Роль антигенов HLA I класса (G, E, C) в генезе репродуктивных потерь раннего срока тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Шенгелия Маргарита Олеговна
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 145
Оглавление диссертации кандидат наук Шенгелия Маргарита Олеговна
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Ранние репродуктивные потери. Частота, формы, критерии установки диагноза, мультифакториальность заболевания
1.2 Исторические предпосылки, развитие иммунологии репродукции, открытие главного комплекса гистосовместимости HLA
1.3 Механизмы «ухода» иммунной системы плода от материнского организма
1.4 Иммунологическая основа взаимодействия при беременности. Классы
и основные функции HLA
1.5 HLA I класса E, ^ в патогенезе ранних репродуктивных потерь
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Первый этап исследования. Оценка хорионов при неразвивающейся беременности при нормальном и аномальном кариотипе плода
2.1.1 Цитогенетический метод
2.1.2 Морфологический метод
2.1.3 Статистический анализ первого этапа исследования
2.2 Второй этап исследования. Анализ 9 полиморфных аллелей гена ИЬЛ-О
I класса у беременных Северо-Западного региона РФ в I триместре гестации47
2.2.1 Молекулярно-генетические методы
2.2.2 Статистический анализ второго этапа исследования
2.3 Третий этап исследования. Изучение уровней экспрессии sHLA-G, HLA-G, HLA-E, HLA-C и PIBF у беременных с ранними репродуктивными потерями
в анамнезе
2.3.1 Статистический анализ третьего этапа исследования
2.4 Четвёртый этап исследования. Изучение уровней экспрессии 5 биологических компонентов (sHLA-G, HLA-E и HLA-C, PIBF и релаксина) в фолликулярной жидкости у пациенток с репродуктивными нарушениями в программах ВРТ60
2.4.1 Иммунологический метод: оценка уровня экспрессии sHLA-G, HLA-E,
HLA-C PIBF и релаксина в фолликулярной жидкости
2.4.2 Статистический анализ четвертого этапа исследования
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Оценка хорионов при неразвивающейся беременности при нормальном и аномальном кариотипе плода
3.1.1 Анализ результатов цитогенетического исследования
3.1.2 Анализ результатов морфологического исследования
3.1.3 Иммуногистохимическая верификация экспрессии Н^А^ и рецептора KIR2DL4 в ворсинчатом хорионе
ГЛАВА 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1 Анализ 9 полиморфных аллелей гена ИЬЛ-О I класса у беременных СевероЗападного региона РФ в I триместре гестации
4.1.1 Анализ результатов клинико-анамнестических данных
4.1.2 Результаты генетического исследования
ГЛАВА 5 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
5.1 Изучение уровней sHLA-G, HLA-G, HLA-E, HLA-C и PIBF у беременных с ранними репродуктивными потерями в анамнезе
5.1.1 Анализ результатов клинико-анамнестических данных
5.1.2 Течение I триместра настоящей беременности
5.1.3 Изучение уровней sHLA-G, HLA-G, HLA-E, HLA-C и PIBF
ГЛАВА 6 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
6.1 Изучение уровней 5 биологических компонентов ^Н^А^, HLA-E и Н^А-^
PIBF и релаксина) у женщин с репродуктивными нарушениями в
программах ВРТ
ГЛАВА 7 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Морфогенез имплантации и гравидарной трансформации эндометрия у пациенток с хроническим эндометритом2024 год, доктор наук Траль Татьяна Георгиевна
Метаболические и гинетически детерминированные признаки неразвивающейся беременности2011 год, кандидат медицинских наук Мелешкина, Ольга Игоревна
Формирование толерантности к аллоантигенам плода на ранних сроках беременности в норме и при привычном выкидыше2018 год, кандидат наук Кречетова, Любовь Валентиновна
Особенности иммунореактивности эндометрия при неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями хориона2022 год, кандидат наук Романова Ольга Алексеевна
Прогнозирование исходов беременности у женщин с угрозой прерывания ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе2021 год, кандидат наук Григушкина Елена Владимировна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль антигенов HLA I класса (G, E, C) в генезе репродуктивных потерь раннего срока»
ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования
Современные подходы к ведению пациенток с репродуктивными потерями на ранних сроках гестации в анамнезе основываются на преконцепционной подготовке, при которой установленный кариотип эмбриона спонтанно прервавшейся беременности определяет дальнейший объем диагностических методов обследования на этапе планирования следующей беременности.
В этиопатогенезе многократных ранних гестационных потерь (до 6 недель эмбриогистологического срока) ведущую роль играют иммунные факторы при исключения генетических аномалий эмбриона [5,8].
Известно, что с самых ранних сроков физиологической беременности в организме женщины формируется гестационная иммуносупрессия, основанная на взаимодействии с эмбрионом, являющимся аллотрасплантатом по отношению к организму матери. Одним из основных механизмов «бегства» является модификация экспрессии молекул системы лейкоцитарных антигенов человека I класса (англ. HLA, Human Leukocyte Antigens, класс Ia - HLA-A, В и С; класс Ib -HLA-E, -F и -G) в трофобласте [30,37,41], отсутствие идентичных гаплотипов в генах HLA II класса (DQA1, DQB1, DRB1) у супружеской пары [17,22,23], эффективность работы системы HLA III класса (NFKBL1, DDX39B) материнского организма [32, 34].
Роль генов HLA II класса в генезе ранних репродуктивных потерь достаточно изучена. Так, сходство у пары по локусам более чем на 25% расценивается как неблагоприятный фактор для репродукции [50].
Участие системы HLA I класса изучается в трансплантологии [28,71], онкологии [44,78,82] и гематологии [29], так как экспрессия этих генов и их белковых молекул являются основными предиктивными биомаркерами отторжения трансплантата или степени злокачественности опухолевого процесса.
Степень разработанности научной темы
Под контролем системы ИЬА I класса находится взаимодействие всех иммунокомпетентных клеток организма [10], что позволяет распознавать свои и чужеродные антигены при беременности с последующим запуском иммунного ответа [37,38].
^^А^ является самым изученным представителем системы ^^А I класса, клинический интерес к которому сосредоточен как на определении концентрации sHLA-G, так и на исследовании полиморфизмов гена ИЬЛ-О. Описаны ассоциации полиморфизмов гена ИЬЛ-О с акушерской патологией, такой как бесплодие, невынашивание беременности и неудачи ВРТ, однако гетерогенность популяций не позволяет унифицировать полиморфные аллели для всех выборок [47,50,51]. Было проведено 5 исследований по определению sHLA-G как потенциального маркера ранних гестационных потерь. Доказано, что sИLA-G напрямую регулируют эндоваскулярную и децидуальную инвазию, что в последующем защищает эмбрион от атаки материнскими клетками иммунной системы [45,48,49], что, по данным ряда авторов, подтверждается повышением его уровня экспрессии при неотягощенной физиологической беременности [85,86,87]. Однако, по данным других исследователей, отягощенный репродуктивный анамнез никак не влияет на уровень экспрессии sHLA-G при беременности [88, 90].
В единичных работах иностранных ученых описаны ассоциации полиморфизмов гена ИЬЛ-Е и ИЬЛ-С с ранними репродуктивными потерями [100,121,122], повышение уровня антител к HLA-C у пациенток с многократными потерями плода в I триместре [125]. Показано, что ИLA-E выполняет защитную роль с самых ранних этапов предимплантационного периода до момента активной инвазии вневорсинчатого трофобласта [99,104], в то время как HLA-C может оказывать непосредственное влияние на инвазию трофобласта и инициацию нормальной плацентации. Однако роль экспрессии молекул HLA-C и ИLA-E в течение беременности в качестве предиктивных маркеров ее успешного развития до сих пор не изучена.
Комплексное исследование системы ЫЬА I класса Е, С) у пациентов с ранними репродуктивными потерями в анамнезе может объяснить иммуноопосредованное звено в патогенезе прерывания беременности при исключении генетических аномалий эмбриона.
Цель исследования
Цель исследования: оценить роль антигенов Н^А I класса Е и С) в генезе репродуктивных потерь раннего срока.
Задачи исследования
1. Провести комплексное цитогенетическое и морфологическое исследование ткани ворсинчатого хориона при неразвивающейся беременности: верифицировать экспрессию HLA-G и KIR2DL4 рецептора при нормальных и аномальных кариотипах плодов.
2. Оценить уровни биологических молекул sHLA-G, КСА^, ИLA-E, ^ЛЬА-С, PIBF и трофобластического Р-глобулина (ТБГ) в крови у беременных I триместра с репродуктивными нарушениями.
3. Изучить особенности течения первого триместра у беременных с репродуктивными нарушениями в зависимости от различий в уровнях HLA-G, -Е и -С в крови.
4. Провести молекулярно-генетический анализ 9 полиморфных аллелей гена ЫЬА^ у беременных с репродуктивными нарушениями в I триместре.
5. Исследовать уровни 5 биологических компонентов (sHLA-G, ЫЬА-Е и ^ЛЬА-С, PIBF и релаксина) в фолликулярной жидкости у пациенток с репродуктивными нарушениями в программах ВРТ.
Научная новизна исследования
Впервые верифицирована высокая экспрессия Н^А^ в тканях хориона, которая является новым морфологическим критерием прогрессирования беременности с нормальным кариотипом плода.
Впервые установлена генетическая предрасположенность к потерям беременности на ранних сроках у носителей сочетанного генотипа по двум вариантам полиморфизма 3741* Бв/Юв/ 14п.н. и -725С/С в гене ИЬЛ-О.
Впервые у пациенток с репродуктивными нарушениями идентифицированы уровни Н^А-Е и HLA-C в крови, которые определяют прогрессирование беременности, угрозу самопроизвольного выкидыша и прерывание беременности в ранние эмбриональные сроки. Высокие уровни HLA-E и Н^А-С являются прогностическими факторами потери беременности в ранние эмбриональные сроки.
Впервые на основании выделенных факторов при оценке уровня HLA-C в крови разработана математическая модель прогнозирования риска развития угрожающего выкидыша у пациенток с ранними репродуктивными потерями и привычным выкидышем. Получен патент № 2784574 «Способ прогнозирования угрожающего выкидыша у женщин в I триместре гестации» (28.11.2022).
Впервые у пациенток с репродуктивными нарушениями в фолликулярной жидкости определены локальные уровни sHLA-G, Н^А-Е, Н^А-С, PIBF, релаксина.
Практическая и теоретическая значимость
Определен предиктивный уровень ИЬА-С в плазме крови, при значении, равном 118 мкг/мл или выше, прогнозируется угрожающий выкидыш в сроке 513 недель беременности.
Впервые получены формулы интегральной оценки маркеров иммунного гомеостаза (экспрессии sHLA-G, HLA-G, ИLA-E, ИЬА-С, PIBF, ТБГ), которые позволяют эффективно прогнозировать вероятность развития угрожающего выкидыша I триместра (чувствительность 73,1%, специфичность 89,3%, точность 81,5%).
Методология исследования
Дизайн исследования включил 4 последовательных взаимосвязанных этапа. Методология, материал, методы, объем выборки для каждого из них были определены исходя из задач: 1) цитогенетическое и морфологическое исследование 121 образца абортивного материала при неразвивающейся и прогрессирующей беременности, прерванной при медицинском аборте (исследование «случай-контроль» 2019-2020 гг.), 2) анализ 9 полиморфных аллелей гена ^А^ у 180 человек - 62 беременных в I триместре гестации и 118 человек из популяционной выборки Северо-Западного региона РФ (исследование «случай-контроль» 20202022 гг.), 3) оценка уровней sHLA-G, ИЬА^, ИLA-E, ИЬА-С, PIBF, ТБГ в плазме крови 70 женщин в I триместре гестации (проспективное когортное исследование 2019-2022 гг.), 4) оценка уровней 5 биологических компонентов ^Н^А^, ИLA-E, ИЬА-С, PIBF, релаксина) в ФЖ (проспективное когортное исследование 2022 г.). В работе использованы клинико-анамнестический, инструментальный, иммуноферментный, молекулярно-биологический, цитогенетический,
молекулярно-генетический, морфологический (гистологический и иммуногистохимический) методы исследования, которые выполнялись в различных лабораториях ФГБНУ "НИИ АГиР им. Д.О.Отта".
