Регуляция катаболических сигнальных путей при функциональной разгрузке M.soleus крысы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат наук Белова, Светлана Павловна

• Белова, Светлана Павловна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Белова, Светлана Павловна

Список сокращений.....................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................6

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................13

1.1. Функциональная разгрузка скелетной мышцы............................................13

1.2. Вывешивание и мышечная масса..................................................................13

1.3. Механизмы, ответственные за потерю белка в скелетной мышце............14

1.3.1. Регуляция кальпаин-опосредованного цитоскелетного протеолиза.... 15

1.3.2. Убиквитин-протеасомная система и ее роль в деградации белков......18

1.3.3. Транскрипционная регуляция мышечно-специфических E-3-лигаз MuRF-1 и MAFbx при атрофических процессах..............................................23

2. ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................32

2.1. Экспериментальные методы и подходы.......................................................32

2.1.1. Объект исследований................................................................................32

2.1.2. Вывешивание крыс. Введение нифедипина на фоне 3-х суточного вывешивания........................................................................................................32

2.1.3. Вывешивание крыс. Введение PD150606 на фоне 3-х суточного вывешивания........................................................................................................33

2.1.4. Введение ШВ-0354, блокатора ОТ-^ сигналинга, крысам на фоне 3 -х суточного вывешивания..................................................................................34

2.1.5. Введение бортезомиба, протеасомного ингибитора, крысам на фоне 7-ми суточного вывешивания................................................................................35

2.2. Методики обработки биоматериала и анализ данных.................................37

2.2.1. ДДС-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом....................37

2.2.2. Исследование экспрессии генов..............................................................39

2.3. Анализ полученных данных...........................................................................43

2.3.1. Анализ блотов............................................................................................43

2.3.2. Анализ данных ПЦР-РВ...........................................................................43

2.4. Статистическая обработка данных................................................................43

3 .РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................................45

3.1. Эффект блокирования кальциевых каналов L-типа при вывешивании .... 45

3.2. Исследование действия ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы m.soleus при функциональной разгрузке...................47

3.3. Исследование действия IMD-0354, ингибитора МР-кВ сигналинга, на атрофию т. soleus при вывешивании...................................................................54

3.4. Исследование действия протеасомного ингибитора бортезомиба на атрофические процессы в т. soleus при вывешивании......................................61

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................................................69

4.1. Блокирование L-кальциевых каналов при вывешивании.........................69

4.2. Действие ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы при функциональной разгрузке т^о1еш.............................................................70

4.3. Роль №-кВ сигналинга в развитии атрофии при функциональной разгрузке т. soleus...................................................................................................73

4.4. Действие протеасомного ингибитора на катаболические и анаболические сигнальные пути при функциональной разгрузке т^о1еш...............................76

ВЫВОДЫ...................................................................................................................81

Список используемой литературы...........................................................................82

Список сокращений

MuRF-1 - E3-y6mBffraH^^a3a (muscle ring finger 1)

атрогин-1/MAFbx - E3-yбиквитин-лигaзa (атрогин-1/muscle atrophy F-box)

ЭГТА - этиленгликоль-бис(2-аминоэтил-эфир)тетрауксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Akt/PKB — протеинкиназа B

DHPR - дигидропиридиновые рецепторы

eIF2 - фактор инициации трансляции 2

eIF4E - фактор инициации трансляции 4E (5'-cap-связывaюший фактор)

FOXO - семейство транскрипционных факторов

GSK3P - киназа гликоген-синтазы Эр (glycogen sintase kinase ЭР)

IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста 1

m. soleus - musculus soleus;

mTOR - белок, активность которого блокируется рапамицином (mammalian target of rapamicin)

NF-kB - транскрипционный фактор (nuclear factor-кБ transcription factor) IkB - ингибитор kB IKKp - киназа IkB

PHAS-1/4E-BP1 - связывающий фактор инициации трансляции 4E

p70S6k - киназа S6 рибосомального белка p70

P-p70S6k - фосфорилированная форма p70S6k

PD 150606 - (Z)-3-(4-Iodophenyl)-2-mercapto-2-propenoic acid

IMD-0354 - N-(3,5-Bis-trifluoromethyl-phenyl)-5-chloro-2-hydroxy-benzamide

Ub - убиквитин

MyLC1 - легкие цепи миозина I

MyLC2 - легкие цепи миозина II

MyHC - тяжелые цупи миозина

MyBP-C - миозин-связывающий белок С

KLF-15 - транскрипционный фактор (Kruppel-like factor 15)

eIF3-f - эукариотический фактор инициации трансляции

GRE - глюкокортикоид-зависимый элемент промотора GR - глюкокортикоидный рецептор TNFa - фактор некроза опухоли a

NFATcl - ядерный фактор (Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция катаболических сигнальных путей при функциональной разгрузке M.soleus крысы»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

В настоящее время известно, что атрофия скелетных мышц при функциональной разгрузке вызывается снижением синтеза белка и усилением его распада [1, 2]. Сократительные белки занимают около 70 % объема мышечного волокна, и эта фракция разрушается быстрее при атрофии [з]. Деградация миофибриллярных белков в скелетной мышце опосредована кальпаиновой и убиквитин-протеасомной системами (рис.1)[4].

Ранее было обнаружено, что при функциональной разгрузке в мышце резко увеличивается концентрация кальция [5, 6] и остается на этом уровне длительное время [б]. Кальпаины становятся протеолитически активными только при аутолизе, который происходит при повышенной концентрации кальция в среде (рис.1) [7]. Кальций может проникать из внеклеточного пространства через различные типы наружных кальциевых каналов, а также поступать из структур саркоплазматического ретикулума (рис.1) [8]. В нашей лаборатории ранее проводился эксперимент с блокированием кальциевых каналов L-типа, и атрофию удалось частично предотвратить, однако, механизм этого эффекта остался неясным. В данной работе мы предположили, что введение нифедипина, блокатора кальциевых каналов L-типа (дигидропиридиновых рецепторов (DHPR)), предотвратит активацию кальпаинов и распад цитоскелетных белков т^о1еш на ранних этапах разгрузки.

Известно, что Е3-лигаза МиКР-1 участвует в убиквитинировании толстых филаментов при атрофии [8]. Однако толстые филаменты защищены от убиквитирования в миофибриллах связанными белками [8]. Кальпаины могут подготавливать толстые филаменты к убиквитинированию [10]. Существуют данные, что протеасомы, являющиеся конечным звеном убиквитин-протеасомной системы (см. рис.1.), начинают деградацию миофибриллярных белков только после того, как находящиеся вокруг них белки будут отщеплены

от миофибриллярной структуры кальпаинами [11]. В тоже время сообщается, что ингибирование активности кальпаинов не снижало протеасомную деградацию миофибриллярных белков при сепсисе [13]. Таким образом, несмотря на имеющиеся опубликованные работы по регуляции деградации белка на различных моделях атрофии [9,10,11], в настоящее время не ясно, является ли активация кальпаинов необходимым шагом для протеасомной деградации миофибриллярных белков при функциональной разгрузке. Мы предположили, что ингибирование активности кальпаинов блокатором РЭ150606 при функциональной разгрузке снизит активность убиквитин-протеасомной системы.

Рис.1. Протеолитические системы скелетной мышцы и возможные механизмы их взаимодействия (рисунок по Sorimachi H. and Ono Y.,2012 [12] с модификациями).

MAFbx и MuRFl - мышечно-специфические Е3-лигазы, экспрессия которых значительно увеличивается уже на третьи сутки функциональной разгрузки [14]. Мыши, у которых не синтезируются атрогин-1/MAFbx и MuRFl устойчивы к мышечной атрофии [14]. В настоящее время в литературе большое внимание уделяется вопросу регуляции экспрессии ЕЗ-лигаз атрогин-1/MAFbx и MuRFl различными транскрипционными факторами [15,16,17,18,19]. Существует достаточно данных в поддержку FOXO3a как транскрипционного фактора, регулирующего экспрессию атрогин-1/MAFbx и MuRFl [15, 16, 17]. В работах нашей лаборатории не всегда наблюдается четкое соответствие экспрессии атрогин-1/MAFbx и MuRFl уровню pFOXO3, что может указывать на существование других механизмов регуляции экспрессии Е3-лигаз. В 2014 г. Кандарян С. с соавторами было обнаружено, что для транскрипционной активации MuRF-1 при атрофии скелетных мышц запрашивается сайт NF-kB (nuclear factor kB), а не FOXO [18,19]. Подавляющая часть экспериментов по участию сигнального пути NF-kB в развитии атрофии была сделана с использованием нокаутных животных, или с помощью введения в мышцу плазмид (т.е. при использовании генетических модификаций) [20, 21]. Известно, что плазмиды проникают в ограниченное число мышечных волокон, а нокаутные животные могут иметь механизмы, компенсирующие отсутствие гена. В связи с этим, актуальным становится исследование роли сигнального пути NF-kB на интактных животных. В данной работе внимание уделено влиянию нативных IKKP и 1кВа, являющихся ключевыми в активации всего сигнального каскада NF-kB [22], на атрофические процессы в скелетной мышце и экспрессию MuRF-1 и MAFbx при действии разгрузки как естественного физиологического фактора.

