного участков гена ТсгЪ, включая энхансер (красный), гибридизуется с участком 6В1 нормальной хромосомы 6 (N6), но дает два сигнала в хромосомах с ту(6). В, ВАС-клон КР24-204Р9, содержащий полностью л оку с Вш1% гибридизуется с центромерной областью нормальной хромосомы 6 (N6), тогда как в хромосоме с ту(6) сигнал разбивается на два. Вставки на диаграммах А и В показывают нормальную хромосому N6 (слева) и хромосому 6 с инверсией (справа).
Dss1
Tcrb
N6
1F
2F 3 F
Dss 1 Tcrb
Dss1 Tcrb
inv(6)
1F 2F
3F 2F
Рис. 9. FISH-картирование границ инверсии с помощью коротких 11ЦР-генерированных FISH - проб. IF - 3F - FISH-пробы; Черным представлены интроны гена Dssl, лиловым - его экзоны. Заштрихованным представлен локус Tcrb. N6- расположение генов в нормальной хромосоме 6. inv(6) -расположение генов в хромосоме 6 с инверсией. Остальные пояснения в тексте.
сеп
( 3'
Похожие диссертационные работы по специальности «Молекулярная биология», 03.01.03 шифр ВАК
Подавление репарации двунитевых разрывов ДНК ингибиторами HDAC как механизм сенсибилизации опухолевых клеток к генотоксическим препаратам2024 год, кандидат наук Гнедина Ольга Олеговна
«Клиническое значение определения наивных Т- и В- клеток у больных с опухолями иммунной системы»2018 год, кандидат наук Образцов Игорь Владимирович
Изучение механизмов образования транслокаций, ассоциированных со вторичными лейкозами, вызванными терапией ингибиторами ДНК-топоизомераз II2023 год, кандидат наук Ломов Николай Андреевич
Роль транскрипционного фактора Prep1 в регуляции глюконеогенеза в клетках печени2017 год, кандидат наук Кулебякин, Константин Юрьевич
Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt112012 год, кандидат биологических наук Посвятенко, Александра Викторовна
Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тимахов, Роман Анатольевич, 2012 год
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Staal S.P., Hartley J.W., Rowe W.P. Isolation of transforming murine leukemia
viruses from mice with a high incidence of spontaneous lymphoma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 3065-3067.
2 Staal S.P., Hartley J.W. Thymic lymphoma induction by the AKT8 murine
retrovirus // J. Exp. Med. 1988. V. 167. P. 1259-1264.
3 Staal S.P. Molecular cloning of the akt oncogene and its human homologues AKT1
and AKT2: amplification of AKT1 in a primary human gastric adenocarcinoma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 5034-5037.
4 Staal S.P., Huebner К., Croce C.M., Parsa N.Z., Testa J.R. The AKT1 proto-
oncogene maps to human chromosome 14, band q32 // Genomics. 1988. V. 2. P. 96-98.
5 Nakatani K., Thompson D.A., Barthel A., Sakaue H., Liu W., Weigel R.J., Roth
R.A. Up-regulation of Akt3 in estrogen receptor-deficient breast cancers and androgen-independent prostate cancer lines // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 21528-21532.
6 Bellacosa A., Testa J.R., Staal S.P., Tsichlis P.N. A retroviral oncogene, akt,
encoding a serine-threonine kinase containing an SH2-like region // Science. 1991. V. 254. P. 274-277.
7 Coffer P.J. Woodgett J.R. Molecular cloning and characterisation of a novel
putative protein-serine kinase related to the cAMP-dependent and protein kinase C families // Eur. J. Biochem. 1991. V. 201. P. 475-481.
8 Thomas C., Deak M., Alessi D., van Aalten D. High-resolution structure of the
pleckstrin homology domain of protein kinase b/akt bound to phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate // Curr. Biol. 2002. V. 12. P. 12561262.
9 Kumar C.C., Diao R., Yin Z., Liu Y., Samatar A.A., Madison V., Xiao L.
Expression, purification, characterization and homology modeling of active Akt/PKB, a key enzyme involved in cell survival signaling // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1526. P. 257-268.
10 Bellacosa A., Chan T.O., Ahmed N.N., Datta K., Malstrom S., Stokoe D.,
McCormick F., Feng J., Tsichlis P. Akt activation by growth factors is a multiple-step process: the role of the PH domain. // Oncogene. 1998. V. 17. P. 313-325.
11 Alessi D.R., James S.R, Downes C.P., Holmes A.B., Gaffney P.R., Reese C.B.,
Cohen P. Characterization of a 3-phosphoinositide-dependent protein kinase which phosphorylates and activates protein kinase Balpha // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 261-269.
12 Feng J., Park J., Cron P., Hess D., Hemmings B.A. Identification of a PKB/Akt
hydrophobic motif Ser-473 kinase as DNA-dependent protein kinase // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 P. 41189-41196.
13 Di Cristofano A., Pandolfi P.P. The multiple roles of PTEN in tumor suppression.
// Cell. 2000. V. 100. P. 387-390.
14 Du, K., Herzig, S., Kulkarni, R. N., and Montminy, M. TRB3: a tribbles homolog
that inhibits Akt/PKB activation by insulin in liver // Science. V. 300. P. 15741577.
15 Maira S.M., Galetic I., Brazil D.P., Kaech S., Ingley E., Thelen M., Hemmings
B.A. Carboxyl-terminal modulator protein (CTMP), a negative regulator of PKB/Akt and v-Akt at the plasma membrane // Science. 2001. V. 294. P. 374380.
16 Diehl J.A., Cheng M., Roussel M.F., Sherr C.J. Glycogen synthase kinase-3beta
regulates cyclin Dl proteolysis and subcellular localization. // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 3499-3511.
17 Muise-Helmericks R.C., Grimes H.L., Bellacosa A., Malstrom S.E., Tsichli P.N.,
Rosen N. Cyclin D expression is controlled post-transcriptionally via a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 29864-29872.
18 Testa J.R., Bellacosa A. AKT plays a central role in tumorigenesis // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 10983-10985.
