Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристика тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сударкина, Ольга Юрьевна

• Сударкина, Ольга Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сударкина, Ольга Юрьевна

список сокращений введение обзор литературы

1. Белки, инактивирующие рибосомы

2. Структура RIP

3. Действие RIP на рибосомы

4. Биосинтез рицина

5. Взаимодействие RIP 2 с клетками млекопитающих

5.1 Поступление RIP 2 в цитоплазму клеток

5.2 Ответ клетки на воздействие RIP

6. Биологическая роль и практическое применение RIP

7. Токсические лектины омелы 29 материалы и методы

1. Растительный материал

2. Выделение мРНК из растения и синтез кДНК

3. Амплификация фрагментов геномной ДНК, кодирующих токсические лектины омелы с помощью вырожденных праймеров

4. Амплификация концов кДНК

5. Клонирование полных кодирующих последовательностей генов токсических лектинов омелы

6. Выделение геномной ДНК омелы и Саузерн-блот анализ

7. Оценка количественного соотношения трех генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК

8. Количественная ПЦР

9. Секвенирование ДНК

10. Конструкция экспрессионных плазмид, кодирующих рекомбинантные А- и В-цепи лектинов омелы

11. Синтез А- и В-цепей токсических лектинов омелы в Е. coli.

12. Выделение рекомбинантных А- и В-цепей токсических лектинов омелы

13. Вестерн-блот анализ рекомбинантных А-цепей

14. Каталитическая активность рекомбинантных А-цепей

15. Приготовление поликлональной антисыворотки к В-цепи ML2p

16. Лектиновые свойства рекомбинантных В-цепей 39 результаты

1. Клонирование полных кодирующих участков генов токсических лектинов омелы и анализ структуры кодируемых белков

2. Количественное соотношение трех вариантов генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК и их транскриптов в мРНК

3. Количественное содержание генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК

4. Получение рекомбинантных А-цепей токсических лектинов омелы и определение их функциональной активности

5. Получение рекомбинантных В-цепей токсических лектинов омелы и определение их функциональной активности обсуждение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Токсические лектины омелы (Viscum album L.): клонирование и характеристика»

Токсические лектиы омелы (Viscum album L.) относятся к семейству белков, инактивирующих рибосомы, в которых энзиматическая А-цепь соединена дисульфидной связью с лектиновой В-цепью. А-цепь - специфическая РНК N-гликозидаза, которая гидролитически выщепляет остаток аденина из высоко консервативной области 28S рРНК. Модифицированная таким образом рибосома неспособна связывать факторы элонгации, что ведет к остановке трансляции и, в конечном счете, гибели клетки. В-цепь связывается с олигосахаридами гликопротеинов и гликолипидов клеточной поверхности, содержащих концевые остатки галактозы, обеспечивая эндоцитоз токсина. К этому семейству относятся также рицин клещевины (Ricinus communis L.) и шига токсин, продуцируемый бактерией Shigella dysenteriae.

Изучение цитотоксического действия белков этого семейства связано с исследованиями клеточных механизмов ретроградного транспорта белков и липидов от плазматической мембраны в эндоплазматический ретикулум, механизмов риботоксического стресса и апоптоза. В этих исследованиях белки, инактивирующие рибосомы, оказываются удобным инструментом. Исключительная токсичность для клеток человека обусловливает применение их для создания цитотоксических препаратов направленного действия, таких как иммунотоксины. Было показано, что токсины этого типа способны доставлять сшитые с ними чужеродные белки и пептиды в цитоплазму клеток, что делает возможным использование их для доставки различных антигенов в клетки для презентации, связанной с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости и индукции протективного клеточного иммунитета при вирусных инфекциях и онкологических заболеваниях.

В настоящее время экстракты омелы белой (Viscum album) широко используются в Европе для общей иммуностимуляции при онкологических заболеваниях. Три токсических лектина MLI, MLII и MLIII, различающиеся по углеводной специфичности и цитотоксичности, являющиеся действующим началом этих экстрактов, в малых дозах стимулируют иммунную систему к продукции цитокинов, таких как интерлейкин-1 и 6, интерферон-у и фактор некроза опухоли а, индуцируют цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и естественных киллеров, усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов. При этом ряд эффектов, оказываемых лектинами омелы на иммунную систему могут вызывать их изолированные В-цепи. Иммуностимулирующее действие может увеличивать эффективность цитотоксических и вакцинных препаратов на основе лектинов омелы. Получение рекомбинантных лектинов необходимо для их практического применения и структурно-функциональных исследований. До недавнего времени была известна только первичная структура количественно преобладающего в растении лектина MLI. Целью данной работы было клонирование генов токсичеких лектинов омелы и характеристика функциональных свойств их каталитических и лектиновых субъединиц. В работе представлены следующие результаты. Клонированы три варианта генов токсических лектинов омелы, два из которых кодируют MLI, структура гена которого к началу работы не была известна, и MLIII, аминокислотная последовательность которого была недавно определена. Третий вариант, предположительно, соответствует MLII, данных о структуре которого в литературе пока нет. Впервые получены оценки размера семейства генов токсических лектинов и генома омелы. Получены энзиматически активные рекомбинантные А-цепи, которые могут быть использованы для разработки цитотоксических препаратов направленного действия. Полученные рекомбинантные В-цепи, кодируемые тремя вариантами генов, обладают сниженным сродством к моносахарам галактозе и N-ацетилгалактозамину, но связываются со сложными олигосахридами асиалофетуина и могут обладать той же биологической активностью, что и природные В-цепи. обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сударкина, Ольга Юрьевна

выводы

1) Клонированы гены трех токсических лектинов омелы.