У человека через десять дней разгрузки концентрация свободных аминокислот в мышце увеличивается на 48% [23]. Было сделано предположение, что накопление эндогенных аминокислот при функциональной разгрузке мышц может активировать работу протеасомной системы и регулировать работу анаболических сигнальных путей (регулировать экспрессию

ЕЗ-лигаз и активность каскада сигнального пути mTOR-p70S6k) (см. рис.2.). Так как аминокислоты являются продуктом деградации белков в протеасоме, для проверки этой гипотезы мы решили ингибировать работу протеасом при функциональной разгрузке мышц.

Рис. 2. Возможные механизмы воздействия аминокислот на атрофические процессы в мышце (Рисунок по 8ап^1 М. и др., 2006 [15] с модификациями).

Ранее применяли ингибирование протеасом при различных моделях атрофии и получали ее снижение [24, 25, 26]. Однако было отмечено, что применяемые ингибиторы протеасом (MG132, КЬ^ могли ингибировать и кальпаины [25]. Кроме того, эти исследования были сделаны на моделях, в которых активно работает лизосомальная система протеолиза, кроме убиквитин-протеасомной, а также наблюдается апоптоз (это модели денервации, иммобилизации). Влияние ингибирования протеасом с помощью специфических ингибиторов на развитие атрофических процессов при функционально разгрузке, моделируемой вывешиванием, исследовано не было. В данной работе для исследования функциональной разгрузки мышц использован наиболее специфический ингибитор протеасом - бортезомиб.

Цель и задачи исследования:

Целью настоящего исследования являлось исследование механизмов регуляции катаболических сигнальных путей при функциональной разгрузке скелетных мышц, в частности m.soleus.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить роль накопления кальция в цитоплазме при функциональной разгрузке мышц в активации кальпаинов, экспрессии ЕЗ-лигаз MuRF-1 и MAFbx и разрушении цитоскелетных белков.

2. Исследовать роль активации кальпаинов в регуляции работы убиквитин-протеасомной системы и анаболических сигнальных путей с помощью введения ингибитора кальпаинов PD150606.

3. Изучить роль транскрипционных факторов NF-kB в увеличении экспрессии ЕЗ-лигаз MuRF-1 и atrogin-1/MAFbx и развитии атрофии скелетных мышц крыс при их трехдневной функциональной разгрузке с помощью введения IMD-0354, ингибитора IKKp.

4. Оценить роль накопления аминокислот методом ингибирования работы протеасом в предотвращении атрофии m.soleus, вызванной функциональной разгрузкой.

Положения, выносимые на защиту

1. Увеличение поступления кальция в мышечное волокно через кальциевые каналы L-типа при функциональной разгрузке мышц приводит к активации ц-кальпаина и разрушению цитоскелетных белков.

2. Кальпаин-1 участвует в регуляции экспрессии ЕЗ-лигаз и развитии атрофии в скелетной мышце при ее функциональной разгрузке. Блокирование кальпаинов предотвращает развитие атрофии.

3. Ингибирование сигнального пути NF-kB in vivo с помощью IMD-0354 предотвращает деградацию IkBa, но не ингибирует экспрессию ЕЗ-

убиквитинлигаз MuRF-1 и MAFbx при сроке функциональной разгрузки в 3 дня.

4. Ингибирование протеасом при функциональной разгрузке мышц приводит к снижению протеолитических процессов, но не затрагивает анаболические сигнальные пути.

Научная новизна работы

1. Впервые обнаружено, что блокирование кальциевых каналов L-типа предотвращает активацию ц-кальпаина и снижает степень разрушения цитоскелетных белков при функциональной разгрузке m.soleus.

2. Впервые показано, что введение ингибитора кальпаинов PD150606 вывешенным животным приводит к снижению экспрессии кальпаина-1 и предотвращает развитие мышечной атрофии, вызванной функциональной разгрузкой, воздействуя как на катаболические, так и на анаболические сигнальные пути.

3. Впервые в эксперименте in vivo с использованием ингибитора обнаружено, что сигнальный путь NF-kB принимает участие в регуляции экспрессии ЕЗ-лигаз MuRF-1 и MAFbx при функциональной разгрузке мышц. Впервые показано, что блокирование in vivo киназной активности IKKP, компонента сигнального пути NF-kB, не предотвращает развитие атрофических процессов скелетных мышц, вызванных функциональной разгрузкой. Обнаружена также взаимосвязь между работой IKKbeta и экспрессией ЕЗ-лигаз MuRF-1 и Atragm-1/MAFbx.

4. Впервые предпринята попытка проверить гипотезу о том, что накопление эндогенных аминокислот при функциональной разгрузке мышц может регулировать экспрессию ЕЗ-лигаз и активность каскада сигнального пути mTOR-p70S6k. Впервые показано, что ингибирование протеасом с помощью бортезомиба снижает активность катаболических сигнальных путей, не оказывая какого-либо влияния на анаболические сигнальные пути.

Научно-практическая значимость

Выявление механизмов регуляции катаболических сигнальных путей, участвующих в развитии атрофических процессов в скелетных мышцах, приведет к пониманию природы перестройки их структурных и функциональных характеристик и возможности их защиты от повреждающих воздействий, а также функциональной коррекции в заданном направлении. Полученные в работе данные могут найти приложение в космической и реабилитационной медицине, нейрологии и геронтологии. На основе этих фундаментальных исследований станет возможна разработка препаратов, защищающих белки мышц от разрушения и предотвращающих развитие мышечной атрофии при гипокинезии и гравитационной разгрузке, а также при различных патологических состояниях.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная разгрузка скелетной мышцы

Скелетная мышца обладает уникальной способностью к адаптации. В ответ на меняющиеся условия функционирования мышечные волокна способны изменять свои физиологические, морфологические и биохимические свойства. Например, при хронической электростимуляции и эксцентрической нагрузке повышение сократительной активности приводит к гипертрофии, а при бездействии мышца атрофируется [27, 28].

Для изучения процессов, происходящих в мышце при атрофии, были разработаны несколько способов моделирования у животных бездействия скелетной мышцы, включая иммобилизацию задних конечностей, денервацию и вывешивание.

Вывешивание является наиболее распространенной моделью для изучения эффектов функциональной разгрузки на мышцу. В литературе достаточно много данных, полученных с помощью денервации мышц. Однако денервация приводит не только к бездействию мышц, но и к нарушениям трофической регуляции, что может затруднять интерпретацию получаемых данных. Согласно методике вывешивания Ильина-Новикова [29] животное подвешивается за хвост таким образом, что передние конечности опираются на пол, а задние его не касаются. Данная модель также широко используется для моделирования космического полёта и микрогравитации, т.к. она отражает некоторые аспекты этого воздействия и вызывает схожие признаки мышечной атрофии, которые наблюдаются, как у животных, так и у человека при космическом полёте [30].

1.2. Вывешивание и мышечная масса

Вывешивание приводит к развитию атрофии скелетной мышцы. бшб кН. с соавторами показали, что степень развития атрофии зависит от типа

скелетной мышцы и типа ее волокон [31]. Экстензоры, содержащие в основном медленные мышечные волокна, такие как soleus, проявляют более значительное развитие атрофии, чем флексоры, содержащие в основном волокна быстрого типа, такие как tibialis anterior и extensor digitorium longus. Следует также отметить, что мышцы со смешанным типом волокон, такие как gastrocnemius, атрофируются незначительно. Атрофия характеризуется уменьшением площади поперечного сечения мышечных волокон [32], наблюдается выборочная потеря сократительных белков (в основном миофибриллярных), составляющих примерно 70% от общего белка в мышце. Более того, вывешивание приводит к трансформации волокон медленного типа в быстрый [31, 33]. Такая адаптация может быть причиной развития дисфункции мышцы во время функциональной разгрузки.

1.3. Механизмы, ответственные за потерю белка в скелетной мышце

Функциональная разгрузка, вызванная длительной невесомостью или постельным режимом (вызванным различными заболеваниями) приводит к значительным изменениям скелетных мышц, преимущественно постуральных, как m.soleus. Исследования на животных [33] и добровольцах [34] показали, что разгрузка приводит к изменениям на молекулярном уровне, которые проявляются в потере массы мышц и ухудшении их функции. При разгрузке цитоскелетные и сократительные белки скелетных мышц подвергаются деструкции. Мышечная атрофия, вызванная разгрузкой, отличается от атрофии, вызванной денервацией или другими стимулами. Атрофия при разгрузке обусловлена снижением белкового синтеза и резким увеличением белкового распада [1]. Известны четыре протеолитические системы, вовлекаемые в распад мышечных белков: лизосомальная (аутофаги/лизосомы), каспазная, кальпаиновая, убиквитин-протеасомная. Степень вовлечения каждой из этих систем в развитие атрофии при различных её моделях (кахексия, сепсис,

денервация, иммобилизация, вывешивание) разная. Работа этих протеолитических систем изучалась по отдельности во всех этих моделях атрофии, но их взаимосвязи и степень вовлечения в процесс протеолиза изучены не достаточно.

