Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Семенов, Дмитрий Владимирович

• Семенов, Дмитрий Владимирович
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Семенов, Дмитрий Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Моноклональные абзимы

1.2. Природные абзимы

1.2.1. Природные абзимы с протеазной активностью

1.2.2. Природные абзимы, гидролизующие нуклеиновые кислоты

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Методы

2.2.1. Очистка нуклеотидов

2.2.2. Определение концентрации нуклеотидов

2.2.3. Тестирование нуклеотид-гидролизующей активности белковых препаратов

2.2.4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза нуклеотидов, катализируемых антителами и лактоферрином

2.2.5. Анализ гомогенности белковых препаратов электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na

2.2.6. Выделение slgA и IgG из человеческого молока

2.2.7. Разделение slgA и IgG ионообменной хроматографией

2.2.8. Анализ препаратов белков встречной радиальной иммунодиффузией

2.2.9. Очистка Ig аффинной хроматографией на сорбентах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека

2.2.10. Очистка и тестирование ферментативной чистоты АТР-абзимов гель-фильтрацией в условиях разрушения иммунных комплексов

2.2.11. Анализ сродства иммуноглобулинов к АТР с помощью аффинной хроматографии на АТР-сефарозе

2.2.12. Анализ сродства АТР-абзимов к ДНК аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе

2.2.13. Получение протеолитических фрагментов IgG

2.2.14. Определение концентрации белка

2.2.15. Модификация IgG и slgA аналогами АТР

2.2.16. Тестирование АТР-гидролизующей активности белков после их 42 разделения электрофорезом в полиакриламидном геле

2.2.17. Иммуноферментный анализ взаимодействия антител с белками

Escherichia coli

2.2.18. Выделение лактоферрина из человеческого молока

2.2.19. Гель-фильтрационный анализ олигомерных форм лактоферрина

2.2.20. Аффинная модификация лактоферрина химически активными 43 аналогами АТР

2.2.21. Ограниченный протеолиз лактоферрина трипсином

2.2.22. Ограниченный протеолиз лактоферрина бромцианом

2.2.23. Флуоресцентные измерения

2.2.24. Нумерация аминокислотных остатков в составе полипептида

лактоферрина

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Нуклеотид-гидролизукпцая активность иммуноглобулинов молока человека

3.1.1. Выделение иммуноглобулинов из молока

3.1.2. Тестирование АТР-гидролизующей активности препаратов

иммуноглобулинов после электрофореза в полиакриламидном геле

3.1.3. Совыделение фосфатазы молока с иммуноглобулинами

3.1.4. Анализ иммуноглобулинов аффинной хроматографией

3.1.5. Оптимизация условий протекания реакции гидролиза АТР, катализируемой slgA- и IgG-абзимами

3.2. Локализация АТР-гидролизующего центра абзимов

3.2.1. Аффинная модификация иммуноглобулинов химически активными аналогами АТР

3.2.2. Анализ АТР-азной активности Fab- и Fe- фрагментов иммуноглобулинов

3.2.3. АТРазная активность L и Н субъединиц иммуноглобулинов

3.3. Субстратная специфичность АТР-гидролизующих абзимов

3.3.1. Субстратная специфичность абзимов молока в реакции гидролиза

нуклеотидов

3.3.2. Взаимодействие NTP-гидролизующих абзимов молока с

нуклеиновыми кислотами

3.3.3. Взаимодействие NTP-гидролизующих абзимов с белками 78 3.4. Поиск АТР-гидролизующих ферментов молока человека

3.4.1. Выделение лактоферрина из молока

3.4.2. Взаимодействие лактоферрина с АТР

3.4.3. Локализация участка связывания АТР на молекуле лактоферрина

3.4.4. Конформационные перестройки лактоферрина

3.4.5.Влияние АТР на связывание лактоферрином казеина и гепарина

3.4.6. Гидролиз нуклеозидтрифосфатов лактоферрином молока

3.4.7. Локализация АТР-гидролизующего центра лактоферрина

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений

АГ - антиген АИЗ - аутоиммунные заболевания

АК - аминокислота АПС - аналог переходного состояния

AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИП - вазоактивный интестинальный пептид

ДТТ - дитиотреитол

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил

ЛФ - лактоферрин (лактотрансферрин)

Мм - молекулярная масса

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЭИ - полиэтиленимин

СКВ - системная красная волчанка

Трис - трисгидроксиметил аминометан

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин

ЭДТА - этилендиамин тетраацетат

ЭФ - электрофорез

Ig - иммуноглобулин

NaOAc - ацетат натрия

оАТР - 2',3-диальдегидное производное АТР

RC1-ATP - у-[4-]\[-(2-хлорэтил)-М-метиламино] бензил амид АТР

SDS - додецилсульфат натрия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека»

ВВЕДЕНИЕ

Открытие каталитически активных антител (абзимов) является одним из наиболее ярких достижений в молекулярной биологии и биохимии за последнее десятилетие. Несмотря на сравнительно небольшой срок (всего около десяти лет), прошедший с момента получения первых абзимов, в настоящее время достигнут огромный прогресс в этой области исследований. На сегодняшний день получение антител (АТ) к стабильным аналогам переходного состояния (АПС) можно считать универсальным, детально разработанным подходом к генерации биокатализаторов химических превращений. Теоретические основы этого подхода были предложены Л. Полингом в 1948 г., который выявил общие черты в механизмах узнавания гаптена антителом и переходного состояния реакции ферментом. Идея о возможности получения абзимов как АТ к стабильным аналогам переходных состояний впервые была высказана Б. Дженксом [1] и экспериментально подтверждена А. Трамонтано с соавт. [2].

Своим быстрым развитием область исследования каталитических АТ обязана не только огромному практическому потенциалу абзимов. Интерес к каталитической активности АТ обусловлен также возникновением новых подходов к решению фундаментальных задач биохимического и молекулярно-биологического характера. Действительно, абзимы являются мощным инструментом в исследовании механизмов биокатализа, реализуемых белковыми структурами. Кроме того, феномен химического превращения антигена под действием АТ заставляет по новому оценить роль последних в различных иммунологических процессах. Необходимо отметить, что возможность генерации абзимов при иммунизации животных гаптенами-АПС сама по себе не свидетельствовала в пользу наличия естественной каталитической функции у АТ в организме. Достаточным основанием, позволяющим утверждать, что АТ в организме выступают не только в качестве связывающего, но и в качестве химически трансформирующего антиген начала, могло быть обнаружение каталитической активности у «природных» АТ и представление строгих доказательств того, что активность не связана с присутствием в препаратах АТ примеси ферментов. Первым подобным исследованием были работы группы С. Пола, в которых показано, что в крови людей, страдающих астмой присутствуют АТ с протеолитической активностью [3]: они расщепляют вазоактивный интестинальный пептид (ВИП). Затем были обнаружены ДНК- [4 - 6] и РНК-гидролизующие АТ [7 - 9] в крови больных СКВ.

Дальнейшие исследования показали, что абзимы образуются и при других АИЗ: ревматоидном артрите и склеродермии [10], аутоиммунном тиреоидите, полиартрите [11], рассеянном склерозе [12], а также при различных формах вирусного гепатита [13] и при СПИДе [14] - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного статуса пациента.

Недавно нами было показано также, что б^А здоровых по медицинским показаниям рожениц фосфорилируют ряд белков молока [15 - 16]; б^А и ^О-абзимы молока катализируют гидролиз ДНК и РНК [17 - 18]. Следовательно, наработка абзимов возможна и в здоровых организмах в отсутствие аутоиммунных процессов. В ходе исследования активностей АТ молока было отмечено, что пул ^О и э^А обладает не только протеинкиназной и нуклеазной активностями, но и гидролизует АТР до АБР и ортофосфата. Целью настоящей работы является исследование нуклеотид-гидролизующей активности антител человеческого молока, установление субстратной специфичности таких антител, определение роли отдельных субъединиц иммуноглобулинов в связывании и гидролизе нуклеотидов. Для выяснения роли нуклеотид-гидролизующих антител в человеческом молоке актуальным также было выявление других белков молока, способных связывать и гидролизовать АТР.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Фундаментальным и наиболее исследованным свойством иммуноглобулинов является их способность связывать самые разнообразные по структуре соединения. Современным представлениям о связи между структурой иммуноглобулинов и их функциями, специфичностью и механизмами осуществления этих функций посвящен ряд обзоров [19, 20]. В рамках данной работы необходимо, на наш взгляд, рассмотреть строение антиген-связывающих и пространственно близких к ним областей антител, в силу того, что именно они непосредственно участвуют в связывании и химической трансформации субстрата осуществляемых абзимами.

Мономерная молекула иммуноглобулина состоит из четырех субъединиц: двух идентичных "тяжелых" полипептидных цепей (Н) 51-72 кДа, и двух идентичных "легких" (Ь) цепей 20-25 кДа. Цепи соединены межцепочечными дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями (рис. 1, а). Мономеры иммуноглобулинов могут быть объединены в пентамерные комплексы с помощью дисульфидных связей с дополнительным полипептидом - .Г-цепью (^М), или в димерные комплексы дисульфидными связями с 1-цепью и секреторным компонентом (э^А), либо без секреторного компонента (1§А) [19].

Иммуноглобулины - гликопротеины с четко выраженной доменной структурой. Легкие цепи антител образуют два гомологичных домена: вариабельный - Уь; и константный - Сь Структура тяжелой цепи в зависимости от класса иммуноглобулина образована 4-мя или 5-ю гомологичными доменами, один из которых вариабельный - Ун, а остальные константные Сн1-СнЗ/4. Антигенсвязывающий активный центр формируется Уь и Ун доменами (рис. 1, а)[20].

Домен ^ образован приблизительно 107 - 110 АК. Вторичная структура доменов ^ представлена обширными областями, образующими две плоскости антипараллельных Р-складок, и так называемыми петлями, структура которых представлена элементами ос-спиралей и изгибами (поворотами) цепи (рис. 1, б) [19,20].

Такое строение характерно не только для но и для широкого крута других полипептидов, образующих суперсемейство ^-подобных белков. В число последних входят антигены главного комплекса гистосовместимости, дифференцировочные антигены лейкоцитов, ряд клеточных рецепторов и другие белки. Внутри этого

суперсемейства сходство вторичной и третичной структур полипептидов обусловлено существенной гомологией первичных последовательностей белков [20].

Между Сн1 и Сц2 доменами тяжелой цепи имеется так называемый шарнирный участок, который придает молекуле пространственную гибкость. Пептидные связи этого участка наиболее подвержены протеолизу. Так, ограниченный протеолиз папаином происходит с образованием двух идентичных Fab-фрагментов антител (от англ. "Fragment antigen binding") и одного Fc-фрагмента (от. Англ. "Fragment cristalline"). Под действием трипсина и пепсина образуется Р(аЬ)г-фрагмент, состоящий из двух Fab-фрагментов, соединенных в шарнирной области дисульфидными связями (рис. 1, а) [19].

Из рис. 1, б видно, что антиген-связывающие V-домены антител представлены относительно консервативными каркасными участками FR1 - FR4 (от англ. "Framework Region"), образующими Р-складки, и гипервариабельными, областями CDR1-CDR3 (от англ. "Complementarity-Determining Region"). Каркасные участки (FR) формируют структуру доменов цепей и вносят существенный вклад во взаимодействие тяжелых и легких цепей между собой [21]. Таким образом структурообразующая часть, на которую приходится более 80% всего Vl или Ун домена, формируется инвариантными элементами вариабельных регионов цепей. Необходимо отметить, что контактная область между Vl и Vh доменами приблизительно на 40% формируется за счет CDR-областей. Поэтому взаимное расположение V-доменов цепей различно даже для идиотипически родственных иммуноглобулинов. В частности, отмечены вариации угла взаимного поворота Vl и Vh доменов от 165° до 180° [21, 22].