2) Определено количественное соотношение трех генов mllp, т12р и т13р в геномной ДНК, которое составляет 1.5:1:4 соответственно. Количественное соотношение транскриптов mllp, т12р и т13р в мРНК составляет 50:10:1 соответственно. Семейство генов токсических лектинов омелы включает по меньшей мере 6-7 генов.

3) Количественное содержание генов токсических лектинов омелы в геномной ДНК составляет 1 ген на 50 пг ДНК. Получена приблизительная оценка размера генома омелы: 3 - 3.5 х 1011 по.

4) Получены каталитически активные рекомбинантные А-цепи токсических лектинов омелы.

5) Получены рекомбинантные В-цепи трех токсических лектинов омелы, обладающие сниженным сродством к простым сахарам. Рекомбинантная В-цепь изоформы одного из токсических лектинов омелы обладает наиболее высоким сродством к простым сахарам, близким к природному лектину.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю профессору Юрию Васильевичу Козлову за чуткое руководство и интеллектуальную поддержку и Алме Габиденовне Курмановой за неоценимую помощь и участие в проведении экспериментальной работы и плодотворное обсуждение полученных результатов.

Я благодарю московский Центр медицинских исследований Университета Осло за поддержку данной работы. Я выражаю искреннюю благодарность профессору А.Г. Тоневицкому за предоставленные препараты природных лектинов омелы MLI, MLII и MLIII и антитела к ним.

Я благодарю всех сотрудников нашей лаборатории, помогавших проведению работы: Юдкину Ольгу Владимировну, Лукьянова Евгения Владимировича, Ермакову Нину Викторовну, а также Сарафанова Андрея Гаруновича и Пенькова Дмитрия Николаевича.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клонированы гены трех токсических лектинов омелы, два из которых кодируют MLI и MLIII, и третий, предположительно, кодирует MLII. Данные о структуре генов лектинов омелы, кроме MLI, получены впервые. Впервые получена оценка размера семейства генов токсических лектинов омелы и приблизительная оценка размера генома омелы. Получены функционально активные рекомбинантные А- и В-цепи токсических лектинов омелы. Впервые получены данные, указывающие на возможность путем изменения структуры белка компенсировать отсутствие N-гликозилирования, необходимого для поддержания функционально активной конформации В-цепей RIP 2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сударкина, Ольга Юрьевна, 2007 год

1. Olsnes S. 2004. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon. 44(4), 361370.

2. Lin J.-Y., Kao W.-Y., Tserng, K.-Y., Chen C.-C., Tung T.-C. 1970. Effect of crystalline abrin on the biosynthesis of protein, RNA and DNA in experimental tumors. Cancer Res. 30,2431-2433.

3. Lin J.-Y., Liu K., Chen C.-C., Tung T.-C. 1971. Effect of crystalline ricin on the biosynthesis of protein, RNA and DNA in experimental tumors. Cancer Res. 31, 921-924.

4. Girbes Т., Ferreras J.M., Arias F.J., Stirpe F. 2004. Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. Mini Rev. Med. Chem. 4(5), 461-476.

5. Stirpe F., Williams D.G., Onyon L.J., Legg R.F., Stevens W.A.1981. Dianthins, ribosome-damaging proteins with anti-viral properties from Dianthus caryophyllus I.(carnation). Biochem J. 195(2), 399-405.

6. Stirpe F., Olsnes S., Pihl A. 1980. Gelonin, a new inhibitor of protein synthesis, nontoxic to intact cells. Isolation, characterization, and preparation of cytotoxic complexes with concanavalin A. J. Biol. Chem. 255(14), 6947-6953.

7. Irvin J.D. 1975. Purification and partial characterization of the antiviral protein from Phytolacca americana which inhibits eukaryotic protein synthesis. Arch. Biochem. Biophys. 169(2), 522-528.

8. Irvin J.D., Kelly Т., Robertus J.D. 1980. Purification and properties of a second antiviral protein from Phytolacca americana which inactivates eukaryotic ribosomes. Arch. Biochem. Biophys. 200(2), 418-425.

9. Barbieri L., Bolognesi A., Cenini P., Falasca A.I., Minghetti A., Garofano L., Guicciardi A., Lappi D., Miller S.P., Stirpe F. 1989. Ribosome-inactivating proteins from plant cells in culture. Biochem. J. 257(3), 801-807.

10. Miyano M., Appelt K., Arita M., Habuka N., Kataoka J., Ago H., Tsuge H., Noma M., Ashford V., Xuong N. 1992. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Mirabilis antiviral protein. J. Mo I Biol. 226(1), 281283.

11. Coleman W.H., Roberts W.K. 1982. Inhibitors of animal cell-free protein synthesis from grains. Biochim. Biophys. Acta. 696(3), 239-244.

12. Olsnes S., Pihl A. 1973. Different biological properties of the two constituent peptide chains of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. Biochemistry. 12(16), 3121-3126.

13. Olsnes S. 1978. Ricin and ricinus agglutinin, toxic lectins from castor bean. Methods Enzymol. 50,30-35.

14. Wei C.H., Hartman F.C., Pfuderer P., Yang W.K. 1974. Purification and characterization of two major toxic proteins from seeds of Abrus precatorius. J. Biol. Chem. 249(10), 3061-3067.