Можно предположить, что эти системы могут участвовать в развитии атрофии одновременно и работать согласовано. Действительно, некоторые данные поддерживают эту гипотезу. Например, специфичный для мышцы кальпаин-3 вносит вклад в убиквитинирование белков [35], а активирование кальпаинов в миотубах увеличивает активность ферментов протеасом [36]. Но в противоположность этому Багееё М.и и др. [37] сообщили, что ингибирование кальпаинов в течение 16-часового сепсиса у крыс не привело к снижению протеасом-зависимой деградации белков. По мнению авторов, это свидетельствует о возможности независимой работы протеолитических путей при белковом распаде, вызванном сепсисом. А В. ВееЫег и др. [38] обнаружили предотвращение атрофии денервированных мышц при ингибировании протеасом, но в то же время отметили, что этот механизм действует не для всех моделей атрофии. М^адёгу полагает, что убиквитин-протеасомная и аутофаго-лизосомная системы являются главными протеолитическими путями, которые должны согласованно активироваться при атрофии мышцы [39]. Однако автор признаёт, что роль и регуляция аутофагового пути в скелетной мышце остаётся в большей части неизученной. Таким образом, анализ литературных данных, посвященных исследованиям работы и взаимодействия протеолитических систем при атрофии мышц, свидетельствует о достаточно большом разбросе мнений о регуляции белкового распада при атрофии.

1.3.1. Регуляция кальпаин-опосредованного цитоскелетного протеолиза

Кальпаины - внутриклеточные нелизосомальные Са2+ -регулируемые цистеиновые протеазы. Они опосредуют регуляторное расщепление специфических субстратов во множестве процессов, связанных с

дифференцировкой, жизнью и смертью клетки. Мышечная ткань экспрессирует в основном 3 вида кальпаинов: кальпаин 1 и 2 (также называемые ц- и m-), которые лучше охарактеризованы, и кальпаин 3 (также называемый p94), который высоко экспрессирован в этой ткани. Подтверждения того, что кальпаины играют ключевую роль в атрофии, основаны на данных, полученных с помощью анализа их экспрессии, измерения активности кальпаинов и использования ингибиторов кальпаинов. Установлено, что содержание кальпаинов увеличено в атрофических состояниях, таких как бездействие, денервация, сепсис и др. [40, 41, 42, 43, 44]. Однако, этих данных не достаточно для того, чтобы точно установить роль кальпаинов в атрофии мышц, потому что увеличение в экспрессии РНК и/или белка не обязательно связано с увеличением активности, тогда как активность кальпаинов зависит от соотношения кальин/кальпастатин.

Данные, полученные с помощью введения ингибиторов кальпаинов (леупептин, E-64 и др.) могут искажать действительную картину участия кальпаинов в атрофии ввиду недостаточной их специфичности, так как они могут ингибировать катепсины и другие цистеиновые протеазы [45]. Использование трансгенных мышей с оверэкспрессией кальпастатина, который не только ингибирует его активность, но также предотвращает его связывание с мембранами, подтверждает участие кальпаинов в атрофии [46].

Известны работы, где применяли блокирование кальпаинов на культуре мышечных клеток [46], при сепсисе мышц [48] и некоторых других случаях, в которых сигнальные пути, задействованные в белковой деградации, отличны от процессов, вызывающих атрофию при функциональной разгрузке мышц. Блокирование кальпаинов при функциональной разгрузке встречается в очень небольшом количестве работ, где исследовалось изменение функциональных характеристик мышц и изменение мышечной массы [49, 50]. Однако

механизмы этих изменений (т.е. сигнальные пути, которые могли быть задействованы в этих процессах) исследованы не были.

В то время как роль кальпаинов в атрофии не вызывает сомнений, трудно выделить вклад каждой изоформы кальпаинов в этот процесс. Они могут играть различную роль в развитии атрофии, так как имеют различные активационные сигналы и могут быть локализованы в различных частях клетки [51].

Ранее было обнаружено, что при функциональной разгрузке в мышце резко увеличивается концентрация кальция [5, 6], и остаётся на этом уровне длительное время, что может приводить к активации кальпаинов [52]. Такое увеличение наблюдалось после 10-суточного вывешивания мышей. Причем концентрация Ca2+ повышалась уже после 2 суток вывешивания [53]. Tischler M.E. и соавторы в своей работе уделили внимание роли m- и ^-кальпаинов при атрофии, развивающейся при гравитационной разгрузке [54]. Robyn M. Murphy и Graham D. Lamb показали, что кальпаины становятся протеолитически активными только при аутолизе, который происходит при повышенной концентрации кальция в среде. Причём это повышение может быть незначительным, но должно держаться в течение длительного времени [55].

Активация ^-кальпаинов происходит при микромолярных (физиологических) концентрациях ионов кальция, в то время как для активации m-кальпаинов в бесклеточной системе необходимы более высокие миллимолярные концентрации. К гравитационной разгрузке наиболее чувствительными оказались ^-кальпаины. Изменения m-кальпаинов были менее выраженными. В последнее время стало известно, что m-кальпаины также могут быть активированы физиологическими концентрациями ионов кальция с помощью ^-кальпаинов [56]. Субстратами кальпаинов является большое количество цитоскелетных белков, среди которых десмин, талин, титин, дистрофин [57, 58]. Динамика деструкции цитоскелетных, мембранных и сократительных белков при функциональной разгрузке неодинакова. Однако

уже через две недели вывешивания масса т. soleus снижается на 40%. Клеточные факторы, запускающие процесс атрофии, исследованы недостаточно.

В работах нашей лаборатории было показано, что при блокировании поступления кальция при разгрузке атрофия мышц частично предотвращается. Однако механизм этого процесса остаётся неисследованным. Вопрос о роли повышенной концентрации кальция при функциональной разгрузке мышц в активации кальпаинов изучен слабо. Взаимодействие кальпаинов с убиквитин-протеасомной системой также требует изучения.

1.3.2. Убиквитин-протеасомная система и ее роль в деградации белков

Деградация большинства (80-90%) белков в клетке осуществляется в 26S протеасоме [59;60]. Протеасома - очень крупная мультисубъединичная протеаза, присутствующая в клетках эукариот, архей и некоторых бактерий. В эукариотических клетках протеасомы содержатся и в ядре, и в цитоплазме. Основная функция протеасомы - протеолитическая деградация ненужных и повреждённых белков до коротких пептидов (4-25 аминокислотных остатков), которые затем могут быть расщеплены до отдельных аминокислот [94]. Во внутренней протеолитической полости коровой части протеасомы (20S протеасомы) располагается несколько пептидазных центров. Для того чтобы белок-мишень расщепился протеасомой, он должен быть помечен путём присоединения к нему маленького белка убиквитина (ЦЪ) (рис.1). Присоединение к белку молекул убиквитина осуществляется с помощью специфических Е3-убиквитинлигаз. В результате этого процесса к белку присоединяется полиубиквитиновая цепь, которая связывается с протеасомой и обеспечивает расщепление белка-мишени. Белок разворачивается при входе в канал протеасомы и протягивается через него, гидролизуясь до коротких пептидов, которые высвобождаются из противоположного отверстия канала [61, 62, 63, 64]. Сама молекула убиквитина внутрь протеасомы не попадает, а

после уничтожения меченой белковой молекулы освобождается и метит другую молекулу. Данный процесс получил название «убиквитин-зависимая деградация белка». За это открытие его авторы А.Чехановер, А.Хершко и И.Роуз (A.Ciechanoveг, Л.Не^ко, I.Rose) в 2004 году были удостоены Нобелевской премии по химии.

В мышце убиквитин-протеасомная система необходима для удаления саркомерных белков при изменении двигательной активности. В нескольких экспериментах было показано, что полиубиквитинированные белки накапливаются преимущественно в миофибриллярной фракции мышц грызунов в катаболических состояниях. Считается, что основные сократительные белки являются субстратами для убиквитин-протеасомной системы [65, 66].

Компоненты убиквитин-протеасомной системы активно синтезируются при бездействии [76, 77] и при атрофии другой природы (вызываемой голоданием, диабетом, раковыми заболеваниями и др.) [78]. Большая часть миофибриллярных белков при атрофии подвергается деградации через АТФ-зависимый убиквитин-протеасомный путь [79, 80]. Процесс убиквитинирования субстрата включает в себя взаимодействие трёх классов белков, а именно Е1 (убиквитин-активирующие), Е2 (убиквитин-связывающие), Е3 (убиквитин-лигазы).

В настоящее время значительное внимание уделяется увеличению экспрессии убиквитинлигаз при различных заболеваниях, т.к. из всех белков, вовлеченных в убиквитинирование субстрата, именно они имеют наибольшую специфичность по тканям и субстратам.