В формировании антиген-связывающих активных центров в основном участвуют АК CDR областей антител, однако далеко не все АК остатки гипервариабельных областей непосредственно контактируют с лигандом. Большинство из них предназначено для придания активному центру уникальной конформации, необходимой для связывания лиганда. Аминокислотные остатки каркасных областей так же принимают участие в формировании активного центра и могут непосредственно контактировать с антигеном [19].

Недавно были установлены некоторые закономерности, касающиеся аминокислотной композиции антиген-связывающих регионов антител. Согласно данным различных авторов, остатки аспарагина и гистидина встречаются от двух до восьми раз

Место гидролиза

Место гидролиза пепсином

б)

РН1 °Ш1 ГР2 °Ш2 РПЗ С0ЯЗГП4

0 25 50 75 100

/V, оо-□—□-[О—МП—□ С108

Рис. 1. а) Схематическое строение молекулы ^01 человека с легкой цепью ж-типа. Утолщенные линии с цифрами на границах обозначают гипервариабельные участки СБШ - СЭКЗ (схема приведена согласно [23]). б) Взаимное расположение константных ИИ-РИЛ, вариабельных СОШ-СЭКЗ регионов (сверху) и элементов вторичной структуры □ - (3-складок, ¡\]\ - а-спиралей (снизу) в Уь-домене легкой цепи ж-типа человека (схема составлена по данным [19, 24]).

чаще в CDR, чем в FR областях [25]. В непосредственной близости с антигеном отмечена высокая частота встречаемости остатков тирозина и триптофана [22].

Результаты многочисленных исследований комплексов антиген-антитело, позволяют выделить три различных типа структуры антиген-связывающих активных центров иммуноглобулина:

1. Полости (cavity) характерны для активных центров, связывающих низкомолекулярные лиганды (гаптены);

2. Выемки или бороздки (groove) образуют пептид-, ДНК-, полисахарид-связывающие активные центры;

3. Плоские (planar) области формируются активными центрами антител, взаимодействующих с белками [21].

Отмечены исключения из приведенной закономерности строения антиген связывающих активных центров: так активный центр антител к низкомолекулярным гаптенам может иметь форму бороздки, характерной для пептид- и ДНК- связывающих центров AT [26].

Активный центр антител является конформационно-лабильной структурой. Взаимодействие антител с лигандами может сопровождаться конформационными перестройками, которые варьируют от небольших сдвигов боковых цепей АК остатков до глобальных перестроек в третичной и четвертичной структуре Fab-фрагментов молекулы иммуноглобулина [21, 22, 27]. В тех случаях, когда в качестве лиганда выступает антиген, антитела меняют конформацию не существенно. То есть взаимодействие с антигеном в большинстве случаев соответствует механизму "ключа и замка". Однако при взаимодействии с соединениями структурно родственными антигену (перекрестная реактивность антител) или с соединениями существенно отличающимися от антигена (полиреактивность антител) структурная комплементарность может быть достигнута благодаря конформационным изменениям как антител, так и лиганда [28]. Таким образом, взаимодействие антител с лигандами может характеризоваться элементами механизмов индуцированного соответствия и деформации субстрата, характерных для взаимодействия ферментов с субстратами [29].

В образовании комплексов АТ-АГ важную роль играют молекулы воды. Так показано, что в случае комплексов AT с белковыми антигенами молекулы воды могут располагаться не только на периферии, но и в области непосредственно образующей плоский контакт АТ-АГ [30]. Молекулы воды обнаружены в областях контактов с

антигеном антипептидных, анти-ДНК и антигаптеновых антител. При этом, молекулы воды могут выступать в качестве необходимого элемента, формирующего структурную комплементарность АТ и АГ [31].

Приведенные выше сведения о конформационной лабильности активного центра антител, возможности изменений в структуре антигена под действием антител, а также данные о доступности антигена для молекул воды позволяют говорить о элементах функционального сходства антител и ферментов.

Впервые гипотеза о возможности проявления антителами каталитических свойств была высказана Б. Дженксом [1, 32] в 1969 г. Гипотеза базировалась, с одной стороны, на концепции ферментативного катализа о комплементарности фермента переходному состоянию реакции, и, с другой - на возможности получения антител к широкому кругу стабильных аналогов переходных состояний. Таким образом Б. Дженкс предположил, что с помощью иммунизации гаптенами - стабильными аналогами переходных состояний (АПС) химических реакции могут быть получены антитела, катализирующие эти реакции. Как будет показано ниже, гипотеза Б. Дженкса послужила отправной точкой для получения антител-катализаторов (абзимов) самых различных химических превращений. Детальные исследования показали, что катализ реакций моноклональными антителами может осуществляться не только благодаря комплементарности переходному состоянию (по механизму "ключ к замку"), но и благодаря реализации элементов механизма индуцированного соответствия, кислотно-основного катализа и даже ковалентного катализа.

Открытие пептид- и НК-гидролизующих абзимов в крови пациентов с заболеваниями, протекающими с нарушением иммунного статуса, показало возможность спонтанной индукции каталитической активности у антител. Полученных на сегодняшний день данных о строении активных центров и о механизмах катализа пока недостаточно для обсуждения структурно-функциональных основ каталитических свойств природных абзимов. Однако высказано несколько предположений, которые объясняют ферментоподобные свойства иммуноглобулинов. Одно из них базируется на возможности деформации субстрата (структурно подобного антигену) при связывании с антителами [33]. Другое предположение основывается на возможности формирования функциональных элементов ферментов на основе антиген-связывающих активных центров антител [34].

Моноклональные абзимы

Описание взаимодействий рецептора и лиганда, фермента и субстрата строится на ряде общих принципов, основополагающим из которых является принцип структурного соответствия, или комплементарности биополимера лиганду, фермента - переходному состоянию реакции. Собственно концепция комплементарности фермента переходному состоянию введена Дж. Б. С. Холдейном и развита Л. Полингом в середине нашего столетия [35]. Опираясь на эту концепцию, Б. Дженкс в 1969 году, предложил использовать связывающий потенциал иммуноглобулинов для генерации биокатализаторов [1]. Первые экспериментальные попытки получить абзимы были предприняты Столляром Б.Д. и Разо В. [36], которые применили для иммунизации кроликов конъюгат Тч[-(5-фосфопиридоксил)-3'-амино-Ь-тирозина с БСА. Однако полученные к гаптену поликлональные антитела слабо ускоряли реакцию переаминирования Ь-тирозина [37]. И только с использованием гибрид омной технологии для отбора клонов антител-продуцирующих В-лимфоцитов А. Трамонтано с соавт. [2] удалось получить моноклональные абзимы с эстеразной активностью. Для получения таких абзимов, а в последствии и абзимов с амидазной активностью, применяли гаптены, которые отличаются от субстратов тем, что разрываемая в ходе реакции сложноэфирная или амидная связь субстрата (С-0 или С-1Ч) заменена в них на связи Р-0 или Р-Ы фосфонатной или фосфонамидной групп [38]. Подобные замены часто применяются при конструировании АПС. Они основываются на том, что процесс гидролиза сложного эфира или г

К н

амида протекает через образование

о

частично

заряженного

тетраэдрического переходного

переходное остояние

состояния атома углерода с

участием молекулы воды, как показано на рис. 2 .

Пространственное

¿' V 6 0-1*1

iii

аналог переходного остояния

расположение лигандов при карбонильном атоме углерода в переходном состоянии II

Рис. 2. Гидролиз сложного эфира (I), катализируемый АТ к аналогу переходного состояния реакции (III)

соответствует таковому для заместителей при тетраэдрическом атоме фосфора в фосфонатной группе III. Поэтому антитела, обладающие высоким сродством к гаптену-АПС - III, при взаимодействии с субстратом снижают энергию активации реакции

В частности, для иммунизации авторы работы [2] применили ряд АПС, из которых наилучшие результаты были получены с соединением IV (рис. 3).

Моноклональные антитела 6D4 к гаптену IV гидролизовали сложный эфир V с Кт = 1.9*10"6 М и £cat=2.7*10"2 с"1, при этом достигалось ускорение реакции в 960 раз по сравнению с некаталитическим гидролизом этого эфира. С несколько меньшей скоростью протекал гидролиз эфира VI (kcat = 8*10"3 с^^б.г.Ю^М).

В этой работе, которая стала отправной точкой в получении и исследовании каталитической функции антител, впервые были предложены критерии сравнительной эффективности и специфичности катализа реакций абзимами. Критерий - kcJKm общепринят для оценки эффективности действия фермента, он служит мерой энергии кинетического барьера ферментативной реакции и ограничен величиной 109 M'V , когда лимитирующей стадией реакции является встречная диффузия фермента и субстрата. Другой критерий - это отношение константы скорости реакции превращения фермент-субстратного комплекса в продукт (kcat) к константе скорости превращения субстрата в продукт (£uncat) в отсутствие катализатора. Максимальное значение kcJkmüüi для исследованных к настоящему времени ферментативных реакций достигает Ю10 [35].

Следующим шагом на пути генерации высокоэффективных биокатализаторов путем иммунизации стабильными АПС стала работа А. Трамонтано с соавт. [39]. Была

гидролиза сложного эфира I [2].

о

R = NHCOCF3 R'= NHCOCH3

Рис. 3. Гаптен (IV) и субстраты (V, VI) моноклональных абзимов 6D4 [2].

сделана попытка улучшения каталитических свойств абзимов путем отбора моноклональных антител с наибольшим сродством к АПС IV R'= NHCO(CH2)4CON(COCH2)2 (рис. 3). Таким образом были получены моноклональные IgG - продукты клонов 50D8 и 57G4, которые катализировали гидролиз эфира V R'=NHCOCH3 (рис. 3). При этом активность AT 50D8 была сравнима с таковой для известных эстераз. Так, в частности, значение ксщ для антител 50D8 было всего в 10 - 100 раз ниже, чем у эстеразы печени свиньи в реакции гидролиза эфира, сходного с эфиром V, в 102 - 104 раз больше, чем значение kcat для химотрипсина в реакции гидролиза синтетических субстратов, и практически укладывалось в диапазон значений kcat для большинства других эстераз. Кроме того, параметр kcat/kmcat для абзимов 50D8 составлял ~106.

Существенное улучшение каталитических свойств 50D8 по сравнению с абзимами 6D4 (см. выше) достигнуто благодаря тому, что AT обладали высоким сродством (Ki = 50 нМ) к АПС, в то время как сродство к субстрату было достаточно низким: Кт реакции гидролиза эфира V составляло всего 1.5 мМ.

Для генерации AT, катализирующих гидролиз амидов, авторами работы [38] предложено использование фосфонамидного АПС IX (рис. 4). После иммунизации конъюгатом этого гаптена с БСА получены моноклональные AT, из которых 44 клона В-лимфоцитов были предварительно отобраны с использованием иммуноферментного

VII

он

анализа, основанного на связывании абзимами АПС. Способностью гидролизовать амид VII (рис. 4) обладали продукты только одного клона - 43С9. Катализ в этом

VIII

случае характеризовался

н

следующими значениями параметров: kcat/ku„c!lt= 1.5 • 105, kcJKm=2.24 М"1 с"1.

IX

Рис. 4. Реакции гидролиза амида VII и сложного эфира VII, катализируемые абзимами 43С9 к АПС IX

Удивительной особенностью абзимов 43С9 оказалась их

способность катализировать

помимо гидролиза и-нитроанилидного производного VII еще и гидролиз и-нитрофенильного производного VIII. Причем гидролиз сложного эфира VIII

отличался особенно высоким для абзимов значением отношения кса11Кт= 1.5*105 М"1 с"1 и

i

одним из самых высоких значений kcat= 40 с" . Необходимо отметить, что абзимы 43 С9 с наилучшими эстеразными свойствами получали и отбирали с помощью АПС IX реакции гидролиза амида VII (рис. 4) [38]. Это свидетельствует, скорее всего, о непредсказуемости иммунной системы в генерации каталитически активных АТ.