15. Olsnes S., Pihl A.1973. Isolation and properties of abrin: a toxic protein inhibiting protein synthesis. Evidence for different biological functions of its two constituent-peptide chains. Eur. J. Biochem. 35(1), 179-185.

16. Franz H., Ziska P., Kindt A. 1981. Isolation and properties of three lectins from mistletoe (Viscum album L.). Biochem. J. 195(2), 481-484.

17. Olsnes S., Haylett Т., Refsnes K. 1978. Purification and characterization of the highly toxic lectin modeccin./. Biol. Chem. 253(14), 5069-5073.

18. Barbieri L., Zamboni M., Montanaro L., Sperti S., Stirpe F. 1980. Purification and properties of different forms of modeccin, the toxin of Adenia digitata. Separation of subunits with inhibitory and lectin activity. Biochem. J. 185(1), 203-210.

19. Stirpe F., Barbieri L., Abbondanza A., Falasca A.I., Brown A.N., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1985. Properties of volkensin, a toxic lectin from Adenia volkensii.J. Biol. Chem. 260(27), 14589-14595.

20. Fraser M.E., Chernaia M.M., Kozlov Y.V., James M.N. 1994. Crystal structure of the holotoxin from Shigella dysenteriae at 2.5 A resolution. Nature Struct. Biol. 1(1), 59-64.

21. Lindberg A.A., Brown J.E., Stromberg N., Westling-Ryd M., Schultz J.E., Karlsson K.A. 1987. Identification of the carbohydrate receptor for Shiga toxin produced by Shigella dysenteriae type I. J. Biol. Chem. 262(4), 1779-1785.

22. Ling H., Boodhoo A., Hazes В., Cummings M.D., Armstrong G.D., Brunton J.L., Read R.J. 1998. Structure of the shiga-like toxin I B-pentamer complexed with an analogue of its receptor Gb3. Biochemistry. 37(7), 1777-1788

23. Roberts L.M., Lamb F.I., Pappin D.J., Lord JM. 1985. The primary sequence of Ricinus communis agglutinin. Comparison with ricin. J. Biol. Chem. 260(29), 15682-15686.

24. Kourmanova A.G., Soudarkina O.J., Olsnes S., Kozlov J.V. 2004. Cloning and characterization of the genes encoding toxic lectins in mistletoe (Viscum album L.). Eur. J. Biochem. 271(12), 2350-2360.

25. Lin Q., Chen Z.C., Antoniw J.F., White R.F. 1991. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding the anti-viral protein from Phytolacca americana. Plant Mol. Biol 17(4), 609-614.

26. Poyet J.L., Radom J., Hoeveler A. 1994. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding the pokeweed antiviral protein II from Phytolacca americana and its expression in E. coli. FEBS Lett. 347(2-3), 268-272.

27. Kataoka J., Habuka N., Masuta C., Miyano M., Koiwai A. 1992. Isolation and analysis of a genomic clone encoding a pokeweed antiviral protein. Plant Mol. Biol 20(5), 879-886.

28. Poyet J.L., Hoeveler A. 1997. cDNA cloning and expression of pokeweed antiviral protein from seeds in Escherichia coli and its inhibition of protein synthesis in vitro. FEBS Lett. 406(1-2), 97-100.

29. Montfort W., Villafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. 1987. The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. J. Biol Chem. 262(11), 5398-5403.

30. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. 1991. Structure of ricin A-chain at 2.5 A. Proteins. 10(3), 251-259.

31. Rutenber E., Robertus J.D. 1991. Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. Proteins. 10(3), 260-269.

32. Robertus J.D., Monzingo A.F. 2004. The structure of ribosome inactivating proteins. Mini Rev. Med. Chem. 4(5), 477-486.

33. Hailing K.C., Hailing A.C., Murray E.E., Ladin B.F., Houston L.L., Weaver R.F. 1985. Genomic cloning and characterization of a ricin gene from Ricinus communis. Nucleic Acids Res. 13(22), 8019-8033.

34. Wood K.A., Lord J.M., Wawrzynczak E.J., Piatak M. 1991. Preproabrin: genomic cloning, characterisation and the expression of the A-chain in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 198(3), 723-732.

35. Kozlov Yu.V., Kabishev A.A., Lukyanov E.V., Bayev A.A. 1988. The primary structure of the operons coding for Shigella dysenteriae toxin and temperature phage H30 shiga-like toxin. Gene. 67(2), 213-221.

36. Corpet F. 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 16(22), 10881-10890.

37. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. 1992. p-Trefoil fold. Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interleukins-ip and la and fibroblast growth factors. J. Mol. Biol. 223(2), 531-543.

38. Wales R., Richardson P.T., Roberts L.M., Woodland H.R., Lord J.M. 1991. Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin В chain. J. Biol. Chem. 266(29), 19172-19179.

39. Van Damme E.J.M., Peumans W.J., Barre A., Rouge P. 1998. Plant Lectins: a composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles. Crit. Rev. Plant Sci. 17, 576- 692.

40. Pascal J.M., Day P.J., Monzingo A.F., Ernst S.R., Robertus J.D., Iglesias R., Perez Y., Ferreras J.M., Citores L., Girbes T. 2001. 2.8-A crystal structure of a nontoxic type-II ribosome-inactivating protein, ebulin 1. Proteins. 43(3), 319-326.

