Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.17, кандидат физико-математических наук Миронов, Владимир Андреевич

• Миронов, Владимир Андреевич
• кандидат физико-математических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Миронов, Владимир Андреевич

Оглавление

Введение

1. Современные методы моделирования структуры и свойств белковых систем

1.1. Моделирование структуры белков

1.1.1. Метод молекулярной механики

1.1.2. Методы квантовой механики

1.1.3. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ)

1.2. Методы исследования возбужденных электронных состояний

1.3. Классическая молекулярная динамика

2. Экспериментальные и теоретические исследования красных флуоресцентных белков а8РР595 и семейства шРгийв

2.1. Структура и фотофизические свойства белка азРР595

2.1.1. Общие сведения о фотопереключаемых белках

2.1.2. Строение белка азРР595

2.1.3. Схема фотопереключения

2.1.4. Оптические свойства белка азРР595

2.1.5. Теоретические исследования белка аэРР595

2.2. Белки семейства тРшИэ

3. Моделирование спектров белка азЕР595

3.1. Анион и цвиттерион хромофора

3.1.1. Равновесные геометрические конфигурации

3.1.2. Спектры поглощения

3.2. Нейтральная форма хромофора

3.3. Колебательная структура спектров поглощения белка азРР595

3.4. Флуоресценция активной формы белка азРР595

4. Исследование процессов безызлучателыюй деактивации хромофора белка а8ГР595

4.1. Методика расчетов

4.2. Результаты

4.2.1. Влияние фотовозбуждения на электронную структуру хромофора

4.2.2. Изучение процесса релаксации транс-изомера хромофора на ППЭ состояния Б і

5. Влияние окружения на оптические свойства хромофора

5.1. Зависимость энергий электронных переходов от окружения хромофора

5.2. Влияние окружения на возбужденное состояние хромофора

6. Исследование влияния давления на белки семейства тРгиШ

6.1. Методика расчетов

6.2. Результаты

6.2.1. Проверка модели

6.2.2. Зависимость структурных факторов от давления

6.2.3. Спектры поглощения белка т81га\уЬеггу

6.3. Заключение

7. Термическая изомеризация хромофора белка авЕР595 и

его мутантов

7.1. Методика расчетов

7.2. Результаты

7.2.1. Анион хромофора в белках азРР595 и КїїР

7.2.2. Нейтральная форма хромофора в белке азРР595

Выводы

Список литературы

Список сокращений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики»

Введение

Флуоресцентные белки находят широкое применение в современной биотехнологии в качестве маркеров для исследования процессов в живой клетке. Общим структурным элементом флуоресцентных белков семейства зеленого флуоресцентного белка (вРР) является хромофор, формирующийся на стадии посттрансляционной модификации белка. Именно молекуле хромофора флуоресцентные белки обязаны своими уникальными оптическими свойствами.

В последнее время активно исследуются красные флуоресцентные белки, полосы поглощения и флуоресценции которых лежат в области окна прозрачности (650-1300 нм) биологических тканей. С помощью красных флуоресцентных белков можно изучать намного более крупные объекты, чем при использовании вРР. Особенно интересным классом красных флуоресцентных белков являются фотоактивируемые белки, которые способны к изменению своих фотофизических свойств под воздействием излучения с определенной длиной волны. Причиной такого поведения являются фотохимические процессы, одним из которых является изомеризация молекулы хромофора на поверхности потенциальной энергии (ППЭ) возбужденного электронного состояния. Использование белка с подобными свойствами в качестве флуоресцентной метки способно значительно повысить разрешающую способность методов детектирования и предоставляет новые возможности исследования биологических систем. Такие белки также являются перспективным материалом для изготовления трехмерных носителей информации.

Понимание процессов, протекающих во флуоресцентных белках необходимо для создания новых вариантов фотопереюпочаемых белков с нужными свойствами и расширения границ их применения. Современные методы компьютерного моделирования предоставляют данные, существенно дополняющие экспериментальные результаты и позволяющие прогнозировать более эффективные биомаркеры.

Цель работы - исследование процессов, происходящих преимущественно в красных флуоресцентных белках с помощью современных методов квантовой и вычислительной химии. В частности, планировалось:

1. Соотнести наблюдаемые экспериментальные полосы поглощения темной и активной форм красного белка азРР595 с различными вариантами протонирования хромофорной молекулы.

2. Исследование фотоактивации и поиск каналов безызлучательной релаксации на ППЭ возбужденного электронного состояния хромофора аэРР595 в белковом окружении.

3. Исследование механизма тушения флуоресценции и термической деактивации активной формы белка азРР595.

4. Изучение влияния высокого давления на фотофизические свойства красных флуоресцентных белков семейства тРгикз.

Научная новизна результатов:

1. На основании рассчитанных энергий электронных переходов установлено, что анионная форма хромофора преобладает как в темной, так и в активной форме белка азРР595. Показано соответствие наблюдаемой полосы поглощения, ответственной за тушение флуоресценции, нейтральной форме хромофора.

2. Найдены и характеризованы структуры конических пересечений для двух конкурирующих каналов безызлучательной релаксации темной формы белка. Показано различие фотофизических свойств темной и активной форм белка азРР595.

3. Установлен механизм разгорания флуоресценции азРР595, в основе которого лежит фотоиндуцированная реакция изомеризации аниона хромофорной группы, связанная с одним из каналов быстрой безызлучательной релаксации темной формы белка через коническое пересечение возбужденного и основного электронных состояний.

4. Изучено влияние белкового окружения на положение максимума в спектре поглощения анионной формы хромофора азРР595.

5. С помощью методов молекулярной динамики найдены структурные факторы, обуславливающие зависимость от давления таких фотофизических свойств, как длина волны поглощения и квантовый выход флуоресценции белков тРгикэ.

6. Построены профили энергии для процессов термической изомеризации хромофора красных флуоресцентных белков азРР595 и КБР в белковой матрице.

Личный вклад диссертанта заключается в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, разработке путей решения поставленных задач, проведении вычислений методами квантовой химии, комбинированными методами квантовой механики и молекулярной механики, методом классической молекулярной динамики, интерпретации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы.

Научная и практическая значимость данной работы заключается в том, что полученные результаты позволяют детализировать механизмы фотохимических реакций протекающих в красном флуоресцентном белке азРР595, а также влияние структурных факторов на свойства белков тРгикэ. Результаты данной работы могут быть применены для прогнозирования свойств новых перспективных вариантов красных флуоресцентных белков.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ломоносов» (Москва 2009), 7-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва 2011), IX ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва 2009), Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе 2011), 9-м Конгрессе-триенпале

Всемирной ассоциации специалистов по теоретической и вычислительной химии \\^АТОС (Испания 2011), XIX конференции «Последние достижения в исследовании водородных связей» (Германия 2011).

Результаты опубликованы в 10 печатных изданиях, в том числе в 4 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень журналов ВАК РФ и в 6 тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 152 наименований. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка, 11 формул и 15 таблиц.

1. Современные методы моделирования структуры и свойств белковых систем

В данной главе приведен краткий обзор современных методов вычислительной химии, используемых для моделирования процессов, протекающих в белках. Ввиду большого размера и сложности таких систем теоретическое и экспериментальное их исследование сопряжено со значительными трудностями. Поскольку полностью макромолекулу белка практически невозможно описать с помощью традиционных методов квантовой химии, широкое распространение в данной области получили параметрические методы, использующие для описания белка силовые поля, и гибридные методы. Поскольку единого подхода для решения всех классов задач, связанных с белками, не существует, критически важен правильный выбор метода для решения поставленных задач. В то же время, правильно комбинируя различные подходы можно моделировать системы любой сложности и получать при этом корректные результаты.

1.1. Моделирование структуры белков

1.1.1. Метод молекулярной механики

В основе метода молекулярной механики лежит идея о том, что энергию системы можно представить в виде простой параметрической функции, зависящей только от координат ядер атомов, входящих в систему [1-3]. При этом все необходимые параметры определяются заранее и постоянны в ходе моделирования. Обычно, потенциальная энергия системы представляется следующим образом:

= ^хСг "1" Еьепс1 "I" Еуйу, + Ее1ес + (1)

где Еш - полная энергия молекулы; Е$1г - энергия деформации связей; ЕЪспс1 — энергия деформации валентных углов; Е,0ГЗ - энергия деформации торсионных углов; - энергия ван-дер-ваальсовых взаимодействий; Ее!ес - энергия электростатического взаимодействия. Подобное представление часто называют в литературе моделью «шариков и пружин», где шариками являются атомы системы, а пружины - связи между ними. Набор

независимых параметров, входящих в уравнение потенциальной энергии системы называют силовым полем.

Энергетический вклад деформации связей и валентных углов выражают через следующие уравнения:

Е5(г=~Ь(Ь-Ь0)2, (2)

где кь - силовая константа растяжения связи; Ьо - стандартная длина связи; Ь - текущая длина связи.

Еьепа ~ ~ ~ (3)

где кд - силовая константа деформации валентных углов; 0О - равновесное значение валентного угла; 0 - текущее значение валентного угла.

Вклад вращения двугранных углов в потенциальную энергию является периодической функцией от величины соответствующего угла и обычно задается с помощью суммы потенциалов следующего вида:

ЕЬогз = + совСп?» - (ро)), (4)

где к<р - торсионный барьер (барьер вращения); ср - текущее значение торсионного угла; п - период (число минимумов энергии на один полный цикл); сро - стандартное значение торсионного угла.

Ваи-дер-ваальсовы взаимодействия между не связанными атомами обычно выражаются потенциалом Леннарда-Джонса:

^уйю ~ ¿-I 12 6' 7 Ч Ч/

где Ау - коэффициент вклада отталкивания, Ву - коэффициент вклада притяжения; - расстояние между атомами / и у.

Электростатические взаимодействия описываются кулоновским потенциалом:

ье1еа —

где е - диэлектрическая проницаемость; Q¡, ()2 - заряды на взаимодействующих атомах; г - межатомное расстояние.

Главным достоинством метода молекулярной механики является простота описания системы, низкие требования к вычислительным

ресурсам и высокая вычислительная масштабируемость. Это позволяет изучать системы, содержащие сотни тысяч и даже миллионы атомов, а также исследовать их динамическое поведение (молекулярная динамика).

Гармоническое приближение, лежащее в основе современных силовых полей, существенно ограничивает использование для моделирования химических процессов и систем, значительно возмущенных по сравнению с равновесным состоянием. Также в подавляющем большинстве силовых полей отсутствуют перекрестное влияние различных компонентов друг на друга. Все это приводит к тому, что разрыв и образования связей сложно описать с помощью методов молекулярной механики [1]. Для исследования каждой реакции необходимо конструировать отдельное силовое поле, что является весьма трудоемким процессом. Репараметризация силового поля также необходима при исследовании возбужденных электронных состояний. Для таких целей значительно более удобным и точным (но и более трудоемким) является квантовомеханический подход. Также, важным ограничивающим фактором применения этих методов является зачастую низкая точность результатов.