Детальное исследование механизма гидролиза смешанных эфиров АТ 43С9 проведено С. Дж. Бенковиком с соавт. [40]. Было показано, что катализ реакции, приведенной на рис. 4 - многостадийный процесс (рис. 5), который в общих чертах напоминает гидролиз пептидов сериновыми протеазами.

он-

Ab + S^=^ Ab*l—* Ab*P¡ *Ej=5 - Ab*^ + £ Ab + I? + f

АБС Д E

Рис. 5. Механизм гидролиза сложных эфиров и амидов АТ 43 С9 [40].

Согласно данным кинетического анализа, абзимы образовывали ковалентный интермедиат (Ab*Pi) с карбоксильной группой продукта (рис. 5). То есть гидролиз, как и в случае сериновых протеаз, протекал по механизму «пинг-понг». Ускорение реакции АТ 43 С9 осуществляли не только благодаря стабилизации переходного состояния, но и благодаря реализации элементов кислотно-основного катализа. Результаты исследования кинетики гидролиза свидетельствовали также о существенных конформационных перестройках активного центра абзимов в ходе связывания субстрата, следовательно, 43 С9 подобно ферментам использовали механизм индуцированного соответствия.

Сходство антигенных детерминант аналога переходного состояния и субстрата, необходимое для генерации абзимов, приводило к тому, что продукт реакции обладал высоким сродством к активному центру абзимов. Поэтому лимитирующей стадией реакции гидролиза был процесс диссоциации комплекса фермент-продукт (стадия Е, рис. 5).

Дальнейшие исследования активного центра антител семейства 43 С9 опирались на данные о структуре комплекса абзим-аналог переходного состояния, которые были

получены с помощью компьютерного моделирования, а также на данные анализа активности генно-инженерных конструкций на основе мРНК гибридомы 43 С9. Для получения таких конструкций кДНК копии суммарной мРНК гибридомы 43 С9 были встроены в фаг лямбда, после чего были отобраны фаги, экспрессирующие тяжелые или легкие цепи Ig [41]. Индивидуальные фаговые библиотеки тяжелых и легких цепей скрещивали и получали комбинированные библиотеки. Из них отбирали те библиотеки, которые экспрессировали высокоаффинные AT к гаптену - аналогу переходного состояния. Полученные таким образом генно-инженерные фаговые антитела проявляли каталитические свойства, сходные с продуктами исходной гибридомы 43С9. Сравнение последовательностей ДНК-копии мРНК антител 43С9 и ДНК, кодирующей генно-инженерные фаг-экспрессируемые антитела, показало их полную идентичность. На основе фаговой конструкции генов абзимов были получены генно-инженерные антитела, в которых вариабельные части тяжелой и легкой цепей соединены полиглициновым спейсером - NPN43C9 антитела (так называемые одно-цепочечные антитела) [42].

Авторами работы [43] показано, что остаток аргинина легкой цепи - Arg L 96 комплекса NPN43C9 с АПС IX расположен вблизи атома фосфора фосфонамидной группы АПС (рис. 6). Было высказано предположение о решающей роли этого остатка в

катализе благодаря тому, что именно он осуществляет стабилизацию переходного состояния. Предположение было подтверждено после получения мутантных одно-цепочечных антител, в которых остаток Arg L 96 заменен на глутамин [43]. Мутантные антитела обладали способностью связывать субстрат, но были полностью лишены каталитической активности. Работы по сайт-направленному мутагенезу выявили также роль в катализе остатка гистидина His L 91 (рис. 6), имидазольная группа которого,

Фосфонамидный Тетраздрическии аналог субстрата атом фосфора л

Туг L 32

Туг Н 95

His Н 35

His L 91

Arg L96

Рис. 6. Фрагмент активного центра АТ 43 С9 как предполагают авторы [44], является в комплексе с аналогом переходного состояния IX.

нуклеофилом, образующим интермедиат с

ацильной группой субстрата.

О существовании ацильного интермедиата Ab*P¡ (рис. 5) свидетельствовали косвенные данные кинетических экспериментов [40], однако прямое доказательство было получено недавно масс-спектрометрическим методом [45]. Показано, что при насыщающих концентрациях субстрата приблизительно 8% антител 43С9 находятся в ковалентном комплексе с продуктом. Мутантные His L 91 - Gin "одно-цепочечные" антитела обладают способностью связывать субстрат и не образуют с ним промежуточного соединения. Участие имидазольной группы гистидина в образовании ацильного интермедиата антителами 43 С9 авторы отмечают как беспрецедентное для действия аналогичных протеаз.

Недавно опубликованные данные рентгеноструктурного анализа абзимов 17Е8 с эстеразной и амидазной активностями в комплексе с АПС показали, что, как, и в случае 43 С9 антител, гидролиз протекает с образованием промежуточного ацильного интермедиата [46]. При этом в качестве акцептора ацильной группы субстрата выступал остаток серина антител 17Е8. Нуклеофильность остатка серина в активном центре была существенно увеличена благодаря взаимодействию с остатками гистидина и аспарагина. Механизм, реализуемый 17Е8, близок к механизму действия сериновых протеаз настолько, что сохранял даже каталитическую триаду Ser-His-Asp, характерную для активного центра трипсина [46].

АПС-гаптены абзимов 43С9 и 17Е8 не включали в себя структурные элементы, которые целенаправленно могли бы привести к реализации такого сложного механизма катализа. Возможно, что генерация иммунной системой абзимов, реализующих практически весь набор элементов катализа, присущий природным ферментам с аналогичной активностью, является вполне закономерным процессом. Ответ на вопрос о том, почему абзимы с наилучшими кинетическими характеристиками «организуют» процесс катализа подобно ферментам, может помочь в решении многих проблем, связанных с исследованиями как моноклональных, так и природных каталитических AT.

Разрешению интригующего вопроса о реализации различных механизмов катализа семейством абзимов, полученных с помощью иммунизации одним АПС посвящен ряд работ [47, 48]. Как было отмечено выше, при получении "одно-цепочечных" антител из фаговых библиотек легких цепей и библиотек тяжелых цепей авторы работы [41] скрещиванием получали библиотеки, экспонирующие на поверхности фага функциональные антитела. Аналогичным образом с использованием

гена тяжелой цепи абзимов 43 С9 и фаговой библиотеки статистического набора генов легких цепей были получены несколько конструкций "одно-цепочечных" антител с эстеразной активностью [48]. Анализ ДНК легких цепей этого семейства абзимов с 43С9 подобной активностью выявил высокую степень гомологии внутри этого семейства и 9698% гомологию с легкой цепью антитела 43С9. При этом все легкие цепи абзимов демонстрировали консервативность остатков Arg L 96 и His L 91 (рис. 6) и их ближайшего аминокислотного окружения. Параметры kcat/kmc.dt у всех членов семейства таких антител были приблизительно одинаковы. Эти данные свидетельствуют о том, что в ходе формирования иммунного ответа к гаптену - АПС, предельное сродство и наилучшие каталитические характеристики достигаются абзимами семейства 43С9. Дальнейшее улучшение каталитических свойств AT требует изменения в консервативных участках вариабельных регионов. Такие изменения можно производить в настоящее время только с помощью генно-инженерных конструкций, но не с помощью иммунизации и гибридомной технологии. Последняя работа Г. П. Миллера с соавт. [48] устанавливает границы применения метода иммунизации гаптенами-АПС для получения ферментов с заранее заданными свойствами. Таким образом, структура активного центра антитела является первым "шаблоном", с получением которого открывается возможность дальнейшего конструирования еще более эффективных и специфических биокатализаторов.

Детальное исследование механизма катализа гидролиза эфиров и амидов абзимами выявило ряд закономерностей, характерных и для других реакций, катализируемых моноклональными AT к АПС.

Прежде всего необходимо отметить влияние структурного сходства АПС субстрата и продуктов реакции. Высокое сродство к переходному состоянию в случае моноклональных антител не может быть обеспечено только изменяющимися в ходе превращения группами субстрата. В энергетику связывания существенный вклад вносят неизменные группы субстрата [49]. Поэтому лимитирующей стадией каталитического превращения, зачастую, является диссоциация фермент-субстратного комплекса. Может иметь место также и ингибирование продуктом реакции. Генно-инженерные абзимы могут быть лишены такого недостатка [50].

Наибольший вклад в связывание субстрата AT семейства 43С9 вносят остатки аминокислот тяжелой цепи, а аминокислоты легкой цепи участвуют в генерации и стабилизации переходного состояния реакции, то есть непосредственно осуществляют

катализ [43]. Удивительно, что аминокислотные остатки легкой цепи большинства исследованных природных и гибридомных абзимов играют решающую роль в катализе. Фундаментальные исследования взаимодействия антител с антигеном свидетельствуют о том, что тяжелая цепь вносит больший вклад в узнавание антигена, чем легкая цепь [51]. Видимо в этом и заключается больший "каталитический потенциал" легкой субъединицы олигомера I». Возможно, что структура легкой цепи обеспечивает реализацию того или иного механизма катализа.

Работы, касающиеся получения и исследования свойств абзимов с эстеразной и амидазной активностью, являются лишь небольшой частью огромного числа публикаций, посвященных методам генерации каталитических антител (для обзора см. [52, 53]). Некоторые примеры гаптенов, использованных для иммунизации, и субстраты катализируемых моноклональными абзимами реакций, приведены в конце главы в таблице 1. Из данных таблицы видно, что дизайн гаптена позволяет получать антитела, которые осуществляют стереоспецифический катализ реакций, субстраты и продукты которых не имеют аналогов в живой природе; а кроме того катализ реакций, механизм которых не реализуется природными биокатализаторами. В настоящее время описано более 100 реакций, катализируемых моноклональными абзимами, полученными как иммунизацией различными гаптенами - стабильными АПС, так и с помощью других подходов.

Один из принципиально новых подходов к конструированию гаптенов для получения абзимов с заданными каталитическими свойствами был предложен авторами работы [54]. Была сделана попытка генерировать в активном центре антител набор аминокислотных остатков, характерных для активных центров ферментов, путем введения в гаптен специфических иммуногенных групп.

Для того, чтобы окружение гапетна в активном центре абзима содержало аминокислотные остатки с карбоксильной группой (глутамат или аспаратат), в состав нитрофенильного производного X (рис. 7) было введено положительно заряженное при физиологических значениях рН четвертичное аммониевое основание. Авторы [54] предполагали, что карбоксильная группа в активном центре абзима будет выступать в качестве промежуточного акцептора протона (такова роль остатков глутамата и аспартата в гидрофобном окружении активных центров некоторых ферментов). Полученные к гаптену X моноклональные абзимы 43Б4-303 действительно катализировали реакцию (3-элиминирования, приведенную на рис. 7. Отношение кса1/Кт

для этой реакции было найдено равным 1.38*102 М_1с"'. При этом достигалось более чем 1000-кратное ускорение реакции по сравнению с некаталитическим процессом. Исследования кинетических закономерностей превращения, а также ингибирование реакции в результате специфической ковалентной модификации карбоксильных остатков антител свидетельствовали об участии в катализе АК остатков глутамата либо аспаратата, что практически подтверждало эффективность предложенного подхода к выбору гаптена. Необходимо отметить, что в данном случае гаптен не был подобен АПС, более того, он имел противоположный переходному состоянию заряд. Предложенный авторами [54] подход в дальнейшем был адаптирован для получения антител, способных катализировать реакцию дегидратации [55,] и реакцию цис-транс изомеризации [56] (таблица 1).

О

Г^чг МН г он

Р о

X

ОМ

XI

Рис. 7. АПС X и реакция (3-элиминирования катализируемая АТ43Б4-ЗБЗ [54].

При конструировании аналогов переходного состояния реакции Дильса - Альдера авторы работы [57] опирались на достаточно хорошо изученный механизм реакции с участием М-замещенного малеимида XIV (рис. 8). Моноклональные АТ 1Е9 связывали аналог переходного состояния XII с Кд =1.3*10"6 М и ускоряли двусубстратную реакцию циклизации приблизительно в 10 раз (рис. 8). В дальнейшем этот подход был использован для получения абзимов, катализирующих стереоспецифическую конденсацию по Дильсу-Альдеру [58] (таблица 1). Приведенные примеры катализа реакций, механизм которых не реализуется в живой природе, наиболее ярко демонстрирует возможности использования гаптена-АПС для наработки абзимов с заданной ферментативной активностью.

