Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Мишин, Александр Сергеевич

• Мишин, Александр Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мишин, Александр Сергеевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

T.I. Флуоресцентный белок avGFP и его свойства 7 I.I. 1. Аминокислотные замены, влияющие на экспрессию avGFP

1.1.2. avGFP дикого типа и другие его варианты с 13 протонированным хромофором

1.1.3. Варианты avGFP с анионным хромофором

1.1.4. Варианты avGFP с флуоресценцией в синей и голубой 18 областях спектра

1.1.5. Варианты avGFP с флуоресценцией в желтой области 21 спектра

1.1.6.Фотоконверсия GFP в бескислородных условиях 24 I.II Флуоресцентные белки с хромофором, отличающимся от GFP

1.11.1. Красный флуоресцентный белок DsRed и его варианты

1.11.2. Флуоресцентные белки с DsRed-подобным 34 предшественником хромофора.

I.II.3 Красный фотоактивируемый флуоресцентный белок Kaede

I.1 II. Функциональное значение, эволюция и разнообразие GFP- 39 подобных белков

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра»

Первый представитель семейства GFP-подобных белков - avGFP - был выделен из гидромедузы Aequorea victoria [140, 100]. Однако качественный скачок в исследовании флуоресцентных белков наступил много позднее, после 1992 года, когда удалось клонировать этот ген [82]. С этого момента интерес к флуоресцентным белкам не ослабевает. Отличительным, и наиболее важным для практического использования свойством avGFP и других известных GFP-подобных белков является способность к формированию хромофора вне зависимости от внешних ферментативных активностей, субстратов или вспомогательных кофакторов, за исключением молекулярного кислорода [44, 110]. Известно, что ген GFP содержит всю необходимую информацию для формирования функционально активного белка [56], что и определяет основную область применения флуоресцентных белков - в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки.

Менее 10 лет назад GFP-подобные белки были обнаружены в коралловых полипах класса Anthozoa, в том числе впервые - природные желтые и красные флуоресцентные белки [63], а также нефлуоресцентные хромобелки [58]. Представления о филогенетическом разнообразии флуоресцентных белков значительно расширились после их обнаружения в представителях ракообразных Copepoda (тип Членистоногие) [96], а недавно - в ланцетниках (тип Хородовые) [25] Цветовой диапазон известных в настоящее время флуоресцентных белков, как природных, так и созданных искусственно, перекрывает почти всю видимую область спектра, от синего до дальне-красного [19, 72,99]

В тоже время, для различных представителей флуоресцентных белков характерны индивидуальные особенности и ограничения при проведении реальных экспериментов, среди которых существенны олигомерное состояние, рН-зависимый характер флуоресценции, склонность к агрегации и т.д, что затрудняет трактовку результатов, полученных с использованием различных флуоресцентных белков. До сих пор актуальной остается задача получения новых спектральных вариантов наиболее широко используемого флуоресцентного белка avGFP. Особый научно-практический интерес представляет возможность создания флуоресцентных белков на основе avGFP с флуоресценцией в красной области спектра, получить которые до сих пор не удалось, ни смотря на более чем 15-летнюю историю его мутагенеза и множество накопленных данных о структурно-химических основах флуоресценции природных красных флуоресцентных белков.

При этом единственное описанное состояние avGFP, в котором этот белок проявляет способность к красной флуоресценции, - при фотоактивации под действием интенсивного облучения синим светом в условиях пониженного содержания кислорода [28, 93], - остается практически не изученным и нашло только ограниченное применение в экспериментах с анаэробными организмами. До настоящего времени не найдено объяснения необычному характеру спектра эмиссии флуоресценции avGFP при такой фотоактивации, чувствительности процесса к содержанию кислорода, и не предложено гипотез, объясняющих механизм данного явления.

Целью данной работы стало получение вариантов avGFP, способных к флуоресценции в красной области спектра, с применением современных данных о механизме образования хромофоров красных флуоресцентных белков, и исследование фотоконверсии avGFP и некоторых других ФБ в бескислородных условиях.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Мишин, Александр Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый экспериментальный подход к получению красных флуоресцентных белков путем внесения в зеленые флуоресцентные белки аминокислотных замен, стабилизирующих соединение-предшественник и катализирующих формирование хромофора красных флуоресцентных белков.