В скелетных мышцах при функциональной разгрузке особенно активно участвуют в процессах протеасомной деградации такие ЕЗ-лигазы, как атрогин-1/МЛБЬх и МиИБ-1 [1, 81, 82]. А нокауты по атрогин-УМЛБЬх и МиКБ-1 у мышей снизили на 56% и 36% соответственно потерю их мышечной массы

после 14-дневной денервации [1]. Эти белки часто используются в качестве маркёров мышечной атрофии.

Появляется все больше работ, посвященных анализу субстратов мышечно-специфических ЕЗ-лигаз MuRF-1 и MAFbx. С помощью методики двух-гибридного скрининга показано взаимодействие MuRF-1 с миофибриллярными белками: небулин, тропонины T1 и T3 и легкие цепи миозинов [8, 67, 83, 84]. Centner с соавторами показали, что MuRF-1 убиквитинирует титин [85]. В работе Witt S.H. и соавторов возможные мишени для MuRF-1 поделены на 2 класса: белки, вовлеченные в синтез АТФ, и миофибриллярные белки [67]. Множество миофибриллярных белков (например, титин, небулин, MyLC-2, cTNI), взаимодействующих с MuRF-1, не является основной мишенью этой Е3-лигазы, так как уровень их экспрессии и убиквитинирования не различался у нокаутных по MuRF-1 (MuRFl-КО) мышей и мышей дикого типа [67]. Анализ экспрессии белков у мышей с селективной оверэкспрессией MuRF-1 в скелетной мышце также подтверждает, что мишенями MuRF-1 являются не только миофибриллярные белки, так как мышцы трансгенных мышей не атрофировались и уровень экспрессии миофибриллярных белков не снижался относительно такового у животных дикого типа [68, 69]. Сравнение протеасом и транскриптомов MuRF-1-трансгенных мышей выявило значительные различия в ферментах, участвующих в синтезе АТФ, особенно вовлеченных в гликолиз, подтверждая тем самым важную роль MuRF-1 и в метаболической регуляции [68].

Участие MuRF-1 в деградации миофибриллярных белков подтверждается в работе Clarke B.A. и соавторов с использованием нокаутных мышей и культуры C2C12 [84]. Cohen S. и соавторы [9] сравнивали атрофический ответ мышей дикого типа и мутантов по MuRF-1 и сообщили, что после денервации и голодания потеря толстых филаментов, таких как миозин-связывающий белок C (MyBP-C) и легкие цепи миозина 1 и 2 (MyLC1 и MyLC2), происходила до

потери тяжелых цепей миозина (MyHC) и зависела от MuRF-1. Кроме того, был сделан вывод о том, что после разборки миофибрилл конечная убиквитинизация и деградация тяжелых цепей миозина (MyHC), но не актина или других белков тонких филаментов, были MuRF-1-зависимыми. Такая избирательная деградация белков толстых филаментов Е3-лигазой MuRF-1 основана на наблюдении, что содержание MyLCl, MyLC2, MyBP-C и MyHC было выше у мутантных по MuRF-1 мышей, чем у мышей дикого типа после 14-ти суток денервации, в то время как содержание актина и других белков тонких филаментов было снижено и у мутантных животных и у животных дикого типа. По-видимому, за деградацию тонких филаментов могут отвечать другие Е-3 лигазы [10, 70, 71]. Cohen S. и соавторы показали, что за убиквитинирование тонких филаментов может отвечать ЕЗ-лигаза Trim32 [9, 10].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Белова, Светлана Павловна, 2016 год

Список используемой литературы

1. Jackman R.W., Kandarian S.C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy.// Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2004, 287, с.834-843.

2. Bodine S.C. Disuse-induced muscle wasting, Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 2013. C.2200-2208.

3. Baldwin K.M., Herrick R.E., Ilyina-Kakueva E., Oganov V.S. Effects of zero gravity on myofibril content and isomyosin distribution in rodent skeletal muscle. // FASEB J., 1990, 4 p.79-83.

4. Solomon V., Goldberg A.L. Importance of the ATP-ubiquitin-proteasome pathway in the degradation of soluble and myofibrillar proteins in rabbit muscle extracts. // J. Biol. Chem. 271 (1996) С. 26690-26697.

5. Ingalls C.P., Warren G.L., Armstrong R.B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading.// J.Appl.Physiol. 1999. V. 87. № 1. P. 386-390.

6. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L. Calcium-dependent signaling mechanisms and soleus fiber remodeling under gravitational unloading. // J. Muscle Res.Cell Motil. 2008. V. 29. № 6/8. P. 221-230.

7. Verburg E., Murphy R.M., Richard I., Lamb G.D. Involvement of calpains in Ca2+-induced disruption of excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle fibers. //Amer. J. Physiol. Cell Physiol. 2009. V. 296. № 5.P. C. 1115-1122.

8. Мак-Комас А.Д. Скелетные мышцы, «Олимпийская литература», Киев, 2001, стр. 113.

9. Cohen S., Brault J.J., Gygi S.P., Glass D.J.,Valenzuela D.M., Gartner C., Latres E., Goldberg A.L. During muscle atrophy, thick, but not thin, filament components are degraded by MuRF1-dependent ubiquitylation.//J. Cell Biol. 2009. V. 185. № 6. P. 1083-1095.

10. Cohen S., Zhai B., Gygi S.P., Goldberg A.L. Ubiquitylation by Trim32 causes coupled loss of desmin, Z-bands, and thin filaments in muscle atrophy, J. Cell Biol., 2012, 198, p.575-589.

11.Goll D.E., Neti G., Mares S.W., Thompson V.F. Myofibrillar protein turnover: the proteasome and the calpains. //J. Anim. Sci. 86 (2008) C.19-35.

12.Sorimachi H., Ono Y. Regulation and physiological roles of the calpain system in muscular disorders. // Cardiovasc Res., 2012, 1; 96(1), p.11-22.

13.Fareed M.U., Evenson A.R., Wei W., Menconi M., Poylin V., Petkova V., Pignol B., Hasselgren P.O. Treatment of rats with calpain inhibitors prevents sepsis-inducedmuscle proteolysis independent of atrogin-1/MAFbx andMuRF1 expression. //Am. J.Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 2006, 290, C. 1589-1597.

14.Bodine S.C., Latres E., Baumhueter S, Lai V.K., Nunez L., Clarke B.A., Poueymirou W.T., Panaro F.J., Na E., Dharmarajan K., Pan Z.Q., Valenzuela D.M., DeChiara T.M., Stitt T.N., Yancopoulos G.D., Glass D.J. Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy.// Science., 2001; 294(5547): p.1704-1708.

15.Sandri M., Lin J., Handschin C., Yang W., Arany Z.P., Lecker S.H.,

Goldberg A.L., Spiegelman B.M. PGC-1alpha protects skeletal muscle from atrophy by suppressing FoxO3 action and atrophy-specific gene transcription. // Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: p. 16260-16265.

16.Sandri M., Sandri C., Gilbert A., Skurk C., Calabria E., Picard A., Walsh K, Schiaffino S, Lecker S.H., Goldberg A.L. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy.// Cell, 2004, 117, p. 399-412.

17.Senf S.M., Dodd S.L., McClung J.M., Judge A.R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. // FASEB J, 2008, 22, p.3836-3845.

18.Wu C.L., Cornwell E.W., Jackman R.W., Kandarian S.C. NF-kB but not FoxO sites in the MuRFl promoter are required for transcriptional activation in disuse muscle atrophy.// Am J Physiol Cell Physiol., 2014; 306(8), p.762-767

19.Jackman R.W., Cornwell E.W., Wu C.L., Kandarian S.C. Nuclear factor-KB signalling and transcriptional regulation in skeletal muscle atrophy.// Exp Physiol., 2013; 98(1), p.19-24.

20.Mourkioti F., Kratsios P., Luedde T., Song Y.H., Delafontaine P, Adami R., Parente V., Bottinelli R., Pasparakis M., Rosenthal N. Targeted ablation of IKK2 improves skeletal muscle strength, maintains mass, and promotes regeneration.// J Clin Invest., 2006; 116 (11): C. 2945-2954.

21.Judge A.R., Koncarevic A., Hunter R.B., Liou H.C., Jackman R.W., Kandarian S.C. Role for IkappaBalpha, but not c-Rel, in skeletal muscle atrophy.// American Journal of Physiology, 2007, V. 292, № 1, p.372-382.

22.Hosokawa S., Haraguchi G., Sasaki A., Arai H., Muto S., Itai A., Doi S., Mizutani S., Isobe M. Pathophysiological roles of nuclear factor kappaB (NF-kB) in pulmonary arterial hypertension: effects of synthetic selective NF-kB inhibitor IMD-0354.// Cardiovasc Res., 2013, 1; 99(1), p.35-43

23.Gamrin L., Berg H.E., Essen P., Tesch P.A., Hultman E., Garlick P.J., McNurlan M.A., Wernerman J. The effect of unloading on protein synthesis in human skeletal muscle.// Acta Physiol Scand., 1998; 163(4): C.369-377.