XIII XIV

Рис. 9. Аналог переходного состояния XII и реакция Дильса Альдера, катализируемая антителами 1Е9

Наибольшее ускорение реакции в присутствии абзимов (kcal/kunoat = 109) показано с использованием оригинального подхода, предложенного в работе [59]. Для генерации антител, катализирующих конденсацию ацетона с альдегидом XVI (рис. 9), в качестве гаптена использовали дикетон XV, предполагая, что активные центры AT с наивысшим сродством к XV будут содержать реакционоспособный остаток лизина. Взаимодействие гаптена с антителом будет протекать с образованием основания Шиффа. Этот подход, направленный на генерацию гаптеном его ковалентного взаимодействия с AT, авторы назвали "реактивной иммунизацией" (reactive immunization [60]). Предполагалось также, что s-аминогруппа лизина в реакции с альдегидом XVI будет образовывать ковалентный интермедиат, который после связывания второго субстрата - енолята превратится в продукт реакции XVII.

После иммунизации мыши и наработки первичных клонов В-лимфоцитов были получены комбинированные фаговые библиотеки генов тяжелых и легких цепей

XVI XVII

Рис. 8. Гаптен XV, использованный [59] для генерации АТ, катализирующих превращение альдегида XVI в альдоль XVII

иммуноглобулинов [61]. Фаги отбирали по способности ковалентно связываться с иммобилизованным гаптеном XV. Таким образом были получены фаги, которые экспонировали антитела, содержащие в активном центре лизин. Описанный подход, сочетающий элементы гибридомной технологии и фагового дисплея, оказался чрезвычайно эффективным и позволил получить абзимы-альдолазы, демонстрирующие рекордное ускорение и 95 %-ую стереоселективность катализируемой реакции.

Как видно из приведенных выше примеров, современные подходы к получению абзимов сочетают в себе не только дизайн гаптена и наработку моноклональных антител к нему, но и получение генно-инженерных конструкций на основе АТ, а в некоторых случаях еще и рациональное изменение активного центра путем сайт-направленного мутагенеза. Большинство достижений в этой области запатентовано авторами приведенных выше работ. Необходимо отметить также, что именно практическая ценность биокатализаторов является основной движущей силой исследований моноклональных абзимов. Вместе с тем в этих исследованиях остается не решенным фундаментальный вопрос о возможности наличия естественной каталитической функции у «природных» антител.

Как сообщают авторы обзора [62], первые попытки выявить собственную каталитическую активность антител были проделаны еще в середине 60-х годов. Л. И.Слоубин [63] в 1966 г. показал ускорение гидролиза и-нитрофенилацетата в присутствии антител. Кульберг А. Я. с соавт. [64] в 1968 открыл способность ^ кролика к аутопротеолизу при кислом значении рН. Однако, наиболее убедительные и обширные данные, подтверждающие наличие у иммуноглобулинов естественной способности не только связывать, но и химически трансформировать лиганды были получены в течение последнего десятилетия.

Таблица 1

Гаптены, использованные для иммунизации, субстраты и продукты реакций, катализируемых моноклональными абзимами.

Гаптен Субстрат Продукты AT условия реакции Km, MKM kcat c-1 Äcat/A"m M-l • с"1 Литература

Гидролиз карбонатов О | 0 1 OtN—\\)/—^ О — | С02 | + НО^—'f МОРС 167 pH 7.0, ЗОоС 208 0.007 3.36 [65]

но но ос О OjN-^^-OH co2 МеОН 7K16.2 pH 7.5, ЗОоС 3330 5.2*10-3 1.56 [66]

Гидролиз сложных зфиров --V хОН соон О OjN-^^-OH НО^Ч НО- л yv 4 NH О CNJ1S7 pH 8.0 110 0.040 364 [67]

,—ч о jm соон о 20G9 pH 8.8, 25oC 300 0.152 500 [68]

/—\ о. он соон 0 но^ KD2-260 pH 6.0,20oC 4.9 0.042 8600 [69]

&VJÖI V-WHO II X=(CH2)3NHC0CH2C02H ч "уос"> СУ" "Ш 3B9 pH 7.7 490 0.0018 3.74 [70]

Гидролиз амидов H2N-v _ 0 Gly Phe ßAla HO;C -Gty СООН Gly Phe NH2 ßAla НОгС-GIy 28F11 pH 6.5, 37oC - 6-10-4 - [71]

Гидролиз зфиров ОСНз „фл О ОН 0 ОСНз ОСНз НзСО-d у--0^ о ф i ОСНз ОСНз 6 НзСО—^ \--OH лф H0 ^ ОСНз OH 37C4 pH 6.0 31 1.6-10-3 54 [72]

О О N r/ r, rl= СНз, r2=Ar ч™] НО HO 14D9 pH 5.7,37oC 340 9.5-10-5 0.279 [73]

Таблица 1 (продолжение).

Гаптен Субстрат Продукты АТ условия реакции мкМ ксаЬ с-1 М-1 • с-1 Литература

Гидролиз кеталея Н02С1Ш-| СУ Д — .он 0 N11 ^^ .О Д ^ .он о гчн ноО он Д .он 1409 рН 5.7, 20оС 100 7.5-10-5 0.78 [56]

Гидролиз зпоксидов 1ЧН Н02С "1 0 Д .он 0 гш ^^ о^Т / о мн'4^0" но.^, но Д ^ ^он 0 NH ^^ 14Б9 рН 5.6, 240С 25 2.9.10-5 1.0 [74]

С02И Г^ О но2с-^)—^ но но,с—6 Ъ—' о—' 2609 рНб.б 356 1.5-10-3 43 [75]

Трансзтерификация . п ? 1 [-он СНзСНО и и„Л„ 2Н6-1 2200 0.067 30 [76]

Образование амида со2н ' ТОо Р О, о, р Ш -0 он XX. 17С8 рН 8.0,23оС 2200 3.8-10-4 0.173 [77]

Из омеризация 11 н\ Ц1 02М ^^ N02 со,н 1М02 о 0, N N0, DY.il 0-4 рН 7.5 220 0.08 364 [56]

Восстановление "Хи5 он "ХХХр о 1411 о А5 рН 5.0 1240 0.0017 14 [78]

„сгг IX? 37В39.3 рН 5.0 52 0.0016 32 [79]

Таблица 1 (продолжение).

Гаптен Субстрат Продукты AT условия реакции мкМ fccat с-1 ^cat^m M-l • с-1 Литература

Декарбоксиляроваыие S03H L-, SO3H 1—rNHX NH ^^-OH co2 21D8 pH 8.0,20oC 168 0.28 1667 [80]

Реакция Дильса-Алвдера A Ш> То 0*4 Г но2с---J O^NH 0 рл 7D4 pH 7.4,370C Диен Диенофил 960 1700 5.7.10-5 0.06 0.034 [58]

4x1 HN N но2с^1 O^^NH 0 ^^COjH 22С8 pH 7.4, 370С Диен Диенофил 700 7500 5.3.10-5 0.076 0.007 [58]

0 0 0 <А О 0 0 оА 0 0 0 НИ Диенофил 8300 0.055 6.6 [81]

Перегруппировка Кляйзена H Н02с oj <ÇAVCO2H О 0 со2н он C02H p OH 1F7 рН 7.5,14оС 51 1.2« 10-3 24 [82]

Дегидратация Н02с—v 02N-/ - н-f H20 20A2F6 рН 7.0,370С 1100 5.8.10-6 5.3.10-3 [55]

Взаимодействие порфирина с металлом M

y-NH N \ \\ Н3С. Ё Г~ N N'A \_NH N-аУ \ Î н. J / N N—\ / N' 4N"\ 7G12-A10-G1-A12 Zn++ Си++ 49 50 8.6.10-6 1.4*10-6 0.17 0.028 [83]

СГ^ОН О ОН O^OH О ОН O^OH СГЧ)Н

1.2. ПРИРОДНЫЕ АБЗИМЫ 1.2.1. Природные абзимы с протеазной активностью

Новое направление в области каталитически активных антител появилось благодаря обнаружению С. Полом с соавт. [3] в сыворотке больных астмой иммуноглобулинов класса О, способных гидролизовать кишечный вазоактивный пептид (ВИП). Вопрос о том, является ли наблюдаемая каталитическая активность препаратов иммуноглобулинов собственным свойством АТ, или активность проявляют ферменты, совыделяющиеся с антителами, - является ключевым в начальной стадии исследования каталитической функции природных абзимов. В настоящее время в литературе отсутствуют публикации, которые были бы специально посвящены этому вопросу. Вместе с тем в пионерских работах по природным абзимам [4 - 18] решение именно этого вопроса является отправной точкой исследования. Пол с соавт. [3] приводил обширный список аргументов в пользу того, что активность является собственным свойством ВИП-гидролизующих АТ крови больных астмой. Наиболее существенные из них таковы:

1. Препараты каталитических АТ, полученные с помощью аффинной хроматографии, были, согласно окраске белков серебром, электрофоретически чистыми.

2. ВИП-гидролизующей активностью обладали фракции БаЬ фрагментов ^О после их аффинной очистки.

3. Каталитическая активность полностью сорбировалась вместе с белковым материалом на протеин А-сефарозу и элюировалась с сорбента буфером с низким значеним рН.

4. Иммунопреципитация антител с помощью анти-^О сыворотки приводила к потере 75% ВИП-гидролизующей активности препаратов.

5. Препараты АТ только двух из шести сывороток больных астмой проявляли активность, в то время как АТ из сыворотки крови здоровых доноров не проявляли ее совсем.

6. Дополнительная очистка иммуноглобулинов гель-фильтрацией в условиях разрушения нековалентных белок-белковых комплексов не приводила к потере каталитической активности АТ.

7. Значение Кт (38 нМ) реакции гидролиза ВИП в присутствии АТ свидетельствовало о высоком сродстве активного центра к субстрату, сравнимым с таковым для комплексов антиген - антитело.

8. Сайт-специфичность протеолиза ВИП (см. ниже) отличалась от специфичности гидролиза этого пептида известными протеазами.

Предложенные С. Полом с соавт. [3] подходы к доказательству наличия у антител собственной каталитической активности в последующих работах по природным (поликлональным) каталитически активным АТ были существенно дополнены (см. ниже).

Позже в крови больных тиреоидитом Хашимото (аутоиммунный тиреоидит) были обнаружены АТ, способные протеолизовать тиреоглобулин [84]. Предполагалось, что АТ к гормонам, возникающие в результате аутоиммунного процесса, могут способствовать выведению гормона из кровотока путем ферментативной деградации. Поэтому абзимы с протеазной активностью должны были проявлять высокую субстратную специфичность. Авторы также полагали, что возникающие при аутоиммунном процессе антитела-протеазы благодаря своей высокой сайт-специфичности могут быть полезны как модель для создания "протеин-рестриктаз". В связи с этим было показано, что расщепление антителами пептидной связи в ВИП происходит специфически между остатками С^б-Мп (рис. 10). Детальное исследование субстратной специфичности таких абзимов показало, что ВИП-гидролизующие антитела в общем наборе поликлональных АТ к пептиду узнают специфические фрагменты в составе пептида и не реагируют перекрестно с пептидами, проявляющими частичную гомологию с ВИП [85]. Пептидные фрагменты ВИП: К15-К21, Тц-Мп, Ь|з-К2о не расщепляются антителами и являются малоэффективными ингибиторами протеолиза самого пептида. Однако пептидный фрагмент Угг-]^ является эффективным конкурентным ингибитором гидролиза и связывания ВИП поликлональными антителами. Таким образом авторами работы [86] было установлено, что именно эта часть молекулы ответственна за узнавание ВИП природными абзимами. Следует отметить, что расщепляемая пептидная связь удалена от антигенной детерминанты на пять аминокислотных остатков (рис. 10). Такое расположение сайта расщепления исключает реализацию механизма деформации субстрата в катализе гидролиза ВИП.