1.1.2. Методы квантовой механики

Квантовомеханические методы широко используются для исследования химических реакций и возбужденных электронных состояний небольших систем. В большинстве методов квантовой химии используется так называемое адиабатическое приближение, позволяющее отделить электронные переменные от ядерных в уравнении Шредингера. Таким образом, для каждой интересующей исследователя геометрической конфигурации атомов решается электронное уравнение Шредингера, в которое ядерные координаты входят в качестве параметров. На текущий момент существует достаточно большой набор используемых методов квантовой химии. К ним относятся такие методы, как метод Хартри-Фока, метод конфигурационного взаимодействия (КВ), многоконфигурационный метод самосогласованного поля (МКССП), теория функционала плотности

и различные методы теории возмущений. Существует большое количество обзоров и книг (например, [1,4]), посвященных теоретическим аспектам этих методов, поэтому останавливаться на описании отдельных методов мы не будем. Отдельно лишь будут обсуждаться методы исследования возбужденных электронных состояний.

Основным недостатком данных методов является огромные вычислительные ресурсы (по сравнению с методами молекулярной механики), необходимые для их применения. На текущий момент традиционные неэмпирические методы квантовой механики можно использовать для изучения систем, содержащих не более нескольких сотен атомов. В то же время большинство белков состоят из тысяч атомов, что делает их исследование квантовохимическими методами чрезвычайно сложной задачей.

Одним из подходов, позволяющих изучать процессы внутри белка с помощью квантовой химии, является приближение внедренного кластера [5]. В данном приближении из всей белковой системы выделяется лишь интересующая исследователя часть и ее ближайшее окружение. При этом взаимодействие выделенного фрагмента с остальным белком игнорируется. Основной идеей метода является то, что основной влияние на интересующий процесс внутри белка оказывает небольшое число белковых остатков. Чтобы удержать выделенный фрагмент в соответствии с белковой структурой, используется схема блокировки координат [5], в которой часть граничных атомов выделенной области поддерживаются неподвижными. Данный подход оправдывает себя в том случае, когда взаимодействие оставшейся части белка на исследуемый процесс мало. Для этого необходимо аккуратно выбирать молекулярный кластер исходя из специфики системы.

1.1.3. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ)

Белковые системы обычно слишком большие для того, чтобы их исследование оказалось возможным с помощью квантовохимических

методов, в то же время, молекулярная механика не способна описывать процессы разрыва или образования связей. Поэтому для моделирования реакций в белках часто используются гибридные методы. Основная идея данного подхода заключается в разделении системы на две (или более) части. Одна из них — та, где происходит сама реакция - описывается с помощью высокоуровневых методов, обеспечивающих необходимую точность результатов. Другая же часть - менее важная и, обычно, существенно превосходящая по размеру первую, - с помощью нетребовательных к ресурсам, но менее точных методов. Реализация комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ, [6-8]) предполагает описание первой подсистемы с помощью методов квантовой химии (КМ-подсистема), а второй - с помощью методов молекулярной механики (ММ-подсистема).

Существует два варианта [8] реализации схемы КМ/ММ — аддитивный и вычитательный. К последнему, в частности, относится распространенный метод ОМОМ. Однако наибольшую популярность приобрел первый способ. В аддитивной схеме КМ/ММ полный гамильтониан системы представляется в виде суммы [6]:

Н = ^км + + #км/мм> (7)

где Якм и Нмм - гамильтонианы соответственно КМ и ММ-подсистем; ^км/мм ~ гамильтониан, описывающий взаимодействие подсистем. Взаимодействие подсистем может описываться различным образом. В самом простом случае оно описывается на уровне силовых полей. Данный подход называется механическим внедрением [1]. В схеме КМ/ММ в варианте механического внедрения, однако, не учитывается взаимная поляризация КМ и ММ-подсистем. Вариант, в котором учитывается поляризация КМ-подсистемы атомами ММ-подсистемы, и вариант, учитывающий общую поляризацию, называются, соответственно, электронным внедрением и поляризованным внедрением [1]. Последний подход используется очень редко, ввиду малого распространения поляризуемых силовых полей и высоких вычислительных затрат. Варианты

механического и электронного внедрения, которые и были использованы в данной работе, реализованы во многих квантовохимических программных пакетах.

1.2. Методы исследования возбужденных электронных состояний

В настоящее время представлено достаточно большое количество методов, позволяющих моделировать возбужденные электронные состояния молекулярных систем. Одним из наиболее старых и в то же время точных из них является метод конфигурационного взаимодействия (КВ), основанный на вариационном принципе [1,4]. Волновая функция в данном методе представляется в виде нормированной суммы нескольких определителей Слейтера. Обычно, для этой цели используют решение уравнений Хартри-Фока для основного электронного состояния и возбужденные (однократно (Б), двукратно (Б), трехкратно (Т) и т.д.) относительно него детерминанты:

Коэффициенты <2[ находят с помощью диагонализации матрицы гамильтониана системы в базисе используемых определителей Слейтера. Таким образом можно получить волновые функции как для основного, так и для возбужденных электронных состояний системы. В случае, когда используются все возможные возбужденные определители Слейтера, метод носит название полное KB (Full CI). Однако их количество чрезвычайно велико даже для небольших систем, поэтому обычно ограничиваются использованием определенным максимальным уровнем возбуждений. В таком варианте метод носит название ограниченного КВ. Исследования показали, что учет уже пятикратных возбуждений не вносит существенного вклада в энергию системы. Для поиска геометрических конфигураций в больших системах используют метод KB в простейшем варианте, в котором учитываются только однократные возбуждения (КВ1 или CIS) [9]. Метод

s

D

Т

КВ1 во многих случаях дает качественно правильное описание ППЭ, когда низшие возбужденные состояния хорошо описывается с помощью однократных возбуждений. Однако результаты расчетов становятся существенно хуже, когда возрастает вклад многоэлектроиных возбуждений. Главными недостатками метода КВ1 являются плохой учет электронной корреляции и размерная несогласованность метода.

Для расчетов электронных спектров очень важен учет электронной корреляции. Для небольших молекулярных систем часто используют метод КВ с учетом одно- и двукратными возбуждениями (КВ2, CISD). Недостатками этого метода является большая вычислительная сложность и уменьшение учитываемой доли энергии корреляции с ростом размера системы [1,4]. Одним из способов уменьшения вычислительной сложности является оценка вклада двукратных возбуждений с помощью теории возмущений (CIS(D), [Ю]). Такой подход позволяет добиться масштабируемости О (Л/5) против 0(N6) для метода CISD. Еще большего выигрыша в масштабируемости можно добиться, масштабируя вклады в энергию корреляции от электронов с параллельным (SS) и непараллельным направлениями (OS) спинами. Для основного состояния можно показать [11], что поправка по теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка равна:

ее ~ ec,scs-mp2 = pssess* + posaos > ^

где вклады в энергию корреляции от параллельных (Е^) и антипараллельных (Еспинов масштабируются. Эмпирически найденные значения коэффициентов масштабирования pss = - и pos = -. Поскольку

3 5

электроны с антипараллельным спином вносят основной вклад в энергию

корреляции, это выражение можно еще более упростить, оставив в

(2)

уравнении (9) только £¿5 и перемасштабировав pos [12]. Таким образом, вычислительная сложность метода уменьшается до 0(N4) от размера базиса. Такой метод носит название SOS-CIS(D) [13]. Когда вклад двукратных возбуждений в энергию корреляции не слишком высок, он дает

хорошую оценку энергий электронных переходов для систем с закрытыми оболочками.

Иногда встречаются системы, в которых основное и/или интересующее возбужденное состояние плохо описывается с помощью одного определителя Слейтера. В таких случаях, использование вышеприведенных методов может приводить к значительным ошибкам. Для таких систем необходимо использовать многоконфигурационные методы, например многоконфигурационный метод самосогласованного поля (МКССП, MCSCF) [1,4,14]. Как и в методе KB, волновая функция представляет собой сумму нескольких определителей Слейтера. Особенностью метода МКССП является то, что референсный детерминант не является фиксированным: коэффициенты разложения молекулярных орбиталей на атомные также оптимизируются. Одной из основных проблем данного метода является выбор определителей Слейтера, которые необходимы для корректного описания электронной структуры исследуемой системы. Одним из наиболее популярных подходов является вариант МКССП в полном активном пространстве нескольких орбиталей (Complete Active Space Self-Consistent Field, CASSCF). В данном варианте выбор конфигураций осуществляется с помощью разделения молекулярных орбиталей на два набора - активное и неактивное пространства орбиталей. Орбитали в неактивном пространстве всегда либо дважды заняты, либо вакантные. В пространстве активных орбиталей проводится процедура KB, на основании которой строятся отобранные по симметрии наборы конфигурационных функций состояния, которые и участвуют в процедуре оптимизации MCSCF. Разделение орбиталей на активное и неактивное пространства проводится вручную в зависимости от специфики исследуемой системы и протекающих в ней процессов. Для органических хромофоров низшие возбужденные состояния обычно соответствуют л — п* переходам. В этом случае используется 7г-приближение, в котором активное пространство состоит из всех 7г-орбиталей хромофора. При расчетах спектров важно сбалансированное описание основного и

возбужденного электронных состояний. В этом случае используется метод САЭБСР с усреднением электронной плотности по нескольким состояниям (8Ая-СА88СР, п — число состояний, по которым проводится усреднение). Также 8А-СА88СР используется при исследовании конических пересечений для повышения вычислительной стабильности процедуры

ссп.

В большинстве случаев доля энергии электронной корреляции, полученная с помощью метода МКССП очень невелика (т.н. статическая электронная корреляция). Зачастую это приводит к некорректным энергиям электронных переходов или даже неправильному порядку возбужденных состояний. Для получения правильной картины энергетических уровней системы необходимо использовать мпогокопфигурационные методы, учитывающие динамическую составляющую электронной корреляции. В дайной работе был использован метод ХМССЮРТ2 [15], являющийся расширенным вариантом многоконфигурационной теории возмущений второго порядка [16].

Ввиду значительной вычислительной сложности вышеописанных методов, большой популярностью для расчета спектров фотовозбуждения пользуются методы теории функционала плотности в нестационарном варианте (ТОБРТ), а также некоторые полуэмпирические методы. Правильный выбор функционала позволяет добиться хороших результатов для многих органических соединений. Однако существующие на текущее время функционалы некорректно оценивают энергии электронных переходов, связанных с переносом заряда. Поскольку в хромофорах флуоресцентных белков подобные переходы часто имеют место, метод ТБОРТ в данной работе не использовался. В то же время, полуэмпирический метод [17], который был использован для

расчета спектров поглощения нейтральной формы хромофора, дает хорошую оценку энергии 80-81 перехода для хромофоров флуоресцентных белков [18-20].

