Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков из ZOANTHUS тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Плетнева, Надежда Владимировна

• Плетнева, Надежда Владимировна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Плетнева, Надежда Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свойства, структура и применение флуоресцентных белков

1.2. Разнообразие структур хромофоров

1.2.1. Группа хромофоров I (диапазон эмиссии ~445-538 нм)

1.2.2. Группа хромофоров II (диапазон эмиссии ~ 570-655 нм)

1.2.3. Группа хромофоров П1 (посттрансляционная фрагментация основной цепи)

1.2.4. Группа хромофоров IV (посттрансляционная модификация первого остатка хромофора)

ГЛАВА 2. КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zRFP574 (Zoanthus sp2).

2.1. Пространственная структура.

2.2. Структура хромофора

ГЛАВА 3. ЗЕЛЁНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zGFP506 {Zoanthus sp.)

3.1. Пространственная структура.

3.2. Структура хромофора

ГЛАВА 4 МУТАНТНЫЙ ВАРИАНТ zGFP506N66D

ГЛАВА 5. ЖЁЛТЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, zYFP538 {Zoanthus sp.)

5.1. Пространственная структура.

5.2. Структура хромофора

5.3. Мутантные варианты

ГЛАВА 6. СТУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ.

ГЛАВА 7 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

7.1. Выделение, очистка и кристаллизация белков.

7.2 Определение структуры, кристаллографическое уточнение.

7.3 Материалы, оборудование, программное обеспечение.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков из ZOANTHUS»

Клонирование в 1992г гена зелёного флуоресцентного белка (green fluorescent protein - GFP) и, позднее, других GFP подобных белков положило начало новой области исследований в клеточной биологии, биотехнологии и биомедицине, связанной с практическим использованием этих белков в качестве маркеров и генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров (Глава 1. "Обзор литературы"). В большинстве случаев, практическое применение флуоресцентных белков требует разработки мономерных мутантных вариантов с эмиссией в дальне-красной области спектра, обладающих высоким квантовым выходом, высокой скоростью созревания хромофора и фотостабильностью. Молекулярный механизм формирования хромофора и роль его аминокислотного окружения, как ближайшего, так и дальнего, в проявлении спектральных свойств флуорофора полностью не ясны. В этой связи, важно понять каким образом особенности стереохимии белка определяют его основные свойства, включая характеристики цветового спектра и установить ключевые остатки ответственные за формирование структуры мономера и олигомеризацию белка. Эти знания необходимы для разработки рационального подхода по созданию улучшенных вариантов белков, удовлетворяющих требуемым критериям. Биологические функции и фотофизические свойства этих объектов строго взаимосвязаны с их структурами. Поэтому, важный фундамент для успешного решения этой задачи создают исследования пространственной организации GFP подобных белков. В этой связи, фундаментальный и прикладной интерес для дальнейшего развития этой области представляет детальное изучение пространственных структур флуорофоров и молекулярных процессов их посттрансляционной модификации с целью направленного воздействия на их фотофизические свойства.

Предметом настоящей диссертационной работы являются рентгеноструктурные исследования на атомном уровне пространственных структур красного (zRFP574), зелёного (zGFP506) и жёлтого (zYFP538) флуорецентных белков из морского бутончатого полипа рода Zoanthus (семейство Zoanthids, класс Anthozoa; Рис. &) (Matz et cit., 1999; Labas et al., 2002), a также генно-инженерного варианта zGFP506 с заменой Asn66Asp (zGFP506JN66D).

Рис. & Отдельные разновидности морских бутон чаты х полипов рода Zoanthus (район Карибского моря). Полипы имеют животное происхождение, развиваются в симбиозе с микроскопическими одноклеточными фитопланктонами (Zooxanthellae) и образуют плотно заселенные колонии, прикрепляющиеся на общем основании к твердой основе. Полипы перерабатывают органическую субстанцию из водной среды, а также питаются морскими организмами (мелкие черви, креветки, яйца морского ежа и т.д.) Симбиотические растительные фитопланктоны превращают энергию солнца в пищу путем фотосинтеза.