I

Н, Эз А4 Р6 Т7 й8 м9 V,, ^2Ц3^К15О16М17А18У19

22

"А_▲

антигенная детерминанта

1

1 - пептидные связи, расщепляемые антителами из крови больных астмой

2 - пептидные связи, расщепляемые моноклональными абзимами

Рис. 10. Сайт-специфичность гидролиза ВИП поликлоналными и моноклональными абзимами

В работах по определению субстратной специфичности ВИП-гидролизующих АТ было отмечено, что в случае ряда доноров гидролизу могут подвергаться любые пептидные связи между остатками Ям-Угг, Ту-Б« [87]. Это наблюдение впервые позволило предположить поликлональный характер природных ВИП-абзимов [88]. Кроме того было отмечено, что легкая цепь ^О обладает способностью гидролизовать ВИП без участия тяжелой цепи. Эффективность гидролиза ВИП легкой цепью была значительно выше, чем у интактной молекулы ^О, однако сайт-специфичность оставалась прежней [89].

Было проведено исследование возможности появления абзимов с ВИП-гидролизующей активностью в крови животных после иммунизации конъюгатом ВИП с белком-носителем [90]. Продукты части гибридом, отобранных по сродству к ВИП и его фрагментам, оказались способными специфически гидролизовать пептидные связи ВИП между К20-К21 и Кц-У22 (рис. 10.). Действительно, факт генерации антиген-гидролизующих антител в результате прямой иммунизации антигеном может иметь важное значение. Он выявляет некоторые стороны процесса возникновения абзим-продуцирующих клонов В-лимфоцитов. С другой стороны, возможность получения моноклональных пептид-гидролизующих абзимов открыла новые перспективы в понимании механизма протеолиза, катализируемого антителами.

Моноклональные ВИП-абзимы проявляли каталитические свойства, близкие к таковым природных поликлональных абзимов из сыворотки крови больных астмой. Они узнавали в составе пептида ту же антигенную детерминанту. Как и в случае природных абзимов, легкая цепь моноклональных AT катализировала гидролиз ВИП с более высокой эффективностью, чем IgG-олигомер. Однако моноклональные абзимы отличались сайт-специфичностью протеолиза субстрата [91]. Как было отмечено выше, они расщепляли пептидные связи, образованные аминокислотами К20-К21 и K21-Y22. Собственно данные по специфичности гидролиза (которая напоминает специфичность сериновых протеаз), а также работы по клонированию гена легкой цепи ВИП-гидролизующих моноклональных AT мыши с последующим сиквенированием последовательности и молекулярным моделированием показали, что активный центр таких абзимов сходен с активным центром субтилизина [92]. Этот вывод был подтвержден экспериментами по сайт-направленному мутагенезу CDR-региона легкой цепи AT [93]. Было показано, что аминокислотные остатки абзима: Ser 27, His 93 и Glu 28 расположены вблизи расщепляемой пептидной связи субстрата. Эти остатки не участвуют в связывании субстрата, а их взаимное расположение аналогично таковому для серина Ser 221 и гистидина His 64 в фермент-субстратных комплексах субтилизина А. Замена любого из перечисленных остатков аминокислот на аланин приводила к потере каталитической активности мутантной формы легкой цепи. Однако способность связывать субстрат при таких заменах сохранялась. Это дало возможность предположить, что механизм АТ-зависимого гидролиза ВИП подобен механизму, реализуемому сериновыми протеазами. Данные по инактивации AT специфическим ингибитором сериновых протеаз - диизопропилфторфосфатом, подтверждали это предположение [90].

Совокупность данных о механизме гидролиза эфиров и амидов моноклональными абзимами 43С9 [40 - 45] и 17Е8 [46] свидетельтвует о реализации практически всех элементов белкового катализа, свойственного сериновым протеазам. В связи с этим кажется весьма вероятным, что природные абзимы с протеазной активностью также подобны ферментам. Однако, достоин удивления тот факт, что в случае каждого отдельного абзима с протеазными либо амидазными свойствами реализуется уникальный протеазо-подобный активный центр на основе вариабельных регионов антител. Наиболее возможной причиной возникновения ВИП-гидролизующих абзимов авторы работы [90] называют аутоиммунный процесс, в результате которого появляются

антитела к антигенным детерминантам самого вазоактивного пептида. То есть, как и в случае "неприродных" абзимов 43С9 в гаптен не заложена структурная информация для иммунной системы, которая приводила бы к реализации наблюдаемых каталитических свойств. Все эти данные позволяют высказать предположение, что, по крайней мере, в случае протеазных и амидазных абзимов, уже преиммунный репертуар антител несет примитивные структурные элементы каталитических центров, которые в процессе формирования иммуного ответа могут превратиться в полноценные активные центры.

1.2.2. Природные абзимы, гидролизующие нуклеиновые кислоты

Шустер А.М. с соавт. впервые показали наличие ДНК-гидролизующих аутоантител в крови больных системной красной волчанкой, ревматоидным артиритом и системной склеродермой [4]. При доказательстве того, что ДНКазная активность является собственным свойством АТ, авторы опирались на аргументы близкие, приведенным выше, а именно: активность сохранялась после всех стадий очистки АТ, включавшей осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию на протеин А-сефарозе, и ДНК-целлюлозе, а также повторную гель-фильтрацию. Кроме того, активность проявляли фракции только Р(аЬ), но не Рс фрагментов, полученных протеолизом Сайт-специфичность гидролиза ДНК

антителами существенно отличалась от специфичности ДНКазы I и от специфичности гидролиза ДНК суммарными нуклеазами сыворотки крови человека [4].

Детальное исследование субстратной специфичности поликлональных антител из сыворотки крови больных СКВ в реакции гидролиза нуклеиновых кислот, проведенное авторами работ [7] позволило установить, что антитела в 10 - 15 раз эффективнее гидролизуют РНК чем ДНК. При этом было показано, что РНК-гидролизующая активность также является собственным свойством антител, а не совыделяющихся с ними ферментов крови [7, 8].

Гидролиз поликлональными АТ из сыворотки крови больных СКВ и РНК, и ДНК мог быть объяснен тем, что ДНК- и РНК-гидролизующие антитела (в общем наборе иммуноглобулинов) являются продуктами различных клонов В-лимфоцитов и имеют различные по структуре активные центры. Однако приведенные в работе [8] данные о способности моноклональных анти-ДНК антител мышей линии гидролизовать как ДНК, так и РНК указывают в пользу того, что ДНКазные активные центры иммуноглобулинов обладают широкой субстратной специфичностью по отношению к НК и способны осуществлять гидролиз и рибо, и дезоксирибо нуклеиновых кислот. Необходимо отметить, что эти данные не исключают возможности наличия в общем наборе поликлональных антител сыворотки больных СКВ абзимов с преимущественно ДНКазной либо с РНКазной активностью.

Проведенные исследования показали, что НК-гидролизующие абзимы образуются и при других заболеваниях - аутоиммунном тиреоидите [12], полиартрите [9],

рассеянном склерозе [13], а также при различных формах (А, В, С и дельта) вирусного гепатита [13] и при СПИДе [14] - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного статуса. В то же время, АТ из крови больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-ти перстной кишки и некоторыми онкологическими заболеваниями (раки матки, молочной железы, желудочно-кишечного тракта) не проявляли ни ДНК-, ни РНК-гидролизующей активности [12].

Имеющиеся на сегодняшний день данные указывают на многообразие НК-гидролизующих активных центров, которые могут быть сформированы на основе активного центра антител. В работе [8] было показано, что ^М сыворотки крови больных СКВ обладают большей удельной РНКазной активностью, чем и ^М

абзимы проявляют существенные различия в сиквенс-специфичности гидролиза РНК. Проведенные с использованием препаратов ^М-абзимов исследования зависимости начальных скоростей реакции от рН реакционной смеси, а также кинетические и термодинамические параметры гидролиза РНК свидетельствовали о поликлональности РНК-абзимов. 1§М, гидролизующие г(рА)1з, проявляли высокую активность в широком диапазоне рН - от 6.2 до 8.8. Тем не менее, для одного из препаратов были ярко выражены максимумы при рН около 7.8 и 8.7, в другом препарате преобладали ^М, гидролизующие г(рА)1з с оптимумом рН в интервале 8.2 - 9.0, а третий не имел выраженных оптимумов.

Многообразие НК-гидролизующих активных центров антител выражается в различной сиквенс-специфичности гидролиза РНК и ДНК, проявляемой препаратами абзимов, выделенных из сывороток крови пациентов с различными патологиями [9]. Кроме того, это многообразие выражается еще и в широте физико-химических свойств проявляемых НК абзимами. В частности, в работе [94] отмечено, что ДНК-гидролизующие антитела пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями характеризуются различными значениями изоэлектрических точек, и различным сродством как к аффинным сорбентам (ДНК-сефакрил, голубая сефароза), так и ионообменным сорбентам (ДЭАЭ-сефароза, МопоБ, МопоС)).

Наблюдаемое многообразие свойств активных центров НК-гидролизующих антител, с одной стороны, указывает на поли/олиго-клональность НК абзимов, а с другой стороны, является основанием для предположения о широте спектра механизмов гидролиза нуклеиновых кислот антителами. Вместе с тем, приведенные выше данные позволяют говорить и о множестве путей генерации НК-абзимов. Авторами работ [95,

96] была сделана попытка показать, что ДНК-гидролизующие абзимы, возникающие при системных патологиях, являются антиидиотипическими AT к топоизомеразе-I человека, другими словами, активный центр таких абзимов является прообразом каталитического центра антигена-фермента (топоизомеразы I) и сохраняет некоторые функции исходного фермента. Действительно, в работе [97] было показано сходство антигенных детерминант ДНК-гидролизующих антител сыворотки больных системной красной волчанкой с антигенными детерминантами топоизомеразы I человека.

Авторы работы [98] на основании данных о взаимодействии анти-ДНК антител с ДНКазой I предположили, что ДНК-абзимы могут иметь активный центр, копирующий активный центр последней. Недавно были получены антиидиотипические антитела к ДНКазе I, которые обладали нуклеазной активностью [99]. Кроме того, Г. Гололобов с соавт. [100] показали, что ДНКазной активностью обладают антитела больных некоторыми типами лейкемии и синдромом иммунодефицита. ДНК-абзимы таких больных связывали преимущественно неидентифицированный белок с Мм 35 кДа, входящий в состав нуклеопротеида пролиферирующих лимфоцитов. Было высказано предположение о том, что ДНКазная активность AT является результатом аутоиммунизации комплексами нуклеиновых кислот с белками-продуктами гибели лимфоидных клеток. С. Пол с соавт. [90] ранее показал, что ВИП-гидролизующие AT могут возникать в результате иммунизации животных непосредственно пептидом. Поэтому последнее предположение Г. Гололобова с соавт. кажется вполне оправданным и может отражать один из путей генерации аутоабзимов.

Особый интерес представляют исследования моноклональных AT мышей, линии NZBxNZW, у которых развитие аутоиммунных процессов имеет много общего с СКВ человека. Авторами работы [101] показано, что моноклональные ауто-АТ BV04-01 мышей линии NZBxNZW подобно антителам больных СКВ гидролизуют ДНК. Ранее [102, 103] были получены рентгеноструктурные данные комплексов таких антител с олигонуклеотидом d(pT)3 (рис. 11). Было показано, что в связывании фосфатной группы лиганда (PI) участвуют остатки Ser Н 52а и Asn Н 53, образующие водородные связи. Межнуклеозидная фосфатная группа - Р2 образует ионную связь с аргинином Arg Н 52. Ароматические группы триптофана Trp Н 100а и тирозина Туг L 32 принимают участие в стэкинг-взаимодействии с тиминовым основанием Т2. Наиболее интересным является расположение имидазольного кольца гистидина His L 27d, который, как бы

Ser H 52a

/Р1

Asn H 53 f Arg H 52

T1 t\ w

i

'^КЯЫгЯвКУ' i P2

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Семенов, Дмитрий Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что поликлональные slgA и IgG антитела (AT) молока человека обладают нуклеотид-гидролизующей активностью. Каталитические свойства AT сохранялись после ряда хроматографических стадий очистки, обработки иммуноглобулинов кислыми буферами и хаотропными агентами, разрушающими нековалентые взаимодействия белков; электрофореза в диссоциирующих условиях и получения Fab-фрагментов AT с помощью их гидролиза протеазами. Показано, что в формирование активных центров AT вовлечены как тяжелые, так и легкие цепи олигомеров.