1.3. Классическая молекулярная динамика

Скорость реакций в таких больших системах как белки будет определяться как средняя по ансамблю различных элементарных процессов с участием множества переходных состояний [21]. Нахождение всех возможных локальных минимумов и соответствующих переходных состояний не представляется возможным, поэтому появляется необходимость использовать методы, учитывающие конформациопную подвижность всех участников реакции. Одним из таких методов является классическая молекулярная динамика (МД). Методы классической динамики часто применяются для исследования макромолекул, конденсированных сред и даже астрономических объектов [22-26]. Применение классической динамики ограничено теми объектами, для которых можно пренебречь релятивистскими и квантовыми эффектами или учесть их в неявном виде.

Метод МД является мощным инструментом для исследования химических и биологических систем. В классическом приближении атомы являются материальными точками, движущимися по ППЭ [1,27,28]. Динамическую траекторию получают последовательным интегрированием Ньютоновских уравнений движения с заранее выбранным шагом. Полученная траектория, таким образом, состоит из отдельных кадров (snapshots), для каждого из которых определены координаты и скорость каждого атома, а также действующая на него в данный момент сила. Начальные значения координат и скоростей выбираются исходя из специфики системы и решаемой задачи. Значения действующих па атомы сил вычисляются для каждого шага выбранным методом. Ввиду своей вычислительной сложности, методы квантовой механики до недавнего времени редко использовались для получения молекулярно-динамических траекторий больших систем. В связи с этим, молекулярная динамика обычно ассоциируется с использованием молекулярно-механических силовых полей. Однако, метод силовых полей плохо применим для исследования реакций. Поэтому с развитием вычислительных технологий

все большее распространение получает МД, основанная на гибридных КМ/ММ моделях или на только квантово-механических расчетах.

Важной особенностью метода МД является возможность учета энтропийной составляющей свободной энергии исследуемого процесса. Существует целый класс методов, позволяющих рассчитать свободную энергию реакции. Наиболее популярными из них являются метод гистограмм, термодинамическое интегрирование и теория возмущений свободной энергии [27—29]. Однако, зачастую прямое исследование интересующего процесса с помощью МД невозможно: обычно важные (связанные с протеканием реакции) участки фазового пространства характеризуются высокими значениями свободной энергии и поэтому система может ни разу не пройти через них за разумное время моделирования. Это приводит к тому, что выборка, полученная с помощью метода МД оказывается статистически недостоверной. Такое явление называют квазинеэргодичностыо [29]. Существует несколько подходов для того, чтобы улучшить статистическую выборку для регионов, обычно недоступных для метода МД. Одним из таким подходов является метод выборки по важности или зонтичной выборки (umbrella sampling, [29-31]). В этом методе исходное Больцмановское распределение модифицируется для того, чтобы обеспечить доступность важных областей фазового пространства. Можно показать, что исходное значение свободной энергии легко можно определить из выборки, полученной в модифицированном распределении [30].

ЙЛ

2. Экспериментальные и теоретические исследования красных флуоресцентных белков аэРР595 и семейства тРгиКэ

Белки вРР-типа широко распространены в природе. Они присутствуют в клетках многих представителей морской фауны, обеспечивая их яркую окраску и способность к свечению. Их способность к поглощению и флуоресценции в видимой области спектра обусловлена наличием в их структуре молекулы хромофора (рисунок 1), образующейся на стадии посттрансляционной модификации из аминокислот белка. Разнообразная и насыщенная окраска этих белков обусловлена большим коэффициентом поглощения в уникальной для каждого из них области спектра. Многие из этих белков, как, например, ОРР, способны ярко флуоресцировать, но большинство их являются обычными хромопротеинами [32]. Особенно удобны в использовании флуоресцентные белки, поглощающие и испускающие свет в области окна прозрачности биологических тканей. Поскольку оно расположено в красной области спектра (650-1200 нм [33-35]), такие белки часто называют красными флуоресцентными белками. В настоящий момент биотехнологам удалось лишь приблизиться к коротковолновой границе данного диапазона. Поэтому красные флуоресцентные белки являются объектами активного исследования. Важными их представителями являются широко использующиеся в настоящий момент белки тРгикБ, полученные прямым мутагенезом белка БэКес! [36,37], а также белок азРР595, который, как и многие его мутанты, обладает уникальной возможностью к обратимой фотоактивации, что открывает широкие возможности для визуализации процессов в живых организмах. Описанные причины явилось причиной выбора данных белков в текущем исследовании.

Одним из первых открытых красных флуоресцентных белков является выделенный из кораллов О'исозота белок БвКес! [38,39]. С помощью рентгеноструктурного анализа было показано [40-42], что причиной сдвига пиков поглощения и флуоресценции в красную сторону

является расширенная на одну двойную связь, по сравнению с вРР, л-система хромофора (рисунок 1). Причиной этого отличия являются особенности биосинтеза красных флуоресцентных белков, который протекает в несколько стадий [42—45]. На первой стадии происходит автокаталитическая циклизация двух аминокислотных остатков с образованием имидазолинового кольца с последующей его дегидратацией и окислением мостиковой двойной связи, при этом формируется ОРР-подобный хромофор. На последующей стадии происходит медленное окисление кислородом воздуха пептидной связи примыкающей к хромофору аминокислоты (РИе65 в случае белка DsR.ec!) с образованием ацилиминного фрагмента. При этом формируется хромофор, поглощающий и испускающий свет в красной области спектра. В некоторых из флуоресцентных белков (Каес1е, гРР538, азРР595, тОгаг^е, тКО [45]) могут происходить дальнейшие модификации хромофора.

Рисунок 1. Системы сопряженных к-связей хромофоров зеленого флуоресцентного белка и красного флуоресцентного белка ОяЯесІ.

2.1. Структура и фотофизические свойства белка аБрР595

2.1.1. Общие сведения о фотопереключаемых белках

На текущий момент известно большое количество флуоресцентных белков, способных к изменению своих свойств под воздействием внешнего излучения (фотоактивации) [46]. В большинстве из них этот процесс наиболее эффективно протекает под воздействием ультрафиолетового излучения высокой интенсивности и необратим. Эффект необратимой фотоактивации объясняется различными фотохимическими процессами разрывов ковалентных связей, в частности, декарбоксилирования боковой цепи остатка вІи222 в варианте белка вРР, или разрыва основной цепи

РІ7Є,

65

белка (Kaede и др.). Уникальной способностью флуоресцентных белков asFP595 и Dronpa, а также их производных, является способность к фотопереключению - обратимой фотоактивации. Данные белки могут существовать в одной из двух форм, только одна из которых способна к флуоресценции. Переход между ними протекает под воздействием света видимого диапазона и имеет иной механизм, чем в остальных фотоактивируемых белках.

Белок asFP595 был выделен из средиземноморской актинии Anemonia Sulcata [47]. Именно его присутствием обусловлена фиолетовая окраска щупалец этого коралла. Хромопротеин asFP595 в своем обычном состоянии (темная форма) активно поглощает излучение середины видимого светового диапазона (максимум поглощения 565 им), оставаясь прозрачным в синей и красной областях видимого спектра. В этой форме белок практически не флуоресцирует. Однако было обнаружено, что интенсивное облучение зеленым светом приводит появлению яркой флуоресценции в красном диапазоне видимого спектра (максимум флуоресценции 610 нм) [32,47,48]. Этот явление получило название разгорания флуоресценции («kindling») или фотопереключение. Процесс фотопереюночепия полностью обратим: при прекращении облучения белка исходное состояние белка восстанавливается за время порядка нескольких секунд [47,49]. Флуоресценцию белка можно принудительно прервать облучением флуоресцирующей формы синим светом (~450 нм) - так называемое тушение флуоресценции, которое так же восстанавливает исходную форму. Таким образом, в процессе фотоактивации образуется некая флуоресцирующая форма белка - активная форма. Поглощение и эмиссия вблизи окна прозрачности биологических тканей делает asFP595 более удобным инструментом для исследования живых систем, чем фотоперюночаемый белок Dronpa, активный в зеленой области спектра.

Структура белка asFP595 и его мутантов [50-52] подобна структуре тщательно исследованного флуоресцентного белка GFP. Его третичная структура (рисунок 2) представляет собой так называемый р-бочонок,

образованный 11 Р-листами, по оси которого проходит а-спираль с прикрепленным к ней хромофором. Такое строение характеризуется высокой плотностью и способствует защите хромофора от окружающей среды, обеспечивая стабильность и устойчивость при нагревании и действии денатурирующих агентов. Подобная третичная структура консервативна и сохраняется у всех белков вРР-типа. Значение окружения не исчерпывается защитной функцией: оно играет ключевую роль в процессе образования хромофора на стадии посттрансляционной модификации белка [46].

Рисунок 2. Структура тетрамера белка аяЕР595. Хромофор белка выделен красным.

2.1.2. Строение белка авРР595

Структура фотоактивного центра белка азРР595 [50] показана на рисунке 3. Процесс образования хромофора белка из остатков Ме163-Туг64-в1у65 похож на описанный выше механизм формирования хромофора

белка БзКес1. Отличительной чертой биосинтеза белка аБрР595 является разрыв ацилиминной связи Сузб2-Ме1бЗ, происходящий, по всей видимости уже после формирования хромофора. Это приводит, во-первых, к росту подвижности хромофора по сравнению с аналогичными белками, поскольку он соединен лишь одной связью с основной цепью. Во-вторых, это дополнительно сдвигает спектр поглощения белка в красную область видимого спектра [53].

I

Аг936

Рисунок 3. Строение фотоактивного центра нативного белка азРР595

Поскольку механизм разрыва ацилиминной связи неизвестен (простой гидролиз или более сложный процесс), гетероатомы на концах разрыва связи неизвестны. Теоретически, хромофор может содержать как карбонильную группу, так и иминогруппу. Точность использованных методов рентгеноструктурного анализа не позволяет сделать выбор в пользу одного из этих вариантов. Методы хроматомасс-спектрометрии обладают достаточной для этого точностью, однако результаты независимо проведенных исследований [51,54] противоречат друг другу. Однако иминогруппа представляется менее вероятной [55], поскольку гидролиз >1-ацилиминов протекает чрезвычайно легко с образованием карбонильного

соединения. В настоящий момент большинство исследователей считают, что в структуре хромофора содержится именно карбонильная группа.

Рисунок 4. Резонансные структуры для аниона хромофора аяРР595.

Полностью сформированный, хромофор представляет собой сопряженную систему, состоящую из двух связанных углеродным мостиком ароматических колец. В отличие от хромофора белка вРР, хромофор азРР595 характеризуется тремя основными резонансными структурами (рисунок 4). Это приводит к дополнительной делокализации электронной плотности по хромофору и, в частности, к уменьшению длины связи углерод-кислород фенольного фрагмента по сравнению с хромофором белка вРР [56].