2. С применением предложенного подхода, на основе GFP впервые получен вариант, названный R10-3, с флуоресценцией и в зеленой, и в красной области спектра (максимум возбуждения 555 нм, максимум эмиссии 585 нм).

3. Для варианта R10-3 предложен новый неокислительный механизм образования хромофора с красной флуоресценцией, основанный на дегидратации остатка Ser65 с участием боковой цепи Asn68 в качестве катализатора.

4. Показана возможность применения R10-3 в качестве дополнительной двухцветной метки in vivo совместно с другими красными и зелеными флуоресцентными белками с использованием всего двух каналов измерения флуоресценции.

5. Показана широкая распространенность явления фотоактивации в бескислородных условиях с образованием формы, флуоресцирующей в красной области спектра (максимум возбуждения 525 нм, максимум эмиссии 600 нм) среди зеленых и голубых флуоресцентных белков различного происхождения. Показана необходимость наличия остатка тирозина в хромофоре для данного типа фотоактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе разработан новый экспериментальный подход к получению красных флуоресцентных белков из зеленых флуоресцентных белков путем внесения аминокислотных замен, стабилизирующих соединение-предшественник (протонированную форму зеленого хромофора) и катализирующих формирование DsRed-подобного хромофора красных флуоресцентных белков. С применением данного подхода удалось впервые получить вариант (R10-3) наиболее широко используемого флуоресцентного белка GFP медузы Aequorea Victoria, способный к флуоресценции в красной области спектра. Получение такого флуоресцентного белка с применением традиционных стратегий мутагенеза не удавалось не смотря на более чем 15 лет интенсивного исследования GFP. Полученные результаты являются прямым подтверждением одной из гипотез, объясняющих механизм образования DsRed-подобных хромофоров. В частности, подтверждена ключевая роль протонированной формы-предшественника хромофора с флуоресценцией в красной области спектра и роль аминокислотных замен, увеличивающих свободное пространство вокруг хромофора.

Группу полученных в работе вариантов avGFP, способных к флуоресценции в красной области спектра, объединяет ряд особенностей, таких как необычная для красных флуоресцентных белков кинетика функционального созревания, а также некоторые консервативные аминокислотные замены, не описанные ранее. Предложен новый, неокислительный механизм образования хромофора в полученных вариантах avGFP, в котором ключевое значение придается сочетанию остатков Ser65 и Asn68. Данный механизм лучше, чем опубликованные ранее, объясняет уникальные особенности новых вариантов avGFP.

В данной работе обнаружена неожиданно широкая распространенность малоизученного явления фотоактивации в бескислородных условиях с образованием формы, флуоресцирующей в красной области спектра, среди множества зеленых и голубых флуоресцентных белков различного происхождения. Способность к данному типу фотоактнвации, описанному первоначально лишь для некоторых вариантов avGFP, как оказалось, объединяет флуоресцентные белки, содержащие в составе хромофора остаток тирозина, вне зависимости от сходства их аминокислотных последовательностей или олигомерного состояния. Таким образом, данный тип фотоактивации оказался единственным широко распространенным среди флуоресцентных белков, в отличие от описанных ранее типов фотоактивации, характерных для узких групп флуоресцентных белков, объединенных множеством консервативных аминокислотных остатков.

Продемонстрирована возможность использования флуоресцентного белка R10-3 в качестве двуцветной метки совместно с другими красными и зелеными флуоресцентными белками, причем для детекции трех условных цветов в этом случае достаточно только двух каналов измерениея флуоресценции.

В заключение, автор выражает искреннюю благодарность всему коллективу сотрудников лаборатории молекулярных технологий ИБХ РАН и компании «Евроген» за дружественную рабочую атмосферу и всестороннюю помощь в подготовке данной работы, в особенности Екатерине Барсовой, Юрию Янушевичу, Илье Ямпольскому, а также заведующему лабораторией Сергею Лукьянову. Особую признательность хочется выразить научному руководителю Константину Лукьянову за обсуждение результатов, умелое руководство и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мишин, Александр Сергеевич, 2009 год

1. Красновский А.А. Реакции обратимого фотохимического восстановления хлорофилла, его аналогов и производных. // Успехи химии 1960. - Т.29(6). — Р.736-759.