Положения, выносимые на защиту
1. Высокая экспрессия HLA-G в ворсинах хориона является новым морфологическим критерием прогрессирования беременности плодом с нормальным кариотипом на момент ее прерывания. При неразвивающейся беременности плодом как с нормальным, так и с аномальным кариотипом по типу полиплоидии экспрессия HLA-G снижена.
2. Сочетание генотипов 3741*Del/Del 14п.н. и -725С/С гена HLA-G ассоциировано с прерыванием беременности на ранних сроках гестации.
3. Уровень белковых молекул HLA I класса (G, E и C) детерминируют течение беременности на ранних сроках. При прогрессирующей беременности высокий уровень sHLA-G, ТБГ и прогестерона сочетается с низким уровнем HLA-E и HLA-C. Напротив, при угрожающем выкидыше одновременно происходит снижение уровней HLA-G, ТБГ и прогестерона и повышение уровней HLA-E и HLA-C. При потере беременности отмечен наиболее высокий уровень HLA-E и HLA-C на фоне трехкратного падения показателей ТБГ и прогестерона.
Апробация результатов
По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, 5 статей в ведущих периодических изданиях, индексируемых в международной реферативной базе данных Scopus и рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов научных исследований, 1 статья индексируется в базе данных RSCI на платформе Web of Science. Получен патент на изобретение .№2784574 (28.11.2022).
Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (приказ № 89 от 22.10.2019) и было выполнено в рамках научно-исследовательской работы по поисковой теме: «Разработка диагностических критериев прогнозирования ранних репродуктивных потерь на основании экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса G, E, C» (номер темы госрегистрации: АААА-А20-120041390025-9).
Основные результаты работы внедрены в клиническую практику клинико-диагностического отделения, отделения вспомогательных репродуктивных технологий, отдел акушерства и перинатологии, отдел иммунологии и межклеточных взаимодействий ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта».
Результаты исследования представлены и доложены на 8 Международной конференции по HLA-G, 2019, Париж; XX Всероссийском научно-образовательном форуме «Мать и Дитя», 2019, Москва; XXI Всероссийском научно-образовательном форуме «Мать и Дитя», 2020, Москва; 19 Мировом конгрессе по гинекологической эндокринологии (The 19th Gynecological Endocrinology World Congress - virtual edition), 2020, Флоренция; Конференции с международным участием «Здоровье женщины, плода, новорожденного», 2021, Санкт-Петербург; III Национальном Конгрессе с международным участием «Инфекции. Год с COVID-19: итоги» (ЛАБРиН - 2021); Научно-практической Школе: «Современная стратегия ведения пар с репродуктивными потерями (невынашивание беременности, неудачи ЭКО), 2021, Санкт-Петербург; XV Общероссийском семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и контраверсии», 2021, Сочи; XXII Всероссийском научно-образовательном форуме «Мать и дитя - 2021», 2021, Москва; 37 Виртуальной ежегодной встрече Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE's virtual 37th Annual Meeting), 2021, Милан; 2 Международной конференции по изменению парадигмы ведения ранней беременности и невынашивания беременности (PCMEP), 2021, Дубай; XXIII Всероссийском научно-образовательном форуме «Мать и дитя - 2022», 2022, Москва; 9 Международной конференции по HLA-G, 2022, Париж; 38 Виртуальной ежегодной встрече Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE's virtual 38th Annual Meeting), 2022, Милан; 19 Всемирном конгрессе по репродукции человека, 2023, Венеция. Победитель конкурса молодых учёных в рамках III Общероссийской научно-практической конференции для акушеров-гинекологов "Оттовские чтения", 2021 г., Санкт-Петербург.
Личный вклад автора в исследование
Автор самостоятельно выполнил сбор и систематизацию данных клинического обследования, сбор биологического материала. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование проведены автором совместно с сотрудниками лаборатории иммуногистохимии, молекулярно-генетическое исследование проведено автором совместно с сотрудниками отдела геномной медицины ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта». Операции abrasio cavi uteri, морфометрический анализ, постановка электрофореза, систематизация и статистическая обработка данных, интерпретация полученных результатов и сопоставление с данными литературы, формулировка выводов и разработка практических рекомендаций, подготовка материалов диссертационного исследования проведены автором самостоятельно.
Структура и объем диссертации
Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, заключение и список литературы. Диссертационное исследование изложено на 145 страницах машинописного текста. Список литературы состоит из 143 источников, включая 12 отечественных и 131 зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 37 таблицами.
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Ранние репродуктивные потери. Частота, формы, критерии установки диагноза, мультифакториальность заболевания
Рост числа бесплодных супружеских пар с невынашиванием беременности в анамнезе, включая повторные потери плода и неудачи ВРТ, является неблагоприятным фоном в демографической картине Российской Федерации [1]. Согласно предоставленным данным Российского общества акушеров-гинекологов от 2021года в зависимости от региона нашей страны частота бесплодных браков варьирует в промежутке от 17,2% до 24% [2], частота невынашивания беременности раннего срока - 11-13%, в каждом четвертом случае - привычная потеря плода, что составляет 1-5%.
Диагноз «привычная» потеря плода или привычное невынашивание беременности (ПНБ) в Российской Федерации определяется как потеря двух или более беременностей с момента зачатия до 22 недель гестации. Выделяют три формы репродуктивных нарушений, в зависимости от акушерского анамнеза: первичную, вторичную и третичную. Первичное ПНБ характеризуется привычной потерей плода без предыдущей пролонгации беременности после 22 недель гестации, вторичное ПНБ проявляется эпизодом повторных неудач после одной или нескольких предыдущих беременностей, прогрессирующих после 22 недель, завершившихся рождением живого ребенка, в то время, как при третичном ПНБ выкидыши предшествуют выношенной беременности, а затем вновь происходят после родов. Также существует понятие о третичном ПНБ, которое характеризуется наличием выкидышей, как до, так и после выношенной беременности (рисунок 1).
ПРИВЫЧНОЕ НЕВЫНАШИВАНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ
наличие у женщины 2-х и более клинических потерь беременности на сроке до 22 недель
БИОХИМИЧЕСКАЯ БЕРЕМЕННОСТЬ САМОПРОИЗВОЛЬНЫЙ выкидыш НЕРАЗВИВАЮЩАЯСЯ БЕРЕМЕННОСТЬ ПЕРВИЧНОЕ ПНБ ВТОРИЧНОЕ ПНБ ТРЕТИЧНОЕ ПНБ ПАРИТЕТ БРАКА
КАК В ЕСТЕСТВЕННОМ ЦИКЛЕ. ТАК II ПОСЛЕ ВРТ
" ПУЗЫРНЫЙ ЗАНОС ВНЕМАТОЧНАЯ БЕРЕМЕННОСТЬ НЕУДАЧИ ИМПЛАНТАЦИИ РАННИЕ РЕПРОДУКТИВНЫЕ ПОТЕРИ Репродуктивные потери до • п оявления с/б пл ода Репродуктивные потери с • появления с/б плода до 13 недель в Репродуктивные потери >13 недель = поздние выкидыши Поздние выкидыши спонтанные/индуцированные
ИСКЛЮЧЕНО ИЗ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДО 10 НЕДЕЛЬ ГЕСТАЦИИ
Рисунок 1 - Современные представления о структуре ПНБ
Согласно последним рекомендациям ESHRE (2022) в определение ПНБ включены как клинические потери (подтвержденная беременность на основании ультразвукового исследования), так и доклинические потери беременности (подтвержденная беременность на основании исследования уровня в-ХГЧ в моче или сыворотке крови) в естественном цикле или в протоколе ВРТ [3].
Известно, что риск невынашивания возрастает с увеличением числа предшествующих потерь беременности на разных сроках гестации. Так, риск повторных потерь беременности после 1-го выкидыша составляет 13-17%, тогда как после 2-х предшествующих случаев невынашивания на ранних сроках гестации - риск повторного выкидыша составляет 36-38% [4].
Среди всего большого спектра причин ранних репродуктивных потерь этиология в половине случаев остается неясной. Это подходит под понятие «идиопатического невынашивания беременности», и пациентки из данной группы являются самыми сложными для консультации врача. Доказано, что при идиопатическом привычном выкидыше частота эмбрионов с генетическими нарушениями значительно ниже, чем при однократном случае невынашивания
беременности (НБ) [5]. В настоящее время считается общепризнанным, что в этиопатогенезе многократных ранних гестационных потерь в случае исключения генетических аномалий ведущую роль играют иммунные механизмы [6]. Так, среди причин привычного выкидыша неясного генеза различные иммунные механизмы достигают 70%. Изучение иммунологического профиля не рекомендовано рутинно проходит на конечном этапе всего исследования, после исключения других возможных механизмов реализации потерь плода.
Этиология самопроизвольного прерывания беременности мультифакториальна. Так, здоровая развивающаяся беременность складывается из совокупности четырех основных компонентов:
1) компонент со стороны плода - генетически полноценный эмбрион при его толерантности к иммунной системе матери;
2) компонент со стороны материнского организма - оптимальная продукция гормонов, направленных на сохранение беременности, при достаточной экспрессии чувствительных к ним рецепторов, архитектоника матки, витаминный и микронутриентный гомеостаз в системе «мать-плацента-плод»;
3) компонент со стороны организма отца - оптимальный баланс гормонов, влияющих на репродуктивное здоровье, качество спермы и ее генетического составляющего;
4) компонент со стороны внешней среды - влияние эмбриотоксических и тератогенных веществ в критические периоды органогенеза, действие ионизирующего излучения, повреждающее действие инфекционных агентов, воздействие ксенобиотиков, к которым относятся лекарственные препараты.
Известно, что с самых ранних сроков физиологической беременности в организме женщины формируется гестационная иммуносупрессия, основанная на взаимодействии с эмбрионом, являющимся аллотрасплантатом по отношению к организму матери. Успешная материнская переносимость полуаллогенного плода представляет собой «иммунологический парадокс». Так, в норме иммунная система матери активно адаптируется к присутствию полуаллогенных антигенов плода, унаследованных от отца, формируя иммунологическую толерантность,
необходимую для предотвращения отторжения фетальных тканей. У беременной эмбрион обычно считается естественным аллотрансплантатом, но на самом деле трансплантатом является плацента.
В 2000 году A. Beer и J. Kwak впервые определили 5 иммунологических категорий, ассоциированных с репродуктивными нарушениями, такими как невынашивание беременности, неудачи ВРТ и идиопатическое бесплодие, куда были включены: генетическая совместимость супругов по антигенам системы HLA II класса; 2) антифосфолипидный синдром (АФС); 3) наличие антинуклеарных/антигистоновых/антиспермальных антител; 4) тяжелая иммунологическая патология с имплантационными нарушениями и 5) высокое содержание клеток CD19+CD5+ [7]. Данная классификация постоянно обновляется, и в настоящее время известно более 100 иммунологических биомаркеров, которые могут приводить к ранним репродуктивным потерям при нормальном кариотипе плода [8]. Так, существует спектр обследования пациентов с привычной потерей плода, включающий большую иммунологическую панель, представленную в таблице 1.
Ключевой компонент иммунной системы, главный комплекс гистосовместимости (MHC), представляет собой систему человеческих лейкоцитарных антигенов (или систему тканевой совместимости человека, англ. HLA, Human Leukocyte Antigens), участвующую в презентации антигенов. Известно, что система HLA I класса контролирует взаимодействие всех иммунокомпетентных клеток организма [10], что включает распознавание своих и чужеродных клеток с последующим запуском ответа иммунной системы с ранних сроков беременности.
Чтобы избежать распознавания и отторжения тканей плода, при беременности возникают три основных механизма «бегства» от иммунного ответа организма: (а) анатомическое разделение посредством барьера между тканями матери и плода, которым служит плацента; (b) модификация экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости в плаценте; (с) подавление иммунитета, опосредованного материнскими клетками.