Конфигурация хромофора в белке несколько отличается от плоской, например, в природном азРР595 угол между их плоскостями около 20°. В обычном состоянии (темная форма) хромофор белка присутствует только в виде транс-изомера. Это отличает азРР595 от белка вРР и его флуоресцентных аналогов, в которых наблюдается г/г/с-конфигурация. Хромофор заключен в полость из аминокислотных остатков, образующие с ним развитую сеть водородных связей. Окружение оказывает решающее влияние на фотофизические свойства белка, что подтверждают эксперименты по мутагенезу азРР595 [32]. Наиболее существенными являются мутации по позициям 143, 158 и 197. В природных аналогах вРР

65

Б

В

аминокислоты в позициях 143 и 158 определяют принадлежность белка к ряду флуоресцентных белков или к ряду хромопротеипов. Как правило, для флуоресцентных белков характерно присутствие в позиции 143 полярного остатка, обычно серина или гистидипа. Такой вариант стабилизирует хромофор в благоприятном для флуоресценции состоянии. У нефлуоресцирующих белков в позиции 143 обычно расположен остаток цистеина или аспарагина. У белка asFP595 положение 143 занято остатком аланина. Этот неполярный остаток не может участвовать в стабилизации положения хромофора, но, в то же время, не создает значительных стерических затруднений.

Мутация A143G приводит к увеличению продолжительности жизни активной формы белка без изменения остальных его свойств. Этот мутант получил название KFP [32,47,51]. Его структура аналогична структуре природного белка. Мутант A143S слабо флуоресцирует, причем максимумы поглощения и флуоресценции близки к природному asFP595. Его фотоактивация приводит к значительному росту интенсивности флуоресценции [47,50]. Интересно, что флуоресценция этого мутанта может быть полностью потушена до и после фотоактивации. Вероятно, обычное состояние этого белка характеризуется присутствием небольшого количества активной формы белка. Замена Ala 143 на остатки других аминокислот, характерных для природных хромопротеинов, приводит к потере эффекта разгорания флуоресценции.

Позиция 158 в белке asFP595 занята остатком серина, что также нехарактерно как для флуоресцентных белков, так и для хромопротеинов. У белков, способных флуоресцировать, эта позиция, как правило, занята остатком неполярной аминокислоты — валина или изолейцина. Мутация этого остатка на валин приводит к появлению флуоресценции у мутанта и отсутствию какого-либо отклика на облучение зеленым светом. Эта позиция более критична для флуоресценции, чем 143. Замена аминокислоты в 143 позиции в мутанте S158V не приводит к

значительному изменению его свойств. Исследование структура S158V показало, что хромофор принимает z/z/c-конформацию, как и в белке GFP.

Методы рентгеноструктурного анализа не позволяют определить положения атомов водорода в структуре белка. Поэтому преобладающую протонированную форму хромофора (рисунок 5) в основном состоянии темной формы белка с помощью данного метода экспериментально определить невозможно. Наиболее важные позиции хромофора, способные участвовать в кислотно-основном равновесии: это и-фенокси-кислород и пептидный атом азота остатка Туг64. Поэтому возможно равновесие между четырьмя протонированными состояниями хромофора: катион, нейтральная форма, цвитгерион и анион.

Поскольку время жизни активной формы природного белка asFP595 невелико (примерно 7 с [32]), ее структуру определить затруднительно. Поэтому авторы [50] выбрали для этой цели мутант A143S. Этот белок обладает большим, по сравнению с природным asFP595, квантовым выходом процесса разгорания флуоресценции и весьма продолжительным временем жизни активной формы, что важно для получения приемлемых результатов.

нейтральный

анион цвиттерион

Рисунок 5. Возможные протонированные формы хромофора белка asFP595.

2.1.3. Схема фотопереключения

В работе [50] были получены рентгеновские структуры мутанта asFP595-A143S в темной форме, а также структуры того же мутанта после интенсивного облучения зеленым светом (550/40 нм) в течение 1 мин и 5 мин. Анализ полученных структур показал, что процесс фотопереключения сопряжен с процессом транс-цис изомеризации мостиковой связи хромофора белка (фотоизомеризация). В темной форме хромофор присутствует исключительно в виде транс-томсрп, тогда как активная форма содержит г/г/оизомер, подобно флуоресцирующему мутанту asFP595-S158V. В случае недостаточного облучения (1 мин) активирующим излучением получается смесь темной и активной форм белка.

Таким образом, процесс фотопереключепия белка asFP595 можно описать следующим образом (рисунок 6): хромофор в обычном состоянии присутствует в виде транс-изомера, но при облучении зеленым светом происходит транс-цис изомеризация его мостикового фрагмента. Полученный г/г/с-изомер неустойчив и спонтанно изомеризуется с возвращением в исходное состояние. Данный процесс также ускоряется облучением синим светом (-450 нм).

Аналогичный процесс фотоизомеризации хромофора наблюдается и для хромофора GFP в растворе [57-59]. В настоящее время существует несколько предположений относительно деталей механизма протекания изомеризации. Первоначально, предполагали процесс с синхронным или почти синхронным вращением по обеим мостиковым связям (hula-twist в англоязычной литературе, [60]). Этот механизм кажется более предпочтительным в белковом окружении, чем простое вращение по связи мостик-имидазольное кольцо, поскольку для его осуществления необходимо меньше свободного места. Однако причин, по которым второй путь реализован быть не может, пока не было найдено. Вероятно, протекание изомеризации возможно по обоим механизмам.

"О

ці/с-изомер активная форма

транс- изомер темная форма

о

Рисунок 6. Схема фотопереключения белка asFP595.

2.1.4. Оптические свойства белка asFP595

Поглощение и флуоресценция

Спектры поглощения и флуоресценции белка asFP595 предоставляют важную информацию как для его практического применения, так и для теоретических исследований. Его темная форма обладает полосой поглощения с максимумом 575 нм и широким плечом в синей части спектра. Квантовый выход флуоресценции темной формы чрезвычайно мал и не превышает 0.001. Однако даже такое его значение позволяет исследовать спектры возбуждения и испускания флуоресценции. Авторам [48] удалось получить аналогичные данные для малоустойчивой активной формы белка при 150 К. Обе формы характеризуются максимумом флуоресценции при 600 нм и пиком возбуждения флуоресценции при 580 нм. Поскольку стоксов сдвиг флуоресценции мал (-1000 см"1), то, в сравнении с белком GFP, можно соотнести спектр флуоресценции с испусканием аниона или цвиттериона хромофора. Для нейтрального хромофора, согласно экспериментальным и теоретическим исследованиям [61,62], величина сдвига должна быть значительно больше.

В мутанте A143S, как уже было сказано выше, содержится заметное количество активной формы. Поскольку темная форма белка практически

не флуоресцирует, то спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции этого мутанта можно отнести только к активной форме. Оптические спектры мутанта А143 8 незначительно отличаются от свойств природного азРР595.

Данные сверхбыстрой фемтосекундной спектроскопии

Методы пико- и фемтосекундной спектроскопии позволяют изучать эволюцию системы при фотовозбуждении с высоким временным разрешением, что делает их чрезвычайно мощным инструментом исследования динамики первичных процессов в флуоресцентных системах. В работе [48] было изучено поведение темной формы белка при фотоактивации. Спектры поглощения и флуоресценции белка с высоким временным разрешением представляют собой сложные многоэкспонентные зависимости.

Зависимость флуоресценции белка от времени изменяется при варьировании мощности возбуждающего излучения (таблица 1). В случае низкой интенсивности в спектре преобладает экспонента с малым (17 пс) характеристическим временем, что говорит о существовании механизма сверхбыстрой дезактивации флуоресценции.

Таблица 1. Характеристические времена и их относительные амплитуды для белка азРР595 и его мутанта А1438 [48].

Эксперимент Характеристические времена, пс Амплитуды, %

флуоресценция, азРР595, низкая интенсивность возбуждающего излучения 17 230 1600 84 11 5

флуоресценция, аБрР595, высокая интенсивность возбуждающего излучения 150 800 2200 45 30 25

поглощение, аБрР595 0.32 2.6 12.1 78 19 3

поглощение, азРР595-А1438 0.24 52 386 2.4 56 13 13 18

При эксперименте с возбуждающим излучением высокой интенсивности значительно возрастают амплитуды экспонент наносекундного диапазона. Авторы связывают этот эффект с образованием в ходе опыта активной формы белка. При этом меньшее из этих из времен, по-видимому, соответствует адаптации белкового окружения к хромофору в возбужденном электронном состоянии.

Полученная в статье [48] зависимость поглощения белка от времени примечательна отсутствием в спектре компонент с большими характеристическими временами. Было получено время жизни темной формы в возбужденном состоянии - 300 фс, что на несколько порядков меньше подобного значения для активной формы (2.2 не). Этот факт хорошо объясняет малый квантовый выход флуоресценции темной формы белка и свидетельствует о наличие высокоэффективного канала безызлучательной релаксации для транс-изомера хромофора в белке. Хромофор в активной форме белка, напротив, способен находиться продолжительное время в возбужденном электронном состоянии, что существенно увеличивает квантовый выход флуоресценции по сравнению с темной формой.

Мутант А1438 характеризуется присутствием как фемтосекундной, так и наносекундной составляющих в спектре поглощения, что, по-видимому, свидетельствует о присутствии некоторого количества активной формы в данном белке при обычных условиях.

Экспериментальная зависимость спектра поглощения темной формы мутанта А143С в возбужденном электронном состоянии от времени [63] представляет большой интерес для понимания процессов, протекающих в возбужденном электронном состоянии. Сразу после фотовозбуждения появляется полоса поглощения с максимумом 480 нм, в диапазоне 600-650 им — полоса вынужденного испускания. Интенсивность этих полос чрезвычайно быстро падает со временем - через -1.5 пс полоса поглощения 450-500 нм исчезает, а в диапазоне 600-650 нм вынужденное испускание сменяется поглощением. Через ~5 пс белок возвращается в исходное

состояние. Появление отрицательного пика в диапазоне 520 - 590 нм на разностном спектре поглощения (рисунок 7) связано с поглощением основного электронного состояния хромофора в этом диапазоне. В таблице 2 приведены характеристические времена для этих полос поглощения. Очевидно, что совпадающие характеристические времена (80 фс и 380 фс) соответствуют одним и тем же процессам, происходящим на поверхности возбужденного электронного состояния.

0.004 0.002 0.000

о о

< -0.002 -0.004 -0.006 -0.008

Рисунок 7. Спектры фотоиндуцированного поглощения мутанта A143G рН 7.0 при задержках: 1-80 фс; 2 -400 фс; 3-1,5 пс; 4 - 4,5 пс [63].

Таблица 2. Характеристические времена темной формы мутанта A143G, при различных длинах волн детектирования.