19 Viglietto G., Motti M.L., Bruni P., Melillo R.M., D'Alessio A., Califano D., Vinci,
F., Chiappetta G., Tsichlis P., Bellacosa A., Fusco A., Santoro M. Cytoplasmic relocalization and inhibition of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kipl by PKB/Akt-mediated phosphorylation in breast cancer // Nat. Med. 2002. V. 8. P. 1136-1144.
20 Franke, T. F., Hornik, C. P., Segev, L., Shostak, G. A., and Sugimoto, C. PI3K/Akt
and apoptosis: size matters. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 8983-8998.
21 Creagh E.M., Martin S.J. Caspases: cellular demolition experts. // Biochem. Soc.
Trans. 2001. V. 29. P. 696-702.
22 Trencia A., Perfetti A., Cassese A., Vigliotta G., Miele C., Oriente F., Santopietro
S., Giacco F., Condorelli G., Formisano P., Beguinot F. Protein kinase B/Akt binds and phosphorylates PED/PEA-15, stabilizing its antiapoptotic action // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 4511-4521.
23 Zhou B.P., Liao Y., Xia W., Spohn B., Lee M.H., Hung M.C. Cytoplasmic
localization of p21Cipl/WAFl by Akt-induced phosphorylation in HER-2/neu-overexpressing cells //Nat. Cell Biol. 2001. V. 3. P. 245-252.
24 Wendel H.G., De Stanchina E., Fridman J.S., Malina A., Ray S., Kogan S.,
Cordon-Cardo C., Pelletier J., Lowe S.W. Survival signalling by Akt and eIF4E in oncogenesis and cancer therapy // Nature. 2004. V. 428. P. 332-337.
25 Mayo L.D., Donner D.B. A phosphatidylinositol 3-kinaseAkt pathway promotes
translocation of Mdm2 from the cytoplasm to the nucleus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 11598-11603.
26 Gottlob, K., Majewski, N., Kennedy, S., Kandel, E., Robey, R. B., and Hay, N.
Inhibition of early apoptotic events by Akt/PKB is dependent on the first committed step of glycolysis and mitochondrial hexokinase // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 1406-1418.
27 Plas D.R., Thompson C.B. Cell metabolism in the regulation of programmed cell
death // Trends Endocrinol. Metab. 2002. V. 13. P. 75-78.
28 Cross D.A., Alessi D.R., Cohen P., Andjelkovich M., Hemmings B.A. Inhibition
of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B // Nature. 1995. V. 378. P.785-789.
29 Kohn A.D., Summers S.A., Birnbaum M.J., Roth R.A. Expression of a
constitutively active Akt Ser/Thr kinase in 3T3-L1 adipocytes stimulates glucose uptake and glucose transporter 4 translocation // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 31372-31378.
30 Deprez J., Vertommen D., Alessi D.R., Hue L., Rider M.H. Phosphorylation and
activation of heart 6-phosphofructo-2-kinase by protein kinase B and other protein kinases of the insulin signaling cascades // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 17269-17275.
31 Elstrom R.L., Bauer D.E., Buzzai M., Karnauskas R., Harris M.H., Plas D.R.,
Zhuang H., Cinalli R.M., Alavi A., Rudin C.M., Thompson C.B. Akt stimulates aerobic glycolysis in cancer cells // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 3892-3899.
32 Warburg O. On the origin of cancer cells // Science. 1956. V. 123. P. 309-314.
33 Staveley B.E., Ruel L., Jin J., Stambolic V., Mastronardi F.G., Heitzler P.,
Woodgett J.R., Manoukian A.S. Genetic analysis of protein kinase B (AKT) in Drosophila// Curr. Biol. 1998. V. 8. P. 599-602.
34 Verdu J., Buratovich M.A., Wilder E.L., Birnbaum M.J. Cell-autonomous
regulation of cell and organ growth in Drosophila by Akt/PKB // Nat. Cell Biol. 1999. V. l.P. 500-506.
35 Bjornsti M.A., Houghton P.J. Lost in translation: dysregulation of cap-dependent
translation and cancer // Cancer Cell. 2004. V. 5. P. 519-523.
36 Inoki K., Li Y., Zhu T., Wu J., Guan K.L. TSC2 is phosphorylated and inhibited
by Akt and suppresses mTOR signalling //Nat. Cell. Biol. 2002. V. 4. P. 648657.
37 Potter C.J., Pedraza L.G., Xu T. Akt regulates growth by directly phosphorylating
Tsc2 // Nat. Cell Biol. 2002. V. 4. P. 658-665.
38 Li Y., Corradetti M.N., Inoki K., Guan K.L. TSC2: filling the GAP in the mTOR
signaling pathway // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29. P. 32-38.
39 Gingras A.C. Sonenberg N. Adenovirus infection inactivates the translational
inhibitors 4E-BP1 and4E-BP2 //Virology. 1997. V. 237. P. 182-186.
40 Kim D.H., Sabatini D.M. Raptor and mTOR: subunits of a nutrient-sensitive
complex // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2004. V. 279. P. 259-270.
41 Long X., Muller F., Avruch J. TOR action in mammalian cells and in
Caenorhabditis elegans // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2004. V. 279. P. 115-138.
42 Martin K.A., Blenis J. Coordinate regulation of translation by the PI 3-kinase and
mTOR pathways // Adv. Cancer Res. 2002. V. 86. P. 1-39.
43 Proud C.G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and
elongation by nutrients // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2004. V. 279. P. 215244.
44 Bjornsti M.A., Houghton P.J. Lost in translation: dysregulation of cap-dependent
translation and cancer // Cancer Cell 2004. V. 5. P. 519-523.
45 Ruggero D., Pandolfi P.P. Does the ribosome translate cancer? // Nat. Rev. Cancer
2003. V. 3. P. 179-192.
46 Inoki K., Zhu T., Guan K.L. TSC2 mediates cellular energy response to control
cell growth and survival. // Cell. 2003. V. 115. P. 577-590.
47 Carling D. The AMP-activated protein kinase cascade—a unifying system for
energy control // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29. P. 18-24.