41. Endo Y., Tsurugi K. 1987. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. J. Biol. Chem. 262(17), 8128-8130.

42. Hartley M.R., Legname G., Osborn R., Chen Z., Lord J.M. 1991. Single-chain ribosome inactivating proteins from plants depurinate Escherichia coli 23S ribosomal RNA. FEBSLett. 290(1-2), 65-68.

43. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. 1988. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature. 334(6180), 362-364.

44. Larsson S.L., Sloma M.S., Nygard 0.2002. Conformational changes in the structure of domains II and V of 28S rRNA in ribosomes treated with the translational inhibitors ricin or alpha-sarcin. Biochim. Biophys. Acta. 1577(1), 5362.

45. Osborn R.W., Hartley M.R. 1990. Dual effects of ricin A chain on protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate. Inhibition of initiation and translocation. Eur. J.Biochem. 193(2), 401-407.

46. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z. Wool I.G., Steitz T.A. 1998. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95(23), 13436-13441.

47. Correll C.C., Wool I.G., Munishkin A. 1999. The two faces of the Escherichia coli 23 S rRNA sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 A resolution. J. Mol. Biol. 292(2), 275-287.

48. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. 2000.The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science. 289(5481), 905-920.

49. Gluck A., Endo Y., Wool I.G. 1992. Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. Analysis with tetraloop mutants. J. Mol. Biol. 226(2), 411-424.

50. Allerson C.R., Verdine G.L. 1995. Synthesis and biochemical evaluation of RNA containing an intrahelical disulfide crosslink. Chem. Biol. 2(10), 667-675.

51. Marchant A., Hartley M.R. 1995. The action of pokeweed antiviral protein and ricin A-chain on mutants in the alpha-sarcin loop of Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 254(5), 848-855.

52. Hudak K.A., Wang P., Turner N.E. 2000. A novel mechanism for inhibition of translation by pokeweed antiviral protein: depurination of the capped RNA template. RNA. 6(3), 369-380.

53. Endo Y., Tsurugi K. 1988. The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA. J. Biol. Chem. 263(18), 8735-8739.

54. Chaddock J.A., Monzingo A.F., Robertus J.D., Lord J.M., Roberts L.M. 1996. Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity. Eur. J. Biochem. 235(1-2), 159-166.

55. Peumans W.J., Hao Q., Van Damme E.J. 2001. Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? FASEBJ. 15(9), 1493-506.

56. Hudak K.A., Dinman J.D., Turner N.E. 1999. Pokeweed antiviral protein accesses ribosomes by binding to L3. J. Biol. Chem. 274(6), 3859-3864.

57. Vater C.A., Bartle L.M., Leszyk J.D., Lambert J.M., Goldmacher V.S. 1995. Ricin A chain can be chemically cross-linked to the mammalian ribosomal proteins L9 andLlOe.y. Biol. Chem. 270(21), 12933-12940.

58. Rajamohan F., Venkatachalam Т.К., Irvin J.D., Uckun F.M. 1999. Pokeweed antiviral protein isoforms PAP-I, PAP-II, and PAP-III depurinate RNA of human immunodeficiency virus (HIV)-l. Biochem. Biophys. Res. Commun. 260(2), 453458.

59. Barbieri L., Valbonesi P., Bonora E., Gorini P., Bolognesi A., Stirpe F. 1997. Polynucleotide:adenosine glycosidase activity of ribosome-inactivating proteins: effect on DNA, RNA and poly(A). Nucleic Acids Res. 25(3), 518-522.

60. Chen X.Y., Link T.M., Schramm V.L. 1998. Ricin A-chain: kinetics, mechanism, and RNA stem-loop inhibitors. Biochemistry. 37(33), 11605-11613.

61. Tregear J.W., Roberts L.M. 1992. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. Plant Mol. Biol. 18(3), 515-525.

62. Lord J.M., Roberts L.M., Robertus J.D. 1994. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. FASEB J. 8(2), 201-208.

63. Youle R.J., Huang A.H.C. 1976. Protein bodies from the endosperm of castor bean. Subfractionation, protein components, lectins, and changes during germination. Plant Physiol. 58, 703-709.

64. Lamb F.I., Roberts L.M., Lord J.M. 1985. Nucleotide sequence of cloned cDNA coding for preproricin. Eur. J. Biochem. 148(2), 265-270.

65. Ferrini J.B., Martin M., Taupiac M.P., Beaumelle B. 1995. Expression of functional ricin В chain using the baculovirus system. Eur. J. Biochem. 233(3), 772-777.

66. Lord J.M. 1985. Synthesis and intracellular transport of lectin and storage protein precursors in endosperm from castor bean. Eur. J. Biochem. 146(2), 403-409.

67. Lord JM. 1985. Precursors of ricin and Ricinus communis agglutinin. Glycosylation and processing during synthesis and intracellular transport. Eur. J. Biochem. 146(2), 411-416.

68. Kimura Y., Hase S., Kobayashi Y., Kyogoku Y., Ikenaka Т., Funatsu G. 1988. Structures of sugar chains of ricin D. J. Biochem. (Tokyo). 103(6), 944-949.

69. Harley S.M., Lord J.M. 1985. In vitro endoproteolytic cleavage of castor bean lectin precursors. Plant Sci. 41, 111 116.