X, им Характеристические времена

450 80 фс, 385 фс

600 80 фс, 380 фс, 1.34 пс

Заключение диссертации по теме «Математическая и квантовая химия», Миронов, Владимир Андреевич

Выводы

1. Показано, что анионная форма хромофора преобладает как в темной, так и в активной форме белка аБрР595. Подтверждено отнесение наблюдаемой полосы поглощения азРР595, ответственной за тушение флуоресценции, к нейтральной форме хромофора.

2. Причиной высокого квантового выхода флуоресценции активной формы белка азРР595 является плоское строение цис-изомера хромофора в белке в возбужденном электронном состоянии. Для трансизомера хромофора темной формы белка характерны два основных канала безызлучательной релаксации в основное электронное состояние, связанных с вращением мостиковых связей. Оба канала отвечают коническим пересечениям поверхностей потенциальной энергии Эо и

3. В основе процесса фотоактивации белка азРР595 лежит фотоиндуцированная реакция изомеризации аниона хромофора, связанная с одним из каналов быстрой безызлучательной релаксации. Низкий квантовый выход фотоактивации объясняется особенностями топографий соответствующего конического пересечения и потенциальной поверхности состояния Б] вблизи точки вертикального электронного перехода.

4. Показано, что основной канал термической деактивации флуоресцирующей формы белка а$РР595 соответствует структурам с анионной формой хромофора.

5. Основное отличие белков тСЬеггу и тБ^ахуЬеггу по отношению к внешнему давлению объясняется различной подвижностью их структур. Изменение оптических свойств белка тБ^алуЬеггу связано с наличием двух конформеров белка, соотношение которых зависит от внешнего давления.

6.3. Заключение

Полученные результаты показывают, что рост давления приводит к существенным изменениям в сети водородных связей хромофора, в числе молекул воды, окружающих его. При этом структура хромофора существенно не изменяется. Ключевым отличием белков т81га\уЬеггу и шСЬеггу является их структурная подвижность, причем структура тСЬегту более жесткая. Структурная подвижность т81га\уЬеггу также приводит к существованию 2-х конформеров (К1 и К2), находящихся в приблизительно равной пропорции при атмосферном давлении. Они отличаются положением 8ег146 и обладают различными оптическими свойствами (спектр К2 сдвинут в красную область) и поведением при росте давления. При высоких значениях внешнего давления конформация К1, которая идентична рентгеновской структуре, становится доминирующей. Таким образом, влияние давления на спектры белка тБЦ-ачуЬеггу можно с помощью двух факторов: изменение в энергии возбуждения для каждой из конформаций, и изменение соотношения конформаций. Рассчитанная величина сдвига в поглощении (+0.04 эВ) согласуется с экспериментальной величиной сдвига в спектре флуоресценции (+0.09 эВ). Анализ электростатического взаимодействия хромофора с его окружением позволил объяснить причину данного сдвига. Согласно расчетам, основной вклад в данный сдвиг вносит высококонсервативный остаток ЬуБ70. Положительный заряд па протонированной аминогруппе данного остатка стабилизирует основное состояние анионной формы хромофора, которая имеет значительный отрицательный заряд на атоме кислорода имидазолинонового фрагмента. При изменении давления также изменяется расстояние между этми остатком и хромофором, что и приводит к синему сдвигу в обеих конформациях.

Белок тСЬегту характеризуется меньшей подвижностью структуры при атмосферном давлении. Для него не было обнаружено существование нескольких конформеров. Следовательно, стоит ожидать менее выраженного эффекта влияния давления на оптические свойства белка.

Стоит отметить, что расстояние между остатком Ьуэ70 и хромофором также уменьшается с ростом давления, что также отражается в небольшом синем сдвиге флуоресценции, наблюдаемом экспериментально.

Согласно полученным в работе данным можно сделать вывод, что давление увеличивает квантовый выход только флуоресцентных белков с относительно подвижной структурой, тогда как более жесткие флуоресцентные белки обладают квантовым выходом, близким к максимальному. Существенное увеличение квантового выхода для некоторых флуоресцентных белков может быть признаком существования нескольких конформеров данного белка при атмосферном давлении. Также стоит отметить, что причина низкого квантового выхода некоторых флуоресцентных белков является динамической по природе и зависит больше от подвижности структуры и флуктуаций в сети водородных связей фотоактивного центра, чем от их строения.

7. Термическая изомеризация хромофора белка asFP595 и его мутантов

Время жизни активной формы разгорающегося флуоресцентного белка связано с барьером термической цис-транс изомеризации хромофора. У природного белка asFP595 время полупревращения флуоресцирующей формы весьма мало (не превышает 10 с), что затрудняет его применение в качестве флуоресцентного биомаркера. Попытки улучшить эту характеристику с помощью мутагенеза показали, что замена остатка Ala 143 на глицин (мутант KFP) приводит к увеличению этого времени на порядок (-50 с). В данной работе был проведен расчет энергии изомеризации хромофоров белка asFP595 и его мутанта KFP в основном электронном состоянии.

7.1. Методика расчетов

Для изучения данного процесса был проведен расчет профиля свободной энергии Гельмгольца вдоль координаты реакции изомеризации хромофора для белков asFP595 и KFP с помощью метода зонтичной выборки [30,31] совместно с методом взвешенных гистограмм (WHAM [148]). Данный подход предполагает разделение реакционного пути на отдельные участки (так называемые «окна»). Для каждого окна выбирается некоторый сглаживающий потенциал и проводится молекулярная динамика. Общий профиль свободной энергии получается объединением результатов с отдельных окон с помощью процедуры WHAM.

В качестве стартового приближения были использованы данные рентгеноструктурного анализа. Координаты тяжелых атомов для белков \vt-asFP595 и KFP были взяты из банка данных белковых структур PDB (PDB ID: 2А50 и 1XMZ соответственно). После добавления недостающих атомов водорода, обе системы были погружены в куб воды размером -60x70x60 А3. Для соблюдения электронейтральности систем, к ним были добавлены ионы Na+ и СГ в физиологических концентрациях. Для описания атомов белка, молекул воды (TIP3P) и ионов использовалось силовое поле CIIARMM. Параметры силового поля, как и в случае белков mFruits, были аналогичны таковым для белка GFP [102].

Вначале были проведены предварительные расчеты с помощью программы NAMD для достижения термодинамического равновесия. Длины траекторий составили 5 не с шагом 1фс. Расчеты были проведены в ансамбле NPT (300 К, 1 бар). Остальные параметры расчетов аналогичны таковым для mFruits (глава 5.1).

Для расчета профиля изомеризации был использован программный пакет СР2К. Для описания системы использовалось приближение КМ/ММ. КМ подсистема включала в себя хромофор, остатки Lys67, Arg92, Glu 145, Ser 158, Glu 195, Hisl97, Glu215 и несколько молекул воды, и описывалась с помощью метода DFT (BLYP/QZV2P). ММ-подсистема включала в себя все остальные атомы и описывалась силовым полем CHARMM.

В качестве координаты реакции £ была выбрана полусумма торсионных углов связи мостик-имидазол (см. рисунок 15): 1 f = - (¿.(N2-CA2-CB2-HBÏ) + z(iC2-CA2-CB2-CG)) (10)

Такой выбор координаты реакции позволяет избежать нежелательной пирамидализации мостикового атома углерода в процессе изомеризации [56]. Путь реакции был разбит на 16-18 окон в зависимости от исследуемой системы. Для данного исследования были использованы гармонические сглаживающие потенциалы. Силовые постоянные и центры приложения выбранных для окон потенциалов следующие:

1. KFP, анион хромофора: 0, 20, 40, 60, 80, 120, 130, 160, 180, 200 - 40 ккал/(моль-радиан); 90, 95, 100, 108, 110 -80 ккал/(моль-радиан); 85, 115 - 60 ккал/(моль-радиан); 103 -160 ккал/(моль-радиан).

2. asFP595, анион хромофора: 0, 20, 40, 60, 80, 100, 115, 120, 140, 160, 180, 200 - 40 ккал/(моль-радиаи); 90, 95, 105, 110 -80 ккал/(моль-радиан).

3. азРР595, нейтральный хромофор:0, 20, 40, 60, 120, 140, 160, 180, 200 - 40 ккал/(моль-радиан); 70 - 60 ккал/(моль-радиан); 80, 110 - 80 ккал/(моль-радиан); 90, 95, 98, 100, 105 -160 ккал/(моль-радиан). Параметры потенциала выбирались с таким расчетом, чтобы добиться хорошего перекрывания гистограмм распределения вероятности Р(() между отдельными окнами.

Расчет КМ/ММ молекулярно-динамических траекторий был осуществлен в несколько этапов. На первом этапе была проведена изомеризация хромофора в белке (в приближении КМ/ММ) в рамках одной МД-траектории с помощью изменяющегося во времени гармонического потенциала с силовой постоянной 40 ккал/моль-радиан. Результаты этого расчета использовались для получения стартовых структур для каждого окна метода зонтичной выборки. После этого с помощью программы ИАМЕ) проводили 200 пс МД с использованием силовых полей для релаксации ММ-части системы. Координаты атомов КМ-части на этом этапе фиксировались. Далее для каждого окна были получены отдельные МД-траектории с использованием соответствующего сглаживающего потенциала. Также, чтобы избежать локального перегрева КМ-части, перед каждым КМ/ММ молекулярно-динамическим расчетом систему релаксировали в течение 1-2 пс при малом времени релаксации термостата (1 фс). Результаты расчета профиля свободной энергии с помощью метода взвешенного анализа гистограмм приведены на рисунке 31 и в таблице 15. Критерий сходимости процедуры по энергии 10~6 ккал/моль.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Миронов, Владимир Андреевич, 2013 год

Список литературы

1. Jensen F. Introduction to Computational Chemistry. John Wiley & Sons, 2006. P. 624.

2. MacKerell A.D., Bashford D., Dunbrack R.L., Evanseck J.D., Field M.J., et al. All-Atom Empirical Potential for Molecular Modeling and Dynamics Studies of Proteins //J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102, N. 18. P. 3586-3616.

3. Cornell W.D., Cieplak P., Bayly C.I., Gould I.R., Merz K.M., et al. A Second Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117, N. 19. P. 5179-5197.

4. Szabo A., Ostlund N.S. Modern Quantum Chemistry: Introduction to Advanced Electronic Structure Theory. Courier Dover Publications, 1996. P. 480.

5. Siegbahn P.E.M., Himo F. The quantum chemical cluster approach for modeling enzyme reactions // WIREs Comput. Mol. Sci. 2011. V. 1, N. 3. P. 323-336.

6. Warshel A., Levitt M. Theoretical studies of enzymic reactions: Dielectric, electrostatic and steric stabilization of the carbonium ion in the reaction of lysozyme // J. Mol. Biol. 1976. V. 103, N. 2. P. 227-249.

7. Bakowies D., Thiel W. Hybrid Models for Combined Quantum Mechanical and Molecular Mechanical Approaches // J. Phys. Chem. 1996. V. 100, N. 25. P.10580-10594.