48 Kyriakis J.M. At the crossroads: AMP-activated kinase and the LKB1 tumor
suppressor link cell proliferation to metabolic regulation // J. Biol. 2003. V. 2. P. 26.
49 Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. // Cell. 2000. V. 100. P. 57-
70.
50 Dimmeler S., Fleming I., Fisslthaler B., Hermann C., Busse R., Zeiher A.M.
Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt-dependent phosphorylation. //Nature. 1999. V. 399. P. 601-605.
51 Fulton D., Gratton J.P., McCabe T.J., Fontana J., Fujio Y., Walsh K., Franke T.F.,
Papapetropoulos A., Sessa W.C. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt. // Nature. 1999. V. 399. P. 597601.
52 Kang S.S., Kwon T., Kwon D.Y., Do S.I. Akt protein kinase enhances human
telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit // J. Biol. Chem. V. 274. P. 13085-13090.
53 Thant A.A., Nawa A., Kikkawa F., Ichigotani Y., Zhang Y., Sein T.T., Amin A.R.,
Hamaguchi M. Fibronectin activates matrix metalloproteinase-9 secretion via the MEK1-MAPK and the PI3K-Akt pathways in ovarian cancer cells // Clin. Exp. Metastasis. 2000. V. 18. P. 423-428.
54 Aoki K., Tamai Y., Horiike S., Oshima M., Taketo M.M. Colonic polyposis
caused by mTOR-mediated chromosomal instability in Apc+/Delta716 Cdx2+/-compound mutant mice // Nat. Genet. 2003. V. 35. P. 323-330.
55 Eng C. PTEN: one gene, many syndromes // Hum. Mutat. 2003. V. 22. P. 183-198.
56 Shayesteh L., Lu Y., Kuo W.L., Baldocchi R., Godfrey T., Collins C., Pinkel D.,
Powell B., Mills G.B., Gray J.W. PIK3CA is implicated as an oncogene in ovarian cancer//Nat. Genet. 1999. V. 21. P. 99-102.
57 Philp A.J., Campbell I.G., Leet C., Vincan E., Rockman S.P., Whitehead R.H.,
Thomas R.J., Phillips W.A. The phosphatidylinositol 3'-kinase p85alpha gene is an oncogene in human ovarian and colon tumors // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 7426-7429.
58 Samuels Y., Wang Z., Bardelli A., Silliman N., Ptak J., Szabo S., Yan H., Gazdar
A., Powell S. M., Riggins G. J., Willson J. K., Markowitz S., Kinzler K. W., Vogelstein B., Velculescu, V. E. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers // Science. 2004. V. 304. P. 554.
59 Stal O., Perez-Tenorio G., Akerberg L., Olsson B., Nordenskjold B., Skoog L.,
Rutqvist L.E. Akt kinases in breast cancer and the results of adjuvant therapy // Breast Cancer Res. 2003. V. 5. P. 37-44.
60 Bacus S.S., Altomare D.A., Lyass L., Chin D.M., Farrell M.P., Gurova K., Gudkov
A., Testa J.R. AKT2 is frequently upregulated in HER-2/neu-positive breast cancers and may contribute to tumor aggressiveness by enhancing cell survival. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 3532-3540.
61 Schlegel J., Piontek G., Mennel H.D. Activation of the anti-apoptotic Akt/protein
kinase B pathway in human malignant gliomas in vivo // Anticancer Res. 2002. V. 22. P. 2837-2840.
62 Sun S., Steinberg B.M. PTEN is a negative regulator of STAT3 activation in
human papillomavirus-infected cells // J. Gen. Virol. 2002. V. 83. P. 16511658.
63 Tanno S., Tanno S., Mitsuuchi Y., Altomare D.A., Xiao G.H., Testa J.R. AKT
activation up-regulates insulin-like growth factor-I receptor expression and promotes invasiveness of human pancreatic cancer cells. // Cancer Res. 2001. V. 61. P.589-593.
64 Yuan. Z.Q., Sun M., Feldman R.I., Wang G., Ma X., Jiang C., Coppola D., Nicosia
S.V., Cheng J.Q. Frequent activation of AKT2 and induction of apoptosis by
inhibition of phosphoinositide-3-OH kinase/Akt pathway in human ovarian cancer // Oncogene 2000. V. 19. P. 2324-2330.
65 Liu A.X., Testa J.R., Hamilton T.C., Jove R., Nicosia S.V., Cheng J.Q. AKT2, a
member of the protein kinase В family, is activated by growth factors, v-Ha-ras, and v-src through phosphatidylinositol 3-kinase in human ovarian epithelial cancer cells // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 2973-2977.
66 Skorski Т., Bellacosa A., Nieborowska-Skorska M., Majewski M., Martinez R.,
Choi J.K., Trotta R., Wlodarski P., Perrotti D., Chan Т.О., Wasik M.A., Tsichlis P.N., Calabretta B. Transformation of hematopoietic cells by BCR/ABL requires activation of a PI-3k/Akt-dependent pathway // EMBO J. 1997. V. 16. P. 6151-6161.
67 Slupianek A., Nieborowska-Skorska M., Hoser G., Morrione A., Majewski M.,
Xue L., Morris S.W., Wasik M.A., Skorski T. Role of phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway in nucleophosmin/anaplastic lymphoma kinase-mediated lymphomagenesis // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 2194-2199.
68 Waldmann V., Wacker J. Mutations of the PH domain of protein kinase В
(PKB/AKT) are absent in human epidermal skin tumors // Dermatology. 2001. V. 203. P. 284-288.
69 Waldmann V., Wacker J., Deichmann M. Mutations of the activation-associated
phosphorylation sites at codons 308 and 473 of protein kinase В are absent in human melanoma // Arch. Dermatol. Res. 2001. V. 293. P. 368-372.
70 Waldmann V., Wacker J., Deichmann M. Absence of mutations in the pleckstrin
homology (PH) domain of protein kinase B (PKB/Akt) in malignant melanoma // Melanoma Res. 2002. V. 12. P. 45-50.