2. Показано, что slgA и IgG антитела проявляют широкую субстратную специфичность в реакции гидролиза нуклеотидов. Имея определенное сходство с описанными ранее фосфатазами и АТРазами, поликлональные нуклеотид-гидролизующие абзимы в то же время существенно отличались от этих ферментов по ряду термодинамических и кинетических характеристик, а также субстратной специфичности. Способность нуклеотид-гидролизующих абзимов взаимодействовать с ДНК, нуклеотидами и различными белками, включая белки Е. coli, может указывать на полиреактивные свойства таких AT, а также на возможность их индукции под действием бактериальных компонентов кишечной флоры.

3. Впервые показано, что лактоферрин (ЛФ) молока человека связывает и гидролизует АТР. Согласно данным исследования АТР-гидролизующей активности белков молока после их разделения электрофорезом в денатурирующем условиях, ЛФ является основным белком молока с такой гидролитической функцией. Показано, что аффинная модификация ЛФ 2',3'-диальдегидным производным АТР (оАТР) приводит к образованию основания Шиффа с одним из остатков лизина, С-концевого домена белка. Стехиометрия ковалентной модификации составляет 1 моль оАТР на моль белка. АТР-связывающий участок ЛФ не совпадает и не перекрывается с описанными ранее полианион-связывающим и антибактериальным кластерами ЛФ. Взаимодействие ЛФ с АТР приводит к диссоциации его олигомерных форм до мономеров и изменению характера его взаимодействия с полисахаридами, нуклеиновыми кислотами к некоторыми белками, что может указывать на регуляторную функцию АТР-связывающего центра ЛФ.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молоко содержит исключительно большой набор биологически активных компонентов, способных обеспечить рост и развитие млекопитающих на ранних стадиях постнатального онтогенеза. Биохимические и молекулярно биологические свойства компонентов молока в настоящее время являются предметом интенсивных исследований. Это обусловлено тем, что компоненты молока проявляют антивирусные и бактерицидные свойства [131, 146], обладают гормональной активностью [168], способны активировать апоптоз раковых клеток [169], а также важны для создания пассивного иммунитета у новорожденных.

Последние исследования в этой области в основном сосредоточены на лигандсвязывающих и ферментативных свойствах, проявляемых компонентами молока. Изучение механизмов взаимодействия компонентов молока с белками, нуклеиновыми кислотами и низкомолекулярными лигандами ведет к пониманию различных аспектов функционирования иммунной системы, процессов транспорта и метаболизма соединений в организме.

В настоящей работе впервые проведено исследование взаимодействия антител и ЛФ молока человека с нуклеотидами. Получены результаты, свидетельствующие о наличии у этих белков собственной нуклеотид-гидролизующей активности. При этом показано, что активность антител человеческого молока носит неспецифический фосфатазный характер, в то время как детали процесса взаимодействия ЛФ с АТР указывают на специфические АТР-связывающие и АТР-гидролизующие свойства этого белка. Принимая во внимание бактерицидную и антивирусную активность ЛФ и ^ (как показано ранее [170, 171], э^А проявляют эту активность кооперативно с ЛФ) можно предположить, что описанные в данной работе свойства являются важными для функционирования секреторной иммунной системы человека в целом.

Опубликованные ранее результаты исследования протеинкиназной [15, 16] и НК-гидролизующей [17, 18] активностей АТ человеческого молока в совокупности с нашими данными позволяют говорить о реализации секреторной иммунной системой каталитического потенциала активных центров АТ в отсутствие аутоиммунной патологии, а также в отсутствие иммунизации аналогами переходных состояний химических превращений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Семенов, Дмитрий Владимирович, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jencks W. Catalysis in chemistry and Enzymology N. Y. McGraw-Hill. 1969.

2. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A. Catalytic antibodies. Science. 1986. V. 234. P. 1566-1570.

3. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science. 1989. V. 244. P. 1158-1162.

4. Shuster A. M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smirnov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science. 1992. V. 256. P. 665-667.

5. Gololobov G.V., Chernova E.A., Schourov D.V., Smirnov I.V., Kudelina I.A., and Gabibov A.G. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: application of the flow linear dichroism technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 254-257.

6. Щуров Д.В., Макаревич О.И., Лопаева O.A., Бунева В.Н., Невинский Г.А., Габибов

A.Г. Взаимодействие ДНК-гидролизующих аутоантител с низкомолекулярными субстратами. Доклады РАН. 1994. Т. 337. С. 407-410.

7. Бунева В.Н., Андриевская О.А., Романникова И.В., Гололобов Г.В., Ядав Р.П., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Взаимодействие каталитически активных антител с олигорибонуклеотидами. Мол. биол. 1994. V. 28. С. 738-743.

8. Андриевская О.А., Канышкова Т.Г., Ямковой В.И., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Моноклональные антитела к ДНК лучше гидролизуют РНК, чем ДНК. Доклады РАН. 1997.V. 355. С. 401-403.

9. Власов А.В., Андриевская О.А., Канышкова Т.Г., Барановский А.Г., Наумов В.А., Бреусов А.А., Жьеже Р., Бунева В.Н., Невинский Г.А. РНК-гидролизующие антитела из крови больных системной красной волчанкой. Биохимия. 1997. V. 62. С. 556-562.

10. Шустер A.M., Гололобов Г.В., Квашук О.А., Габибов А.Г. Антитиидиотипические и природные каталитически активные антитела. Молекуляр. биология. 1991. Т. 25. С. 593602.

11. Власов А.В., Барановский А.Г., Канышкова Т. Г., Принц А. В., Забара В. Г., Наумов

\

B. А., Бреусов А. А., Жьеже Р., Бунева В. Н., Невинский Г. А. Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом и аутоиммунным тиреоидитом. Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 1117-1127.

12. Барановский А.Г., Канышкова Т.Г., Могильницкий А.С., Наумов В.А., Бунева В.Н., Бойко А.Н., Фаворова О.О., Невинский Г.А. Поликлональные антитела из крови больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют РНК и ДНК. Молекуляр. биология. 1997. Т. 63. С. 1171-1172.

13. Барановский А.Г., Матюшин В.Г., Власов А.В., Забара В. Г., Наумов В.А., Жьеже Р., Бунева В. Н., Невинский Г. А. ДНК- и РНК- гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита. Биохимия. 1997. Т. 62. С. 1598-1607.

14. Gololobov G.V., Mikhalap, S.Y., Starov A.V., Gabibov A.G. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Proceedings of the l-st\ International Conference "Catalytic antibodies and Antibody Engineering". M. 1993. P. 25.

15. Кит Ю.Я., Семенов Д.В., Невинский Г.А. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 519-526.

16. Kit Yu.Ya., Semenov D.V., Nevinsky G.A. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. Bioch. Mol. Biol. Internat.. 1996. V. 39. P. 521-527.

17. Канышкова Т. Г., Семенов Д. В., Власов А.В., Хлиманков Д.Ю., Барановский А.Г., Шипицын М. В., Ямковой В.И., Бунева В. Н., Невинский Г. А. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из молока человека и их возможная биологическая роль. Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 1086-1096.

18. Kanyshkova Т. G., Semenov D. V., Khlimankov D. Yu., Buneva V.N., Nevinsky G.A. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. FEBS Lett.. 1997. V. 416. P. 23-27.

19. Hasemann C.A., Capra J.D. Immunoglobulins: Structure and function. Fundamental immunology. Ed. Paul W. N.Y. Raven press. 1989. P. 209-204.

20. Alzari P.M., Lascombe M.B., Polyak R.J. Three-dimentional structure of antibodies. Annu. Rev. Immunol. 1988. V. 6. P.555-801.

21. Webster D.M., Henry A.H., Rees A.R. Antibody-antigen interactions. Curr. Opinion in Structural Biology. 1994. V. 4. P. 123-129.

22. Davies D.R., Cohen G.H. Interactions of protein antigens with antibodies. PNAS. USA. 1996. V. 93. P. 7-12.

23. Деев C.M. Иммуноглобулины. Белки и пептиды.Наука. М. Т. 1. С.319-329.

24. Epp O., Lattman E.E., Schiffer M., Huber R., Palm W. The molecular structure of a dimer composed of the variable portions of the Bence-Jones protein REI refined at 2.0-A resolution. Biochem. 1975. V. 14. P. 4943-4952.

25. Padlan E.A. On the nature of antibody combining sites: unusual structural features that may confer on these sites an enhanced capacity for binding ligands. Proteins. 1990. V. 7. P. 112-124.

26. Golinelli-Pimpaneau B., Gigant B., Bizebard T., Navaza J., Saludjian P., Zemel R., Tawfik D.S., Eshhar Z., Green B.S., Knossow M. Crystal structure of a catalytic antibody Fab with esterase-like activity. Structure. 1994. V. 2. P. 175-183.

27. Smith T.J., Chase E.S., Schmidt T.J., Olson N.H., Baker T.S. Neutralizing antibody to human rhinovirus 14 penetrates the receptor-binding canyon. Nature. 1996. V. 383. P. 350-354.

28. Braden B.C., Fields B.A., Ysern X., Goldbaum F.A., Dall'Acqua W., Schwarz F.P., Poljak R.J., Mariuzza R.A. Crystal structure of the complex of the variable domain of antibody D1.3 and turkey egg white lysozyme: a novel conformational change in antibody CDR-L3 selects for antigen. J. Mol. Biol. 1996. V. 257 P. 889-894.

29. Braden B.C., Dall'Acqua W., Eisenstein E., Fields B.A., Goldbaum F.A., Malchiodi E.L., Mariuzza R.A., Schwarz F.P., Ysern X., Poljak R.J. Protein motion and lock and key complementarity in antigen-antibody reactions. Pharm. Acta. Helv. 1995. V. 69. P. 225-230.

30. Bhat T.N., Bentley G.A., Boulot G., Greene M.I., Tello D., DallAcqua W., Souchon H., Schwarz F.P., Mariuzza R.A., Poljak R.J. Bound water molecules and conformational stabilization help mediate an antigen-antibody association. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 1089-1093.

31. Braden B.C., Fields B.A., Poljak R.J. Conservation of water molecules in an antibody-antigen interaction. J. Mol. Recognit. 1995. V. 8. P. 317-325

32. Lerner R.A., Tramontano A. Catalytic antibodies. Sci. Am. 1988. V. 258 P. 58-60.

33. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.I., Schourov D.V., Chernova E.A., Yadav R.P. DNA-hydrolyzing autoantibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47. P. 293-302.

34. Tramontano A. Immune recognition, antigen design, and catalytic antibody production. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V.47. P. 257-273.

35. Fersht A. Enzyme Structure and Mechanism. Freeman W.H. and Company, eds. Reeding and San Francisco. 1977.

36. Raso V., Stollar B.D. The antibody-enzyme analogy. Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry. 1975. V. 14. P. 591-599.

37. Raso V., Stollar B.D. The antibody-enzyme analogy. Characterization of antibodies to phosphopyridoxyltyrosine derivatives. Biochemistry. 1975. V. 14. P.584-591.

38. Janda K.D., Schloeder D., Benkovic S.J., Lerner R.A., Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science. 1988. V. 241. P. 1188-1191.

39. Tramontane A., Janda K.D., Lerner R.A. Chemical reactivity at an antibody binding site elicited by mechanistic design of a synthetic antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 6736-6740.