2. Ando R., Наша Н., Yamamoto-Hino М., Mizuno Н., Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. II Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V.99(20). - P. 12651-6.

3. Baedeker M.Schulz G.E. Autocatalytic peptide cyclization during chain folding of histidine ammonia-lyase. // Structure. 2002. - V.10(l). - P.61-7.

4. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - V.97(22). - P. 11984-9.

5. Barondeau D.P., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. Understanding GFP chromophore biosynthesis: controlling backbone cyclization and modifying post-translational chemistry. // Biochemistry. 2005. - V.44(6). - P. 1960-70.

6. Barondeau D.P., Putnam C.D., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. Mechanism and energetics of green fluorescent protein chromophore synthesis revealed by trapped intermediate structures. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. -V. 100(21). — P. 12111-6.

7. Bevis B.J., Glick B.S. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). // Nat Biotechnol. 2002. - V.20(l). - P.83-7.

8. Blum C., Meixner A.J., Subramaniam V. Room temperature spectrally resolved single-molecule spectroscopy reveals new spectral forms and photophysical versatility of aequorea green fluorescent protein variants. И Biophys J. 2004. -V.87(6). - P.4172-9.

9. Boknian S.H., Ward W.W. Renaturation of Aequorea gree-fluorescent protein. // Biochem Biophys Res Commun. 1981. - V.101(4). - P.1372-80.

10. Brejc K., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. V.94(6). -P.2306-11.

11. Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., Lukyanov K.A. Interconversion of Anthozoa GFP-Iike fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. // BMC Biochem. 2002. - V.3. - P.7.

12. Cadwell R.C., Joyce G.F. Mutagenic PCR. // PCR Methods Appl. 1994. -V.3(6). - P.S136-40.

13. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V.99(12). - P.7877-82.

14. Cannon M.B., Remington S.J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. // Protein Sci. 2006. - V. 15(1). - P.45-57.

15. Chan M.C., Karasawa S., Mizuno H., Bosanac I., Ho D., Prive G.G., Miyawaki A., Ilcura M. Structural characterization of a blue chromoprotein and its yellow mutant from the sea anemone Cnidopus japonicus. // J Biol Chem. 2006. -V.281(49). - P.37813-9.

16. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. V.93(16). - P.8362-7.

17. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. // J Biol Chem. 2003. - V.278(9). - P.7215-9.

18. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. // Trends Biotechnol. 2005. - V.23(12). - P.605-13.

19. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G.Ward W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. IIBiochemistry. 1993. - V.32(5). - P.1212-8.

20. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). // Gene. 1996. - V. 173(1 Spec No). - P.33-8.

21. Crameri A., Whitehorn E.A., Tate E., Stemmer W.P. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. II Nat Biotechnol. 1996. — V.14(3). - P.315-9.

22. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A.Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. // Trends Biochem Sci. 1995. - V.20(l 1). - P.448-55.

23. Cubitt A.B., Woollenweber L.A.Heim R. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Methods Cell Biol. 1999. - V.58.-P. 19-30.

24. Deheyn D.D., Kubokawa К., McCarthy J.K., Murakami A., Porrachia M., Rouse G.W., Holland N.D. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. // Biol Bull. 2007. - V.213(2). - P.95-100.

25. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. // Biotechnology (NY). 1995. - V.13(2). - P.151-4.

26. Ehrig Т., O'Kane D.J., Prendergast F.G. Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. // FEBSLett. 1995. - V.367(2). - P.163-6.

27. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J., Leibler S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. // Curr Biol. 1997. - V.7(10). - P.809-12.

28. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J., B.Leibler S. Protein mobility in the cytoplasm of Escherichia coli. H J Bacteriol. 1999. - V.181(l). - P.197-203.

29. Elsliger M.A., Wachter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. // Biochemistry. 1999. - V.38(17). - P.5296-301.