Объекты исследования (231 аминокислотный остаток) с хромофоробразующими последовательностями в позиции 66-68, Asp-Tyr-Gly (zRFP574), Asn-Tyr-Gly (zGFP506) и Lys-Tyr-Gly (zYFP538), характеризуются резко отличающимися спектральными характеристиками с максимумами возбуждения/эмиссии 553/574 нм, 492/506 им, 528/538 нм соответственно (Matz et а!., 1999; Gurskaya et al., 2001a; Labas et al., 2002; Yanushevich et al., 2003). При общей величине -78% идентичности аминокислотных последовательностей, выбранные белки являются прекрасными моделями для выявления стереохимических факторов, ответственных за переход от зелёного к жёлтому и затем к красному излучающим состояниям. Исследование этой проблемы явилось одной из задач диссертационной работы, решение которой базировалось на результатах начального этапа по установлению полной пространственной структуры объектов исследования, детального изучения структуры хромофора и хромофор содержащей области. При этом, изучение пространственной структуры зелёного флуоресцентного белка zGFP506 и его мутантного варианта zGFP506N66D с заменой первого остатка хромофора Asn66Asp было выполнено для доказательства сделанного вывода относительно фактора, инициирующего посттрансляционную модификацию хромофора за пределы стандартной "зелёной" формы у красного флуоресцентного белка zRFP574. Для аналогичной цели, было проведено спектральное изучение серии генно-инженерных мутантов zYFP538 по сайтам 44 и 69.

Олигомеризация природных флуоресцентных белков представляет собой серьёзную биотехнологическую проблему, существенно ограничивающую их применение. В этой связи, с целью выявления остатков ответственных за тетрамеризацию исследуемых объектов, в работе был сделан детальный анализ аминокислотной композиции на контактных поверхностях внутри белковых тетрамеров и на его основе предложены аминокислотные замены, приводящие к наиболее вероятному разрушению межмономерных интерфейсов.

Исследуемые белки обладают уникальными спектральными характеристиками и их мономерные варианты были бы широко востребованы для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Можно надеяться, что полученные результаты окажутся полезными для понимания молекулярного механизма формирования хромофоров данной группы белков и разработки их мономерных вариантов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Плетнева, Надежда Владимировна

выводы

1. Методом рентгенеструктурного анализа определена пространственная структура красного флуоресцентного белка гЛРР574 дикого типа при разрешениях 2.4А и 1.51 А. Показано, что пространственная организация мономера гКБР574 представляет собой р-бочонок, образованный 11-ю р-сегментами, с центральной а-спиралью содержащий хромофор. Хромофор гКРР574 представляет собой планарную бициклическую систему сопряжённых двойных связей, сформированную из пятичленного имидазолинонового и фенольного циклов. Установлено, что продолжение постгрансляционной модификации хромофора за пределы стандартной "зелёной" формы сопровождается декарбоксилированием боковой цепи первого остатка хромофоробразующей последовательности Аэрбб. Дополнительная постгрансляционная стадия приводит к расширению сопряженной тг-электронной системы и, как следствие, к сдвигу максимумов длин волн возбуждения и эмиссии в красную область спектра. Сделан вывод, что причиной инициирующей соответствующую цепь реакций является электростатический , конфликт между пространственно сближенными отрицательно заряженными боковыми цепями остатка Аэрбб хромофора и каталитического остатка С1и221.

2. Для выявления роли остатка 66 в формировании хромофора установлена пространственная структура зелёного флуоресцентного белка гСРР506 дикого типа разрешение 2.2А), а также его мутантного варианта гСРР506К66Б в переходной зелёной" (разрешение 2.4А) и зрелой "красной" (разрешение 2.2А) формах. В отличие от

2&РР574 боковая цепь первого остатка хромофора Авпбб в гОРР5С)6 остается модифицированной. Однако, замена Авпбб хромофора гОБР506 на отрицательно заряженный Аэрбб инициирует в мутантном варианте гСРР506К660 дополнительную цепь реакций, приводящих к декарбоксилированию боковой цепи Азрбб, аналогично

83 наблюдаемому у г11РР574. Полученные данные подтвердили сделанный вывод относительно инициирующей роли электростатических взаимодействий А5р66—01и221 в наблюдаемом эффекте.