8. Senn H.M., Thiel W. QM/MM methods for biomolecular systems. // Angew. Chem., Int. Ed. 2009. V. 48, N. 7. P. 1198-1229.

9. Foresman J.B., Head-Gordon M., Pople J.A., Frisch M.J. Toward a systematic molecular orbital theory for excited states // J. Phys. Chem. 1992. V. 96, N. l.P. 135-149.

10. Head-Gordon M., Rico R.J., Oumi M., Lee T.J. A doubles correction to electronic excited states from configuration interaction in the space of single substitutions // Chem. Phys. Lett. 1994. V. 219, N. 1-2. P. 21-29.

11. Grimme S. Improved second-order Moller-Plesset perturbation theory by separate scaling of parallel- and antiparallel-spin pair correlation energies // J. Chem. Phys. 2003. V. 118, N. 20. P. 9095-9102.

12. Jung Y., Lochan R.C., Dutoi A.D., Head-Gordon M. Scaled opposite-spin second order Möller-Plesset correlation energy: an economical electronic structure method. // J. Chem. Phys. 2004. V. 121, N. 20. P. 9793-9802.

13. Rhee Y.M., Head-Gordon M. Scaled second-order perturbation corrections to configuration interaction singles: efficient and reliable excitation energy methods. // J. Phys. Chem. A. 2007. V. 111, N. 24. P. 5314-5326.

14. Garavelli M. Computational Organic Photochemistry: Strategy, Achievements and Perspectives // Theor. Chem. Acc. 2006. V. 116, N. 1-3. P. 87-105.

15. Granovsky A.A. Extended multi-configuration quasi-degenerate perturbation theory: the new approach to multi-state multi-reference perturbation theory. // J. Chem. Phys. 2011. V. 134, N. 21. P. 214113.

16. Nakano II. Quasidegenerate perturbation theory with multiconfigurational self-consistent-field reference functions // J. Chem. Phys. 1993. V. 99, N. 10. P. 7983.

17. Zerner M.C. Semiempirical Molecular Orbital Methods // Rev. Comp. Ch. / ed. Lipkowitz K.B., Boyd D.B. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 1991. V. 2. P. 313-366.

18. Зубова H.H., Булавина А.Ю., Савицкий А.П. Спектральные и физико химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 163-224.

19. Topol I.A., Collins J.R., Polyakov I.V., Grigorenko B.L., Nemukhin A. V. On photoabsorption of the neutral form of the green fluorescent protein chromophore. // Biophys. Chem. Elsevier B.V., 2009. V. 145, N. 1. P. 1-6.

20. Collins J.R., Topol I.A., Nemukhin A.V., Savitsky A.P. Computational modeling structure and spectra of biological chromophores // Proc. of SPIE. SPIE, 2009. V. 7191. P. 719102-719102-5.

21. Bolhuis P.G., Chandler D., Dellago C., Geissler P.L. Transition path sampling: throwing ropes over rough mountain passes, in the dark. // Annual review of physical chemistry. 2002. V. 53. P. 291-318.

22. Shaitan K.V., Ermolaeva M.D., Saraikin S.S. Nonlinear dynamics of molecular systems and the correlations of internal motions in oligopeptides // Ferroelectrics. 1999. V. 220, N. 1. P. 205-220.

23. Karplus M., McCammon J.A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. //Nat. Struct. Mol. Biol. 2002. V. 9, N. 9. P. 646-652.

24. Rahman A. Molecular Dynamics Study of Liquid Water // J. Chem. Phys. 1971. V. 55, N. 7. P. 3336.

25. Kuksin A.Y., Norman G.E., Pisarev V. V., Stegailov V.V., Yanilkin A.V. Theory and molecular dynamics modeling of spall fracture in liquids // Phys. Rev. B: Condens. Matter Mater. Phys. 2010. V. 82, N. 17. P. 174101.

26. Springel V. Smoothed Particle Hydrodynamics in Astrophysics // Annual Review of Astronomy and Astrophysics. 2010. V. 48, N. 1. P. 391-430.

27. Rapaport D.C. The Art of Molecular Dynamics Simulation // Book / ed. Rapaport D.C. Cambridge University Press, 2004. V. 2, N. 2. P. 549.

28. Frenkel D., Smit B. Understanding Molecular Simulation: From Algorithms to Applications. Academic Press, 2001. P. 664.

29. Chipot C., Pohorille A. Free Energy Calculations: Theory and Applications in Chemistry and Biology. Springer London, Limited, 2007.

30. Torrie G.M., Valleau J.P. Nonphysical sampling distributions in Monte Carlo free-energy estimation: Umbrella sampling // Journal of Computational Physics. 1977. V. 23, N. 2. P. 187-199.

31. Kästner J. Umbrella sampling // WIREs Comput. Mol. Sei. 2011. V. 1, N. 6. P. 932-942.

32. Chudakov D.M., Feofanov A. V, Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278, N. 9. P. 7215-7219.

33. Lin M.Z., McKeown M.R., Ng H.-L., Aguilera T.A., Shaner N.C., et al. Autofluorescent proteins with excitation in the optical window for intravital imaging in mammals. // Chemistry & biology. Elsevier Ltd, 2009. V. 16, N. 11. P. 1169-1179.

34. Anderson R.R., Parrish J.A. The Optics of Human Skin. // J. Invest. Dermatol. 1981. V. 77, N. 1. P. 13-19.

35. Tromberg B.J., Shah N., Lanning R., Cerussi A., Espinoza J., et al. Noninvasive in vivo characterization of breast tumors using photon migration spectroscopy. // Neoplasia (New York, N.Y.). 2000. V. 2, N. 1-2. P. 26-40.

36. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22, N. 12. P. 1567-1572.

37. Shu X., Shaner N.C., Yarbrough C.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. // Biochemistry. 2006. V. 45, N. 32. P. 9639-9647.

38. Matz M.V, Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17, N. 10. P. 969-973.

39. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2000. V. 97, N. 22. P. 1199011995.

40. Wall M.A., Socolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2000. V. 7, N. 12. P. 1133-1138.

41. Yarbrough D., Wächter R.M., Kallio K., Matz M. V, Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2001. V. 98, N. 2. P. 462-467.

42. Tubbs J.L., Tainer J.A., Getzoff E.D. Crystallographic structures of Discosoma red fluorescent protein with immature and mature chromophores: linking peptide bond trans-cis isomerization and acylimine formation in chromophore maturation. // Biochemistry. 2005. V. 44, N. 29. P. 9833-9840.

43. Bravaya K.B., Subach O.M., Korovina N., Verkhusha V. V., Krylov A.I. Insight into the common mechanism of the chromophore formation in the red fluorescent proteins: the elusive blue intermediate revealed. // J. Am. Chem. Soc. 2012. V. 134, N. 5. P. 2807-2814.

44. Strack R.L., Strongin D.E., Mets L., Glick B.S., Keenan R.J. Chromophore formation in DsRed occurs by a branched pathway. // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132, N. 24. P. 8496-8505.

45. Pakhomov A.A., Martynov V.l. Posttranslational chemistry of proteins of the GFP family // Biochemistry (Moscow). 2009. V. 74, N. 3. P. 250-259.

46. Степаненко О.В., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии // Цитология. 2007. Т. 49, №. 5. С.395-420.

47. Lukyanov К.А., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Matz M.V, Labas Y.A., et al. Natural animal coloration can Be determined by a nonfluorescent green fluorescent protein homolog. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, N. 34. P. 25879-25882.

48. Schüttrigkeit T.A., Feilitzsch T. Von, Kompa C.K., Lukyanov K.A., Savitsky A.P., et al. Femtosecond study of light-induced fluorescence increase of the dark chromoprotein asFP595 // Chem. Phys. 2006. V. 323, N. 2-3. P. 149-160.

49. Chudakov D.M., Belousov V.V, Zaraisky A.G., Novoselov V.V, Staroverov D.B., et al. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21, N. 2. P. 191-194.

50. Andresen M., Wahl M.C., Stiel A.C., Gräter F., Schäfer L.V., et al. Structure and mechanism of the reversible photoswitch of a fluorescent protein. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2005. V. 102, N. 37. P. 1307013074.

51. Wilmann P.G., Petersen J., Devenish R.J., Prescott M., Rossjohn J. Variations on the GFP chromophore: A polypeptide fragmentation within the chromophore revealed in the 2.1-A crystal structure of a nonfluorescent chromoprotein from Anemonia sulcata. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280, N. 4. P. 2401-2404.

52. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., et al. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. //Biochemistry. 2005. V. 44, N. 15. P. 5774-5787.

53. Ivashkin P.E., Yampolsky I. V, Lukyanov K.A. Synthesis and properties of chromophores of fluorescent proteins // Russ. J. Bioorg. Chem. 2009. V. 35, N. 6. P. 652-669.

54. Tretyakova Y.A., Pakhomov A.A., Martynov V.l. Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129, N. 25. P. 7748-7749.

55. Yampolsky I.V, Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., et al. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. // Biochemistry. 2005. V. 44, N. 15. P. 5788-5793.

56. Olsen S., Smith S.C. Bond selection in the photoisomerization reaction of anionic green fluorescent protein and kindling fluorescent protein chromophore models. // J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130, N. 27. P. 86778689.

57. Bell A.F., He X., Wachter R.M., Tonge P.J. Probing the ground state structure of the green fluorescent protein chromophore using Raman spectroscopy. // Biochemistry. 2000. V. 39, N. 15. P. 4423-4431.

58. He X., Bell A.F., Tonge P.J. Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore // FEBS Lett. 2003. V. 549, N. 1-3. P. 3538.

59. Vengris M., Van Stokkum I.II.M., He X., Bell A.F., Tonge P.J., et al. Ultrafast Excited and Ground-State Dynamics of the Green Fluorescent Protein Chromophore in Solution // J. Phys. Chem. A. 2004. V. 108, N. 21. P. 4587-4598.

60. Martin M.E., Negri F., Olivucci M. Origin, nature, and fate of the fluorescent state of the green fluorescent protein chromophore at the CASPT2//CASSCF resolution. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126, N. 17. P. 5452-5464.

61. Lossau H., Kummer A.D., Heinecke R., Pôllinger-Dammer F., Kompa C.K., et al. Time-resolved spectroscopy of wild-type and mutant Green Fluorescent Proteins reveals excited state deprotonation consistent with fluorophore-protein interactions // Chem. Phys. 1996. V. 213, N. 1-3. P. 116.

62. Kummer A.D., Wiehler J., Schuttrigkeit T.A., Berger B.W., Steipe B., et al. Picosecond time-resolved fluorescence from blue-emitting chromophore variants Y66F and Y66H of the green fluorescent protein. // Chembiochem : a European journal of chemical biology. 2002. V. 3, N. 7. P. 659-663.