24.Tawa N.E. Jr., Odessey R., Goldberg A.L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.// J Clin Invest., 1997, №1; 100 (1):p.197-203.

25.Caron A.Z., Haroun S., Leblanc E., Trensz F., Guindi C., Amrani A, Grenier G. The proteasome inhibitor MG132 reduces immobilization-induced

skeletal muscle atrophy in mice. // BMC Musculoskelet Disord., 2011; 12: p.185.

26.Jamart C., Raymackers J.M., Li An G., Deldicque L., Francaux M. Prevention of muscle disuse atrophy by MG132 proteasome inhibitor. //Muscle Nerve, 2011; 43(5), p.708-716.

27.Baldwin K.D., Haddad F. Skeletal muscle plasticity: cellular and molecular responses to altered physical activity paradigms // Am. J. Phys. Med. Rehabil., 2002; 81: p.40-51.

28.Grichko VP1, Heywood-Cooksey A, Kidd KR, Fitts RH. Substrate profile in rat soleus muscle fibers after hindlimb unloading and fatigue. //J Appl Physiol (1985). 2000; 88(2):473-8.

29.Novikov V.E., Ilyin E.A. Age-related reactions of rat bones to their unloading. // Aviat. Space Environ. Med., 1981; 52(9): p.551-553.

30.Morey-Holton E.R., Globus R.K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects // J. Appl. Physiol., 2002; 92: p.1367-1377.

31.Fitts R.H., Riley D.R., Widrick J.J. Physiology of a microgravity environment: invited review: microgravity and skeletal muscle // J. Appl. Physiol., 2000; 89: p.823-839.

32.Templeton G.H., Sweeny L., Timson B.F., Padalino M., Dudenhoefter G.A. Changes in fiber composition of soleus muscle during rat hindlimb suspension // J.Appl. Physiol., 1988; 65: p. 1191-1195.

33.Thomason D. B. and Booth F.W. Atrophy of the soleusmuscle by hindlimb unweighting. //Journal of Applied Physiology, 1990, vol. 68, no. 1, C. 1-12.

34.Caiozzo V. J. Plasticity of skeletal muscle phenotype: mechanical consequences // Muscle and Nerve, 2002, vol. 26, no. 6, C. 740-768.

35.Kramerova I., Kudryashova E., Venkatraman G., Spencer M.J. Calpain 3 participates in sarcomere remodeling by acting upstream of the ubiquitin-proteasome pathway. // Hum Mol Genet., 2005; 14(15): C. 2125-2134.

36.Menconi M.J., Wei W., Yang H., Wray C.J., Hasselgren P.O. Treatment of cultured myotubes with the calcium ionophore A23187 increases proteasome activity via a CaMK II-caspase-calpain-dependent mechanism. // Surgery. 2004; 136(2): C.135-142.

37.Fareed M.U., Evenson A.R., Wei W., Menconi M., Poylin V., Petkova V., Pignol B., Hasselgren P.O.Treatment of rats with calpain inhibitors prevents sepsis-induced muscle proteolysis independent of atrogin-1/MAFbx and MuRF1 expression. //Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 2006; 290(6): C.1589-1597

38.Beehler B.C, Sleph P.G., Benmassaoud L., Grover G.J. Reduction of skeletal muscle atrophy by a proteasome inhibitor in a rat model of denervation. // Exp Biol Med (Maywood). 2006; 231(3): C. 335-341

39.Sandri M. Autophagy in skeletal muscle. //FEBS Lett. 2010; 584(7):C.1411-1416.

40.Haddad F., Roy R. R., Zhong H., Edgerton V. R., Baldwin K.M. Atrophy responses to muscle inactivity. II. Molecular markers of protein deficits. //Journal of Applied Physiology, 2003, 95,791-802

41.Hong D. H., Forsberg N. E. Effects of dexamethasone on protein degradation and protease gene expression in rat L8 myotube cultures. //Molecular and Cell Endocrinology, 1995, 108, p.199-209.

42.Tang H., Cheung W. M., Ip F. C., Ip N. Y. Identification and characterization of differentially expressed genes in denervated muscle.// Molecular and Cellular Neuroscience, 2000, 16,127-140.

43.Voisin L., Breuille D., Combaret L., Pouyet C., Taillandier D., Aurousseau E. Muscle wasting in a rat model of long-lasting sepsis results from the activation of lysosomal, Ca2+ -activated, and ubiquitin-proteasome proteolytic pathways.//Journal of Clinical Investigation,1996, 97, 1610-1617.

44.Williams A. B., Decourten-Myers G. M., Fischer J. E., Luo G., Sun X., Hasselgren P.O. Sepsis stimulates release of myofilaments in skeletal muscle by a calcium-dependent mechanism. // FASEB Journal, 1999, 13, 1435-1443

45.Donkor I. O. A survey of calpain inhibitors. // Current Medicinal Chemistry, 2000, 7, p. 1171-1188.

46.Tidball J.G., Spencer M. J. Expression of a calpastatin transgene slows muscle wasting and obviates changes in myosin isoform expression during murine muscle disuse.//Journal of Physiology, 2002, 545, p. 819-828.

47.Nozaki K., Das A., Ray S.K., Banik N.L. Calpain inhibition attenuates intracellular changes in muscle cells in response to extracellular inflammatory stimulation.// Exp Neurol., 2010; 225(2): p. 430-435.

48.Callahan L.A., Supinski G.S. Sepsis-induced myopathy.// Crit Care Med., 2009; 37: p.354-367.

49.Salazar J.J., Michele D.E., Brooks S.V. Inhibition of calpain prevents muscle weakness and disruption of sarcomere structure during hindlimb suspension. // J Appl Physiol., 2010; 108(1): p.120-127.

50.0tani K, Han D.H., Ford E.L., Garcia-Roves P.M., Ye H., Horikawa Y., Bell G.I., Holloszy J.O., Polonsky K.S. Calpain system regulates muscle mass and glucose transporter GLUT4 turnover.//J Biol Chem., 2004, 14; 279(20): p. 20915-20920.

51.Goll D.E., Thompson V.F., Li H., Wei W., Cong J. The calpain system. // Physiological Reviews, 2003, 83, p.731-801.

52.Costelli P., Tullio R.D., Baccino F. M., Melloni, E. Activation of Ca(2+)-dependent proteolysis in skeletal muscle and heart in cancer cachexia. // British Journal of Cancer, 2001, 84, 946-950.

53.Ingalls C., Environ.P., Wenke J.C., Armstrong R.B. Time course changes in [Ca2+]i,force and protein content in hindlimb-suspended mouse soleus muscles // Aviat.Space Med., 2001; 72(5): p.471-476.

54.Tischler M.E., Rosenberg S., Satarug S., Henriksen E.J., Kirby C.R., Tome M., Chase P. Different mechanisms of increased proteolysis in atrophy induced by denervation or unweighting of rat soleus muscle. // Metabolism, 1990; 39(7): p.756-763

55.Murphy R.M., Lamb G.D. Endogenous calpain-3 activation is primarily governed by small increases in resting cytoplasmic [Ca2+] and is not dependent on stretch.// J Biol Chem. 2009, 20;284(12): p.7811-7819.

56.Garcia Diaz B.E., Gauthier S., Davies P.L. Ca2+ dependency of calpain 3 (p94) activation. // Biochemistry, 2006; 45: p.3714-3722.

57.Bartoli M., Richard I. Calpains in muscle wasting // Int. J. Biochem. Cell Biol., 2005; 37: p.2115-2133.

58.Enns D.L., Raastad T., Ugelstad I., Belcastro A.N. Calpain/calpastatin activities and substrate depletion patterns during hindlimb unweighting and reweighting in skeletal muscle // Eur. J. Appl. Physiol., 2007; 100(4): p.445-455.

59.Rock K.L., Gramm C., Rothstein L., Clark K., Stein R., Dick L., Hwang D., Goldberg A.L. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.// Cell., 1994, 9; 78(5), p. 761-771.

60.Craiu A., Gaczynska M., Akopian T., Gramm C.F., Fenteany G., Goldberg A.L., Rock K.L. Lactacystin and clasto-lactacystin beta-lactone modify

multiple proteasome beta-subunits and inhibit intracellular protein degradation and major histocompatibility complex class I antigen presentation. //J Biol Chem., 1997, 16; 272(20): p.13437-13445.

61.Kisselev A.F., Akopian T.N., Goldberg A.L. Range of sizes of peptide products generated during degradation of different proteins by archaeal proteasomes. // J Biol Chem., 1998, 23; 273(4): p.1982-1989.

62.Kisselev A.F., Akopian T.N., Woo K.M., Goldberg A.L. The sizes of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20 S proteasomes. Implications for understanding the degradative mechanism and antigen presentation. // J Biol Chem., 1999, 5; 274 (6): p. 3363-3371.

63.Glickman M.H., Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.// Physiol Rev., 2002; 82(2): p. 373-428.

64.Ciechanover A., Schwartz A.L. Ubiquitin-mediated degradation of cellular proteins in health and disease. // Hepatology, 2002, 35(1): p.3-6.