71 Cheng J.Q., Godwin A.K., Bellacosa A., Taguchi T., Franke T.F., Hamilton T.C.,
Tsichlis P.N., Testa J.R. AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 9267-9271.
72 Bellacosa A., de Feo D., Godwin A.K., Bell D.W., Cheng J.Q., Altomare D.A.,
Wan M., Dubeau L., Scambia G., Masciullo V., Ferrandina G., Benedetti Panici P., Mancuso S., Neri G., Testa J.R. Molecular alterations of the AKT2 oncogene in ovarian and breast carcinomas // Int. J. Cancer 1995. V. 64. P. 280285.
73 Cheng J.Q., Ruggeri B., Klein W.M., Sonoda G., Altomare D.A., Watson D.K.,
Testa J.R. Amplification of AKT2 in human pancreatic cells and inhibition of AKT2 expression and tumorigenicity by antisense RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 3636-3641.
74 Miwa W., Yasuda J., Murakami Y., Yashima K., Sugano K., Sekine T., Kono A.,
Egawa S., Yamaguchi K., Hayashizaki Y., Sekiya T. Isolation of DNA sequences amplified at chromosome 19ql3.1-ql3.2 including the AKT2 locus
in human pancreatic cancer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 225. P. 968-974.
75 Ruggeri B.A., Huang L., Wood M., Cheng J.Q., Testa J.R. Amplification and
overexpression of the AKT2 oncogene in a subset of human pancreatic ductal adenocarcinomas //Mol. Care. 1998. V. 21. P. 81-86.
76 Thompson F.H., Nelson M.A., Trent J.M., Guan X.Y., Liu Y., Yang J.M.,
Emerson J., Adair L., Wymer J., Balfour C., Massey K., Weinstein R., Alberts D.S., Taetle R. Amplification of 19ql3.1-ql3.2 sequences in ovarian cancer. G-band, FISH, and molecular studies // Cancer Genet. Cytogenet. 1996. V. 87. P. 55-62.
77 Arranz E., Robledo M., Martinez B., Gallego J., Roman A., Rivas C., Benitez J.
Incidence of homogeneously staining regions in non-Hodgkin lymphomas. // Cancer Genet. Cytogenet. 1996. V. 87. P. 1-3.
78 Xu X., Sakon M., Nagano H., HiraokaN., Yamamoto H., Hayashi N., Dono K.,
Nakamori S., Umeshita K., Ito Y., Matsuura N., Monden M. Akt2 expression correlates with prognosis of human hepatocellular carcinoma. // Oncol. Rep. 2004. V. 11. P. 25-32.
79 Roy H.K., Olusola B.F., Clemens D.L., Karolski W.J., Ratashak A., Lynch H.T.,
Smyrk T.C. AKT proto-oncogene overexpression is an early event during sporadic colon carcinogenesis // Carcinogenesis. 2002. V. 23. P. 201-205.
80 Knobbe C.B., Reifenberger G. Genetic alterations and aberrant expression of genes
related to the phosphatidyl-inositol-3'-kinase/protein kinase B (Akt) signal transduction pathway in glioblastomas // Brain Pathol. 2003. V. 13. P. 507-518.
81 Stal O., Perez-Tenorio G., Akerberg L., Olsson B., Nordenskjold B., Skoog L.,
Rutqvist L. E. Akt kinases in breast cancer and the results of adjuvant therapy. // Breast Cancer Res. 2003. V. 5. P. 37-44.
82 Knuutila S. Bjorkqvist A.M., Autio K., Tarkkanen M., Wolf M., Monni O.,
Szymanska J., Larramendy M.L., Tapper J., Pere H. DNA copy number amplifications in human neoplasms: review of comparative genomic hybridization studies // The American journal of pathology. 1998. V. 152 P. 1107-1123
83 Hashimoto K., Mori N., Tamesa T., Okada T., Kawauchi S., Oga A., Furuya T.,
Tangoku A., Oka M., Sasaki K. Analysis of DNA copy number aberrations in hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinomas by conventional CGH and array CGH // Mod. Pathol. 2004. V. 17. P. 617-622.
84 Nakatani K., Thompson D.A., Barthel A., Sakaue H., Liu W., Weigel R.J., Roth,
R. A. Up-regulation of Akt3 in estrogen receptor-deficient breast cancers and androgen-independent prostate cancer lines. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 21528-21532.
85 Ahmed N.N., Franke T.F., Bellacosa A., Datta K., Gonzalez-Portal M.E., Taguchi
T., Testa J.R., Tsichlis P.N. The proteins encoded by c-akt and v-akt differ in post-translational modification, subcellular localization and oncogenic potential // Oncogene. 1993. V. 8. P. 1957-1963.
86 Cheng J.Q., Altomare D.A., Klein M.A., Lee W.C., Kruh G.D., Lissy N.A., Testa
J. R. Transforming activity and mitosis-related expression of the AKT2 oncogene: evidence suggesting a link between cell cycle regulation and oncogenesis // Oncogene 1997. V. 14. P. 2793-2801.
87 Sun M., Wang G., Paciga J.E., Feldman R.I., Yuan Z.Q., Ma X.L., Shelley S.A.,
Jove R., Tsichlis P.N., Nicosia S.V., Cheng J.Q. AKTl/PKBalpha kinase is frequently elevated in human cancers and its constitutive activation is required for oncogenic transformation in NIH3T3 cells // Am. J. Pathol. 2001. V. 159. P. 431-437.
88 Grille S.J., Bellacosa A., Upson J., Klein-Szanto A.J., van Roy F., Lee-Kwon W.,
Donowitz M., Tsichlis P.N., Larue L. The protein kinase Akt induces epithelial mesenchymal transition and promotes enhanced motility and invasiveness of squamous cell carcinoma lines // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 2172-2178.
89 Arboleda M.J., Lyons J.F., Kabbinavar F.F., Bray M.R., Snow B.E., Ayala R.,
Danino M., Karlan B.Y., Slamon D.J. Overexpression of AKT2/protein kinase Bbeta leads to up-regulation of betal integrins, increased invasion, and
metastasis of human breast and ovarian cancer cells // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 196-206.