Таблица 1 - Иммунологическая панель обследования пациентов с ПНБ [9]
Гены Killer Immunoglobulin Гены Human Leukocyte Определение
Receptor (KIR) Antigen (HLA) внутриклеточных цитокинов
KIR2DL1 KIR2DS1 Class I CD4+T cells NKT cells
KIR2DL2 KIR2DS2 HLA-A TNFa TNFa
KIR2DL3 KIR2DS3 HLA-B IFNg IFNg
KIR2DL4 KIR2DS4 HLA-C IL-17 IL-17
KIR2DL5 KIR2DS5 Class II IL-4 IL-4
IL- DQal IL-10 IL-10
KIR3DL1 KIR3DS1 HLA-DQbl CD8+T cells NK cells
KIR3DL2 HLA-DRB1 TNFa TNFa
KIR3DL3 HLA-DRD3/4/5 IFNg IFNg
HLA-G 14 bp ins/del IL-17 IL-4 IL-10 IL-17 IL-4 IL-10
Цитотоксическая активность NK-клеток Иммунофенотипирование в репродукции
E:T 50:1 Native State Total T cells CD4+ NKT cells
E:T 25:1 Native State Total NKT cells CD8+ NKT cells
E:T 12.50:1 Native State Total NK cells CD4-8 NKT cells
E:T 25:1+IL-2 Stinulation CD16+ NK cells CD8+ T cells
E:T 25:1+Intralipid CD16- NK cells CD4+ T cells
E:T 25:1+12.5 mg/dl IgG Activated T cells Activated CD4+ T cells
E:T 25:1+6.5 mg/dl IgG CD28+ T cells Activated T cells
Total B cells Regulatory T cells
B1a B cells
Anti-HLA антитела
Цитокины в сыворотке
Определение аутоантител
Другое
Антитела HLA I класса
• HLA-A
• HLA-B
• HLA-C
Антитела HLA II класса
• HLA-DQA1
• -DQB1, -DRB1, -DRB3
• -DRB-4, -DRB5 Комплемент C1q
TNFa
IL-6 IL-8 IL-17
TGFb-1/2/3
Антинуклеарные антитела
АФА
Антитела щитовидной железы:
- анти-ТПО
- анти-ТГ
- анти-ТТГ рецептор Ревматоидный фактор Антител к циклическому цитрулиновому пептиду (анти-ССР)
Антитела к ХГЧ
Антитела к
протромбину
Антитела
к аннексину V
Антиспермальные
антитела
Активность компонентов системы комплемента: С3 и С4
Общий 1§М
Общий 1§А Общий 1§0 Общий 1§Б Витамин Б
Гомоцистеин
Полиморфизмы МТЫБЯ (С677Т А1298С)
Индекс Омега-3
В частности, ряд ученых считает, что полный отказ этих механизмов может вызвать выкидыш, в то время как частичное нарушение иммунной толерантности плода может привести к нарушению структуры плаценты при ее формировании с образованием дисфункциональной маточно-плацентарной перфузии [11].
Таким образом, до настоящего времени сохраняющиеся различия в терминологии при потере плода и сроках прерывания беременности влияют на официальные статистические данные патологии в отдельных странах, отсутствие стандартизации в клинических протоколах при «недоказанной базе иммунологической панели обследования» данной когорты пациентов не позволяют адекватно оценить проблему как на мировом, так и на всероссийском уровне.
1.2 Исторические предпосылки, развитие иммунологии репродукции, открытие главного комплекса гистосовместимости HLA
Все основополагающие механизмы, которые непосредственно связаны с проблемой ранних репродуктивных потерь иммунологического генеза, можно приурочить к открытиям мирового масштаба второй половины XX века.
Так, в 1952 году французский ученый Jean-Baptiste-Gabriel-Joachim Dausset, американский иммунолог венесуэльского происхождения Baruj Benacerraf и американский трансплантолог-иммунолог George Davis Snell получили мировую известность за счет совершенного ими совместного открытия человеческих лейкоцитарных антигенов. Данное открытие позволило ученым предсказывать вероятность реакции отторжения при пересадке органов и тканей, что положило начало развития современной трансплантологии [12].
На год позже, в 1953 году, P. Medawar положил начало в области репродуктивной иммунологии, поставив вопрос «почему полуаллогенный плод защищен от отторжения со стороны материнской иммунной системы?» [13,14]. Если к беременности применять классические правила трансплантационного иммунитета - плод, как «трансплантат», должен быть отвергнут организмом матери - «хозяином».
Напротив, активация иммунной системы с подтверждением беременности организмом женщины необходимо для успешной имплантации и последующего развития беременности [15].
Исследования 1960-х годов продемонстрировали влияние системы HLA на развитие, течение и исход беременности с самых ранних сроков гестации [16]. В работах 1970-х годов была показана ассоциация большого числа совпадений HLA в парах с привычным невынашиванием беременности. По данным Л.Д. Серовой, «при совместимости супругов по 3 и более антигенам HLA системы риск НБ и бесплодия возрастает до 100%» [17].
В 1980 году J. Dausset, B. Benacerraf и G. Snell были удостоены Нобелевской премии по медицине и физиологии «за открытия, касающиеся генетически детерминированных структур на клеточной поверхности, регулирующих иммунологические реакции». C. Ober с соавт. показали высокую частоту HLA-DQ совпадений у супругов с привычной потерей плода, используя метод ПЦР [18].
В 90-х годах была установлена связь между привычной потерей плода и локусами HLA-DR (DR1 и DR3) [19-21]. Так, в парах с ПНБ супруги чаще совпадали по HLA-DR антигенам, в том числе, достоверно чаще диагностировался гаплотип HLA-B44/DR5 [22].
Таким образом, во второй половине XX века было доказано, что беременность представляет собой иммунологический парадокс, где плод по отношению к организму матери является аллотрансплантатом, однако открытие механизмов «ухода» от распознавания и отторжения тканей плода иммунной системой матери было совершено значительно позже.
1.3 Механизмы «ухода» иммунной системы плода от материнского организма
В 2019 году группой бельгийских и итальянских ученых были определены несколько моделей взаимодействия (интерфейсов) полуаллогенного трофобласта с материнской иммунной системой в зависимости от гестационного возраста и анатомического расположения [11] (рисунок 2). На ранней стадии имплантации бластоциста окружена трофэктодермой, которая впоследствии преобразуется как
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Комплексный подход к прегравидарной подготовке женщин со спорадическим случаем неразвивающейся беременности2021 год, кандидат наук Сафарова Гюлай Агамуса кызы
Морфологические и иммуногистохимические особенности неразвивающейся беременности I триместра2015 год, кандидат наук Траль, Татьяна Георгиевна
Роль факторов врожденного и адаптивного иммунитета в генезе невынашивания беременности2016 год, кандидат наук Нефедова Диана Давидовна
Иммуноцитохимические маркеры привычного невынашивания беременности2023 год, кандидат наук Дамирова Кемер Фирудин кызы
Оптимизация ведения пациенток с неразвивающейся беременностью2014 год, кандидат наук Юлбарисова, Резеда Рифовна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шенгелия Маргарита Олеговна, 2023 год
Источник кривой
— ЕН1_А-6 (ЕД/мл)
-ША-в (нг/мл)
Н1_А-Е (нг/мл) Н1_А-С (м кг/мл) Р1БР (нг/мл) ТБГ (нг/мл)
Прогестерон (нмоль/л) Опорная линия
Рисунок 13 - ЯОС-кривая оценки вероятности развития угрожающего выкидыша в зависимости от уровней sHLA-G, НЬЛ^, НЬЛ-Б и НЬЛ-С и PIБF
Таблица 31 - Площадь под ROC-кривой (AUC)
Переменные результата проверки Область Асимптотический 95% доверительный интервал
нижняя граница верхняя граница
sHLA-G (Ед/мл) 0,530 0,358 0,702
HLA-G (нг/мл) 0,501 0,324 0,678
HLA-E (нг/мл) 0,627 0,462 0,792
HLA-C (мкг/мл) 0,826 0,696 0,957
PIBF (нг/мл) 0,720 0,570 0,870
ТБГ (нг/мл) 0,520 0,347 0,693
Прогестерон (нмоль/л) 0,338 0,178 0,499
Среди всех проанализированных иммунологических маркеров sHLA-G, НЬЛ^, HLЛ-Б и PIBF в отношении оценки вероятности развития угрожающего выкидыша в I триместре показали свою низкую прогностическую значимость, в то время как у НЬЛ-С она оказалась высокой (рисунок 14, таблица 32).
ROC Кривые
0,0 0,2 0,4 0,6 0,3 1,0
1 - Специфичность
Рисунок 14 - ЯОС-кривая оценки вероятности развития угрожающего выкидыша
в зависимости от уровней ИЬЛ-С
Таблица 32 - Оценка прогностической ценности метода определения уровня
HLA-C
Показатель %
Точность метода (Acc) 81,5
Чувствительность (Se) 73,1
Специфичность (Sp) 89,3
Площадь под ROC - кривой (AUC) 0,83
95% доверительный интервал (ДИ) 0,708-0,947
На основании полученных данных при помощи логарифмического анализа и построения ROC-кривой была установлена специфичность, чувствительность и прогностическая значимость оценки ИЬЛ-С как фактора предикции развития угрожающего выкидыша у пациенток с ранними репродуктивными потерями и привычным невынашиванием беременности. Был получен патент на изобретение № 2784574 «Способ прогнозирования угрожающего выкидыша у женщин в I триместре гестации» (Дата подачи заявки 22.09.2022 Дата государственной
регистрации в Государственном реестре изобретений РФ 28.11.2022). Способ прогнозирования угрожающего выкидыша у женщин в I триместре гестации путем исследования биологического материала, отличается тем, что в периферической венозной крови беременной женщины в сроке гестации 5-13 недель беременности определяют содержание уровня HLA-C (Human leucocyte antigen C) и при значении HLA-C, равном 118 мкг/мл или выше, прогнозируют угрожающий выкидыш. Способ обладает точностью 81,5% и специфичностью 89,3%.
Таким образом, можно заключить о высокой эффективности изолированного применения метода определения уровня HLA-C в прогнозировании развития угрожающего выкидыша у пациенток с 5 до 13 недель гестации с точностью 81,5% и специфичностью 89,3%.
Течение II и III триместра и исходы настоящей беременности
Статистически значимым оказалось количество женщин с досрочным прерыванием беременности (неразвивающаяся беременность и преждевременные роды) из группы 1, что составило 28,6%, по сравнению с группой 3, где данное осложнение не было выявлено ни у одной беременной (28,6% и 0%, p=0,004). Гестационный сахарный диабет, плацентарная недостаточность и анемия беременных развились в единичных случаях. В 3-х группах статистически не отличались: срок родов, росто-весовые параметры и состояние новорожденного по шкале Апгар (таблица 33).
Таблица 33 - Течение II и III триместра гестации и исходы беременности
Показатель Группа 1 с НБ (n=30)* Группа 2 Контрольная (n=32) Р
n % n %
ГСД (%) 9 30% 7 21,87% p=0,465
ОРВИ (%) 5 16,67% 3 9,37% p=0,393
Анемия беременных (%) 10 33,33% 9 28,13% p=0,657
Преэклампсия (%) 5 16,67% 1 3,13% p=0,072
ИЦН (%) 4 13,33% 2 6,25% p=0,346
Угрожающие преждевременные роды (%) 9 30% 5 15,625% p= =0,177
Инфекция мочевыводящих путей (%) 6 20% 2 6,25% p= =0,107
Хроническая плацентарная недостаточность (%) 2 6,67% 1 3,13% p= =0,660
Гипотрофия плода (%) 0 0% 0 0% p =1,00
Преждевременные роды на сроке 32-37 недель (%) 1 3,33% 0 0% p= =0,356
Срочные роды (%) 29 96,67% 32 100% p= =0,298
Роды через естественные родовые пути (%) 20 66,67% 23 71,87% p= =0,659
КС по экстренным показаниям (%) 4 13,33% 5 15,63% p= =0,798
КС в плановом порядке (%) 6 20% 4 12,5% p= =0,423
Вес новорожденного (г) (M±m) 3316,9±91,59 3280,56±94,58 p= =0,790
Рост новорожденного (см) (M±m) 50,88±0,59 49,83±0,46 p= =0,204
Примечание: * - из группы 1 были исключены пациентки с неразвивающейся беременностью в I триместре (п=8)
Так, среди пациенток с ранними репродуктивными потерями чаще в течение беременности развивается преэклампсия, повышен риск развития угрожающих преждевременных родов, истмико-цервикальной недостаточности и досрочного прерывания беременности.