40. Benkovic S.J., Adams J.A., Borders C.L. Jr., Janda K.D., Lerner R.A., The enzymic nature of antibody catalysis: development of multistep kinetic processing. Science. 1990 V. 250 P. 1135-1139.

41. Sastry L., Mubaraki M., Janda K.D., Benkovic S.J., Lerner R.A., Screening combinatorial antibody libraries for catalytic acyl transfer reactions. Ciba Found. Symp. 1991. V. 159. P. 145151.

42. Gibbs R.A., Posner B.A., Filpula D.R., Dodd S.W., Finkelman M.A., Lee T.K., Wroble M., Whitlow M., Benkovic S.J., Construction and characterization of a single-chain catalytic antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 4001-4004.

43. Roberts V.A., Stewart J., Benkovic S.J, Getzoff E.D., Catalytic antibody model and mutagenesis implicate arginine in transition-state stabilization. J. Mol. Biol. 1994. V. 235. P. 1098-1116.

44. Stewart J.D., Roberts Y.A., Thomas N.R., Getzoff E.D., Benkovic S.J., Site-directed mutagenesis of a catalytic antibody: an arginine and a histidine residue play key roles Biochemistry. 1994. V. 33. P. 1994-2003.

45. Krebs J.F., Siuzdak G., Dyson H.J., Stewart J.D., Benkovic S.J., Detection of a catalytic antibody species acylated at the active site by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 1995. V. 34. P. 720-723.

46. Zhou G. W., Guo J., Huang W., Fletterick R.J., Scanlan T.S. Crystal structure of a catalytic antibody with a serine protease active site. Science. 1994. V. 265. P. 1059-1064.

47. Guo J., Huang W., Zhou G.W., Fletterick R.J., Scanlan T.S., Mechanistically different catalytic antibodies obtained from immunization with a single transition-state analog. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Y. 92. P.1694-1698.

48. Miller G.P., Posner B.A., Benkovic S.J., Expanding the 43C9 class of catalytic antibodies using a chain-shuffling approach. Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5. P. 581-590.

49. Stewart J.D., Benkovic S.J., Recent developments in catalytic antibodies. Int. Rev. Immunol. 1993.V. 10. P. 229-240.

50. Stewart J.D., Krebs J.F., Siuzdak G., Berdis A.J., Smithrud D.B., Benkovic S.J. Dissection of an antibody-catalyzed reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 7404-7409.

51. Иммуноглобулины под ред Лейтмена Г. Гуда P.M. Мир. 1981.

52. Schultz P.G., Lerner R.A. From molecular diversity to catalysis: lessons from the immune system. Science. 1995. V. 269. P. 1835-1842.

53. Thomas N.R. Hapten design for the Generation of catalytic antibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47. P. 345-372.

54. Shokat K.M., Leumann C.J., Sugasawara R., Schultz P.G. A new strategy for the generation of catalytic antibodies. Nature. 1989. V. 338 P. 269-271.

55. Yoon S. S., Oei Y., Sweet E., Schultz P. G. An Antibody-Catalyzed [2,3]-EIimination Reaction. J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 11686-11687.

56. Lerner R.A, Benkovic S.J., Schultz P.G. At the crossroads of chemistry and immunology: catalytic antibodies. Science. 1991. V. 252. P. 659-667.

57. Na J., Houk K. N., Hilvert D. Transition State of the Base-Promoted Ring-Opening of Isoxazoles. Theoretical Prediction of Catalytic Functionalities and Design of Haptens for Antibody Production. J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 6462-6471.

58. Gouverneur V.E., Houk K.N., de Pascual-Teresa В., Beno В., Janda K.D., Lerner R. Control of the exo and endo pathways of the Diels-Alder reaction by antibody catalysis. Science. 1993. V. 262 P. 204-208.

59. Wagner J., Lerner R.A., Barbas C.F. 3rd, Efficient aldolase catalytic antibodies that use the enamine mechanism of natural enzymes. Science. 1995. V. 270 P. 1797-1800.

60. Barbas C.F. 3rd, Heine A., Zhong G., Hoffmann Т., Gramatikova S., Bjornestedt R., List В., Anderson J., Enrico A. S., Wilson I. A., Lerner R.A., Immune versus natural selection: antibody aldolases with enzymic rates but broader scope. Science. 1997. V. 278. P. 2085-2092.

61. Janda K.D., Lo L.C., Lo C.H.L., Sim M.M., Wang R., Wong C.H., Lerner R. Chemical selection for catalysis in combinatorial antibody libraries. Science. 1997. V. 275. P. 945-948.

62. Генералов И.И., Новиков Д.К. Успехи современной биологии. 1997. Т. 118. С. 178193.

63. Slobin I.I. Preparation and some properties of antibodies with specificity toward p-nitrophenyl esters. Biochemistry. 1966. V. 5. P.665.

64. Кульберг А.Я., Дочева Ю.В., Тарханова И.А., Спивак В.А. О протеолитической активности в препаратах очищенного иммуноглобулина G и антител кролика. Биохимия. 1969. Т. 34. С. 1178.

65. Pollack S.J., Jacobs J.W., Schultz P.G. Selective chemical catalysis by an antibody. Science. 1986. V. 234. P. 1570-1573.

66. Shokat K.M., Schultz P.G. Catalytic antibodies. Annu. Rev. Immunol. 1990. V. 8. P. 335363.

67. Tawfik D.S., Zemel R.R., Arad-Yellin R, Green B.S., Eshhar Z. Simple method for selecting catalytic monoclonal antibodies that exhibit turnover and specificity. Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9916-9921.

68. Martin M.T., Napper A.D., Schultz P.G., Rees A.R. Mechanistic studies of a tyrosine-dependent catalytic antibody. Biochemistry. 1991. V. 30. P. 9757-9761.

69. Ohkubo K, Urata Y., Seri K.I., Ishida H., Sagava Т., Nakashima Т., Imagava I. Chem. Lett. 1993. V. XX. P. 1075-1078.

70. Landry D.W., Zhao K., Yang G.X., Glickman M., Georgiadis T.M. Antibody-catalyzed degradation of cocaine. Science. 1993. V. 259. P. 1899-1901.

71. Iverson B.L., Lerner R.A. Sequence-specific peptide cleavage catalyzed by an antibody. Science .1989. V. 243 P. 1184-1188.

72. Iverson B.L., Cameron K.E., Jahangiri G.K., Stoudt C., Lerner R.A. Selective clevage of trityl protecting groups catalyzed by an antibody. J.Am. Chem. Soc. 1992. V. 112. 5320-5323.

73. Reymond J.L., Janda K.D., Lerner R.A. Antibody Catalyzed Hidrolysis of enol ethers. J.Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. 3909-3917.

74. Sinha S.C., Keinan E., Reymond J.L. Antibody-catalyzed enantioselsctive epoxide hidrolysis. J.Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 4893-4894.

75. Janda K.D., Shevlin C.G., Lerner R.A. Antibody catalysis of a disfavored chemical transformation. Science. 1993. V. 259. P. 490-493.

76. Wirsching P., Ashley J.A., Benkovic S.J., Janda K.D., Lerner R.A. An unexpectedly efficient catalytic antibody operating by ping-pong and induced fit mechanisms. Science. 1991. V. 252. P.680-685

77. Jacobsen J.R., Schultz P.G. Antibody catalysis of peptide bond formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 5888-5892.

78. Nakayama G.R., Schultz P.G. Stereospecific antibody catalyzed reduction of an a-keto amide. J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 780-781.

79. Jacobsen J.R., Prudent J.R., Kochersperger L., Yonkovich S., Schultz P.G. An efficient antibody-catalyzed aminoacylation reaction. Science. 1992. V. 256. P. 365-367.

80. Lewis C., Kramer T., Robinson S., Hilvert D. Medium effects in antibody-catalyzed reactions. Science. 1991. V. 253. P. 1019-1022.

81. Suckling C.J., Tedford C.M., Proctor G.R., Khalaf A.I., Bence L.M., Stimson W.H. Catalytic antibodies: a new window on protein chemistry. Ciba. Found. Symp. 1991. V. 159. P. 201-208.

82. Hilvert D., Carpenter S.H., Nared K.D., Auditor M.T. Catalysis of concerted reactions by antibodies: the Claisenrearrangement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 4953-4955.

83. Cochran A.G., Schultz P.G. Antibody-catalyzed porphyrin metallation. Science. 1990. V. 249. P. 781-783.

84. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M. D., Kaveil S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. 1995. V. 154. P. 3328 - 3332.

85. Paul S., Said S.I., Thompson A.B., Voile D.J., Agrawal D.K., Foda H., de la Rocha S. Characterization of autoantibodies to vasoactive intestinal peptide in asthma J. Neuroimmunol. 1989. V. 23. P. 133-142.

86. Paul S., Voile D.J., Powell M.J, Massey R.J., Site specificity of a catalytic vasoactive intestinal peptide antibody. An inhibitory vasoactive intestinal peptide subsequence distant from the scissile peptide bond. J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 11910-11913.

87. Paul S., Mei S., Mody B., Eklund S.H., Beach C.M., Massey R.J., Hamel F., Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 16128-16134.

88. Paul S., Johnson D.R., Massey R. Binding and multiple hydrolytic sites in epitopes recognized by catalytic anti-peptide antibodies. Ciba Found. Symp. 1991. V. 159. P. 156-167.

89. Mei S., Mody B., Eklund S.H., Paul S. Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 15571-15574.

90. Paul S., Sun M., Mody R., Tewary H.K., Stemmer P., Massey R.J., Gianferrara T., Mehrotra S., Dreyer T., Meldal M.,et al. Peptidolytic monoclonal antibody elicited by a neuropeptide. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 13142-13145.

91. Sun M., Li L., Gao Q.S., Paul S., Antigen recognition by an antibody light chain. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 734-738.

92. Gao Q.S., Sun M., Tyutyulkova S., Webster D., Rees A., Tramontano A., Massey R.J., Paul S., Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 32389-32393.

93. Gao Q.S., Sun M., Rees A.R., Paul S. Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. J. Mol. Biol. 1995. Y. 253. P. 658-664.

94. Kozyr A.V. A novel method for purification of catalytic antibodies towward DNA from sera of patients with limfoprolifertive disease. Biochem. Molbiol. Internat. 1996. V. 39. P. 403413.

95. Шустер A.M., Гололобов Г.В., Квашук O.A., Габибов А.Г., Антиидиотипические и природные каталитически активные антитела. Молекуляр . биология. 1991. Т. 25. С. 593601.

96. Гололобов А.В., Взаимодействие ДНК-белок при аутоиммунном процессе. Автореф. дисс. на соискание уч. степ, к.х.н. М. 1992. РАН ИМБ им. В.А.Энгельгардта.

97. Габибов А.Г., Каталитичекие функции антител и экспрессированных фрагментов кДНК ферментов. Дисс. на соиск. научн. степ, д.х.н. в виде науч. доклада. М. 1992. РАН ИМБ им. В.А.Энгельгардта.

98. Puccetti A., Madaio М.Р., Bellese G., Magliorini P. Anty-DNA Antibodyes Bind to DNase I. J. Exp. Med. V. 1995. 181. P. 1797 - 1804.

99. Crespeau H., Laouar A., Rochu D. Polyclonal DNase abzyme produced by anti-idiotypic internal image method. C. R. Acad. Sci. 1994. V. 317 P. 819-823.

100. Gololobov G.V., Mikhalap S.V., Starov A.V., Kolesnikov A.F., Gabibov A.G. DNAprotein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47. P. 305-314.

101. Щуров Д. В. Каталитические антитела .Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 5-15.

102. Rini J.M., Schulze-Gahmen U., Wilson I. A. Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigen recognition. Science. 1992. V. 255. P. 959-965.

103. Herron J.N., He X.M., Ballard D.W., Blier P.R., Pace P.E., Bothwell A.L., Voss E.W. Jr., Edmundson A.B., An autoantibody to single-stranded DNA: comparison of the three-dimensional structures of the unliganded Fab and a deoxynucleotide-Fab complex. Proteins. 1991. V. 11. P. 159-175.