3. Пространственная структура жёлтого флуоресцентного белка гУБР538 установлена при разрешении 1.8А. Хромофор гУРР538 представляет собой планарную трициклическую систему сопряжённых двойных связей. Помимо пятичленного имидазолинонового и фенольного (Туг67) циклов, характерных для стандартной бициклической "зелёной" формы, хромофор гУРР538 содержит дополнительный шестичленный тетрагидропиридиновый цикл. Сделан вывод, что энергетический конфликт положительно заряженной аминогруппы природной боковой цепи остатка хромофорного Ьувбб с окружением гидрофобного кармана (11е44, Ьеи46, РЬе65, Ьеи204 и Ьеи219) является инициатором дополнительной посттрансляционной модификации, ведущей к фрагментации основной цепи с образованием третьего шестичленного гетероцикла. Следствием является формирование "жёлтого" хромофора с расширенной сопряженной тг-электронной системой. Результаты спектральных исследований целенаправленно сконструированных мутантов гУРР53811е44А1а, 2УРР53811е44А1аА8р69Азп и гУРР538Ие448ег находятся в полном согласии с этим выводом.

4. Структуры и спектральные характеристики хромофоров исследованных объектов (общая аминокислотная идентичность 72%) определяются прежде всего хромофоробразующей аминокислотной последовательностью и стереохимией ближайшего аминокислотного окружения хромофоров.

NYG JCYG DYG a Ь С

Рис. S Химические формулы хромофоров зелёного, zGFP506 (а), жёлтого, zYFP538 (б) и красного, zRFP574 (с) флуоресцентных белков (Zoanthus) по данным рентгеноструктурного анализа (с указанием максимумов длин волн в спектрах возбуждения и эмиссии).

По данным рентгеноструктурного анализа структура хромофора zGFP506 (кодируемого последовательностью Asn66-Tyr67-Gly68) представляет собой планарную бициклическую систему сопряженных двойных связей, состоящую из пятичленного имидазолинонового цикла и фенольного (п-оксибензилиденового) кольца Туг67 (Рис. $а) Первый остаток Asn66 хромофора характеризуется интактной боковой цепью, sp3 гибридизацией Са атома и транс- конфигурацией предшествующей пептидной связи.

Хромофор zYFP538 (кодируемый последовательностью Lys66-Tyr67-Gly68) имеет планарную трициклическую структуру, состоящую из стандартного "зелёного" бициклического ядра и дополнительного шестичленного тетрагидропиридинового цикла, предположительно образованного (по механизму Remington et al. 2005) в результате реакции трансиминирования атома N^ боковой цепи остатка Lys66 с реакционноспособной ацилиминной связью Ca=N(66) переходного состояния (Рис.$Ь). Образование хромофора сопровождается фрагментацией основной цепи по связи Ca-N(66).

Структура хромофора zRFP574 (кодируемого последовательностью Asp66-Tyr67-Gly68) состоит из характерного для "зелёной" формы бициклического ядра с модифицированным первым остатком Asp66 (Рис.$с). Модифицированный Asp66 zRFP574, в резком отличии от соответствующего Asn66 в zGFP506, характеризуется декарбоксилированной боковой цепью, sp2 гибридизацией Са атома и цис- конфигурацией предшествующей пептидной связи.

5. Изучена стереохимическая композиция контактирующих поверхностей между мономерными субъединицами на двух интерфейсах (ИФ1 и ИФ2) в тетрамерной упаковке исследуемых флуоресцентных белков. Интерфейс ИФ1 стабилизируется, главным образом, центральным гидрофобным кластером, образованным плотно упакованными боковыми цепями консервативных остатков из 8-10 боковых цепей. Интерфейс ИФ2 стабилизируется, в основном, сетью из шести консервативных водородных связей и десяти солевых мостиков. Предполагается, что рационально выбранная частичная замена гидрофобных остатков центрального кластера на • гидрофильные на ИФ1, совмещенная с мутациями Cysl49Ser и Lys/Arg на Glu/Asp (или Glu/Asp на Lys/Arg) на ИФ2 приведет к разрушению интерфейсов.