Таким образом, в плазме крови идентифицированы различные уровни sHLA-G, HLA-G, HLA-E, HLA-C в зависимости от акушерского анамнеза и клинического течения настоящей беременности. У пациентов с ранними репродуктивными потерями на сроке более 6 недель по сравнению с пациентками без отягощенного акушерского анамнеза отмечается тенденция к повышению уровней sHLA-G и HLA-C (2,65±0,14 и 2,29±0,03, р=0,026; 226,26±59,43 и 135,83±29,71, р=0,057 соответственно). Установлена ассоциация между уровнем экспрессии HLA-E и хроническим экдометритом (р=0,020).
У беременных с угрожающим выкидышем I триместра установлены достоверно различные уровни HLA-C, PIBF и прогестерона (239,19±34,61, 1470,66±61,04 и 69,04±5,39) по сравнению с беременными при физиологичном течении гестации (91,89±34,61, 1263,59±49,96 и 85,75±6,34) (р<0,05). Оценки предиктивной значимости уровня HLA-C в крови позволяет с высокой
вероятностью (точность 81,5%, специфичность 89,3%) прогнозировать развитие угрожающего выкидыша в I триместре беременности.
При неразвивающейся беременности установлены достоверно низкие уровни ТБГ и прогестерона по отношению к группе с пролонгирующей беременностью (2259,50±1115,71, 15149,56±1616,29 соответственно, р<0,001 и 53,21±11,02, 93,22±6,29 соответственно, р=0,002).
Отмечено, что у пациенток с отягощенным акушерским анамнезом повышен риск досрочного прерывания беременности в 7 раз по сравнению с женщинами без невынашивания беременности в анамнезе.
ГЛАВА 6 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение уровней 5 биологических компонентов (sHLA-G, HLA-E и HLA-C, PIBF и релаксина) у женщин с репродуктивными нарушениями в программах ВРТ
Четвёртый этап работы включал исследование уровней sHLA-G, HLA-E, HLA-C, PIBF и релаксина в образцах фолликулярной жидкости у пациенток (n=22) с репродуктивными нарушениями в программах ВРТ.
Методика получения образцов ФЖ и постановки твердофазного иммуноферментного анализа описана в главе 2.
Средний возраст пациенток в исследуемой группе составил 34,6±2,7 лет, ИМТ 23,3±2,9 лет (таблица 34).
При анализе гинекологического анамнеза к наиболее частой патологии среди всех обследованных можно отнести воспалительные заболевания органов малого таза, такие как хронический сальпингоофорит (72,3%) и хронический эндометрит (59,1%). Гинекологические операции в анамнезе имели 81,9% пациенток, среди которых 40,9% относятся к диагностической лапароскопии и 36,6% - к abrasio cavi uteri.
При анализе экстрагенитального анамнеза нарушение функции щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит) встречалось у каждой пятой женщины. Хронический гастрит и хронический цистит были установлены в 13,6% случаев, хронический пиелонефрит и дегенеративно-дистрофические заболевания позвоночника наблюдались у каждой 10-й пациентки.
Таблица 34 - Характеристика исследуемой когорты пациенток
Параметры Группа обследования
n %
Характеристика группы:
Возраст (лет) 34,6±2,7
ИМТ (кг/м2) 23,3±2,9
Репродуктивный анамнез:
Длительность бесплодия (годы) 5,1±3,1
Роды в анамнезе 3 13,6
Невынашивание беременности в анамнезе 5 22,7
Привычное невынашивание беременности 3 13,6
Искусственный аборт в анамнезе 6 27,3
Структура гинекологической патологии:
Аномалия полового аппарата 1 4,5
Хронический эндометрит 13 59,1
Хронический сальпингоофорит 16 72,7
Полип эндометрия в анамнезе 1 4,5
Синехии полости матки 1 4,5
НГЭ Ш ст. 6 27,3
Миома матки 2 9,1
Рецидивирующий вагиноз/вагинит 2 9,1
Хирургические вмешательства:
Гинекологические операции 18 81,8
Гистероскопия диагностическая 9 40,9
Гистерорезектоскопия (полипэктомия) 1 4,5
Abrasio cavi uteri 8 36,6
Соматический анамнез
Артериальная гипертензия 1 4,5
Хронический гастрит 3 13,6
АИТ 4 18,2
Хронический пиелонефрит 2 9,1
Хронический цистит 3 13,6
Дегенеративно-дистрофическое заболевание позвоночника 2 9,1
Продолжительность периода репродуктивных неудач в среднем составил 5,1±3,1 лет (таблица 35).
Если у женщины в анамнезе не было беременностей в естественном цикле, то имеет место первичное бесплодие; если в анамнезе не было родов позднее 22 недель, то ПНБ первичное, а если были - вторичное. При анализе
репродуктивного анамнеза диагноз «первичное бесплодие» был установлен в 40,9% случаев, среди которых каждая третья пациентка имели неудачи ВРТ. В группе пациенток анамнестически процент неудач при программах ВРТ составил 86,4%.
Таблица 35 - Форма репродуктивных нарушений у женщин исследуемой группы
Форма Группа обследования
n %
Первичное бесплодие 9 40,9
среди них неудачи ВРТ 3 13,6
Вторичное бесплодие 13 59,1
Неудачи ВРТ 19 86,4
Первичное ПНБ 0 0
Вторичное ПНБ 1 4,5
Длительность бесплодия (годы) 5,1±3,1
По данным акушерского анамнеза среднее число беременностей составило 1,14±0,35 (таблица 36). Невынашивание беременности ранних сроков встречалось у каждой пятой пациентки и составило 22,7%. Срочные роды отмечены у 13,6% пациенток.
Таблица 36 - Исходы предыдущих беременностей у женщин исследуемой группы
Форма Группа обследования
n %
Среднее число беременностей (M±m) 1,14±0,35
Невынашивание беременности (1+2): 5 22,7
1. Самопроизвольный выкидыш 2 9,1
2. Неразвивающаяся беременность 3 13,6
Искусственный аборт 6 27,3
Срочные роды 3 13,6
Результаты иммунологического исследования ФЖ представлены в таблице 37.
Таблица 37 - Экспрессия биологических компонентов фолликулярной жидкости в исследуемой группе
№ пациентки ИЬЛ-Б, нг/мл бИЬЛ-О, Ед/мл ИЬЛ-С, мкг/мл РШБ, нг/мл Яе1ахт, пг/мл
1 3,529 0,228 190 1197,3 5,871
2 3,309 0,253 210 1409,7 8,58
3 2,868 0,262 300 1843,7 13,26
4 2,869 0,228 10 1884,7 12,74
5 3,015 0,243 233 3118,4 5,143
6 2,941 0,222 248 3333,8 3,9
7 2,868 0,256 47 2787,6 3,643
8 3,824 0,293 168 2716,2 3,129
9 2,868 0,225 145,3 1346,0 6
10 3,088 0,243 228 1050,1 6,814
11 3,162 0,234 245 1896,8 5,614
12 3,235 0,215 14 1177,5 15,21
13 2,721 0,265 132 3053,1 5,957
14 3,235 0,24 237 3009,1 5,014
15 3,603 0,237 18 3135,1 3,771
16 4,118 0,3 453 2651,0 2,314
17 3,824 0,259 175 1400,6 5,443
18 3,162 0,237 147 528,1 11,7
19 3,382 0,237 175 1484,1 7,757
20 2,941 0,268 18 1962,1 7,543
21 3,256 0,225 17 1919,6 4,2
22 2,982 0,253 19 1402,1 3,686
Рисунок 15 - Основные характеристики экспрессии биологических компонентов фолликулярной жидкости (среднее значение, стандартное отклонение, максимальные и минимальные значения в выборке)
Среднее значение всех определенных биологических компонентов представлено на рисунке 15 и составило: 0,242±0,02 Ед/мл для sHLA-G, 3,18±0,55 нг/мл для HLA-E, 155,8±87,5 нг/мл для HLA-C, 1951,1±955,2 нг/мл для PIBF и 6,28±3,5 пг/мл для релаксина.
В результате исследования установлена положительная корреляция высокой силы связи между показателями ИЬЛ-Б ФЖ и возрастом (г=0,813), ИМТ (г=0,866), а также между уровнями ИЬЛ-С и тестостероном (г=0,960). Отмечена отрицательная обратная связь между показателями уровня PIBF ФЖ и релаксином (г=-0,450). Выявлена отрицательная обратная связь между PIBF и антителами к тиреопероксидазе (г=-0,649) и ТТГ (г=-0,519) (рисунок 16).
3500,0 3000,0
Е"
г
"й 2500,0
а
& 2000,0 РЭ
Е
1500,0 1000,0 500,0
3500,0
д-. 3000,0
¡3 2500,0 ЬьГ
РЗ 2000,0
Е
1500,0
• • • .
• о •
Г — - 0,450*
9 |у=2,67ЕЗ-1,07Е2*х{ • •
а • . • О • •
•
2,5
5,0 7,5 10,0 12,5 15,0
Яе1ахш, пг/мл '
г = -0,649*
( р
у=2,ЗЗЕЗ-1,51 х]
.00 200,00 400,00 600.00 800,00 1000.00 1200.00
а/т к ТПО, МЕ/мл
4.2 4,0 | 3.8
я з.б ы
< 3.4 Я 3.2 3.0 2.8
•
• !_
= 0,866**
г •
•
• у =1,64+0,07*х|
• • •
• • • • •
18 20 22 24 26
ИМТ, кг/м 2
28
400,0
м 200-°
,00 20,00 40,00 60,00 80.00 100,00 120,00 140,ОС
Тестостерон, нмоль/л
4,2 4,0 3 3.8 Я 3,6
ы
< 3,4 И 3,2 3,0 2,8
1,00 2,00 3,00 4,00
ТТГ, мЕд/л
•
Г = = 0,813** в
--- ■
|у =2,8+0,01*х| •
• • •
30 32 34 36 38 Возраст, годы
40
Рисунок 16 - Корреляция Пирсона между уровнем биомаркеров в фолликулярной жидкости и исследуемыми показателями (*р<0,05;**р<0,001)
Таким образом, в фолликулярной жидкости у пациенток с репродуктивными нарушениями идентифицирована экспрессия эНЬА-О (0,242±0,02 Ед/мл), НЬА-Е (3,18±0,55 нг/мл), НЬА-С (155,8±87,5 мкг/мл), PIBF (1951,1±955,2 нг/мл) и релаксина (6,28±3,5 пг/мл). Установлена отрицательная обратная связь между показателями уровня PIBF и релаксином (г=-0,450), антителами к тиреопероксидазе (г=-0,649) и ТТГ (г=-0,519), прямая корреляция между НЬА-С и тестостероном (г=0,960).
ГЛАВА 7 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Фундаментальной основой иммунологического распознавания плода организмом матери, начиная с предимплантационного периода, является система главного комплекса гистосовместимости человека.
С целью комплексного исследования системы НЬА I класса Е, С) у пациентов с ранними репродуктивными потерями в анамнезе было проведено проспективное пилотное исследование, включающее четыре последовательных взаимосвязанных этапа, где были обследованы 331 женщина.
Известно, что строгий контроль экспрессии человеческих лейкоцитарных антигенов I класса в хорионе и вневорсинчатом трофобласте имеет важное значение для благоприятного течения и развития беременности [10]. На первом этапе нашего исследования впервые были определены иммуногистохимические различия по экспрессии НЬА-О в хорионах при нормальных и аномальных кариотипах у пациенток с неразвивающейся беременностью. Хорошо известно, что децидуальные клетки обладают способностью активно препятствовать инвазии и развитию аномальных эмбрионов, однако каким образом запускается этот механизм отторжения до конца не изучено. При сравнении иммуногистохимической картины неразвивающейся беременности у пациенток с нормальным и аномальным кариотипом эмбрионов установлен одинаково низкий уровень экспрессии НЬА-О, что указывает на морфологическую общность в механизмах ее прерывания и характеризуется пониженной реакцией иммунной системы.
На основании анализа полученных данных нами была выдвинута гипотеза патогенеза отторжения эмбриона при неразвивающейся беременности на стации инвазии трофобласта при генетических и иммунологических причинах.
Так, согласно данной гипотезе, в случае эмбрионов с полиплоидией на фоне большого объема генетического материала срабатывает триггер, приводящий к резкому ответу на децидуализацию клеток со стороны dNK-клеток, Т-клеток, макрофагов и приводящий к избирательной суперактивации - избыток
ТМБ-а, 1Ъ-1р, -6, -10, -17, -18, эотаксина (CCL11) с секрецией НВ-БОБ, что способствует активному препятствию инвазии и росту аномальных человеческих эмбрионов за счет блокировки децидуальной и эндоваскулярной инвазии.