30. Eswar N., Webb В., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Eramian D., Shen M.Y., Pieper U., Sali A. Comparative protein structure modeling using Modeller. // Curr Protoc Bioinformatics. 2006. - V.Chapter 5. - Unit 5 6.

31. Eswar N., Webb В., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Eramian D., Shen M.Y., Pieper U., Sali A. Comparative protein structure modeling using MODELLER. // Curr Protoc Protein Sci. 2007. - V.Chapter 2. - Unit 2 9.

32. Garcia-Parajo M.F., Koopman M., van Dijk E.M., Subramaniam V., van Hulst N.F. The nature of fluorescence emission in the red fluorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2001. -V.98(25). P. 14392-7.

33. Griesbeck O., Baird G.S., Campbell R.E., Zacharias D.A., Tsien R.Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. И J Biol Chem. 2001. - V.276(31). - P.29188-94.

34. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc Natl Acad Sci US A.-2000.- V.97(22). P. 11990-5.

35. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. GFP-like chi'omoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. IIFEBSLett. 2001. - V.507(l). - P.16-20.

36. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. // BMC Biochem. 2001. - V.2. - P.6.

37. Hanson G.T., Aggeler R., Oglesbee D., Cannon M., Capaldi R.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. // J Biol Chem. 2004. - V.279(13). -P.13044-53.

38. Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. Improved green fluorescence. // Nature. 1995.- V.373(6516). P.663-4.

39. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. -V.91(26). P.12501-4.

40. Heim R., Tsien R.Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. // Curr Biol. 1996. - V.6(2). - P.178-82.

41. Henderson J.N.Remington S.J. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2005. V. 102(36). - P.12712-7.

42. Henderson J.N.Remington S.J. The kindling fluorescent protein: a transient photoswitchable marker. // Physiology (Bethesda). 2006. - V.21. - P. 162-70.

43. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.IC., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. // Gene. -1989. V.77(l). - P.51-9.

44. Hopf M., Gohring W., Ries A., Timpl R., Hohenester E. Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1. // Nat Struct Biol. 2001. - V.8(7). - P.634-40.

45. Jakobs S., Schauss A.C. Hell S.W. Photoconversion of matrix targeted GFP enables analysis of continuity and intermixing of the mitochondrial lumen. // FEBS Lett. 2003. - V.554(l-2). - P.194-200.

46. Jayaraman S., Haggie P., Wachter R.M., Remington S.J., Verkman A.S. Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. // J Biol Chem. 2000. - V.275(9). - P.6047-50.

47. Kikuchi A., Fukumura E., Karasawa S., Mizuno H., Miyawaki A., Shiro Y. Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. // Biochemistry. 2008. -y.47(44).-P. 11573-80.

48. Kneen M., Farinas J., Li Y., Verkman A.S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. // Biophys J. 1998. - V,74(3). - P.1591-9.

49. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. И Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - V.99(7). - P.4256-61.

50. Lim C.R., Kimata Y., Oka M., Nomaguchi K.Kohno K. Thermosensitivity of green fluorescent protein fluorescence utilized to reveal novel nuclear-like compartments in a mutant nucleoporin NSP1. // J Biochem. — 1995. — V. 118(1). -P.13-7.

51. Lippincott-Schwartz J.Patterson G.H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. // Science. 2003. - V.300(5616). - P.87-91.

52. Llopis J., McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.G. Tsien R.Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. И Proc Natl Acad Sci USA. 1998. - V.95(12). - P.6803-8.

53. Malo G.D., Pouwels L.J., Wang M., Weichsel A., Montfort W.R., Rizzo M.A., Piston D.W.Wachter R.M. X-ray structure of Cerulean GFP: a tryptophan-basedchromophore useful for fluorescence lifetime imaging. // Biochemistry. 2007. -V.46(35). - P.9865-73.

54. Martynov V.I., Maksimov B.I., Martynova N.Y., Pakhomov A.A., Gurskaya N.G. Lukyanov S.A. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. II J Biol Chem. 2003. - V.278(47). -P.46288-92.