70. Harley S.M., Beevers H. 1982. Ricin inhibition of in vitro protein synthesis by plant ribosomes, Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 79, 5935- 5938.

71. Richardson P.T., Westby M., Roberts L.M., Gould J.H., Colman A., Lord J.M. 1989. Recombinant proricin binds galactose but does not depurinate 28 S ribosomal RNA. FEBS Lett. 255(1), 15-20.

72. Frigerio L., Vitale A., Lord J.M., Ceriotti A., Roberts L.M. 1998. Free ricin A chain, proricin, and native toxin have different cellular fates when expressed in tobacco protoplasts. J. Biol. Chem. 273(23), 14194-14199.

73. Hegde R., Podder S.K. 1997. A- and B-subunit variant distribution in the holoprotein variants of protein toxin abrin: variants of abrins I and III have constant toxic A subunits and variant lectin В subunits. Arch. Biochem. Biophys. 344(1), 75-84.

74. Yang Q., Liu R.S., Gong Z.Z., Liu W.Y. 2002. Studies of three genes encoding Cinnamomin (a type II RIP) isolated from the seeds of camphor tree and their expression patterns. Gene. 284(1-2), 215-223.

75. Chambery A., Di Maro A., Monti M.M., Stirpe F, Parente A. 2004. Volkensin from Adenia volkensii Harms (kilyambiti plant), a type 2 ribosome-inactivating protein. Eur. J. Biochem. 271(1), 108-117.

76. Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1976. Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to surface receptors of human cells. J. Biol. Chem. 251(13), 3977-3984.

77. Moya M., Dautry-Varsat A., Goud В., Louvard D., Boquet P. 1985. Inhibition of coated pit formation in Hep2 cells blocks the cytotoxicity of diphtheria toxin but not that of ricin toxin. J. Cell Biol. 101(2), 548-559.

78. Simpson J.C., Smith D.C., Roberts L.M., Lord J.M. 1998. Expression of mutant dynamin protects cells against diphtheria toxin but not against ricin. Exp. Cell Res. 239(2), 293-300.

79. Sandvig K., van Deurs B. 1999. Endocytosis and intracellular transport of ricin: recent discoveries. FEBSLett. 452(1-2), 67-70.

80. Ghosh R.N., Mallet W.G., Soe T.T., McGraw Т.Е., Maxfield F.R. 1998. An endocytosed TGN38 chimeric protein is delivered to the TGN after trafficking through the endocytic recycling compartment in CHO cells. J. Cell Biol. 142(4), 923-936.

81. Wilcke M., Johannes L., Galli Т., Mayau V., Goud В., Salamero J. 2000. Rabl 1 regulates the compartmentalization of early endosomes required for efficient transport from early endosomes to the trans-Golgi network. J. Cell Biol 151(6), 1207-1220.

82. Stirpe F., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1982. Action of viscumin, a toxic lectin from mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem. 257(22), 13271-13277.

83. Riederer M.A., Soldati Т., Shapiro A.D., Lin J., Pfeffer S.R. 1994. Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 125(3), 573-582.

84. Mallard F., Antony C., Tenza D., Salamero J., Goud В., Johannes L. 1998. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. J. Cell Biol. 143(4), 973-990.

85. Mallard F., Tang B.L., Galli Т., Tenza D., Saint-Pol A., Yue X., Antony C., Hong W., Goud В., Johannes L. 2002. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. J. Cell Biol. 156(4), 653-664.

86. Sandvig K., Garred O., Prydz K., Kozlov J.V., Hansen S.H., van Deurs B. 1992. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358(6386), 510-512.

87. Majoul I.V., Bastiaens P.I., Soling H.D. 1996. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J. Cell Biol. 133(4), 777-789.

88. Cosson P., Letourneur F. 1997. Coatomer (COPI)-coated vesicles: role in intracellular transport and protein sorting. Curr. Opin. Cell Biol. 9(4), 484-487.

89. Munro S., Pelham H.R. 1987. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48(5), 899-907.

90. Girod A., Storrie В., Simpson J.C., Johannes L., Goud В., Roberts L.M., Lord J.M., Nilsson Т., Pepperkok R. 1999. Evidence for a COP-I-independent transport route from the Golgi complex to the endoplasmic reticulum. Nat. Cell Biol. 1(7), 423-430.

91. Simpson J.C., Dascher C., Roberts L.M., Lord J.M., Balch W.E. 1995. Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. J. Biol. Chem. 270(34), 20078-20083.

92. White J., Johannes L., Mallard F., Girod A., Grill S„ Reinsch S., Keller P., Tzschaschel В., Echard A., Goud В., Stelzer E.H. 1999. Rab6 coordinates a novel Golgi to ER retrograde transport pathway in live cells. J. Cell Biol. 147(4), 743760.

93. Johnson A.E., van Waes M.A. 1999. The translocon: a dynamic gateway at the ER membrane. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 799-842.

94. Tsai В., Rapoport T.A. 2002. Unfolded cholera toxin is transferred to the ER membrane and released from protein disulfide isomerase upon oxidation by Erol. J. Cell Biol. 159(2), 207-216.

95. H.Ellgaard L., Molinari M., Helenius A. 1999. Setting the standards: quality control in the secretory pathway. Science. 286(5446), 1882-1888.

96. Simpson J.C., Roberts L.M., Romisch K., Davey .J, Wolf D.H., Lord J.M. 1999. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS Lett. 459(1), 80-84.