104 Щуров Д.В. Каталитические антитела к ДНК при системном аутоиммунном ответе: аспекты субстратной специфичности. Автореф. Дис. на соискание уч. степ, к.х.н. М. РАН ИМБим. В.А.Энгельгардта. 1996. С. 17-22.

105. Подуст В.Н. ДНК полимераза а из плаценты человека: выделение, харктеризация и исследование методом аффинной модификации. Дисс. на соискание уч. степ, к.х.н. Новосибирск. 1989.

106. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М. Мир. 1991.

107. Эберт К., Эдерер X. Компьютеры в химии. М. Мир. 1988. С. 284.

108. Келети Т. Основы ферментативной кинентики. М. Мир. 1990.

109. Диксон М. Уэбб Э. Ферменты. М. Мир. 1982. С. 482-530.

110. Laemmli U. К. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4. Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

111. Merril C.R., Goldman D., Van Keuren M.L. Gel protein stains: silver stain. Methods Enzymol. 1984.V. 104 P. 441-447.

112. Goldfarb M.F., Savadove M.S., Inman J.A. Two-dimensional electrophoretic analysis of human milk proteins. Electrophoresis. 1989.V. 10. P. 67-70.

113. Остерман JI.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М. Наука. 1983.

114. ТурковаЯ. Аффинная хроматография. М. Мир. 1980. С.190-191.

115. Брок Й. Фрагментирование иммуноглобулинов. Иммунологические методы под.ред. Фримеля Г. М. Медицина. 1987. С. 413-427.

116. Layne Е. Spectrophotometric and turbodimetric methods for measuring proteins. Methods Enzymol. 1957. V. 3. P. 447-454.

117. Ehresmann В., Imbault P., Weil J.H. Spectrophotometric determination of protein concentration in cell extracts containig tRNA's and rRNA's. Anal. Biochem. 1973. V. 54. P. 454-463.

118. Невинский Г.А., Газарянц М.Г., Мкартчан З.С. Аффинная модификация креатинкиназы скелетных мышц кролика 2', 3' диальдегидными производными АТР и ADP. Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 487-495.

119. Мишенина Г.Ф., Самуков В.В., Шубина Т.Н. Селективная модификация монозамещенных фосфатных групп в 5'-моно- и полифосфатах нуклеозиодов и олигонуклеотидов. Биоорган, химия. 1979. Т. 5. С. 886-894.

120. Берстон М. Гистохимия ферментов. М. Мир. 1965. С. 208-209.

121. Брок Й. Приготовление конъюгированых антигенов. Иммунологические методы под.ред. Фримеля Г. М. Медицина. 1987. С. 432-442.

122. Owen P., Graeme-Cook К.А., Crowe В.А., Condon С. Bacterial membranes: preparative techniques and criteria of purirty. Techniques in lipid and membrane biochemistry. V. B4/1. P. 41-49.

123. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. V. 76 P. 4350-4354.

124. Turner B.M. J. The use of alkaline-phosphatase-conjugated second antibody for the visualization of electrophoretically separated proteins recognized by monoclonal antibodies. Immunol. Methods. 1983. V. 63. P. 1-6.

125. Legrand D., Mazurier J., Metz-Boutigue M., Jolles J., Jolles P., Montreuil J., Spik J. Characterization and localization of an iron-binding 18-kDa glycopeptide isolated from the N-terminal half of human lactotransferrin. Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 787. P. 90-96.

126. Грачев M.A., Мустаев A.A., Колочева Т. И. Идентификация остатка гистидина в активном центре РНК полимеразы Escherichia coli. Доклады АН СССР. 1985. V. 281. Р. 723-727.

127. Rey M.W., Woloshuk S.L., deBoer H.A., Pieper F.R. Complete nucleotide sequence of human mammary gland lactoferrin. Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 5288.

128. Deleage G., Clerc F.F., Roux В., Gautheron D.C. ANTHEPROT: A package for protein sequence analysis using a microcomputer. CABIOS. 1988. V. 4. P. 351-356.

129. Deleage G., Clerc F.F., Roux B. ANTHEPROT: IBM PC and Apple Macintosh versions. () CABIOS. 1989. V. 5. P. 159-160.

130. Tomasi T.B. in Immunology of Breast milk. Ogra P. L. and Dayton D. H., eds. Raven Press. New York. 1979. P. 1-5.

131. Heremans J. F. Immunoglobulin A. The Antigens. New York. 1974. V. 2. P. 365-522.

132. Kim K., Keller M.A., Heiner D.C. Immunoglobulin G subclasses in human colostrum milk and saliva. Acta Paediatr. 1992. V. 81. P. 113-118.

133. Langone J.J. Applications of immobilized protein A in immunochemical techniques. J Immunol. Methods. 1982. V. 55. P. 277-296.

134. Davies M. The separation of the antibody and antigen components of immune complexes formed during normal human pregnancy.Immunobiology. 1986. Y. 171. P. 180-194.

135. Vidal M.A., Conde F.P. Studies of the IgM and IgA contamination obtained by eluting IgG from protein A-Sepharose column with pH steps. J. Immunol. Methods. 1980. V. 35. P. 169172.

136. Brunda M.J., Minden P., Grey H.M. Heterogeneity of binding of human IgA subclasses to protein A. J. Immunol. 1979. V. 123. P. 1457-1461.

137. Kim E.E., Wyckoff H.W. Reaction mechanism of alkaline phosphatase based on crystal structures.Two-metal ion catalysis. J. Mol. Biol. 1991. V. 218. P. 449-464.

138. Costas M.J., Montera J.M., Cameselle J.C., Sillero M.A., Sillero A. Dinucleosidetriphosphatase from rat brain. Int. J. Biochem. 1984. V. 16. P. 757-762.

139. Charbonnier J.B., Carpenter E., Gigant B., Golinelli-Pimpaneau B., Eshhar Z., Green B.S., Knossow. M. Crystal structure of a catalytic antibody Fab with esterase-like activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 11721-11725.

140. Hardonk M.J., Koudstaal J. Enzyme histochemistry as a link between biochemistry and morphology. Prog. Histochem. Cytochem. 1976. V. 8. P. 1-68.

141. Smith H.R. Steinberg A. Autoimmunity - a perspective. Ann. Rev. Immunol. 1983. V. 1. P. 175-210.

142. Steller J. A., Jacob S.T. Immunization of rabbits with purified RNA polymerase I induced a distinct population of antibodies against nucleic acidc as well as anti-RNA polimerase I antibodies, both characteristic of systemic lupus erthematosus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 6797-6801.

143. Rauch J., Tannenbaum H., Stollar B.D., Schwartz R.S. Monoclonal anti-cardiolipin antibodies bind to DNA. Eur. J. Immunol. 1984. V. 14. P. 529-534.

144. Mestecky J., McGhee J.R., Immunoglobulin A (IgA): Molecular and cellular interactions involved in IgA biosinthesis and immune response. Adv. Immuno. 1987. V. 40. P. 153-245.

145. Monsteir M., Bona C. A. Antibodies possesing multiple antigen spécificités and exhibiting extensive idiotypic cross-reactivity. Int. Rev. Immunol. 1988. V. 3. P. 59-70.

146. Sousa, M., and Brock, J.H. (1989) Iron in Immunity Cancer and Inflammation. John Wiley & Sons.

147. Blackberg, L., and Hernel, O. Isolation of lactoferrin from human whey by a single chromatographic step. FEBS Lett. 1980. V. 109. P. 180-184.

148. Остерман Л.А. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М. Наука. С. 365-369.

149. Furmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, М.В., Swamy, C.V., and Das, M.R. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity. J. Exp. Med. 1989. V. 170. P. 415-429.

150. Kolocheva T.I., Nevinsky G.A., Volchkova V.A., Levina A.S., Khomov V.V., Lavrik O.I. DNA polymerase I (Klenow fragment): role of the structure and length of a template in enzyme recognition. FEBS Lett. 1989. V. 248.P. 97-100.

151. Kolocheva T.I., Nevinsky G.A., Levina A.S., Khomov V.V., Lavrik O. J. The mechanism of recognition of templates by DNA polymerases from pro- and eukaryotes as revealed by affinity modification data. Biomol. Struct. Dyn. 1991. V. 9. P. 169-186.

152. Невинский Г.А. Важная роль слабых взаимодействий в процессах узнавания ферментами протяженных молекул ДНК и РНК. Молекуляр. биология. 1995.Т. 29, С. 1637.

153. Legrand, D., Mazurier, J., Metz-Boutigue, M., Jolles, J., Jolles, P., Montreuil, J., and Spik, J. Characterization and localization of an iron-binding 18-kDa glycopeptide isolated from the N-terminal half of human lactotransferrin. Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 787. P. 90-96.

154. Mazurier J., Spik G., Montreuil J. Isolation and characterization of the cyanogen bromide fragments from human lactotransferrin. FEBS Lett. 1974. V. 48. P. 262-265.

155. Mazurier, J., and Spik, G. Comparative study of the iron-binding properties of human transferrins. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 629. P. 399-408.

156. Mann, D.M., Romm, E., and Migliorini, M. Delineation of the glycosaminoglycan-binding site in the human inflammatory response protein lactoferrin. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 23661-23667.

157. Tomita M., Takase M., Wakabayashi H., and Bellamy W. Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment. Adv. Exp. Med. Biol. 1994.V. 357. P. 209-218.

158. Mantel C., Miyazawa K., Broxmeyer H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity. Adv. Exp. Med. Biol. 1994. V. 357. P. 121-132.

159. Bagby G.C., Bennet R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production. Blood. 1982. V. 60. P. 108-112.

160. Nevinsky G.A., Ankilova V.N., Lavrik O.I., Mkrtchyan Z.S., Nersesova L.S., Akopyan J.I. Functional non-identity of creatine kinase subunits of rabbit skeletal muscle. FEBS Lett. 1982. V. 149. P.36-40.

161. Watanabe, Т., Nagura, H., Watanabe, K., and Brown, W.R. The binding of human milk lactoferrin to immunoglobulin A. FEBS Lett. 1984. V. 168. P. 203-207.

162. Anderson, B.F, Baker, H.M., Norris, G.E., Rice, D.W., and Baker, E.N. Structure of human lactoferrin: crystallographic structure analysis and refinement at 2.8 A resolution J. Mol. Biol. 1989.V. 209. P. 711-734.

163. Anderson B. F., Baker H. M., Norris G. E., Rumball S. V., Baker E. N. Apolactoferrin structure demonstrates ligand-induced conformational changein transferrins. Nature. 1990. V. 344. p. 784-787.

164. Legrand D., Mazurier J., Aubert J. P., Loucheux-Lefebvre M. H., Montreuil J., Spik G. Evidence for interactions between the 30 kDa N- and 50 kDa C-terminal tryptic fragments of human lactotransferrin. Biochem. J. 1986. V. 236. P. 839-844.

165. He J., Furmanski P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. Nature. 1995. V. 373. P. 721-724.

166. Лактионов П. П. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками и клетками организма. Дисс. на соиск. уч. степени канд. биол. наук. Новосибирск. 1997.

167 Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Lactoferrin is a new transcriptional factor having many different unique biological functions. Proceedings of the 1-st international conference on bioinformatics of genom regulation and structure. 1998. V. 2. P. 405-407.

168. Schams D., Karg H. Hormones in milk. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1986. V.464. P.75-86.

169. Hakansson A., Zhivotovsky В., Orrenius S., Sabharwal H., Svanborg C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P.8064-8068.

170. Funakoshi S., Doi Т., Nakajima Т., Suyama Т., Tokuda M. Antimicrobial effect of human serum IgA. Microbiol. Immunol. 1982.V. 26. P. 227-239.

171. Baynes R.D., Bezwoda W.R. Lactoferrin and the inflammatory response. Adv. Exp. Med. Biol. 1994.V. 357. P.133-141.