65.Combaret L., Tilignac T., Claustre A., Voisin L., Taillandier D., Obled C., Tanaka K., Attaix D. Torbafylline (HWA 448) inhibits enhanced skeletal muscle ubiquitin-proteasome-dependent proteolysis in cancer and septic rats. // Biochem J. 2002, 15; p. 185-192.

66.Taillandier D., Aurousseau E, Combaret L, Guezennec C.Y, Attaix D. Regulation of proteolysis during reloading of the unweighted soleus muscle. // Int J Biochem Cell Biol. 2003; 35(5): p. 665-75.

67.Witt S.H., Granzier H., Witt C.C., Labeit S. MURF-1 and MURF-2 target a specific subset of myofibrillar proteins redundantly: towards understanding MURF-dependent muscle ubiquitination. //J Mol Biol. 2005; 350(4): p. 713722.

68.Hirner S., Krohne C., Schuster A., Hoffmann S., Witt S., Erber R., Sticht C., Gasch A., Labeit S., Labeit D. MuRF1-dependent regulation of systemic

carbohydrate metabolism as revealed from transgenic mouse studies. // J Mol Biol., 2008; 379: p.666-677.

69.Mayans O., Labeit S. MuRFs specialized members of the TRIM/RBCC family with roles in the regulation of the trophic state of muscle and its metabolism. In: TRIM/RBCC Proteins, edited by Meroni G. New York: Springer, 2012, p. 119-129.

70.Kudryashova E., Kudryashov D., Kramerova I., Spencer M.J. Trim32 is a ubiquitin ligase mutated in limb girdle muscular dystrophy type 2H that binds to skeletal muscle myosin and ubiquitinates actin. // J Mol Biol., 2005; 354(2): p. 413-24.

71.Polge C., Heng A.E., Jarzaguet M., Ventadour S., Claustre A., Combaret L., Bechet D., Matondo M., Uttenweiler-Joseph S., Monsarrat B., Attaix D., Taillandier D. Muscle actin is polyubiquitinylated in vitro and in vivo and targeted for breakdown by the E3 ligase MuRF1. // FASEB J., 2011; 25(11): p. 3790-3802.

72. Attaix D., Ventadour S., Codran A., Bechet D., Taillandier D., Combaret L. The ubiquitin-proteasome system and skeletal muscle wasting. // Essays Biochem., 2005; 41: p.173-86.

73.Lagirand-Cantaloube J., Offner N., Csibi A., Leibovitch M.P., Batonnet-Pichon S., Tintignac L.A., Segura C.T., Leibovitch S.A. The initiation factor eIF3-f is a major target for atrogin1/MAFbx function in skeletal muscle atrophy. // EMBO J., 2008; 27(8): p.1266-1276.

74.Lokireddy S., McFarlane C., Ge X., Zhang H., Sze S.K., Sharma M., Kambadur R. Myostatin induces degradation of sarcomeric proteins through a Smad3 signaling mechanism during skeletal muscle wasting. // Mol. Endocrinol. 2011; 25(11): p. 1936-1949.

75.Bonaldo P., Sandri M. Cellular and molecular mechanisms of muscle atrophy. // Dis Model Mech. 2013; 6(1): p.25-39

76.Ikemoto M., Nikawa T., Takeda S., Watanabe C., Kitano T., Baldwin K.M., Izumi R., Nonaka I., Towatari T.,Teshima S.,Rokutan K., Kishi K. Space shuttle flight (STS-90) enhances degradation of rat myosin heavy chain in association with activation of ubiquitin-proteasome pathway.// The FASEB Journal, 2001, vol. 15, no. 7, p. 1279-1281.

77.Hasselgren P. O., Fischer J. E. Counter-regulatory hormones and mechanisms in amino acid metabolism with special reference to the catabolic response in skeletalmuscle. // CurrentOpinion in Clinical Nutrition andMetabolic Care, 1999, vol. 2, no. 1, p. 9-14.

78.Lecker S. H., Jagoe R. T., Gilbert A., Gomes M., Baracos V., Bailey J.,Price S.R., Mitch W.E., Goldberg A.L. Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression.// The FASEB Journal, 2004, vol. 18, no. 1, p.39-51.

79.Jagoe R.T., Goldberg A.L. What do we really know about the ubiquitin-proteasome pathway in muscle atrophy? // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 2001; 4: p.183-190.

80.Lecker S.H., Solomon V., Mitch W.E., Goldberg A.L. Muscle protein breakdown and the critical role of the ubiquitin-proteasome pathway in normal and disease states // J. Nutr., 1999; 129: p.227-237.

81.Dupont-Versteegden E.E., Fluckey J.D., Knox M., Gaddy D., Peterson C.A. Effect of flywheel-based resistance exercise on processes contributing to muscle atrophy during unloading in adult rats. // J. Appl. Physiol., 2006; 101(1): p.202-212.

82.Reid M.B. Response of the ubiquitin-proteasome pathway to changes in muscle activity // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 2005; 288(6): p.1423-1431.

83.Kedar V., McDonough H., Arya R., Li H.H., Rockman H.A., Patterson C. Muscle-specific RING finger 1 is a bona fide ubiquitin ligase that degrades

cardiac troponin I // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004; 101(52): p.18135-18140.

84.Clarke B.A., Drujan D., Willis M.S., Murphy L.O., Corpina R.A., Burova E., Rakhilin S.V., Stitt T.N., Patterson C., Latres E., Glass D.J. The E3 Ligase MuRF1degrades myosin heavy chain protein in dexamethasone-treated skeletal muscle. // Cell Metab., 2007; 6(5): p.376-385.

85.Centner T., Yano J., Kimura E., McElhinny A.S., Pelin K., Witt C.C., Bang M.L., Trombitas K., Granzier H., Gregorio C.C., Sorimachi H., Labeit S.Identification of muscle specific ring finger proteins as potential regulators of the titin kinase domain. // J. Mol. Biol., 2001; 306(4): p.717-726.

86.Tintignac L.A., Lagirand J., Batonnet S., Sirri V., Leibovitch M.P., Leibovitch S.A. Degradation of MyoD mediated by the SCF (MAFbx) ubiquitin ligase // J.Biol. Chem., 2005; 280(4): p.2847-2856.

87.Li H.H., Kedar V., Zhang C., McDonough H., Arya R., Wang D.Z., Patterson C. Atrogin-1/muscle atrophy F-box inhibits calcineurin-dependent cardiac hypertrophy by participating in an SCF ubiquitin ligase complex // J. Clin. Invest., 2004; 114(8): p.1058-1071.

88.Sandri M., Sandri C., Gilbert A., Skurk C., Calabria E., Picard A., Walsh K.,Schiaffino S., Lecker S.H., Goldberg A.L. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy // Cell, 2004; 117(3): p.399-412.

89.Giresi P.G., Stevenson E.J., Theilhaber J., Koncarevic A., Parkington J.,Fielding R.A., Kandarian S.C. Identification of a molecular signature of sarcopenia. // Physiol. Genomics, 2005; 21(2): p.253-263.

90.Kamei Y., Mizukami J., Miura S., Suzuki M., Takahashi N., Kawada T., Taniguchi T., Ezaki O. A forkhead transcription factor FKHR up-regulates lipoprotein lipase expression in skeletal muscle // FEBS Lett., 2003; 536(1-3): p.232-236.

91.Kamei Y., Miura S., Suzuki M., Kai Y., Mizukami J., Taniguchi T., Mochida K., Hata T., Matsuda J., Aburatani H., Nishino I., Ezaki O. Skeletal muscle FOXO1 (FKHR) transgenic mice have less skeletal muscle mass, down-regulated Type I (slow twitch/red muscle) fiber genes, and impaired glycemic control // J.Biol. Chem., 2004; 279(39): p.41114-41123.

92.Stitt T.N., Drujan D., Clarke B.A., Panaro F., Timofeyva Y., Kline W.O.,Gonzalez M., Yancopoulos G.D., Glass D.J. The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy-induced ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors // Mol. Cell., 2004; 14(3): p.395-403.

93.Cai D., Frantz J.D., Tawa N.E. Jr., Melendez P.A., Oh B.C., Lidov H.G., Hasselgren P.O., Frontera W.R., Lee J., Glass D.J., Shoelson S.E. IKKbeta/NFkappaB activation causes severe muscle wasting in mice // Cell, 2004; 119(2): p.285-298.

94. Сорокин А. В., Ким Е. Р., Овчинников Л. П. Протеасомная система деградации и процессинга белков.// Успехи биологической химии, 2009, 49, с.3-76.

95.Krawiec B.J., Frost R.A., Vary T.C., Jefferson L.S., Lang C.H. Hindlimb casting decreases muscle mass in part by proteasome-dependent proteolysis but independent of protein synthesis.// Am J Physiol Endocrinol Metab., 2005; 289(6), p. 969-980.