90 Sun M., Wang G., Paciga J. E., Feldman R.I., Yuan Z.Q., Ma X.L., Shelley S.A.,
Jove R., Tsichlis P.N., Nicosia S.V., Cheng J.Q. AKTl/PKBalpha kinase is frequently elevated in human cancers and its constitutive activation is required for oncogenic transformation in NIH3T3 cells // Am. J. Pathol. 2001. V. 159. P. 431-437.
91 Altomare D.A., Tanno S., De Rienzo A., Klein-Szanto A., Skele K.L., Hoffman J.
P., Testa J.R. Frequent activation of AKT2 kinase in human pancreatic carcinomas. // J. Cell. Biochem. 2003. V. 87. P. 470-476.
92 Yuan Z.Q., Sun M., Feldman R.I., Wang G., Ma X., Jiang C., Coppola D., Nicosia
S.V., Cheng J.Q. Frequent activation of AKT2 and induction of apoptosis by inhibition of phosphoinositide-3-OH kinase/Akt pathway in human ovarian cancer // Oncogene. 2000. V. 19. P. 2324-2330.
93 Di Cristofano A., Pesce B., Cordon-Cardo C., Pandolfi P.P. Pten is essential for
embryonic development and tumour suppression // Nat. Genet. 1998. V. 19. P. 348-355.
94 Podsypanina K., Ellenson L. H., Nemes A., Gu J., Tamura M., Yamada K.M.,
Cordon-Cardo C., Catoretti G., Fisher P.E., Parsons R. Mutation of Pten/Mmacl in mice causes neoplasia in multiple organ systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1563-1568.
95 Suzuki A., de la Pompa J.L., Stambolic V., Elia A.J., Sasaki T., del Barco
Ban-antes I., Ho A., Wakeham A., Itie A., Khoo W., Fukumoto M., Mak T.W. High cancer susceptibility and embryonic lethality associated with mutation of the PTEN tumor suppressor gene in mice // Curr. Biol. 1998. V. 8. P. 11691178.
96 Ackler S., Ahmad S., Tobias C., Johnson M.D., Glazer R. I. Delayed mammary
gland involution in MMTV-AKT1 transgenic mice // Oncogene 2002. V. 21. P. 198-206.
97 Hutchinson J., Jin J., Cardiff R.D., Woodgett J.R., Muller W.J. Activation of Akt
(protein kinase B) in mammary epithelium provides a critical cell survival signal required for tumor progression // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 22032212.
98 Hutchinson J.N., Jin J., Cardiff R.D., Woodgett J.R., Muller W.J. Activation of
Akt-1 (PKB-alpha) can accelerate ErbB-2-mediated mammary tumorigenesis but suppresses tumor invasion // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 3171-3178.
99 Holland E.C., Celestino J., Dai C., Schaefer L., Sawaya R.E., Fuller G.N.
Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice //Nat. Genet. 2000. V. 25. P. 55-57.
100 Uhrbom L., Dai C., Celestino J.C., Rosenblum M.K., Fuller G.N., Holland E.C.
Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural
progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 5551-5558.
101 Backman S.A., Stambolic V., Suzuki A., Haight J., Elia A., Pretorius J., Tsao M.
S., Shannon P., Bolon B., Ivy G.O., Mak T.W. Deletion of Pten in mouse brain causes seizures, ataxia and defects in soma size resembling Lhermitte-Duclos disease //Nat. Genet. 2001. V. 29. P. 396-403.
102 Kwon C.H., Zhu X., Zhang J., Knoop L.L., Tharp R., Smeyne R.J., Eberhart
C.G., Burger P.C., Baker S.J. Pten regulates neuronal soma size: a mouse model of Lhermitte-Duclos disease //Nat. Genet. 2001. V. 29. P. 404-411.
103 Marino S., Krimpenfort P., Leung C., van der Korput H.A., Trapman J.,
Camenisch I., Berns A., Brandner S. PTEN is essential for cell migration but not for fate determination and tumourigenesis in the cerebellum // Development 2002. V. 129. P. 3513-3522.
104 Kwon C.H., Zhu X., Zhang J., Baker S.J. mTor is required for hypertrophy of
Pten-deficient neuronal soma in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 12923-12928.
105 Majumder P.K., Yeh J.J., George D.J., Febbo P.G., Kum J., Xue Q., BikoffR.,
Ma H., Kantoff P.W., Golub T.R., Loda M., Sellers W.R. Prostate intraepithelial neoplasia induced by prostate restricted Akt activation: the MP AKT model // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 7841-7846.
106 Majumder P.K., Febbo P.G., Bikoff R., Berger R., Xue Q., McMahon L.M.,
Manola J., Brugarolas J., McDonnell T.J., Golub T.R., Loda M., Lane H.A., Sellers W.R. mTOR inhibition reverses Akt-dependent prostate intraepithelial neoplasia through regulation of apoptotic and HIF-1 -dependent pathways // Nat. Med. 2004. V. 10. P. 594-601.
107 Backman S.A., Ghazarian D., So K., Sanchez O., Wagner K.U., Hennighausen
L., Suzuki A., Tsao M.S., Chapman W.B., Stambolic V., Mak T.W. Early onset of neoplasia in the prostate and skin of mice with tissue-specific deletion of Pten // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 1725-1730.
108 Trotman L.C., Niki M., Dotan Z.A., Koutcher J.A., Di Cristofano A., Xiao A.,
Khoo A.S., Roy-Burman P., Greenberg N.M., Dyke T.V., Cordon-Cardo C., Pandolfi P. Pten dose dictates cancer progression in the prostate // PLoS Biol. 2003. V. l.P. E59.
109 Wang S, Gao J., Lei Q., Rozengurt N., Pritchard C., Jiao J., Thomas G.V., Li G.,
Roy-Burman P., Nelson P.S., Liu X., Wu H. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer // Cancer Cell. 2003. V. 4. P. 209-221.