6. Полученные в настоящей работе результаты вносят вклад в создание общей структурной базы для изучения механизмов формирования хромофоров и разработки соответствующих мономерных вариантов флуоресцентных белков для технологий многоцветного мечения и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

7. Результаты диссертационной работы представлены в трех статьях и трёх тезисах на конференциях и симпозиумах:

Статьи:

1. Pletneva N, Pletnev S, Tikhonova T, Popov V, Martynov V. & Pletnev V. (2006) "Crystal structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore." Acta Cryst. D62:527-532.

2. H. В. Плетнева, С. В. Плетнев, Д. M. Чудаков, Т. В.Тихонова В. О. Попов, В. И.

Мартынов, А. Влодавер, 3. Даутер и В. 3. Плетнев (2007) Пространственная структура жёлтого флуоресцентного белка zYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 Â. Биоорганическая химия, 33(4) (принята к публикации).

3. Pletneva N, Pletnev V, Tikhonova T, Pakhomov A, Popov V, Martynov V, Wlodawer A,

Dauter Z & Pletnev S. (2007) Refined crystal structures of red and green fluorescent proteins from button polyp Zoanthus Acta Cryst. D63 (accepted).

Конференции/Симпозиумы:

1. Плетнева НВ, Тихонова ТВ, Мартынов ВИ, Плетнёв ВЗ "Новая постгрансляционная модификация хромофора белка GFP-семейства. Рентгеноструктурные исследования белка Z2FP574 из Zoanthus sp. на атомном уровне" VIII чтения, посвященные памяти академика Ю. А. Овчинникова, г. Москва-Пущино, 25-27 октября 2006г.,

2. Плетнева НВ, Тихонова ТВ, Пахомов АА, Мартынов ВИ, Плетнёв ВЗ "Структуры хромофоров зелёного и красного флуоресцентных белков из морского полипа {Zoanthus)", III Российский Симпозиум "Белки и Пептиды", г. Пущино, 16-21 сентября 2007г.

3. Плетнева НВ, Тихонова ТВ, Чудаков ДМ, Мартынов ВИ, Плетнев ВЗ

Рентгеноструктурные исследования флуоресцентных белков семейства Zoanthus sp." XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии, г. Москва, 23-28 сентября 2007г.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Плетнева, Надежда Владимировна, 2008 год

1. Ando R, Mizuno H, & Miyawaki A. (2004) "Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting" Science, 306:1370-1373.

2. Andersen M, Wahl MC, Stiel AC, Grater F, Scafer LV, Trowitzsch S, Weber G, Eggeling C, Grubmuller H, Hell SW & Jakobs S. (2005) "Structure and mechanism of reversible photoswitch of a fluorescent protein". Proc. Natl. Acad. Sci. 120:13070-13074.

3. Barondeau DP, Putnam CD, Kassman CJ, Tainer JA & Getzoff E. (2003) " Mechanism and energetics of green fluorescent protein chromophore synthesis revealed by trapped intermediate structures". Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 12111-12116.

4. Barondeau DP, Kassmann CJ, Tainer JA & Getzoff ED (2006) "Understanding GFP posttranslational chemistry: structures of designed variants that achieve backbone fragmentation, hydrolysis, and decarboxylation." J. Am. Chem. Soc. 128:4685 4693.

5. Burmeister WP (2000) "Structural changes in a cryo-cooled protein crystal owing to radiation damage." Acta Cryst. D56:328-341.

6. Cambridge Soft Corporation. http://w\vw. camsoft. com.

7. Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Stainbach, PA, Baird GS, Zacharias DA & Tsien RY. (2002) "A monomelic red fluorescent protein". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:7877-7882.

8. Chalfie M & Kain S. (1998) "Green Flourescent Protein: Properties, Applications, and Protocols". New York: Wiley-Liss, pp. 385.