55. Massey V., Palmer G. On the existence of spectrally distinct classes of flavoprotein semiquinones. A new method for the quantitative production of flavoprotein semiquinones. // Biochemistry. 1966. - V.5(10). - P.3181-9.

56. Massey V., Stankovich M., Hemmerich P. Light-mediated reduction of flavoproteins with flavins as catalysts. // Biochemistiy. 1978. - V.17(l). - P. 1-8.

57. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. // Nat Biotechnol. 1999. - V. 17(10). - P.969-73.

58. McAnaney T.B., Shi X., Abbyad P., Jung H., Remington S.J., Boxer S.G. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. // Biochemistiy. 2005. - V.44(24). - P. 8701-11.

59. Mena M.A., Treynor T.P., Mayo S.L., Daugherty P.S. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. // Nat Biotechnol. 2006. - V.24(12). - P. 1569-71.

60. Mizuno H., Mai Т.К., Tong K.I., Ando R., Furuta Т., Ikura M., Miyawaki A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. // Mol Cell. 2003. - V.12(4). - P.1051-8.

61. Morise H., Shimomura O., Johnson F.H.Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. // Biochemistry. 1974. - V.13(12). -P.2656-62.

62. Nagai Т., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K.Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. И Nat Biotechnol. 2002. - V.20(l). - P.87-90.

63. Nguyen A.W.Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. // Nat Biotechnol. 2005. - V.23(3). - P.355-60.

64. Nienhaus K., Nienhaus G.U., Wiedenmann J.Nar PI. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - V.l 02(26). - P.9156-9.

65. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M. Tsuji F.l. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. - V.93(24). -P.13617-22.

66. Olenych S.G., Claxton N.S., Ottenberg G.K.Davidson M.W. The fluorescent protein color palette. // Curr Protoc Cell Biol. 2007. - V.Chapter 21. - .Unit 215.

67. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Science. — 1996. -V.273(5280). P.1392-5.

68. Pakhomov A.A. Martynov V.I. Chromophore aspartate oxidation-decarboxylation in the green-to-red conversion of a fluorescent protein from Zoanthus sp. 2. // Biochemistry. 2007. - V.46(41). - P.l 1528-35.

69. Pakhomov A.A. Martynov V.I. GFP family: structural insights into spectral tuning. // Chem Biol. 2008. - V.15(8). - P.755-64.

70. Pakhomov A.A., Pletneva N.V., Balashova T.A. Martynov V.I. Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chrom о protein from Condylactis gigantea. // Biochemistry. 2006. - V.45(23). - P.7256-64.

71. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., Piston D.W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. // Biophys J. 1997. - V.73(5). - P.2782-90.

72. Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. // Science. 2002. - V.297(5588). - P.l 873-7.

73. Perozzo M.A., Ward K.B., Thompson R.B. Ward W.W. X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. IIJ Biol Chem. 1988. - V.263(16). - P.7713-6.

74. Pletneva N., Pletnev S., Tikhonova Т., Popov V., Martynov V., Pletnev V. Structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006. - V.62(Pt 5). - P.527-32.

75. Prasher D.C., Eckenrode V.IC., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. // Gene. — 1992.-V.lll(2).-P.229-33.

76. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., Rossjohn J. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. // Structure. 2003. - V.ll(3). — P.275-84.

77. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D.M. Remington S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. // Biochemistry. 2005. - V.44(15). - P.5774-87.

78. Rekas A., Alattia J.R., Nagai Т., Miyawaki A.Ikura M. Crystal structure of venus, a yellow fluorescent protein with improved maturation and reduced environmental sensitivity. // J Biol Chem. 2002. - V.277(52). - P.50573-8.

79. Remington S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. // Curr Opin Struct Biol. ~ 2006. V.16(6). - P.714-21.

80. Remington S.J., Wachter R.M., Yarbrough D.K., Branchaud В., Anderson D.C., Kallio K. Lukyanov K.A. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. // Biochemistry. 2005. - V.44(l). — P.202-12.

81. Rizzo M.A., Springer G.H., Granada B. Piston D.W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. // Nat Biotechnol. 2004. - V.22(4). -P.445-9.