97. Spooner R.A., Watson P.D., Marsden C.J., Smith D.C., Moore K.A., Cook J.P., Lord J.M. 2004. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and В chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383(Pt 2), 285-293.

98. Day P.J., Pinheiro T.J., Roberts L.M., Lord J.M. 2002. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipid vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. Biochemistry. 41(8), 2836-2843.

99. Argent R.H., Parrott A.M., Day P.J., Roberts L.M., Stockley P.G., Lord J.M., Radford S.E. 2000. Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. J. Biol. Chem. 275(13), 9263-9269.

100. Griffiths G.D., Leek M.D., Gee D.J. 1987. The toxic plant proteins ricin and abrin induce apoptotic changes in mammalian lymphoid tissues and intestine. J. Pathol 151,221-229.

101. Hughes J.N., Lindsay C.D., Griffiths G.D. 1996. Morphology of ricin and abrin exposed endothelial cells is consistent with apoptotic cell death. Hum. Exp. Toxicol 15 (5), 443-451.

102. Fujii J., Matsui. Т., Heatherly D.P., Schlegel K.H., Lobo P. L., Yutsudo Т., Ciraolo G.M., Morris R.E., Obrig T. 2003. Rapid apoptosis induced by Shiga toxin in HeLa cells. Infect. Immun. 71 (5), 2724-2735.

103. Williams J.M., Lea N., Lord J.M., Roberts L.M., Milford D.V., Taylor C.M. 1997. Comparison of ribosome-inactivating proteins in the induction of apoptosis. Toxicol Lett. 91(2), 121-127.

104. Rao P.V., Jayaraj R., Bhaskar A.S., Kumar O., Bhattacharya R., Saxena P., Dash P.K., Vijayaraghavan R. 2005. Mechanism of ricin-induced apoptosis in human cervical cancer cells. Biochem. Pharmacol. 69(5), 855-865.

105. Korcheva V., Wong J., Corless C., Iordanov M., Magun B. 2005. Administration of ricin induces a severe inflammatory response via nonredundant stimulation of

106. ERK, JNK, and P38 МАРК and provides a mouse model of hemolytic uremic syndrome. Am. J. Pathol. 166(1), 323-339.

107. Derijard В., Hibi M., Wu I.H., Barrett Т., Su В., Deng Т., Karin M., Davis R.J. 1994. JNK1: a protein kinase stimulated by UV light and Ha-Ras that binds and phosphorylates the c-Jun activation domain. Cell. 76(6), 1025-1037.

108. Liu Z.G., Baskaran R., Lea-Chou E.T., Wood L.D., Chen Y., Karin M., Wang J.Y. 1996. Three distinct signalling responses by murine fibroblasts to genotoxic stress. Nature. 384(6606), 273-276.

109. CavigelIi M., Li W.W., Lin A., Su В., Yoshioka K., Karin M. 1996. The tumor promoter arsenite stimulates AP-1 activity by inhibiting a JNK phosphatase. EMBOJ. 15(22), 6269-6279.

110. Galcheva-Gargova Z., Derijard В., Wu I.H., Davis R.J. 1994. An osmosensing signal transduction pathway in mammalian cells. Science. 265(5173), 806-808.

111. Kyriakis J.M., Banerjee P., Nikolakaki E., Dai Т., Rubie E.A., Ahmad M.F., Avruch J., Woodgett J.R. 1994. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature. 369(6476), 156-160.

112. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J., Davis R.J, Greenberg M.E. 1995. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science. 270(5240), 1326-1331.

113. Karin M., Liu Z., Zandi E. 1997. AP-1 function and regulation. Curr. Opin. Cell Biol 9(2), 240-246.

114. Thomson S., Mahadevan L.C., Clayton A.L. 1999. MAP kinase-mediated signalling to nucleosomes and immediate-early gene induction. Semin. Cell Dev. Biol. 10(2), 205-214.

115. Haas S., Kaina B. 1995. c-Fos is involved in the cellular defence against the genotoxic effect of UV radiation. Carcinogenesis. 16(5), 985-991.

116. Schreiber M., Baumann В., Cotten M., Angel P., Wagner E.F. 1995. Fos is an essential component of the mammalian UV response. EMBOJ. 14(21), 53385349.

117. MO.Tournier C., Hess P., Yang D.D., Xu J., Turner Т.К., Nimnual A., Bar-Sagi D., Jones S.N., Flavell R.A., Davis R.J. 2000. Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway. Science. 288(5467), 870874.

118. Kuida K., Haydar T.F., Kuan C.Y., Gu Y., Taya C., Karasuyama H., Su M.S., Rakic P., Flavell R.A. 1998. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94(3), 325-337.

119. Narayanan S., Surolia A., Karande A.A. 2004. Ribosome-inactivating protein and apoptosis: abrin causes cell death via mitochondrial pathway in Jurkat cells. Biochem. J. 377(Pt 1), 233-240.

120. Bras M., Queenan В., Susin S.A. 2005. Programmed cell death via mitochondria: different modes of dying. Biochemistry (Mosc). 70(2), 231-239.

121. Smith W.E., Kane A.V., Campbell S.T., Acheson D.W., Cochran B.H., Thorpe C.M. 2003. Shiga toxin 1 triggers a ribotoxic stress response leading to p38 and

122. Colpoys W.E., Cochran B.H., Carducci T.M., Thorpe C.M. 2005. Shiga toxins activate translational regulation pathways in intestinal epithelial cells. Cell Signal. 17(7), 891-899.