110 Ono H., Shimano H., Katagiri H., Yahagi N., Sakoda H., Onishi Y., Anai M.,
Ogihara T., Fujishiro M., Yiana A.Y., Fukushima Y., Abe M., Shojima N., Kikuchi M., Yamada N., Oka Y., Asano T. Hepatic Akt activation induces
marked hypoglycemia, hepatomegaly, and hypertriglyceridemia with sterol regulatory element binding protein involvement. // Diabetes. 2003. V. 52. P. 2905-2913.
111 Horie Y., Suzuki A., Kataoka E., Sasaki T., Hamada K., Sasaki J., Mizuno K.,
Hasegawa G., Kishimoto H., Iizuka M., Naito M., Enomoto K., Watanabe S., Mak T.W., Nakano T. Hepatocyte-specific Pten deficiency results in steatohepatitis and hepatocellular carcinomas // J. Clin. Invest. 2004. V. 113. P. 1774-1783.
112 Tuttle R.L., Gill N.S., Pugh W., Lee J.P., Koeberlein B., Furth E.E., Polonsky K.
S., Naji A., Birnbaum M.J. Regulation of pancreatic beta-cell growth and survival by the serine/threonine protein kinase Aktl/PKBalpha. // Nat. Med. 2001. V. 7, P. 1133-1137.
113 Orsulic S., Li Y., Soslow R.A., Vitale-Cross, L.A., Gutkind J.S., Varmus H.E.
Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system // Cancer Cell. 2002. V. 1. P. 53-62.
114 Bellacosa A. Genetic hits and mutation rate in colorectal tumorigenesis:
versatility of Knudson's theory and implications for cancer prevention. // Genes Chromosomes Cancer. 2003. V. 38. P. 382-388.
115 Malstrom S., Tili E., Kappes D., Ceci J.D., Tsichlis P.N. Tumor induction by an
Lck-MyrAkt transgene is delayed by mechanisms controlling the size of the thymus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 200l.V. 98. P. 14967-14972.
116 Rathmell J.C., Elstrom R.L., Cinalli R.M., Thompson C.B. Activated Akt
promotes increased resting T cell size, CD2 8-independent T cell growth, and development of autoimmunity and lymphoma // Eur. J. Immunol. 2003. V. 33. P. 2223-2232.
117 Mende I., Malstrom S., Tsichlis P.N., Vogt P.K., Aoki M. Oncogenic
transformation induced by membrane-targeted Akt2 and Akt3. // Oncogene 2001. V. 20. P. 4419-4423.
118 Jarvis R.A., Patrick E.A. Clustering using a similarity measure based on shared
near neighbors// Ieee trans, comput. 1973. V. 22. P. 1025-1034.
119 Willett P. Similarity and clustering in chemical Information Systems. N.Y. USA:
John Wiley & Sons, Inc., 1987. 266 p.
120 Li W. A fast clustering algorithm for analyzing highly similar compounds of very
large libraries // J. Chem. Inf. Model. 2006. V. 46. P. 1919-1923.
121 Flower D.R. On the properties of bit string-based measures of chemical similarity
//J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1998. V. 38. P. 379-386.
122 Joce C., Stahl J.A., Shridhar M., Hutchinson M.R., Watkins L.R., Fedichev P.O.,
Yin H. Application of a novel in silico high-throughput screen to identify selective inhibitors for protein-protein interactions // Bioorg. Med. chem. Lett. 2010. V. 20. P. 5411-5413.
123 Fedichev P.O., Men'shikov L.I. Long-range order and interactions of macroscopic
objects in polar liquids // Arxiv preprint. 2006. arXiv:cond-mat/0601129v3
124 Fedichev P.O., Getmantsev E.G., Menshikov L.I. O (NlogN) continuous
electrostatics method for fast calculation of solvation energies of biomolecules // J. Comput. Chem. 2011. V. 32. P. 1368-1376.
125 Men'shikov L.I., Fedichev P.O. The possible existence of the ferroelectric state of
supercooled water // Rus. J. Phys. chem. 2011. V. 85. P. 906-908.
126 Case D.A., Darden t.A., Cheatham III. T.E., Simmerling C.L., Wang J., Duke
R.E., Luo R., Walker R.C., Zhang W., Merz K. M., et al. AMBER 9 // AMBER 11. 2010. University of California, San Francisco.
127 Hansson T., Marelius J., Aqvist J. Ligand binding affinity prediction by linear
interaction energy methods // J. COMP-AID MOL DeS. 1996. V. 12. P. 27-35.
128 Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H.,
Shindyalov I.N., Bourne P.E. The protein data bank // Nucl. Acids Res. 2000. V. 28. P. 235-242
129 Okimoto N., Futatsugi N., Fuji H., Suenaga A., Morimoto G., Yanai R., Ohno Y.,
Narumi T., Taiji M. High-performance drug discovery: computational screening by combining docking and molecular dynamics simulations // PLoS comput. Biol. 2009. V. 5. P. 1-13
130 Fillmore G.C. Wang, Q. Carey, M.J. Kim, C.H. Elenitoba-Johnson, K.S.J. Lim,
M.S. Expression of Akt (protein kinase B) and its isoforms in malignant lymphomas // Leukemia & lymphoma. 2005. V. 46 P. 1765-1773
131 Mende I, Malstrom S, Tsichlis P.N., Vogt P.K., Aoki M. Oncogenic
transformation induced by membrane-targeted Akt2 and Akt3. // Oncogene 200l.V. 20 P. 4419-4423.
132 Look A.T. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. //
Science. 1997. V. 278 P. 1059-1064.
133 Grawunder U., West, R.B., Lieber, M.R. Antigen receptor gene rearrangement. //
Curr Opin. Immunol., 1998. V. 10 P. 172-180.
134 Kruisbeek A.M., Haks M.C., Carleton M., Michie A.M., Zuniga-Pflucker J.C.,
Wiest D.L. Branching out to gain control: how the pre-TCR is linked to multiple functions. // Immunol. Today. 2000. V. 21 P. 637-644.