82. Rizzuto R., Brini M., De Giorgi F., Rossi R., Heim R., Tsien R.Y. Pozzan T. Double labelling of subcellular structures with organelle-targeted GFP mutants in vivo. // Curr Biol. 1996. - V.6(2). - P. 183-8.

83. Sacchetti A., Cappetti V., Marra P., Dell'Arciprete R., El Sewedy Т., Crescenzi C. Alberti S. Green fluorescent protein variants fold differentially in prokaryotic and eukaryotic cells. // J Cell Biochem Suppl. 2001. - V.Suppl 36. - P. 117-28.

84. Sali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial4 restraints. // JMolBiol. 1993. - V.234(3). - P.779-815.

85. Salih A., Larkum A., Cox G., Kuhl M., Hoegh-Guldberg O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. И Nature. 2000. - V.408(6814). - P.850-3.

86. Sawin K.E., Nurse P. Photoactivation of green fluorescent protein. // Curr Biol. -1997. V.7(10). - P.R606-7.

87. Schwede T.F., Retey J. Schulz G.E. Crystal structure of histidine ammonia-lyase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile. // Biochemistry. 1999. - V.38(17). - P.5355-61.

88. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., Tsien R.Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. // Nat Biotechnol. 2004. ~ V.22(12). -P. 1567-72.

89. Shaner N.C., Steinbach P.A., Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. // Nat Methods. 2005. - V.2(12). - P.905-9.

90. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. // J Cell Comp Physiol. 1962. - V.59. - P.223-39.

91. Shu X., Shaner N.C., Yarbrough C.A., Tsien R.Y. Remington S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. // Biochemistiy. 2006.- V.45(32). P.9639-47.

92. Siemering K.R., Golbik R., Sever R. Haseloff J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. // Ciirr Biol. 1996. - V.6(12). -P.1653-63.

93. Sniegowski J.A., Lappe J.W., Patel H.N., Huffman H.A., Wachter R.M. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. I/ J Biol Chem. 2005. - V.280(28). - P.26248-55.

94. Stewart C.N., Jr. Go with the glow: fluorescent proteins to light transgenic organisms. // Trends Biotechnol. 2006. - V.24(4). - P. 155-62.

95. Stoner-Ma D., Jaye A.A., Matousek P., Towrie M., Meech S.R., Tonge P.J. Observation of excited-state proton transfer in green fluorescent protein using ultrafast vibrational spectroscopy. // J Am Chem Soc. 2005. - V. 127(9). - P.2864-5.

96. Takahashi E., Takano Т., Nomura Y., Okano S., Nakajima O., Sato M. In vivo oxygen imaging using green fluorescent protein. // Am J Physiol Cell Physiol. —2006. V.291(4). - P.C781-7.

97. Terskikh A., Fradlcov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. // Science. 2000. - V.290(5496). - P.1585-8.

98. Terskikh A.V., Fradkov A.F., Zaraisky A.G., Kajava A.Y., Angres B. Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development. IIJ Biol Chem. 2002. - V.277(10). - P.7633-6.

99. Tretyakova Y.A., Pakhomov A.A., Martynov V.I. Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata. // J Am Chem Soc.2007. V. 129(25). - P.7748-9.

100. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. // Annu Rev Biochem. 1998. - V.67. - P.509-44.

101. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. // EMBO Rep. 2005. - V.6(3). - P.233-8.

102. Tunggal J., Wartenberg M., Paulsson M., Smyth N. Expression of the nidogen-binding site of the laminin gamma 1 chain disturbs basement membrane formation and maintenance in F9 embryoid bodies. II J Cell Sci. 2003. - V.l 16. - Pt 5). -P.803-12.

103. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. // Chem Biol. 2004. - V.l 1(6). - P.845-54.

104. Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V., Zaraisky A.G., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K. Uversky V.N. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. // Biochemistry. 2003. - V.42(26). -P.7879-84.

105. Verkhusha V.V. Lukyanov K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. // Nat Biotechnol. — 2004. — V.22(3). P.289-96.