В случае эмбрионов с нормальным кариотипом срабатывает триггер, приводящий к отторжению «аллотрансплантата» из-за недостаточной активации иммунной системы организма матери на фоне низкой экспрессии/секреции молекул НЬА-О вневорсинчатыми клетками трофобласта (ЕУТ). Известно, что НЬА-О может взаимодействовать с рецепторами лейкоцитов, включая CD8, ЫЬЯБ1 и ЫЬКБ2 и рецептор KIR2DL4 с ёМК-клетками, Т-клетками, макрофагами, что приводит к недостаточной активации пролиферации и цитотоксической активности Т-клеток, а также к ингибированию dNK-клеток. Так, на фоне селективного ингибирования происходит недостаточная продукция ШК-у, ТЫЬ-а, ^-1р, -6, -10, -17, -18, эотаксина (СШ1) и секреции HB-EGF, что заставляет организм воспринимать эмбрион, как видоизмененные собственные клетки, давая начало «отторжению аллотрансплантата». После этого запускается каскад адаптивного иммунного ответа через клеточный и гуморальный иммунитет, что приводит к активному препятствованию инвазии трофобласта.
Физиологически экспрессия НЬА-О тканеспецифична, включая клетки трофобласта [129]. Известно, что «универсальным» рецептором для НЬА-О на клетках натуральных киллеров является KIR2DL4. Так, по данным китайских исследователей экспрессия KIR2DL4 в децидуальных (ЫК-клетках снижена у ряда пациенток с привычным невынашиванием беременности [130]. К1Я2ЭЬ4 экспрессируется на децидуальных МК-клетках, что ингибирует киллерную активность МК-клеток в отношении НЬА-О-положительных плодов. В нашем исследовании, экспрессия рецептора KIR2DL4 верифицирована в ворсинах хориона (в цитотрофобласте и синцитиотрофобласте), а также в структурах эндометрия - как в железах, строме, так и в поверхностном эпителии независимо от кариотипа, и площадь экспрессии рецептора KIR2DL4 статистически не различалась между группами. При сохранности рецепторного профиля
определяющим показателем успешного развития эмбриона является не количественные показатели экспрессии KIR2DL4 рецептора, а достаточная продукция эмбрионом белковых молекул HLA-G, которые связываются с рецепторами и в дальнейшем модулируют работу материнских dNK.
Экспрессия антигенов HLA-G клетками трофобласта имеет большое значение для защиты плода от полуаллогенной реакции материнского организма. Впервые Ellis S.A. и соавт. идентифицировали экспрессию HLA-G вневорсинчатыми клетками трофобласта [131]. Наше исследование продемонстрировало высокий уровень экспрессия HLA-G в ворсинах хориона генетически нормальных эмбрионов при прогрессирующей беременности по сравнению с неразвивающейся беременностью, что связано с адекватной реакцией в иммунной системе матери на полуаллогенный плод.
Помимо прямой экспрессии белковых молекул HLA-G в тканях хориона, защищающих плод от атаки материнским организмом, известно, что ген HLA-G обладает иммуномодулирующими свойствами [132,133], поэтому на втором этапе исследования нами были изучены 9 полиморфных аллелей гена HLA-G I класса у беременных Северо-Западного региона РФ в I триместре гестации.
Известно, что различные популяции имеют свои уникальные особенности в генетической структуре, в том числе в гене HLA-G. По данным ряда исследователей, в зависимости от вариативных последовательностей в нуклеотидной цепи кодирующей области локуса гена HLA-G наблюдается 44 различных аллели, частота которых, по-видимому, варьирует от популяции к популяции [63,134,135]. С помощью количественного анализа недавно было сообщено, что аллельные варианты гена HLA-G, такие как 01:05N, 01:06, 01:04:01, 01:01:08 и т.д., связаны с более низким уровнем продукции sHLA-G, известные как «низкосекреторные» аллели, и, таким образом, могут способствовать развитию привычного невынашивания беременности на ранних сроках [136].
Кроме того, по данным C. Ober и соавт., аллель -725*G/- ассоциирована с привычным невынашиванием беременности, что противоречит данным о том, что этот однонуклеотидный полиморфизм связан с высоким уровнем экспрессии
растворимой формы белковых продуктов экспрессии HLA-G [62]. В нашей работе статистически значимых различий в полиморфизме гена HLA-G -725*C/G между беременными с репродуктивными потерями в анамнезе и группой контроля выявлено не было.
В 2019 году был опубликован систематический метаанализ статей, посвященных связи генотипа HLA-G и привычного невынашивания беременности [137]. Авторы пришли к выводу, что среди женщин, проживающих на территории Европейского союза, с генотипом 3741 *ins/del 14 п.н. значительно чаще установлен диагноз привычного невынашивания беременности, хотя на основании ряда исследований имеются противоречивые данные, опровергающие заключение метаанализа [52,138,139]. При нашем исследовании установлено, что частота генотипа 3741*del/del 14 п.н. была определена в группе с невынашиванием беременности в 2,3 раза чаще, по сравнению с группой контроля, что в корне отличается от данных, представленных выше. Так, согласно рассчитанному коэффициенту отношения шансов, в нашем исследовании носители сочетанного генотипа 3741*del/del и -725*С/С были определены в 9 раз чаще среди пациенток с ранними репродуктивными потерями в анамнезе в отличии от группы контроля. Однако, по данным Hashemi M. и соавт. [140] в иранской популяции генотипы как по отдельности (-725*С/С и 3741*del/del), так и их сочетание были связаны с повышенным риском привычной потери плода на ранних сроках, что соответствует данным, полученным в ходе нашего исследования. Напротив, согласно данным группы польских ученых, было установлено, что риск осложнений во время беременности зависит от аллелей HLA-G*0101, HLA-G*0108 и HLA-G*0106 и не зависит от 3741*ins/del 14 п.н. полиморфизм в 3'UTR гена HLA-G [141]. Таким образом, в нашей работе различия в распределении частот аллелей и генотипов HLA-G среди исследуемых групп по сравнению с другими популяциями свидетельствует о важности продолжения исследования генетической структуры каждой конкретной популяции на больших выборках.
Доказано, что sHLA-G, HLA-E, HLA-C как напрямую, так и опосредованно через взаимодействие с dNK-клетками регулируют эндоваскулярную
и децидуальную инвазию, что в последующем защищает эмбрион от атаки материнскими клетками иммунной системы [10,37,38,39,99,105]. Все перечисленные молекулы экспрессируются не только на ворсинах хориона, но и попадают в кровеносное русло материнского организма посредством внеклеточных везикул, начиная с предимплантационного этапа, таким образом, запуская механизм иммуносенсибилизации, поэтому на следующем этапе мы исследовали уровни белковых молекул HLA I класса (G, E, C) в плазме крови у беременных для оценки их влияния на клиническое течение I триместра гестации.
Впервые данные о содержании sHLA-G в плазме и сыворотке крови, как беременных, так и небеременных были получены немецкими учеными в конце 1990-х годов [77]. В результате проведенного исследования, Hunt и соавт. установили, что уровни sHLA-G в крови повышены у беременных по сравнению с небеременными женщинами [84]. Так, были определены значимо различные уровни растворимой формы HLA-G у пациенток с привычной потерей плода по сравнению с женщинами с физиологически протекающей беременностью (у пациенток с репродуктивными потерями в анамнезе средний уровень sHLA-G составил 34,6±9,5 Ед/мл) и диапазон от 80 Ед/мл до 200 Ед/мл растворимой формы HLA-G был отмечен как благоприятный для развития беременности [85]. Zidi и соавт. в проведенном исследовании sHLA-G не обнаружили различий между группой женщин с самопроизвольным выкидышем в анамнезе и группой здоровых небеременных женщин [86], что соответствует нашим данным. Так, в нашем исследовании достоверных различий между группами пациентов с ранними репродуктивными потерями и контрольной группой получено не было, однако, это может быть связано с особенностью постановки или использованием других реактивов. Некоторые исследования выявили стабильные уровни sHLA-G на протяжении всей беременности [84,87], тогда как другие обнаружили снижение уровней sHLA-G в зависимости от срока гестации [88,89]. При измерении уровня sHLA-G в крови во время беременности остается до конца неизвестно, является ли
источник молекул эмбриональным или продуцируется за счет материнского организма.
Группой ученых из КНР в 2021 году было обнаружено, что молекулы HLA-E, экспрессия которых ограничена цитоплазмой клеток трофобласта, секретируются также во внеклеточных везикулах в крови на ранних сроках гестации [106]. Так, внеклеточные везикулы, продуцируемые клетками трофобласта и содержащие HLA-E, способствуют секреции IFN-y и VEGFa клетками dNK. Однако роль экспрессии молекул HLA-C и HLA-E в течение беременности в качестве предиктивных маркеров ее успешного развития до настоящего времени не была изучена. В нашей работе у беременных с угрожающим выкидышем I триместра установлены достоверно различные уровни HLA-C по сравнению с физиологическим течением гестации, а у пациенток с прерыванием беременности на фоне угрожающего выкидыша уровень HLA-C в 4 раза выше, по сравнению с пациентками с неразвивающейся беременностью на фоне отсутствия симптомов угрожающего выкидыша. При неразвивающейся беременности установлены высокие показатели уровней HLA-C и HLA-E.
Система HLA I класса несет комплексный вклад в репродуктивную систему на различных уровнях. Так, в фолликулярной жидкости определено более 500 различных биологических компонентов и ведутся исследования по изучению не только состава [142], но и прогностических маркеров успешной имплантации в протоколах ВРТ, поэтому на четвертом этапе пилотного проспективного исследования нами были исследованы уровни sHLA-G, HLA-E, HLA-C, PIBF и релаксина в образцах ФЖ у пациенток с репродуктивными нарушениями в программах ВРТ. Так, можно утверждать то, что фолликулярная жидкость является уникальной биосредой, которая характеризует локальный гомеостаз фолликулов. Впервые была установлена экспрессия HLA-E, HLA-C в ФЖ, что не было изучено ранее по данным мировой и отечественной литературы. Были опубликованы несколько работ со сложным дизайном, связанных с экспрессией sHLA-G в ФЖ. Японские ученые в своем исследовании показали, что измерение уровней sHLA-G в ФЖ, полученных с помощью ELISA, при выборе ооцитов были
ложноположительными. Был сделан вывод о том, что экспрессия sHLA-G в ФЖ не обладает высокой прогностической значимостью при выборе ооцитов для успешной имплантации [91]. Rizzo и соавт. (2007) сообщили, что высокий уровень экспрессии sHLA-G в ФЖ имеет значимую прогностическую ценность при отборе ооцитов для успешной имплантации [79]. Однако группой ученых не было предоставлено данных, касающихся вариации уровней sHLA-G в нескольких ФЖ от каждого пациента. Shaikly и соавт. (2008) также сообщили об обнаружении sHLA-G в ФЖ с помощью ИФА [92].
Уровень растворимой формы HLA-G в ФЖ составил 0,25±0,02 Ед/мл, что отличалось от данных японских коллег (средние значения которой соответствовали 5,5±0,52 нг/мл в группе с успешной имплантацией и 4,9±0,30 нг/мл в группе с неудачей ЭКО), которые проводили исследование по аналогичной методике, однако используя реактивы с другим методом оценки концентраций [91]. Нами впервые в исследовании был определен уровень HLA-C и HLA-E. Средние показатели уровня релаксина в ФЖ составили 6,7±3,5 пг/мл, и это, по сравнению с нашей предыдущей работой, оказалось значительно ниже (средний уровень релаксина составил 47,5±15,7 пг/мл), что может быть связано с большей выборкой и другим дизайном исследования. В нашем исследовании были включены только пациентки с трубно-перитонеальным фактором, при исключении других причин бесплодия в протоколе ВРТ. Так, гормональные или идиопатические причины бесплодия (СПЯ, НГЭ, иммунологические факторы), которые не исключались из исследования коллег, вероятно, могут оказывать опосредованное влияние на уровень релаксина в ФЖ.