63. Shelaev I., Mironov V.A., Rusanov A.L., Gostev F., Bochenkova A.V., et al. The origin of radiationless conversion of the excited state in the kindling fluorescent protein (KFP): femtosecond studies and quantum modeling // Laser Phys. Lett. 2011. V. 8, N. 6. P. 469-474.

64. Martynov V.l., Savitsky A.P., Martynova N.Y., Lukyanov K.A., Lukyanov S. Alternative cyclization in GFP-like proteins family. The formation and structure of the chromophore of a purple chromoprotein from Anemonia sulcata. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276, N. 24. P. 2101221016.

65. Zagranichny V.E., Rudenko N. V, Gorokhovatsky A.Y., Zakharov M.V, Balashova T.A., et al. Traditional GFP-type cyclization and unexpected fragmentation site in a purple chromoprotein from Anemonia sulcata, asFP595. // Biochemistry. 2004. V. 43, N. 42. P. 13598-13603.

66. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G., Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1996. V. 93, N. 16. P. 8362-8367.

67. Altoè P., Bernardi F., Garavelli M., Orlandi G., Negri F. Solvent effects on the vibrational activity and photodynamics of the green fluorescent protein chromophore: a quantum-chemical study. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127, N. 11. P. 3952-3963.

68. Olsen S., Smith S.C. Radiationless decay of red fluorescent protein chromophore models via twisted intramolecular charge-transfer states. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129, N. 7. P. 2054-2065.

69. Toniolo A., Granucci G., Martinez T.J. Conical Intersections in Solution: A QM/MM Study Using Floating Occupation Semiempirical Configuration Interaction Wave Functions // J. Phys. Chem. A. 2003. V. 107, N. 19. P. 3822-3830.

70. Nemukhin A.V., Topol I.A., Burt S.K. Electronic Excitations of the Chromophore from the Fluorescent Protein asFP595 in Solutions // J. Chem. Theory Comput. 2006. V. 2, N. 2. P. 292-299.

71. Grigorenko B.L., Savitsky A.P., Topol I.A., Burt S.K., Nemukhin A.V. Ground-state structures and vertical excitations for the kindling fluorescent protein asFP595. // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110, N. 37. P. 1863518640.

72. Schäfer L.V., Groenhof G., Klingen A.R., Ullmann G.M., Boggio-Pasqua M., et al. Photoswitching of the Fluorescent Protein asFP595: Mechanism, Proton Pathways, and Absorption Spectra // Angew. Chem. 2007. V. 119, N. 4.P.536-542.

73. Amat P., Granucci G., Buda F., Persico M., Tozzini V. The chromophore of asFP595: a theoretical study. // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110, N. 18. P. 9348-9353.

74. Sun M. Excited state properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein: 2D and 3D theoretical analyses // Int. J. Quantum Chem. 2006. V. 106, N. 4. P. 1020-1026.

75. Bravaya K.B., Bochenkova A.V., Granovsky A.A., Savitsky A.P., Nemukhin A. V. Modeling photoabsorption of the asFP595 chromophore. //J. Phys. Chem. A. 2008. V. 112,N. 37. P. 8804-8810.

76. Sinicropi A., Andruniow T., Ferré N., Basosi R., Olivucci M. Properties of the emitting state of the green fluorescent protein resolved at the CASPT2//CASSCF/CHARMM level. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127, N. 33. P. 11534-11535.

77. Nemukhin A.V., Bochenkova A.V., Bravaya K.B., Granovsky A.A. Accurate modeling of the S0-S1 photo-absorption in biological chromophores // Proc. of SPIE. SPIE, 2007. V. 6449. P. 64490N-64490N-5.

78. Schäfer L.V., Groenhof G., Boggio-Pasqua M., Robb M.A., Grubmüller Ii. Chromophore protonation state controls photoswitching of the fluoroprotein asFP595. // PLoS Comput. Biol. 2008. V. 4, N. 3. P. ЄІ000034.

79. Chapagain P.P., Regmi C.K., Castillo W. Fluorescent protein barrel fluctuations and oxygen diffusion pathways in mCherry. // J. Chem. Phys. 2011. V. 135, N. 23. P. 235101.

80. Haidinger W., Szostak M.P., Beisker W., Lubitz W. Green fluorescent protein (GFP)-dependent separation of bacterial ghosts from intact cells by FACS. // Cytometry. 2001. V. 44, N. 2. P. 106-112.

81. Maksimow M., Hakkila K., Karp M., Virta M. Simultaneous detection of bacteria expressing GFP and DsRed genes with a flow cytometer. // Cytometry. 2002. V. 47, N. 4. P. 243-247.

82. Boldyreva E.V. Pligh-pressure diffraction studies of molecular organic solids. A personal view. // Acta Crystallogr., Sect. A: Found. Crystallogr. International Union of Crystallography, 2008. V. 64, N. Pt 1. P. 218-231.

83. Boldyreva E.V. Crystalline Amino Acids A link between chemistry, materials science and biology // Models, Mysteries and Magic of Molecules / ed. Boeyens J.C.A., Ogilvie J.F. Springer Netherlands, 2008. P. 167-192.

84. Boldyreva E.V., Sowa II., Seryotkin Y.V., Drebushchak T.N., Ahsbahs II., et al. Pressure-induced phase transitions in crystalline 1-serine studied by single-crystal and high-resolution powder X-ray diffraction // Chem. Phys. Lett. 2006. V. 429, N. 4-6. P. 474^178.

85. Hamann S.D. High Pressure Chemistry // Annu. Rev. Phys. Chem. 1964. V. 15, N. 1. P. 349-370.

86. Scheyhing C.I-L, Meersman F., Ehrmann M.A., Heremans K., Vogel R.F. Temperature-pressure stability of green fluorescent protein: a Fourier transform infrared spectroscopy study. // Biopolymers. 2002. V. 65, N. 4. P. 244-253.

87. Leiderman P., Huppert D., Remington S.J., Tolbert L.M., Solntsev K.M. The effect of pressure on the excited-state proton transfer in the wild-type green fluorescent protein // Chem. Phys. Lett. 2008. V. 455, N. 4-6. P. 303-306.

88. Verkhusha V.V., Pozhitkov A.E., Smirnov S.A., Borst J.W., Van Iloek A., et al. Effect of high pressure and reversed micelles on the fluorescent proteins // Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj. 2003. V. 1622, N. 3. P. 192-195.

89. I-Ierberhold II. Characterization of the Pressure-induced Intermediate and Unfolded State of Red-shifted Green Fluorescent Protein—A Static and Kinetic FTIR, UV/VIS and Fluorescence Spectroscopy Study // J. Mol. Biol. 2003. V. 330, N. 5. P. 1153-1164.

90. Mauring K., Deich J., Rosell F.I., McAnaney T.B., Moerner W.E., et al. Enhancement of the fluorescence of the blue fluorescent proteins by high pressure or low temperature. // J. Phys. Chem. B. 2005. V. 109, N. 26. P. 12976-12981.

91. Malavasi N.V., Foguel D., Bonafe C.F.S., Braga C.A.C.A., Chura-Chambi R.M., et al. Protein refolding at high pressure: Optimization using eGFP as a model // Process Biochem. Elsevier Ltd, 2011. V. 46, N. 2. P. 512-518.

92. Barstow B., Ando N., Kim C.U., Gruner S.M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. //Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A. 2008. V. 105, N. 36. P. 13362-13366.

93. Barstow B., Ando N., Kim C.U., Gruner S.M. Coupling of pressure-induced structural shifts to spectral changes in a yellow fluorescent protein. // Biophys. J. Biophysical Society, 2009. V. 97, N. 6. P. 1719-1727.

94. Pozzi E.A., Schwall L.R., Jimenez R., Weber J.M. Pressure-Induced Changes in the Fluorescence Behavior of Red Fluorescent Proteins. // J. Phys. Chem. B. 2012. V. 116,N. 34. P. 10311-10316.

95. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., et al. The Protein Data Bank. // Nucleic acids research. 2000. V. 28, N. 1. P. 235242.

96. Granovsky A.A. Firefly version 7.1 .G, WWW: http://classic.chem.msu.su/gran/firefly/index.html.

97. Ponder J.W., Richards F.M. An efficient newton-like method for molecular mechanics energy minimization of large molecules // J. Comput. Chem. 1987. V. 8, N. 7. P. 1016-1024.

98. Henderson J.N., Remington S.J. The kindling fluorescent protein: a transient photoswitchable marker. // Physiology (Bethesda). 2006. V. 21. P. 162-170.

99. Voityuk A.A., Michel-Beyerle M.-E., Rösch N. Quantum chemical modeling of structure and absorption spectra of the chromophore in green fluorescent proteins // Chem. Phys. 1998. V. 231, N. 1. P. 13-25.

100. Hasegawa J., Ise T., Fujimoto K.J., Kikuchi A., Fukumura E., et al. Excited states of fluorescent proteins, mKO and DsRed: chromophore-protein electrostatic interaction behind the color variations. // J. Phys. Chem. B. 2010. V. 114, N. 8. P. 2971-2979.

101. Phillips J.C., Braun R., Wang W., Gumbart J., Tajkhorshid E., et al. Scalable molecular dynamics with NAMD. // J. Comput. Chem. 2005. V. 26, N. 16. P. 1781-1802.

102. Reuter N., Lin II., Thiel W. Green Fluorescent Proteins: Empirical Force Field for the Neutral and Deprotonated Forms of the Chromophore. Molecular Dynamics Simulations of the Wild Type and S65T Mutant // J. Phys. Chem. B. 2002. V. 106, N. 24. P. 6310-6321.

103. Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Topol I.A., Burt S.K. Modeling of Biomoleeular Systems with the Quantum Mechanical and Molecular Mechanical Method Based on the Effective Fragment Potential Technique: Proposal of Flexible Fragments // J. Phys. Chem. A. 2002. V. 106, N. 44. P. 10663-10672.

104. Nemukhin A.V., Grigorenko B.L., Topol I.A., Burt S.K. Flexible effective fragment QM/MM method: validation through the challenging tests. // J. Comput. Chem. 2003. V. 24, N. 12. P. 1410-1420.

105. VandeVondele J., Krack M., Mohamed F., Parrinello M., Chassaing T., et al. Quickstep: Fast and accurate density functional calculations using a mixed Gaussian and plane waves approach // Comput. Phys. Commun. 2005. V. 167, N. 2. P. 103-128.

106. Goedecker S., Teter M., Hutter J. Separable dual-space Gaussian pseudopotentials // Phys. Rev. B: Condens. Matter Mater. Phys. 1996. V. 54, N. 3.P. 1703-1710.

107. Frisch M.J., Trucks G., Schlegel II.B., Scuseria G., Robb M.A., et al. Gaussian 03, Revision C.02.

108. Collins J.R., Topol I.A., Savitsky A.P., Nemukhin A.V. Modeling structure and spectra of the kindling fluorescent protein asFP595 // SPIE. 2011. V. 7910, N. May 2011. P. 79100C-79100C-5.