106. Volkmer A., Subramaniam V., Birch D.J. Jovin T.M. One- and two-photon excited fluorescence lifetimes and anisotropy decays of green fluorescent proteins. // Biophys J. 2000. - V.78(3). - P. 1589-98.

107. Wachter R.M. Chromogenic cross-link formation in green fluorescent protein. // Acc Chem Res. 2007. - V.40(2). - P. 120-7.

108. Wachter R.M., Elsliger M.A., Kallio K., Hanson G.T., Remington S,J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. II Structure. 1998. - V.6(10). - P.1267-77.

109. Wall M.A., Socolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. // Nat Struct Biol. 2000. — V.7(12).-P.l 133-8.

110. Ward W.W., Bokman S.H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. // Biochemistry. 1982. - V.21 (19). - P.4535-40.

111. Wood T.I., Barondeau D.P., Flitomi C., Kassmann C.J., Tainer J.A. Getzoff E.D. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis. // Biochemistry. 2005. - V.44(49). - P.16211-20.

112. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S. , Lukyanov K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. // Biochemistiy. 2005. - V.44(15). -P.5788-93.

113. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N., Jr. The molecular structure of green fluorescent protein. // Nat Biotechnol 1996. - V. 14(10). - P. 1246-51.

114. Yang T.T., Cheng L., Kain S.R. Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. // Nucleic Acids Res. 1996. - V.24(22). - P.4592-3.

115. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. // Proc Natl Acad Sci US A. ~ 2001. V.98(2). - P.462-7.

116. Yolcoe H. Meyer T. Spatial dynamics of GFP-tagged proteins investigated by local fluorescence enhancement. // Nat Biotechnol. — 1996. V. 14(10). - P. 1252-6.

117. Youvan D.C., Michel-Beyerle M.E. Structure and fluorescence mechanism of GFP. // Nat Biotechnol. 1996. - V. 14(10). - P. 1219-20.

118. Zacharias D.A., Tsien R.Y. Molecular biology and mutation of green fluorescent protein. I/ Methods Biochem Anal. 2006. - V.47. - P.83-120.

119. Zacharias D.A., Violin J.D., Newton A.C., Tsien R.Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. // Science. 2002. - V.296(5569). - P.913-6.

120. Zapata-Hommer O., Griesbeck O. Efficiently folding and circularly permuted variants of the Sapphire mutant of GFP. // BMC Biotechnol. 2003. - V.3. - P.5.

121. Zolotukhin S., Potter M., Hauswirth W.W., Guy J., Muzyczka N. A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. // J Virol. 1996. - V.70(7). - P.4646-54.

122. Beinert H. Spectral characteristics of flavins at the semiquinoid oxidation level. II J. Am. Chem. Soc. . 1956. - V.78. - P.5323.

123. Gorbunov M.Y., Z. S. Kolber, M. P. Lesser and P. G. Falkowski. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals, . // Limnology and Oceanography 2001. -V.46.-P.75-85.

124. Flerring P.J. Bioluminescence of invertebrates other than insects. London, 1978.

125. Johnson F.H., L. C. Gershman, J. R. Waters, G. T. Reynolds, Y. Saiga and O. Shimomura. Quantum Efficiency of Cypridina Luminescence, with a Note on That of Aequorea. // Journal of Cellular and Comparative Physiology 1962. - V.60. — P.85-104.

126. Kawaguti S. On the phsiology of reef corals. VI. Study of the pigments. // Palao Trop. Biol. Stn. Stud. 1944. - V.2. -P.617-674.

127. Krasnovsky A.A. The primary processes of photosynthesis in plants. // Annual Reviews of Plant Physiology. 1960. - V.l 1. - P.363-410.

128. Mazel C.H.a.E.F. Contribution of fluorescence to the spectral signature and perceived color of corals. // Limnology and Oceanography 2003. - V.48. - P.390-401.

129. Rao P., Hayon, E. Ionization constants and spectral characteristics of some semiquinone radicals in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1973. - V.77(19). -P.2274 - 2276.

130. Sambrook J. F.E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. -1989.

131. Ward W.W. Fluorescent proteins: who's got 'em and why? . Cambridge, UK, 2002. -P. 123-126.