9. Chiang CF, Okou DT, Griffin TB, Verret CR &Williams MN (2001) "Green fluorescent proteinrendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions" Arch Biochem1. Biophys. 394(2):229-235.

10. Chudakov DM, Feofanov AV, Mudrik NN, Lukyanov S & Lukyanov KA. (2003) "Chromophore environment provides clue to 'kindling fluorescent protein' riddle". J. Biol. Chem., 278:7215-7219.

11. Chudakov DM, Lukyanov S. and Lukyanov KA. (2005) "Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging". Trends in Biotechnology, 23:605-613.

12. Collaborative Computational Project Number 4 (1994). "The CCP4 suite: programs for protein crystallography." Acta. Cryst. D50(Pt5):760-763.

13. Cubbit AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gros LA & Tsien RY. (1995) "Understanding, improving and using green fluorescent proteins". Trends Biochem. Sci., 20:448-455.

14. DeLano WL (2002). http://www.pymol.org.

15. Ehrig T, O'Kane DJ & Prendergast FG. (1995) "Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. " FEBS Let. 367:163-166.

16. Emsley P & Cowtan K (2004). "Coot: model-building tools for molecular graphics." Acta Cryst. D60:2126-2132.

17. Evans SV (1993) " SETOR: hardware-lighted three-dimensional solid model representations of macromolecules." J. Mol. Graphics, 11:134-138.

18. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM,

19. Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA & Chudakov DM (2006) "Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein." EMBO Rep. 7:1006-1012.

20. Fang Y, Dery O, Haugwitz M, Turpin P, Kain SR (2006) "Practical considerations for use of reef coral fluorescent proteins in mammalian cells: applications in fluorescence microscopy and flow cytometry." Methods Biochem. Anal. 47:339-359.

21. Gurskaya NG, Savitsky AP, Yanushevich YG, Lukyanov SA, & Lukyanov KA (2001a) "Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis." BMC Biochemistry, 2:6.

22. Gurskaya NG, Fradkov AF, Terskikh A, Matz MV, Labas YA. Martynov VI, Yanushevich YG, Lukyanov KA, & Lukyanov SA. (2001b) "GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins". FEBS Letters, 507:16-21.

23. Heim R, Prasher DC & Tsien RY. (1994) "Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein." Biochemistry, 91:12501-12504.

24. Heim R & Tsien RY "Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer." (1996) Curr. Biol. 6:178-182.

25. Jung G, Wiehler J & Zumbusch A (2005) "The photophysics of green fluorescent protein:influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222." Biophys. J. 88, 1932-1947.

26. Karasawa S, Araki T, Yamamoto-Hino M & Miyawaki A (2003) "A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomelic version for use in fluorescent labeling." J Biol Chem. 278:34167-34171.

27. Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H & Miyawaki A (2004) "Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer." Biochem. J. 381:307-312.

28. Kuner T. & Augustine GJ. (2000) "A genetically encoded ratiometric indicator for chloride: capturing chloride transients in cultured hippocampal neurons." Neuron, 27:447-459.

29. Martynov VI, Maksimov B I, Martynova NY, Pakhomov AA, Gurskaya NG & Lukyanov SA (2003) "A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins." J. Biol. Chem. 278:46288-46292.

30. Matano, Y., Nomura, H. & Suzuki, H. (2000) "Stabilized bismuthonium ylides bearing a highly cross-conjugated ylidic carbon atom: synthesis, structures, and reactions" J. Organomet. Chem. 611, 89-99.

31. Matz MA, Fradkov Y, Labas A, Savitsky A, Zaraisky M. Markelov & Lukyanov S, 1999. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology, 17:969-973.

32. McDonald IK, Thornton JM. (1994) "Satisfying hydrogen bonding potential." J. Mol. Biol. 238:777-793.

33. Mizuno H, Sawano A, Eli P, Hama H & Miyawaki A (2001) "Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer." Biochemistry 40:2502-2510.

34. Mizuno H, Mal TP, Tong Kl, Ando R, Furuta T, Ikura M & Miyawaki A (2003) "Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein." Mol. Cell 12:1051-1058.