123. Kyriakis J.M., Avruch J. 2001. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation. Physiol. Rev. 81(2), 807-869.

124. Johnson G.L., Lapadat R. 2002. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science. 298(5600), 1911-1912.

125. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. 1993. Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim. Biophys. Acta. 1154(3-4), 237-282.

126. Peumans W.J., Van Damme E.J. 1995. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiol. 109(2), 347-352.

127. Kumar M.A., Timm D.E., Neet K.E., Owen W.G, Peumans W.J., Rao A.G. 1993. Characterization of the lectin from the bulbs of Eranthis hyemalis (winter aconite) as an inhibitor of protein synthesis. J. Biol. Chem. 268(33), 25176-25183.

128. Kreitman R.J. 1999. Immunotoxins in cancer therapy. Curr. Opin. Immunol. 11(5), 570-578.

129. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. 2003. Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. Semin. Oncol. 30(4), 545-557.

130. Frankel A.E., Kreitman R.J. 2005. CLL immunotoxins. Leuk. Res. 29(9), 985986.

131. Jain R.K. 1996. Delivery of molecular medicine to solid tumors. Science. 271(5252), 1079-1080.

132. Beaumelle В., Taupiac M.P., Lord J.M., Roberts L.M. 1997. Ricin A chain can transport unfolded dihydrofolate reductase into the cytosol. J. Biol. Chem. 272(35), 22097-220102.

133. Smith D.C., Lord J.M., Roberts L.M., Tartour E., Johannes L. 2002.1st class ticket to class I: protein toxins as pathfinders for antigen presentation. Traffic. 3(10), 697-704.

134. Tartour E„ Ciree A., Haicheur N. Benchetrit F„ Fridman W.H. 2000. Development of non-live vectors and procedures (liposomes, pseudo-viral particles, toxin, beads, adjuvantsellipsis) as tools for cancer vaccines. Immunol Lett. 74(1), 45-50.

135. Bocci V. Mistletoe (Viscum album) lectins as cytokine inducers and immunoadjuvant in tumor therapy. A review. 1993. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 7(1), 1-6.

136. Hajto Т., Hostanska K., Gabius H.J. 1989. Modulatory potency of the beta-galactoside-specific lectin from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in vivo in rabbits and patients. Cancer Res. 49(17), 4803-4808.

137. Schumacher U., Feldhaus S., Mengs U. 2000. Recombinant mistletoe lectin (rML) is successful in treating human ovarian cancer cells transplanted into severe combined immunodeficient (SCID) mice. Cancer Lett. 150(2), 171-175.

138. Weber K., Mengs U., Schwarz Т., Hajto Т., Hostanska K., Allen T.R., Weyhenmeyer R., Lentzen H. 1998. Effects of a standardized mistletoepreparation on metastatic В16 melanoma colonization in murine lungs. Arzneimittelforschung. 48(5), 497-502.

139. Franz H. Mistletoe lectins and their A and В chains. 1986. Oncology.43 Suppl. 1, 23-34.

140. Fritz P., Dippon J., Kierschke Т., Siegle I., Mohring A, Moisa A., Murdter Т.Е. 2004. Impact of mistletoe lectin binding in breast cancer. Anticancer Res. 24(2C), 1187-1192.

141. Stirpe F., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. 1982. Action of viscumin, a toxic lectin from mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem. 257(22), 13271-13277.

142. Ribereau-Gayon G., Jung M.L., Frantz M, Anton R. 1997. Modulation of cytotoxicity and enhancement of cytokine release induced by Viscum album L. extracts or mistletoe lectins. Anticancer Drugs. 8 Suppl. 1, S3-8.

143. Barbieri L., Ciani M., Girbes Т., Liu W.Y., Van Damme E.J., Peumans W.J., Stirpe F. 2004. Enzymatic activity of toxic and non-toxic type 2 ribosome-inactivating proteins. FEBS Lett. 563(1-3), 219-222.

144. GIeeson P. A., Hughes R.C. 1985. Binding and uptake of the toxic lectin modeccin by baby hamster kidney (BHK) cells. Isolation of mutants defective in the internalization of modeccin. J. Cell Sci. 76,283-301.

145. Olsnes S, Sandvig K, Eiklid K, Pihl A. 1978. Properties and action mechanism of the toxic lectin modeccin: interaction with cell lines resistant to modeccin, abrin, and ricin. J. Supramol. Struct. 9(1), 15-25.

146. Wang B.Z., Zou W.G., Liu W.Y., Liu X.Y. 2006. The lower cytotoxicity of cinnamomin (a type II RIP) is due to its B-chain. Arch. Biochem. Biophys. 451(1), 91-96.

147. Logemann J., Schell J., Willmitzer L. 1987. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163(1), 16-20.

148. Huguet Soler M., Stoeva S., Schwamborn C., Wilhelm S„ Stiefel Т., Voelter W. 1996. Complete amino acid sequence of the A chain of mistletoe lectin I. FEBS Lett. 399(1-2), 153-157.

149. Soler M.H., Stoeva S., Voelter W. 1998. Complete amino acid sequence of the В chain of mistletoe lectin I. Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(3), 596-601.

150. Lin Z., Zhu Y., Cui X., Li H. 1995. Single-site polymerase chain reaction through single oligonucleotide ligation. Anal. Biochem. 231(2), 449-452.