Уровень PIBF в фолликулярной жидкости составил 2013,9±822,4 нг/мл, что соответствует данным, полученным польскими коллегами (1850±1610 нг/мл) [143]. В исследовании методика определения уровня экспрессии PIBF была идентичной (система ELISA), однако использовались реактивы другой фирмы (в польском исследовании Cloud-Clone Corp.: Human PIBF1 ELISA Kit SEN433Hu). Так, ФЖ является универсальной средой, которая отражает состояние общего и локального гомеостаза. Фолликулярная жидкость отражает в себе комбинацию различных
биологических веществ, и ее комплексная оценка может позволить установить качество ооцита для прогнозирования наступления беременности в протоколе ЭКО.
Таким образом, многие данные в нашей работе получены впервые, что затрудняет обсуждение, сравнение и анализ представленных показателей с результатами других ученых. Наше исследование продемонстрировало комплексный вклад антигенов ИЬЛ I класса (О, Е и С) при наступлении и пролонгировании беременности, начиная с предимплантационного периода, имплантации и первой волны инвазии трофобласта. Определяется перспективность дальнейшего изучения неклассических антигенов ИЬЛ I классов в реализации ранних репродуктивных потерь в качестве современных предиктивных маркеров пролонгирования беременности.
ВЫВОДЫ
1. Экспрессия ИЬЛ-О в вневорсинчатом хорионе при прогрессирующей беременности у генетически нормальных эмбрионов достоверно выше, по сравнению с неразвивающейся беременностью вне зависимости от кариотипа плода (прогрессирующая беременность 67,1±1,6; неразвивающаяся с нормальным кариотипом 37,7±3,3 и при аномальном кариотипе 36,4±2,9, р<0,001). При этом экспрессия ИЬЛ-О при неразвивающейся беременности как с нормальным, так и с аномальным кариотипом плода по типу полиплоидии одинаково низкая и не имеет отличий (р=0,403). Вне зависимости от кариотипов плодов площадь экспрессии рецептора KIR2DL4 не имеет значимых различий между прогрессирующей и неразвивающейся беременностью (29,6±2,1; 33,1±1,3 и 27,5±1,8 р=0,75).
2. В плазме крови идентифицированы различные уровни sHLA-G, ИЬЛ-О, ИЬЛ-Е, ИЬЛ-С в зависимости от акушерского анамнеза и клинического течения настоящей беременности. Установлены ассоциации между уровнем ИЬЛ-О и самопроизвольными выкидышами (р=0,017), уровнем ИЬЛ-Е и хроническим эндометритом (р=0,020), уровнем ИЬЛ-С и неразвивающейся беременностью, в том числе до 6 недель (р=0,026).
3. У беременных с угрожающим выкидышем I триместра установлены достоверно различные уровни ИЬЛ-С и прогестерона (239,19±34,61, 3901,4±1670,1 и 69,04±5,39) по сравнению с беременными при физиологичном течении гестации (91,89±34,61, 13116,1±1974,4 и 85,75±6,34) (р<0,05). Оценки предиктивной значимости уровня ИЬЛ-С в крови позволяет с высокой вероятностью (чувствительность 73,1%, специфичность 89,3%, точность 81,5%) прогнозировать развитие угрожающего выкидыша в I триместре беременности.
4. При неразвивающейся беременности установлено трехкратное снижение уровня ТБГ и значимое снижение показателей прогестерона в крови по сравнению с пролонгирующей беременностью (2259,50±1115,71, 15149,56±1616,29 соответственно, р<0,001 и 53,21±11,02, 93,22±6,29 соответственно, р=0,002), при
одновременно высоких показателях уровней ИЬЛ-С и ИЬЛ-Е (380,2±173,1 и 265,2±142,2, р=0,001; 5,47±2,56 и 4,15±0,82, соответственно, р=0,436).
5. Сочетанный генотип 3741*Ве1/Бе1 14п.н. и -725С/С в гене ИЬЛ-О ассоциирован с прерыванием беременности на ранних сроках гестации. Для данных пациенток характерен высокий уровень ИЬЛ-С и низкий уровень ТБГ и прогестерона (495,6±124,6 мкг/мл, 7170,0±3002,7 нг/мл и 65,4±4,9 нмоль/л соответственно) по сравнению носителями изолированных генотипов 3741Юе1/Ве1 14п.н. и -725С/С.
6. В фолликулярной жидкости у пациенток с репродуктивными нарушениями идентифицирована экспрессия sHЬA-G (0,242±0,02 Ед/мл), ИЬЛ-Е (3,18±0,55 нг/мл), ИЬЛ-С (155,8±87,5 мкг/мл), PIBF (1951,1±955,2 нг/мл) и релаксина (6,28±3,5 пг/мл). Установлена отрицательная обратная связь между показателями уровня PIBF и релаксином (г=-0,450), антителами к тиреопероксидазе (г=-0,649) и ТТГ (г=-0,519) в крови, прямая корреляция между уровнями ИЬЛ-С и тестостерона (г=0,960) в крови.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Преконцепционный подход к ведению пациентки с неразвивающейся беременностью на ранних сроках включает цитогенетическое исследование эмбриона, при котором установленный кариотип спонтанно прервавшейся беременности определяет дальнейший объем диагностических методов обследования и позволяет выделить группы высокого риска по ранним репродуктивным потерям и идиопатическому невынашиванию беременности. При установлении аномального кариотипа плода рекомендовано кариотипирование супружеской пары с дальнейшим генетическим консультированием. При установленном нормальном кариотипе плода необходимо дополнительное иммунологическое обследование (НЬА-типирование супружеской пары, определение критериальных и некритериальные антифосфолипидные антитела, функциональная активность КК-клеток) на этапе планирования следующей беременности.
2. На этапе предгравидарной подготовки рекомендовано проведение молекулярно-генетического исследование по определению двух вариантов полиморфизма в гене ИЬЛ-О (3741ёе1/ёе1 14п.н., -725С/С) в группе высокого риска у пациенток с ранними репродуктивными потерями с нормальным кариотипом плода.
3. В рамках прогнозирования угрожающего выкидыша I триместра у всех беременных при отсутствии симптомов прерывания беременности рекомендована дополнительная оценка иммунного статуса, включающая оценку уровня ИЬЛ-С в плазме крови в сроке 5-13 недель беременности, и при значении ИЬЛ-С, равном 118 мкг/мл или выше, прогнозируется угрожающий выкидыш. При выявлении высокого уровня ИЬЛ-С в плазме крови пациентке рекомендовано дополнительное обследование ТБГ и прогестерона дважды в динамике. Отсутствие нарастания показателей в динамике указывает на высокий риск по угрожающему выкидышу и спонтанному прерыванию беременности (рисунок 17).
Примеры кинического применения:
Клинический случай 1. Пациентка Н., 34 год, четвертая беременность, ЭКО (бесплодие, ассоциированное с трубно-перитонеальным фактором). В анамнезе 1 поздний выкидыш на сроке 16-17 недель, 1 срочные роды (ЭКО), 1 неразвивающаяся беременность раннего срока (ЭКО).
На момент обследования в ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» в сроке 56 недель беременности жалоб не предъявляла, беременность развивалась физиологически. У пациентки исследовали уровень ИЬА-С, и он составил 128 мкг/мл в плазме, что выше заявленного уровня (>118 мкг/мл).
По заключению было спрогнозировано развитие угрожающего самопроизвольного кидыша, что подтвердилось на сроке 6-7 недель беременности при ультразвуковой диагностике (ретрохориальная гематома). После начала сохраняющей терапии через 4 дня по данным УЗ-исследования была диагностирована неразвивающаяся беременность.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Клинический случай 2. Пациентка А., 29 лет. Беременность вторая, самостоятельная. В анамнезе 1 срочные роды, без осложнений. На момент обследования в ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» в сроке 11-12 недель беременности жалоб не предъявляла, беременность развивалась физиологически. У пациентки исследовали уровень ИЬА-С, который составил 25 мкг/мл (<118 мкг/мл).
По заключению проведенного исследования не было спрогнозировано развитие угрожающего выкидыша. Беременность закончилась срочными родами в 40-41 неделю гестации. Родился живой доношенный мальчик массой 3550 г, ростом 51 см, оценкой по шкале Апгар 9/9 баллов.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Рисунок 17 - Алгоритм подготовки и ведения пациенток с ранними репродуктивными потерями идиопатического генеза
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На современные процессы демографии оказывает роль рост частоты ранних репродуктивных потерь, которая включает как повторные потери плода в естественном цикле, так и за счет многократных неудач ВРТ, которая прослеживается во всех странах мира и в Российской Федерации [1].
Причины потерь плода на ранних сроках крайне разнообразны и в половине случаев не выяснены и подходит под понятие «идиопатического невынашивания беременности», что связано с ограниченностью методов исследования, а широкое внедрение к практику стандартных общепринятых диагностических и лечебных подходов не улучшает ситуацию в целом. Известно, что среди причин привычного выкидыша неясного генеза иммунные механизмы играют ведущую роль, при исключении генетических аномалий эмбриона [3,5]. Поэтому учеными ведется активный поиск биологических маркеров, которые могут явиться предикторами успешного наступления и пролонгирования беременности, начиная с предимплантационного периода, имплантации и первой волны инвазии трофобласта.
Роль системы НЬА I класса Е, С) в патогенезе ранних репродуктивных потерь обсуждается [38,40]. Показано, что sHLA-G, НЬА-Е, НЬА-С иммуноопосредованно регулируют активацию МК-клеток посредством взаимодействия как с ингибирующими, так и с активирующими их рецепторами [43,44]. Так, все патогенетические звенья, на которые воздействуют молекулы системы Н^А^, -Е, -С, касаются самых ранних сроков гестации -предимплантационного периода и имплантации эмбриона на стадии первой волны инвазии трофобласта, с 5-6 недель эмбриогистологического срока, когда вневорсинчатый трофобласт постепенно окружает наружные стенки децидуальных капилляров и внутриэндометриальных веточек спиральных артерий, в результате чего вокруг этих сосудов образуется цитотрофобластический щит [10,11,23,128]. Данный процесс регулирования эндоваскулярной и децидуальной инвазии
в последующем защищает эмбрион от атаки материнскими клетками иммунной системы.
Все перечисленные молекулы экспрессируются не только на ворсинах хориона, но и попадают в кровеносное русло материнского организма посредством внеклеточных везикул, начиная с предимплантационного этапа, таким образом, запуская механизм иммуносенсибилизации.
Поэтому нашей целью было определение вклада главного комплекса гистосовместимости I класса Е, С) на двух уровнях (геномики и протеомики) регулирования процессов имплантации и был разработан сложный дизайн исследования, носящий проспективный пилотный характер и включающий 4 последовательных взаимосвязанных этапа. Так, на первом этапе была проведена оценка хорионов при неразвивающейся беременности при нормальном и аномальном кариотипе плода в сравнении с прогрессирующей беременностью с анализом экспрессии Н^А^. Продукция Н^А^ представляется критическим фактором дифференцировки трофобласта и его полноценной инвазии. Известно, что напрямую экспрессия Н^А^ не связана с защитой эмбриона/плода от атаки клетками иммунной системы материнского организма, однако существует влияние на ремоделирование тканей и сосудов. Секретируемые молекулы растворимой формы Н^А^ клетками вневорсинчатого трофобласта регулируют децидуальную и эндоваскулярную инвазию [45,48,49]. При сравнении иммуногистохимической картины неразвивающейся беременности у пациенток с нормальным и аномальным кариотипом эмбрионов установлен одинаково низкий уровень экспрессии Н^А^, что указывает на морфологическую общность в механизмах ее прерывания и характеризуется пониженной реакцией иммунной системы, напротив, в то время, как высокий уровень экспрессии Н^А^ во вневорсинчатом хорионе генетически нормальных эмбрионов при пролонгирующей беременности доказывает защитные функции данных белковых молекул от цитотоксичного воздействия dNK-клеток гравидарного эндометрия.
На следующем этапе нами были изучены 9 полиморфных аллелей гена ИЬА^ I класса у беременных Северо-Западного региона РФ в I триместре
гестации. Отмечено, что частота гомозиготного генотипа 3741*del/del 14 п.н. была установлена в 2,3 раза чаще в группе с ранними репродуктивными потерями в анамнезе и пациентки данной группы, согласно рассчитанному коэффициенту отношения шансов, являлись носителями сочетанного генотипа 3741*del/del и -725*С/С в 9 раз чаще по сравнению с группой контроля. Таким образом, популяционные различия в распределении генотипов HLA-G среди исследуемых групп по сравнению с другими популяциями, свидетельствует о важности исследования генетической структуры каждой конкретной популяции.