96.Beehler B.C., Sleph P.G., Benmassaoud L., Grover G.J. Reduction of skeletal muscle atrophy by a proteasome inhibitor in a rat model of denervation.// Exp Biol Med (Maywood), 2006; 231(3): p. 335-341.

97.Chacon-Cabrera A., Fermoselle C., Urtreger A.J., Mateu-Jimenez M., Diament M.J.,de Kier Joffe E.D.,Sandri M., Barreiro E. Pharmacological strategies in lung cancer-induced cachexia: effects on muscle proteolysis, autophagy, structure, and weakness. J Cell Physiol., 2014; 229(11), p.1660-1672.

98.Baehr L.M., Furlow J.D., Bodine S.C. Muscle sparing in muscle RING finger 1 null mice: response to synthetic glucocorticoids. // J Physiol., 2011; 589: p.4759-4776.

99.Cho J.E., Fournier M., Da X., Lewis M.I. Time course expression of Foxo transcription factors in skeletal muscle following corticosteroid administration. // J Appl Physiol (1985). 2010; 108(1): p. 137-145.

100. Furuyama T., Kitayama K., Yamashita H., Mori N. Forkhead transcription factor FOXO1 (FKHR)-dependent induction of PDK4 gene expression in skeletal muscle during energy deprivation. // Biochem J., 2003; 375: p. 365-371.

101. Sacheck J.M., Hyatt J.P., Raffaello A., Jagoe R.T., Roy R.R., Edgerton V.R., Lecker S.H., Goldberg A.L. Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during systemic diseases. // FASEB J., 2007; 21(1): p.140-55.

102. Waddell D.S., Baehr L.M., van den Brandt J., Johnsen S.A., Reichardt H.M., Furlow J.D., Bodine S.C. The glucocorticoid receptor and FOXO1 synergistically activate the skeletal muscle atrophy-associated MuRF1 gene. // Am J Physiol Endocrinol Metab., 2008; 295(4): p.785-797.

103. Shimizu N., Yoshikawa N., Ito N., Maruyama T., Suzuki Y., Takeda S., Nakae J., Tagata Y., Nishitani S., Takehana K., Sano M., Fukuda K., Suematsu M., Morimoto C., Tanaka H. Crosstalk between glucocorticoid receptor and nutritional sensor mTOR in skeletal muscle. // Cell Metab., 2011; 13(2): p.170-182.

104. Watson M.L, Baehr L.M., Reichardt H.M., Tuckermann J.P., Bodine S.C., Furlow J.D. A cell-autonomous role for the glucocorticoid receptor in skeletal muscle atrophy induced by systemic glucocorticoid exposure. // Am J Physiol Endocrinol Metab., 2012; 302(10)

105. Brunet A., Bonni A., Zigmond M.J., Lin M.Z., Juo P., Hu L.S., Anderson M.J., Arden K.C., Blenis J., Greenberg M.E. Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. // Cell. 1999, 19; 96 (6): p. 857-868.

106. Hunter R.B., Stevenson E., Koncarevic A., Mitchell-Felton H., Essig D.A., Kandarian S.C. Activation of an alternative NF-kB pathway in skeletal muscle during disuse atrophy. // FASEB J., 2002, 16, p. 529-538.

107. Baldwin A.S. Jr. The NF-kB and IkB proteins: new discoveries and insights.// Annu Rev Immunol., 1996, 14, p. 649-683.

108. Ghosh S., May M.J., Kopp E.B. NF-kB and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. // Annu Rev Immunol, 1998, 16: p. 225-260.

109. Li Y.P., Lecker S.H., Chen Y., Waddell I.D., Goldberg A.L., Reid M.B. TNF-a increases ubiquitin-conjugating activity in skeletal muscle by up-regulating UbcH2/E220k. // FASEB J., 2003, 17: p.1048-1057.

110. Li Y.P., Reid M.B. NF-kB mediates the protein loss induced by TNF-a in differentiated skeletal muscle myotubes. //Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 2000, 279: p.1165-1170.

111. Guttridge D.C., Mayo M.W., Madrid L.V., Wang C.Y., Baldwin A.S. Jr. NF-KB-induced loss of MyoD messenger RNA: possible role in muscle decay and cachexia. // Science, 2000, 289: p. 2363-2366.

112. Booth F.W., Criswell D.S. Molecular events underlying skeletal muscle atrophy and the development of effective countermeasures // Int. J. Sports, 1997: p.256-269.

113. Bodine S.C., Stitt T.N., Gonzalez M., Kline W.O., Stover G.L., Bauerlein R., Zlotchenko E., Scrimgeour A., Lawrence J.C., Glass D.J., Yancopoulos G.D. Akt/mTOR pathway is a crucial regulator of skeletal

muscle hypertrophy and can prevent muscle atrophy in vivo // Nat. Cell Biol., 2001; 3(11): p.1014-1029.

114. Rhoads R.E. Signal transduction pathways that regulate eukaryotic protein synthesis // J. Biol. Chem., 1999; 274(43): p.30337-30340.

115. Yimlamai T. The effects of hindlimb unweighting and beta 2-agonist on the ubiquitin-proteasome pathway and insulin-like growth factior I // Dissertation of the requirements for the degree of doctor of philosophy-2004.

116. Rom O., Reznick A.Z. The role of E3 ubiquitin-ligases MuRF-1 and MAFbx in loss of skeletal muscle mass. // Free Radic Biol Med., 2015, 29(15), 1184-1193.

117. Glass D.J. Skeletal muscle hypertrophy and atrophy signaling pathways. // Int J Biochem Cell Biol. 2005; 37(10): p. 1974-1984.

118. Zhang G., Jin B., Li Y.P. C/EBPp mediates tumour-induced ubiquitin ligase atrogin1/MAFbx upregulation and muscle wasting. // EMBO J., 2011; 30(20): p. 4323-4335.

119. Li Y.P., Chen Y., John J., Moylan J., Jin B., Mann D.L., Reid M.B. TNF-alpha acts via p38 MAPK to stimulate expression of the ubiquitin ligase atrogin 1/MAFbx in skeletal muscle. FASEB J., 2005; 19(3): p. 362-370.

120. Moylan J.S., Smith J.D., Chambers M.A., McLoughlin T.J., Reid M.B. TNF induction of atrogin-1/MAFbx mRNA depends on Foxo4 expression but not AKT-Foxo1/3 signaling. // Am J Physiol Cell Physiol., 2008; 295(4): p.986-993.

121. Zhang G., Li Y.P. p38p MAPK upregulates atrogin1/MAFbx by specific phosphorylation of C/EBPp. // Skelet Muscle. 2012; 2(1): p.20.

122. Lokireddy S., Wijesoma I.W., Bonala S., Wei M., Sze S.K., McFarlane C., Kambadur R., Sharma M. Myostatin is a novel tumoral factor that induces cancer cachexia. // Biochem J., 2012; 446(1): p. 23-36.

123. Lokireddy S., Wijesoma I.W., Sze S.K., McFarlane C., Kambadur R., Sharma M. Identification of atrogin-1-targeted proteins during the myostatin-induced skeletal muscle wasting. // Am J Physiol Cell Physiol., 2012; 303(5): p.512-529.

124. Sartori R., Milan G., Patron M., Mammucari C., Blaauw B., Abraham R., Sandri M. Smad2 and 3 transcription factors control muscle mass in adulthood. Am J Physiol Cell Physiol. // 2009; 296(6): p.1248-1257.

125. Goodman C.A., McNally R.M., Hoffmann F.M., Hornberger T.A. Smad3 induces atrogin-1, inhibits mTOR and protein synthesis, and promotes muscle atrophy in vivo. // Mol Endocrinol. 2013; 27(11): p. 19461957.

126. Bollinger L.M., Witczak C.A., Houmard J.A., Brault J.J.3. SMAD3 augments FoxO3-induced MuRF-1 promoter activity in a DNA-binding-dependent manner. // Am J Physiol Cell Physiol., 2014; 307(3): p. 278-287.

127. Hu M.C., Lee D.F., Xia W., Golfman L.S., Ou-Yang F., Yang J.Y., Zou Y., Bao S., Hanada N., Saso H., Kobayashi R., Hung M.C. IkappaB kinase promotes tumorigenesis through inhibition of forkhead FOXO3a. // Cell. 2004; 117(2): p. 225-237.

128. Kornblau S.M., Singh N., Qiu Y., Chen W., Zhang N., Coombes K.R. Highly phosphorylated FOXO3A is an adverse prognostic factor in acute myeloid leukemia. // Clin Cancer Res., 2010; 16(6): p. 1865-1874.

129. Goodman C.A., Mabrey D.M., Frey J.W., Miu M.H., Schmidt E.K., Pierre P., Hornberger T.A. Novel insights into the regulation of skeletal muscle protein synthesis as revealed by a new nonradioactive in vivo technique.// FASEB J. 2011. V.25. №3. P.1028-1039.

130. Viljoen G.J., Nel L.H., Crowther J.R. Molecular diagnostic PCR handbook,Published by Springer, The Netherlands, 2005, XVIII, p. 307.