135 Look A.T. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias //
Science. 1997. V. 278. P. 1059-1064
136 Kirsch I.R. Trans-rearrangements and the risk of lymphoid malignancy // Ann.
Oncol. 1997. V. 8. P. 45-48
137 Tycko B. Sklar J. Chromosomal translocations in lymphoid neoplasia: a
reappraisal of the recombinase model // Cancer Cells. 1990. V. 2. P. 1-8.
138 Rabbitts T. H. Chromosomal translocations in human cancer // Nature. 1994. V.
372. P. 143-149.
139. Davila M., Foster S., Kelsoe G., Yang K.A role for secondary V(D)J
recombination in oncogenic chromosomal translocations? // Adv. Cancer Res. 2001. V. 81 P. 61-92,
140 Rabbitts, T. H. Chromosomal breakpoints hit the spot. // Nat. Med. 1997. V. 3 P.
496-497
141 Greaves M.F. Biological models for leukaemia and lymphoma. // IARC Sci. Publ.
2004. P. 351-372.
142 Sanchez-Garcia I. Consequences of chromosomal abnormalities in tumor
development // Annu. Rev. Genet. 1997. V. 31. P. 429-453
143 Taub R., Kirsch I., Morton C., Lenoir G., Swan D., Tronick S., Aaronson S.,
Leder P. Translocation of the c-myc gene into the immunoglobulin heavy chain locus in human Burkitt lymphoma and murine plasmacytoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 7837-7841.
144 Pekarsky Y., Hallas C., Croce C.M. Molecular basis of mature T-cell leukemia //
JAMA. 2001. V. 286. P. 2308-2314
145 Petrie H.T., Livak F., Burtrum D., Mazel S.T cell receptor gene recombination
patterns and mechanisms: cell death, rescue, and T cell production. // J. Exp. Med. 1995. V. 182. P. 121-127.
146 Na S.Y., Patra A., Scheuring Y., Marx A., Tolaini M., Kioussis D., Hemmings
B., Hunig T., Bommhardt U. Constitutively active protein kinase B enhances
Lck and Erk activities and influences thymocyte selection and activation // J. Immunol. 2003. V. 171. P. 1285-1296.
147 Tsujimoto Y., Finger L.R., Yunis J., Nowell P.C., Croce, C.M. Cloning of the
chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation// Science. 1984. V. 226. P. 1097-1099.
148 Guo W. Lasky J.L. Chang C.J. Mosessian S. Lewis X. Xiao Y. Yeh, J.E. Chen
J.Y. Iruela-Arispe M.L. Varella-Garcia M. and others Multi-genetic events collaboratively contribute to Pten-null leukaemia stem-cell formation // Nature. 2008. V. 453. P. 529-533.
149 Erikson J. Finger L. Sun L. Nishikura K. Minowada J. Finan J. Emanuel B.S.
Nowell P.C. Croce C.M. and others. Deregulation of c-myc by translocation of the alpha-locus of the T-cell receptor in T-cell leukemias // Science. 1986. V. 232. P. 884-886.
150 Huppi K. Siwarski D. Skurla R. Klinman D. Mushinski J.F. Pvt-1 transcripts are
found in normal tissues and are altered by reciprocal (6; 15) translocations in mouse plasmacytomas // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 7. P. 6964-6968.
151 Graham M. Adams J.M. Cory S. Murine T lymphomas with retroviral inserts in
the chromosomal 15 locus for plasmacytoma variant translocations // Nature. 1985. V. 314. P. 740-743.
152 Webb E., Adams J.M., Cory S. Variant (6; 15) translocation in a murine
plasmacytoma occurs near an immunoglobulin kappa gene but far from the myc oncogene. //Nature. 1984. V. 312 P. 777-779.
153 Cory S. and Graham M. Webb E. Corcoran L. Adams J.M.
Variant (6; 15) translocations in murine plasmacytomas involve a chromosome 15 locus at least 72 kb from the c-myc oncogene // EMBO J. 1985. V. 4. P. 675-681.
154 Shtivelman E. Bishop J.M. Effects of translocations on transcription from PVT. //
Mol Cell Biol. 1990. V. 10. P. 1835-1839.
155 Merlo G.R., Zerega B., Paleari L., Trombino S., Mantero S., Levi G. Multiple
functions of Dlx genes // Int. J. Dev. Biol. 2000. V. 44. P. 619-626.
156 Panganiban G., Rubenstein J.L., Developmental functions of the Distal-less/Dlx
homeobox genes. //Development. 2002. V. 129. P. 4371-4386.
157 Woodside K.J., Shen H., Muntzel C., Daller J.A., Sommers C.L., Love P.E.
Expression of Dlx and Lhx family homeobox genes in fetal thymus and thymocytes // Gene Expr. Patterns. 2004. V. 4. P. 315-320.
158 Lee. M. H., Kim. Y.J., Yoon W.J., Kim J.I., Kim B.G., Hwang Y.S., Wozney J.
M., Chi X.Z., Bae S.C., Choi K.Y., Cho J.Y., Choi J.Y., Ryoo H.M. Dlx5 specifically regulates Runx2 type II expression by binding to homeodomain-
response elements in the Runx2 distal promoter. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 35579-35587.
159 Roca H., Phimphilai M., Gopalakrishnan R., Xiao G., Franceschi R.T.
Cooperative interactions between RUNX2 and homeodomain protein-binding sites are critical for the osteoblast-specific expression of the bone sialoprotein gene. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 30845-30855.
160 Fujita T., Azuma Y., Fukuyama R., Hattori Y., Yoshida C., Koida M., Ogita K.,
and Komori, T. Runx2 induces osteoblast and chondrocyte differentiation and enhances their migration by coupling with PI3K-Akt signaling. // J Cell Biol. 2004. V. 166. P. 85-95.
161 Harris S.E., Guo D., Harris M.A., Krishnaswamy A., Lichtler A. Transcriptional
regulation of BMP-2 activated genes in osteoblasts using gene expression microarray analysis: role of Dlx2 and Dlx5 transcription factors. // Front. Biosci. 2003. V. 8. P. 1249-1265.