На третьем и четвертом этапе мы оценивали роль белковых молекул экспрессии генов HLA I класса (G, E, C) в различных средах, в частности, в плазме крови и в фолликулярной жидкости.
В плазме крови установлены закономерности у изученных биомаркеров в зависимости от клинического течения настоящей беременности. Так, у беременных с угрожающим выкидышем I триместра установлены достоверно различные уровни HLA-C, HLA-E по сравнению с физиологическим течением гестации, а у пациенток с прерыванием беременности на фоне угрожающего выкидыша уровень HLA-C в 4 раза выше, по сравнению с пациентками с неразвивающейся беременностью на фоне отсутствия симптомов угрожающего выкидыша. Для оценки предиктивной значимости уровней экспрессии HLA I класса у пациенток с ранними репродуктивными потерями в отношении развития угрожающего выкидыша был использован метод бинарной логистической регрессии с ROC-анализом и среди всех проанализированных иммунологических маркеров sHLA-G, HLA-G и HLA-E показали свою низкую прогностическую значимость, в то время как у HLA-C она оказалась высокой. Определен предиктивный уровень, при значении, равном 118 мкг/мл или выше, прогнозируется угрожающий выкидыш в сроке гестации 5-13 недель беременности (чувствительность 73,1%, специфичность 89,3%, точность 81,5%). Таким образом, уровень белковых молекул HLA I класса (G, E и C) определяет течение беременности на ранних сроках и способствует благоприятной имплантации ворсин хориона во время первой волны инвазии трофобласта.
Методы вспомогательных репродуктивных технологий позволили на четвертом этапе провести пилотное исследование по изучению уровней 5 биологических компонентов ^^А^, Н^А-Е и Н^А-С, PIBF и релаксина) в фолликулярной жидкости у пациенток с репродуктивными нарушениями в программах ВРТ для подтверждения теории о комплексном вкладе Н^А I класса в репродуктивную систему. На сегодняшний день в ФЖ определено более 500 различных биологических компонентов [79,92,93,142]. В нашем исследовании в ФЖ были впервые идентифицированы sHLA-G, Н^А-Е, ^А-С, PIBF и релаксин, а также продемонстрированы корреляционные связи антителами и гормонами в крови, что позволяет отнести ее к универсальной среде, которая возможно содержит все иммунологические молекулы, определяемые в крови, и характеризует состояние общего и локального гомеостаза, таким образом, ее комплексное изучение в будущем позволит установить качество ооцита для прогнозирования наступления беременности в протоколе ЭКО.
Таким образом, результаты нашего исследования продемонстрировали, что антигенам Н^А I класса Е и С) отведена ведущая роль в наступлении и пролонгировании беременности, начиная с предимплантационного периода, имплантации и первой волны инвазии трофобласта. Молекулы Н^А I класса определяют ответ организма на ткани плода, осуществляют контроль взаимодействия всех иммунокомпетентных клеток организма, запуск и реализацию иммунного ответа при процессе имплантации и определяют адекватный ответ женского организма на эмбрион.
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
CT - цитотрофобласт
EVT - вневорсинчатый трофобласт
HLA - система человеческих лейкоцитарных антигены
MHC - главный комплекс гистосовместимости
IFN-y - интерферон-у
IL - интерлейкин
KIR2DL4 - иммуноглобулиноподобным рецептором киллерных клеток
LILRB1 и LILRB2 - Leukocyte Ig-like Receptor - лейкоцитарный Ig-подобный
рецептор
NK-клетки - Natural killer cells, естественные киллеры, натуральные киллеры
NKT-клетки - натуральные киллеры Т-клетки
аNK-клетки - спонтанно активированные NK-клетки
иаЫК-клетки - индуцированно-активированные NK-клетки
uNK-клетки - маточные NK-клетки
PIBF - прогестерон индуцированный блокирующий фактор
RIF - повторные неудачи имплантации
sHLA-G - растворимая форма HLA-G
ST - синцитиотрофобласт
T-клетки - Т-лимфоциты
TCR - рецептор Т-клеток
TNF-a - tumor necrosis factor-a, фактор некроза опухоли-a
Антитела к ТПО - антитела к тиреопероксидазе
АПК - антиген-презентирующая клетка
АФС - антифосфолипидный синдром
ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии
ИГХ - иммуногистохимия
мРНК - матричная РНК
миРНК - микроРНК
ОР - отношение рисков ОШ - отношение шансов
ПНБ - привычное невынашивание беременности
ТБГ - трофобластический Р-глобулин
ТВП - трансвагинальная пункция фолликулов
ОКК - ооцит-кумулюсных комплексов
ТТГ - тиреотропный гормон
ФЖ - фолликулярная жидкость
ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баклейчева, М.О. Роль гена HLA-G и его экспрессии в генезе привычного невынашивания беременности / М.О. Баклейчева, О.Н. Беспалова, Т.Э. Иващенко // Журнал акушерства и женских болезней. - 2022. - Т.71, № 1. - С. 101-108. DOI: https://doi.org/10.17816/JQWD76384.
2. Женское бесплодие - 2021: клинические рекомендации Минздрава РФ. URL https://moniiag.ru/wp-content/uploads/2019/07/Klinicheskie-rekomendatsii.-ZHenskoe-besplodie.pdf.
3. ESHRE Early Pregnancy Guideline Development Group. Recurrent pregnancy loss / Guideline of the European Society of Human Reproduction and Embryology, Update 2022. - Р. 12-13.
4. Привычный выкидыш: клинические рекомендации Минздрава РФ. - 2022 URL https://www.dzhmao.ru/spez/klin recom/akushGinekol/2022/KR pr vikidish.pdf
5. Carp, H. (Ed.). (2020). Recurrent Pregnancy Loss: Causes, Controversies, and Treatment (3rd ed.). London. CRC Press. - P. 30-42. https://doi.org/10.1201/9780429450303.
6. ESHRE Guideline Group on RPLESHRE guideline: recurrent pregnancy loss / R. Bender Atik, O.B. Christiansen, J. Elson [et al.] // Hum. Reprod. Open. - 2018. - N 2. - P. hoy004. doi: 10.1093/hropen/hoy004.
7. Агнаева, А.О. Ранние эмбриональные потери при HLA совместимости супругов /А.О. Агнаева, О.Н. Беспалова. - Журнал акушерства и женских болезней. - 2015. - Т.64, № 3 - С. 69-80. doi:10.17816/J0WD64369-80.
8. Хачатрян, Н.А. Аллоиммунные механизмы привычного выкидыша /Н.А. Хачатрян, Л.В. Кречетова, Н.К. Тетруашвили // Акушерство и гинекология. - 2014. - № 5. - С. 3-8.
9. https://preventmiscarriage.com/reproductive-immunology.html
10. Moffett, A. Maternal allo-recognition of the fetus / A. Moffett, O. Chazara,
F. Colucci //Fertil Steril. - 2017Jun. - Vol.107, N 6. - P. 1269-1272. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2017.05.001.
11. Brosens, I. Placental bed research: I. The placental bed: From spiral arteries remodeling to the great obstetrical syndromes / I. Brosens, P. Puttemans,
G. Benagiano// Am. J. Obstet. Gynecol. - 2019. - Vol.221. - P.437-456.
12. De Wynter, E.A. Interest of cord blood stem cells / E.A.De Wynter, N.G. Testa// Biomed. Pharmacother. - 2001. - Vol.55, N 4. - P. 195-200. doi: 10.1016/s0753-3322 (01)00049-x.
13. Medawar, B.P. Some immunological and endocrinological problems raised by the evolution of viviparity in vertebrates/ B.P. Medawar //Symp. Soc. Exp.Biol. - 1953. - Vol.7. - P. 320-338.
14. Ribatti, D. Peter Brian Medawar and the discovery of acquired immunological tolerance / D. Ribatti //Immunol Lett. - 2015. - Vol.167, N 2. - P.63-6. doi: 10.1016/j.imlet.2015.07.004.
15. Szekeres-Bartho, J. Immunology in reproduction /J. Szekeres-Bartho, U.R. Markert, M. Varla-Leftherioti // J. Reprod. Immunol. - 2015. - Vol.108. - P. 1. doi:10.1016/j.jri.2015.03.003.
16. Chong, P.J. Immunology of recurrent spontaneous abortion / P.J. Chong, W.L. Manner, W.T. Ching //The Female patient. - 1995. - Vol.20. - Р. 1-4.
17. Серова, Л.Д. Иммунологический HLA-статус у женщин с привычным невынашиванием беременности: методические рекомендации/ Л.Д. Серова. - Москва, 1998. - 18 с.
18. MHC class II compatibility in aborted fetuses and term infants of couples with recurrent spontaneous abortion /С. Ober, T. Steck, K.van der Ven [et al.] / J. Reprod. Immunol. - 1993. - Vol.25, N 3. - P. 195-207. doi: 10.1016/0165-0378(93)90063-n.
19. Steinbrook, R. The cord-blood-bank controversies / R. Steinbrook // N. Engl. J. - Med. - 2004. - Vol.351, N 22. - P.2255-2257. doi:10.1056/NEJMp048283.
20. Common HLA antigens in couples with repeated abortions / L. Komlos, R. Zamir, H. Joshua [et al.] // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1977. - Vol.7, N 3. - P.330-335. doi: 10.1016/0090-1229(77)90066-6.9.
21. A 25% error rate in serologic typing of HLA-B homozygotes / D.F. Lorentzen, K.K. Iwanaga, K.J. Meuer [et al.] // Tissue Antigens. - 1997. - Vol.50, N 4. - P.359-365. doi: 10.1111/j.1399-0039.1997.tb02888.x.
22. Association between HLA-DR1 and -DR3 antigens and unexplained repeated miscarriage / O.B. Christiansen, M. Ring, A. Rosgaard [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 1999. - Vol.5, N 3. - P.249-255. doi: 10.1093/humupd/5.3.249.
23. Role of Human Leukocyte Antigens at the Feto-Maternal Interface in Normal and Pathological Pregnancy: An Update / C. Tersigni, F. Meli, C. Neri [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - Vol.21, N 13. - P. 4756. doi: 10.3390/ijms21134756.
24. Human trophoblast invasion: New and unexpected routes and functions /G. Moser, K. Windsperger, J. Pollheimer [et al.] //Histochem. Cell Biol. - 2018. - Vol.150. - P.361-370.
25. Syncytiotrophoblast extracellular vesicles - Circulating biopsies reflecting placental health /D. Tannetta, G. Collett, M. Vatish [et al.] // Placenta. - 2017. - Vol.52. - P. 134-138.
26. Review: Immunogenetics of human placentation / P. Parham, P.J. Norman, L. Abi-Rached // Placenta. - 2012. - Vol.33, suppl.0. - P. S71-80. doi: 10.1016/j.placenta.2011.11.020.
27. Ander, S.E. Immune responses at the maternal-fetal interface / S.E. Ander, M.S. Diamond, C.B. Coyne //Sci. Immunol. - 2019. - Vol.4. - P.6114.
28. Parham, P. Molecular definition of the transplantation antigens / P. Parham // FEBS J. - 2018. - Vol.285, N 15. - P. 2728-2745. doi: 10.1111/febs.14474.
29. Atlas of genetics and cytogenetics in oncology and haematology in 2013. Huret JL, Ahmad M, Arsaban M, Bernheim A, Cigna J, Desangles F, Guignard JC, Jacquemot-Perbal MC, Labarussias M, Leberre V, Malo A, Morel-Pair C, Mossafa H, Potier JC, Texier G, Viguie F, Yau Chun Wan-Senon S, Zasadzinski A, Dessen P. Nucleic Acids Res. 2013 Jan;41(Database issue):D920-4.
30. Rock, K.L., Present Yourself! By MHC Class I and MHC Class II Molecules / K.L. Rock, E. Reits E, J. Neefjes // Trends Immunol. - 2016. - Vol.37, N 11. - P. 724-737. doi: 10.1016/j.it.2016.08.010.
31. Structure of the human MHC-I peptide-loading complex / A. Blees, D. Januliene, T. Hofmann [et al.] // Nature. - 2017. - Vol.551, N 7681. -P. 525-528. doi: 10.1038/nature24627.
32. Analysis of the gene-dense major histocompatibility complex class III region and its comparison to mouse / T. Xie, L. Rowen, B. Aguado [et al.] // Genome Res. - 2003. - Vol.13, N 12. - P. 2621-36. doi: 10.1101/gr.1736803.