35. Murshudov GN, Vagin AA & Dodson EJ (1997) "Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method." Acta Cryst. D53:240-255.

36. Nienhaus K, Nienhaus GU, Weidenmann J & Nar H. (2005) "Srtuctural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:9156-9159.

37. Oshimi K, Kubo K, Kawasaki A, Maekawa K, Igarashi T & Sakurai T (2002) "Oxidative cyclization of aryl-substituted (Z)-N-acetyl-a-dehydroalanines having a dialkylamino group, in the presence of dioxygen" Tetrahedron Letters, 43, 3291—3294.

38. Otwinowski Z & Minor W (1997) "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.", Methods in Enzymology, Macromolecular Crystallography, part A (Carter CW, Jr. & Sweet RM, Eds.), Academic Press. V276:307-326.

39. Pakhomov AA, Martynova NY, Gurskaya NG, Balashova TA & Martynov VI (2004)

40. Photoconversion of the chromophore of a fluorescent protein from Dendronephthya sp." Biochemistry (Moscow) 69, 901-908.

41. Pakhomov AA, Pletneva NV, Balashova TA & Martynov VI. (2006) "Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea." Biochemistry 45, 7256-7264.

42. Pakhomov AA & Martynov VI. (2007) "Chromophore Aspartate Oxidation-Decarboxylation in' the Green-to-Red Conversion of a Fluorescent Protein from Zoanthns sp2" Biochemistry. 46 (accepted).

43. Palmer AE & Tsien RY. (2006) "Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators". Nature protocols, 1:1057-1065

44. Petersen J, Wilmann PG, Beddoe T, Oakley AJ, Devenish RJ, Prescott M & Rossjohn J.(2003) "The 2.0-Â Crysatl Structure of eqFP611, a Fea Red Fluorescent Protein from the Sea Anemone Entacmaea quadricolor". J. Biol. Chem., 278:44626-44631.

45. Perrakis A, Sixma TK, Wilson KS & Lamzin VS (1997) "wARP: improvement and extension of crystallographic phases by weighted averaging of multiple-refined dummy atomic models." Acta Cryst., D53:448—455.

46. Pilati T (1987) "Structure of (Z)-3-methoxycarbonylamino-N,N-dimethyl-2-phenylpropenamide" Acta Cryst. C43.-2432-2434.

47. Prescott M, Ling M, Beddoe T, Oakley AJ, Dove S, Hoegh-Guldberg O, Devenish RJ, Rossjohn J (2003) "The 2.2 a crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation." Structure 11:275-284.

48. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'Leary S, Kallio K, Chudakov DM & Remington SJ (2005) "Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution." Biochemistry, 44:5774 -5787.

49. Ravelli RB & Garman EF (2006) "Radiation damage in macromolecular cryocrystallography." Curr. Opin. Struct. Biol. 16:624-629.

50. Rekas A, Alattia JR, Nagai T, Miyawaki A. (2002) "Crystal structure of Venus, a Yellow Fluorescent Protein with Improved Maturation and Reduced Environmental Sensitivity". J. Biol. Chem., 277:50573-50578.

51. Remington S J, Wachter RM, Yarbrough DK, Branchaud B, Anderson DC, Kallio K & Lukyanov KA (2005) "zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore." Biochemistry, 44:202-212.

52. Remington SJ. (2006) "Fluorescent proteins: maturation, photochemistiy and photophysics", Curr. Opin. Struct. Biol. 16:1-8.

53. Rizzo MA., Springer GH., Granada B., Piston DW. (2004) "An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET", Nat Biotechnol., 22(4)-.445-449.

54. Sack JS (1988) "CHAIN a crystallographic modeling program." J. Mol. Graphics, 6, 224-225.

55. Salih A, Larkum A, Cox G, Kuhl M. & Hoegh-Guldberg O. (2000) "Fluorescent pigments in corals are photoprotective ". Nature, 408:850-853.

56. Sato M, Ozawa T, Inukai K, Asano T & Umezawa Y. (2002) "Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells" Nat. biotechnol. 20:287-294.