109. Laino T., Nifosi R., Tozzini V. Relationship between structure and optical properties in green fluorescent proteins: a quantum mechanical study of the chromophore environment// Chem. Phys. 2004. V. 298, N. 1-3. P. 17-28.

110. Filippi C., Zaccheddu M., Buda F. Absorption Spectrum of the Green Fluorescent Protein Chromophore: A Difficult Case for ab Initio Methods? // J. Chem. Theory Comput. 2009. V. 5, N. 8. P. 2074-2087.

111. Valsson O., Filippi C. Gas-Phase Retinal Spectroscopy: Temperature Effects Are But a Mirage // J. Phys. Chem. Lett. 2012. P. 908-912.

112. Ilasegawa J., Fujimoto K.J., Swerts B., Miyahara T., Nakatsuji H. Excited states of GFP chromophore and active site studied by the SAC-CI method: effect of protein-environment and mutations. // J. Comput. Chem. 2007. V. 28, N. 15. P. 2443-2452.

113. Callis P.R., Liu T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins // J. Phys. Chem. B. American Chemical Society, 2004. V. 108, N. 14. P. 4248-4259.

114. Lax M. The Franck-Condon Principle and Its Application to Crystals // J. Chem. Phys. 1952. V. 20, N. 11. P. 1752.

115. Li H., Jensen J.H. Partial Hessian vibrational analysis: the localization of the molecular vibrational energy and entropy // Theor. Chem. Acc. 2002. V. 107, N. 4. P. 211-219.

116. Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A., Elbert S.T., Gordon M.S., et al. General atomic and molecular electronic structure system // J. Comput. Chem. 1993. V. 14, N. 11. P. 1347-1363.

117. Bravaya K.B., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Krylov A.I. Quantum chemistry behind bioimaging: insights from ab initio studies of fluorescent proteins and their chromophores. // Acc. Chem. Res. 2012. V. 45, N. 2. P. 265-275.

118. Battad J.M., Wilmann P.G., Olsen S., Byres E., Smith S.C., et al. A structural basis for the pl-I-dependent increase in fluorescence efficiency of chromoproteins. // J. Mol. Biol. 2007. V. 368, N. 4. P. 998-1010.

119. Epifanovsky E., Polyakov I., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Krylov

A.I. Quantum Chemical Benchmark Studies of the Electronic Properties of the Green Fluorescent Protein Chromophore. 1. Electronically Excited and Ionized States of the Anionic Chromophore in the Gas Phase // J. Chem. Theory Comput. 2009. V. 5, N. 7. P. 1895-1906.

120. Olsen S., McKenzie R.H. A dark excited state of fluorescent protein chromophores, considered as Brooker dyes // Chem. Phys. Lett. Elsevier

B.V., 2010. V. 492, N. 1-3. P. 150-156.

121. Yarkony D.R. Diabolical conical intersections // Rev. Mod. Phys. 1996. V. 68, N. 4. P. 985-1013.

122. Yarkony D.R. Conical Intersections: The New Conventional Wisdom // J. Phys. Chem. A. 2001. V. 105, N. 26. P. 6277-6293.

123. Atchity G.J., Xantheas S.S., Ruedenberg K. Potential energy surfaces near intersections//J. Chem. Phys. 1991. V. 95, N. 3. P. 1862.

124. Martinez T.J. Physical chemistry: Seaming is believing. // Nature. 2010. V. 467, N. 7314. P. 412-413.

125. Toniolo A., Olsen S., Manohar L., Martinez T.J. Conical intersection dynamics in solution: The chromophore of Green Fluorescent Protein // Faraday Discuss. 2004. V. 127. P. 149.

126. Olsen S., McKenzie R.II. A diabatic three-state representation of photoisomerization in the green fluorescent protein chromophore. // The Journal of chemical physics. 2009. V. 130, N. 18. P. 184302.

127. Rusanov A.L., Mironov V.A., Goryashenko A.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., et al. Conformational partitioning in pl-I-induced fluorescence of the kindling fluorescent protein (KFP). // J. Phys. Chem. B. 2011. V. 115, N. 29. P. 9195-9201.

128. Voityuk A.A. Structure and rotation barriers for ground and excited states of the isolated chromophore of the green fluorescent protein // Chem. Phys. Lett. 1998. V. 296, N. 3-4. P. 269-276.

129. Olsen S., Lamothe K., Martinez T.J. Protonic gating of excited-state twisting and charge localization in GFP chromophores: a mechanistic hypothesis for reversible photoswitching. // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132, N. 4. P. 1192-1193.

130. Zhang L., Hermans J. Hydrophilicity of cavities in proteins. // Proteins. 1996. V. 24, N. 4. P. 433-438.

131. Olsson M.H.M., Sondergaard C.R., Rostkowski M., Jensen J.II. PROPKA3: Consistent Treatment of Internal and Surface Residues in Empirical pKa Predictions // J. Chem. Theory Comput. 2011. V. 7, N. 2. P. 525-537.

132. Dmitrienko D.V., Vrzheshch E.P., Drutsa V.L., Vrzheshch P.V. Red fluorescent protein DsRed: Parametrization of its chromophore as an amino acid residue for computer modeling in the OPLS-AA force field // Biochemistry (Moscow). 2006. V. 71, N. 10. P. 1133-1152.

133. Marx D., Hutter J. Ab initio molecular dynamics: theory and implementation // Modern Methods and Algorithms of Quantum Chemistry. 2000. V. 1. P. 301^149.

134. Grimme S., Antony J., Ehrlich S., Krieg H. A consistent and accurate ab initio parametrization of density functional dispersion correction (DFT-D) for the 94 elements H-Pu. // J. Chem. Phys. 2010. V. 132, N. 15. P. 154104.

135. Nose S. A molecular dynamics method for simulations in the canonical ensemble // Mol. Phys. 1984. V. 52, N. 2. P. 255-268.

136. Chai J.-D., Head-Gordon M. Systematic optimization of long-range corrected hybrid density functionals. // J. Chem. Phys. 2008. V. 128, N. 8. P. 084106.

137. Shao Y., Molnar L.F., Jung Y., Kussmann J., Ochsenfeld C., et al. Advances in methods and algorithms in a modern quantum chemistry program package. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2006. V. 8, N. 27. P. 31723191.

138. Hsiao Y., Sanchez-Garcia E., Doerr M., Thiel W. Quantum refinement of protein structures: implementation and application to the red fluorescent protein DsRed.Ml. // J. Phys. Chem. B. 2010. V. 114, N. 46. P. 1541315423.

139. Meech S.R. Excited state reactions in fluorescent proteins. // Chem. Soc. Rev. 2009. V. 38, N. 10. P. 2922-2934.

140. Sniegowski J.A., Phail M.E., Wachter R.M. Maturation efficiency, trypsin sensitivity, and optical properties of Arg96, Glu222, and Gly67 variants of green fluorescent protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 332, N. 3.P. 657-663.

141. Jung G., Wiehler J., Zumbusch A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. // Biophysical journal. Elsevier, 2005. V. 88, N. 3. P. 1932-1947.

142. Zuev D., Bravaya K.B., Makarova M.V, Krylov A.I. Effect of microhydration on the electronic structure of the chromophores of the photoactive yellow and green fluorescent proteins. // J. Chem. Phys. 2011. V. 135, N. 19. P. 194304.

143. Day R., Garcia A.E. Water penetration in the low and high pressure native states of ubiquitin. // Proteins. 2008. V. 70, N. 4. P. 1175-1184.

144. Meinhold L., Smith J.C., Kitao A., Zewail A.H. Picosecond fluctuating protein energy landscape mapped by pressure temperature molecular dynamics simulation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. V. 104, N. 44. P. 17261-17265.

145. Collins M.D., Hummer G., Quillin M.L., Matthews B.W., Gruner S.M. Cooperative water filling of a nonpolar protein cavity observed by high-pressure crystallography and simulation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. V. 102, N. 46. P. 16668-16671.

146. Voityuk A.A., Kummer A.D., Michel-Beyerle M.-E., Rôsch N. Absorption spectra of the GFP chromophore in solution: comparison of theoretical and experimental results // Chem. Phys. 2001. V. 269, N. 1-3. P. 83-91.

147. Dong J., Solntsev K.M., Tolbert L.M. Solvatochromism of the green fluorescence protein chromophore and its derivatives. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128, N. 37. P. 12038-12039.

148. Roux B. The calculation of the potential of mean force using computer simulations // Comput. Phys. Commun. 1995. V. 91, N. 1-3. P. 275-282.

149. Weber W., Helms V., McCammon J.A., Langhoff P.W. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999. V. 96, N. 11. P. 6177-6182.

150. Nemukhin A.V., Topol I.A., Grigorenko B.L., Savitsky A.P., Collins J.R. Conformation dependence of pKa's of the chromophores from the purple asFP595 and yellow zFP538 fluorescent proteins. // J. Mol. Struc-THEOCHEM. 2008. V. 863, N. 1-3. P. 39-43.

151. Nielsen J.E., McCammon J.A. Calculating pKa values in enzyme active sites. // Protein science : a publication of the Protein Society. 2003. V. 12, N. 9. P. 1894-1901.

152. Li H., Robertson A.D., Jensen J.H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. // Proteins. 2005. V. 61, N. 4. P. 704721.

Список сокращений

АИВМ1 - 2-ацетил-4-(4-гидроксибензилидеи)-1 -метилимидазолин-5-он

CASSCF - метод самосогласованного поля в полном пространстве

активных орбиталей

CI - коническое пересечение

DFT - метод функционала электронной плотности

GFP - зеленый флуоресцентный белок

HBDI - 4-(4-гидроксибензилиден)-1,2-диметилимидазолин-5-он

XMCQDPT2 - расширенный метод многоконфигурационной

квазивырожденной теории возмущений второго порядка

MECI - точка с минимальной энергией на поверхности конического

пересечения.

MRMP2 - многоконфигурационная теория возмущений Меллера-Плессе второго порядка

SA-CASSCF - многоконфигурационный метод самосогласованного поля в полном пространстве активных орбиталей с усреднением электронной плотности по нескольким состояниям

SS-CASSCF - многоконфигурационный метод самосогласованного поля в полном пространстве активных орбиталей с усреднением электронной плотности по одному электронному состоянию WHAM - метод взвешенных гистрограмм

ZINDO - вариант метода частичного пренебрежения дифференциальным перекрыванием, предложенный М. Зернером ВЗМО - высшая занятая молекулярная орбиталь KB - метод конфигурационного взаимодействия КМ - молекулярно-механическая подсистема

КМ/ММ - комбинированный метод квантовой и молекулярной механики

МД - метод молекулярной динамики

ММ - молекулярно-механическая подсистема

НСМО - низшая свободная молекулярная орбиталь

ППЭ - поверхность потенциальной энергии

РСА - метод рентгеноструктурного анализа

СКО - среднеквадратичное отклонение

ЭСП - электростатический потенциал