33. Gene map of the extended human MHC / R. Horton, L. Wilming, V. Rand [et al.] //Nat. Rev. Genet. - 2004. - Vol.5, N 12. - P. 889-99. doi: 10.1038/nrg1489.
34. Schott, G. MHC Class III RNA Binding Proteins and Immunity /G. Schott, M.A. Garcia-Blanco // RNA Biol. - 2021. - Vol.18, N 5. - P. 640-646. doi: 10.1080/15476286.2020.1860388.
35. Burton, G.J. What is the placenta? /G.J. Burton, E. Jauniaux // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2015. - Vol.213, N 4 Suppl.4 - P. S6.e1, S6-8. doi: 10.1016/j.ajog.2015.07.050.
36. The Dual Role of HLA-C in Tolerance and Immunity at the Maternal-Fetal Interface / H. Papuchova, T.B. Meissner, Q. Li [et al.] //Front Immunol. - 2019. - Vol.10. - P. 2730. doi: 10.3389/fimmu.2019.02730.
37. Advances in the study of HLA class Ib in maternal-fetal immune tolerance / Y. Yang, W. Wang, J. Weng [et al.] // Front Immunol. - 2022. - Vol.13. -P. 976289. doi: 10.3389/fimmu.2022.976289.
38. Djurisic, S. HLA Class Ib Molecules and Immune Cells in Pregnancy and Preeclampsia / S. Djurisic, T.V. Hviid // Front Immunol. - 2014. - Vol.5. -P. 652. doi: 10.3389/fimmu.2014.00652.
39. Human leukocyte antigens: The unique expression in trophoblasts and their crosstalk with local immune cells / X.X. Lin, Y.M. Xie, S.J. Zhao [et al.] // Int. J. Biol. Sci. - 2022. - Vol.18, N 10. - P. 4043-52. doi: 10.7150/ijbs.73616.
40. Comparison of the expression of human leukocyte antigen (HLA)-G and HLA-e in women with normal pregnancy and those with recurrent miscarriage / A. Bhalla, P.R. Stone, H.S. Liddell [et al.] /Reproduction. - 2006. - Vol.131, N 3. - P. 583-9. doi: 10.1530/rep.1.00892.
41. Definitive class I human leukocyte antigen expression in gestational placentation: HLA-f, HLA-e, HLA-c, and HLA-G in extravillous trophoblast invasion on placentation, pregnancy, and parturition / R. Hackmon, L. Pinnaduwage, J. Zhang [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. - 2017. - Vol.77, N 6. - P. e12643. doi: 10.1111/aji.12643.
42. Баклейчева, М.О. Роль экспрессии HLA I класса (G, E и C) в ранних репродуктивных потерях / М.О. Баклейчева, О.Н. Беспалова, Т.Э. Иващенко // Акушерство и гинекология. - 2020. - №2 2. - С. 30-36 https://dx.doi.org/10.18565/ aig.2020.2.30-36.
43. HLA class I molecules as immune checkpoints for NK cell alloreactivity and anti-viral immunity in kidney transplantation / B. Duygu, T.I. Olieslagers, M. Groeneweg [et al.] / Front. Immunol. - 2021. - Vol.12. - P. 680480. doi:10.3389/fimmu.2021.680480.
44. A systematic review of immunotherapy in urologic cancer: evolving roles for targeting of CTLA-4, PD-1/PD-L1, and HLA-G / E.D. Carosella, G. Ploussard, J. LeMaoult [et al.] // Eur. Urol. - 2015. - Vol.68, N 2. - P. 267-79. doi:10.1016/j.eururo.2015.02.032.
45. HLA-G Orchestrates the Early Interaction of Human Trophoblasts with the Maternal Niche / S. Gregori, G. Amodio, F. Quattrone [et al.] // Front. Immunol. - 2015. - Vol.6. - P. 128. doi: 10.3389/fimmu.2015.00128.
46. Examining extended human leukocyte antigen-G and HLA-F haplotypes: the HLA-G UTR-4 haplotype is associated with shorter time to pregnancy in an infertility treatment setting when both female and male partners are carriers / L.L. Nilsson, T. Scheike, C.H. Langkilde [et al.] //Fertil. Steril. - 2020. -Vol.114, N 3. - P. 628-639. doi: 10.1016/j.fertnstert.2020.04.052.
47. HLA class Ib in pregnancy and pregnancy-related disorders /G. Persson, W.N. Melsted, L.L. Nilsson [et al.] // Immunogenetics. - 2017. - Vol.69, N 8-9. - P. 581-595. doi: 10.1007/s00251-017-0988-4.
48. Dahl, M.The many faces of human leukocyte antigen-G: relevance to the fate of pregnancy / M. Dahl, S. Djurisic, T.V. Hviid // J. Immunol. Res. - 2014. - P. 591489. doi: 10.1155/2014/591489.
49. Lynge Nilsson, L. Controlling the Immunological Crosstalk during Conception and Pregnancy: HLA-G in Reproduction / L. Lynge Nilsson, S. Djurisic, T.V. Hviid // Front. Immunol. - 2014. - Vol.5. - P. 198. doi: 10.3389/ fimmu.2014.00198.
50. Характер распределения антигенов системы HLA у супружеских пар с репродуктивными расстройствами /А.Н. Киселева, Е.В. Бутина, Н.В. Исаева [и др.] // Акушерство, гинекология и репродукция. - 2019. -Т.13, N 2. - С. 111-118.
51. Изучение связи полиморфизма гена HLA-G, внутриматочной инфекции и невынашивания беременности у женщин / Л.А. Гордеева, Е.Н. Воронина, Е.Г. Поленок [и др.] // Медицинская иммунология. - 2021. -Vol.23, N 2. - P. 369-380. https://doi.org/10.15789/1563-0625-SOR-2155.
52. HLA-G allelic variants are associated with differences in the HLA-G mRNA isoform profile and HLA-G mRNA levels / T.V. Hviid, S. Hylenius, C. R0rbye
[et al.] // Immunogenetics. - 2003. - Vol.55, N 2. - P. 63-79. doi: 10.1007/ s00251 -003-0547-z.
53. HLA-G and IL-10 in serum in relation to HLA-G genotype and polymorphisms /T.V. Hviid, R. Rizzo, O.B. Christiansen [et al.] // Immunogenetics. - 2004. -Vol.56, N 3. - P. 135-41. doi: 10.1007/s00251-004-0673-2.
54. High Amounts of Total and Extracellular Vesicle-Derived Soluble HLA-G are Associated with HLA-G 14-bp Deletion Variant in Women with Embryo Implantation Failure / S. Nardi Fda, R. Slowik, T. Michelon [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. - 2016. - Vol.75, N 6. - P. 661-71. doi: 10.1111/aji.12507.
55. Maternal HLA-C2 and 14 bp insertion in HLA-G is associated with recurrent implantation failure after in vitro fertilization treatment / L.E. Lashley, L.D. van der Westerlaken, G.W. Haasnoot[et al.] // Tissue Antigens. - 2014. - Vol.84, N 6. - P. 536-44. doi: 10.1111/tan.12452.
56. Association of the maternal 14-bp insertion/deletion polymorphism in the histocompatibility leukocyte antigen G gene with recurrent implantation failure / M. Enghelabifar, S. Allafan, J.Khayatzadeh [et al.] // Iran. J. Reprod. Med. - 2014. - Vol.12, N 9. - P. 641-6.
57. The 14 bp deletion-insertion polymorphism in the 3' UT region of the HLA-G gene influences HLA-G mRNA stability / P. Rousseau, M. Le Discorde, G. Mouillot [et al.] // Hum. Immunol. - 2003. - Vol.64, N 11. - P. 1005-10. doi: 10.1016/j.humimm.2003.08.347.
58. Association of HLA-G Null Allele Polymorphism in Women with Threatened Abortion in Comparison with Control / E. Naghavian, S. Abediankenari, Z. Rahmani [et al.] // J. Mazandaran Univ. Med. Sci. - 2014. - Vol.24. - P. 27.
59. The balance of the immune system between HLA-G and NK cells in unexplained recurrent spontaneous abortion and polymorphisms analysis / F. Arjmand,
N. Ghasemi, S.A. Mirghanizadeh [et al.] // Immunol. Res. - 2016. - Vol.64, N 3. - P. 785-90. doi: 10.1007/s12026-015-8771-9.
60. The miscarriage-associated HLA-G -725G allele influences transcription rates in JEG-3 cells / C. Ober, C. Billstrand, S. Kuldanek [et al.] // Hum. Reprod. - 2006. - Vol.21, N 7. - P. 1743-8. doi: 10.1093/humrep/del036.
61. HLA-G gene repression is reversed by demethylation / P. Moreau, G. Mouillot, P. Rousseau [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol.100, N 3. - P. 1191-6. doi: 10.1073/pnas.0337539100.
62. Variation in the HLA-G promoter region influences miscarriage rates / C. Ober, C.L. Aldrich, I. Chervoneva [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 2003. - Vol.72, N 6. - P. 1425-35. doi: 10.1086/375501.
63. Implications of the polymorphism of HLA-G on its function, regulation, evolution and disease association / E.A. Donadi, E.C. Castelli, A. Arnaiz-Villena [et al.] // Cell. Mol. Life Sci. - 2011. - Vol.68, N 3. - P. 369-95. doi: 10.1007/s00018-010-0580-7.
64. Ellis, S.A. Human trophoblast and the choriocarcinoma cell line BeWo express a truncated HLA Class I molecule /S.A. Ellis, M.S. Palmer, A.J. McMichael // J. Immunol. - 1990. - Vol.144, N 2. - P. 731-5.
65. HLA-G expression in extravillous trophoblasts is an intrinsic property of cell differentiation: a lesson learned from ectopic pregnancies / D.S. Goldman-Wohl, I. Ariel, C. Greenfield [et al.] // Mol. Hum. Reprod. - 2000. - Vol.6, N 6. - P. 535-40. doi: 10.1093/molehr/6.6.535.
66. HLA-G expression in placenta in relation to HLA-G genotype and polymorphisms / T.V. Hviid, L.G. Larsen, A.M. Hoegh [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. - 2004. - Vol.52, N 3. - P. 212-7. doi: 10.1111/j.1600-0897.2004.00208.x.
67. Human Amnion-Derived Stem Cells Have Immunosuppressive Properties on NK Cells and Monocytes / J. Li, C. Koike-Soko, J. Sugimoto [et al.] // Cell Transplant. - 2015. - Vol.24, N 10. - P. 2065-76. doi: 10.3727/096368914X685230.
68. Identification of a thymic epithelial cell subset sharing expression of the class Ib HLA-G molecule with fetal trophoblasts / L. Crisa, M.T. McMaster, J.K. Ishii [et al.] // J. Exp. Med. - 1997. - Vol.186, N 2. - P. 289-98. doi: 10.1084/jem.186.2.289.
69. Modulation of HLA-G expression in human thymic and amniotic epithelial cells / S. Lefebvre, F. Adrian, P. Moreau [et al.] // Hum. Immunol. - 2000. - Vol.61, N 11. - P. 1095-101. doi: 10.1016/s0198-8859(00)00192-0.
70. Expression of HLA-G in human cornea, an immune-privileged tissue / M. Le Discorde, P. Moreau, P. Sabatier [et al.] // Hum. Immunol. - 2003. - Vol.64, N 11. - P. 1039-44. doi: 10.1016/j.humimm.2003.08.346.
71. Immunohistochemical study of HLA-G expression in lung transplant recipients /O. Brugière, G. Thabut, M. Pretolani [et al.] // Am. J. Transplant. - 2009. -Vol.9, N 6. - P. 1427-38. doi: 10.1111/j.1600-6143.2009.02650.x.
72. The class I HLA repertoire of pancreatic islets comprises the nonclassical class Ib antigen HLA-G / V. Cirulli, J. Zalatan, M. McMaster [et al.] // Diabetes. - 2006. - Vol.55, N 5. - P. 1214-22. doi: 10.2337/db05-0731.
73. HLA-G expression is up-regulated by progesterone in mesenchymal stem cells / E. Ivanova-Todorova, M. Mourdjeva, D. Kyurkchiev [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. - 2009. - Vol.62, N 1. - P. 25-33. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00707.x.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.