162 Zweidler-McKay P.A. Pear W.S. Notch and T cell malignancy // Semin. Cancer
Biol. 2004. V. 14. P. 329-340.
163 Okita C., Meguro M., Hoshiya H., Haruta M., Sakamoto Y.K., Oshimura M.A
new imprinted cluster on the human chromosome 7q21-q31, identified by human-mouse monochromosomal hybrids // Genomics. 2003. V. 81. P. 556559.
164 Horike S., Cai S., Miyano M., Cheng J.F., Kohwi-Shigematsu T. Loss of silent-
chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. // Nat. Genet. 2005. V. 37. P. 31-40.
165 Lee J.Y., Lee Y.M., Kim M.J., Choi J.Y., Park E.K., Kim S.Y., Lee S.P., Yang J.
S., Kim D.S. Methylation of the mouse DIx5 and Osx gene promoters regulates cell type-specific gene expression // Mol. Cells. 2006. V. 22. P. 182-188.
166 Li J., Zou C., Bai Y., Wazer D.E., Band V., Gao Q. DSS1 is required for the
stability of BRCA2 // Oncogene. 2006. V. 25. P. 1186-1194.
167 Kojic M., Yang H., Kostrub C.F., Pavletich N.P., Holloman W.K. The BRCA2-
interacting protein DSS1 is vital for DNA repair, recombination, and genome stability in Ustilago maydis. // Mol. Cell. 2003. V. 12. P. 1043-1049.
168 Gudmundsdottir K., Lord C.J., Witt E., Tutt A.N., Ashworth A. DSS1 is required
for RAD51 focus formation and genomic stability in mammalian cells // EMBO Rep. 2004. V. 5. P. 989-993.
169 Pedersen N., Mortensen S., Sorensen S.B., Pedersen M.W., Rieneck K., Bovin L.
F., Poulsen H.S. Transcriptional gene expression profiling of small cell lung cancer cells // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 1943-1953.
170 Nakamura Y., Daigo Y., Nakatsuru S. Compositions and methods for treating
lung cancer. U.S. Provisional Application Serial No.60/555,757 (WO/2005/089735).http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=JP2005005621& DISPLAY=STATUS., 2005.
171 Maxwell G.L., Chandramouli G.V., Dainty L., Litzi T.J., Berchuck A., Barrett J.
C., Risinger J.I. Microarray analysis of endometrial carcinomas and mixed mullerian tumors reveals distinct gene expression profiles associated with different histologic types of uterine cancer. // Clin. Cancer Res. 2005. V.l 1. P. 4056-4066.
172 Kato T, Sato N, Takano A, Miyamoto M, Nishimura H, Tsuchiya E, Kondo S,
Nakamura Y, Daigo Y. Activation of placenta-specific transcription factor distal-less homeobox 5 predicts clinical outcome in primary lung cancer patients. // Clin. Cancer Res. 2008.. V.14. P. 2363-2370.
173. Broach J.R., Thorner J. High-Throughput screening for drug discovery// Nature.
1996. V. 384. P. 14-16.
174. Young K., Lin S., Sun L., Lee E., Modi M., Hellings S., Husbands M.,
Ozenberger B., Franco R. Identification of a calcium channel modulator using a high throughput yeast two-hybrid screen. // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 946-950.
175. Hamasaki K., Rando R.R. The binding site of a specific aminoglycoside binding
RNA molecule //Anal. Biochem. 1998. V. 261. P. 183-190.
176. Moore K.J., turconi S., Miles-Williams A., Djaballah H.,
Hurskainen P. A homogenous 384-well high throughput screen for novel tumor necrosis factor receptor: ligand interactions using time resolved energy transfer //J. Biomol. Screen. 1999. V. 4. P. 205-214.
177. Dunn D., Orlowski M., Mccoy P., Gastgeb F., Appell K. Ultra-high throughput screen of two-million-member combinatorial compound collection in a miniaturized, 1536-well assay format// J. Biomol. Screen. 2000. V. 5. P. 177— 188.
178 Dunn, D.A. and Feygin, I. Challenges and solutions to ultra-high-throughput
screening assay miniaturization: submicroliter fluid handling // Drug Discovery Today. 2000. V. 5. P. 84-91.
179 Joce C., Stahl J.A., Shridhar M., Hutchinson M.R., Watkins L.R., Fedichev P.O.,
Yin H. Application of a novel in silico high-throughput screen to identify selective inhibitors for protein-protein interactions // Bioorg. Med. chem. Lett. 2010. V. 20. P. 5411-5413.
180. Okimoto N., Futatsugi N., Fuji H., Suenaga A., Morimoto
G., Yanai R., Ohno Y., Narumi T., Taiji M. High-performance drug discovery: computational screening by combining docking and molecular dynamics simulations // PLoS comput. Biol. 2009. V. 5. P. 1-13.
181. Huo S., Wang J., Cieplak P., Kollman P.A., Kuntz I.D. Molecular dynamics and
free energy analyses of cathepsin D-inhibitor interactions: insight into structure-based ligand design// J. Med. Chem. 2002. V. 45. P. 1412-1419.
182. Masukawa K.M., Kollman P.A., Kuntz I.D. Investigation of neuraminidase-
substrate recognition using molecular dynamics and free energy calculations // J. Med. Chem. 2003. V. 46. P. 5628-5637.
183. Kuhn B., Gerber P., Schulz-Gasch t., Stahl M.J. Validation and use of the MM-
PBSA approach for drug discovery// J. Med. Chem. 2005. V. 48. P. 4040-4048.
184. Xu H., Li C., He X., Niu K., Peng H., Li W., Zhou C., Bao J. Molecular
modeling, docking and dynamics simulations of GNA-related lectins for potential prevention of influenza virus (H1N1) // J. Mol. Model. 2011. V. 18. P. 27-37
185. Ferrara P., Curioni A., Vangrevelinghe E., Meyer T., Mordasini T. New scoring
functions for virtual screening from molecular dynamics simulations with a quantum-refined force-field (QRFF-MD). Application to cyclin-dependent kinase 2 // J. chem. Inf. Model. 2006. V. 46. P. 254-263.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.