131. Stevens L., Sultan K.R., Peuker H., Gohlsch B., Mounier Y., Pette D. Time dependent changes in myosin heavy chain mRNA and protein isoforms in unloaded soleus muscle of rat // Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 1999; 277(6Pt.1):p.1044-1049.

132. Meissner J.D., Gros G., Scheibe R.J., Scholz M., Kubis H.P. Calcineurin regulates slow myosin, but not fast myosin or metabolic enzymes, during fast-toslow transformation in rabbit skeletal muscle cell culture // J. Physiol., 2001; 533(1): p.215-226.

133. Brasier A.R., Lu M, Hai T, Lu Y, Boldogh I. NF-kappa B-inducible BCL-3 expression is an autoregulatory loop controlling nuclear p50/NF-kappa B1 residence. // J Biol Chem., 2001; 276(34): p. 32080-93.

134. Ten R.M., Paya C.V., Israël N., Le Bail O., Mattei M.G., Virelizier J.L., Kourilsky P., Israël A. The characterization of the promoter of the gene encoding the p50 subunit of NF-kappa B indicates that it participates in its own regulation.// EMBO J., 1992; 11(1): p.195-203.

135. Mukhina A.M., Altaeva E.G., Nemirovskaya T.L., Shenkman B.S. The role of L-type calcium channels in the accumulation of Ca2+ in soleus muscle fibers in the rat and changes in the ratio of myosin and serca isoforms in conditions of gravitational unloading.// Neurosci. Behav. Physiol., 2008, V. 38, №2. P. 181-188.

136. Giger J.M., Bodell P.W., Zeng M., Baldwin K.M., Haddad F. Rapid muscle atrophy response to unloading: pretranslational processes involving MHC and actin. //J Appl Physiol (1985), 2009; 107(4): p. 1204-1212.

137. Rey M.A., Davies P.L. The protease core of the muscle-specific calpain, p94, undergoes Ca2+-dependent intramolecular autolysis.// FEBS Lett., 2002, 18;532(3): p. 401-406.

138. Zhang B.T., Yeung S.S., Allen D.G., Qin L., Yeung E.W. Role of the calcium-calpain pathway in cytoskeletal damage after eccentric contractions.// J Appl Physiol (1985), 2008; 105 (1): p. 352-357.

139. Branca D., Gugliucci A., Bano D., Brini M, Carafoli E. Expression, partial purification and functional properties of themuscle-specific calpain isoform p94. // Eur J Biochem., 1999; 265(2): p. 839-846.

140. Duguez S., Bartoli M., Richard I. Calpain 3: a key regulator of the sarcomere? // FEBS J., 2006; 273(15): p.3427-3436.

141. Kachaeva E.V., Shenkman B.S. Various jobs of proteolytic enzymes in skeletal muscle during unloading: facts and speculations. // J. Biomed. Biotechnol. 2012, V.2012, p. 6-18.

142. Ma X.W., Li Q., Xu P.T., Zhang L., Li H., Yu Z.B., Tetanic contractions impair sarcomeric Z-disk of atrophic soleus muscle via calpain pathway. // Mol. Cell.Biochem., 2011, 354, p. 171-180.

143. Gustafsson T., Osterlund T., Flanagan J.N., F. von Walden, Trappe T.A., Linnehan R.M., Tesch P.A. Effects of 3 days unloading on molecular regulators of muscle size in humans. // J. Appl. Physiol., 2010, 109, p. 721727.

144. Clarke B.A., Drujan D., Willis M.S., Murphy L.O., Corpina R.A., Burova E., Rakhilin S.V., Stitt T.N., Patterson C., Latres E., Glass D.J. The E3 ligase MuRFldegrades myosin heavy chain protein in dexamethasone-treated skeletal muscle. // Cell Metab., 2007, 6, p. 376-385.

145. Attaix D., Baracos V.E. MAFbx/atrogin-1 expression is a poor index of muscle proteolysis. // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 2010, 13, p. 223224.

146. Wang X., Chen W.R., Xing D. A pathway from JNK through decreased ERK and Akt activities for FOXO3a nuclear translocation in response to UV irradiation. //J. Cell. Physiol., 2012, 227, p. 1168-1178.

147. Smith I.J., Dodd S.L. Calpain activation causes a proteasome-dependent increase in protein degradation and inhibits the Akt signalling pathway in rat diaphragm muscle. // Exp. Physiol., 2007, 92, p. 561-573.

148. Romeo Y., Zhang X., Roux P.P., Regulation and function of the RSK family of protein kinases. // Biochem. J., 2012, 441, 553-569.

149. Dupont E., Cieniewski-Bernard C., Bastide B., Stevens L. Electrostimulation during hindlimb unloading modulates PI3K-AKT downstream targets without preventing soleus atrophy and restores slow phenotype through ERK. // Am. J.Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 2011, 300, p. 408-417.

150. Dodd S.L., Hain B., Senf S.M., Judge A.R. Hsp27 inhibits IKKbeta-induced NF-kappaB activity and skeletal muscle atrophy.// FASEB J., 2009; 23(10): p. 3415-3423.

151. Delhase M., Hayakawa M., Chen Y., Karin M. Positive and negative regulation of IkappaB kinase activity through IKKbeta subunit phosphorylation. // Science, 1999; 284(5412): p.309-313.

152. Rothwarf D.M., Karin M. The NF-kappa B activation pathway: a paradigm in information transfer from membrane to nucleus.// Sci STKE., 1999(5): p. RE1.

153. Bodine S.C., Baehr L.M. Skeletal muscle atrophy and the E3 ubiquitin ligases MuRF1 and MAFbx/atrogin-1.// Am J Physiol Endocrinol Metab., 2014, 15; 307(6): p. 469-484.

154. Reed S.A., Senf S.M., Cornwell E.W., Kandarian S.C., Judge A.R. Inhibition of IkappaB kinase alpha (IKKa) or IKKbeta (IKKP) plus forkhead box O (Foxo) abolishes skeletal muscle atrophy.// Biochem Biophys Res Commun., 2011, 18; 405(3): p. 491-496.

155. Chariot A. The NF-kappaB-independent functions of IKK subunits in immunity and cancer.// Trends Cell Biol., 2009; 19 (8): p. 404-413.

156. Lomonosova Y.N., Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L. Attenuation of unloading-induced rat soleus atrophy with the heat-shock protein inducer 17-(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin. // FASEB J., 2012; 26(10): p.4295-4301.

157. Capel F., Prod'homme M., Bechet D., Taillandier D., Balage M, Attaix D, Combaret L. Lysosomal and proteasome-dependent proteolysis are differentially regulated by insulin and/or amino acids following feeding in young, mature and old rats. // J Nutr Biochem., 2009; 20 (8): p. 570-576.

158. Shenkman B.S., Belova S.P., Lomonosova Y.N., Kostrominova T.Y., Nemirovskaya T.L. Calpain-dependent regulation of the skeletal muscle

atrophy following unloading. Arch Biochem Biophys., 2015, 15; 584: p. 3641.

159. Белова С. П., Ломоносова Ю. Н., Шенкман Б. С., Немировская Т. Л. Блокирование дигидропиридиновых каналов препятствует увеличению уровня активированного ^-кальпаина при функциональной разгрузке m.soleus./ Доклады академии наук, 2015,Т. 460, № 1, с. 98-101.

160. Childs T.E., Spangenburg E.E., Vyas D.R., Booth F.W. Temporal alterations in protein signaling cascades during recovery from muscle atrophy.// Am J Physiol Cell Physiol., 2003; 285(2): p. 391-398.

161. Urso M.L., Scrimgeour A.G., Chen Y.W., Thompson P.D., Clarkson P.M.Analysis of human skeletal muscle after 48 h immobilization reveals alterations in mRNA and protein for extracellular matrix components.// J Appl Physiol (1985)., 2006; 101(4): p. 1136-1148.

162. Marimuthu K., Murton A.J., Greenhaff P.L. Mechanisms regulating muscle mass during disuse atrophy and rehabilitation in humans.// J Appl Physiol (1985), 2011; 110(2): p. 555-560.

163. Glover E.I., Phillips S.M., Oates B.R., Tang J.E., Tarnopolsky M.A., Selby A., Smith K., Rennie M.J. Immobilization induces anabolic resistance in human myofibrillar protein synthesis with low and high dose amino acid infusion. J Physiol., 2008, 15; 586(24): p. 6049-6061.

164. Greenhaff P.L., Karagounis L.G., Peirce N, Simpson E.J., Hazell M., Layfield R, Wackerhage H., Smith K., Atherton P., Selby A., Rennie M.J. Disassociation between the effects of amino acids and insulin on signaling, ubiquitin ligases, and protein turnover in human muscle.// Am J Physiol Endocrinol Metab., 2008; 295(3): p. 595-604

165. Rennie M.J., Selby A., Atherton P., Smith K., Kumar V., Glover E.L., Philips S.M. Facts, noise and wishful thinking: muscle protein turnover in aging and human disuse atrophy. Scand J Med Sci Sports., 2010; 20(1): p. 59.