57. Schnell R, Sandalova T, Hellman U, Lindqvist Y & Schneider G (2005) "Siroheme- and Fe4-S4.-dependent NirA from Mycobacterium tuberculosis is a sulfite reductase with a covalent Cys-Tyrbond in the active site." J. Biol. Chem. 280(29):27319-27328.

58. Schwede TF, Retey J & Schulz GE. (1999) "Crystal structure of Histidine Ammonia-Liase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile". Biochemistry, 38:5355-5361.

59. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE & Tsien RY (2004) "Improved monomelic red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein." Nat Biotechnol. 22:1567-1572.

60. Shu X, Shaner NC, Yabrough CA, Tsien RY & Remington SJ. (2006) "Novel chromophores and buried charges control color in mFruits". Biochemistry, 45:9639-9647.

61. Sheldrick GM & Schneider TR (1997) "SHELXL:high resolution refinement. Methods in Enzymology (eds. by C. W. Carter, Jr. & R. M. Sweet) San Diego: Academic Press. V277:319-343.

62. Tsien RY (1998) "The green fluorescent protein:" Ann. Rev. Biochem. 67:509-544

63. Verkhusha W & Lukyanov KK (2004a) "The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins." Nat. Biotechnol. 22:289-296.

64. Verkhusha W, Chudakov DM, Gurskaya NG, Lukyanov S & Lukyanov K. (2004b) "Common pathway for the Red Formation in Fluorescent Proteins and Chromoproteins". Chemistry & Biology, 11:845-854.

65. Wachter RM, King BA, Heim R, Kallio, K, Tsein RY, Boxer SG & Remington SJ. (1997) "Crystal structure and photodynamic behavior of the blue emission variant Y66H/Y145F of green fluorescent protein". Biochemistry, 36:9759-9765.

66. Wachter RM, Esliger MA, Kallio K, Hanson GT & Remington SJ. (1998) " Structural basis of spectral shifts in yellow-emission variants of green fluorescent protein "Structure, 6:12671277.

67. Wall MA, Socolich M & Ranganathan R (2000) "The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed." Nat. Struct. Biol. 7:1133-1138.

68. Wang, S., Smith, S. C. (2007) " Mechanistic aspects of proton chain transfer in the green fluorescent protein. Part II. A comparison of minimal quantum chemical models" Phys. Chem. Chem. Phys., 9(4):452-458.

69. Wallace AC, Laskowski RA, Thornton JM. (1995) "LIGPLOT: A program to generate schematic diagrams of protein-ligand interactions." Protein Engin. 8:127-134.

70. Whittaker JW (2003) "Free radical catalysis by galactose oxidase." Chem. Rev. 103, 2347-2363.

71. Wiedenmann J, Ivanchenko S, Oswald F, Schmitt F, Rocker C, Salih A, Spindler KD &

72. Nienhaus GU (2004) "EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:15905-15910.

73. Wood TI, Barondeau DP, Hitomi C, Kassmann CJ, Tainer JA & Getzoff ED (2005) "Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis." Biochemistry 44:16211-16220.

74. Yanushevich YG, Gurskaya NG, Staroverov DB, Lukyanov SA & Lukyanov KA (2003) "A natural fluorescent protein that changes its fluorescence" Rus. Bioorg. Chem. 29, 325-329.

75. Yampolsky IV, Remington SJ, Martynov VI, Potapov VK, Lukyanov S. & Lukyanov K. A. (2005) "Synthesis and properties of the chromophore os asFP595 chromoprotein from Anemonia Sulcata " Biochemistry 44, 5788-5793

76. Yang F, Moss LG, & Phillips GN (1996) "The molecular structure of green fluorescent protein" Nature Biotechnol. 14, 1246-1251

77. Зубова НН, Булавина АЮ и Савицкий АП. (2003). «Спектральные и физико-химические свойства зелёного (ОРР) и красного (с1гКР583) флуоресцирующих белков", Успехи биол. хим. 43:163-224.

78. Зубова НН и Савицкий АП. (2005) «Молекулярные клеточные сенсоры на основе цветных флуоресцирующих белков». Успехи биол. хим., 45:1-66.98:462-467.4772.