151. Frohman M.A., Dush M.K., Martin G.R. 1988. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85(23), 8998-9002.

152. Dellaporta S.L., Wood J. and Hicks J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1,19-21.

153. Diviacco S., Norio P., Zentilin L., Menzo S., Clementi M., Biamonti G., Riva S., Falaschi A., Giacca M. 1992. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates. Gene. 122(2), 313-320.

154. Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Егорова С.Г., Колесанова Е.Ф., Агапов И.И., Солопова О.С., Зайцев И.З., Тоневицкий А.Г. 2000. Разворачивание А-субъединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта токсина. Молекуляр. биология 34(1), 152-159.

155. Eck J., Langer М., Mockel В., Baur A., Rothe М., Zinke Н., Lentzen Н. 1999. Cloning of mistletoe lectin gene and characterization of the recombinant A-chain. Eur. J. Biochem. 264,775-784.

156. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Palmer R.A., Niwa H., Pflueller U., Eck J., Lentzen H., Agapov I.I., Kirpichnikov M.P. 1998. Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. FEBSLett. 432, 367-370.

157. Niwa H., Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Saward S., Pftiller U., Palmer R.A. 2003. Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexed with galactose. Eur. J. Biochem. 270(13), 27392749.

158. Roberts L.M., Lord J.M. 2004. Ribosome-inactivating proteins: entry into mammalian cells and intracellular routing. Mini Rev. Med. Chem. 4(5), 505-512.

159. Simpson J.C., Lord J.M., Roberts L.M. 1995. Point mutation in hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that P250 plays a key role in membrane translocation. Eur. J. Biochem. 232,458-463.

160. Jolliffe N.A., Di Cola A., Marsden C.J., Lord J.M., Ceriotti A., Frigerio L., Roberts L.M. 2006. The N-terminal ricin propeptide influences the fate of ricin A-chain in tobacco protoplasts. J. Biol. Chem. 281(33), 23377-23385.

161. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340(4),783-795.

162. Messing J. 2001. Do plants have more genes than humans? Trends Plant Sci. 6(5), 195-196.195.0'Hare M., Roberts L.M., Thorpe P.E., Watson G.J., Prior В., Lord J.M. 1987. Expression of ricin A chain in Escherichia coli. FEBS Lett. 216(1), 73-78.

163. Hegde R., Podder S.K. 1992. Studies on the variants of the protein toxins ricin and abrin. Eur. J. Biochem. 204(1), 155-164.

164. Evensen G., Mathiesen A., Sundan A. 1991. Direct molecular cloning and expression of two distinct abrin A-chains. J. Biol. Chem. 266(11), 6848-6852.

165. Yang Q., Liu R.S., Gong Z.Z., Liu W.Y. 2002. Studies of three genes encoding Cinnamomin (a type II RIP) isolated from the seeds of camphor tree and their expression patterns. Gem. 284(1-2), 215-223.

166. Wacker R., Stoeva S., Pfuller K., Pfuller U., Voelter W. 2004. Complete structure determination of the A chain of mistletoe lectin III from Viscum album L. ssp. album. J. Pept. Sci. 10,138-148.

167. Wacker R., Stoeva S., Betzel C., Voelter W. 2005. Complete structure determination of N-acetyl-D-galactosamine-binding mistletoe lectin-3 from Viscum album L. album. J. Pept. Sci. 11,289-302.

168. Hegde R., Podder S.K. 1997. A- and B-subunit variant distribution in the holoprotein variants of protein toxin abrin: variants of abrins I and III have constant toxic A subunits and variant lectin В subunits. Arch. Biochem. Biophys. 344(1), 75-84.

169. Lin Q., Chen Z.C., Antoniw J.F., White R.F. 1991. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding the anti-viral protein from Phytolacca americana. Plant. Mol. Biol. 17(4), 609-614.

170. Richardson P.T., Hussain K„ Woodland H.R., Lord J.M., Roberts L.M. 1991. The effects of N-glycosylation on the lectin activity of recombinant ricin В chain. Carbohydr Res. 213,19-25.

171. Eck J., Langer M., Mockel В., Witthohn K., Zinke H., Lentzen H. 1999. Characterization of recombinant and plant-derived mistletoe lectin and their B-chains. Eur. J. Biochem. 265, 788-797.

172. Певзнер И.Б., Агапов И.И., Пфюллер У., Пфюллер К., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Тоневицкий А.Г., Кирпичников М.П. 2005. Клонирование и экспрессия В-субъединицы токсического лектина омелы III. Биохимия. 70, 378-389.

173. Hussain K., Bowler C., Roberts L.M., Lord J.M. 1989. Expression of ricin В chain in Escherichia coli. FEBSLett. 244, 383-387.

174. Wu J.H., Singh Т., Неф A., Wu A.M. 2005. Carbohydrate recognition factors of the lectin domains present in the Ricinus communis toxic protein (ricin). Biochimie. 88, 201-217.

175. Tahirov Т.Н., Lu Т.Н., Liaw Y.C., Chen Y.L., Lin J.Y. 1995. Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. J. Mol. Biol. 250,354-367.

176. Chambery A., Di Maro A., Monti M.M., Stirpe F., Parente A. 2004. Volkensin from Adenia volkensii Harms (kilyambiti plant), a type 2 ribosome-inactivating protein. Eur. J. Biochem. 271,108-117.